JP2022062046A - Fkpaの精製、及び組換えポリペプチドの産生のためのその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年8月20日出願の米国仮出願第62/207,908号、2015年8月20日出願の米国仮出願第62/207,910号、及び2015年8月26日出願の米国仮出願第62/210,378号の利益を主張するものであり、これらの各々の開示は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる:コンピュータ可読形態(CRF)の配列表(ファイル名:146392033640_Sequence_Listing.txt、記録日:2016年8月19日、サイズ:58KB)。
「検出」という用語は、標的分子の定性的測定及び定量的測定の両方を含むために本明細書で最も広義に使用される。検出は、試料中の標的分子の単なる存在を特定すること、ならびに標的分子が検出可能なレベルで試料中に存在するかを決定することを含む。
100×画分X/Y
FkpAの超高純度調製物の生成方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、調製物は、約95.0%、約96.0%、約97.0%、約98.0%、約99.0%、約99.1%、約99.2%、約99.3%、約99.4%、約99.5%、約99.6%、約99.7%、約99.8%、約99.9%のうちのいずれかを超える純度のFkpAを含む。いくつかの実施形態では、99%の純度の調製物は、調製物中の材料の1%以下が、FkpAの産生中に存在する細胞または細胞溶解物中に存在する物質(例えば、タンパク質、核酸、脂質等)であることを示す。FkpAの99%の純度の調製物は、FkpAの精製または製剤化に使用される緩衝液、塩、または他の賦形剤を含有し得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、FkpAの超高純度調製物を産生するための、以下の例示的ではあるが非限定的な方法を提供する。FkpAを、E.coliで発現させる。細胞ペーストを、10体積で、25mMのMES(pH6.0)(溶解緩衝液)中に懸濁させ、懸濁液が均質になるまで混合する。室内圧力(6000~8000psi)での4回通過で、微小流動化剤HC-8000を使用して、細胞溶解を行う。SS-34回転子を使用してRC6遠心分離機内で、懸濁液を15,000rpmで30分間遠心分離する。
浄化された遠心分離物(1.5MのTris塩基でpH8.0に調整)を、結合及び溶出モードでDEAE Sepharose(登録商標)Fast Flow(GE Healthcare)を含有するカラムに装填する。カラムは、以下の特性を有し、つまり、カラムは、27.0cm(高さ)×2.6cm(直径)、体積145mL、タンパク質容量50mg/mL以下の樹脂であった。カラムを、3CVの250mMのMES(pH6.0)で事前平衡化し、25mMのMES(pH6.0)で平衡化する。装填終了時、カラムを3CVの平衡化緩衝液で洗浄する。0~30%の緩衝液B(25mMのMES、300mMのNaCl)の9CVの勾配を使用して、FkpAを溶出させる。画分を、SDS-PAGEによって分析する。
その後、プールされたSP画分を、結合及び溶出モードでButyl-S Sepharose(登録商標)クロマトグラフィー材料に適用する。カラムは、以下の特性を有し、つまり、カラム寸法は、9.4cm(高さ)×2.6cm(直径)、体積50mL、タンパク質容量20mg/mL以下の樹脂であった。カラムを、300mMの硫酸ナトリウム、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)で平衡化する。等体積の50mMのリン酸塩、0.6Mの硫酸ナトリウム(pH7.0)の添加によってSPプールを調整してから、Butyl-S Sepharose(登録商標)カラムに装填する。その後、カラムを50mMのリン酸塩、300mMの硫酸ナトリウム(pH7.0、3CV)で洗浄する。FkpAを、精製水でカラムから溶出させる。画分を収集し、カラム画分のSDS-PAGE分析によって分析する。
その後、プールされたButyl Sepharose(登録商標)画分を、Superdex200を使用してサイズ排除クロマトグラフィーに供する。このステップを使用して、いかなる残留高分子量種及び低分子量種も除去し、FkpAを製剤化する。Superdex200は、10~600kDalの分子量を有する分子の分画範囲を有し、FkpA等のタンパク質に適している。カラムは、Superdex200であり、以下の特性を有し、つまり、カラムは、60cm×2.6cmの直径、体積320mL、装填体積16mL以下であった。遠心分離フィルターを使用して、HICプール(画分7~11)を16mL以下(SEC CVの5%以下)の体積に濃縮する。これらの装置を、20分間隔でEppendorf臨床遠心分離機を使用して目標体積に到達するまで3000rpmで遠心分離する。Superdex200サイズ排除カラムを、3CVのPBS(pH7.5±0.4)で平衡化する。Butyl Sepharose(登録商標)画分を、カラムに装填し、PBS(pH7.5±0.4)で1mL/分の流量でさせる。
FkpAの調製物の純度の決定方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、調製物中のFkpAの純度は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定される。いくつかの実施形態では、調製物中のFkpAの純度は、高性能液体クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー(HPLC SEC)によって決定される。いくつかの実施形態では、調製物中のFkpAの純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって決定される。いくつかの実施形態では、SDS PAGEゲル上のタンパク質は、蛍光タンパク質画像化を使用して特定される。いくつかの実施形態では、SDS PAGEは、Sypro(登録商標)Rubyを使用して画像化される。いくつかの実施形態では、SDS-PAGE上のタンパク質は、Heukeshoven銀染色を使用して可視化される。他の実施形態では、FkpA分子の同一性は、N末端配列分析、ペプチド質量フィンガープリント法(PMF)、CHIP TOFによる無傷/還元質量、及びウエスタンブロット分析を含むが、これらに限定されない特性評価アッセイを使用して確認される。
本発明は、FkpAの超高純度調製物の生成方法を提供する。「FkpA」タンパク質という用語は、細菌FKBP型ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼを指す。FkpAは、周辺質タンパク質ジスルフィドイソメラーゼIは、シス/トランスペプチジル-プロリルイソメラーゼ(PPIase)活性及びシャペロン活性の両方を呈する。FkpAは、ペプチドが細胞の周辺質内に出現するとき、ポリペプチドの折り畳みを補助し得る。いくつかの実施形態では、FkpAは、細菌由来である。いくつかの実施形態では、FkpAポリペプチドは、E.coli FkpAポリペプチドである。他の実施形態では、FkpAポリペプチドは、Enterobacteria、Azoarcus、Salmonella、Buchnera、Xanthmonas、Campylobacter、Shigella、Pseudomonas、Yersina、Erwinia、及びNeisseriaのうちのいずれかの種由来である。いくつかの実施形態では、FkpAポリペプチドは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、FkpAポリペプチドは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約99%のうちのいずれかの同一性を有するアミノ酸配列を含む。
タンパク質折り畳み及び組み立てがFkpA(例えば、外因性FkpA)の発現によって支援され得る、細菌(例えば、E coli)中に産生され得るポリペプチドの例としては、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、半抗体、抗体断片、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Fc含有タンパク質、免疫コンジュゲート、サイトカイン、及びインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドの例としては、レニン等の哺乳類タンパク質;ホルモン;ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;アルファ-1-抗トリプシン;インスリンA-鎖;インスリンB-鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;第VIIIC因子、第IX因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子等の凝固因子;タンパク質C等の抗凝固因子;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性剤;ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)等のプラスミノーゲン活性化因子;ボンベシン;トロンビン;造血成長因子;腫瘍壊死因子-アルファ及び-ベータ;エンケファリナーゼ;RANTES(活性化時に調節され、正常T細胞が発現及び分泌している);ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP-1-アルファ);ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン;ミュラー管抑制物質;レラキシンA-鎖;レラキシンB-鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;酵素;ベータ-ラクタマーゼ等の微生物タンパク質;DNase;IgE;CTLA-4等の細胞毒性Tリンパ球関連抗原(CTLA);インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子(VEGF);ホルモンまたは成長因子の受容体;タンパク質AまたはD;リウマチ因子;骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、-4、-5、もしくは-6(NT-3、NT-4、NT-5、もしくはNT-6)等の神経栄養因子、またはNGF-b等の神経成長因子;血小板由来成長因子(PDGF);aFGF及びbFGF等の線維芽細胞成長因子;表皮成長因子(EGF);TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、またはTGF-β5を含むTGF-アルファ及びTGF-ベータ等の形質転換成長因子(TGF);インスリン様成長因子-I及び-II(IGF-I及びIGF-II);des(1-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP);サイトカイン;CD3、CD4、CD8、CD19、及びCD20等のCDタンパク質;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;融合ポリペプチド、すなわち、2つ以上の異種ポリペプチドまたはその断片からなり、組換え核酸によってコードされるポリペプチド;Fc含有ポリペプチド、例えば、第2のポリペプチドに融合した免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質、またはその断片;免疫コンジュゲート;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン-アルファ、-ベータ、及び-ガンマ等のインターフェロン;コロニー刺激因子(CSF)、例えば、M-CSF、GM-CSF、及びG-CSF;インターロイキン(IL)、例えば、IL-1~IL-10、IL13、IL17;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;分解促進因子;例えば、AIDSエンベロープの一部分等のウイルス抗原;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節タンパク質;CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4、及びVCAM等のインテグリン;CA125(卵巣癌抗原)またはHER2、HER3、もしくはHER4受容体等の腫瘍関連抗原;イムノアドヘシン;ならびに上記に列挙されるタンパク質のうちのいずれかの断片及び/または変異形、ならびにタンパク質、例えば、上述のタンパク質のうちのいずれか等を含むタンパク質に結合する抗体断片を含む抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られ、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる可能な変異形を除き、かかる変異形は、一般に、少量で存在する。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、別個の抗体またはポリクローナル抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。抗体断片を産生するための様々な技法が、開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質消化によって得られていた(例えば、Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992)及びBrennan et al.,Science229:81(1985)を参照されたい)。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞から直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上記に考察される抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Fab’-SH断片をE.coliから直接回収し、化学的にカップリングして、F(ab’)2断片を形成することができる(Carter et al.,Bio/Technology10:163-167(1992))。別のアプローチに従って、F(ab’)2断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を産生するための他の技法は、当業者に明らかである。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Fv断片(scFv)である。WO93/16185、米国特許第5,571,894号、及び米国特許第5,587,458号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第5,641,870号に記載される「直鎖状抗体」であってもよい。かかる直鎖状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書におけるタンパク質のアミノ酸配列変異形が企図される。例えば、タンパク質の結合親和性及び/または他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。タンパク質のアミノ酸配列変異形は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/またはそれへの挿入、及び/またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。
「ポリペプチド変異形」とは、ポリペプチドの全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する本明細書に定義されるポリペプチド、例えば、活性ポリペプチドを意味する。かかるポリペプチド変異形としては、例えば、1つ以上のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のN末端またはC末端に付加または欠失されたポリペプチドが挙げられる。通常、ポリペプチド変異形は、全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%のうちのいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。任意に、変異形ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して1つ以下の保存的アミノ酸置換を有し、あるいは天然ポリペプチド配列と比較して約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、または約10個以下のうちのいずれかの保存的アミノ酸置換を有する。
表1。
(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)非荷電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D)、Glu(E)
(4)塩基性:溶解(K)、Arg(R)、His(H)
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性:Asp、Glu
(4)塩基性:His、Lys、Arg
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本明細書に記載のポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するような方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。ポリペプチドのかかるエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリックスを使用して、ポリペプチドが親和性精製によって容易に精製されることも可能になる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の一方は1つの抗原に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、特定の抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、1つのアームがIL13に結合し、1つのアームがIL17に結合する二重特異性抗体である。
多重特異性抗体及び/または一アーム抗体及び/またはイムノアドヘシンの産生方法としてノブ・イン・ホールを使用することは、当該技術分野で周知である。Genentechに譲渡された米国特許第5,731,168号(1998年3月24日付与)を参照されたい。多重特異性抗体の生成方法を記載する他の参考文献としては、Amgenに譲渡されたPCT公開第WO2009089004号(2009年7月16日公開)、及びNovo Nordisk A/Sに譲渡された米国特許公開第20090182127号(2009年7月16日公開)が挙げられる。Marvin and Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6):649-658及びKontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9もまた参照されたい。簡潔な考察が、本明細書に提供されている。
表2。アミノ酸の特性
a水の分子量を差し引いたアミノ酸の分子量。Handbook of Chemistry and Physics,43rd ed.Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961からの値。
bA.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972からの値。
cC.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975からの値。アクセス可能な表面積は、この参考文献の図6~20に定義されている。
表3
FkpAを使用した異種ポリペプチド(例えば、多重特異性抗体)の組換え産生について、ポリペプチド(例えば、多重特異性抗体)をコードする核酸は、単離され、更なるクローニング(DNAの増幅)または発現のために複製可能なベクターに挿入される。ポリペプチド(例えば、多重特異性抗体)をコードするDNAは、従来の手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物起源のいずれかのものである。IgG、IgM、IgA、IgD、及び、IgE定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域が、この目的のために使用され得、かかる定常領域が任意のヒトまたは動物種から得られ得ることが理解される。
i.ベクター構築
本発明の多重特異性抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準の組換え技法を使用して得られ得る。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離され、配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはPCR技法を使用して合成され得る。得られた後、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能かつ当該技術分野で既知の多くのベクターが、本発明の目的のために使用され得る。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方)及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、様々な成分を含有する。ベクター成分としては、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地で培養される。
