KR20220122678A - 엔테로바이러스의 정제된 조성물 및 글루타티온 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엔테로바이러스의 정제된 조성물, 그의 제약 조성물 및 엔테로바이러스의 정제를 위한 글루타티온 친화성 크로마토그래피 방법에 관한 것이다.

Description

엔테로바이러스의 정제된 조성물 및 글루타티온 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제 방법

발명의 분야

본 발명은 엔테로바이러스의 정제된 조성물 및 엔테로바이러스의 정제를 위한 글루타티온 친화성 크로마토그래피 방법에 관한 것이다.

전자적으로 제출된 서열 목록 참조

본 출원의 서열 목록은 파일명이 24943WOPCT-SEQLIST-17NOV2020.txt이고 생성 날짜가 2020년 11월 17일이고, 크기가 17.6 kb인 ASCII 형식의 서열 목록으로서 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다. EFS-Web을 통해 제출된 이 서열 목록은 명세서의 일부이며 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

피코나비리다에(Picornaviridae)과의 엔테로바이러스(Enterovirus) 속은 폴리오바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 번호가 매겨진 엔테로바이러스, 및 리노바이러스를 포함한 몇몇 종의 인간 병원체를 함유하는 작고 외피가 없는 단일 가닥 양성 센스 RNA 바이러스이다 [1]. 널리 연구된 폴리오바이러스 외에도, 비-폴리오 엔테로바이러스 예컨대 EV-A71 (수족구병) [2], EV-D68 (호흡기 질환) 및 콕사키바이러스 A24 (급성 출혈성 결막염) [3]로 인한 질환에 대한 백신 및 치료제 개발에 대한 연구가 유입되고 있다. 엔테로바이러스는 또한 종양용해성 바이러스 면역요법으로 사용하기 위해 평가되었다 [4]. 야생형 균주로부터 유래된 콕사키바이러스 A21 (CVA21)은 세포 표면 수용체 ICAM-1을 과발현하는 종양의 그의 선택적 감염 및 종양용해로 인해 여러 유형의 암 치료제로서 현재 1b/2상 임상 시험에서 평가되고 있다 [5].

엔테로바이러스 바이러스 백신 및 면역요법에 대한 수요 증가는 통상적인 생산 플랫폼에 도전할 수 있을 것이다. 구배 초원심분리는 통상적으로 캡시드 및 불순물 청소를 함유하는 전체 게놈의 농축에 이용되나, 그의 처리량이 낮고 노동 집약적인 프로토콜로 인해 정제 공정에서 잠재적인 병목현상이 될 수 있다 [6] (도 1a). 재조합 아데노-연관 바이러스 유전자 요법 정제 플랫폼에 의해 입증된 바와 같이, 구배 초원심분리에서 크로마토그래피-기반 방법으로의 이동은 확장성 및 생산성을 개선시킬 수 있다 [7]. 빈 (게놈 결핍; 생성물 불순물) 및 전체 (게놈 함유; 표적 생성물) 엔테로바이러스 입자 분리에 대한 어떠한 크로마토그래피 기술도 입증되지 않았다. 감염성, 성숙 비리온의 정제된 조성물을 생성하기 위해 빈 캡시드 및 오염 불순물을 제거할 수 있는 구배 초원심분리에 대한 크로마토그래피-기반 대안이 여전히 필요하다. 이것은 대규모 상업용 제조에 더 적합한 엔테로바이러스 정제 공정을 가능하게 할 것이다.

본 발명은 CVA21의 정제된 조성물이며, 여기서 게놈 대 감염가 비가 약 5000 게놈/pfu 미만이거나; 입자 대 감염가 비가 약 5000 입자/pfu 미만이거나; 역상 HPLC 또는 UPLC에 의해 측정 시 VP0 대 VP2 비가 약 0.01 미만이거나; 또는 CE-SDS에 의해 측정 시 총 VP1+VP2+VP3+VP4 피크 면적/총 피크 면적이 적어도 95%인 CVA21의 정제된 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기에 기재된 정제된 조성물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 제약 조성물을 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 불순물로부터 엔테로바이러스를 정제하기 위한 글루타티온 친화성 크로마토그래피의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 감염된 숙주-세포 배양 수확물로부터 게놈-함유 완전 성숙 엔테로바이러스 비리온을 선택적으로 포획 및 농축시킴으로써, 1종 이상의 불순물, 예컨대 비감염성 게놈-결핍 엔테로바이러스 프로캡시드, 숙주-세포 단백질 (HCP), 숙주-세포 DNA (HC-DNA), 및 배지-관련 불순물 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA)을 제거한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 불순물로부터 엔테로바이러스를 정제하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피의 용도를 포함한다.

