KR20220129026A - 아밀로이드 제거를 위한 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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유니버시티 오브 테네시 리서치 파운데이션
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Abstract

아밀로이드 결합 영역을 포함하는 키메라 수용체 뿐만 아니라 키메라 수용체를 포함하는 세포가 본원에서 제공된다. 또한 본원에서는 키메라 수용체를 포함하는 세포를 투여함으로써 아밀로이드-기반 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

아밀로이드 제거를 위한 키메라 항원 수용체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 17일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/962,763에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일에 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일에 대한 다음 제출 내용은 그 전체가 참조로 여기에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능한 형식 (CRF) (파일 명칭: 165992000540SEQLIST.TXT, 기록 날짜: 2021년 1월 15일, 크기 : 54KB).
분야
본 출원은 아밀로이드를 제거하거나 아밀로이드-관련 질병을 치료하는데 사용될 수 있는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
아밀로이드증은 알츠하이머병의 발병 뿐만 아니라 면역글로불린 경쇄-관련(AL) 아밀로이드증과 같은 덜 알려져 있지만 유사하게 파괴적인 장애와 관련된 파괴적인 병적 측면이다((Dispenzieri, A., 등, Blood Rev, 2012. 26(4): p. 137-54; Merlini, G., Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2017. 2017(1): p. 1-12). AL 환자는 심장, 간, 비장, 신장 및 말초 신경에 아밀로이드가 발생하여 장기 기능 장애를 일으키고 항상 치명적이다. 전신 질병에서 아밀로이드 침착물은 면역학적으로 불활성이다. 이는 면역계의 식세포(대식세포, "M
Figure pct00001
")에 의해 인식되거나 제거되지 않으며 항체 반응을 일으키지 않는다. 심각한 심장 아밀로이드증을 나타내는 환자에서 예후는 약 9개월의 중앙값 생존으로 좋지 않다(Gertz, M.A., 등, Blood, 1991. 77(2): p. 257-62; Grogan, M., A. 등, Heart, 2017. 103(14): p. 1065-1072). AL 아밀로이드증의 치료는 일반적으로 아밀로이드 형성 경쇄 단백질의 형질 세포 분비를 억제하기 위한 항-형질 세포 화학요법 및 면역요법을 포함한다. 그러나 존재하는 조직 아밀로이드의 제거는 이제 이러한 환자를 위해 개발 중인 많은 신규 치료제의 주요 목표가 되었다.
또한, 50세 이상의 일반 미국 인구의 약 3%가 의미를 알 수 없는 모노클로날 감마병증(MGUS, monoclonal gammopathy of unknown significance)으로 알려진 형질 세포 장애를 가지고 있다(Weiss, B.M., 등, Blood, 2009. 113(22): p. 5418-22). 이 장애는 형질 세포에 의한 모노클로날 면역글로불린 경쇄(LC)의 분비를 동반할 때 파괴적이고 종종 치명적인 병태인 LC-관련(AL) 아밀로이드증의 불길한 전구체이며, LC로 구성된 고도로 정렬된 단백질 원섬유, 또는 이들의 단편은 간, 심장, 신장, 비장, 내장 및 신경을 포함하는 장기 및 조직의 세포외 공간에 침착된다(Dispenzieri, A., 등, Blood Rev, 2012. 26(4): p. 137-54; Merlini, G., Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2017. 2017(1): p. 1-12; Wechalekar, A.D., 등, Systemic amyloidosis. Lancet, 2015). 아밀로이드 원섬유는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)과 같은 혈청-유래 단백질과 결합하여 침착되어 복잡한 병리학적 매트릭스를 생성한다. 아밀로이드는 "비자연" 단백질 응집체이지만, 비면역원성이고 환자에서 선천성 면역계의 식세포에 의한 제거에 대해 놀랍게도 내성이 있다. 사실, 부검-유래 물질에 대한 평가는 면역 세포의 확실한 유입을 보여주지 않는다.
AL 아밀로이드증의 발병기전 및 환자 생존율의 개선에 대한 수십 년의 연구에도 불구하고(Dispenzieri, A., 등, Blood Rev, 2012. 26(4): p. 137-54), 질병은 여전히 변함없이 치명적으로 남아 있다. 중증 심장 AL-관련 아밀로이드증을 나타내는 대상체의 전체 생존은 약 9개월이다(Grogan, M., A. 등, Heart, 2017. 103(14): p. 1065-1072). 이는 환자가 일반적으로 조직 아밀로이드의 상당한 장기-손상 부하와 동반된 불량한 예후를 나타내기 때문이고, 특히 심장(Kristen, A.V., 등, J Am Coll Cardiol, 2016. 68(1): p. 13-24) 또는 신장(Kuroda, T., 등, BMC Nephrol, 2012. 13: p. 118) AL 아밀로이드증이 주요 증상이다(Kristen, A.V., 등, J Am Coll Cardiol, 2016. 68(1): p. 13-24; Banypersad, S.M., 등, Eur Heart J, 2015. 36(4): p. 244-51). AL 아밀로이드증 환자의 확립된 임상 관리는 친-아밀로이드생성 전구체 LC 단백질의 생산을 방지하여 아밀로이드 부하의 확장을 방지하는 것을 목표로 한다. 이것은 형질 세포 화학요법 및 면역요법(Chaulagain, C.P. and R.L. Comenzo, Clin Adv Hematol Oncol, 2015. 13(5): p. 315-24; Comenzo, R.L., 등, N Engl J Med, 2008. 358(1): p. 92; author reply 92-3; Sanchorawala, V., 등, Bone Marrow Transplant, 2004. 33(4): p. 381-8; Varga, C. and R.L. Comenzo, Bone Marrow Transplant, 2018), 프로테아좀 억제제(Chaulagain, C.P. and R.L. Comenzo, Clin Adv Hematol Oncol, 2015. 13(5): p. 315-24; Sidiqi, M.H. and M.A. Gertz, Leuk Lymphoma, 2018: p. 1-7; Milani, P., 등, Kidney Int Rep, 2018. 3(3): p. 530-541), 및 자가 줄기 세포 이식(D'Souza, A., 등, J Clin Oncol, 2015. 33(32): p. 3741-9)을 사용하여 달성된다. 그러나 이러한 접근법은 존재하는 조직 아밀로이드의 활성 용해를 촉진하도록 설계되지 않았다. 이러한 접근법에 대한 반응으로 성공적인 혈액학적 관해에도 불구하고, 대부분의 환자에서 LC 단백질이 회복되고 질병이 진행된다. 이러한 환자에서, 조직에 아밀로이드가 끊임없이 축적되면 장기 기능 장애, 삶의 질 악화 및 사망에 기여하는 주요 요인이 된다.
AL 아밀로이드의 흡수는 2개 이상의 아밀로이드-반응성 결합 단백질을 사용하여 입증되었다: (1) mAb 11-1F4(Hrncic, R., 등, Am J Pathol, 2000. 157(4): p. 1239-46; Solomon, A., 등, Clin Cancer Res, 2003. 9(10 Pt 2): p. 3831S-8S; Solomon, A., 등, Cancer Biother Radiopharm, 2003. 18(6): p. 853-60; Wall, J.S., 등, Blood, 2010. 116(13): p. 2241-4) 및 (2) 펩티드 p5+14(Kennel, S.J., 등, Mol Imaging Biol, 2016. 18(4): p. 483-9; Martin, E.B., 등, Sci Rep, 2016. 6: p. 22695; Wall, J.S., 등, Molecules, 2015. 20(5): p. 7657-82). 또한, "아밀로이드-제거" 치료제의 필요성을 해결하기 위해, 지난 적어도 20년 동안 아밀로이드-반응성 모노클로날 항체(mAb)가 개발되었으며 최근에는 세 가지 시약에 대한 임상 시험이 수행되었다(Richards, D.B., 등, Sci Transl Med, 2018. 10(422); Edwards, C.V., 등, Amyloid, 2017. 24(sup1): p. 58-59; Gertz, M.A., 등, J Clin Oncol, 2016. 34(10): p. 1097-103; Gertz, M.A., 등, Am J Hematol, 2016. 91(12): p. E506-E508; Wall, J.S., 등, Blood, 2010. 116(13): p. 2241-4). 이러한 mAb를 사용한 수동 면역요법에 대해 제안된 작용 방식은 특이적 아밀로이드 결합 및 아밀로이드의 옵소닌화를 포함하여 국소화된 대식세포(M
Figure pct00002
) 활성화 및 아밀로이드의 식세포작용을 유발한다(Wall, J.S., 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(46): p. E10839-E10848). 또한, M
Figure pct00003
의 자극은 mAb Fc 도메인과 Fc-수용체(FcR)의 상호작용을 통해 또는 아밀로이드-결합 mAb에 의한 상보체 고정 후 상보체 C3 수용체를 통해 매개된다(Bodin, K., 등, Nature, 2010. 468(7320): p. 93-7; Milde, R., 등, Cell Rep, 2015. 13(9): p. 1937-48). 임상적으로 평가된 3개의 mAb 중 2개인, 키메라 (c)11-1F4 및 인간화 NEOD001 mAb가 생성되었거나 전임상 개발을 거쳤다(Hrncic, R., 등, Am J Pathol, 2000. 157(4): p. 1239-46; Wall, J.S., 등, PLoS One, 2012. 7(12): p. e52686; Solomon, A., D.T. Weiss, and J.S. Wall, Clin Cancer Res, 2003. 9(10 Pt 2): p. 3831S-8S; O'Nuallain, B., 등 Amyloid and Amyloidosis: Proceedings of the Xth International Symposium on Amyloidosis. 2005. Tours, France: CRC Press). 1상 임상시험에서 긍정적인 임상 데이터에도 불구하고, NEOD001 프로그램은 중추적인 3상 시험(NCT02312206)의 중간 평가에서 효능 부족으로 종료되었고, c11-1F4 2상 시험이 중단되었다. 세 번째 mAb(Glaxo-SmithKline; NCT03044353)의 1상 시험에서 데자미주맙을 사용한 AL 환자의 치료가 조직 아밀로이드의 극적이고 측정가능한 제거를 초래할 수 있음을 나타내는 데이터가 생성되었다(Richards, D.B., 등, Sci Transl Med, 2018. 10(422)). 이 시험은 최근 발표될 데이터와 함께 중단되었다. 따라서 추가적인 "아밀로이드-제거" 치료제의 개발이 필요하다. 이러한 mAb 시험에 대한 전체 결과에도 불구하고, AL 아밀로이드의 옵소닌화로 인해 용해될 수 있다는 가설을 뒷받침하는 데이터가 생성되었다.
관심 표적을 제거하기 위한 한 가지 접근법은 표적에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 식세포를 투여하는 것이다. 예를 들어, CD19 결합 수용체 및 세포질 친-식세포작용 신호전달 요소를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제시하는 M
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는 CD19-코팅된 비드의 향상된 흡수 및 배양물에서 CD19-발현 B-림프구의 향상된 사멸을 나타내는 것으로 입증되었다(Morrissey, M.A., 등, Elife, 2018. 7). 구체적으로, 식세포작용-신호전달 면역수용체, 티로신-기반 활성화 모티프(ITAMs; see Hamerman, J.A., 등, Immunol Rev, 2009. 232(1): p. 42-58; Swisher, J.F. and G.M. Feldman, Immunol Rev, 2015. 268(1): p. 160-74)를 포함하는 세포질 요소를 사용하는 CAR는 CD19 및 직경이 최대 20μm인 CD22-코팅된 입자의 흡수를 크게 향상시켰다. 추가로, CD19-양성 라지(Raji) B 림프구의 사멸이 배양물에서 관찰되었다. 이 연구는 종양 세포 항원 결합 및 종양 세포-사멸에 초점을 맞추었으며, 또한 몇 가지 고유한 CAR 작제물이 식세포작용을 향상시키는 동시에 일부는 다른 것보다 더 효율적임을 보여주었다.
종합하면, 아밀로이드 침착물을 제거하도록 설계된 치료제가 당업계에 필요하다.
본원에서는 활성화시 대식세포를 활성화시키는 수용체의 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인; 막횡단 도메인; 및 아밀로이드 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체 단편은 scFv이다. 일부 구현양태에서, 항체는 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 VL 및 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 VH를 포함하고, 여기서 CDRL1은 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL2는 서열번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL3은 서열번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH1은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH2는 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH3은 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체는 서열번호: 19 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호: 20 또는 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합은 영역은 11-1F4 항체 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 항체 단편은 인간화된다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 반응성 펩티드는 서열번호: 1-18에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 CH2 도메인 또는 이의 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인은 서열번호: 33에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 세포질 도메인 I, 세포질 도메인 II, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 30, 31, 41, 42 또는 45에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인에 대한 아밀로이드의 결합은 키메라 수용체의 세포질 도메인을 활성화시킨다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 분비 리더 서열이 있거나 없는 서열번호: 43에 제시된 서열에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현양태에서, 수용체의 각 성분은 함께 또는 개별적으로 서열번호: 43의 상응하는 성분에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
또한, 본원에서 제공되는 키메라 수용체를 코딩하는 핵산이 제공된다.
일부 구현양태에서 본원에 제공된 키메라 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 세포가 본원에 제공된다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 침착물을 본원에 제공된 키메라 수용체 또는 본원에 제공된 키메라 수용체를 포함하는 청구항의 조작된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여, 아밀로이드를 제거하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드는 AA, AL, AH, ATTR, Aß2M, 야생형 TTR, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALect2, Afib, ACys, ACal, AMedin, AIAPP, APro, AIns, APrP 또는 Aβ이다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체의 아밀로이드 결합 영역은 아밀로이드에 대한 결합 친화성을 갖는다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 침착물을 키메라 수용체와 접촉시키면 아밀로이드의 적어도 부분적인 제거를 초래한다.
본원에서 제공되는 키메라 수용체 또는 본원에서 제공되는 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 아밀로이드 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 또한 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 대상체에 투여하는 단계는 키메라 수용체를 발현하는 대식세포 또는 단핵구를 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 11-1F4 scFv(왼쪽, "(i) 11-1F4"로 표시) 및 p5+14 펩티드-기반(오른쪽, "(ii) 펩티드"로 표시) 아밀로이드-특이적 CAR 구조의 개략도를 제공한다. 왼쪽에서, 11-1F4-기반 CAR은 N-말단에서 C-말단까지 11-1F4 항체 scFv(VL(짙은 회색 타원형으로 표시), scFv 링커(VL 및 VH을 연결하는 선), 및 VH(중간 회색 타원형), 스페이서 서열(다이아몬드)을 포함)로 이루어진 세포외 도메인, 막횡단 도메인(직사각형) 및 세포질 도메인(큰 중간 회색 타원형)을 포함한다. 오른쪽에서, 펩티드-기반 CAR은 N-말단에서 C-말단까지, p5+14 펩티드, 첫 번째 스페이서 서열(작은 마름모꼴), CH2 도메인(바둑판 타원형), 두 번째 스페이서 서열(큰 마름모꼴)로 이루어진 세포외 도메인, 막횡단 도메인(직사각형) 및 세포질 도메인(더 큰 중간 회색 타원형)을 포함한다.
도 2는 모노클로날 항체 주입 직전(왼쪽) 및 모노클로날 항체 주입 후 42일(오른쪽)의 전신 전방 123I-SAP 신티그라피를 보여준다. 간 아밀로이드 부하의 현저한 감소가 관찰되었다(Richards 등 , Sci Transl Med, 2018 10(422)).
도 3은 키메라 항원 수용체의 특징의 개략도이다.
도 4a-4d는 m11-1F4의 생체내 투여를 평가한 실험 결과를 나타낸다. 도 4a는 125I-m11-1F4를 사용하여 SPECT/CT 영상으로 검출된 마우스에 피하 이식된 인간 AL 아밀로이드 추출물(화살표)을 나타낸다. 도 4b는 피하 인간 AL 아밀로이드(화살표)를 보유하는 마우스의 m11-1F4로의 치료가 병변의 퇴행을 야기함을 보여준다. 도 4c는 대조군 처리된 동물을 나타낸다. 도 4d는 PET/CT 영상화에 의한 AL 아밀로이드증 환자에서 124I-m11-1F4의 생체분포를 나타낸다. 화살표는 확대된 아밀로이드-부하된 간에서 mAb의 흡수이다.
도 5a-5b는 펩티드 p5+14가 조직 절편에서 인간 AL 아밀로이드에 결합한다는 것을 보여주는 결과를 보여준다. 도 5a는 방사성요오드화되었을 때, 124I-p5+14가 AL 아밀로이드증 환자에서 아밀로이드를 함유할 가능성이 있는 장기(신장, 비장 및 췌장)로 국소화되는 것으로 나타났음을 보여준다. 도 5b는 환자의 PET/CT 영상화를 나타낸다.
도 6은 제안된 11-1F4 scFv(왼쪽, "(i) 11-1F4"로 표시) 및 p5+14 펩티드- 기반(오른쪽, "(ii) 펩티드"로 표시) CAR 구조의 개략도를 보여준다.