当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が、用いられ得る。以下の手順、つまり、免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカまたは陽イオン交換樹脂(SP等)または陰イオン交換(DEAE等)でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えば、Sephadex G-75を使用したゲル濾過が、好適な精製手順のうちの例示的なものである。
いくつかの態様では、本発明は、超高純度FkpAを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物は、約95.0%、約96.0%、約97.0%、約98.0%、約99.0%、または約99.5%のうちのいずれかを超えるFkpAである、FkpAを含む。いくつかの実施形態では、95%のFkpAを含む組成物は、調製物中の材料の5%未満が、FkpAの産生中に存在する細胞または細胞溶解物(例えば、タンパク質、核酸、脂質等)中に存在した他の物質である、組成物である。いくつかの実施形態では、FkpAポリペプチドの割合は、サイズ排除クロマトグラフィー(例えば、HPLC-SEC)によって測定される。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAを含む組成物は、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、または約0.1%のうちのいずれか未満の低分子量種(例えば、SECまたはSDS-PAGEによって測定される、FkpA未満の分子量を有する種)を含む。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAを含む組成物は、約2%未満の低分子量種を含む。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAを含む組成物は、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、または約0.1%のうちのいずれか未満の高分子量種(例えば、SECまたはSDS-PAGEによって測定される、FkpAを超える分子量を有する種)を含む。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAを含む組成物は、約1%未満の高分子量種を含む。
ある特定の態様では、本発明は、FkpAの存在について組換えポリペプチド試料を分析するための免疫アッセイにおいて使用するための抗体(例えば、ポリクローナル抗体及び/またはモノクローナル抗体)を生成するための、免疫原として使用するための超高純度FkpAを提供する。例えば、本抗体は、組換えポリペプチド(例えば、多重特異性抗体)が外因性FkpAを発現する細菌細胞で産生された組換えポリペプチド試料中の、FkpAを検出及び/または定量するための免疫アッセイにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、超高純度FkpAに特異的に結合するポリクローナル抗体を提供する。いくつかの態様では、ポリクローナル抗体は、FkpAの異なるエピトープに特異的に結合し、それ故にFkpA断片、変異形、誤折り畳みタンパク質等を検出するための有用性を提供する。免疫アッセイで測定される試料中のFkpAのレベルの過剰定量または過剰評価をもたらし得る、宿主細胞タンパク質不純物に対するウサギ抗体の生成を最小限に抑えるために、動物(例えば、ウサギ)は、超高純度FkpAで免疫化される。
いくつかの実施形態では、本発明は、FkpAの存在及び/または分量についての組換えポリペプチド(例えば、多重特異性抗体)試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して試料中のFkpAを検出することと、試料中で検出されたFkpAの量を1つ以上の濃度の超高純度FkpA参照標準物の検出と比較することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、調製物は、約1%、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%、または約0.01%のうちのいずれか未満の不純物を含む。いくつかの実施形態では、超高純度FkpA参照標準物は、本明細書に記載の方法によって調製される。いくつかの実施形態では、免疫アッセイは、超高純度FkpAに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAに特異的に結合する抗体は、約1%、約0.9%、約0.8%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%、約0.09%、約0.08%、約0.07%、約0.06%、約0.05%、約0.04%、約0.03%、約0.02%、または約0.01%のうちのいずれか未満の非FkpA化合物に結合する。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態では、超高純度FkpAに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAに特異的に結合する抗体は、検出抗体として使用される。いくつかの実施形態では、検出抗体は、検出剤(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、FkpAは、E.coli FkpAである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、宿主細胞(例えば、E.coli宿主細胞)内で調製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、FkpAを過剰発現する(例えば、FkpAを過剰発現したE.coli宿主細胞)。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、外因性FkpAを発現する(例えば、外因性FkpAを発現したE.coli宿主細胞)。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物であるか、または組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は、1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド調製物は、最終精製産物である。いくつかの実施形態では、超高純度FkpAに特異的に結合する抗体は、免疫アッセイにおいて、約50ng/mL、約25ng/mL、約15ng/mL、約10ng/mL、約5ng/mL、約2.5ng/mL、及び/または約1.5ng/mL未満、及び/またはそれらのうちのいずれかのFkpAを検出することができる。
本明細書に記載の精製方法で使用される多重特異性抗体は、組換え方法を含む、当該技術分野で周知の方法を使用して得ることができる。以下の項は、これらの方法に関する手引きを提供する。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドmRNAを有し、かつそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリを含むが、これらに限定されない任意の供給源から得ることができる。したがって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト組織から調製されたcDNAライブラリから好都合に得ることができる。ポリペプチドをコードする遺伝子もまた、ゲノムライブラリから、または既知の合成手順(例えば、自動核酸合成)によって得ることができる。
以下の説明は、主にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによる、ポリペプチドの産生に関する。当然ながら、当該技術分野で周知の代替の方法を用いて、ポリペプチドを調製することができることが企図される。例えば、適切なアミノ酸配列またはその部分は、固相技法を使用する直接ペプチド合成によって産生され得る(例えば、Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis W.H.Freeman Co.,San Francisco,Calif.(1969)、Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963)を参照されたい)。インビトロタンパク質合成は、手動技法を使用して、または自動で行われ得る。自動合成は、例えば、製造業者の指示を使用して、Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City,Calif.)を使用して達成され得る。ポリペプチドの様々な部分を別個に化学的に合成し、化学的または酵素的方法を使用して組み合わせて、所望のポリペプチドを産生することができる。
「ベクター」という用語は、発現ベクター及び形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
宿主細胞は、例えば、細菌、酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、多重特異性抗体を産生するための方法及び試薬を提供する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、半抗体を別個に産生することによって産生され、各半抗体は、特定のエピトープに結合するVH/VL単位を含む。いくつかの実施形態では、各半抗体は、宿主細胞内で別個に産生される。いくつかの実施形態では、各半抗体は、同じ宿主細胞内でともに産生される。半抗体は、混合され、多重特異性抗体へと組み立てられる。いくつかの実施形態では、各半抗体は、同じ宿主細胞内でともに産生される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、FkpA、DsbA、及び/またはDsbC等のシャペロンを発現して、半抗体の折り畳みを容易にする。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、IL13に結合する半抗体及びIL17に結合する半抗体から組み立てられる。
シャペロン(例えば、FkpA、Dsba、及び/またはDsbC)を使用して、E.coli内で生成されるポリペプチド(例えば、多重特異性抗体)の精製方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、多重特異性抗体の精製は、親和性クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの逐次的ステップを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、親和性クロマトグラフィー前に組み立てられる。他の態様では、多重特異性抗体は、親和性クロマトグラフィー後に組み立てられる。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、抗体の一方のアーム(すなわち、一方のVH/VL単位)がIL13に結合し、他方のアームがIL17に結合する、二重特異性抗体である。
本明細書に記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む、製剤及び製剤の作製方法もまた、本明細書に提供される。例えば、精製されたポリペプチドは、薬学的に許容される担体と組み合わされてもよい。
いくつかの態様では、本発明は、FkpAを発現する宿主細胞内で産生された組換えポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物中の組換えポリペプチドは、FkpAを含む宿主細胞タンパク質から精製されている。いくつかの実施形態では、本組成物は、FkpAを発現する宿主細胞内で産生された組換えポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
本明細書に記載の方法によって精製されたポリペプチド(例えば、多重特異性抗体)及び/または本明細書に記載の方法によって精製されたポリペプチドを含む製剤は、製品に含有され得る。いくつかの実施形態では、製品は、本明細書に記載の超高純度FkpAポリペプチドを使用して生成された抗体を含む。製品は、ポリペプチド、抗体、ポリペプチド及び/またはポリペプチド製剤を含有する容器を含み得る。好ましくは、製品は、(a)本明細書に記載のポリペプチド及び/またはポリペプチド製剤を含む組成物を容器内に含む容器、ならびに(b)対象への製剤の投与に関する指示を有する添付文書を含む。
FkpAは、典型的には高レベルでは発現されないE.coli内のシャペロンタンパク質であるが、FkpAを過剰発現するE.coliが、抗体を含むヘテロ多量体真核生物タンパク質の適切な組み立て及び折り畳みを改善するために使用されている(Zhang et al.,2003,BioTechniques,35:1032-1042)。
表4。ECPアッセイ検出
材料及び方法
抽出ステップ
FkpAを、E.coli(66F8:ΔfhuA ΔphoA ilvG2096(Valr)Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenEと命名されたW3110誘導体)内で発現させた。そのために、FkpAのORFを含有する適合性プラスミド(pACYC、Novagen,Madison,WI)を、EP1356052に記載されるように構築した(例えば、実施例9~10、特に段落[0207]を参照されたい)。0.5mLの凍結ストック培養物(10~15%のDMSOを含有)を融解し、使用して、0.5mlのテトラサイクリン溶液(5mg/ml)ならびに/または2mLのカナマイシン溶液(5mg/mL)及び2.5mlの1Mのリン酸ナトリウム溶液で補助した500mlのSoy LB培地を含有する2Lの振盪フラスコに植え付けた。培養物を、大規模培養物に拡大した。200mMのIPTGの50mLのボーラス添加を、およそ200のODで発酵物に添加した。IPTGを使用して、FkpAオープンリーディングフレーム(ORF)の発現を制御するために使用されるtacIIプロモーターを誘導した。発酵運転時間は、50時間であった。
(成熟タンパク質のアミノ酸配列に基づく)FkpAの等電点(pI)の計算値は、7.01である。pH6.0で行われる陽交換クロマトグラフィーは、標的タンパク質の良好な結合をもたらすはずである一方で、(3~6のpI値を有する)E.coliタンパク質(ECP)不純物の大半は、カラムを貫流するはずである。
SP Sepharose(登録商標)Fast Flow陽イオン-交換クロマトグラフィーを使用する、FkpA精製物の分取評価を、AKTA Explorer100(GE Healthcare)で行った。2.6cm(幅)×27.3cm(長さ)のカラム(1CV=145mL)を、この操作に使用した。全てのステップを、8.85mL/分(100cm/時)の流量で行った。カラムを、3CVの50mMの溶出緩衝液(25mMのMES、1.0MのNaCl(pH6.0))で事前平衡化し、その後、3CVの平衡化緩衝液(25mMのMES(pH6.0))で平衡化した。溶解物上清をカラムに装填し、20mLの平衡化緩衝液で追跡した。カラムを5CVの平衡化緩衝液で洗浄し、その後、50mMのMES、100mMのNaCl(pH6.0)で段階溶出させた。段階溶出後、カラムから3CVの溶出緩衝液をストリップした。
残留ECPを除去するためのSP Sepharose(登録商標)Fast Flowの潜在性を更に評価するために、第1の分取評価からの画分11~18の再クロマトグラフィーを行った。
Q Sepharose(登録商標)Fast Flow
強陰イオン-交換培地Q Sepharose(登録商標)Fast Flow(QSFF)(GE Healthcare)で充填された1mLの重力流カラムを使用して、この潜在的な第2のクロマトグラフィーステップの分析評価を行った。
表5。QSFF及びPhenyl Sepharose(登録商標)カラム画分からの分光光度データ
FkpA(mg/mL)=(吸光度(280nm)-吸光度(320nm))/0.54
表6。Q Sepharose(登録商標)Fast Flow回収データ
疎水性相互作用培地Phenyl Sepharose(登録商標)Fast Flow(低置換)(GE Healthcare)で充填された1mLの重力流カラムを使用して、この潜在的な第2のクロマトグラフィーステップの分析評価を行った。
表6。Pheny Sepharose(登録商標)(低置換)回収データ
第2の精製ステップの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)の潜在性を実証したところで、異なる疎水性を有する3つのHIC培地、つまり、Phenyl Sepharos(登録商標)(低置換)と、Octyl Sepharose(登録商標)Fast Flowと、Butyl Sepharose(登録商標)4Fast Flow(GE Healthcare)とを比較する、第2の評価を行った。
表7。カラム再生画分からの分光光度データ
FkpA(mg/mL)=(吸光度(280nm)-吸光度(320nm))/0.54
表8。HICゲル再生
異なる疎水性を有する3つのHIC培地を比較した後、追加のHICゲル、つまり、Butyl-S Sepharose(登録商標)6Fast Flow(GE Healthcare)を評価した。このゲルは、評価されたHICゲルのクロマトグラフィー培地において最も弱いHICリガンドを有する。
Butyl-S Sepharose(登録商標)6Fast FlowまたはButyl Sepharose(登録商標)4Fast Flowのいずれかを含有する1mLの重力流カラムを、直接比較した。手順は、2×3mLのPWではなく、6.0mLのPWを使用してカラムを1回ストリップしたことを除いて、Butyl-S Sepharose(登録商標)6Fast Flowについて上述の通りであった。
表9。分光光度データ:Butyl-S Sepharose(登録商標)6Fast Flow
FkpA(mg/mL)=(吸光度(280nm)-吸光度(320nm))/0.54
表10。Butyl-S Sepharose(登録商標)回収データ
この実験の目的は、カラムの、0.3Mの硫酸ナトリウムの中間洗浄が、潜在的な減少する硫酸ナトリウム勾配と同等の精製(回収及び純度)を提供するかどうかを評価することであった。
表11。Butyl-S Sepharose(登録商標)Fast Flow回収データ
FkpA(mg/mL)=(吸光度(280nm)-吸光度(320nm))/0.54
表12。Butyl-S Sepharose(登録商標)Fast Flow回収データ
Butyl-S Sepharose(登録商標)クロマトグラフィーステップを拡大して、Butyl-S Sepharose(登録商標)クロマトグラフィーステップに対して回収及び純度を比較した。一連の開発運転を行って、ステップを最適化した。分析HIC運転は、FkpAがButyl-S Sepharose(登録商標)ゲルに比較的密接に結合したことを示した。延長溶出ステップを評価して、FkpA回収の増加が得られ得るかどうかを確認した。
緩衝液及び溶液
調整緩衝液:0.6Mの硫酸ナトリウム、50mMのリン酸塩(pH7.0)
平衡化緩衝液:0.3Mの硫酸ナトリウム、50mMのリン酸塩(pH7.0)(A11)
溶出溶液:精製水(PW、A12)
再生溶液:2%のNaOH
カラム調製
この評価のために、2.6cm×9.4cm(50mL)のカラムを調製した。カラムを3CVの平衡化緩衝液で平衡化した。
140mLの調整緩衝液を、添加全体を通して緩徐に混合しながら、140mLのSP Sepharose(登録商標)FFプールに徐々に添加した。全ての調整緩衝液を添加した後、室温で30分間混合を続けた。
クロマトグラムを図9に示す。少量のブレークスルーODが観察され、これは分析評価に基づいて期待されていた。溶出ピークは、明白なテーリングを有し、約6CVの溶出後に10mAUFSに到達する。プール後物を別個の画分として収集した。2%(0.5M)の水酸化ナトリウムを再生溶液として使用して、カラム再生を行った。紫外可視分光光度分析カラム画分を表13に示す。質量平衡は、分析運転のものよりも高かったが、データは、先の分析運転から生成されたものと同様である。拡大運転は、FkpAの純度及び回収に関して同様のカラム性能を示す。第2のカラム運転は、同等のカラムプロファイルを示した。
表13。Butyl-S Sepharose(登録商標)回収
SDS-PAGEによるカラム画分の分析(図10A)は、この精製ステップが分析評価と同等であることを示し、これは、このHICステップの拡大が、SP Sepharose(登録商標)Fast Flowプール中に存在する宿主細胞タンパク質不純物の除去を複製することができたことを実証する。より高い分子量の不純物はカラムを貫流し、より低い分子量の不純物は(先のゲルによって証明される通り)カラムに密接に結合した。溶出物プールは非常に清潔であり、非常に少量のFkpAがプール後物中に観察された。染色溶液中で一晩インキュベートした後、SYPRO Ruby試薬(Bio-Rad Laboratories)を使用して、同じゲルを画像化した。SYPRO Ruby画像化は、タンパク質含有試料の分析のより高感度の検出方法である。SYPRO Ruby画像化(図10B)は、精製されたFkpAの画分が、依然として、宿主細胞タンパク質不純物及び/またはクリッピングされた形態のFkpAであり得る、いくつかのより低い分子量のバンドを有することを示す。