본 발명의 전술한 및 기타 목적, 특색 및 이점은 첨부 도면에 예시된 바와 같이, 본 발명의 다양한 실시양태에 대한 하기 보다 특정한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 1a-b: a: 구배 초원심분리 공정에 대한 설명. 정화된 세포 배양 수확물을 먼저 부피 감소를 위해 농축한다. 구배는 초원심분리기 관에서 준비하고 샘플을 상단에 로딩한다. 원심분리 후, 구배는 분획화하고, 선택된 분획은 풀링한다. 풀링된 분획은 투석하여 구배 용액을 제거한다. b: GSH 친화성 크로마토그래피 공정에 대한 설명. 정화된 세포 배양 수확물을 GSH 친화성 컬럼에 직접 로딩한다. 컬럼을 세척하여 불순물을 제거하고 정제된 바이러스를 용리한다. 컬럼은 추후 사용을 위해 재생시킬 수 있다.
도 2: 엔테로바이러스 형태형성 및 어셈블리. VP0+ VP1 + VP3으로 이루어진 5개의 프로토머가 어셈블리하여 오량체를 형성한다. 빈 프로캡시드는 자유 오량체의 가역적 어셈블리로부터 형성될 수 있다. 12개의 오량체가 복제 소기관에서 새로 합성된 게놈을 응축 및 캡시드화하여 프로비리온을 형성하고, VP0은 자가촉매적으로 절단되어 VP4+VP2를 형성하고 성숙 비리온이 형성된다. 성숙 비리온은 VP4를 함유하는 유일한 입자이며 전염성이 있을 수 있으나, 모든 성숙 비리온이 전염성이 있을 수 있는 것은 아니다. 성숙 비리온은 A-입자와 A-입자의 빈 캡시드로 분해될 수 있다. [10]으로부터 적합화된다.
도 3: Akta 퓨어(Pure)를 사용하고 CVA21을 사용하여 유니콘(UNICORN) 소프트웨어에 의해 분석한 GSH 친화성 크로마토그래피 크로마토그램 작업을 위한 예시적인 크로마토그래피. mL로의 GSH 친화성 크로마토그래피 작업 부피에 대한 mAU로의 280 nm에서의 흡광도 (UV 1_280, 실선) 트레이스 및 mS/cm로의 전도도 (Cond, 점선) 트레이스. 상단 도면은 전체 크로마토그램을 나타낸다. 상단 도면의 점선 박스 안에 도시된 하단 도면은 세척, 용리 및 스트립 단계를 나타낸다.
도 4: CVA21을 사용하는 GSH 친화성 크로마토그래피 공정의 은 염색과 12% 아크릴아미드 Bis-Tris SDS-PAGE 환원. 정화된 수확물의 숙주 세포 및 배지 불순물은 GSH 통과 (GSH FT) 및 세척 (GSH W1-2) 단계에서 청소되었다. CVA21은 VP1-VP2-VP3 바이러스 캡시드 밴드만 관찰되고 (VP4 (7 kDa) 겔에서 흘러나옴) 최소 VP0로 고농도 및 순도 (미량의 BSA 검출됨)에서 용리되었다. GSH 용리 (GSH 용리액) 샘플을 구배 초원심분리 정제된 (UC 퓨어) CVA21과 비교하였다.
도 5: 모세관 전기영동 정량적 웨스턴 블롯 (프로테인 심플(Protein Simple))을 사용하여 초원심분리 정제 물질 (UC 퓨어)에 대한 CVA21 정화된 수확물 및 GSH 크로마토그래피 통과 (GSH FT) 및 용리 (GSH 용리) 샘플의 상대적 비교. 항-VP1 폴리클로날 항체 (pAb)에 의해 검출된 총 캡시드 입자 및 항-VP4 pAb로 검출된 VP0/VP4 신호 비. 높은 VP0/VP4 비 (많은 양의 VP0 함유 입자: 빈 프로캡시드, 프로비리온, 오량체, 프로토머)을 가진 입자는 통과하여 흘렀으며, 한편 낮은 VP0/VP4 (많은 양의 VP4 함유 입자: 성숙 비리온만) 비를 가진 바이러스 입자는 GSH 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리되었다. UC 퓨어와 비교하여, GSH 용리는 10배 낮은 VP0/VP4 비를 발생시켰는데, 이는 높은 성숙 바이러스 입자 순도를 나타낸다.
도 6a-b: GSH 친화성 용리의 수크로스 구배 특성화. 1 mL 샘플을 15-42% w/v 수크로스 구배로 로딩하고 230,000 g에서 100분 동안 스피닝하였다. 12x1 mL 분획을 취하고 분획 5-8에서 빈 캡시드 (프로캡시드 또는 분해된 A-입자)가 예상되었고 분획 9-12에서 완전 캡시드 (성숙 비리온 또는 프로비리온)이 예상되었다. 6a: GSH 친화성 크로마토그래피 정제된 용리액의 은 염색과 12% 아크릴아미드 Bis-Tris SDS-PAGE의 환원. 바이러스 단백질 밴드 VP1-VP2-VP3 (VP4는 표시되지 않음)이 검출가능하며 어떠한 VP0 및 어떠한 빈 캡시드도 검출되지 않음. 6b: 항-VP1 폴리클로날 항체를 사용한 모세관 전기영동 정량적 웨스턴 블롯팅 (프로테인 심플)을 사용한 수크로스 구배 분획에서의 총 입자 분포. GSH 친화성 크로마토그래피 용리액은 총 입자의 약 99.8%의 완전 성숙 비리온 집단을 함유하였다.
도 7: 항-BSA 1차 항체를 사용한 모세관 전기영동 정량적 웨스턴 블롯 (프로테인 심플)에 의해 검출된 GSH 친화성 크로마토그래피 분획에 걸친 BSA 청소. 샘플에서 BSA의 질량을 정화된 수확물에서 BSA의 초기 질량으로 나누어 계산된 정화된 수확물 샘플에 대한 % BSA 질량.
도 8: GSH 로보컬럼(Robocolumn) 및 테칸 프리덤(Tecan Freedom) EVO 150을 사용한 아암 9의 GSH 친화성 크로마토그래피 크로마토그램 작업에 대한 예시적인 크로마토그램 (표 3 참조). 280 nm에서의 흡광도 (실선) 및 추정된 NaCl 농도 (점선) 트레이스가 표시됨. 상단 도면은 전체 크로마토그램을 나타낸다. 상단 도면의 점선 박스 내에 도시된 하단 도면은 세척, 용리 및 스트립 단계를 나타낸다. ~61-CV에서 샘플링된 용리 분획.
도 9a-b: 다중 엔테로바이러스 혈청형의 GSH 친화성 크로마토그래피 정제의 은 염색과 12% 아크릴아미드 Bis-Tris SDS-PAGE의 환원. 평가된 엔테로바이러스 균주 (1-9) 및 마크에 대한 정화된 세포 배양 수확물 (도 9a) 및 GSH 용리 분획 (도 9b)의 이미지가 표시된다. 에코바이러스 1 (1), 리노바이러스 1B (2), 리노바이러스 35 (3), 콕사키바이러스 A 13 (4), 콕사키바이러스 A 15 (5), 콕사키바이러스 A 18 (6), 콕사키바이러스 A 20b (7), 및 콕사키바이러스 A 21 (8, 9)에 대한 GSH 용리에서 엔테로바이러스 캡시드 바이러스 단백질 (VP) 밴드 검출됨.
도 10: 상이한 상류 조건으로 생성된 CVA21의 GSH 친화성 크로마토그래피의 은 염색과 12% 아크릴아미드 Bis-Tris SDS-PAGE의 환원. 정화된 벌크 (CB)는 100x로 미리 희석하고 GSH 용리액 (GSH)은 실험 아암 1-5의 경우 순수 샘플을 로딩하였다. GSH 용리 샘플에서의 바이러스 단백질 (VP) 밴드는 VP0, VP1, VP2, 및 VP3으로서 확인된다. 아암 A, C, 및 D에서 검출된 더 높은 VP0은 GSH 크로마토그래피 단계에 걸쳐 빈 프로캡시드 청소의 차이를 나타낸다.
도 11: 초원심분리 정제된 바이러스와 비교한 아암 1-5로부터의 GSH 용리 샘플 및 정화된 수확물에 대한 항-VP4 pAb로 검출된 모세관 전기영동 정량적 웨스턴 VP0/VP4 신호 비의 비교. GSH 용리 샘플에서 관찰된 VP0/VP4 비에 의해 추정된 바와 같은 빈 프로캡시드/완전 성숙 바이러스 입자 비의 차이는 GSH 크로마토그래피 단계에 걸친 빈 프로캡시드 청소의 차이를 나타낸다.
도 12: 세포 배양 수확물의 정화, 수확 전 임의적 용해 단계, GSH 친화성 크로마토그래피 단계, 임의적 음이온 교환 (AEX) 연마 크로마토그래피 단계, 용액 조정, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피 단계, 접선 유동 여과 (TFF) 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하는 완충제 교환 단계, 및 최종 여과 단계를 포함하는, 확장가능하고 강력한 엔테로바이러스 정제 공정이 기재되어 있다. 다음 단계로 향하는 각각의 단위 작업으로부터의 생성물에 대한 샘플 명칭이 표시되어 있다.
도 13: 정제된 바이러스를 생성하기 위해 GSH, AEX, 용액 조정, CEX, TFF, 및 여과 단계와 함께 예로서 배치 4를 사용하는 도 12에서의 정제 공정의 은 염색과 12% 아크릴아미드 Bis-Tris SDS-PAGE의 환원. 모든 샘플은 순수 상태로 로딩됨. VP0은 GSH 용리, AEX FT, 및 CEX 공급 샘플에서 검출되나 CEX 용리에서는 청소된다. CEX 스트립은 대부분 높은 VP0 함량을 가진 빈 프로캡시드를 함유한다. 최종 정제된 바이러스는 VP1, VP2, VP3 밴드만 검출되어 고순도를 갖는다.
도 14: 배치 1-4로부터의 GSH 용리, CEX 용리, 및 정제된 바이러스 샘플의 은 염색과 12% 아크릴아미드 Bis-Tris SDS-PAGE의 환원. 부피 농도 계수로 정규화된 샘플 로딩. 배치 1-3으로부터의 GSH 단계는 VP0을 청소하나, 일부 VP0은 배치 4에 남아 있다. 도 14에 나타낸 바와 같이, CEX 단계는 빈 프로캡시드를 청소하고 배치 1-4로부터의 최종 정제된 바이러스 샘플은 모두 유사한 바이러스 단백질 분포와 고순도를 갖는다. 희미한 VP0 밴드가 UC 퓨어 샘플에서 검출가능함.
도 15: 초원심분리 정제된 바이러스와 비교한 배치 1-4로부터의 정화된 수확물, GSH 용리액, 및 정제된 바이러스 샘플에 대한 항-VP4 pAb로 검출된 모세관 전기영동 정량적 웨스턴 VP0/VP4 신호 비의 비교. 배치 1-3 빈 프로캡시드는 GSH 단계에 걸쳐 청소되었으며 한편 배치 4 빈 프로캡시드는 CEX 단계에 걸쳐 청소되었다. 배치 1-4 정제된 바이러스 빈 프로캡시드/완전 성숙 바이러스 입자 비는 모두 초원심분리기 정제된 바이러스보다 ~10배 낮다.
도 16: H-클래스 바이오쉘(Class BIOshell) C4 컬럼 (워터스(Waters)) 상에서 역상 아세토니트릴 구배를 사용하여 검출된 바와 같은 배치 1 정제된 바이러스에 대한 예시적인 RP-HPLC 크로마토그램. 바이러스 단백질 (VP1-4)은 질량 분석법에 의해 확인된 바와 같이 동정된다. VP0:VP2 피크 면적 비에 의한 빈 프로캡시드 대 완전 성숙 비리온 비의 추정.
도 17: 배치 1-4 및 초원심분리 정제된 바이러스 (UC 퓨어)에 대한 게놈 (RT-qPCR) 및 입자 (HPSEC) 대 감염가 (플라크) 비. 분석 결과는 표 6을 참조한다.
도 18: 배치 4 정제된 바이러스 샘플에서 VP1, VP2, VP3 및 VP4의 분리 및 상대적 이동 시간을 나타내는 예시적인 CE-SDS 전기영동도.