I. 정의
달리 명시되지 않는 한, 기술 용어는 통상적인 용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 문헌(Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995(ISBN 9780471185710)) 및 기타 유사한 참고 문헌에서 찾을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나(a, an)" 및 "상기(the)"는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 단수 및 복수를 모두 지칭한다. 약어, "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 exempli gratia에서 파생되었으며 비제한적인 예를 나타내기 위해 여기에서 사용된다. 따라서 약어 "e.g."는 "예를 들어"라는 용어와 동의어이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다(comprise)"는 "포함하다(include)"를 의미한다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값 및/또는 "약" 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 그러한 범위가 표현될 때, 다른 측면은 범위의 하나의 특정 값 및/또는 범위의 다른 특정 값까지를 포함한다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여 및 다른 종점과는 독립적으로 모두 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 유사하게, 값이 근사치로 표현될 때, 선행사 "약"을 사용하여 특정 값이 또 다른 측면을 형성함을 이해할 것이다. 특정 예시적인 구현양태에서, "약"이라는 용어는 당업계의 정상 허용 오차 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내로 이해된다. 약은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 약이라는 용어로 수정될 수 있다. 또한, "예", "예시적인" 또는 "예시된"과 같은 본원에서 사용된 용어는 선호도를 나타내기 위한 것이 아니라, 오히려 이후에 논의되는 측면이 제시된 측면의 단지 하나의 예임을 설명하기 위한 것이다.
핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며 설명을 위해 제공됨을 추가로 이해해야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 상충하는 경우 용어 설명을 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
본 개시내용의 다양한 구현양태의 검토를 용이하게 하기 위해, 특정 용어에 대한 다음 설명이 제공된다:
투여: 선택된 경로에 의한 대상체에 조성물의 도입. 예를 들어, 선택된 경로가 정맥내인 경우, 조성물을 대상체의 정맥에 도입함으로써 조성물을 투여한다. 일부 실시예에서 펩티드는 대상체에게 투여된다.
용어 아밀로이드, 아밀로이드 침착물, 아밀로이드 원섬유 및 아밀로이드 섬유는 특정 구조적 특성을 공유하는 불용성 섬유질 단백질 응집체를 지칭한다. 단백질 응집체는, 예를 들어 여러 다른 단백질의 응집에 의해 형성되고 섬유 축에 수직으로 적층된 β 시트의 정렬된 배열로 구성된 3차 구조를 갖는다(Sunde 등, J. Mol. Biol. (1997) 273:729-39). 장기에 아밀로이드가 비정상적으로 축적되면 아밀로이드증이 발생할 수 있다. 그 발생은 다양하지만, 모든 아밀로이드는 콩고 레드(Congo red)와 같은 특정 염료로 염색되고 염색 후 편광에서 특징적인 적-록 복굴절 외관을 갖는다는 점에서 공통적인 형태학적 특성을 가지고 있다. 아밀로이드는 또한 일반적인 미세구조적 특징 및 일반적인 x선 회절 및 적외선 스펙트럼을 공유한다.
아밀로이드증은 아밀로이드 침착물의 존재와 같은 아밀로이드의 존재를 특징으로 하는 병리학적 병태 또는 질병을 지칭한다. "아밀로이드 질병" 또는 "아밀로이드증"은 아밀로이드 원섬유의 형성, 침착, 축적 또는 지속과 관련된 질병이다. 이러한 질병에는 알츠하이머병, 다운 증후군, 네덜란드 유형의 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈 및 뇌 베타-아밀로이드 혈관병증이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 전신성 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, ATTR 아밀로이드증, ALect2 아밀로이드증 및 II형 당뇨병의 IAPP 아밀로이드증과 같은 다른 아밀로이드 질병도 아밀로이드 질병이다.
아밀로이드생성은 아밀로이드 침착물을 생산하거나 생산하려는 경향을 지칭한다. 예를 들어, 특정 가용성 단량체 단백질은 잘 정렬된 비분지형 8- 내지 10-nm 폭의 원섬유로 응집되는 광범위한 형태적 변화를 겪을 수 있다. 예를 들어, 30개 이상의 단백질이 사람에게서 아밀로이드 침착물(또는 아밀로이드)을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 면역글로불린 경쇄와 같은 다양한 단백질 부류 내의 모든 단백질이 아밀로이드를 형성할 수 있는 것은 아니며, 즉 일부 단백질은 비-아밀로이드생성이고, 이는 이들은 아밀로이드를 형성하지 않는 경향임을 의미한다. 그러나 부류의 다른 단백질은 아밀로이드 침착물을 형성할 수 있으므로, 아밀로이드생성이다. 또한, 경쇄 단백질 부류 내에서 일부는 아밀로이드 원섬유를 형성하는 용이성에 근거하여 다른 것보다 더 "아밀로이드생성"으로 간주될 수 있다. 특정 경쇄 단백질은 환자 또는 시험관 내에서 쉽게 아밀로이드 원섬유를 형성할 수 없기 때문에 비-아밀로이드 생성 또는 덜 아밀로이드 생성으로 간주된다.
동물: 살아있는 다세포 척추동물 유기체, 예를 들어 포유류 및 조류를 포함하는 범주. 포유류라는 용어는 인간과 비-인간 포유류를 모두 포함한다. 유사하게, "대상체"라는 용어는 인간 및 수의 대상체를 모두 포함한다. 일부 실시예에서 대상체는 아밀로이드 질병을 앓고 있는 대상체와 같은 대상체이다.
제거: 용어 "제거하다(clear)" 또는 "제거(clearance)"는 측정가능한 정도로 감소시키거나 제거하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아밀로이드 침착물의 제거는 침착물을 측정가능하거나 식별가능한 정도로 감소시키거나 제거하는 것과 관련된다. 제거로 인해 100% 제거될 수 있지만 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 오히려, 제거는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 그 이상의 제거와 같이 100% 미만의 제거를 초래할 수 있다.
항체는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 헤테로 면역글로불린의 부류에 속하는 단일 사슬, 2-사슬 및 다중-사슬 단백질 및 당단백질을 지칭한다(모노클로날 항체가 바람직하다); 여기에는 이러한 면역 글로불린의 합성 및 유전 공학 변이체도 포함된다. "항체 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv 및 Fv 단편 뿐만 아니라 원하는 표적 에피토프 또는 에피토프들에 대해 특이성을 갖는 항체의 임의의 부분을 포함한다. "모노클로날 항체"는 B-림프구의 단일 클론에 의해 생산된 항체이다. 모노클로날 항체는, 예를 들어 골수종 세포와 면역 비장 세포의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 제조함으로써 당업자에게 공지된 방법에 의해 생산된다.
에피토프는 항체 아미노산 서열의 특이성에 의해 결정되는 바와 같이, 항체에 의해 인식되는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 항원 결정기라고도 한다. 예를 들어, 에피토프는 특정 항체에 의해 인식되는 재조합 단백질의 일부일 수 있다. 또한, 에피토프는 형태적 에피토프 및 선형 에피토프일 수 있다.
키메라 항체는 전형적으로 상이한 종의 2개의 상이한 항체로부터 유래된 서열을 포함하는 항체를 지칭한다. 가장 전형적으로, 키메라 항체는 인간 및 뮤린 항체 단편, 일반적으로 인간 불변 및 뮤린 가변 영역을 포함한다.
인간화 항체는 비-인간 항체, 전형적으로 뮤린으로부터 유래된 항체, 및 모 항체의 항원-결합 특성을 유지하거나 실질적으로 유지하지만 인간에서 덜 면역원성인 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.
상보성 결정 영역 또는 CDR은 자연 면역글로불린 결합 부위의 자연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 지정된 3개의 CDR을 갖는다. 정의에 따르면, 경쇄의 CDR은 위치 24 및 34(L-CDR1), 50 및 56(L-CDR2), 89 및 97(L-CDR3)의 잔기에 의해 결합되고; 중쇄의 CDR은 카밧(Kabat 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, NIH Publication No. 91-3242)에 의해 기술된 넘버링 규칙을 사용하여 위치 31 및 35b(H-CDR1), 50 및 65(H-CDR2), 95 및 102(H-CDR3)의 잔기에 의해 결합된다.
프레임워크 영역은 CDR 사이에 개재된 아미노산 서열을 지칭한다. 항체의 이러한 부분은 CDR을 항원 결합에 적합한 방향으로 유지하는 역할을 한다.
유효량 또는 치료적 유효량: 임의의 장애 또는 질병의 증상 및/또는 근본 원인을 방지, 치료(예방 포함), 감소 및/또는 개선하기에, 예를 들어 및/또는 아밀로이드증의 방지 또는 억제하기 위한 충분한 제제의 양이다. 일부 구현양태에서, "유효량"은 질병의 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분하다. 유효량은 1회 이상 투여될 수 있다.
발현 제어 서열: 작동적으로 연결된 이종 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열. 발현 제어 서열은 발현 제어 서열이 핵산 서열의 전사 및 적절한 경우 번역을 제어 및 조절할 때 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 단백질-코딩 유전자 앞의 시작 코돈(ATG), 인트론을 위한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위한 해당 유전자의 정확한 해독 틀 유지, 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 용어 "제어 서열"은 최소한 그 존재가 발현에 영향을 미칠 수 있는 성분을 포함하도록 의도되고, 또한 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열이다. 또한 세포-유형 특이적, 조직-특이적 또는 외부 신호 또는 제제에 의해 유도될 수 있는 프로모터-의존성 유전자 발현을 제어할 수 있도록 하기에 충분한 프로모터 요소를 포함하며; 이러한 요소는 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다. 구성적 및 유도성 프로모터가 모두 포함된다(Bitter 등, Methods in Enzymology 153:516-544, 1987 ). 예를 들어, 박테리아 시스템에서 클로닝하는 경우, 박테리오파지 람다의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등과 같은 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 한 구현양태에서, 포유동물 세포 시스템에서 클로닝하는 경우, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 레트로바이러스 긴 말단 반복부, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 사용할 수 있다. 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 생산된 프로모터는 또한 핵산 서열의 전사를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 숙주의 삽입된 유전자 서열의 효율적인 전사를 촉진하는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 복제 기점, 프로모터 뿐만 아니라 형질전환된 세포의 표현형 선택을 허용하는 특정 핵산 서열을 함유한다.
억제하다: 측정가능한 정도로 감소시키다. 예를 들어, 억제는 기능의 완전한 상실 또는 측정되는 측면의 완전한 중단을 요구하지 않는다. 예를 들어, 플라크 형성을 억제한다는 것은 플라크의 추가 성장을 멈추거나 플라크의 추가 성장을 늦추거나 플라크 크기를 줄이는 것을 의미할 수 있다.
질병의 억제 또는 치료: 질병 또는 병태의 완전한 발달을 억제하는 것, 예를 들어 아밀로이드증을 억제하는 것. "치료"는 발병하기 시작한 질병 또는 병리학적 병태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 의미한다. 질병 또는 병리학적 병태와 관련하여 용어 "개선"은 치료의 관찰가능한 유익한 효과를 지칭한다. 유익한 효과는, 예를 들어 감수성인 대상체에서 질병의 임상 증상의 지연된 발병, 질병의 일부 또는 전체 임상 증상의 중증도 감소, 질병의 더 느린 진행, 대상체의 전반적인 건강 또는 웰빙의 개선, 또는 특정 질병에 특이적인 당업계에 잘 알려진 다른 매개변수에 의해 입증될 수 있다. "예방적" 치료는 병리 발생 위험을 감소시킬 목적으로 질병의 징후를 나타내지 않거나 초기 징후만 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다.
아밀로이드 침착물 형성과 관련하여, "억제"는 대조군과 비교할 때와 같이 아밀로이드 침착물의 형성 감소를 방지하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 억제는 대조군과 비교하여 아밀로이드 침착의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 그 이상의 감소를 초래할 수 있다.
단리된: 펩티드, 세포, 핵산 또는 혈청 샘플과 같은 "단리된" 생물학적 성분이 실질적으로 분리되거나, 분리되어 생산되거나, 유기체의 세포에서 다른 생물학적 성분으로부터 정제된 것이고, 성분은, 예를 들어 다른 염색체 및 염색체 외 DNA 및 RNA, 및 단백질과 같이 자연적으로 발생한다. 따라서 "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 이 용어는 또한 화학적으로 합성된 펩티드 및 핵산 뿐만 아니라 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질을 포함한다. "단리된" 또는 "정제된"이라는 용어는 절대적인 순도를 요구하지 않으며; 오히려 상대적인 용어로 사용된다. 따라서, 예를 들어, 단리된 펩티드 제제는 펩티드 또는 단백질이 세포 내의 자연 환경에 있는 것보다 펩티드 또는 단백질이 더 풍부한 제제이다. 바람직하게는, 단백질 또는 펩티드가 제제의 총 펩티드 또는 단백질 함량의 적어도 50%, 예컨대 펩티드 또는 단백질 농도의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 99%를 나타내도록 정제된다.
연결: 본원에 사용된 용어 "연결", "연결된", "합류" 또는 "합류된"은 단백질 및/또는 단백질 도메인을 기능적으로 연결하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 단백질 도메인은 삽입 서열(intervening sequences) 또는 도메인이 있거나 없는 재조합 융합 단백질에서와 같이 공유 결합을 통해 다른 단백질 도메인에 연결될 수 있다. 결합은 또한, 예를 들어 동일한 핵산 가닥에 두 개의 핵산 서열을 함께 배치하여 서열이 함께 발현되도록 하는 것과 같이 두 개의 서열을 함께 통합하는 것을 포함한다.
핵산: 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 뉴클레오티드 단위(리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 관련 자연 발생 구조 변이체 및 합성 비-자연 발생 유사체)로 구성된 중합체, 관련 자연 발생 구조 변이체 및 이의 합성 비-자연 발생 유사체. 따라서, 이 용어는 뉴클레오티드 및 이들 사이의 연결이 비-자연 합성 유사체, 예를 들어 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA) 등을 포함하는 뉴클레오티드 중합체를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 일반적으로 약 50개 이하의 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)로 표시될 때, 이것은 또한 "U"가 "T"를 대체하는 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
뉴클레오티드는 당에 연결된 염기, 예를 들어 피리미딘, 퓨린 또는 이의 합성 유사체에 연결된 염기, 또는 펩티드 핵산(PNA)에서와 같이 아미노산에 연결된 염기를 포함하는 단량체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 하나의 단량체이다. 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 지칭한다.
뉴클레오티드 서열을 설명하기 위해 본원에서 통상적인 표기법이 사용된다: 단일-가닥 뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5'-말단이고; 이중-가닥 뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향을 5'-방향이라고 한다. 초기 RNA 전사체에 뉴클레오티드가 5'에서 3'으로 추가되는 방향을 전사 방향이라고 한다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥을 "코딩 가닥"이라고 하고; 해당 DNA에서 전사된 mRNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5'에서 5' 말단에 위치하는 DNA 가닥 상의 서열을 "업스트림 서열"이라 하고; RNA와 동일한 서열을 갖고 코딩 RNA 전사체의 3'에서 3' 말단에 있는 DNA 가닥 상의 서열을 "다운스트림 서열"이라고 한다.
cDNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 mRNA와 상보적이거나 동일한 DNA를 지칭한다.
코딩은 뉴클레오티드(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 및 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로 작용하는 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드의 특정 뉴클레오티드 서열의 고유한 특성을 말한다. 따라서 유전자에 의해 생산된 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우 유전자는 단백질을 코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 둘 모두는 단백질 또는 해당 유전자 또는 cDNA의 다른 산물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
재조합 핵산은 자연적으로 함께 연결되지 않은 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 이것은 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 증폭되거나 조립된 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터와 같은 핵산 벡터를 포함한다. 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"로 지칭된다. 그런 다음 유전자는 "재조합 폴리펩티드"와 같은 것을 생산하기 위해 재조합 숙주 세포에서 발현된다. 재조합 핵산은 비코딩 기능(예를 들어, 프로모터, 복제 기점, 리보솜-결합 부위 등)도 제공할 수 있다. 서열이 제 1 서열인 폴리뉴클레오티드가 서열이 제 2 서열인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 경우, 제 1 서열은 제 2 서열에 대한 "안티센스"이다.
약제학적으로 허용되는 담체: 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체는 통상적이다. 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995))은 본원에 개시된 융합 단백질의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술한다.
일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 일반적으로 비히클로서 물, 생리 식염수, 균형된 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약제학적 및 생리학적으로 허용되는 유체를 포함하는 주사가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들어, 분말, 알약, 정제 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체에 더하여, 투여될 약제학적 조성물은 습윤제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충제 등과 같은 무독성 보조 물질, 예를 들어 나트륨 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트를 소량 함유할 수 있다.
폴리펩티드: 단량체가 아미드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산 잔기인 중합체. 아미노산이 알파-아미노산인 경우, L-광학 이성질체 또는 D-광학 이성질체가 사용될 수 있으며, L-이성질체가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 아미노산 서열을 포괄하는 것으로 의도되고 당단백질과 같은 변형된 서열을 포함한다. "폴리펩티드"라는 용어는 특히 자연적으로 발생하는 단백질 뿐만 아니라 재조합 또는 합성으로 생산된 단백질을 포함하도록 의도되었다. 일부 실시예에서, 펩티드는 본원에 개시된 펩티드 중 하나 이상이다.