Butyl-S Sepharose(登録商標)クロマトグラフィーステップの拡大は、異なるHIC培地の分析評価から選択されたパラメータにより、線形であった。Butyl-S Sepharose(登録商標)は、それがこの第2の精製ステップについて評価されたHIC培地のうちで最も弱いリガンドを有するため、FkpAの最良の回収を提供する。分子純度は、この単位操作によって大いに増強され、主要な不純物バンドは、SDS-PAGE分析に基づいて、貫流中に存在するか、またはより高度に保持されているかのいずれかである。
その一次配列に基づいて、FkpAは、約26kDaのモル質量を有する。FkpAについての先の公開情報は、分子がより高い分子量で非共有結合性会合を通して泳動することを示唆する。FkpAを含有するButyl-S Sepharose(登録商標)プールと並んで、タンパク質参照物を使用して、分析評価を行って、FkpAがサイズ排除クロマトグラフィーカラム上のどこで遊走するかを決定した。
TSKgel G3000SWxl HPLC-SECカラム(7.8mm×30cm、Tosoh Bioscience)を、評価に使用した。移動相は、0.25MのKCl、0.2Mのリン酸カリウム(pH6.2)であった。カラム流量は、0.5mL/分であった。FkpAを、タンパク質標準物、つまり、抗体(約150kDa)、ウシ血清アルブミン(約66.5kDa)、及びNutropin(登録商標)(約22kDa)と比較した。
HPLC-SEC結果を図11に示す。FkpAは、抗体とBSAとの間に保持時間を有し、これは、FkpAがその一次配列から予測されるよりもずっと大きな溶液モル質量を有するという、先の参考文献を確認する(表14)。
表14。FkpA及び標準物のHPLC-SEC
Superdex200サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を選択して、FkpAから残留するより高い分子量種及びより低い分子量種を分離し、タンパク質を製剤化した。
初期Superdex200運転を、120mLのカラムで行った。最終製剤化バルクの生成のためにSuperdex200SECステップを拡大する前に、カラム画分を純度について特性評価した。
1.6cm×60cm(1CV=120mL)のSuperdex200カラム(GE Healthcare)を、このパイロット運転に使用した。カラムを1CVの0.1MのNaOHで浄化し、その後、3CVのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.5)(平衡化緩衝液)で平衡化した。
1対のAmicon Ultra10kDaユニット(Millipore Corporation)を使用して、30mLのButyl-S Sepharose(登録商標)プールを濃縮した。Amiconユニットを、残余分体積が6mL以下(1CVの5%以下)になるまで、20分間のサイクルを使用して、Eppendorf5810R遠心分離機内、3000rpmで遠心分離した。
Superdex200クロマトグラフィーステップのクロマトグラムを、図12に示す。プロファイルは、TSKgel G3000SWxl HPLC-SECカラムがより高い分子量種のより良好な解像度を産出したことを除いて、TSKgel G3000SWxl HPLC-SECカラムを使用するHPLC-SECプロファイルと実質的には違わないようである。
カラム画分32~42を、SDS-PAGEによって分析した。SDS試料緩衝液とともに室温(加熱なし)で1時間インキュベートすることによって、試料をSDS-PAGEのために調製した。通常の試料調製に対するこの修正は、試料の加熱がより低い分子量種の存在に関与するかどうかを確認するために行った。
ウエスタンブロット分析を行って、材料が、ウサギの免疫化に使用するのに十分に純粋であるか、または追加の精製作業が必要とされるかどうかどうかを決定した。この分析では、Superdex200カラムの画分37(ピーク画分、図12)を使用した。
タンパク質をトリプシンによって消化させ、UPLC-MS/MSによって分析して、1)材料中に存在するFkpAペプチド配列、及び2)試料中に他のタンパク質不純物が存在しないことを決定した。分析は、0~40%のアセトニトリルの45分間のUPLC勾配からなり、これを高解像度四重極飛行時間質量分析計に直接スプレーし、この質量分析計は、MS調査スキャンに続いて、クロマトグラフィー分離中の各連続MSスキャンから上位20個の最も豊富な前駆体イオンのMS/MSを収集した。LC-MS/MS生データファイルを、UniprotのE coli規準及びアイソフォームデータベースに対して検索し、356のFkpAペプチドを特定した(高MS/MSサンプリング速度のため、多くは同じペプチドの複数の事例であった)。質量分析計の較正に使用した内部標準物に起源を持つ、2つのβ-ガラクトシダーゼペプチドもまた見出され、それ故にFkpA試料には含有されていなかった。質量分析法を使用して、FkpAを更に特性評価し、ベータ-ガラクトシダーゼを内部対照として使用した。
表15。質量分析の結果
初期パイロット運転後、その後の運転2~4を320mLのカラムで行って、最終製剤化バルクを生成した。
2.6cm×60cmのカラム(320mLの床体積)を1CVの0.1MのNaOHで浄化し、その後、3CVのPBS(pH7.5)(平衡化緩衝液)で平衡化した。
一定分量の60mg~95mgを、運転2~4に使用した。運転1に使用したものと同じ手順を使用して、SECのための一定分量を調製した。標的最終体積は、16.0mL以下(床体積の5%以下)であった。図15は、運転2中に得られたクロマトグラムを示す。画分37~44をプールし、TSKgel G3000SWxl HPLC-SECカラムを使用して再分析した。図16は、運転2の画分37~44のTSKgel G3000SWxl HPLC-SECクロマトグラムを示す。約2%の凝集体を確認することができる。この量の凝集は、凝集体に対して生成された抗体を有するために望ましい。結果は、運転3及び4でも同様であった。
運転1からのカラム画分35~40及び運転2~4からの37~44を、SDS-PAGEによって分析した。図17(それぞれレーン2~5)を参照されたい。運転1からの材料は分解したようであり、その後の実験には使用しなかった。
Superdex200プールを、Amicon Ultra10kDaユニットを使用して2.0mg/mLの標的タンパク質濃度まで濃縮した。運転1の材料の不測かつ未知の分解原因のため、運転2~4からの材料のみを最終バルクに含めた。
表16。限外濾過及び濾過ステップからの回収
凍結融解安定性試験の背後にある目的は、試薬が、活性を損失することも、電気泳動またはSECプロファイルを変化させることもなく、最大3回の凍結融解に好適であることを確実にすることである。
75μLの一定分量の超高純度FkpAを、この研究に使用した。1つの一定分量を冷室に保持し、残りの3つを-80℃以下の冷凍庫内に置いた。1時間後、3つの凍結した一定分量を融解し、緩徐に混合した。1つの一定分量(「1回の凍結融解」)を冷室に置き、他の2つを冷凍庫に戻した。残り2つの試料についてプロセスを繰り返し、第2の凍結融解試料を試料に移行させ、第3の凍結融解試料を-80℃以下の冷凍庫内で一晩保持した。第3の試料を翌日融解した。
10μgの一定分量の凍結融解試料の各々を、SDS-PAGEによって分析した。ゲル結果(図18)は、4つの試料の各々の間の同等性を示す。
100μgの一定分量の凍結融解試料の各々を、HPLC-SECによって分析した。サイズ分類結果(図19A及び19Bならびに表17)は、4つの試料間の同等性を示す。より高い分子量種及び単量体における非常に小さな差異は、おそらく手動でのピークの統合よるものである。Superdex200運転2~4からの超高純度FkpAバルクは、タンパク質の明らかな変化はなく、3回の凍結融解に好適である。試薬を、ウサギにおいて抗体を産生するための免疫原として使用するのに、ならびにELISAアッセイの参照物として、及びウサギ抗血清からの抗FkpAを精製するための親和性カラムを構築するためのリガンドとしての機能を果たすのに、好適であると見なした。
表17。FkpAの凍結融解アッセイのHPLC-SEC分析
治療用ポリペプチドの調製物中のFkpAの除去を測定するためのアッセイで使用するために、ポリクローナル抗体を超高純度FkpAに対して生成した。以下の実施例は、ポリクローナルFkpA抗体を生成するために使用される精製方法を説明する。これらの試薬は、FkpA免疫原とともに、特異的FkpA ELISAの開発に必要であった。
プールされた抗血清に、60%の硫酸アンモニウム沈降(ASP)ステップを行った。52.7mLの硫酸アンモニウム溶液(3.8Mの硫酸アンモニウム、50mMのリン酸塩(pH7.0))を、添加全体を通して緩徐に撹拌しながら、73.0mLの抗FkpAウサギ抗血清に緩徐に添加した。添加の完了後、溶液を冷室に移行させ、一晩緩徐に混合した。
製造業者の指示に従ってPierce Kit EZ-Link Peroxidase(カタログ番号31489)を使用して、1mgのASP抗FkpA抗体をHRPにコンジュゲートした。HRPコンジュゲートされたASP抗FkpA抗体を、アッセイ希釈剤中、1/20に更に希釈し、ASP HRPコンジュゲートストックIと表記した。ASP抗FkpA抗体を一定分量に分け、ASPコーティング源と表記した。その後、ASPコーティング源を、PBS中1mg/mLまで希釈し、ASPコーティングストックIと表記した。
ELISAサンドイッチアッセイを行って、実施例6に記載されるように生成された抗IL13/IL17二重特異性抗体試料中のFkpAの量をアッセイした。ASP HRPコンジュゲートストックIを1:90に希釈した。結果は非線形性(表18)を示し、それ故に追加の抗体精製が好ましくあり得ることを示唆する。
表18。ASP ELISAサンドイッチアッセイ
*=データを計算に含めなかった、N/A=該当なし、GTR=範囲超、LTR=範囲未満
ELISAサンドイッチアッセイの線形性を改善するために、一定分量のASP抗FkpA抗体を、親和性(AF)精製及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって更に精製した。活性化グリセリルCPGに共有結合している超高純度FkpAを使用して親和性カラムを構築して、非FkpA抗体から標的抗FkpA抗体を分離した。
2.02mg/mLの超高純度FkpAの、20×1mLのバイアルを2~8℃で一晩融解し、含有物をプールした。125mLのSephadex G-25カラム(GE Healthcare)を使用して、FkpAをカップリング緩衝液(0.1Mの重炭酸ナトリウム、0.5Mの塩化ナトリウム(pH8.3))へと緩衝液交換した。カラム1CVの0.1MのNaOHで浄化し、その後、3CVのカップリング緩衝液で平衡化した。
グリセリル-CPG(Millipore Corporation)を、その高流量特徴、及び溶出相中の低pH条件に耐えるその能力のために、親和性カラムを構築するための支持体として選択した。支持体のグリセリル部分は、アミノ化学カップリング前にアルデヒドに酸化されるアルコール官能基を有する。全てのカップリングステップを室温で行った。
親和性ゲルを、1.6cmのXKカラム(GE Healthcare)に充填した。最終寸法は、1.6cm×6.3cm(CV=12.6mL)であった。カラムを、5CVのPBS、0.02%のアジ化ナトリウム(pH7.2)で洗浄し、その後、使用するまで冷室で保管した。
運転1:FkpA-CPG親和性ゲルの初期評価
60%の硫酸アンモニウムペレットのうちの25%を使用して、親和性カラム性能の初期評価を行った。ペレットを-60℃以下から融解し、室温まで温めた。120mLの3.8Mの硫酸アンモニウム、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)をペレットに添加し、ペレットを緩徐に混合して、それを懸濁させた。懸濁液を4つのSS-34遠心分離管に分け、Sorvall RC6Plus遠心分離機内、15,000rpmで30分間遠心分離した。上清を処分し、4つの遠心分離管のうちの3つを、後日の精製のために-60℃以下の冷凍庫内に再び移行させた。
Superdex200カラム(GE)を使用してSECを行って、凝集体を除去し、pH調整親和性プールを製剤化した。
FkpA-CPG運転1からの83mLのpH調整プールを、Amicon Ultra10kDaユニットを使用して6.0mL以下(1CVの≦5%)の体積まで濃縮した。13mLのpH調整プールを各ユニットに移行させた。濃縮機を、Eppendorf遠心分離機内、3,000rpmで30分間スピンさせた。濾液を除去し、pH調整プールを補充した。UF残余分の標的体積(UF残余分体積=3.8mL)が達成されるまで、プロセスを繰り返した。
ELISAサンドイッチアッセイを行って、ASP抗FkpA抗体及び親和性精製抗FkpA抗体の能力を比較して、5.31mg/mLの抗IL13/IL17を含有する、実施例6に記載されるように調製した抗IL13/IL17二重特異性抗体試料中のFkpAの量をアッセイした。アッセイパラメータを表19に示す。ASP抗FkpA抗体及びAF抗FkpA抗体の結果として生じる標準曲線を、図28A及び28Bに示す。図28A、28B、ならびに表19及び20に示されるように、親和性精製抗体は、0.78ng/mL~100ng/mLの動的範囲を有し、改善された線形性を有し、より少ないHRP検出抗体を必要とした。
表19。ASP抗FkpA抗体及びAF抗FkpA抗体の比較において使用されるパラメータ
表20。ASP抗FkpA抗体及びAF抗FkpA抗体の結果
上述の並行比較に基づいて、親和性クロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、残りのASP抗体を精製した。画分33~46は、約98%の単量体を含有する(図29)。濃度を、UV分光光度法によって0.386mg/mLであると決定した。Superdex200運転2の画分33~46を組み合わせ、前述のようにAmicon Ultra10kDaユニットを使用して濃縮した。濃度を、UV分光光度法によって1.2mg/mLであると決定し、試料をAFコーティングストックIIと表記した。
凍結融解安定性試験の背後にある目的は、試薬が、活性を損失することも、電気泳動またはSECプロファイルを変化させることもなく、最大3回の凍結融解に好適であることを確実にすることである。100μLの一定分量のAFコーティングストックIIを、この実験に使用した。1つの一定分量を冷室に保持し、残りの3つを-60℃以下の冷凍庫内に置いた。1時間後、3つの凍結した一定分量を融解し、緩徐に混合した。1つの一定分量(「1回の凍結融解」)を冷室に置き、他の2つを冷凍庫に戻した。残り2つの試料についてプロセスを繰り返し、第2の凍結融解試料を試料に移行させ、第3の凍結融解試料を-60℃以下の冷凍庫内で一晩保持した。第3の試料を翌日融解した。
表21。AF精製抗体の凍結融解アッセイのHPLC-SEC分析
AFコーティングストックI及びIIを、炭酸塩緩衝液(pH9.6)中3μg/mLに希釈し、Costar96ウェルプレート(カタログ番号9018)上に直接コーティングし、2~8℃で一晩インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)/0.05%のPolysorbate20)で洗浄し、アッセイ希釈剤(0.15Mの塩化ナトリウム[NaCl]/0.1Mのリン酸ナトリウム[NaPO4]/0.1%の魚ゼラチン/0.05%のPolysorbate20/0.05%のProclin300)で、撹拌しながら室温で1~2時間遮断し、その後、再度ELISA洗浄緩衝液で洗浄した。標準曲線(100~1.56ng/mL)及びブランクをプレートに追加し、撹拌しながら室温で2時間インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液で洗浄し、AF HRPコンジュゲートストックIを、アッセイ希釈剤との1:6000の希釈でプレートに添加し、撹拌しながら室温で2時間インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液で洗浄し、SureBlue Reserve(商標)TMB Microwell Peroxidase Substrate(Kirkegaard&Perry Labs[KPL]、カタログ番号53-00-00)をプレートに添加、室温でおよそ20分間色を発現させた。0.6Nの硫酸で反応を停止させた。450nmの波長でODを読み取り、Softmax Proデータ整理ソフトウェアを使用してデータを分析した。AFコーティングストックI及びIIから生成された標準曲線は、ほぼ重ね合わせることができた。コーティング濃度、検出抗体希釈、及びインキュベーション時間をスクリーニングして、最適化した。3ug/mLのコーティング濃度及び1/6000のAF HRPコンジュゲート希釈を、正確かつ頑強であると決定した。コーティングインキュベーション時間は、最大3日間頑強であった。
ウサギA、B、及びCのその後の採血を、溶解材料及び非溶解材料を別個に精製して、赤血球溶血が生じたかどうかに基づいてプールした。両方のプールを、60%のASPに続いて、前述の親和性クロマトグラフィー及びSECによって精製した。SEC-HPLCデータに基づいて、溶解プール(ロットBと表記)と非溶解プール(ロットCと表記)との間には有意な差異は存在しない。画分35~38は、AFコーティングストックII(ロットAと表記)材料に最も密接に似ているため、ロットB画分35~38をともにプールした(表22)。
表22。ロットAとロットBとのHPLC-SEC比較
実験計画を行って、アッセイ条件をスクリーニングし、頑強性を実証した。濃度、コンジュゲートされた希釈物、及びTMB基質インキュベーション時間等のアッセイパラメータは、異なっていた。これらのパラメータのわずかな変動は、アッセイ結果には影響を及ぼさなかった。最適な条件を表23に示す。
表23。
-70℃で保管した超高純度FkpAの安定性
アッセイ対照としての超高純度FkpAの安定性を試験するために、実施例2に記載の標準ストックIをアッセイ希釈剤中で3(低)、15(中)、75(高)ng/mLに希釈し、一定分量に分け、-70℃で保管した。凍結前に、標準曲線を使用して、1つの低、中、及び高の一定分量の濃度をELISAによって測定した。低、中、及び高の超高純度FkpA対照の一定分量の安定性を、一定分量を融解し、FkpAの濃度を決定することによって、合計18日間監視した。-70℃での保管時、低対照は不安定であった。中対照は同様の不安定性を示したが、-70℃での保管時、高対照は安定しているようであった。
半分を-70℃及び他の半分を2~8℃で合計8日間保管した新たな組の低及び中対照に対して、第2の試験を行った。凍結前に、濃度は測定しなかった。先の実験と同様に、凍結した対照の濃度は、1日目の時点で、標的濃度の計算値から30%低下し始めた。2~8℃で保管した対照の濃度は、-70℃で保管した対照よりも緩徐な速度で低下したが、低下は依然として許容範囲外であると見なされた(図34)。
標準ストックIを、アッセイ対照において使用するためのアッセイ希釈剤中の様々な量のポリソルベート中、3(低)、15(中)、または75(高)ng/mLに希釈した。アッセイ希釈剤は0.05%のポリソルベートを含有するため、0.1、0.25、0.5、及び1%のポリソルベート濃度を試験して、それが-70℃で凍結された対照の安定性を改善したかどうかを確認した。凍結前(T=0)に、FkpAの様々な溶液を試験し、上述のように合計15日間監視した。3ng/mLに希釈した全ての試料では、0.5%のポリソルベートを含有する試料のみが、15日間全てにわたって、T=0と比較して、濃度の20%未満の低下を有するようである。他の3ng/mL条件では、より大きな可変性が観察された(表24)。15ng/mLの溶液では、どの条件も、標的濃度の30%未満を超える濃度を有しなかった。0.5%または0.25%のポリソルベートを含有するものの濃度は、15日間全てにわたって、標的の20%以内のままであった(表24)。0.5%のポリソルベートは、試験した全ての対照うちで最良の回収を産出した。標的濃度及び0日目の両方からの差異パーセント(%Diff)は1~13%であり、%CVは1~10%である。0.10%のポリソルベート中で希釈した対照は、20%未満の%Diffを有したが、低対照では、20%が%CVで、より大きな可変性が存在した。全体として、増加した量のポリソルベートは、超高純度FkpAの不安定性を阻止するのに適切であるとは見なされなかった。
表24。異なる濃度のポリソルベートの比較
0.2%の魚ゼラチン、1mg/mLのApoMab(Ashkenazi,A,2008,Nature Reviews Drug Discovery,7:1001-1012)、または緩衝液C(20mMの酢酸ヒスチジン、240mMのスクロース、0.02%のPolysorbate20(pH5.5))中で3(低)、15(中)、75(高)ng/mLに希釈した時の、-70℃での超高純度FkpAの安定性を決定した。(図35A及び35B)。結果は、いくつかの異なる組成物中でのFkpAの安定性、及び全ての場合で、緩衝液C中での保管時に、-70℃で対照が安定したままであることを示す。一例として、緩衝液C中の対照回収の頑強性を、このアッセイを16回繰り返すことによって実証した(表25)。可変性は、許容範囲内であった。
表25。FkpAの検出のためのELISA
実施例3に記載のサンドイッチELISAアッセイが、異なるFkpA標準物を検出する能力を決定した。様々な標準物は、標準ストックI(実施例2に記載)、BioSource FkpA標準物カタログ番号MBS1037402、及びBioSource FkpA標準物カタログ番号MBS1182120を含んだ。使用した標準物は、1.56~100ng/mLであった。BioSource FkpA標準物カタログ番号MBS1037402及びMBS1182120は、標準ストックIよりも低いシグナル伝達を有する標準曲線を産生した(図36)。