친화성 크로마토그래피는 정지상에 고정화된 친화성 리간드를 사용하여 불순물의 복합체 용액으로부터 표적 단백질 또는 생체분자에 선택적으로 결합하여 정제하는 데 사용되는 정제 방법이다. 글루타티온 (GSH) 친화성 크로마토그래피는 원래 고정화된 글루타티온 리간드와 GST 융합 단백질의 상호작용으로 인한 재조합 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)-태그부착된 단백질의 정제를 위해 개발되었으나 [9], GST 또는 임의의 유사한 단백질 서열을 함유하지 않는 엔테로바이러스와 같은 태그부착되지 않은 생체분자의 경우는 아니다. 본원에서, 본 발명자들은 완전 성숙 엔테로바이러스 (예를 들어, CVA21) 비리온의 정제를 위한 GSH 친화성 크로마토그래피의 용도를 입증한다.

정제된 완전 성숙 CVA21 바이러스는 글루타티온 수지에 특이적으로 결합하며 경쟁적 치환 또는 높은 전도도를 가진 용액을 통해 유리 환원된 글루타티온으로 용리될 수 있다. GSH 친화성 크로마토그래피 절차를 사용하여, CVA21은 높은 감염가 수율 (~100%) 및 불순물 청소 (>99.9% BSA 및 HCP 감소)로, 혈청-함유 배지에서 정화된 감염된 숙주-세포 배양 수확물로부터 직접 정제되었다. 예상외로, 성숙 CVA21 비리온이 글루타티온 크로마토그래피 용리에서 농축되었고 빈 CVA21 프로캡시드가 로딩 단계 동안 통과하여 흐른다는 것이 밝혀졌다. 더 낮은 pH에서 결합 및 용리 모드로 작동되는, 추가 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 또한 빈 프로캡시드 및 잔류 불순물의 추가 청소를 제공할 수 있다.

정의

본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 기술 및 과학 용어는 하기에 구체적으로 정의된다. 이 문서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖다.