정제된: "정제된"이라는 용어는 절대적인 순도를 요구하지 않는다. 오히려 상대적인 용어로 의도된다. 따라서, 예를 들어 정제된 단백질 제제는 언급된 단백질이 세포 내 또는 생산 반응 챔버(적절한 경우) 내에서 자연 환경에서의 단백질보다 더 순수한 것이다.
재조합: 재조합 핵산은 자연적으로 발생하지 않는 서열을 가지거나 서열의 2개의 달리 분리된 세그먼트의 인공적인 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이 인공적인 조합은 종종 화학적 합성에 의해 또는 더 일반적으로, 예를 들어 유전 공학 기술에 의해 단리된 핵산 세그먼트의 인공 조작에 의해 달성된다.
서열 동일성: 2개의 핵산 서열 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 유사성은 서열 간의 유사성으로 표현되며, 그렇지 않으면 서열 동일성으로 지칭된다. 서열 동일성은 종종 백분율 동일성(또는 유사성 또는 상동성) 측면에서 측정되며; 백분율이 높을수록 두 서열은 더 유사하다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고려 사항을 제시하는 문헌에 기재되어 있다(Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson & Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp Gene 73: 237-244, 1988; Higgins & Sharp CABIOS 5: 151-153, 1989; Corpet 등 Nuc. Acids Res. 16, 10881-90, 1988; Huang 등 Computer Appls. In the Biosciences 8, 155-65, 1992; and Pearson 등 Meth. Mol. Bio. 24, 307-31, 1994. Altschul 등 (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990).
NCBI 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST)(Altschul 등 J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)는 국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD) 및 인터넷에서 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련하여 사용한다.
작동가능하게 연결된: 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 제 1 핵산 서열은 제 2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며 두 개의 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요한 경우 동일한 해독 틀에 있다.
약제: 대상체 또는 세포에 적절하게 투여될 때 원하는 치료 또는 예방 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물.
벡터: 숙주 세포에 도입되어 형질전환된 숙주 세포를 생산하는 핵산 분자. 재조합 DNA 벡터는 재조합 DNA를 갖는 벡터이다. 벡터는 복제 기점과 같은 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 하나 이상의 바이러스로부터 유래된 적어도 일부 핵산 서열을 갖는 재조합 DNA 벡터이다. 벡터라는 용어는 플라스미드, 선형 핵산 분자를 포함하며, 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스 전반에 걸쳐 설명된다.
대상체는 척추동물을 지칭한다. 척추동물은 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다. 대상체는 인간 환자일 수 있다. 대상체는 질병 또는 병태로 고통받거나 고통받는 것으로 의심되는 환자일 수 있고 치료 또는 진단이 필요할 수 있거나 질병 또는 병태의 진행에 대한 모니터링이 필요할 수 있다. 환자는 효능에 대해 모니터링해야 하는 치료 요법을 받고 있을 수도 있다. 일부 예시적인 구현양태에서, 대상체는 알츠하이머병, 헌팅턴병 또는 프리온 질병과 같은 아밀로이드증, 또는 경쇄(AL) 아밀로이드증 및 제 2형 당뇨병 환자에서 볼 수 있는 것과 같은 말초 아밀로이드증을 앓고 있는 대상체를 포함한다.
치료하는 또는 치료라는 용어는 발병하기 시작한 질병 또는 병리학적 병태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 지칭한다. 질병 또는 병리학적 병태와 관련하여 용어 "개선"은 치료의 관찰가능한 유익한 효과를 의미한다. 유익한 효과는, 예를 들어 감수성인 대상체에서 질병의 임상 증상의 지연된 발병, 질병의 일부 또는 전체 임상 증상의 중증도 감소, 질병의 더 느린 진행, 대상체의 전반적인 건강 또는 웰빙의 개선, 또는 특정 질병에 특이적인 당업계에 잘 알려진 다른 매개변수에 의해 입증될 수 있다. "예방적" 치료는 병리 발생 위험을 감소시킬 목적으로 질병의 징후를 나타내지 않거나 초기 징후만 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다.
바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 용어 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 의미한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산 및 아스파라긴-글루타민이다.
본원에서 논의된 바와 같이, 항원 수용체의 아미노산 서열의 사소한 변이는 아미노산 서열의 변이가 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99%를 유지한다면, 본 발명에 포괄되는 것으로 고려된다. 구체적으로, 보존적 아미노산 대체가 고려된다. 보존적 치환은 측쇄와 관련된 아미노산 계열 내에서 일어나는 치환이다. 유전적으로 코딩된 아미노산은 일반적으로 다음 계열로 나뉜다: (1) 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트이고; (2) 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘이고; (3) 비극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고, 그리고 (4) 비하전 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산에는 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 세린 및 트레오닌이 포함된다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 아미노산의 다른 계열에는 (i) 지방족-하이드록시 계열인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 계열인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 계열인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 (iv) 방향족 계열인 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 예를 들어, 류신을 이소류신이나 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 개별적으로 대체하거나, 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산을 유사하게 대체하는 것은 특히 대체가 프레임워크 부위 내의 아미노산을 포함하지 않는 경우 생성된 분자의 결합 또는 특성에 대한 주요 효과를 갖지 않는다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드를 생성하는지 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이적 활성을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 검정은 본원에서 자세히 설명된다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카르복시-말단은 기능적 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공개 또는 독점 서열 데이터베이스와 비교하여 식별할 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터화된 비교 방법은 알려진 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 형태 도메인을 확인하는 데 사용된다. 알려진 3차원 구조로 접히는 단백질 서열을 확인하는 방법이 알려져 있다(Bowie 등 Science 253:164 (1991)). 따라서, 전술한 실시예는 당업자가 본 발명에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 정의하는 데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 형태를 인식할 수 있음을 입증한다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경하고, (4) 결합 친화성을 변경하고, 그리고 (4) 그러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변경한다. 유사체는 자연-발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 돌연변이 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 자연-발생 서열 (바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분에서 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는다(예를 들어, 대체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나 모 서열을 특징짓는 다른 유형의 이차 구조를 파괴하는 경향이 없어야 한다). 당업계에서 인정하는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌에 기술되어 있다(Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton 등 Nature 354:105 (1991)).
"프레임워크" 또는 "FR"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1 - H1(L1) - FR2 - H2(L2) - FR3 - H3(L3) - FR4; 또는 FR1 - CDR-H1(L1) - FR2 - CDR-H2(L2) - FR3 - CDR3-H3(L3) - FR4.
Ⅱ. 아밀로이드에 결합하는 키메라 수용체
AL 아밀로이드증 환자에게 현재 이용가능한 부적절한 치료 옵션에 비추어, 조직 아밀로이드를 효과적으로 제거하기 위한 대안적 접근법에 대한 긴급한 임상적 필요가 있다. 따라서, 본 개시내용은 CAR-T-림프구 항종양 기술을 모델로 하는 키메라 항원 수용체 식세포(CAR-P) 대식세포("M
Figure pct00005
")(Morrissey, M.A., 등, Elife, 2018. 7)에 대한 작제물의 설계에 부분적으로 기초한다. 일부 구현양태에서, 키메라 항원 수용체는 3개의 기능적 영역을 포함하는 모듈식, 합성, 단쇄 단백질이다: (i) 결합 수용체(세포외 도메인); (ii) 스페이서 및 막횡단 영역, 및; (iii) 세포질 신호전달 도메인(세포내)(Zhang, C., 등, Biomark Res, 2017. 5: p. 22). 일부 구현양태에서, 절단가능한 리더 또는 신호 펩티드는 소포체를 통한 통과를 지시하고 원형질막 상의 디스플레이를 촉진하기 위해 단백질의 N-말단에 배치된다(예를 들어, 도 3 참조). 각각의 "모듈"은 세포질 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 ζ 도메인을 통해 유도된 특이적 표적 결합 및 원하는 세포 반응을 달성하기 위해 단백질에서 유래될 수 있다(Daniyan, A.F. and R.J. Brentjens, J Leukoc Biol, 2016. 100(6): p. 1255-1264; Oluwole, O.O. and M.L. Davila, J Leukoc Biol, 2016. 100(6): p. 1265-1272). 일반적으로, 적절한 표적에 대한 세포 표면-발현 키메라 수용체의 결합은 CAR-제시 세포의 클러스터링 및 활성화를 초래한다.
본원에 상세히 기재된 바와 같이, 키메라 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체, 또는 "CAR") 작제물은 AL 아밀로이드와 같은 아밀로이드의 식세포작용을 특이적으로 인식하고 촉진하기 위해 설계되었다. 작제물은 대식세포에서 발현될 수 있다. 실시예에 기재된 바와 같이, CAR은 표적 결합 수용체로서 아밀로이드 반응성 단일쇄 가변 단편(scFv) 또는 아밀로이드 반응성 합성 펩티드를 포함하도록 설계되었다(예를 들어, 도 1 및 도 6 참조; Wall, J.S., 등, Molecules, 2015. 20(5): p. 7657-82; Wall, J.S., 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(46): p. E10839-E10848). 아밀로이드는 무세포성이며 종양 세포(예를 들어, CD47)(Gu, S., 등, J Immunol Res, 2018. 2018: p. 6156757; Russ, A., 등, Blood Rev, 2018. 32(6): p. 480-489; Tong, B. and M. Wang, Future Oncol, 2018. 14(21): p. 2179-2188) 및 MHC 부류 I(Barkal, A.A., 등, Nat Immunol, 2018. 19(1): p. 76-84)와 관련된 "나를 먹지 마세요(don't eat me)"와 관련된 단백질이 부족한 파괴적인 병적 측면이라는 점을 감안할 때 이 접근법의 우수하고 미개척 표적이라고 믿어진다. 또한, 아밀로이드 혈관계에서 쉽게 접근할 수 있다.
아밀로이드(예를 들어, 인간 아밀로이드 원섬유)에 결합하는 키메라 수용체가 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 세포질 도메인을 포함하고, 여기서 세포질 도메인은 활성화시 식세포(예를 들어, 대식세포)를 활성화시키는 수용체의 신호전달 도메인; 막횡단 도메인; 및 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 세포외 도메인은 아밀로이드 결합 영역을 포함한다.
A. 아밀로이드-결합 영역을 포함하는 세포외 도메인
세포외 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 인간 아밀로이드 원섬유의 에피토프와 같은 영역과 상호작용하거나 그렇지 않으면 결합하는 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 아밀로이드-결합 영역은 아밀로이드 침착물 또는 원섬유(예를 들어, 인간 아밀로이드 침착물 또는 원섬유)에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역은 아밀로이드에서 하나 이상의 아밀로이드생성 펩티드에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역에 의해 결합된 아밀로이드는 아밀로이드생성 λ6 가변 도메인 단백질(Vλ6Wil) 또는 아밀로이드생성 면역글로불린 경쇄(AL), Aβ(1-40) 아밀로이드-유사 원섬유 또는 아밀로이드생성 Aβ 전구체 단백질, 또는 혈청 아밀로이드 단백질 A(AA)을 포함한다. 다른 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역에 의해 결합된 아밀로이드는 면역글로불린 중쇄(AH), β2-마이크로글로불린(Aβ2M), 트랜스티레틴 변이체(ATTR), 아포지질단백질 AI(AApoAI), 아포지질단백질 AII(AApoAII), 겔솔린(AGel), 리소자임(ALys), 백혈구 주화성 인자(ALect2), 피브리노겐 a 변이체(AFib), 시스타틴 변이체(ACys), 칼시토닌((ACal), 락타데린(AMed), 섬 아밀로이드 폴리펩티드(AIAPP, islet amyloid polypeptide), 프로락틴(APro), 인슐린(AIns), 이전(prior) 단백질(APrP); α-시누클레인(AαSyn), 타우(ATau), 심방 나트륨 이뇨 인자(AANF), 또는 IAAP, ALκ4, Alλ1 기타 아밀로이드생성 펩티드의 아밀로이드생성 형태를 포함한다. 아밀로이드-결합 영역에 의해 결합된 아밀로이드생성 펩티드는 단백질, 단백질 단편, 또는 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 침착물 또는 아밀로이드 원섬유는 재조합 아밀로이드생성 단백질을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드는 질병의 병적 측면의 일부이다.
1. 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 아밀로이드 결합 영역
아밀로이드-결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역은 표 A에 제시된 바와 같은 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 표 A에 나타낸 바와 같이 P5, P5R, P5G, P8, P9, P19, P20, P31, P37, P39, P42, P43, P44, P48, P50, P58, P5+14, 또는 p5R+14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합은 펩티드는 표 A에 나타낸 바와 같이, P5, P5R, P5G, P8, P9, P19, P20, P31, P37, P39, P42, P43, P44, P48, P50, P58, P5+14, 또는 p5R+14이다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 키메라 수용체를 아밀로이드 침착물에 표적화하는 것으로 여겨진다.
표 A. 아밀로이드 결합 펩티드 서열의 예
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여기서 D = "D 형태" 거울상 이성질체.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 키메라 수용체의 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 1-18 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 그 이상, 예를 들어 서열번호: 1-18 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 약 10 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 펩티드는, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 2016 032949에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 포함된다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 1에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 2의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 2에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 3의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 3에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 4의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 4에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 5의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 5에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 6의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 6의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 6에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 7의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 7의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 7에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 8의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 8의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 8에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 9의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 9에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 10의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 10의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 10에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 11의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 11에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 12의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 12의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 12에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 13의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 13에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 14의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 14에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 15의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 15의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 15에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 16의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 16의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 16에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 17의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 17의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 17에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 기능적 단편은 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 18의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 펩티드로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 18에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 다중 아밀로이드 결합 펩티드를 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 펩티드는 어레이로(즉, 차례로) 조직화된다.
아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편의 전부 또는 일부를 형성하는 아미노산은 입체이성질체 및 자연 발생 아미노산, 비-자연 발생 아미노산, 번역후 변형 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 유도체화된 아미노산, 아미노산을 모방하도록 설계된 작제물 또는 구조물 등의 변형일 수 있다. 본 발명의 펩티드를 형성하는 아미노산은 자연 발생 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산 중 하나 이상, 또는 변형 및 비정상 아미노산 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 구형 단백질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 구형 단백질 도메인은 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 수용체의 막횡단 도메인으로부터 멀리, 따라서 키메라 수용체를 포함하는 세포의 표면으로부터 멀리 위치시키는 스페이서로서 작용한다. 일부 구현양태에서, 구형 단백질 도메인은 약 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 또는 115개 아미노산 길이이다. 일부 구현양태에서, 구형 단백질 도메인은 면역글로불린 도메인이다. 일부 구현양태에서, 구형 단백질 도메인은 불활성이다. 일부 구현양태에서, 구형 단백질 도메인은 기질에 대한 특이적 결합이 결여되어 있다. 일부 구현양태에서, 구형 단백질 도메인은 중쇄 불변 도메인 또는 이의 단편, 예컨대 CH2 도메인 또는 이의 단편이다. 일부 구현양태에서, 구형 단백질 도메인은 형광 단백질, 예를 들어 GFP이다. 일부 구현양태에서, 구형 단백질 도메인은 담체 단백질이다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 중쇄 불변 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 CH2 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 마우스 CH2 도메인 또는 이의 단편이다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 인간 CH2 도메인 또는 이의 단편이다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 IgG2 CH2 도메인 또는 이의 단편이다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 면역글로불린 불변 도메인 또는 이의 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 중쇄 불변 도메인 또는 이의 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 CH2 도메인 또는 이의 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 마우스 CH2 도메인이다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 인간 CH2 도메인이다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 IgG2 CH2 도메인이다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 pFuse 벡터로부터 유래된다.
일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 표 2 또는 표 3에 제시된 CH2 도메인 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 서열번호: 33의 아미노산 세트를 포함한다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 서열번호: 33에 제시된 아미노산에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 서열번호: 33의 아미노산에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, CH2 도메인 또는 이의 단편은 서열번호: 33의 아미노산 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호: 33에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 스페이서에 연결된 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 아밀로이드 결합 영역의 N- 및/또는 C-말단이다. 일부 구현양태에서 스페이서는 약 3 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 발명의 스페이서 펩티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 이 값 사이의 값 또는 범위 포함하여, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100 또는 155개 아미노산 길이이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 가요성 링커이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 전하를 띠지 않는다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 글리신 세린 링커이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 VTPTV의 아미노산 서열(서열번호: 36)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 스페이서에 연결된 아밀로이드-결합 영역은 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 스페이서에 연결된 아밀로이드-결합 영역은 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단 분비 리더 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 CD8의 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 CD8 힌지 도메인의 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더는 서열번호: 38에 제시된 아미노산에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 및 불변 도메인을 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 스페이서, 및 불변 도메인을 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 스페이서, 및 불변 도메인을 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 및 CH2 도메인을 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 스페이서, 및 CH2 도메인을 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 스페이서, 및 CH2 도메인을 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 스페이서, CH2 도메인 및 제 2 스페이서을 포함하는 아밀로이드-결합 영역를 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 표 2에 나타낸 바와 같은 아밀로이드-결합 영역을 포함한다(예를 들어, 표 2에 나타낸 바와 같은 p5+14-스페이서 및 CH2 도메인의 아미노산 서열을 포함한다).