E.coli内に、2つの異なる軽鎖を有するヒトIgG1二重特異性抗体を生成するための技法(Yu et al.,2011,Sci Transl Med3,84ra44)。この方法は、ノブ・イン・ホール技法(Ridgway et al.,1996,Protein Eng.9,617-621、Atwell et al.,1997,J Mol Biol270,26-35)を利用して、免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化を促進する。軽鎖が誤対合することなく、2つの異なる軽鎖の使用を可能にするために、各アームを、別個のE.coli細胞内でヘミマーまたは半抗体として培養した。このアプローチを使用して、抗IL17及び抗IL13の親抗体をベクターにサブクローニングし、抗IL17アームのヒトIgG4ホールとしての発現、及び抗IL13アームのヒトIgG4ノブとしての発現を可能にすることによって、抗IL13/抗IL17二重特異性抗体を生成した。IgG4ノブ重鎖定常領域の配列を配列番号15または16に示し、IgG4ホール重鎖定常領域の配列を配列番号26または27に示す。
親和性精製した抗IL13及び抗IL17半抗体を1:1の質量比で組み合わせた後、pH8.5に滴定した。組み立てプロセスから期待される二重特異性抗体の理論最大量に対して還元した、100倍の過剰モル比のL-グルタチオン(GSH)を混合物に添加し、温度を室温から35℃に調整した。2つの半抗体を酸化還元反応においてインビトロで組み立てて、抗IL13/抗IL17二重特異性抗体を形成した。酸化還元反応を35℃で12~24時間続けた。pHを6.5に調整することによって、組み立て反応を停止させ、プールを水で希釈してから、以下に記載される精製プロセスに供した。
非対合半抗体、ホモ二量体、低分子量種(LMWS)、高分子量種(HMWS)、超高分子量種(vHMWS)、酸性変異形、塩基性変異形、FkpA、DsbA、DsbC、ECP、浸出タンパク質A、E.coli DNA、及び内毒素を含む不純物の存在について、2つのロットの抗IL13/抗IL17二重特異性抗体を分析した。産物品質を表26に提示する。
表26。産物品質
超高純度FkpAに対する抗体ならびに標準及び対照の超高純度FkpAを使用するELISAによって、FkpAの濃度を決定した。抗IL13/抗IL17二重特異性抗体の各産生段階後、LC-MS/MS(液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法)によって、FkpAの存在についても試料を分析した。
超高純度FkpAに対して指向されたポリクローナル血清を、炭酸塩緩衝液(pH9.6)中3μg/mLに希釈し、Costar96ウェルプレート(カタログ番号9018)上に直接コーティングし、2~8℃で一晩インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)/0.05%のPolysorbate20)で洗浄し、アッセイ希釈剤(0.15Mの塩化ナトリウム/0.1Mのリン酸ナトリウム/0.1%の魚ゼラチン/0.05%のPolysorbate20/0.05%のProclin300)で、撹拌しながら室温で1~2時間遮断し、その後、再度ELISA洗浄緩衝液で洗浄した。超高純度FkpAの標準曲線(100~1.56ng/mL)及びブランクをプレートに追加し、撹拌しながら室温で2時間インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液で洗浄し、親和性精製抗FkpA HRPコンジュゲートストックを、アッセイ希釈剤との1:6000の希釈でプレートに添加し、撹拌しながら室温で2時間インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液で洗浄し、SureBlue Reserve(商標)TMB Microwell Peroxidase Substrate(Kirkegaard&Perry Labs、カタログ番号53-00-00)をプレートに添加、室温でおよそ20分間色を発現させた。0.6Nの硫酸で反応を停止させた。450nmの波長でODを読み取り、Softmax Proデータ整理ソフトウェアを使用してデータを分析した。
0.5mgのApomab中、1、5、10、25、及び50ppmのFkpAのFkpA標準物。0.5mgの各抗体試料及び標準物を、5mg/mLの最終濃度になるまで精製水で希釈した。400μLの変性緩衝液(7.2Mの塩酸グアニジン、0.3Mの酢酸ナトリウム(pH5.0))及び10μLの0.5MのBond-Breaker Tris(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、中性pH(Pierce)を、100μLの希釈した試料に添加し、試料を37℃で15分間インキュベートした。
抗IL13/抗IL17抗体におけるFkpAの濃度を更に低減するために、上述の4カラム手順に追加の精製ステップを追加した。POROS(登録商標)50HS陽イオン交換クロマトグラフィーを評価した。pH5.0に調整したPhenyl Sepharose(登録商標)6Fast Flow(高置換)溶出物プールの試料を、POROS(登録商標)HS50(Applied Biosystems(商標))陽イオン交換カラムに適用し、結合及び溶出モードで精製した。線形塩勾配(22CVにわたって、0~500mMの酢酸塩(pH5.8))を使用して、二重特異性抗体を溶出させた。その後、不純物の除去について試料をアッセイした。結果を表28に提示する。
表28。予備POROS(登録商標)HS50の第5のクロマトグラフィーステップの結果
表29。分析SEC-HPLC結果
表30。ELISAによって決定される抗IL13/抗IL17試料中のFkpA濃度
表31 抗IL13/抗IL17試料中のタンパク質濃度(mg/mL)
ハイスループットスクリーニングは、従来の陰イオン交換クロマトグラフィー(例えば、QSFFクロマトグラフィー)と比較して、混合モード陰イオン-交換クロマトグラフィーでの産物関連不純物の解像度の増強を示した(図37)。抗IL17単量体は、QSFFクロマトグラフィーによってほとんどまたは全く分離されなかったが、混合モードクロマトグラフィーでは、抗IL13単量体種及び抗IL17二量体種の分離の改善が観察された。
表32。産物品質
二重特異性抗体産物等のポリペプチド産物中のFkpAの低減について、いくつかのHIC樹脂をスクリーニングした。樹脂としては、Bakerbond(商標)WP Hi-Propyl、Capto(商標)Octyl、Capto(商標)Butyl、Toyopearl(登録商標)Hexyl-650C、Toyopearl(登録商標)PPG-600M、Toyopearl(登録商標)Phenyl-650M、Toyopearl(登録商標)Butyl-650M、及びToyopearl(登録商標)Ether-650Mが挙げられる。Hexyl650Cは、貫流モードで最低のFkpAレベルを産生し、Capto(登録商標)Butylが続いた(図38及び39)。ロボット工学ハイスループットスクリーニングを行って、様々な塩の種類ならびに濃度及びpH条件下、これらの樹脂に対する産物及びFkpAのバッチ結合を評価した。3つの異なるコスモトロピック塩を検査して、選択性に対する塩の種類の影響を決定した。試験した塩及び濃度範囲は、以下の通りであった。100~800mMの酢酸ナトリウム、100~400mMの硫酸ナトリウム、500~2000mMの塩化ナトリウム。加えて、5.0~7.0のpH範囲を評価した。96ウェルの底膜プレートを、各ウェルおよそ50μLの樹脂で充填し、各実験にとって適切な結合条件(塩の種類、塩濃度、pH)で平衡化した。対応する結合条件に調整した、FkpAを含有する部分的に精製された産物プール(すなわち、装填出発材料/供給ストック)を各ウェルに適用して、1μLの樹脂当たり50μgの産物の装填密度を標的とした。混合及びインキュベーションを行って、平衡を達成した後、上清を収集し、相対的産物及びFkpA含有量について分析して、装填出発材料/供給ストックに対する、得られた産物の濃縮を評価した。Hexyl650Cは、貫流モードで最低のFkpAレベルを産生し、Capto(商標)Butylが続いた。
いくつかのプロセスバージョンを評価した。プロセスの第1の例において、E.coli内で半抗体を産生した。図40Aを参照されたい。各半抗体のE.coli全細胞ブロスを、微少流体技術によってホモジナイズした。各ホモジネートプールを水で希釈し、PEIで調整し、室温でインキュベートした。その後、この調整したホモジネートプールを遠心分離して固体を分離し、続いて、一連のフィルターを通して遠心分離物を含有する半抗体を濾過した。その後、半抗体を、タンパク質Aクロマトグラフィーカラム(MabSelect SuRe(商標))を使用する親和性精製に供した。その後、上述の親和性精製された半抗体を組み合わせることによって、二重特異性抗体を組み立てた。この第1のプロセス(プロセス1)について、組み立てられた二重特異性抗体を、結合及び溶出モードで混合モード陰イオン交換クロマトグラフィー(Capto(商標)Adhere)に供し、その後、結合及び溶出モードで陰イオン交換クロマトグラフィー(Q Sepharose(登録商標)Fast Flow)に供した。その後、回収された画分を、貫流モードでHIC(Phenyl Sepharose(登録商標)6Fast Flow、高置換)に供した。最後に、二重特異性抗体を限外濾過及び透析濾過に供して、二重特異性抗体を製剤化した。あるプロセスであるプロセス2(図40B)の別の例において、組み立てられた二重特異性抗体を上述のように調製し、混合モード陰イオン交換クロマトグラフィー(Capto(商標)Adhere)に供し、その後、結合及び溶出モードで陰イオン交換クロマトグラフィー(Q Sepharose(登録商標)Fast Flow)に供した。その後、回収された画分を、貫流モードでHIC(Phenyl Sepharose(登録商標)6Fast Flow、高置換)及び結合及び溶出モードで陽イオン交換クロマトグラフィー(POROS(登録商標)50HS)に供した。最後に、二重特異性抗体を限外濾過及び透析濾過に供して、二重特異性抗体を製剤化した。
結合及び溶出Capto(商標)Adhere混合モード陰イオン交換条件は、以下の通りであった。カラムを50mMの酢酸塩(pH6.5)で平衡化した。pH6.5かつ6.5mS/cmに調整した組み立てプールを、1Lの装填樹脂当たり20g以下のタンパク質の装填密度になるまで、カラムに装填し、平衡化緩衝液で洗浄し、その後、第2の洗浄緩衝液(200mMの酢酸塩(pH6.5))で洗浄した。緩衝液のpHを低下させる(25mMの酢酸塩(pH5.2))ことによって、二重特異性抗体を溶出させた。プールを開始し、280nmでの吸光度に基づいて終結させた。
結合及び溶出QSFF陰イオン交換条件は、以下の通りであった。カラムを50mMのTris(pH8.5)で平衡化した。pH8.5に調整したCapto(商標)Adhere溶出物プールを、1Lの装填樹脂当たり50g以下のタンパク質の装填密度になるまで、カラムに装填し、平衡化緩衝液で洗浄した。緩衝液(100mMの酢酸ナトリウムを有する50mMのTris(pH8.5))の伝導度を増加させることによって、二重特異性抗体を溶出させた。プールを開始し、280nmでの吸光度に基づいて終結させた。
貫流Phenyl Sepharose(登録商標)6Fast Flow(高置換)HIC条件は、以下の通りであった。カラムを170mMの酢酸塩(pH5.5)で平衡化した。調整したQSFF溶出物プール(pH5.5)をカラムに装填した。抗IL13/抗IL17二重特異性抗体を貫流させ、その後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。産物プール収集を開始し、280nmでの吸光度に基づいて終結させた。
結合及び溶出POROS(登録商標)HS50陽イオン交換条件は、以下の通りであった。カラムを50mMの酢酸塩(pH5.5)で平衡化した。5.0mS/cmに調整したPhenyl Sepharose(登録商標)貫流プールを、1Lの装填樹脂当たり20g以下のタンパク質の装填密度になるまで、カラムに装填し、平衡化緩衝液で洗浄し、その後、第2の洗浄緩衝液(50mMの酢酸塩(pH5.8))で洗浄した。伝導度を、22カラム体積(CV)にわたって、10~100%のB(A:WFI、B:500mMの酢酸塩(pH5.8))まで線形勾配で増加させることによって、二重特異性抗体を溶出させた。プールを開始し、280nmでの吸光度に基づいて終結させた。
貫流Hexyl-650C HIC条件は、以下の通りであった。カラムを、125mMの酢酸ナトリウムを有する50mMのMOPS(pH7.0)で平衡化した。調整したQSFF溶出物プール(pH7.0)をカラムに装填した。抗IL13/抗IL17二重特異性抗体を貫流させ、その後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。産物プール収集を開始し、280nmでの吸光度に基づいて終結させた。
結合及び溶出CHT I型セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー条件は、以下の通りであった。カラムを10mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)で平衡化した。10mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)を含有するように調整したQSFF溶出物プールを、1Lの装填樹脂当たり25g以下のタンパク質の装填密度になるまで、カラムに装填し、平衡化緩衝液で洗浄した。伝導度を、20カラム体積(CV)において、0~100%のB(A:平衡化緩衝液、B:1Mの塩化ナトリウムを含有する10mMのリン酸ナトリウム(pH6.8))まで線形勾配で増加させることによって、二重特異性抗体を溶出させた。プールを開始し、280nmでの吸光度に基づいて終結させた。
2つの抗原A及びBに結合する二重特異性抗体を組み立て、精製した。抗IL13/抗IL17二重特異性抗体について上述の、FkpA、DsbA、及びDsbCを過剰発現するE.coli内で、抗A及び抗B半抗体を産生した(実施例6を参照されたい)。抗A半抗体はFc領域に「ノブ」アミノ酸置換を含み、抗B半抗体は「ホール」アミノ酸置換を含んだ。
表35。抗A/抗B産物品質及びプロセス性能
配列
別途表記されない限り、アミノ酸配列はN末端からC末端で提示され、核酸配列は5’から3’で提示される。
E.coli FkpA
アミノ酸配列-リーダー配列なし
AFADKSKLSDQEIEQTLQAFEARVKSSAQAKMEKDAADNEAKGKEYREKFAKEKGVKTSSTGLVYQVVEAGKGEAPKDSDTVVVNYKGTLIDGKEFDNSYTRGEPLSFRLDGVIPGWTEGLKNIKKGGKIKLVIPPELAYGKAGVPGIPPNSTLVFDVELLDVKPAPKADAKPEADAKAADSAKK
(配列番号1)
アミノ酸配列-全配列
MKSLFKVTLLATTMAVALHAPITFAAEAAKPATTADSKAAFKNDDQKSAYALGASLGRYMENSLKEQEKLGIKLDKDQLIAGVQDAFADKSKLSDQEIEQTLQAFEARVKSSAQAKMEKDAADNEAKGKEYREKFAKEKGVKTSSTGLVYQVVEAGKGEAPKDSDTVVVNYKGTLIDGKEFDNSYTRGEPLSFRLDGVIPGWTEGLKNIKKGGKIKLVIPPELAYGKAGVPGIPPNSTXVFDVELLDVKPAPKADAKPEADAKAADSAKK
(配列番号2)
核酸配列
atgaaatcactgtttaaagtaacgctgctggcgaccacaatggccgttgccctgcatgcaccaatcacttttgctgctgaagctgcaaaacctgctacagctgctgacagcaaagcagcgttcaaaaatgacgatcagaaatcagcttatgcactgggtgcctcgctgggtcgttacatggaaaactctctaaaagaacaagaaaaactgggcatcaaactggataaagatcagctgatcgctggtgttcaggatgcatttgctgataagagcaaactctccgaccaagagatcgaacagactctacaagcattcgaagctcgcgtgaagtcttctgctcaggcgaagatggaaaaagacgcggctgataacgaagcaaaaggtaaagagtaccgcgagaaatttgccaaagagaaaggtgtgaaaacctcttcaactggtctggtttatcaggtagtagaagccggtaaaggcgaagcaccgaaagacagcgatactgttgtagtgaactacaaaggtacgctgatcgacggtaaagagttcgacaactcttacacccgtggtgaaccgctttctttccgtctggacggtgttatcccgggttggacagaaggtctgaagaacatcaagaaaggcggtaagatcaaactggttattccaccagaactggcttacggcaaagcgggtgttccggggatcccaccgaattctaccctggtgtttgacgtagagctgctggatgtgaaaccagcgccgaaggctgatgcaaagccggaagctgatgcgaaagccgcagattctgctaaaaaataa
(配列番号3)
Claims (396)
- FkpAポリペプチドを含む細胞溶解物からの前記FkpAポリペプチドの精製方法であって、
a)遠心分離により前記細胞溶解物を浄化することと、
b)前記FkpAポリペプチドを含む前記浄化された細胞溶解物を陽イオン交換クロマトグラフィー材料に適用することと、
c)前記陽イオン交換クロマトグラフィー材料から前記FkpAポリペプチドを溶出させて、前記FkpAポリペプチドを含む陽イオン交換溶出物を生成することと、
d)前記FkpAポリペプチドを含む前記陽イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)材料に適用することと、
e)前記HIC材料から前記FkpAポリペプチドを溶出させて、HIC溶出物を生成することと、
f)前記FkpAポリペプチドを含む前記HIC溶出物をサイズ排除クロマトグラフィーに適用することと、
g)前記サイズ排除クロマトグラフィーから前記FkpAポリペプチドを溶出させることと、を含む、前記方法。 - 前記FkpAポリペプチドを含む前記溶解物が、約pH6.0である、請求項1に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィー材料が、強陽イオン交換体である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記強陽イオン交換体が、スルホプロピル基を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記スルホプロピル基が、架橋アガロースに結合している、請求項4に記載の方法。
- 前記陽イオン交換材料が、溶出前に25mMの2-(N-モルフィリノ(morphilino))エタンスルホン酸(MES)中で洗浄される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FkpAが、塩勾配を使用して前記陽イオンクロマトグラフィー材料から溶出される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩勾配が、線形勾配である、請求項7に記載の方法。
- 前記塩勾配が、9カラム体積にわたって、25mMのMES、300mMのNaClから25mMのMES、300mMのNaClまでの0~30%の勾配である、請求項8に記載の方法。
- 前記陽イオン交換溶出物が、画分で収集される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、疎水性相互作用クロマトグラフィー前にサイズ排除クロマトグラフィーによって分析される、請求項10に記載の方法。
- 少なくとも約25%のFkpAを含む画分が、更なる精製のために選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記HIC材料が、ブチル部分を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブチル部分が、架橋アガロースに結合している、請求項13に記載の方法。
- 前記陽イオン交換溶出物が、HIC前に約0.6Mの硫酸ナトリウム及び約50mMのPO4(約pH7)を含有するように調整される、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FkpA結合HIC材料が、溶出前に40mMのリン酸塩、300mMの硫酸ナトリウム(pH7.0)で洗浄される、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FkpAが、水を使用して前記HIC材料から溶出される、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HIC溶出物が、画分で収集される、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- FkpAを含む画分が、プールされる、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも約25%のFkpAを含む画分が、プールされる、請求項19に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー材料が、架橋アガロースとデキストランとの球状複合体を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイズ排除貫流物が、画分で収集される、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HIC溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー前に濃縮される、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HIC溶出物が、サイズ排除クロマトグラフィー前に約6倍~約10倍に濃縮される、請求項23に記載の方法。