첨부된 청구범위를 포함하여, 본원에 사용된 바와 같이, "하나"와 같은 단어의 단수 형태는 문맥이 분명히 달리 지시하지 않는 한 그의 상응하는 복수 참조대상을 포함한다.

수량 (예를 들어, mM, 또는 M), 효능 (게놈/pfu, 입자/pfu), 순도 (ng/ml), 물질 또는 조성물의 비, 용액의 pH, 또는 방법에서 단계를 특성화하는 파라미터의 값 등을 변형시키는 경우의 용어 "약"은, 예를 들어, 물질 또는 조성물의 제조, 특성화 및/또는 용도와 관련된 전형적인 측정, 취급 및 샘플링 절차를 통해; 이들 절차의 기구적 오류를 통해; 조성물을 제조하거나 사용하거나 절차를 수행하는 데 이용되는 성분의 제조, 공급원, 또는 순도의 차이 등등을 통해 발생할 수 있는 수치적 수량의 변동을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "약"은 ± 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 10%의 변동을 의미할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "x%(w/v)"는 x g/100 ml에 상당하다 (예를 들어, 5% w/v는 50 mg/ml와 동등함).

"CVA21"은 콕사키바이러스 A 21을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 바이러스가 배양, 계대 또는 전파될 때 돌연변이를 겪을 수 있음을 이해할 것이다. CVA21은 이들 돌연변이를 함유할 수 있다. CVA21의 예는 돌연변이가 있거나 없는 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 또는 위치 7274에서 C, 및/또는 위치 7370에서 U를 갖는 서열식별번호: 1), 쿠이켄달(Kuykendall) 균주 (진뱅크 수탁 번호 AF546702 및 AF465515), 및 Coe 균주 (Lennette et al. Am J Hyg. 1958 Nov;68(3):272-87.)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. CVA21은 이들 돌연변이가 전혀 없거나, 하나 이상이 있는 동종 또는 이종 집단일 수 있다.

엔테로바이러스의 속 또는 종을 언급할 때, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 바이러스가 배양, 계대 또는 전파될 때 돌연변이를 겪을 수 있음을 이해할 것이다. 엔테로바이러스는 이들 돌연변이를 함유할 수 있다. 특정 엔테로바이러스의 예는 돌연변이가 있거나 없는 진뱅크 또는 유닛프로 데이터베이스에 열거된 것들을 를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 엔테로바이러스는 이들 돌연변이가 전혀 없거나, 하나 이상이 있는 동종 또는 이종 집단일 수 있다.

"게놈 대 감염가 비"는 게놈 RT-qPCR 검정 (게놈/ml)에 의해 측정된 바와 같은 CVA21 RNA 게놈을 플라크 검정에 의해 측정된 바와 같은 감염가 (pfu/ml)로 나눈 것을 지칭한다. 바이러스 플라크 검정은 바이러스 샘플에서 플라크 형성 단위 (pfu)의 수를 결정한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포주의 감염 후 CVA21의 감염가 (pfu/ml)를 결정하기 위해 다양한 플라크 검정을 개발할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포주는 SK-MEL-28 세포주 (ATTC 기탁 HTB-72)이다. 플라크 검정의 예는 실시예 6에 제공되어 있다. 게놈 RT-qPCR 검정은 CVA21 바이러스 단백질 유전자 (예를 들어, 실시예 6)를 표적으로 하는 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-qPCR 방법을 사용하여 ml당 게놈 카피를 측정한다.

"입자 대 감염가 비"는 HPSEC 검정에 의해 측정된 바와 같은 CVA21 RNA 게놈 (입자/ml)을 플라크 검정에 의해 측정된 바와 같은 감염가 (pfu/ml)로 나눈 것을 지칭한다. 바이러스 플라크 검정은 바이러스 샘플에서 플라크 형성 단위 (pfu)의 수를 결정한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포주의 감염 후 CVA21의 감염가 (pfu/ml)를 결정하기 위해 다양한 플라크 검정을 개발할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포주는 SK-MEL-28 세포주 (ATTC 기탁 HTB-72)이다. 플라크 검정의 예는 실시예 6에 제공되어 있다. 바이러스 HPSEC 검정은 CVA21의 입자 농도 (입자/ml)를 결정한다. 이 검정의 예는 실시예 6에 제공되어 있다.

"VP0 대 VP2 비"는 역상-HPLC 또는 UPLC 방법에 의해 결정된 바와 같은 CVA21 VP0 단백질 및 VP2 단백질의 피크 면적의 비를 지칭한다. 방법의 예는 실시예 6에 기재되어 있다.

"정지상"은 하나 이상의 글루타티온 리간드가 고정화될 수 있는 임의의 표면을 의미한다. 정지상은 현탁액, 정제 컬럼, 이산 입자의 불연속 상, 플레이트, 센서, 칩, 캡슐, 카트리지, 수지, 비드, 모노리스, 겔, 멤브레인, 또는 필터 등이 될 수 있다. 정지상을 형성하기 위한 물질의 예는 기계적으로 안정적인 매트릭스 예컨대 다공성 또는 비다공성 비드, 무기 물질 (예를 들어, 다공성 실리카, 제어된 기공 유리 (CPG) 및 히드록시아파타이트), 합성 유기 중합체 (예를 들어, 폴리아크릴아미드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌-디비닐벤젠, 폴리(스티렌디비닐) 벤 젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 상기 중 임의의 것의 유도체) 및 폴리사카라이드 (예를 들어, 셀룰로스, 아가로스 및 덱스트란)를 포함한다. 문헌 [Jansson, J. C.; Ryd

n, L. Protein Purification; Wiley: New York, 1998]을 참조한다.

엔테로바이러스를 정지상에 "결합"시킨다는 것은 엔테로바이러스가 엔테로바이러스와 정지상에 고정화된 글루타티온 사이의 상호작용에 의해 정지상에 가역적으로 회합되도록 적절한 조건 (pH 및/또는 전도도) 하에 정지상에 관심 엔테로바이러스를 노출시키는 것을 의미한다.

용어 "평형화 용액"은 정지상에 엔테로바이러스를 로딩하기 전에 정지상을 평형화하는 용액을 지칭한다. 평형화 용액은 염 및 완충제 중 하나 이상, 및 임의로 계면활성제를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 평형화 용액은 엔테로바이러스를 포함하는 로딩 용액과 동일한 조건이다.