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역은 서열번호: 37에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역은 서열번호: 37에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역은 서열번호: 37의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 영역으로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 37에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 표 3에 나타낸 바와 같은 아밀로이드-결합 영역을 포함한다(예를 들어, 표 3에 나타낸 바와 같이 "최종 CAR-P 작제물"의 세포외 도메인을 포함한다).
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역은 서열번호: 44에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역은 서열번호: 44에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드-결합 영역은 서열번호: 44의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드-결합 영역으로서의 아밀로이드를 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 44에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
특정 예시적 구현양태에서, 다수의 동일하거나 상이한 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편이 세포외 도메인에 연결될 수 있다.
2. 인간 아밀로이드 원섬유에 결합하는 항체로부터 유래된 아밀로이드 결합 영역
아밀로이드 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 11-1F4 항체 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 11-1F4로부터 유래된다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 표 B에 제시된 바와 같이 항체 11-1F4의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 항체 11-1F의 VH 및/또는 VL을 포함한다.
표 B. 11-1F4 CDR의 아미노산 서열
Figure pct00007
특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 (a) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 VH를 포함한다.
특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 (a) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 VL을 포함한다.
한 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
한 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 측면에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH; 및 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL를 포함한다.
또 다른 측면에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 20에 제시된 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 및 서열번호: 19에 제시된 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL을 포함한다.
또 다른 측면에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 35에 제시된 서열을 갖는 VH의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 및 서열번호: 35에 제시된 서열을 갖는 VL의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL을 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 20의 아미노산 서열에 대한 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 20의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 아밀로이드 결합 영역으로서 아밀로이드에 결합하는 능력을 보유하는 VH 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호: 20에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역(즉, FR에서)에서 발생한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 (a) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 VH를 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 19의 아미노산 서열에 대한 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 19의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 아밀로이드 결합 영역으로서 아밀로이드에 결합하는 능력을 보유하는 VL 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호: 19에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역(즉, FR에서)에서 발생한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 (a) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 VL를 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 35의 아미노산 서열에 대한 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 35의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 아밀로이드 결합 영역으로서 아밀로이드에 결합하는 능력을 보유하는 VH 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 13개의 아미노산이 서열번호: 35에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역(즉, FR에서)에서 발생한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 (a) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 VH를 포함한다.
또 다른 측면에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 34의 아미노산 서열에 대한 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 서열번호: 34의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 아밀로이드 결합 영역으로서 아밀로이드에 결합하는 능력을 보유하는 VL 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 11개의 아미노산이 서열번호: 34에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역(즉, FR에서)에서 발생한다. 특정 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 (a) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 VL를 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 항체 11-1F4의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 항체 11-1F4의 VH 및/또는 VL을 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 여기서 VL은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하고, VH는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 20에 제시된 서열을 갖는 각각 VH의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 19에 제시된 서열을 갖는 VL의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3의 아미노산 서열을 각각 포함하는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 인간화 항체 단편(예를 들어, 11-1F4의 인간화 단편)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 11-1F4로부터 유래된 인간화 scFv를 포함한다
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 링커에 의해 융합된 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현양태에서, 링커는 scFv 링커이다. 일부 구현양태에서, 링커는 약 3 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 발명의 링커 펩티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현양태에서, 링커는 이 값 사이의 값 또는 범위 포함하여, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100 또는 155개 아미노산 길이이다. 일부 구현양태에서, 링커는 가요성 링커이다. 일부 구현양태에서, 링커는 전하를 띠지 않는다. 일부 구현양태에서, 링커는 글리신 세린 링커이다. 일부 구현양태에서, 링커는 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 N-말단에서 C-말단으로, VL, 링커, 및 VH를 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 N-말단에서 C-말단으로, VH, 링커, 및 VL을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 스페이서에 연결된 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 아밀로이드 결합 영역의 N- 및/또는 C-말단이다. 일부 구현양태에서 스페이서는 약 3 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 발명의 스페이서 펩티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 이 값 사이의 값 또는 범위 포함하여, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100 또는 155개 아미노산 길이이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 가요성 링커이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 전하를 띠지 않는다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 글리신 세린 링커이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 N-말단 분비 리더 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 절단가능한 N-말단 분비 리더 서열이다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 CD8 α 사슬, 예를 들어, 마우스 CD8 α 사슬의 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 마우스 CD8 α 사슬의 잔기 1-27(예를 들어, UniProtKB No. P01731 [CD8A_마우스]의 잔기 1-27)을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 서열번호: 28에 제시된 아미노산에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, VL, 링커, 및 VH를 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, VH, 링커, 및 VL을 포함한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 단일-사슬 가변 단편(scFv)이다. 일부 구현양태에서, scFv는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현양태에서, VH 및/또는 VL은 본원에 기재된 VH 및 VL 중 임의의 하나이다. 일부 구현양태에서, scFv는 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 N-말단에서 C-말단으로, VL, 링커, 및 VH를 포함한다. 일부 구현양태에서, 링커는 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, VL, 링커, 및 VH를 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, N-말단 분비 리더 서열은 서열번호: 28에 제시된 아미노산에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 아밀로이드 결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 서열번호: 47에 제시된 아미노산에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 서열번호:47의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, scFv는 서열번호: 47의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 결합 영역으로서 아밀로이드에 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 47에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 아밀로이드-결합 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 서열번호: 48에 제시된 아미노산에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, scFv는 서열번호: 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, scFv는 서열번호: 48의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 아밀로이드 결합 영역으로서 아밀로이드에 결합하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 48에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, VL, 링커, VH, 및 스페이서를 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, VH, 링커, VL, 및 스페이서를 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포외 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, scFv 및 스페이서를 포함한다. 세포외 도메인의 예시적인 구조는 도 6에 도시되어 있다(예를 들어, 다이어그램 (i) 11-1F4 참조).
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 약 100, 10, 1, 0.1, 0.01 μM 미만인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 이 값 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하여, 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 또는 100 μM인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 500, 100, 10, 또는 1 nM 미만인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000 또는 2200 nM 미만인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 이 값 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하여, 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000 또는 2200 nM인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 약 40-50 nM인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 40-50 nM인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 50 nM 미만인 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 인간 아밀로이드 원섬유에 결합하는 c11-1F4의 Kd보다 작은 해리 상수(Kd)로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 약 0.01, 0.1, 또는 1 μM 미만인 항체 농도(EC50)에서 최대 결합의 절반으로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 이 값 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하여, 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μM인 항체 농도(EC50)에서 최대 결합의 절반으로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 약 1, 10, 100 또는 1000 nM 미만인 항체 농도(EC50)에서 최대 결합의 절반으로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 이 값들 사이의 임의의 값 또는 범위를 포함하여, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 100, 250, 500, 750 또는 1000 nM인 항체 농도(EC50)에서 최대 결합의 절반으로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 약 17 nM, 7 nM, 16 nM, 75 nM 또는 95 nM인 항체 농도(EC50)에서 최대 결합의 절반으로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 약 10 nM, 20 nM, 80 nM, 또는 100 nM 미만인 항체 농도(EC50)에서 최대 결합의 절반으로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 영역은 인간 아밀로이드 원섬유에 대한 c11-1F4 결합의 EC50 미만인 항체 농도(EC50)에서 최대 결합의 절반으로 인간 아밀로이드 원섬유에 결합한다.
해리 상수 및 EC50을 계산하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 및 EuLISA를 포함한다. 일부 구현양태에서 해리 상수는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 Len(1-22) 단량체 펩티드에 대한 결합을 측정함으로써 결정된다. 일부 구현양태에서, EC50은 EuLISA를 사용하여 결정된다. 일부 구현양태에서, EC50은 rVλ6Wil 원섬유, Per125 wtATTR 추출물, Ken ATTR 추출물, SHI ALλ 간 추출물, 또는 TAL ALκ 간 추출물에 대한 결합 수준을 측정하기 위해 EuLISA를 사용하여 결정된다.
B. 막횡단 도메인
본원에서는 막횡단 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 세포외 도메인을 세포질 도메인에 연결한다.
막횡단 도메인은 자연 발생 단백질 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 자연 발생 단백질인 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 톨(Toll)-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 및 TLR9(의 막횡단 영역(들)을 적어도 포함한다)로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 Ig(면역글로불린) 힌지를 포함한다.
일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 N-말단 스페이서(예를 들어, 도 6에 도시된 바와 같이 세포외 도메인 및 막횡단 도메인 사이의 스페이서)에 융합된다. 일부 구현양태에서 스페이서는 약 3 내지 약 55개의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 발명의 스페이서 펩티드는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55개 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 이 값 사이의 값 또는 범위를 포함하여, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100 또는 155개 아미노산 길이이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 가요성 링커이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 전하를 띠지 않는다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 글리신 세린 링커이다. 일부 구현양태에서, 스페이서는 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 표 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 표 3에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 CD8로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 α 사슬로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 마우스 CD8 α 사슬로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 마우스 CD8 α 사슬로부터의 잔기 148-218(예를 들어, UniProtKB No. P01731의 잔기 148-218)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호: 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호: 40의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8 α 사슬로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호: 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호: 57의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 합성 막횡단 도메인이다. 막횡단 도메인이 합성인 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 구현양태에서, 막횡단 도메인은 합성 막횡단 도메인의 각 끝에 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항을 포함한다.
C. 세포질 도메인
세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 활성화시 식세포(예를 들어, 대식세포)를 활성화시키는 수용체의 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 식세포작용 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다(예를 들어, Morrissey, M.A., 등, Elife, 2018. 7 참조). 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 CD19의 단편 또는 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 CD3ζ의 단편 또는 영역을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 FcR의 단편 또는 영역, 예를 들어 FcRγ 서브유닛을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 CD19, CD3ζ, 및/또는 FcR로부터 유래된다. 예시적인 세포질 도메인은 문헌(Morrissey, M.A., 등, Elife, 2018. 7)에 추가로 설명되어 있다.
일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 세포질 도메인 I, 세포질 도메인 II, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 1 또는 표 3에 제시된 세포질 도메인 I 또는 세포질 도메인 II의 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 CD19로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, CD19로부터 유래된 세포질 도메인은 "세포질 도메인 I"로 지칭된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 마우스 CD19로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 인간 CD19로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 마우스 CD19의 아미노산 잔기 500-534(예를 들어, UniProtKB No. P25918의 아미노산 잔기 500-534)를 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 30의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인으로서 식세포를 활성화하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 30에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 42의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인으로서 식세포를 활성화시키는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 42에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 Fc 수용체(FcR)로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, Fc 수용체로부터 유래된 세포질 도메인은 "세포질 도메인 II"로 지칭된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 마우스 Fc ERG 전구체의 아미노산 잔기 19-86(예를 들어, UniProtKB No. P20491의 아미노산 잔기 19-86)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 31의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인으로서 식세포를 활성화하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 31에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 41의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 41의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인으로서 식세포를 활성화시키는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 41에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 45의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 45의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인으로서 식세포를 활성화시키는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 45에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 CD19 및 FcR로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 마우스 CD19 및 FcR로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 마우스 CD19의 아미노산 잔기 500-534(예를 들어, UniProtKB No. P25918의 아미노산 잔기 500-534) 및 마우스 Fc ERG 전구체의 아미노산 잔기 19-86(예를 들어, UniProtKB No. P20491의 아미노산 잔기 19-86)을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 30의 아미노산 서열 및 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 30의 아미노산 서열 및 서열번호: 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 세포질 도메인은 서열번호: 30의 아미노산 서열 및/또는 서열번호: 31의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 서열번호: 30의 아미노산 서열 및 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인으로서 식세포를 활성화하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 30 및 서열번호: 31에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, FcR로부터 유래된 도메인 및 CD19로부터 유래된 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 2개 이상의 세포질 도메인은 펩티드 스페이서에 의해 연결된다.
일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 만노스 수용체, 상보체 수용체 1,3 또는 4, 스캐빈저 수용체, 또는 FC 감마 수용체이다.
일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 공동-자극 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 톨-유사 수용체 2로부터 유래된 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포외 도메인에 대한 아밀로이드의 결합은 키메라 수용체의 세포질 도메인을 활성화시킨다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체의 세포질 도메인의 활성화는 수용체의 신호전달 도메인의 활성화를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체의 세포질 도메인의 활성화는 식세포(예를 들어, 대식세포)의 활성화를 초래한다. 일부 구현양태에서, 활성화된 식세포는 아밀로이드를 식세포한다.
D. 전장 키메라 수용체 작제물
아밀로이드(예를 들어, 인간 아밀로이드 원섬유)에 결합하는 키메라 수용체가 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 활성화시 식세포(예를 들어, 대식세포)를 활성화시키는 수용체의 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인; 막횡단 도메인; 및 아밀로이드 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 키메라 수용체의 세포질 도메인, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인은 본원에 기재된 세포질 도메인, 막횡단 도메인 및 세포외 도메인 중 임의의 하나일 수 있다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 세포외 도메인의 N-말단에 N-말단 분비 리더 서열을 추가로 포함한다. 키메라 수용체의 구조의 예시적인 다이어그램이 도 1 및 도 6에 제공되고, 키메라 수용체의 예시적인 아미노산 서열은 표 C에 제공된다.