- FkpAを含むサイズ排除画分が、プールされる、請求項22~24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FkpAポリペプチドが、Escherichia coli FkpAポリペプチドである、請求項1~25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FkpAポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記FkpAポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記FkpAが、細胞で発現される、請求項1~28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、原核生物細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞が、E.coli細胞である、請求項29または30に記載の方法。
- 前記細胞が、FkpAの内因性発現を超えるレベルでFkpAを発現するように操作される、請求項29~31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、微小流動化剤を使用して溶解される、請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~33のいずれか一項に記載の方法によって精製されたFkpAポリペプチドを含む組成物。
- 精製されたFkpAポリペプチドを含む組成物であって、少なくとも約98%の単量体FkpAポリペプチドを含む、前記組成物。
- 前記組成物が、約2%未満の低分子量種を含む、請求項35に記載の組成物。
- 前記組成物が、約5%以下の高分子量種を含む、請求項35または36に記載の組成物。
- 単量体FkpAポリペプチドの割合が、サイズ排除クロマトグラフィーによって検出される、請求項35~37のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約5%、約4%、約3%、約2%、または約1%未満の不純物を含む、請求項38に記載の組成物。
- 前記不純物が、FkpAに対して高分子量及び/または低分子量のポリペプチド種である、請求項39に記載の組成物。
- 前記不純物が、E.coliタンパク質(ECP)、FkpA凝集体、FkpA断片、核酸、または細胞培養培地成分のうちの1つ以上である、請求項39または40に記載の組成物。
- 前記FkpAが、1回以上の凍結融解サイクルに対して安定している、請求項34~41のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記FkpAが、3回の凍結融解サイクルに対して安定している、請求項42に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記FkpAポリペプチドの純度が、クロマトグラフィー、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはウエスタンブロット分析のうちの1つ以上によって測定される、請求項34~43のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記FkpAポリペプチドの純度が、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定される、請求項34~44のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記FkpAポリペプチドの純度が、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定される、請求項34~45のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記FkpAポリペプチドの純度が、蛍光画像化または銀染色を使用してSDSゲル電気泳動によって測定される、請求項34~44のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の非FkpAポリペプチドの存在が、ウエスタンブロット分析により示される抗FkpA抗体と免疫反応しないゲル電気泳動によって特定される種の存在によって特定される、請求項47に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記FkpAポリペプチドの凝集体の存在が、ウエスタンブロット分析により、前記天然FkpAを超える分子量を有する種の存在によって特定される、請求項48に記載の組成物。
- FkpAに特異的に結合する抗体の生成方法であって、動物を、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法によって精製されたFkpAを含む組成物に曝露または免疫化することを含む、前記方法。
- FkpAに特異的に結合する抗体の生成方法であって、動物を請求項34~49のいずれか一項に記載の組成物に曝露または免疫化することを含む、前記方法。
- 前記動物から血清を収集することを更に含み、前記血清がFkpAに特異的に結合する抗体を含む、請求項50または51に記載の方法。
- 前記血清が、FkpAに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む、請求項52に記載の方法。
- 1つ以上のモノクローナル抗体が、前記血清から単離される、請求項52または53に記載の方法。
- 前記動物が、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである、請求項50~54のいずれか一項に記載の方法。
- FkpAに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物であって、前記ポリクローナル抗体が、動物を、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法によって精製されたFkpAを含む組成物に免疫化することによって生成される、前記組成物。
- FkpAに特異的に結合するポリクローナル抗体を含む組成物であって、前記ポリクローナル抗体が、動物を、請求項34~49のいずれか一項に記載の組成物に免疫化することによって生成される、前記組成物。
- 前記ポリクローナル抗体が、前記動物の血清から収集される、請求項56または57に記載の組成物。
- FkpAに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む組成物であって、前記モノクローナル抗体が、動物を、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法によって精製されたFkpAを含む組成物に免疫化することによって生成される、前記組成物。
- FkpAに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む組成物であって、前記モノクローナル抗体が、動物を、請求項34~49のいずれか一項に記載の組成物に免疫化することによって生成される、前記組成物。
- 前記動物が、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ロバ、またはニワトリである、請求項56~60のいずれか一項に記載の組成物。
- FkpAに特異的に結合する抗体の精製方法であって、抗FkpA抗体を含む、請求項56~61のいずれか一項に記載の組成物を、約60%の最終濃度の硫酸アンモニウムになるまで、硫酸アンモニウムと接触させることと、前記溶液を遠心分離することと、前記上清を除去することと、前記ペレットをリン酸緩衝液中に溶解することと、を含む、前記方法。
- 前記リン酸緩衝液が、約50mMのリン酸ナトリウム(約pH7.0)を含む、請求項62に記載の方法。
- FkpAに特異的に結合する抗体の精製方法であって、
a)抗FkpA抗体を含む、請求項56~61のいずれか一項に記載の組成物を、約60%の最終濃度の硫酸アンモニウムになるまで、硫酸アンモニウムと接触させることと、前記溶液を遠心分離することと、前記上清を除去することと、前記ペレットをリン酸緩衝液中に溶解して、抗FkpA抗体溶液を生成することと、
b)前記抗FkpA抗体溶液を親和性クロマトグラフィー材料に適用することと、
c)前記親和性材料から前記抗体を溶出させて、前記抗FkpA抗体を含む親和性溶出物を生成することと、
d)前記硫酸アンモニウム上清をサイズ排除クロマトグラフィーに供することと、e)前記サイズ排除クロマトグラフィーから、前記精製された抗体を含む画分を収集することと、を含む、前記方法。 - 前記リン酸緩衝液が、約50mMのリン酸ナトリウム(約pH7.0)を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィー培地に結合しているFkpAを含む、請求項64または65に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー培地が、架橋デキストランである、請求項66に記載の方法。
- 前記FkpAが、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法によって精製される、請求項66または67に記載の方法。
- 前記FkpAが、請求項34~49のいずれか一項に記載の組成物に由来する、請求項66または67に記載の方法。
- 前記FkpAが、前記クロマトグラフィー培地に共有結合している、請求項66~69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FkpAが、グリセリル-制御孔ガラスカラム(グリセリル-CPG)を使用して前記クロマトグラフィー培地に結合している、請求項66~70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗FkpA抗体が、前記親和性カラムから溶出される、請求項64~71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー材料が、架橋アガロースとデキストランとの球状複合体を含む、請求項64~72のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋アガロースとデキストランとの前記球状複合体が、10,000ダルトン~600,000ダルトンの分子量を有する分子の分離範囲を有する、請求項73に記載の方法。
- 前記サイズ排除貫流物が、画分で収集される、請求項64~74のいずれか一項に記載の方法。
- 抗FkpA抗体を含むサイズ排除画分が、プールされる、請求項75に記載の方法。
- 前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項64~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、請求項50~55のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項64~77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体の約1%未満が、非FkpA化合物に特異的に結合する、請求項64~78のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項62~79のいずれか一項に記載の方法によって精製された、単離された抗FkpA抗体。
- 試料中のFkpAの定量化方法であって、検出システムを使用して前記試料中のFkpAを検出することと、前記試料中で検出されたFkpAの量を1つ以上の濃度の超高純度FkpA参照標準物の検出と比較することと、を含む、前記方法。
- 前記超高純度FkpA参照標準物が、少なくとも約95%、約96%、約97%、または約98%の単量体FkpAポリペプチドを含む、請求項81に記載の方法。
- 前記超高純度FkpA参照標準物が請求項1~33のいずれか一項に記載の方法によって調製され、請求項34~49のいずれか一項に記載のFkpA組成物を含む、請求項81または82に記載の方法。
- 前記検出システムが、免疫アッセイである、請求項81~83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫アッセイが、超高純度FkpA参照標準物に特異的に結合する抗体を含む、請求項84に記載の方法。
- FkpAの存在及び/または分量についての組換えポリペプチド試料の分析方法であって、免疫アッセイを使用して前記試料中のFkpAを検出することと、前記試料中で検出されたFkpAの量を1つ以上の濃度の超高純度FkpA参照標準物の検出と比較することと、を含む、前記方法。
- 前記超高純度FkpA参照標準物が、少なくとも約98%の単量体FkpAポリペプチドを含む、請求項86に記載の方法。
- 前記超高純度FkpA参照標準物が、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項86または87に記載の方法。
- 前記免疫アッセイが、超高純度FkpAに特異的に結合する抗体を含む、請求項84~88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記超高純度FkpAに特異的に結合する前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項89に記載の方法。
- 前記超高純度FkpAに特異的に結合する前記抗体が、前記免疫アッセイにおいて捕捉抗体として使用される、請求項89または90に記載の方法。
- 超高純度FkpAに特異的に結合する前記抗体が、検出抗体として使用される、請求項89~91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出抗体が、検出剤にコンジュゲートされる、請求項92に記載の方法。
- 検出剤が、西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項89~93のいずれか一項に記載の方法。
- FkpAに特異的に結合する前記抗体が、請求項56~61のいずれか一項に記載の組成物中に含まれるか、または請求項50~55のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項89~94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FkpAが、E.coli FkpAである、請求項81~95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、宿主細胞内で調製される組換えポリペプチドを含む、請求項81~96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、E.coli細胞である、請求項97に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、FkpAを過剰発現する、請求項97または98に記載の方法。
- 前記試料が、細胞溶解物である、請求項81~99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が、1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項81~100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物が、最終精製産物である、請求項101に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド試料中に含有される前記組換えポリペプチドが、抗体またはイムノアドヘシンである、請求項81~102のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項103に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項103または104に記載の方法。
- 試料中のFkpAの検出のための免疫アッセイ方法であって、前記試料が、宿主細胞株に由来する組換えポリペプチド調製物から得られ、前記方法が、
(a)FkpAに結合する捕捉抗体を前記試料と接触させて、それにより試料-捕捉抗体組み合わせ材料を生成することと、
(b)FkpAに結合する検出抗体を前記試料-捕捉抗体組み合わせ材料と接触させることと、
(c)前記試料-捕捉抗体組み合わせ材料に結合している前記抗体を検出することと、を含む、前記方法。 - 標準滴定曲線を使用して結合している前記検出抗体のレベルを定量化することを更に含む、請求項106に記載の方法。
- 結合している前記検出抗体のレベルに基づいて、前記試料中に存在するFkpAの量を計算することを更に含む、請求項107に記載の方法。
- 前記試料中に存在するFkpAの前記量が、前記標準滴定曲線を超高純度FkpA組成物で生成された標準滴定曲線と比較することによって決定される、請求項108に記載の方法。
- 前記超高純度FkpA組成物が、少なくとも約98%の単量体FkpAポリペプチドを含む、請求項109に記載の方法。
- 前記組成物中の前記超高純度FkpAが、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項109または110に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、前記超高純度FkpAに特異的に結合する、請求項106~111のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出抗体が、前記超高純度FkpAに特異的に結合する、請求項106~112のいずれか一項に記載の方法。
- 前記超高純度FkpAに特異的に結合する前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項112または113に記載の方法。
- FkpAに結合する前記第2の検出抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされる、請求項106~114のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリクローナル抗体が、請求項50~55のいずれか一項に記載の方法に従って生成される、請求項106~115のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫アッセイが、サンドイッチアッセイである、請求項106~116のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンドイッチアッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)である、請求項117に記載の方法。
- 前記FkpAが、E.coli FkpAである、請求項106~118のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞株に由来する前記組換えポリペプチド調製物が、E.coliから得られる、請求項106~119のいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞株が、外因性FkpAを過剰発現する、請求項120に記載の方法。
- 前記試料が、細胞溶解物である、請求項106~121のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、前記組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が、1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項106~122のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物が、最終精製産物である、請求項123に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチド調製物中に含有される前記組換えポリペプチドが、抗体またはイムノアドヘシンである、請求項106~124のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項125に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項125または126に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、IL13に結合する第1の結合ドメイン、及びIL17に結合する第2の結合ドメインを含む二重特異性抗体である、請求項125に記載の方法。