용어 "로딩 용액"은 관심 엔테로바이러스 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물을 정지상에 로딩하는 데 사용되는 용액이다. 로딩 용액은 임의로 완충제, 염 및 계면활성제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 사용될 때 용어 "세척 용액"은 관심 엔테로바이러스를 용리하기 전에, 정지상을 세척하거나 재평형화하는 데 사용되는 용액을 지칭한다. 세척의 경우, 세척 용액의 전도도 및/또는 pH는 불순물 (예컨대 빈 엔테로바이러스 프로캡시드, BSA 또는 HCP 등)이 정지상로부터 제거되도록 하는 것이다. 재평형화를 위해, 세척 용액과 용리 용액이 동일할 수 있으나, 반드시 이것이 요구되는 것은 아니다. 세척 용액은 염 및 완충제 중 하나 이상, 및 임의로 계면활성제 및/또는 환원제 예컨대 PS-80 및/또는 DTT를 포함할 수 있다.

"용리 용액"은 정지상으로부터 관심 엔테로바이러스를 용리하는 데 사용되는 용액이다. 용리 용액은 염, 완충제 및 유리 환원된 글루타티온 중 하나 이상, 임의로 계면활성제 및/또는 환원제 예컨대 DTT를 포함할 수 있다. 용리 용액의 유리 환원된 글루타티온 (GSH), 염, 완충제 중 하나 이상의 존재는 관심 엔테로바이러스가 정지상으로부터 용리되도록 하는 것이다.

"스트립 용액"은 재사용을 위해 컬럼을 재생시키기 전에 정지상으로부터 강하게 결합된 구성요소를 해리하는 데 사용되는 용액이다. 스트립 용액은 정지상으로부터 실질적으로 모든 불순물 및 엔테로바이러스를 제거하는 데 필요한 전도도 및/또는 pH를 갖는다. 스트립 용액은 염, 완충제 및 GSH 중 하나 이상, 및 임의로 계면활성제 및/또는 환원제를 포함할 수 있다.

용어 "전도도"는 수용액이 두 전극 사이에 전류를 전도하는 능력을 나타낸다. 용액에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 수용액에 존재하는 이온의 양이 증가함에 따라, 용액은 더 높은 전도도를 가질 것이다. 전도도 측정 단위는 mS/cm이며, 예를 들어, GE 헬쓰케어(Healthcare) Akta 시스템 내에서 판매되는 전도도 측정기를 사용하여 측정할 수 있다. 용액의 전도도는 그 안의 이온 농도를 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 완충제의 농도 및/또는 용액 중 염 (예를 들어, NaCl 또는 KCl)의 농도는 원하는 전도도를 달성하기 위해 변경될 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충제의 염 농도는 하기 실시예에서와 같이 원하는 전도도를 달성하도록 변형된다.

관심 엔테로바이러스 또는 "정제된 조성물"을 "정제"한다는 것은 조성물로부터 적어도 하나의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 조성물에서 엔테로바이러스의 순도의 정도를 증가시키는 것을 의미한다. 불순물은 빈 프로캡시드, BSA, 숙주 세포 성분 예컨대 혈청, 단백질 또는 핵산, 세포 파편, 성장 배지 등일 수 있다. 상기 용어는 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재 또는 물, 완충제, 또는 염의 부재 또는 엔테로바이러스를 포함하는 제약 제제의 성분을 지칭하기 위한 것이 아니다.

본원에 사용된 바와 같이, "글루타티온은 정지상에 고정화된다"는 하나 이상의 반응성 기의 접합을 통해 정지상에 공유 부착된 글루타티온을 지칭한다. 한 실시양태에서, 글루타티온 정지상은 글루타티온의 티올 기를 통해 정지상에 접합된 글루타티온이다.

"계면활성제"는 본질적으로 양친매성인 표면 활성제이다.

"성숙 비리온" "완전 성숙 비리온", "완전 성숙 바이러스" 또는 "완전 성숙 바이러스 입자", "완전 성숙 엔테로바이러스", "성숙 엔테로바이러스", "성숙 바이러스 입자"는 도 2에 기재된 바와 같은 성숙 엔테로바이러스 비리온 [(VP4-VP2-VP3-VP1)₅]₁₂ +RNA를 지칭한다. CVA21 VP1-VP4 서열의 예는 표 11에 기재되어 있다

"빈 캡시드"는 프로캡시드 [(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂, 또는 도 2에 따른 분해된 A-입자 [(VP2-VP3-VP1)₅]₁₂를 지칭한다. CVA21의 VP0 서열의 예는 유닛프로 데이터베이스 수탁 번호 P22055이다.

"완전 캡시드"는 도 2에 기재된 바와 같이 성숙 비리온 또는 프로비리온 [(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂+ RNA를 나타낸다.

"총 VP1+VP2+VP3+VP4 피크 면적/총 피크 면적"은 모세관 전기영동 (CE)-SDS 전기영동도에서 CVA21의 VP1, VP2, VP3 및 VP4 바이러스 단백질에 대한 피크 면적의 합을 총 피크 면적 (검출한계 초과의 모든 정량가능한 피크의 피크 면적)으로 나눈 값이다. CE-SDS 방법의 예는 실시예 6에 있다.

"불순물"은 원하는 엔테로바이러스와 상이한 물질을 지칭한다. 불순물은 혈청 (즉, BSA), 숙주 세포 단백질 (HCP), 숙주 세포 DNA (HC-DNA), VP0-함유 엔테로바이러스 (프로토머, 오량체, 프로비리온, 프로캡시드), VP2-함유 엔테로바이러스 (A-입자, 또는 분해된 A-입자)를 포함한 비감염성 바이러스-관련 입자일 수 있다. 한 실시양태에서, 원하는 엔테로바이러스는 완전 성숙 엔테로바이러스 (예를 들어, 완전 성숙 CVA21)이다.

"TCID₅₀/ml" (조직 배양 감염 용량 50%/mL)은 접종물이 표적 배양물의 50%를 감염시키는 희석액으로부터 결정된 접종물내 감염성 유기체의 농도를 나타낸다. CVA21에 대한 TCID₅₀ 검정의 예는 실시예 6에 제공되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이 암을 "치료하다" 또는 "치료하는"은 본 발명의 제약 조성물을 암을 갖거나, 암으로 진단된 대상체에게 투여하여 적어도 하나의 긍정적인 치료 효과, 예컨대 예를 들어, 암 세포 수의 감소, 종양 크기 감소, 말초 기관으로의 암 세포 침윤 속도 감소, 또는 종양 전이 또는 종양 성장 속도 감소를 달성하는 것을 의미한다. 암에서 긍정적인 치료 효과는 다수의 방식으로 측정될 수 있다 (문헌 [W. A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009)]을 참조한다).