표 C. 예시적인 전장 키메라 수용체 작제물의 아미노산 서열
Figure pct00008
Figure pct00009
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 세포외 도메인; 막횡단 도메인; 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 제 1 스페이서, CH2 도메인, 제 2 스페이서, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 제 1 스페이서, CH2 도메인, 제 2 스페이서, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 FcR로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 FcR 및 CD19로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 3에 나타낸 바와 같이 세포질 도메인 II를 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 3에 나타낸 바와 같이 세포질 도메인 I 및 세포질 도메인 II를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 표 3에 나타낸 바와 같이 CAR-P이다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 표 C에 나타낸 바와 같은 펩티드-기반 CAR이다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단 분비 리더 서열이 있거나 없는, 표 3에서 CAR-P 작제물-345aa로 제시된 서열에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체의 각 성분은 함께 또는 별도로 표 3의 CAR-P 작제물-345aa의 상응하는 성분에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, p5를 포함하는 세포외 도메인, 제 1 스페이서, IgG2 CH2 도메인, 제 2 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, p5를 포함하는 세포외 도메인, 제 1 스페이서, IgG2 CH2 도메인, 제 2 스페이서, CD8 α사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, p5를 포함하는 세포외 도메인, 제 1 스페이서, IgG2 CH2 도메인, 제 2 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR에서 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, p5를 포함하는 세포외 도메인, 제 1 스페이서, IgG2 CH2 도메인, 제 2 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, p5+14를 포함하는 세포외 도메인, 제 1 스페이서, IgG2 CH2 도메인, 제 2 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, p5+14를 포함하는 세포외 도메인, 제 1 스페이서, IgG2 CH2 도메인, 제 2 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR 및 CD19에서 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, p5+14를 포함하는 세포외 도메인, 제 1 스페이서, IgG2 CH2 도메인, 제 2 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인 및 FcR에서 유래한 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, p5+14를 포함하는 세포외 도메인, 제 1 스페이서, IgG2 CH2 도메인, 제 2 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR 및 CD19에서 유래한 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, p5+14 및 서열번호: 32에 제시된 아미노산 서열에 따른 제 1 스페이서를 포함하는 세포외 도메인, 및 서열번호: 33에 제시된 아미노산 서열에 따른 CH2 도메인; 제 2 스페이서; 막횡단 도메인; 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, p5+14 및 서열번호: 32에 제시된 아미노산 서열에 따른 제 1 스페이서를 포함하는 세포외 도메인, 및 서열번호: 33에 제시된 아미노산 서열에 따른 CH2 도메인; 제 2 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, p5+14 및 서열번호: 32에 제시된 아미노산 서열에 따른 제 1 스페이서를 포함하는 세포외 도메인, 및 서열번호: 33에 기재된 아미노산 서열에 따른 CH2 도메인; 제 2 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열에 따른 N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편 및 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열에 따른 제 1 스페이서를 포함하는 세포외 도메인, 및 서열번호: 33에 제시된 아미노산 서열에 따른 CH2 도메인; 제 2 스페이서 및 서열번호: 40에 기재된 아미노산 서열에 따른 막횡단 도메인; 및 서열번호: 41에 제시된 아미노산 서열에 따른 세포질 도메인 II 및 서열번호: 42에 제시된 아미노산 서열에 따른 세포질 도메인 I을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 서열번호: 38에 제시된 아미노산 서열에 따른 N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편 및 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열에 따른 제 1 스페이서를 포함하는 세포외 도메인, 및 서열번호: 33에 제시된 아미노산 서열에 따른 CH2 도메인; 제 2 스페이서 및 서열번호: 40에 기재된 아미노산 서열에 따른 막횡단 도메인; 및 서열번호: 41에 제시된 아미노산 서열에 따른 세포질 도메인 II를 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편 및 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열에 따른 제 1 스페이서를 포함하는 세포외 도메인, 및 서열번호: 33에 제시된 아미노산 서열에 따른 CH2 도메인; 제 2 스페이서 및 서열번호: 40에 기재된 아미노산 서열에 따른 막횡단 도메인; 및 서열번호: 41에 제시된 아미노산 서열에 따른 세포질 도메인 II 및 서열번호: 42에 제시된 아미노산 서열에 따른 세포질 도메인 I을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편 및 서열번호: 39에 제시된 아미노산 서열에 따른 제 1 스페이서를 포함하는 세포외 도메인, 및 서열번호: 33에 제시된 아미노산 서열에 따른 CH2 도메인; 제 2 스페이서 및 서열번호: 40에 기재된 아미노산 서열에 따른 막횡단 도메인; 및 서열번호: 41에 제시된 아미노산 서열에 따른 세포질 도메인 II를 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편(예를 들어, p5 또는 p5-14), 제 1 스페이서, 및 CH2 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 제 2 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 43의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 43의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 43에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편(예를 들어, p5 또는 p5-14), 제 1 스페이서, 및 CH2 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 제 2 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 51의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 51의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 51에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편(예를 들어, p5 또는 p5-14), 제 1 스페이서, 및 CH2 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 제 2 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 52의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 52에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편(예를 들어, p5 또는 p5-14), 제 1 스페이서, 및 CH2 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 제 2 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 53의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 53의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 53에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 항체 단편 또는 이의 기능적 단편(예를 들어, 11-1F4로부터 유래된 항체 단편 또는 이의 기능적 단편)을 포함하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, VL, 링커, VH, 스페이서, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, VL, 링커, VH, 스페이서, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, VH는 (a) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL은 (a) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 FcR로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 FcR 및 CD19로부터 유래된다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 1에 나타낸 바와 같은 세포질 도메인 II를 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 1에 나타낸 바와 같이 세포질 도메인 I 및 세포질 도메인 II를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 표 1에 나타낸 바와 같은 11-1F4CAR탠덤 수용체이다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 표 G에 나타낸 바와 같은 scFv-기반 CAR이다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 11-1F4로부터 유래된 항체 단편 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 세포외 도메인, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 11-1F4로부터 유래된 항체 단편 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 세포외 도메인, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 11-1F4로부터 유래된 VL, 링커, 11-1F4로부터 유래된 VH, 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 11-1F4로부터 유래된 VL, 링커, 11-1F4로부터 유래된 VH, 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인, 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 11-1F4로부터 유래된 VL, 링커, 11-1F4로부터 유래된 VH, 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 11-1F4로부터 유래된 VL, 링커, 11-1F4로부터 유래된 VH, 스페이서, CD8 α 사슬로부터 유래된 막횡단 도메인 및 FcR 및 CD19에서 유래한 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 서열번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 분비 리더 서열, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 서열번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커, 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 스페이서 및 서열번호: 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 도메인, 및 서열번호: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 서열번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 분비 리더 서열, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 서열번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커, 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 스페이서 및 서열번호: 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 도메인, 및 서열번호: 31에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 서열번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커, 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 스페이서 및 서열번호: 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 도메인, 및 서열번호: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 서열번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 서열번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv 링커, 서열번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 스페이서 및 서열번호: 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 도메인, 및 서열번호: 31에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 11-1F4로부터 유래된 scFv를 포함하는 세포외 도메인; 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 50의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 50에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 11-1F4로부터 유래된 scFv를 포함하는 세포외 도메인; 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 49의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 49에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 11-1F4로부터 유래된 scFv를 포함하는 세포외 도메인; 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR 및 CD19로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 55의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 55의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 55에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 N-말단에서 C-말단으로, 11-1F4로부터 유래된 scFv를 포함하는 세포외 도메인; 스페이서; CD8 α 사슬에서 유래된 막횡단 도메인; 및 FcR로부터 유래된 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 54의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체는 서열번호: 54의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 54에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 키메라 수용체는 아밀로이드 침착물 또는 원섬유(예를 들어, 인간 아밀로이드 침착물 또는 원섬유)에 결합한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체의 아밀로이드 결합 영역은 아밀로이드에서 하나 이상의 아밀로이드생성 펩티드에 결합한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체의 아밀로이드-결합 영역에 의해 결합된 아밀로이드는 아밀로이드생성 λ6 가변 도메인 단백질(Vλ6Wil) 또는 아밀로이드생성 면역글로불린 경쇄(AL), Aβ(1-40) 아밀로이드-유사 원섬유 또는 아밀로이드생성 Aβ 전구체 단백질 또는 혈청 아밀로이드 단백질 A(AA)를 포함한다. 다른 구현양태에서, 키메라 수용체의 아밀로이드-결합 영역에 의해 결합된 아밀로이드는 면역글로불린 중쇄(AH), β2-마이크로글로불린(Aβ2M), 트랜스티레틴 변이체(ATTR), 아포지질단백질 AI(AApoAI), 아포지질단백질 AII( AApoAII), 젤솔린(AGel), 리소자임(ALys), 백혈구 주화성 인자(ALect2), 피브리노겐 a 변이체(AFib), 시스타틴 변이체(ACys), 칼시토닌((ACal), 락타데린(AMed), 섬 아밀로이드 폴리펩티드(AIAPP), 프로락틴(APro), 인슐린(AIns), 사전 단백질(APrP), α-시누클레인(AαSyn), 타우(ATau), 심방 나트륨 이뇨 인자(AANF), 또는 IAAP, ALκ4, Alλ1 기타 아밀로이드생성 펩티드의 아밀로이드생성 형태를 포함한다. 키메라 수용체의 아밀로이드-결합 영역에 의해 결합된 아밀로이드생성 펩티드는 단백질, 단백질 단편, 또는 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 침착물 또는 아밀로이드 원섬유는 재조합 아밀로이드생성 단백질을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드는 질병의 병적 측면의 일부이다.
일부 구현양태에서, 본원에 기재된 키메라 수용체의 세포질 도메인은 활성화시 식세포(예를 들어, 대식세포)를 활성화시키는 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인의 신호전달 도메인은 상기 기재된 바와 같이 키메라 수용체가 아밀로이드 침착물 또는 원섬유에 결합할 때 활성화된다. 일부 구현양태에서, 식세포의 활성화는 아밀로이드 침착물 또는 원섬유의 식세포작용을 촉진한다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 검출가능한 표지에 접합된다. 일부 구현양태에서, 검출가능한 표지는 방사성핵종(예를 들어, I-125, I-123, I-131, Zr-89, Tc-99m, Cu-64, Br-76, F-18); 효소(양고추냉이 퍼옥시다제); 비오틴; 및 형광단 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 단백질을 검출가능하게 표지하기 위해 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용할 수 있고/있거나 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위해 개조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 수용체는 방사성 동위원소로 방사성 표지되거나 형광 태그 또는 화학발광 태그로 표지될 수 있다. 예시적인 방사성 동위원소는, 예를 들어 18F, 111In, 99mTc, 및 123I, 및 125I를 포함한다. 이들 및 다른 방사성 동위원소는, 예를 들어 키메라 수용체에 공유적으로 연결된 DTPA 또는 DOTA와 같은 킬레이트제의 사용을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 잘 알려진 화학 반응을 사용하여 키메라 수용체에 부착될 수 있다. 형광 또는 화학발광 태그의 예에는 라이신, 시스테인, 글루탐산 및 아스파르트산 측쇄와의 반응에 의해 키메라 수용체에 접합될 수 있는 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 알렉사 염료 및 루시페라제가 포함된다. 하나의 예시적인 구현양태에서, 표지는 사용되는 태그에 적절한 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 마이크로플레이트 판독기 또는 형광계를 사용하여 검출된다. 방사성 표지는, 예를 들어 방사성 방출 유형에 따라 감마 또는 섬광 계수기를 사용하고 특정 방사성 핵종의 정확한 검출에 적합한 에너지 창을 사용하여 검출할 수 있다. 그러나 방사성 동위원소 검출을 위한 임의의 다른 적절한 기술을 사용하여 표지를 검출할 수도 있다. 일부 구현양태에서, 검출가능한 표지는 125I이다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 형광 단백질에 융합된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 GFP에 융합된다.
또한, 본원에 기재된 임의의 키메라 수용체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
III. 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 키메라 수용체의 제조 방법
A. 키메라 수용체를 코딩하는 핵산
아밀로이드에 결합하는 키메라 수용체를 코딩하는 핵산(들)이 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 핵산은 본원에 기재된 키메라 수용체 중 임의의 하나를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은, 활성화시 대식세포를 활성화시키는 수용체의 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인; 막횡단 도메인; 및 아밀로이드 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 N-말단에서 C-말단으로, 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다.
일부 구현양태에서, 핵산은 키메라 수용체를 코딩하고, 여기서 키메라 수용체는 아밀로이드 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 아밀로이드 결합 영역은 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 아밀로이드 결합 영역은 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 아밀로이드 결합 영역 중 임의의 하나일 수 있다.
일부 구현양태에서, 핵산은 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 N-말단에서 C-말단으로, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 제 1 스페이서, CH2 도메인, 제 2 스페이서, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편, 제 1 스페이서, CH2 도메인, 제 2 스페이서, 막횡단 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 서열번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 3에 나타낸 바와 같이 세포질 도메인 II를 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 3에 나타낸 바와 같이 세포질 도메인 I 및 세포질 도메인 II를 포함한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 표 3에 나타낸 바와 같이 CAR-P를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 분비 리더 서열이 있거나 없이, 표 3에서 CAR-P 작제물-345aa로서 제시된 서열에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산에 의해 코딩되는 키메라 수용체의 각 성분은 함께 또는 별도로, 표 3의 CAR-P 작제물-345aa의 상응하는 성분에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 43의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 43의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 43에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 51의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 51의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 51에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 52의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 52의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 52에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 53의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 53의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 53에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 핵산은 키메라 수용체를 코딩하고, 여기서 키메라 수용체는 아밀로이드-결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 아밀로이드 결합 영역은 11-1F4 항체 단편을 포함한다.
일부 구현양태에서, 핵산은 N-말단에서 C-말단으로, 11-1F4 항체 단편을 포함하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 N-말단에서 C-말단으로, VL, 링커, VH, 스페이서, 막횡단 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 N-말단에서 C-말단으로, N-말단 분비 리더 서열, VL, 링커, VH, 스페이서, 막횡단 도메인, 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, VH는 (a) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; VL은 (a) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 1에 나타낸 바와 같은 세포질 도메인 II를 포함한다. 일부 구현양태에서, 세포질 도메인은 표 1에 나타낸 바와 같이 세포질 도메인 I 및 세포질 도메인 II를 포함한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 표 1에 나타난 바와 같이 11-1F4CAR탠덤 수용체를 코딩한다.
일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 49의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 49에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 50 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 50에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 54의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 54의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 54에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 일부 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 55의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 핵산은 서열번호: 55의 아미노산 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체로서 아밀로이드에 결합하고 식세포를 활성화하는 능력은 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체를 코딩한다. 특정 구현양태에서, 총 1 내지 15개의 아미노산이 서열번호: 55에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
B. 벡터, 숙주 세포
일부 구현양태에서, 본원에 제공된 핵산은 하나 이상의 벡터에 존재한다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구현양태에서, 벡터는 본 개시내용의 키메라 수용체를 코딩하는 핵산(들)을 포함한다.
일부 구현양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다.
일부 구현양태에서, 벡터는 pEF-ENTR A 벡터이다.
일부 구현양태에서, 벡터는 다중 유전자 산물을 코딩한다. 일부 구현양태에서, 벡터는 바이시스트론 벡터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 제 2 단백질 산물, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 구현양태에서, 벡터는 트랜스포사제 벡터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 피기백(piggyBac) 벡터이다.
일부 구현양태에서, 벡터는 프로모터를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 코딩하는 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현양태에서, 프로모터는 편재적으로 발현되는 프로모터이다. 일부 구현양태에서, 벡터는 EF1-a 프로모터를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 코딩하는 핵산은 EF1-a 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 구현양태에서, 벡터는 대식세포-특이적 조절 요소, 예를 들어 대식세포-특이적 프로모터를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 코딩하는 핵산은 대식세포-특이적 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 코딩하는 핵산은 대식세포에서 발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
또한, 본원에 기재된 키메라 수용체 중 임의의 것을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현양태에서, 숙주 세포는 본 개시내용의 키메라 수용체를 코딩하는 핵산(들)을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 구현양태에서, 척추동물 세포는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어, Graham 등, J. Gen Virol. 36:59 (1977)에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); TRI 세포(예를 들어 Mather 등 ., Annals NY. Acad. Sci. 383:44-68(1982)에 기재된 것), MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 문헌을 참조한다(Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
IV. 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포
본 개시내용의 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포가 본원에서 제공된다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 중 임의의 하나를 포함하는 조작된 세포가 제공된다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 식세포이다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포이다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 대식세포이다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 뮤린 대식세포이다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 RAW264.7 세포(예를 들어, ATCC TIB-71)이다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 인간 대식세포이다.
일부 구현양태에서, 조작된 세포는 본 개시내용의 키메라 수용체를 발현한다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 키메라 수용체를 코딩하는 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 핵산 중 임의의 것)으로부터 키메라 수용체를 발현한다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 벡터 중 임의의 하나)로부터 키메라 수용체를 발현한다. 일부 구현양태에서, 핵산 및/또는 벡터는 조작된 세포의 게놈 내로 혼입된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 조작된 세포에서 일시적으로 발현된다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 키메라 수용체를 코딩하는 mRNA로부터 키메라 수용체를 발현한다. 일부 구현양태에서, 조작된 세포는 조작된 세포의 원형질막에 키메라 수용체를 포함한다.
일부 구현양태에서, 세포는 대상체로부터 수득되고, 세포는 본 개시내용의 키메라 수용체의 도입에 의해 조작된다. 대상체의 비제한적 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 트랜스제닉 종을 포함한다. 일부 구현양태에서, 대상체는 인간이다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 탯줄 및 종양을 포함하는 여러 출처에서 수득할 수 있다. 특정 구현양태에서, 당업계에서 이용가능한 임의의 수의 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 전구 세포주가 사용될 수 있다. 특정 구현양태에서, 세포는 피콜(Ficoll) 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일부 구현양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집 또는 백혈구 성분채집에 의해 수득된다. 성분채집 산물은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 포함한다. 성분채집에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 위치시키기 위해 인산염완충 식염수(PBS) 또는 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족하거나 후속 처리 단계를 위해 2가 양이온이 전부는 아니지만 많이 부족할 수 있는 세척액으로 세척할 수 있다. 세척 후, 세포는 예를 들어 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS와 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
일부 구현양태에서, 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 림프구 및 적혈구를 고갈시킴으로써 말초 혈액으로부터 단리된다. 또는 세포를 탯줄에서 단리할 수 있다. 어떤 경우든, 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다.
그렇게 단리된 세포는 CD34, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 또는 CD20을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 항원을 발현하는 세포가 고갈될 수 있다. 이들 세포의 고갈은 단리된 항체, 복수액과 같은 항체를 포함하는 생물학적 샘플, 물리적 지지체에 결합된 항체, 및 세포 결합 항체를 사용하여 달성될 수 있다.
음성 선택에 의한 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포 집단의 농축은 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 지시된 항체의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구현양태에서, 농축은 음성 자기 면역부착 또는 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 지시된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택에 의해 수행된다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포에 대한 세포 집단의 농축은 일반적으로 CD34, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 또는 CD20에 대한 항체를 포함하는 모노클로날 항체 칵테일을 사용하여 달성할 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 세포 집단의 단리 동안, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도가 변할 수 있다. 특정 구현양태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는(즉, 세포의 농도를 증가시키는 것이) 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 구현양태에서, 20억 세포/ml의 농도가 사용된다. 한 구현양태에서, 10억 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 구현양태에서, 1억 초과 세포/ml가 사용된다. 추가 구현양태에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 백만 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 구현양태에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 백만 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 구현양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도의 세포를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다.
일부 구현양태에서, 본 발명의 세포(예를 들어, 조작된 단핵구, 대식세포, 및/또는 수지상 세포)를 포함하는 세포 집단이 제공된다. 세포 집단의 예는 말초혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, 정제된 단핵구 집단, 대식세포 또는 수지상 세포, 및 세포주로부터 유래된 조작된 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 구현양태에서, 말초 혈액 단핵 세포는 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현양태에서, 조작된 단핵구, 대식세포, 또는 수지상 세포의 집단을 포함하는 정제된 세포의 집단이 제공된다.
일부 구현양태에서, 조작된 세포는 상향조절된 M1 마커 및 하향조절된 M2 마커를 갖는다. 예를 들어, HLA DR, CD86, CD80 및 PDL1과 같은 적어도 하나의 M1 마커는 조작된 세포에서 상향조절된다. 또 다른 실시예에서, CD206, CD163과 같은 적어도 하나의 M2 마커는 조작된 세포에서 하향조절된다. 한 구현양태에서, 조작된 세포는 적어도 하나의 상향조절된 M1 마커 및 적어도 하나의 하향조절된 M2 마커를 갖는다.
일부 구현양태에서, 조작된 세포는 면역조절 세포이다. 면역조절 세포는 CD4 T 세포(헬퍼 T 세포), CD8 T 세포(세포독성 T 세포, CTL), 및 기억 T 세포 또는 기억 줄기 세포 T 세포와 같은 T-세포를 포함한다. 또 다른 구현양태에서, T-세포는 자연 살해 T-세포(NK T-세포)를 포함한다.