- 前記IL13が、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項128に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項128または129に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項128~130のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項128~131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項128~132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項128~133のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL17が、ヒトIL17である、請求項128~134のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の結合ドメインが、ヒトIL17AA、IL17FF、及びIL17AFに結合する、請求項128~135のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL17Aが、配列番号6または配列番号7のアミノ酸配列を含み、前記IL17Fが、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項128~136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項128~137のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号21のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項128~138のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項128~139のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号30のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項128~140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項128~141のいずれか一項に記載の方法。
- 細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物の品質アッセイであって、前記薬学的組成物の試料を請求項106~142のいずれか一項に記載の免疫アッセイ方法に供して、前記薬学的組成物中のFkpAの存在または量を検出することを含む、前記品質アッセイ。
- 約30ppm、約25ppm、約20ppm、約15ppm、約14ppm、約13ppm、約12ppm、約11ppm、約10ppm、約9ppm、約8ppm、約7ppm、約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm、または約0.1ppm以下の前記薬学的組成物中のFkpAの量である、請求項143に記載の品質アッセイ。
- 前記細菌細胞が、E.coli細胞である、請求項143または144に記載の品質アッセイ。
- 前記細菌細胞が、外因性FkpAを過剰発現する、請求項143~145のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記試料が、細胞溶解物である、請求項143~146のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記試料が、前記組換えポリペプチド調製物から得られ、前記組換えポリペプチド調製物が、1つ以上のクロマトグラフィー精製ステップに供されている、請求項143~147のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチド調製物が、最終精製産物である、請求項148に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチドが、抗体またはイムノアドヘシンである、請求項143~149のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体、または抗体断片である、請求項150に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項151に記載の品質アッセイ。
- 前記組換えポリペプチドが、IL13に結合する第1の結合ドメイン、及びIL17に結合する第2の結合ドメインを含む二重特異性抗体である、請求項151に記載の品質アッセイ。
- 前記IL13が、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項153に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項153または154に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項153~155のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項153~156のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項153~157のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項153~158のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記IL17が、ヒトIL17である、請求項153~159のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 第2の結合ドメインが、ヒトIL17AA、IL17FF、及びIL17AFに結合する、請求項153~159のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記IL17Aが、配列番号6または配列番号7のアミノ酸配列を含み、前記IL17Fが、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項153~161のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項153~162のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号21のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項153~163のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項153~164のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号30のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項153~165のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項153~166のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 前記薬学的組成物中のDsbA及び/またはDsbCの量を検出するステップを更に含む、請求項153~167のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- DsbAの量が、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm、または約0.1ppm以下である、請求項168に記載の品質アッセイ。
- DsbCの量が、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm、または約0.1ppm以下である、請求項168または169に記載の品質アッセイ。
- DsbA及び/またはDsbCの量が、免疫アッセイによって測定される、請求項168~170のいずれか一項に記載の品質アッセイ。
- 細菌細胞から調製された組換えポリペプチドを含む薬学的組成物中のFkpAの検出のためのキットであって、請求項50~55のいずれか一項に記載の方法によって調製された抗FkpA抗体、または請求項56~61のいずれか一項に記載の抗FkpA抗体の組成物を含む、前記キット。
- 前記キットが、試料中のFkpAを定量するための標準曲線を生成する際の参照標準物として使用するための、かつ/または陽性対照として使用するための超高純度FkpAを更に含む、請求項172に記載のキット。
- 前記超高純度FkpAが、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、請求項172に記載のキット。
- 組換えポリペプチドを含む組成物であって、前記組換えポリペプチドが、内因性FkpAを発現する宿主細胞内で産生され、前記組成物が、約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm、または約0.1ppm以下の濃度のFkpAを含む、前記組成物。
- 前記組成物中のFkpAの量が、免疫アッセイによって決定される、請求項175に記載の組成物。
- 前記組成物中のFkpAの量が、請求項106~124のいずれか一項に記載の免疫アッセイによって決定される、請求項175に記載の組成物。
- 組換えポリペプチドを含む組成物であって、前記組換えポリペプチドが、外因性FkpAを発現するように操作されている宿主細胞内で産生され、前記組成物が、約15ppm、約14ppm、約13ppm、約12ppm、約11ppm、約10ppm、約9ppm、約8ppm、約7ppm、約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm、または約0.1ppm以下の濃度のFkpAを含む、前記組成物。
- 前記組換えポリペプチドが、抗体である、請求項175~178のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項179に記載の抗体。
- 前記組成物が、少なくとも約0.2ppmのFkpAを含む、請求項175~180のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記宿主細胞が、外因性FkpAを発現し、前記組成物が、約13ppm以下を含む、請求項175~181のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記宿主細胞が、外因性FkpAを発現し、前記組成物が、約0.7ppm以下を含む、請求項175~182のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記宿主細胞が、外因性FkpAを発現し、前記組成物が、約6ppm以下を含む、請求項175~183のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組換えポリペプチドが、二重特異性抗体であり、前記二重特異性抗体が、IL13に結合する第1の結合ドメイン、及びIL17に結合する第2の結合ドメインを含む、請求項175~184のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記IL13が、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項185に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項185または186に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項185~187のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項185~188のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項185~189のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項185~190のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記IL17が、ヒトIL17である、請求項185~191のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の結合ドメインが、ヒトIL17AA、IL17FF、及びIL17AFに結合する、請求項185~192のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL17Aが、配列番号6または配列番号7のアミノ酸配列を含み、前記IL17Fが、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項193に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項185~194のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号21のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項185~195のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項185~196のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号30のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項185~196のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項185~198のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm、または約0.1ppm以下の濃度のDsbAを含む、請求項185~199のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中のDsbAの濃度が、免疫アッセイによって決定される、請求項200に記載の組成物。
- 前記組成物が、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm、または約0.1ppm以下の濃度のDsbCを含む、請求項185~201のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中のDsbCの濃度が、免疫アッセイによって決定される、請求項202に記載の組成物。
- 二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組換えポリペプチドが、
a)宿主細胞に、
i)第1の重鎖及び第1の軽鎖をコードする核酸であって、前記第1の重鎖及び前記第1の軽鎖が、第1の抗原結合ドメインを形成する、核酸と、
ii)第2の重鎖及び第2の軽鎖をコードする核酸であって、前記第2の重鎖及び前記第2の軽鎖が、第1の抗原結合ドメインを形成する、核酸と、
iii)FkpAポリペプチドをコードする核酸と、を導入することであって、
前記第1の重鎖及び前記第2の重鎖が、Fcドメインを形成する、導入することと、
b)前記抗体を精製することと、
を含む方法によって産生され、前記組成物が、約5ppm未満のFkpAを含む、前記組成物。 - 前記組成物が、約1ppm未満のFkpAを含む、請求項204に記載の組成物。
- 前記宿主細胞が、原核生物宿主細胞である、請求項175~205のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記宿主細胞が、グラム陰性菌である、請求項206に記載の組成物。
- 前記グラム陰性菌が、E.coliである、請求項207に記載の方法。
- 前記FkpAが、E.coli FkpAである、請求項175~208のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、精製される、請求項175~209のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体が、IL13に結合する第1の結合ドメインを含む、請求項175~210のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体が、IL17に結合する第2の結合ドメインを含む、請求項175~211のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記IL13が、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項211または212に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項211~213のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号10のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項211のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項211~215のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項211~215のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第1の結合ドメインが、配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項211~217のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記IL17が、ヒトIL17である、請求項211~218のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の結合ドメインが、ヒトIL17AA、IL17FF、及びIL17AFに結合する、請求項211~219のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL17Aが、配列番号6または配列番号7のアミノ酸配列を含み、前記IL17Fが、配列番号8または配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項220に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号26のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号27のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項219~221のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号21のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項219~222のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項219~223のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号30のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項219~223のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二重特異性抗体の前記第2の結合ドメインが、配列番号31のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項219~225のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約15ppm以下のDsbAを含む、請求項175~226のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約5ppm以下のDsbAを含む、請求項175~227のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約15ppm以下のDsbCを含む、請求項175~228のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約5ppm以下のDsbCを含む、請求項175~229のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリペプチド及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記ポリペプチドの精製方法であって、
a)前記組成物を親和性クロマトグラフィーに供して、親和性溶出物を産生することと、
b)前記親和性溶出物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成することと、
c)前記混合モード溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記ポリペプチドを含む画分を収集することと、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 多重特異性抗体及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記多重特異性抗体の精製方法であって、前記多重特異性抗体が、複数のアームを含み、各アームが、VH/VL単位を含み、前記方法が、逐次的に、
a)前記組成物をタンパク質Aクロマトグラフィーに供して、タンパク質A溶出物を産生するステップと、
b)前記タンパク質A溶出物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