본원에 사용된 "치료당"은 하루에 환자에게 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 제약 조성물은 매일, 간헐적으로 (1주에 수일, 1주 1회, 2주마다, 3주마다 등) 투여될 수 있다.

CVA21의 조성물 및 제약 조성물

본 발명은 또한 CVA21의 정제된 조성물 및 제약상 허용되는 부형제의 제약 조성물을 제공한다. CVA21은 완전 성숙 CVA21 비리온 [(VP4-VP2-VP3-VP1)₅]₁₂ +RNA, 빈 프로캡시드 [(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂, 분해된 A-입자 [(VP2-VP3-VP1)₅]₁₂, A-입자 [(VP2-VP3-VP1)₅]₁₂ +RNA, 프로비리온 [(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂+ RNA, 프로토머 (VP0-VP3-VP1)₁, 및 오량체 (VP0-VP3-VP1)₅ 중 하나 이상을 포함하는 혼합물일 수 있다. 한 실시양태에서, CVA21은 완전 성숙 CVA21 비리온 [(VP4-VP2-VP3-VP1)₅]₁₂ +RNA를 포함한다. 한 실시양태에서, CVA21은 완전 성숙 CVA21 비리온 [(VP4-VP2-VP3-VP1)₅]₁₂ +RNA 및 빈 프로캡시드 [(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂를 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물의 게놈 대 감염가 비는 약 5000 게놈/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 조성물의 게놈 대 감염가 비는 약 4000 게놈/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 조성물의 게놈 대 감염가 비는 약 3000 게놈/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 조성물의 게놈 대 감염가 비는 약 2000 게놈/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 조성물의 게놈 대 감염가 비는 약 1000 게놈/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 게놈 대 감염가 비는 약 200-2000 게놈/pfu이다. 한 실시양태에서, 조성물의 게놈 대 감염가 비는 약 800 게놈/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 게놈 대 감염가 비는 약 400-700 게놈/pfu이다. 또 다른 실시양태에서, 게놈 대 감염가 비는 약 400-800 게놈/pfu이다. 본 발명은 또한 입자 대 감염가 비가 약 5000 입자/pfu 미만인 CVA21의 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 4000 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 3000 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 2000 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 1000 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 900 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 800 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 700 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 600 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 500 입자/pfu 미만이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 200-600 입자/pfu이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 200-500 입자/pfu이다. 한 실시양태에서, 입자 대 감염가 비는 약 200-800 입자/pfu이다.

본 발명은 VP0 대 VP2 비가 약 0.01 미만인 정제된 CVA21의 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, VP0 대 VP2 비는 약 0.0005-0.01이다. 한 실시양태에서, VP0 대 VP2 비는 약 0.0005-0.005이다. 또 다른 실시양태에서, VP0 대 VP2 비는 약 0.001-0.003이다. 또 다른 실시양태에서, 총 VP1+VP2+VP3+VP4 피크 면적/총 피크 면적은 적어도 95%이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포 DNA는 약 10 ng/ml 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 세포 DNA는 약 0.5 ng/ml 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 양은 약 10,000 pg/용량 미만, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 양은 약 0.05-10,000 pg/용량, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 양은 약 0.05-10 pg/용량, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 양은 약 0.05-1 pg/용량, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 양은 약 100-10,000 pg/용량, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중 소 혈청 알부민의 양은 약 10 ng/ml 미만이다. 한 실시양태에서, 소 혈청 알부민은 약 50,000 pg/용량 미만, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다. 또 다른 실시양태에서, 소 혈청 알부민은 약 500-50,000 pg/용량, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다. 또 다른 실시양태에서, 소 혈청 알부민은 약 50-100 또는 50-150 pg/용량, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다. 또 다른 실시양태에서, 소 혈청 알부민은 약 150 pg/용량 미만, 용량당 약 5E7 pfu CVA21이다.

본 개시내용의 제약상 허용되는 부형제는 예를 들어 용매, 증량제, 완충제, 긴장성 조정제, 및 보존제를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Pramanick et al., Pharma Times, 45:65-77, 2013] 참조). 일부 실시양태에서 제약 조성물은 용매, 증량제, 완충제, 및 긴장성 조정제 중 하나 이상으로서 기능하는 부형제를 포함할 수 있다 (예를 들어, 식염수 중 염화나트륨은 수성 비히클 및 긴장성 조정제 둘 다로서 역할을 할 수 있다).

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 용매로서 수성 비히클을 포함한다. 적합한 비히클은 예를 들어 멸균수, 식염수, 인산염 완충 식염수, 및 링거 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 등장성이다.

제약 조성물은 증량제를 포함할 수 있다. 증량제는 제약 조성물이 투여 전에 동결건조되어야 할 때 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 증량제는 동결 또는 분무 건조 동안 및/또는 저장 동안 활성제의 분해 및 안정화를 돕는 보호제이다. 적합한 증량제는 수크로스, 락토스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 글루코스 및 라피노스와 같은 당류 (모노-, 디-, 및 폴리사카라이드)이다.

제약 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는 pH를 제어하여 가공, 보관 및 임의로 재구성 동안 활성제의 분해를 억제한다. 적합한 완충제는 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 또는 술페이트를 포함하는 염을 포함한다. 다른 적합한 완충제는 예를 들어 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 및 리신과 같은 아미노산을 포함한다. 완충제는 염산 또는 수산화나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 완충제는 조성물의 pH를 4 내지 9의 범위 내로 유지한다. 일부 실시양태에서, pH는 (하한) 4, 5, 6, 7 또는 8 초과이다. 일부 실시양태에서, pH는 (상한) 9, 8, 7, 6 또는 5 미만이다. 즉, pH는 하한이 상한보다 작은 약 4 내지 9의 범위에 있다.

제약 조성물은 긴장성 조정제를 포함할 수 있다. 적합한 긴장성 조정제는 예를 들어 덱스트로스, 글리세롤, 염화나트륨, 글리세린 및 만니톨을 포함한다.

제약 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어 항산화제 및 항균제를 포함한다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 조건 하에 제조되고 단일 사용 용기에 있으므로, 보존제의 포함을 필요로 하지 않는다.