한 구현양태에서, 조작된 세포는 자연 살해 세포를 포함한다. 자연 살해 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 한 구현양태에서, 자연 살해 세포는 NK-92 세포와 같은 세포주를 포함한다. NK 세포주의 추가 예는 NKG, YT, NK-YS, HANK-1, YTS 세포, 및 NKL 세포를 포함한다.
NK 세포는 GvHD의 위험 없이 항종양 효과를 매개하고 T 세포에 비해 수명이 짧다. 따라서, NK 세포는 암세포를 파괴한 직후 소진되어 변형된 세포를 제거할 CAR 작제물에 대한 유도성 자살 유전자의 필요성을 감소시킨다.
조작된 세포는 말초 혈액, 제대혈, 골수, 종양 침윤 림프구, 림프절 조직, 또는 흉선 조직으로부터 수득될 수 있다. 조작된 세포는 태반 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 세포를 포함할 수 있다. 조작된 세포는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 랫트 및 이들의 트랜스제닉 종으로부터 수득될 수 있다. 조작된 세포는 확립된 세포주로부터 수득될 수 있다.
상기 세포는 임의의 공지된 수단에 의해 수득될 수 있다. 조작된 세포는 조작된 세포의 수용자에 대해 자가, 동계, 동종이계 또는 이종일 수 있다.
"자가"라는 용어는 나중에 그 개체에게 재도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. "동종이계"이라는 용어는 물질이 도입된 개체와 동일한 종의 다른 동물에서 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 이상의 개체는 하나 이상의 유전자좌에 있는 유전자가 동일하지 않을 때 서로 동종이계라고 한다. 일부 측면에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원 동맹과 상호작용하기 위해 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
일부 구현양태에서, 조작된 세포에서 표적화된 이펙터 활성은 CD47 또는 SIRPα 활성의 억제에 의해 향상된다. CD47 및/또는 SIRPα 활성은 세포를 항-CD47 또는 항-SIRPα 항체로 처리함으로써 억제될 수 있다. 대안적으로, CD47 또는 SIRPα 활성은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다.
일부 구현양태에서, 본 개시내용의 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 아밀로이드에 대한 결합은 (예를 들어, 아밀로이드에 대한 아밀로이드 결합 영역의 결합을 통해) 인간 아밀로이드 원섬유의 식세포작용을 촉진한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 인간 아밀로이드 원섬유를 옵소닌화한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 세포는 rVλ6Wil 원섬유를 옵소닌화한다. 일부 구현양태에서, 인간 아밀로이드 원섬유를 본 개시내용의 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포와 접촉시키는 단계는 세포에 의한 인간 아밀로이드 원섬유의 흡수를 촉진한다. 일부 구현양태에서, 인간 아밀로이드 원섬유를 본 개시내용의 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포와 접촉시키는 단계는 인간 아밀로이드 원섬유의 옵소닌화를 촉진한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 아밀로이드를 식세포한다.
키메라 수용체(예를 들어, 본원에 기재된 키메라 수용체 중 임의의 하나)를 포함하는 조작된 세포를 생성하는 방법이 또한 본원에 제공된다. CAR-발현 세포는 CAR을 코딩하는 cDNA로 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 표준 형질주입 또는 레트로바이러스 형질도입을 사용하여 생성될 수 있다. 그런 다음 CAR 단백질이 원형질 세포막에 표시된다. 이 분자생물학 기술은 당업계에 알려져 있으며 일반적으로 종양 세포-지시된 CAR-T T 세포 림프구의 발달과 관련이 있다(Chavez, J.C. and F.L. Locke, Best Pract Res Clin Haematol, 2018. 31(2): p. 135-146; Cummins, K.D. and S. Gill, Leuk Lymphoma, 2018. 59(7): p. 1539-1553; Filley, A.C., 등, Front Oncol, 2018. 8: p. 453; Genta, S., 등, Expert Opin Biol Ther, 2018. 18(4): p. 359-367; Ghione, P., 등, Curr Hematol Malig Rep, 2018. 13(6): p. 494-506; Guo, Y., 등, Protein Cell, 2018. 9(6): p. 516-526).
일부 구현양태에서, CAR을 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 벡터)는 임의의 공지된 수단에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 구현양태에서, 폴리뉴클레오티드는 형질주입 또는 형질도입을 사용하여 도입된다. 일부 구현양태에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터이다.
상기 기재된 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되어 조작된 세포를 제공하면, 조작된 세포가 확장된다. 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조작된 세포는 임의의 공지된 수단에 의해 확장된다.
확장된 세포는 본 개시내용에 따라 단리된 조작된 세포를 제공하기 위해 임의의 공지된 수단에 의해 단리된다.
V. 치료 방법, 아밀로이드 제거 방법
일부 구현양태에서, 아밀로이드를 제거하는 방법(예를 들어, 아밀로이드 침착물 제거)이 본원에 제공된다. 일부 구현양태에서, 방법은 아밀로이드 침착물을 본원에 기재된 키메라 수용체 중 임의의 하나와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현양태에서, 방법은 아밀로이드 침착물을 본원에 기재된 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포 중 임의의 하나와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드는 AA, AL, AH, ATTR, Aß2M, 야생형 TTR, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALect2, Afib, ACys, ACal, AMedin, AIAPP, APro, AIns, APrP, 또는 Aβ이다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체에 의해 접촉된 아밀로이드는 아밀로이드생성 λ6 가변 도메인 단백질(Vλ6Wil) 또는 아밀로이드생성 면역글로불린 경쇄(AL), Aβ(1-40) 아밀로이드-유사 원섬유 또는 아밀로이드생성 Aβ 전구체 단백질, 또는 혈청 아밀로이드 단백질 A(AA)를 포함한다. 다른 구현양태에서, 키메라 수용체에 의해 접촉된 아밀로이드는 면역글로불린 중쇄(AH), β2-마이크로글로불린(Aβ2M), 트랜스티레틴 변이체(ATTR), 아포지질단백질 AI(AApoAI), 아포지질단백질 AII(AApoAII), 겔솔린(AGel), 리소자임(ALys), 백혈구 화학주성 인자(ALect2), 피브리노겐 a 변이체(AFib), 시스타틴 변이체(ACys), 칼시토닌((ACal), 락타데린(AMed), 섬 아밀로이드 폴리펩티드(AIAPP), 프로락틴(APro), 인슐린(AIns), 이전 단백질(APrP); α-시누클레인(AαSyn), 타우(ATau), 심방 나트륨 이뇨 인자(AANF), 또는 IAAP, ALκ4, Alλ1 기타 아밀로이드생성 펩티드의 아밀로이드생성 형태를 포함한다. 키메라 수용체에 의해 접촉된 아밀로이드생성 펩티드는 단백질, 단백질 단편, 또는 단백질 도메인일 수 있다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드는 재조합 아밀로이드생성 단백질을 포함한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드는 질병의 병적 측면의 일부이다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체의 아밀로이드-결합 영역은 아밀로이드에 대해 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 침착물을 키메라 수용체와 접촉시키면 적어도 부분적으로 아밀로이드의 제거를 초래한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 형태로 제공된다.
다른 구현양태에서, 아밀로이드증은 전신성 아밀로이드증이다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드증이다. 다른 구현양태에서, 아밀로이드증은 산발성 아밀로이드증이다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드증 또는 아밀로이드 관련 질병은 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, AH 아밀로이드증, Aβ 아밀로이드증, ATTR 아밀로이드증, ALect2 아밀로이드증, 및 II형 당뇨병의 IAPP 아밀로이드증, 알츠하이머병, 다운 증후군, 네덜란드 유형의 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈, 대뇌 베타-아밀로이드 혈관병증, 해면상 뇌병증, 갑상선 종양, 파킨슨병, 루이스 소체 치매, 타우병증, 헌팅턴병, 노인성 전신 아밀로이드증, 가족성 혈액투석증, 노인성 전신 노화, 노화 뇌하수체 장애, 의원성 증후군, 해면상 뇌병증, 반응성 만성 염증, 갑상선 종양, 골수종 또는 기타 형태의 암이다.
또한, 본원에 기재된 키메라 수용체 중 임의의 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 세포(예를 들어, 식세포)가 투여된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 대식세포가 투여된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 단핵구가 투여된다.
특정 예시적 구현양태에서, 아밀로이드증이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 키메라 수용체를 포함하는 세포의 유효량은 대상체에게 투여되어 대상체를 치료하거나 아밀로이드 침착물의 영상화를 가능하게 한다. 특정 예시적 측면에서, 대상체에서 아밀로이드 침착물을 제거하는 방법이 제공된다. 이 방법은 예를 들어, 아밀로이드증이 있는 대상체를 선택하고 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는, 예를 들어 아밀로이드-결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포, 또는 아밀로이드에 결합하는 항체로부터 유래된 아밀로이드-결합 영역을 포함하는 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포를 포함한다. 이에 따라 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 투여는 아밀로이드의 제거 및 이에 따른 대상체의 치료를 초래한다.
일부 구현양태에서, 아밀로이드증이 있는 대상체를 치료하는 방법 및/또는 아밀로이드를 제거하는 방법은 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 아밀로이드증이 있는 인간)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 치료적 유효 용량이 투여된다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 (a) 단일 주입 또는 (b) 다중 주입(예를 들어, 다중 주입으로 분할된 단일 용량)으로 투여된다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 약 104 내지 약 109개 세포/kg, 예를 들어, 약 104 내지 약 105개 세포/kg, 약 105 내지 약 106개 세포/kg, 약 106 내지 약 107개 세포/kg, 약 107 내지 약 108 세포/kg, 또는 약 108 내지 약 109 세포/kg을 포함한다. 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 약 0.6×106개 세포/kg 내지 약 2×107개 세포/kg을 포함한다. 특정 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 약 2×105, 1×106, 1.1×106, 2×106, 3×106, 3.6×106, 5×106, 1×107, 1.8×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 3×108, 또는 5×108 세포/kg을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 적어도 약 1×106, 1.1×106, 2×106, 3.6×106, 5×106, 1×107, 1.8×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 3×108, 또는 5×108 세포/kg을 포함한다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 약 1×106, 1.1×106, 2×106, 3.6×106, 5×106, 1×107, 1.8×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 또는 5×108 세포/kg을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 적어도 약 1×106, 1.1×106, 2×106, 3.6×106, 5×106, 1×107, 1.8×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 또는 5×108 세포/kg을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 최대 약 1×106, 1.1×106, 2×106, 3.6×106, 5×106, 1×107, 1.8×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 또는 5×108 세포/kg을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 약 1.1×106 내지 1.8×107 세포/kg을 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 약 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 또는 5×109 세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 적어도 약 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 또는 5×109 세포를 포함한다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 용량은 최대 약 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 또는 5×109 세포를 포함한다.
키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 면역요법에서 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(Rosenberg 등, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포를 대상체에 투여하는 단계는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식을 비롯한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 경동맥, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 한 측면에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 본 발명의 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 i.v. 주입에 의해 투여된다. 키메라 수용체를 포함하는 세포의 조성물은 질병 부위, 예를 들어 아밀로이드 침착이 있는 신체 부위에 직접 주사될 수 있다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체는 세포(예를 들어, 대식세포) 내로 도입되고, 대상체(예를 들어, 인간)는 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 초기 투여, 및 키메라 수용체를 포함하는 조작된 조작된 세포의 하나 이상의 후속 투여를 받으며, 여기서 1회 이상의 후속 투여는 15일 미만, 예를 들어, 이전 투여 후 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2일에 투여된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 1회 초과 투여는 매주 대상체에게 투여되고, 예를 들어 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 투여는 매주 2, 3, 또는 4회 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 주당 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 1회 초과 투여(예를 들어, 주당 2, 3 또는 4회 투여)(또한 본원에서 "주기"로도 지칭됨)를 받은 후, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포가 투여되지 않은 주 후에, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 1회 이상의 추가 투여(예를 들어, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 1주당 1회 초과 투여)가 대상체에게 투여된다. 일부 구현양태에서, 대상체는 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포의 1회 초과의 주기를 받고, 각 주기 사이의 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일 미만이다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 매주 3회 투여를 위해 격일로 투여된다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 이상 동안 투여된다.
일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 세포는 개체에서 아밀로이드 침착물에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드 침착물은 질병의 병적 측면에 기여할 수 있다. 다른 구현양태에서, 아밀로이드 침착물은 개체에서 아밀로이드증 또는 아밀로이드-관련 질병을 나타낼 수 있다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 세포는 아밀로이드증이 있는 개체의 아밀로이드에 결합한다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드증은 간, 심장 또는 중추 신경계와 같은 특정 조직 또는 장기 시스템에 국소화된다. 다른 구현양태에서, 아밀로이드증은 전신성 아밀로이드증이다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드증은 가족성 아밀로이드증이다. 다른 구현양태에서, 아밀로이드증은 산발성 아밀로이드증이다. 일부 구현양태에서, 아밀로이드증 또는 아밀로이드 관련 질환은 AA 아밀로이드증, AL 아밀로이드증, AH 아밀로이드증, Aβ 아밀로이드증, ATTR 아밀로이드증, ALect2 아밀로이드증, 및 II형 당뇨병의 IAPP 아밀로이드증, 알츠하이머병, 다운 증후군, 네델란드 유형 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌출혈, 대뇌 베타-아밀로이드 혈관병증, 해면상 뇌병증, 갑상선 종양, 파킨슨병, 루이스 소체 치매, 타우병증, 헌팅턴병, 노인성 전신 아밀로이드증, 가족성 혈액투석증, 노인성 전신 노화, 노화 뇌하수체 장애, 의원성 증후군, 해면상 뇌병증, 반응성 만성 염증, 갑상선 종양, 골수종 또는 기타 형태의 암이다. 일부 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 정상 노화와 관련된 아밀로이드에 결합한다. 다른 구현양태에서, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포는 대상체에서 아밀로이드증 또는 아밀로이드-관련 질병의 진단, 치료 또는 예후에 사용된다.
특정 예시적 구현양태에서, 아밀로이드증을 앓고 있는 대상체를 진단 및 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 키메라 수용체를 포함하는 검출가능하게 표지된 조작된 세포를 대상체에게 투여하고, 표지된 조작된 세포의 투여에 기초하여 대상체가 아밀로이드증을 앓고 있음을 결정하는 것을 포함한다. 그 다음, 유효량의 아밀로이드 치료가 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 키메라 수용체를 포함하는 하나 이상의 조작된 세포의 유효량이 투여될 수 있다.
일부 구현양태에서, 대상체는 영장류, 소, 설치류 또는 돼지와 같은 포유동물이다. 일부 구현양태에서, 대상은 인간이다.
구현양태
본원에 제공된 키메라 수용체, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 키메라 수용체를 포함하는 조작된 세포, 및 방법의 다양한 구현양태는 구현양태의 하기 비제한적 목록에 포함된다.
구현양태 1.
활성화시 대식세포를 활성화시키는 수용체의 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인;
막횡단 도메인; 및
아밀로이드 결합 영역을 포함하는, 세포외 도메인을 포함하는 키메라 수용체.
구현양태 2. 구현양태 1에 있어서, 상기 아밀로이드 결합 영역은 표 A에 제시된 바와 같은 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 키메라 수용체.
구현양태 3. 구현양태 2에 있어서, 상기 아밀로이드 결합 펩티드 또는 이의 기능적 단편은 CH2 도메인 또는 이의 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, 키메라 수용체.
구현양태 4. 구현양태 3에 있어서, 상기 CH2 도메인은 표 2 또는 표 3에 제시된 CH2 도메인 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 수용체.
구현양태 5. 구현양태 1에 있어서, 상기 아밀로이드 결합 영역은 11-1F4 항체 단편을 포함하는, 키메라 수용체.
구현양태 6. 구현양태 5에 있어서, 상기 11-1F4 항체 단편이 표 1에 제시된 11-1F4 VL 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 수용체.
구현양태 7. 구현양태 5 또는 6에 있어서, 상기 11-1F4 항체 단편이 인간화된, 키메라 수용체.
구현양태 8. 구현양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포질 도메인은 세포질 도메인 I, 세포질 도메인 II, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 키메라 수용체.
구현양태 9. 구현양태 8에 있어서, 상기 세포질 도메인이 표 1 또는 표 3에 제시된 세포질 도메인 I 또는 세포질 도메인 II의 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 수용체.
구현양태 10. 구현양태 1-9 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포외 도메인에 대한 아밀로이드의 결합은 키메라 수용체의 세포질 도메인을 활성화하는, 키메라 수용체.
구현양태 11. 아밀로이드 침착물을 구현양태 1-10 중 어느 하나의 키메라 수용체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 아밀로이드를 제거하는 방법.
구현양태 12. 구현양태 11에 있어서, 상기 아밀로이드는 AA, AL, AH, ATTR, Aß2M, 야생형 TTR, AApoAI, AApoAII, AGel, Alys, ALect2, Afib, ACys, ACal, AMedin, AIAPP, APro, AIns, APrP 또는 Aβ인, 방법.
구현양태 13. 구현양태 12에 있어서, 상기 키메라 수용체의 아밀로이드 결합 영역이 아밀로이드에 대한 결합 친화성을 갖는, 방법.
구현양태 14. 구현양태 11-13 중 어느 하나에 있어서, 상기 아밀로이드 침착물을 키메라 수용체와 접촉시키는 단계는 아밀로이드의 적어도 부분적 제거를 초래하는, 방법.