c)前記混合モード溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 前記混合モードクロマトグラフィーが、混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項231または232に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項231に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項232または233に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項231~235のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HICが、貫流モードで行われる、請求項231~236のいずれか一項に記載の方法。
- 多重特異性抗体及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記多重特異性抗体の精製方法であって、前記多重特異性抗体が、複数のアームを含み、各アームが、VH/VL単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが、別個に産生され、前記方法が、逐次的に、
a)前記多重特異性抗体の各アームをタンパク質Aクロマトグラフィーに供して、前記多重特異性抗体の各アームのタンパク質A溶出物を産生するステップと、
b)前記多重特異性抗体を含む組成物を産生するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームのタンパク質A溶出物を含む混合物を形成するステップと、
c)前記多重特異性抗体を含む前記組成物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記混合モード溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)に供し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 前記混合モードクロマトグラフィーが、混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項238に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項238または239に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項238~240のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、貫流モードで行われる、請求項238~241のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モード溶出物が、疎水性相互作用クロマトグラフィー前に陰イオン交換クロマトグラフィーに供される、請求項231~242のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項243に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体を含む前記疎水性相互作用クロマトグラフィー画分を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体を含む画分を収集するステップを更に含む、請求項231~244のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項245に記載の方法。
- ポリペプチド及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記ポリペプチドの精製方法であって、
a)前記組成物を親和性クロマトグラフィーに供して、親和性溶出物を産生することと、
b)前記親和性溶出物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成することと、
c)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成することと、
d)前記陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記ポリペプチドを含む画分を収集することと、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 多重特異性抗体及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記多重特異性抗体の精製方法であって、前記多重特異性抗体が、複数のアームを含み、各アームが、VH/VL単位を含み、前記方法が、逐次的に、
a)前記組成物をタンパク質Aクロマトグラフィーに供して、タンパク質A溶出物を産生するステップと、
b)前記タンパク質A溶出物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
c)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成するステップと、
d)前記陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 多重特異性抗体及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記多重特異性抗体の精製方法であって、前記多重特異性抗体が、複数のアームを含み、各アームが、VH/VL単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが、別個に産生され、前記方法が、逐次的に、
a)前記多重特異性抗体の各アームをタンパク質Aクロマトグラフィーに供して、前記多重特異性抗体の各アームのタンパク質A溶出物を産生するステップと、
b)前記多重特異性抗体を含む組成物を産生するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームのタンパク質A溶出物を含む混合物を形成するステップと、
c)前記多重特異性抗体を含む前記組成物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成するステップと、
e)前記陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 前記混合モードクロマトグラフィーが、混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項247~249のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項247に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項248~250のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項247~252のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項247~253のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、貫流モードで行われる、請求項247~254のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体を含む前記疎水性相互作用クロマトグラフィー画分を陽イオン交換クロマトグラフィーに供するステップを更に含む、請求項247~255のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項247~256のいずれか一項に記載の方法。
- ポリペプチド及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記ポリペプチドの精製方法であって、
a)前記組成物を親和性クロマトグラフィーに供して、親和性溶出物を産生することと、
b)前記親和性溶出物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成することと、
c)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成することと、
d)前記陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記ポリペプチドを含む画分を収集することと、
e)前記疎水性相互作用溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ポリペプチドを含む画分を収集することと、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 多重特異性抗体及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記多重特異性抗体の精製方法であって、前記多重特異性抗体が、複数のアームを含み、各アームが、VH/VL単位を含み、前記方法が、逐次的に、
a)前記組成物をタンパク質Aクロマトグラフィーに供して、タンパク質A溶出物を産生するステップと、
b)前記タンパク質A溶出物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
c)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成するステップと、
d)前記陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、
e)前記疎水性相互作用溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ポリペプチドを含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 多重特異性抗体及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記多重特異性抗体の精製方法であって、前記多重特異性抗体が、複数のアームを含み、各アームが、VH/VL単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが、別個に産生され、前記方法が、逐次的に、
a)前記多重特異性抗体の各アームをタンパク質Aクロマトグラフィーに供して、前記多重特異性抗体の各アームのタンパク質A溶出物を産生するステップと、
b)前記多重特異性抗体を含む組成物を産生するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームのタンパク質A溶出物を含む混合物を形成するステップと、
c)前記多重特異性抗体を含む前記組成物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成するステップと、
e)前記陰イオン交換溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、
f)前記疎水性相互作用溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、前記ポリペプチドを含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 前記混合モードクロマトグラフィーが、混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項258~260のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項258に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項259~261のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項258~263のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項258~264のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、貫流モードで行われる、請求項258~265のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項258~266のいずれか一項に記載の方法。
- ポリペプチド及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記ポリペプチドの精製方法であって、逐次的に、
a)前記組成物を親和性クロマトグラフィーに供して、親和性溶出物を産生するステップと、
b)前記親和性溶出物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
c)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成するステップと、
d)前記陰イオン交換溶出物をヒドロキシアパパタイト(hydroxyapapatite)クロマトグラフィーに供し、前記ポリペプチドを含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 多重特異性抗体及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記多重特異性抗体の精製方法であって、前記多重特異性抗体が、複数のアームを含み、各アームが、VH/VL単位を含み、前記方法が、逐次的に、
a)前記組成物をタンパク質Aクロマトグラフィーに供して、タンパク質A溶出物を産生するステップと、
b)前記タンパク質A溶出物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
c)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成するステップと、
d)前記陰イオン交換溶出物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 多重特異性抗体及び1つ以上の不純物を含む組成物からの前記多重特異性抗体の精製方法であって、前記多重特異性抗体が、複数のアームを含み、各アームが、VH/VL単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが、別個に産生され、前記方法が、逐次的に、
a)前記多重特異性抗体の各アームをタンパク質Aクロマトグラフィーに供して、前記多重特異性抗体の各アームのタンパク質A溶出物を産生するステップと、
b)前記多重特異性抗体を含む組成物を産生するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームのタンパク質A溶出物を含む混合物を形成するステップと、
c)前記多重特異性抗体を含む前記組成物を混合モードクロマトグラフィーに供して、混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記混合モード溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、陰イオン交換溶出物を生成するステップと、
e)前記陰イオン交換溶出物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集し、前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記組成物からの産物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 前記混合モードクロマトグラフィーが、混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項268~270のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項271に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項269~272のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項268~273のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで行われる、請求項268~274のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、貫流モードで行われる、請求項268~275のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体を含む前記ヒドロキシアパタイト相互作用クロマトグラフィー画分を限外濾過に供するステップを更に含む、請求項231~245または256~267のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体を含む前記陽イオン交換画分を限外濾過に供するステップを更に含む、請求項245~246または256~267のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体を含む前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー画分を限外濾過に供するステップを更に含む、請求項267~276のいずれか一項に記載の方法。
- 前記限外濾過が、第1の限外濾過、透析濾過、及び第2の限外濾過を逐次的に含む、請求項277~279のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、アガロースに結合しているタンパク質Aを含む、請求項232~233、235~246、248~250、252~257、259~261、263~270、または269~276のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、MAbSelect(商標)、MAbSelect(商標)SuRe、及びMAbSelect(商標)SuRe LX、Prosep-VA、Prosep-VA Ultra Plus、Protein A Sepharose(登録商標)fast flow、またはTyopearl Protein Aクロマトグラフィーである、請求項281に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、タンパク質A平衡化緩衝液、タンパク質A装填緩衝液、またはタンパク質A洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記平衡化緩衝液、装填緩衝液、及び/または洗浄緩衝液が、約pH7~約pH8である、請求項281または282に記載の方法。
- 前記タンパク質A平衡化緩衝液が、約pH7.7である、請求項283に記載の方法。
- 前記タンパク質A平衡化緩衝液が、約25mMのTris及び約25mMのNaClを含む、請求項283または284に記載の方法。
- 前記タンパク質Aクロマトグラフィーが、装填後に平衡化緩衝液で洗浄される、請求項283~285のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の洗浄及び第3の洗浄を更に含み、前記第2の洗浄が、1Mのアルギニンであり、前記第3の洗浄が、平衡化緩衝液である、請求項286に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、pH勾配によって前記タンパク質Aクロマトグラフィーから溶出される、請求項283~287のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、低pHを有するタンパク質A溶出緩衝液を前記タンパク質Aクロマトグラフィーに適用することによって、タンパク質Aから溶出される、請求項283~288のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質A溶出緩衝液が、約150mMの酢酸(約pH2.8または約pH2.9)を含む、請求項289に記載の方法。
- 前記タンパク質A溶出物が、プールされ、前記溶出物のOD280が、約0.5を超える、請求項283~290のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、四級アミン及び疎水性部分を含む、請求項231~291のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、四級アミン及び高架橋アガロースに結合している疎水性部分を含む、請求項231~292のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、N-ベンジル-n-メチルエタノールアミンを含む、請求項231~293のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、Capto(商標)adhereクロマトグラフィーである、請求項294に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び/または混合モード洗浄緩衝液が、約pH6~約pH7である、請求項231~295のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び/または混合モード洗浄緩衝液が、約pH6.5である、請求項296に記載の方法。
- 前記混合モード事前平衡化緩衝液が、約200mMの酢酸塩または約500mMの酢酸塩を含む、請求項296または297に記載の方法。