한 측면에서, 제약 조성물은 종양내 투여를 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 방광내 투여를 위한 것이다. 한 실시양태에서, 치료당 용량은 종양의 크기, 위치 및 수에 따라 최대 약 3E8 TCID₅₀ 또는 약 5E7 pfu이다. 또 다른 실시양태에서, 치료당 용량은 약 3E7 내지 3E8 TCID₅₀ 또는 약 5E6 내지 5E7 pfu이다. 종양 전체에 걸쳐 바이러스의 분포를 증가시키거나 최대화하는 주사 기술은 개선된 치료 결과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 흑색종 및 기타 고형 종양의 치료에서, 다중 병변은 가장 큰 병변(들) (종양>2.5 cm에 주사된 2.0 mL, 1.5 내지 2.5 cm에 주사된 1.0 mL; 0.5 내지 1.5 cm에 주사된 0.5 mL)부터 시작하여 4.0 mL 최대까지 용량 초-분획 패턴으로 주사될 수 있다. CVA21을 처음 주사한 후, 직경이 <0.5 cm으로 감소한 임의의 주사된 병변은 병변이 완전히 해결될 때까지 치료 일정에 따라 0.1 mL의 CVA21을 주사할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 투여를 위한 것이다. 한 실시양태에서, 치료당 용량은 약 1E9 TCID₅₀ 또는 약 1.5E8 pfu이다.

또 다른 측면에서, 제약 조성물은 약 1E5 내지 1E12 TCID₅₀/ml 또는 pfu/ml의 효능을 갖는다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1E6 내지 1E12 TCID₅₀/ml 또는 pfu/ml의 효능을 갖는다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1E7 내지 1E11 TCID₅₀/ml 또는 pfu/ml의 효능을 갖는다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 1E7 내지 8E7 TCID₅₀/ml의 효능을 갖는다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 5E7 내지 8E7 TCID₅₀/ml의 효능을 갖는다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 7.5E7 TCID₅₀/ml의 효능을 갖는다. CVA21 바이러스 TCID₅₀ 검정은 WO 2015/127501, 및 실시예 6에 개시되어 있다. 또 다른 측면에서, 제약 조성물은 5E6 내지 5E7 pfu/ml의 효능을 갖는다. 또 다른 측면에서, 제약 조성물은 1E7 내지 3E7 pfu/ml의 효능 농도를 갖는다. 또 다른 측면에서, 제약 조성물은 1.1E7 pfu/ml의 효능 농도를 갖는다. 효능은 실시예 6의 플라크 검정에 의해 측정될 수 있다.

암 치료 방법

추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 환자에서 암 치료를 위한 의약 제조에서의 제약 조성물의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 종양내 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 방광내 투여된다. 한 실시양태에서, 치료당 용량은 최대 약 3E8 TCID₅₀ 또는 약 5E7 pfu이다. 한 실시양태에서, 치료당 용량은 최대 약 3E7 TCID₅₀ 또는 약 5E6 pfu이다. 한 실시양태에서, 치료당 용량은 최대 약 1E8 TCID₅₀ 또는 약 1.5E7 pfu이다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 투여된다. 한 실시양태에서, 치료당 용량은 1E9 TCID₅₀ 또는 약 1.5E8 pfu이다. 추가 실시양태에서, 제약 조성물은 간헐적인 날들에 투여된다.

본 발명의 제약 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은, 심장암: 육종 (혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐암: 기관지 암종 (편평 세포, 미분화 소세포, 미분화 대세포, 선암종), 폐포 (세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골종 과오종, 중피종; 위장관암: 식도 (편평 세포 암종, 선암종, 평활근종, 림프종), 위 (암종, 림프종, 평활근종), 췌장 (도관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 카르시노이드 종양, 비포마), 소장 (선암종, 림프종, 카르시노이드 종양, 카르포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장 (선암종, 관상 선종, 융모 선종, 과오종, 평활근종), 결장직장; 비뇨생식기암: 신장 (선암종, 빌름 종양(Wilm's tumor) (신모세포종), 림프종, 백혈병), 방광 및 요도 (편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 선암종), 전립선 (선암종, 육종), 고환 (정상피종, 기형종, 배아성 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 간질 세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 선종양 종양, 지방종); 간암: 간세포암 (간세포 암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 골암: 골원성 육종 (골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 악성 림프종 (세망 세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대 세포 종양 척색종, 골연골종 (골연골종 외골종), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골 골종 및 거대세포종양; 신경계 암: 두개골 (골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 기형 골염), 수막 (수막종, 수막육종, 신경교종증), 뇌 (성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 뇌실막종, 배아세포종 (송과체형), 신경아교종, 변형성 골염), 수막 (수막종, 수막육종, 신경교종증), 뇌 (성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 뇌실막종, 생식세포종 (송과종), 다형 교모세포종, 희소돌기아교세종, 신경초종, 망막모세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 수막종, 신경교종, 육종); 부인과 암: 자궁 (자궁내막 암종), 자궁경부 (자궁경부암, 전종양 자궁경부 이형성증), 난소 (난소 암종 (장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 분류되지 않은 암종), 과립막-난포막 세포 종양, 세르톨리-라이디히(Sertoli-Leydig) 세포 종양, 미분화세포종(dysgerminoma), 악성 기형종), 외음부 (편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질 (투명 세포 암종, 편평 세포 암종, 포도상 육종 (배아성 횡문근육종), 나팔관 (암종), 유방; 혈액학적 암: 혈액 (골수성 백혈병 (급성 및 만성), 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군); 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 골수종, 및 버킷 림프종(Burkett's lymphoma)을 포함한, 림프 계통의 조혈 종양, 및 버킷 림프종; 급성 및 만성 골수원성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수구성 백혈병을 포함한, 골수 계통의 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한, 중간엽 기원의 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종, 및 신경초종을 포함한, 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 피부 (비흑색종) 암, 중피종 (세포), 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 갑상선 여포암 및 카포시 육종을 포함한, 기타 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 전술한 암은 진행성, 절제불가능 또는 전이성이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 비소세포 폐암, 방광 암종, 흑색종, 삼중 음성 유방암, 간세포 암종, 위 암종, 두경부 편평 세포 암종, 및 피부 편평 세포 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

글루타티온 친화성 크로마토그래피

본 발명은 글루타티온 친화성 크로마토그래피를 사용하여 엔테로바이러스를 정제하기 위한 확장가능하고 강력한 방법을 제공한다 (도 1b). 한 실시양태에서, 글루타티온 친화성 크로마토그래피 정지상은 정지상의 표면에 고정화된 글루타티온 (GSH)을 포함한다. 글루타티온 (L-글루타티온, 환원된 글루타티온, 또는 GSH로도 명명됨)은 산화환원 전위를 제어하는 데 사용되는 인간 세포에서의 생물학적-활성 트리-펩티드 (글루탐산-시스테인-글리신)이며 많은 세포 기능에 관여한다 [8]. GSH는 하기 화학 구조와 명칭을 갖는다:

(2S)-2-아미노-5-[[(2R)-1-(카르복시메틸아미노)-1-옥소-3-술파닐프로판-2-일]아미노]-5-옥소펜탄산.