구현양태 15. 구현양태 1-10 중 어느 하나의 키메라 수용체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
구현양태 16. 구현양태 15에 있어서, 상기 키메라 수용체를 대상체에게 투여하는 단계는 키메라 수용체를 발현하는 대식세포 또는 단핵구의 투여를 포함하는, 방법.
구현양태 17. 구현양태 1 또는 구현양태 11-16 중 어느 하나에 있어서, 상기 수용체는 분비 리더 서열이 있거나 없이, 표 3에 CAR-P 작제물-345aa로서 제시된 서열에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 키메라 수용체 또는 방법.
구현양태 18. 구현양태 1 또는 구현양태 11-16 중 어느 하나에 있어서, 상기 수용체의 각 성분은 함께 또는 별도로, 표 3의 CAR-P 작제물-345aa의 상응하는 성분에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 키메라 수용체 또는 방법.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만 어떤 식으로든 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용 및 당해 기술분야의 일반적인 수준에 비추어, 당업자는 하기 실시예가 단지 예시적인 것으로 의도되고 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 다수의 변경, 수정 및 변경이 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 첨부된 도면은 본 개시내용의 명세서 및 설명의 필수적인 부분으로 간주되도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 하기 약어가 적용된다: ATTR(연령-의존성 트랜스티레틴-관련); AL(아밀로이드증); CAR(키메라 항원 수용체); CAR-P(키메라 항원 수용체-식세포의); ELISA(효소-결합 면역흡착 검정); FcR(Fc 수용체); mAb(모노클로날 항체); mos(개월); M
Figure pct00010
(대식세포); SAP(혈청 아밀로이드 P); SC(피하); 및 scFv(단일-사슬 가변 단편).
실시예 1. AL 아밀로이드증에 대한 수용체
하기 실시예는 아밀로이드-반응성 모노클로날 항체 11-1F4 및 아밀로이드-표적화 펩티드로부터 유래된 아밀로이드 결합 영역을 기술한다.
11-1F4 모노클로날 항체
아밀로이드-반응성 모노클로날 항체(mAb) 11-1F4가 생성되었고 치료제로서 특성화되었다(Hrncic, R., 등, Am J Pathol, 2000. 157(4): p. 1239-46; O'Nuallain, B., 등, Amyloid and Amyloidosis: Proceedings of the Xth International Symposium on Amyloidosis. 2005. Tours, France: CRC Press; O'Nuallain, B., 등, Biochemistry, 2007. 46(5): p. 1240-7; Wall, J.S., 등, J Nucl Med, 2006. 47(12): p. 2016-2024). mAb는 AL 아밀로이드 원섬유 상에 존재하는 신생-에피토프에 결합했지만, AL 환자의 순환에 존재하는 비-원섬유형 LC 단백질에는 열성적으로 결합하지 않았다. 면역저하된 마우스에 피하(SC) 이식된 인간 AL 아밀로이드 추출물과 11-1F4의 반응성은 작은 동물 SPECT/CT 영상화에 의해 쉽게 입증되었다(도 4a; Wall, J.S., 등, J Nucl Med, 2006. 47(12): p. 2016-202). 아밀로이드가 없는 조직에서는 표적외 결합이 관찰되지 않았다. SC 인간 AL 아밀로이드종을 보유하는 마우스를 11-1F4(5 mg/Kg에서)로 처리하면 식세포 M
Figure pct00011
및 호중구의 동원을 필요로 하는 과정에서 덩어리의 용해(도 4b, 도 4c)가 촉진되었다(Hrncic, R., 등, Am J Pathol, 2000. 157(4): p. 1239-46; O'Nuallain, B., 등, Amyloid and Amyloidosis: Proceedings of the Xth International Symposium on Amyloidosis. 2005. Tours, France: CRC Press; Solomon, A., D.T. Weiss, and J.S. Wall, Clin Cancer Res, 2003. 9(10 Pt 2): p. 3831S-8S). PET/CT 영상화를 통해 AL 환자의 특정 아밀로이드-함유 장기에서 특히 방사성요오드화 11-1F4 축적을 보여주는 인간 최초의 생체 분포 연구(NCT01409148)가 수행되었다.(도 4d; Wall, J.S., 등, Blood, 2010. 116(13): p. 2241-4).
이들 데이터는 11-1F4가 환자에서 AL 아밀로이드를 특이적 표적화할 수 있고 마우스에서 mAb의 결합이 인간 아밀로이드의 M
Figure pct00012
-매개 용해를 촉진할 수 있음을 나타내었다. 뮤린 11-1F4 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(Fv 영역)의 아미노산 서열을 결정하고 키메라 시약(인간 IgG1 사용)을 생성하는 데 사용했다. c11-1F4는 현재 AL 아밀로이드증 환자에서 안전성 및 효능에 대한 1상 임상 평가(NCT02245867)를 거쳤다. 중간 데이터는 c11-1F4 mAb를 사용한 치료가 AL 아밀로이드증 환자에서 내약성이 우수하고 심장 및 신장-관련 바이오마커의 개선을 야기함을 나타내었다(Edwards, C.V., 등, Amyloid, 2017. 24(sup1): p. 58-59).
아밀로이드-표적화 펩티드
지난 7년 동안 합성 아밀로이드-반응성 펩티드 배터리가 생성되고 특성화되었으며, 주로 전신 아밀로이드증에 대한 신규 영상화제 역할을 하였다(Martin, E.B., 등, Sci Rep, 2016. 6: p. 22695; Wall, J.S., 등, Molecules, 2015. 20(5): p. 7657-82; Martin, E.B., 등, Peptides, 2014. 60: p. 63-70; Wall, J.S., 등, Mol Imaging, 2017. 16: p. 1536012117708705; Wall, J.S., 등, Mol Imaging Biol, 2012. 14(4): p. 402-7). 초기에 p5로 명명된 펩티드가 확인되었다: 합성 AL-아밀로이드 원섬유 뿐만 아니라 인간 AL 및 ATTR 아밀로이드 추출물을 결합할 수 있는 31개-아미노산, 비-자연, 다염기성(+8) 시약(Martin, E.B., 등, Biochem Biophys Res Commun, 2013. 436(1): p. 85-9; Wall, J.S., 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(34): p. E586-94). 이어서, 순 양전하가 증가된 p5 유도체(펩티드 p5+14)가 생성되었으며, 이는 AL- 및 ATTR-관련 아밀로이드와 유사하게 결합하지만 더 큰 친화력 및 결합활성을 나타내었다(Martin, E.B., 등, Sci Rep, 2016. 6: p. 22695; Wall, J.S., 등, Molecules, 2015. 20(5): p. 7657-82).
p5+14의 향상된 특성을 감안할 때, 이 펩티드는 전신성 아밀로이드증을 영상화하기 위한 신규 제제로서 임상에 방사성 표지된 변이체를 번역하는 것을 목표로 광범위하게 특성화되었다. 기질로서 예시적인 원섬유 구조인 Aβ(PDB #1BEG)를 사용한 분자 역학 시뮬레이션은 p5+14-원섬유 상호작용이 12개 라이신 아미노산 측쇄를 포함하는 다가 정전기 상호작용에 의해 지배되며, 이는 아밀로이드 원섬유의 반복되는 단백질 서브유닛과 상호작용할 수 있음을 나타내었다. 추가적으로, 라이신 잔기는 아밀로이드 침착물에 편재하는 과황산염화 헤파란 설페이트 글리코스아미노글리칸에 결합할 수 있다(Wall, J.S., 등, Molecules, 2015. 20(5): p.7657-82). 비오틴화될 때, 펩티드 p5+14는 포르말린-고정 파라핀-임베딩된 조직 절편에서 인간 AL 아밀로이드 침착물에 특이적으로 결합하였으며, 이는 콩고 레드-염색 조직 절편에서 녹색-금색 복굴절로 입증되었다(도 5a).
p5+14의 유리한 아밀로이드-결합 및 영상화 능력(즉, 아밀로이드에 대한 특이적 결합 및 건강한 장기 및 조직과의 비반응성) 뿐만 아니라 우수한 전임상 안전성 프로파일에 기초하여, 미국 FDA는 전신성 아밀로이드증 환자에서 요오드-124-표지된 p5+14 펩티드의 1상 PET/CT 영상 시험을 수행하기 위한 연구용 신약 신청(IND# 132282)을 승인했다(NCT03678259). 124I-p5+14 펩티드의 안전성과 아밀로이드 반응성을 평가하기 위해, 2018년 11월 테네시 대학 의료 센터에서 인간을 대상으로 한 최초의 영상 연구를 시작했다. AL 아밀로이드증이 있는 환자의 예비 데이터는 펩티드가 이 대상체에서 아밀로이드를 함유할 가능성이 있는 장기에 국한되어 있음을 시사하였다(도 5b).
펩티드 p5+14를 아밀로이드증에 대한 영상화제로서 임상 평가로 성공적으로 번역한 후, 이 펩티드(또는 다른 p5 유도체)(Wall, J.S., 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(46): p. E10839-E10848; Wall, J.S., 등, Mol Imaging Biol, 2017. 19(5): p. 714-722; Martin, E.B., 등, J Transl Med, 2017. 15(1): p. 247)는 새로운 아밀로이드 치료제의 성분으로 추가로 활용될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같이 펩티드는 CAR의 결합-수용체 성분으로서 사용되며, 이는 아밀로이드의 존재 하에 M
Figure pct00013
를 특이적으로 표적화하고 활성화하여 식세포작용을 초래한다.
실시예 2. 아밀로이드 식세포작용을 위한 CAR 설계
하기 실시예는 아밀로이드 결합 영역으로 구성된 CAR 작제물의 설계를 설명한다.
CAR-P 세포의 한 반복에서, scFv 구조가 CAR 설정에서 활성인 것으로 나타났기 때문에, 단일 사슬 가변 단편(scFv)으로 제공된 아밀로이드 결합 mAb 11-1F4의 사용이 아밀로이드-결합 수용체로서 제안되었다(Morrissey, M.A., 등, Elife, 2018. 7). 124I-11-1F4의 영상화 시험은 mAb가 AL 환자의 단지 약 60%만 영상화하는 것으로 나타났다(Wall, J.S., 등, Blood, 2010. 116(13): p. 2241-4). 따라서, 보다 일반적인 CAR 작제물을 생성하기 위해, 두 번째 CAR-P 설계는 결합 수용체로서 다중 아밀로이드-반응성 펩티드를 사용한다(아래 참조). 이것은 대부분의 CAR 작제물이 mAb 관련 scFv를 수용체로서 사용하기 때문에 새로운 접근법이다. 종양(Le Joncour, V. and P. Laakkonen, Bioorg Med Chem, 2018. 26(10): p. 2797-2806) 및 아밀로이드 표적화 펩티드(Wall, J.S., 등, Molecules, 2015. 20(5): p. 7657-82; Wall, J.S., 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(46): p. E10839-E10848; Wall, J.S., 등, PLoS One, 2013. 8(6): p. e66181; Wall, J.S., 등, Mol Imaging Biol, 2017. 19(5): p. 714-722)의 증가된 유용성을 고려하면, 이 접근법은 CAR-발현 세포의 구축을 위한 새로운 길을 열고, 삶의 질을 향상시키고 환자의 생존을 연장함으로써 환자에게 의미 있는 이점을 제공할 수 있다.
6개의 작제물이 초기 연구를 위해 설계되었다. 3개의 CAR은 11-1F4 scFv를 아밀로이드 결합 수용체로서 포함하고, 세포질 도메인은 (i) 고친화성 뮤린 FcR 공통 γ 서브유닛; (ii) 뮤린 CD19 + FcR(일렬로), 또는; (iii) 신호 형질도입 도메인 없음(음성 대조군으로 작용함)(도 6, 다이어그램 (i))을 포함할 것이다. 예를 들어, 탠덤(CD19+FcR) 세포질 도메인(11-1F4CAR탠덤으로 지정)이 있는 11-1F4 scFv CAR의 모듈을 포함하는 아미노산이 표 1에 나와 있다. 막횡단 및 세포질 도메인은 이전 CAR-P M
Figure pct00014
연구에서 사용된 것과 동일했다(Morrissey, M.A., 등, Elife, 2018. 7).
표 1. 11-1F4 CAR 탠덤 성분의 1차 구조(단일 문자 아미노산 코드).
Figure pct00015
3개의 CAR의 두 번째 세트는 아밀로이드 수용체로서 p5+14 펩티드를 포함하고 3개의 다양한 세포질 신호 도메인을 유사하게 사용할 것이다(도 6, 다이어그램 (ii)). 각 모듈에 대한 단백질 서열은 CAR을 생성하는 데 사용되는 단백질 서열 데이터베이스(예를 들어, UniProt)에서 확인되었다.
p5+14를 갖는 CAR 작제물의 경우, 뮤린 CH2 도메인(IgG2a Fc 도메인으로부터)은 펩티드를 세포 표면으로부터 멀리 위치시키기 위해 펩티드의 바로 원위(C-말단)에 포함되었다. 이것은 고도로 양으로 하전된 p5+14 펩티드와 원형질막의 성분, 특히 높은 음전하 밀도를 갖는 글리코스아미노글리칸과의 상호작용을 최소화하는 데 필요할 것으로 여겨진다. 아밀로이드-반응성 펩티드가 CH2 도메인에 융합된 Fc2a-펩티드 융합 시약이 이전에 생성되었기 때문에, 뮤린 IgG2a Fc CH2 도메인이 선택되었다. 이 구성에서 아밀로이드-반응성 펩티드는 AL 아밀로이드 및 합성 아밀로이드-유사 AL 원섬유에 결합하는 능력을 유지했다(Foster, J.S., 등, Front Immunol, 2017. 8: p. 1082). 펩티드 p5+14 및 뮤린 Fc2a CH2의 서열은 표 2에 제시되어 있다.
표 2. p5+14 CAR 작제물에 사용된 p5+14 및 CH2 도메인의 1차 구조.
Figure pct00016
동일한 목표를 달성하기 위해, CH2 도메인이 임의의 다른 호환가능한 서열로 대체될 수 있다는 점은 주목할 만하다. 유사하게, 다수의 세포질 식세포작용 신호전달 도메인이 사용될 수 있다: M
Figure pct00017
는 별개의 세포질 요소를 갖는 4개의 표준 식세포작용 수용체를 갖지만, 다른 수용체가 결합될 수 있다(Taylor, P.R., 등, Annu Rev Immunol, 2005. 23: p. 901-44). 일반적으로, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM) 요소를 통한 신호전달은 식세포작용 과정의 주요 구성요소로 간주되며, 이러한 요소는 단독으로 다른 요소와 조합하여 사용할 수 있다(Hamerman, J.A., 등, Immunol Rev, 2009. 232(1): p. 42-58; Taylor, P.R., 등, Annu Rev Immunol, 2005. 23: p. 901-44). M
Figure pct00018
의 동시-자극 및 식세포작용의 유도가 아밀로이드 원섬유를 결합하는 것으로 나타난, 표면 결합 패턴 인식 톨-유사 수용체 2의 상호작용을 통해 발생할 수 있다는 점도 주목할 만하다(Friedland, R.P., J Alzheimers Dis, 2015. 45(2): p. 349-62; Tukel, C., 등, Cell Host Microbe, 2009. 6(1): p. 45-53).
실시예 3. 대식세포 세포주에서 CAR의 발현
하기 실시예는 대식세포 세포주에서 상기 실시예 2에 기재된 CAR 작제물의 발현을 기술한다.
전체 CAR을 코딩하는 cDNA 서열은 젠스크립트(Genscript)(Piscataway, NJ)에 의해 합성되고, pEF-ENTR A(Addgene) 벡터로 클로닝되고, VSV-G 슈도타이핑을 갖는 3세대 패키징 시스템을 사용하여 HEK293T 세포로의 형질주입에 의해 렌티바이러스로 패키징하기 위해 pLenti CMV GFP Dest(Addgene)에 재조합된다. 이 바이시스트로닉(bicistronic) 목적지 벡터는 양성으로 형질주입된 세포를 식별할 수 있는 녹색 형광 단백질(GFP) 서열을 포함한다. 뮤린 식세포성 M
Figure pct00019
세포주 RAW264.7(RAW; ATCC TIB-71)을 렌티바이러스로 형질도입하여 안정적인 혼입 후 제한된 희석 클로닝을 수행한다. RAW 세포주 이외에, 비-식세포성 뮤린 단핵구 세포주 WEHI-274.1이 형질도입된다(WEHI; ATCC CRL-1679). 뮤린 RAW M
Figure pct00020
, 심지어 CAR이 없는 것들도 아밀로이드 식세포작용의 기저 수준을 나타낼 것이기 때문에, WEHI-274 세포는 식세포작용이 없을 때 CAR에 대한 아밀로이드의 결합을 연구하기 위한 음성 대조군 세포 역할을 한다고 추론된다. 최종 대조군으로서, GFP-발현 RAW 및 WEHI 세포는 pLenti CMV GFP Dest 또는 GFP만 있는 다른 벡터를 사용한 형질주입 또는 형질도입에 의해 생성된다. 11-1F4 scFv 또는 p5+14 펩티드 CAR의 표면 발현은 이전에 생성된 11-1F4 항-이디오타입 또는 p5+14-반응성 mAb로 고정된 세포 상에서 표준 면역형광(알렉사-594)에 의해 확인된다(Wall, J.S., 등, Pharm Pat Anal, 2017. 6(5): p. 215-223). 세포당 발현된 수용체의 수는 세포 표면 유세포 분석(Qu, C.X., 등, J Clin Lab Anal, 2006. 20(6): p. 250-4) 또는 11-1F4 항-이디오타입 및 항-펩티드 p5+14 항체 사용하여 방사성표지된 항체 결합 검정(Dahle, J., 등, Nucl Med Commun, 2007. 28(9): p. 742-7)에 의해 평가된다.