- 前記混合モード平衡化緩衝液が、約50mMの酢酸塩を含む、請求項296~298のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、請求項296~299のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄緩衝液が、約50mMの酢酸塩(約pH6.5)または約200mMの酢酸塩(約pH6.5)である、請求項300に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体が、pH勾配によって前記混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項231~301のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体が、低pHを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項231~302のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モード溶出緩衝液が、約25mMの酢酸塩(約pH5.2または約pH5.0)を含む、請求項303に記載の方法。
- 前記混合モード溶出物が、プールされ、前記溶出物のOD280が、約0.5超~約1.0である、請求項231~304のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)が、疎水性部分を含む、請求項231~267のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フェニル部分を含む、請求項306に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、架橋アガロースに結合している疎水性部分を含む、請求項306または307に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、架橋アガロースに結合しているフェニル部分またはブチル部分を含む、請求項306~308のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、phenyl Sepharose(登録商標)クロマトグラフィーまたはButyl Sepharose(登録商標)クロマトグラフィーである、請求項309に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用交換クロマトグラフィーが、HIC平衡化緩衝液、HIC装填緩衝液、またはHIC洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記HIC平衡化緩衝液、前記装填緩衝液、及び/または前記HIC洗浄緩衝液が、約pH5~約pH6である、請求項306~310のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HIC平衡化緩衝液、前記装填緩衝液、及び/または前記洗浄緩衝液が、約pH5.5である、請求項311に記載の方法。
- 前記HIC平衡化緩衝液及び前記洗浄緩衝液が、約170mMの酢酸塩を含む、請求項311または312に記載の方法。
- 前記HIC装填緩衝液が、50mMのTris、100mMの酢酸ナトリウム(pH約5.5)である、請求項311~313のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、装填後にHIC洗浄緩衝液で洗浄される、請求項311~314のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ヘキシル部分を含む、請求項306~315のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ヒドロキシル化メタクリルポリマーに結合している疎水性部分を含む、請求項306に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ヒドロキシル化メタクリルポリマーに結合しているヘキシル部分を含む、請求項316または317に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、TOYOPEARL(登録商標)Hexyl650Cである、請求項318に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用交換クロマトグラフィーが、HIC平衡化緩衝液、HIC装填緩衝液、またはHIC洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記HIC平衡化緩衝液、前記HIC装填緩衝液、及び/または前記HIC洗浄緩衝液が、約pH6~約pH8である、請求項316~319のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HIC平衡化緩衝液、前記装填緩衝液、及び/または前記洗浄緩衝液が、約pH7.0である、請求項320に記載の方法。
- 前記HIC平衡化緩衝液及び前記洗浄緩衝液が、約50mMの3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)及び125mMの酢酸塩を含む、請求項320または321に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、装填後にHIC洗浄緩衝液で洗浄される、請求項316~322のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性相互作用溶出物が、プールされ、前記溶出物のOD280が、約0.5超~約1.0である、請求項306~323のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン交換クロマトグラフィーが、四級アミンを含む、請求項243、244、または247~324のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、架橋アガロースに結合している四級アミンを含む、請求項325に記載の方法。
- 前記混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーが、QSFFクロマトグラフィーである、請求項326に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、陰イオン交換事前平衡化緩衝液、陰イオン交換平衡化緩衝液、または陰イオン交換装填緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記陰イオン交換事前平衡化緩衝液、前記陰イオン交換平衡化緩衝液、及び/または陰イオン交換前記装填緩衝液が、約pH8~約pH9である、請求項325~327のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換事前平衡化緩衝液、前記陰イオン交換平衡化緩衝液、及び/または前記陰イオン交換装填緩衝液が、約pH8.5である、請求項328に記載の方法。
- 前記陰イオン交換事前平衡化緩衝液が、約50mMのTris及び約500mMの酢酸ナトリウムまたは約100mMの酢酸ナトリウムを含む、請求項328または329に記載の方法。
- 前記陰イオン交換平衡化緩衝液が、約50mMのTrisを含む、請求項328~330のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、装填後に陰イオン交換平衡化緩衝液で洗浄される、請求項328~331のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体が、塩勾配によって前記陰イオン交換クロマトグラフィーから溶出される、請求項328~332のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体が、増加した塩濃度を有する陰イオン交換溶出緩衝液を前記陰イオン交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記陰イオン交換クロマトグラフィーから溶出される、請求項328~333のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換溶出緩衝液が、約50mMのTris及び約100mMの酢酸ナトリウム(約pH8.5)を含む、請求項334に記載の方法。
- 前記陰イオン交換溶出物が、プールされ、前記溶出物のOD280が、約0.5超~約1.0である、請求項328~335のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである、請求項267~280のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、CHT I型セラミックヒドロキシアパプタイト(hydroxyapaptite)クロマトグラフィーである、請求項337に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、ヒドロキシアパタイト緩衝液Aまたはヒドロキシアパタイト緩衝液Bのうちの1つ以上を使用し、前記ヒドロキシアパタイト緩衝液Bが、ヒドロキシアパタイト緩衝液Aと比較してより高い伝導度を有する、請求項337または338に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイト緩衝液Aが、約10mMのリン酸ナトリウム(約pH6.8)を含む平衡化緩衝液である、請求項339に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイト緩衝液Bが、約10mMのリン酸ナトリウム及び約1M塩化ナトリウム(約pH6.8)を含む、請求項339または340に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体が、ヒドロキシアパタイト緩衝液A中のヒドロキシアパタイト緩衝液Bの勾配を使用して、ヒドロキシアパタイド(hydroxyapaptide)クロマトグラフィーから溶出される、請求項339~341のいずれか一項に記載の方法。
- 前記勾配が、線形勾配である、請求項342に記載の方法。
- 前記勾配が、0%のヒドロキシアパプタイト緩衝液Bから100%のヒドロキシアパプタイト緩衝液Bへと増加する、請求項342または343に記載の方法。
- 前記勾配が、約20カラム体積中、0%のヒドロキシアパプタイト緩衝液Bから100%のヒドロキシアパプタイト緩衝液Bへと増加する、請求項342~344のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイト溶出物が、プールされ、前記溶出物のOD280が、約0.5超~約1.0である、請求項337~345のいずれか一項に記載の方法。
- 陽イオン交換クロマトグラフィーが、カルボン酸部分またはスルホン酸部分を含む、請求項245~246または256~326のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カルボン酸部分または前記スルホン酸部分が、スルホプロピル、スルホエチル、スルホイソブチル、またはカルボキシル部分である、請求項347に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、架橋アガロースに結合しているカルボン酸部分またはスルホン酸部分を含む、請求項347または348のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換材料が、POROS(登録商標)HS50、POROS(登録商標)HS20、SO3 Monolith、S Ceramic HyperD、スルホプロピル-Sepharose(登録商標)Fast Flow(SPSFF)、SP-Sepharose(登録商標)XL(SPXL)、CM Sepharose(登録商標)Fast Flow、Capto(商標)S、Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3、またはFractogel COOである、請求項348または349に記載の方法。
- 前記陽イオン交換装填密度が、約20g/L未満である、請求項347~350のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、陽イオン交換事前平衡化緩衝液、陽イオン交換平衡化緩衝液、陽イオン交換装填緩衝液、または陽イオン交換洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記陽イオン交換事前平衡化緩衝液、前記陽イオン交換平衡化緩衝液、前記陽イオン交換装填緩衝液、及び/または陽イオン交換洗浄緩衝液が、約pH5.0~約pH6.0である、請求項347~351のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換陽イオン交換、前記平衡化緩衝液、前記陽イオン交換装填緩衝液、及び/または陽イオン交換洗浄緩衝液が、約pH5.5または約pH5.8である、請求項352に記載の方法。
- 前記陽イオン交換平衡化緩衝液が、50mMの酢酸ナトリウムを含む、請求項352または353に記載の方法。
- 前記陽イオン交換洗浄緩衝液が、50mMの酢酸ナトリウムを含む、請求項352~354のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、装填後に平衡化緩衝液で洗浄される、請求項352~355のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体が、塩勾配によって前記陽イオン交換クロマトグラフィーから溶出される、請求項352~356のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは多重特異性抗体が、増加した塩濃度を有する陽イオン交換溶出緩衝液を前記陽イオン交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記陽イオン交換クロマトグラフィーから溶出される、請求項352~357のいずれか一項に記載の方法。
- 前記陽イオン交換溶出緩衝液が、500mMの酢酸ナトリウム(約pH5.8)を含む、請求項358に記載の方法。
- 前記溶出が、10%~100%の陽イオン交換溶出緩衝液の勾配溶出である、請求項359に記載の方法。
- 前記陽イオン交換溶出物が、プールされ、前記溶出物のOD280が、約0.5超~約1.0である、請求項352~360のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドまたは前記多重特異性抗体が、細胞内で産生される、請求項251~361のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記アームが、細胞内で産生される、請求項361に記載の方法。
- 前記細胞が、原核生物細胞である、請求項362または363に記載の方法。
- 前記原核生物細胞が、E.coli細胞である、請求項364に記載の方法。
- 前記細胞が、1つ以上のシャペロンを発現するように操作される、請求項364または365に記載の方法。
- 前記シャペロンが、FkpA、DsbA、またはDsbCのうちの1つ以上である、請求項366に記載の方法。
- 前記シャペロンが、E.coliシャペロンである、請求項366または367に記載の方法。
- 前記細胞が溶解されて、前記ポリペプチドまたは前記多重特異性抗体を含む細胞溶解物を生成する、請求項362~368のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が溶解されて、タンパク質Aクロマトグラフィー前に前記多重特異性抗体または前記多重特異性抗体のアームを含む細胞溶解物を生成する、請求項369に記載の方法。
- 前記細胞が、微小流動化剤を使用して溶解される、請求項369または370に記載の方法。
- ポリエスリエンイミン(polyethlyeneimine)(PEI)が、クロマトグラフィー前に前記細胞溶解物に添加される、請求項369~371のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PEIが、約0.4%の最終濃度になるまで前記溶解物に添加される、請求項372に記載の方法。
- 前記細胞溶解物が、遠心分離によって浄化される、請求項369~373のいずれか一項に記載の方法。
- 前記産物特異的不純物が、非対合抗体アーム、抗体ホモ二量体、凝集体、高分子量種(HMW)、低分子量種(LMW)、酸性変異形、または塩基性変異形のうちの1つ以上である、請求項251~373のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記組成物中のE.coliタンパク質(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出タンパク質A、核酸、細胞培養培地成分、またはウイルス不純物のうちのいずれか1つの量を低減する、請求項251~375のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項232~245、247~257、259~267、または269~376のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の第1のアームが、IL13に結合する、請求項377に記載の方法。
- 前記IL13が、ヒトIL13である、請求項378に記載の方法。
- 前記IL13が、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項378または379に記載の組成物。
- 前記多重特異性抗体の前記第1のアームが、配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項378~380のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記第1のアームが、配列番号13のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号14のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項378~381のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記第1のアームが、配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項378~382のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記第1のアームが、配列番号16のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項378~383のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記第1のアームが、配列番号17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項378~384のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体の第2のアームが、IL17に結合する、請求項378~385のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL17が、ヒトIL17である、請求項386に記載の方法。
- 前記IL17が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項386または387に記載の組成物。
- 前記多重特異性抗体の第2のアームが、配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項386~388のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記第2のアームが、配列番号25のアミノ酸配列を含むVH配列、及び配列番号26のアミノ酸配列を含むVL配列を含む、請求項386~389のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記第2のアームが、配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項386~390のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記第2のアームが、配列番号28のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項386~391のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記第2のアームが、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項386~393のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項231~393のいずれか一項に記載の方法によって精製されたポリペプチドまたは多重特異性抗体を含む、組成物であって、約5%、4%、3%、2%、または1%以下の産物特異的不純物を含む、前記組成物。
- 前記産物特異的不純物が、非対合抗体アーム、抗体ホモ二量体、凝集体、高分子量種(HMW)、低分子量種(LMW)、酸性変異形、または塩基性変異形のうちの1つ以上である、請求項394に記載の方法。
- 前記組成物が、約未満を含み、組成物が、前記組成物中、約5%、4%、3%、2%、または1%以下のE.coliタンパク質(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出タンパク質A、核酸、細胞培養培地成分、またはウイルス不純物のうちのいずれか1つを含む、請求項394または395に記載の方法。
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