실시예 4. CAR-P M
Figure pct00021
에 대한 합성 AL 원섬유 및 아밀로이드 추출물의 결합
기능 연구의 첫 번째 단계로서, RAW 및 WEHI 세포가 형질도입되고, GFP-연관 녹색 형광의 발현에 의해 입증되고, 제한 희석에 의해 클로닝되어 합성 AL-연관 아밀로이드 원섬유(Wall, J., 등, Biochemistry, 1999. 38(42): p. 14101-8) 및 인간 AL 아밀로이드 추출물의 세포 표면 결합을 연구한다. 아밀로이드는 숙신이미딜-알렉사플루오르-594(형광 방출 최대 = ~610 nm, ThermoFisher)를 사용하여 표지되고 CAR-P M
Figure pct00022
와 함께 1-3시간 동안 인큐베이션된 후 아밀로이드 물질과 관련된 세포가 유세포 분석에 의해 정량화된다. 데이터는 어튠(Attune) NxT 음향 초점 세포측정기(acoustic focusing cytometer)(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 사용하여 전방 및 측면 산란 매개변수를 사용하여 손상되지 않은 세포에 대해 먼저 게이팅한 다음, GFP(488 nm에서 여기 및 532 nm 필터에서 검출된 방출 사용)에 게이팅함으로써 획득한다. 알렉사플루오르-594(574 nm 필터)에 대해서도 양성인 GFP-양성 세포의 수는 결합 효율의 척도 역할을 한다. 이 연구는 표면-발현된 11-1F4 scFv 및 p5+14 펩티드의 완전성과 아밀로이드 결합 능력을 평가한다. CAR-발현이 결핍된 RAW 및 WEHI 세포는 대조군 집단으로 작용한다. CAR-P-양성 및 대조군 세포를 사용한 n = 5 실험의 데이터는 데이터가 정상적으로 분포되지 않은 경우 짝을 이루지 않은 T-테스트 또는 비모수 등가물을 사용하여 비교된다.
실시예 5. AL 아밀로이드의 생체외 식세포작용
합성 아밀로이드 원섬유 및 인간 AL 아밀로이드 추출물의 식세포작용은 pH-민감성 형광단 pHrodo 레드(방출 최대값 = ~ 600 nm)로 표지된 아밀로이드 물질을 사용하는 형광 현미경에 의해 초기에 연구된다. 이 시약은 형광단의 형광 방출이 크게 향상되는(Miksa, M., 등, J Immunol Methods, 2009. 342(1-2): p. 71-7) M
Figure pct00023
의 산성화된 파골리소좀으로 박테리아 및 보다 최근에는 아밀로이드 원섬유(Richey 등 (2019) Am J. Pathol.)의 흡수를 연구하는 데 광범위하게 사용되었다. CAR-발현 RAW 세포는 반-융합(semi-confluent)될 때까지 24-웰 배양 접시에서 RPMI 배지에서 성장하고 웰당 5 x 105 세포로 시딩한다. 형광단-접합된 AL 아밀로이드는 1-mL 최종 부피에서 25-50 μg/mL의 최종 농도로 웰에 첨가된다. 아밀로이드 물질은 불용성이며 웰 바닥에 빠르게 정착할 것으로 예상된다. 2-24시간의 인큐베이션 기간 후 웰을 따뜻하게 한 RPMI로 세척하고 분석을 위해 준비한다. 이중 형광단(적색 및 녹색) 현미경 사진은 키엔스(Keyence) Bz-x700 형광 현미경(3x 디지털 줌이 있는 40x 대물렌즈)을 사용하여 획득한다. 적색-형광 아밀로이드 입자를 함유하는 CAR-P-양성(녹색) 세포의 수를 정량화하고, 쌍을 이루지 않은 양측 t-테스트 또는 비모수 등가물을 사용하여 CAR-P-음성 세포와 비교한다.
병행하여, 유세포 분석(상기 실시예 3에 기재된 바와 같이)은 배양 접시로부터 들어 올려진 현탁액 중의 세포를 사용하여 수행된다. 일치하는 적색(pHrodo 레드) 및 녹색(GFP-양성) 세포의 수를 정량화하고 CAR-음성, GFP-발현 대조군 RAW 및 WEHI 세포와 비교한다.
실시예 6. AL 아밀로이드-보유 마우스에서 아밀로이드-CAR-P M
Figure pct00024
의 생체내 특성화
인간 AL 아밀로이드 추출물은 근적외선 염료 Dylight800-NHS 에스테르(최대 방출 = 794 nm; Life Technologies) 및 광학 영상용 pHrodo 레드(iBox Scientia, Analytik Jena)로 표지된다. 국소화된 AL 덩어리는 약 2-20 mg의 형광단-접합 아밀로이드의 IP 주사에 의해 수컷 및 암컷 면역저하(NU/NU) 마우스(코호트당 n = 5)에서 유도된다. 주사 후 1주일에, 마우스는 1 x 106 GFP-양성 CAR-P RAW 또는 CAR-P WEHI M
Figure pct00025
(또는 대조군으로서, GFP-양성, CAR-음성 세포)를 500 μL 멸균 PBS 부피로 IP 주입받는다. 아밀로이드 및 식세포작용을 갖는 주입된 M
Figure pct00026
의 공동-국소화는 주입 후 1, 3, 4 및 7일에 마취된(1.5% 이소플루란) 마우스의 광학 영상화에 의해 시각화된다(Wall, J.S., 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 2018. 115(46): P. E10839-E10848). 각 형광단(GFP, pHrodo 레드 및 Dylight800)의 형광 강도는 디지털 영상에서 정량화된다. 아밀로이드-표적화 실험이 끝나면 간, 비장, 폐 및 신장뿐만 아니라 잔류 아밀로이드 물질을 사후에 채취하여 포르말린에 고정하고 조직 절편을 준비하고 형광 현미경으로 평가하여 GFP 양성 M
Figure pct00027
의 전반적인 생체분포를 확인한다. M
Figure pct00028
의 존재는 형광 현미경 사진의 형태 측정 분석에서 최소 5개의 연속 6 μm- 두께 조직 절편에서 정량화된다. CAR-P M
Figure pct00029
를 받은 마우스의 데이터는 쌍을 이루지 않은 양측 t-테스트을 사용하여 대조군 세포와 비교된다.
실시예 7. 예시적인 CAR 작제물
하기 표 3은 예시적인 스페이서, 막횡단, 세포질 영역, CH2, 리더, p5, 및 전장 CAR-P 아미노산 서열을 제공한다.
표 3. CAR 작제물 아미노산 서열.
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
서열
모든 폴리펩티드 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 표시된다.
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF TENNESSEE RESEARCH FOUNDATION <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR REMOVAL OF AMYLOID <130> 16599-20005.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/962,763 <151> 2020-01-17 <160> 59 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys Gln Ala Gln Lys Ala 1 5 10 15 Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys Gln 20 25 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Arg Ala Gln Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg Gln Ala Gln Arg Ala 1 5 10 15 Gln Arg Ala Gln Ala Arg Gln Ala Arg Gln 20 25 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Gly Ala Gln Gly Ala Gln Ala Gly Gln Ala Gly Gln Ala Gln Gly Ala 1 5 10 15 Gln Gly Ala Gln Ala Gly Gln Ala Gly Gln 20 25 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Lys Val Asn Ser Thr 260 265 270 Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly 275 280 285 Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val 290 295 300 Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 305 310 315 320 Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu 325 330 335 Ile Cys Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Val Leu Phe 340 345 350 Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln 355 360 365 Val Arg Lys Ala Ala Ile Ala Ser Arg Glu Lys Ala Asp Ala Val Tyr 370 375 380 Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ser Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His 385 390 395 400 Glu Lys Pro Pro Gln 405 <210> 50 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 50 Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Asp Ile Val Leu Thr 20 25 30 Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile 35 40 45 Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met 50 55 60 His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu 100 105 110 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Phe 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Ser Arg Ser 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu 145 150 155 160 Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile 165 170 175 Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val Ser Trp 180 185 190 Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp 195 200 205 Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met Ser Arg Ser Leu 210 215 220 Ser Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val Leu Phe Lys Leu Asn 225 230 235 240 Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Thr Leu Asp 245 250 255 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Lys Val Asn Ser Thr 260 265 270 Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly 275 280 285 Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val 290 295 300 Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 305 310 315 320 Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu 325 330 335 Ile Cys Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Val Leu Phe 340 345 350 Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln 355 360 365 Val Arg Lys Ala Ala Ile Ala Ser Arg Glu Lys Ala Asp Ala Val Tyr 370 375 380 Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ser Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His 385 390 395 400 Glu Lys Pro Pro Gln Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Ala Asp Glu Glu Leu 405 410 415 Ala Gln Pro Val Gly Arg Met Met Asp Phe Leu Ser Pro His Gly Ser 420 425 430 Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu 435 <210> 51 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Thr Val Gly Gly 20 25 30 Gly Tyr Ser Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys Gln Ala 35 40 45 Gln Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys Gln Val Thr Pro 50 55 60 Thr Val Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 65 70 75 80 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 85 90 95 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 100 105 110 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 115 120 125 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 130 135 140 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 145 150 155 160 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Thr 165 170 175 Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val His Pro Thr Gly 180 185 190 Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro Arg Gly Ser Val 195 200 205 Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 210 215 220 Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu Ile Ile Thr Leu 225 230 235 240 Ile Cys Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Val Leu 245 250 255 Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile 260 265 270 Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Ala Ser Arg Glu Lys Ala Asp Ala Val 275 280 285 Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ser Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys 290 295 300 His Glu Lys Pro Pro Gln 305 310 <210> 52 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Thr Val Gly Gly Gly Tyr Ser Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln 1 5 10 15 Ala Lys Gln Ala Gln Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys 20 25 30 Gln Val Thr Pro Thr Val Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro 50 55 60 Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val 65 70 75 80 Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 85 90 95 Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala 100 105 110 Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys 115 120 125 Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser 130 135 140 Lys Pro Lys Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val 145 150 155 160 His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro 165 170 175 Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 180 185 190 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu 195 200 205 Ile Ile Thr Leu Ile Cys Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu 210 215 220 Asp Ala Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys 225 230 235 240 Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Ala Ser Arg Glu Lys 245 250 255 Ala Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ser Gln Glu Thr Tyr 260 265 270 Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln Leu Tyr Ala Ala Pro Gln 275 280 285 Leu His Ser Ile Gln Ser Gly Pro Ser His Glu Glu Asp Ala Asp Ser 290 295 300 Tyr Glu Asn Met Asp Lys Ser Asp Asp Leu Glu Pro Ala 305 310 315 <210> 53 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 Thr Val Gly Gly Gly Tyr Ser Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln 1 5 10 15 Ala Lys Gln Ala Gln Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys 20 25 30 Gln Val Thr Pro Thr Val Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 35 40 45 Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro 50 55 60 Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val 65 70 75 80 Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 85 90 95 Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala 100 105 110 Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys 115 120 125 Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser 130 135 140 Lys Pro Lys Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro Val 145 150 155 160 His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg Pro 165 170 175 Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 180 185 190 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu 195 200 205 Ile Ile Thr Leu Ile Cys Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu 210 215 220 Asp Ala Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys 225 230 235 240 Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Ala Ser Arg Glu Lys 245 250 255 Ala Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ser Gln Glu Thr Tyr 260 265 270 Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln 275 280 <210> 54 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 54 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly 100 105 110 Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 130 135 140 Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser 145 150 155 160 Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 165 170 175 Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu 180 185 190 Met Ser Arg Ser Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val 195 200 205 Leu Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Val Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro 245 250 255 Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg 260 265 270 Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 275 280 285 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser 290 295 300 Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu 305 310 315 320 Asp Ala Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys 325 330 335 Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Ala Ser Arg Glu Lys 340 345 350 Ala Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ser Gln Glu Thr Tyr 355 360 365 Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln 370 375 <210> 55 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly 100 105 110 Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser 130 135 140 Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser 145 150 155 160 Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 165 170 175 Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu 180 185 190 Met Ser Arg Ser Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val 195 200 205 Leu Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Val Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro 245 250 255 Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg 260 265 270 Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 275 280 285 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser 290 295 300 Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu 305 310 315 320 Asp Ala Val Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys 325 330 335 Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Ala Ser Arg Glu Lys 340 345 350 Ala Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ser Gln Glu Thr Tyr 355 360 365 Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln Ala Glu Ser Tyr Glu Asn 370 375 380 Ala Asp Glu Glu Leu Ala Gln Pro Val Gly Arg Met Met Asp Phe Leu 385 390 395 400 Ser Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu 405 410 <210> 56 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 56 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Thr Val Gly Gly 20 25 30 Gly Tyr Ser Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys Gln Ala 35 40 45 Gln Lys Ala Gln Lys Ala Gln Ala Lys Gln Ala Lys Gln Val Thr Pro 50 55 60 Thr Val Ala Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu Gly Ser Glu Phe Tyr 65 70 75 80 Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Val Ser Gln Asp Gly Ser 85 90 95 Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Met Gly Pro Glu Glu Glu Asp 100 105 110 Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Ala Asp Glu Glu Leu Ala 115 120 125 Gln Pro Val Gly Arg Met Met Asp Phe Leu Ser Pro His Gly Ser Ala 130 135 140 Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Ser Ser Leu Gly Ser Gln Ser Tyr Glu 145 150 155 160 Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln Leu His Ser Ile Gln 165 170 175 Ser Gly Pro Ser His Glu Glu Asp Ala Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp 180 185 190 Lys Ser Asp Asp Leu Glu Pro Ala Trp Glu Gly Glu Gly His Met Gly 195 200 205 Thr Trp Gly Thr Thr 210 <210> 57 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 58 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 58 Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro 1 5 10 15 Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg 20 25 30 Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 59 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ile Ile Thr Leu Ile Cys 20

Claims (24)

  1. 키메라 수용체로서,
    활성화시 대식세포를 활성화시키는 수용체의 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인;
    막횡단 도메인; 및
    아밀로이드 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인
    을 포함하는, 키메라 수용체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 키메라 수용체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 항체 단편이 scFv인, 키메라 수용체.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 VL 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 VH를 포함하고,
    상기 CDRL1은 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 CDRL2는 서열번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 CDRL3은 서열번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 CDRH1은 서열번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 CDRH2는 서열번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    상기 CDRH3은 서열번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는,
    키메라 수용체.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열번호: 19 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열번호: 20 또는 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 키메라 수용체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 아밀로이드 결합 영역이 11-1F4 항체 단편을 포함하는, 키메라 수용체.
  7. 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 인간화된, 키메라 수용체.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 아밀로이드-반응성 펩티드를 포함하는, 키메라 수용체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 아밀로이드-반응성 펩티드가 서열번호: 1-18에 제시된 서열을 포함하는, 키메라 수용체.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 아밀로이드 결합 영역이 CH2 도메인 또는 이의 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된, 키메라 수용체.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 CH2 도메인이 서열번호: 33에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 수용체.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포질 도메인이 세포질 도메인 I, 세포질 도메인 II, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 키메라 수용체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 세포질 도메인이 서열번호: 30, 31, 41, 42 또는 45에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 수용체.
  14. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 도메인에 대한 아밀로이드의 결합은 키메라 수용체의 세포질 도메인을 활성화시키는, 키메라 수용체.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 수용체가 분비 리더 서열이 있거나 없이 서열번호: 43에 제시된 서열에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 키메라 수용체.
  16. 제 1항 또는 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체의 각 성분이 함께 또는 별도로 서열번호: 43의 상응하는 성분에 대해 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 키메라 수용체 또는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 키메라 수용체를 코딩하는, 핵산.
  18. 제 17항의 핵산을 포함하는, 조작된 세포.
  19. 아밀로이드 침착물을 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 키메라 수용체 또는 제 18항의 조작된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 아밀로이드를 제거하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 아밀로이드가 AA, AL, AH, ATTR, Aß2M, 야생형 TTR, AApoAI, AApoAII, AGel, ALys, ALect2, Afib, ACys, ACal, AMedin, AIAPP, APro, AIns, APrP, 또는 Aβ인, 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 키메라 수용체의 아밀로이드 결합 영역이 아밀로이드에 대한 결합 친화성을 갖는, 방법.
  22. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로이드 침착물의 키메라 수용체와의 접촉은 아밀로이드의 적어도 부분적인 제거를 초래하는, 방법.
  23. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 키메라 수용체 또는 제 18항의 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 대상체에게 키메라 수용체를 투여하는 단계는 키메라 수용체를 발현하는 대식세포 또는 단핵구의 투여를 포함하는, 방법.
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