글루타티온은 말레이미드, 할로아세틸, 피리딜 디술피드, 에폭시 또는 기타 유사한 술프히드릴-반응성 기반 화학을 사용하여 SH 기의 접합을 통해 정지상에 고정화될 수 있다. 문헌 [Stenzel MH, ACS Macro Letters, 2, 14-18 (2013)]을 참조한다. GSH 수지는 또한 몇몇 공급업체 (시티바(Cytiva), 써모(Thermo), 퀴아젠(Qiagen), 시그마(Sigma))를 통해 상업적으로 이용가능하다.

배치 모드에서, 정지상은 용액에서 자유롭게 활용된다. 유동 모드로 활용하기 위해, 정지상은 컬럼, 캡슐, 카트리지, 필터 또는 기타 지지체 내로 패키징되며 약 1-500 cm/hr의 유량이 사용된다.

한 측면에서, 본 발명은

a. 엔테로바이러스를 로딩 용액을 사용하여 정지상에 결합시키는 단계이며, 여기서 글루타티온이 정지상에 고정화된 것인 단계;

b. 정지상으로부터의 엔테로바이러스를 용리 용액으로 용리시키는 단계

를 포함하는, 엔테로바이러스를 정제하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 단계 (a) 전에, 정지상을 평형화 용액으로 평형화하는 것이 수행된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 불순물이 단계 a)의 통과액에 존재한다.

방법의 또 다른 측면에서, 단계 a) 후에 그러나 단계 (b) 전에, 정지상을 하나 이상의 세척 용액으로 세척하는 단계 i)를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 불순물이 세척 단계로부터 제거된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (i)은 평형화 용액 또는 로딩 용액보다 높은 전도도를 갖는 세척 용액을 사용한 제1 세척 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (i)은 제1 세척 단계에서의 세척 용액보다 낮은 전도도를 갖는 세척 용액을 사용한 제2 세척 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 용리 용액의 전도도는 제2 세척 단계에서의 세척 용액과 동일하다.

한 실시양태에서, 로딩 용액, 평형화 용액, 세척 용액 또는 용리 용액은 염, 바람직하게는 1가 금속 이온 염, 예컨대 NaCl 또는 KCl을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 로딩 용액 또는 평형화 용액은 약 50-200 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 로딩 용액 또는 평형화 용액은 약 100 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다.

한 실시양태에서, 세척 용액은 약 50-400 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세척 용액은 약 350-450 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세척 용액은 약 400-500 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 추가 실시양태에서, 세척 용액은 약 400 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 세척 용액은 약 100-500 mM NaCl 또는 KCl을 포함하고 제2 세척 용액은 약 50-500 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 세척 용액은 약 350-500 mM NaCl 또는 KCl을 포함하고 제2 세척 용액은 약 50-150 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 세척 용액은 약 400 mM NaCl 또는 KCl을 포함하고 제2 세척 용액은 약 75 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 추가 실시양태에서, 제2 세척 용액은 약 50-150 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 추가 실시양태에서, 제2 세척 용액은 약 100 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다.

용리 단계는 높은 이온 강도 또는 높은 전도도, 낮은 pH (예를 들어, pH 약 5-7)를 가진 용액으로, 또는 유리 GSH의 존재 하에, 또는 그의 조합으로 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 용리 용액은 약 0.5-1 M의 1가 염 예컨대 NaCl 또는 KCl을 포함한다. 한 실시양태에서, 용리 용액은 약 0.5 M의 NaCl 또는 KCl을 포함한다. 한 실시양태에서, 용리 용액은 약 50-500 mM의 NaCl 또는 KCl을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 용리 용액은 약 0.1-100 mM 글루타티온을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 용리 용액은 약 0.1-50 mM 글루타티온을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 용리 용액은 약 0.1-25 mM 글루타티온을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 용리 용액 중 글루타티온은 약 1 mM이다. 한 실시양태에서, 용리 용액은 약 0.5-5 mM 글루타티온 및 약 75-150 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 한 실시양태에서, 용리 용액은 약 0.5-25 mM 글루타티온 및 약 50-500 mM NaCl 또는 KCl을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 용리 용액은 약 0.1-100 mM 글루타티온 및 약 75-150 mM NaCl, 및 임의로 약 0.001-1% w/v PS-80을 포함한다. 다른 추가 실시양태에서, 용리 용액은 약 100 mM NaCl, 약 1 mM 글루타티온, 및 약 0.005% w/v PS80을 포함한다.

한 실시양태에서, 로딩 용액, 평형화 용액, 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상은 약 6.5-8.5의 pH를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 로딩 용액, 평형화 용액, 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상은 약 7-8의 pH를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 로딩 용액, 평형화 용액, 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상은 약 8의 pH를 갖는다. 추가 실시양태에서, 로딩 용액, 평형화 용액, 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상은 약 6-9의 pH를 갖는다. 다른 추가 실시양태에서, 로딩 용액, 평형화 용액, 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상은 약 5-10의 pH를 갖는다.

한 실시양태에서, 로딩 용액, 평형화 용액, 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상은 계면활성제를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 PS-80 또는 PS-20이다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.001-1% w/v PS-80이다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.001-0.1% w/v PS-80이다. 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.005 % w/v PS-80이다. 한 실시양태에서, 로딩 용액, 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상은 EDTA, 또는 환원제 예컨대 DTT 또는 β-메르캅토에탄올을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 환원제는 DTT이다. 또 다른 실시양태에서, DTT는 약 0.1-10 mM이다. 또 다른 실시양태에서, DTT는 약 0.1-5 mM이다. 또 다른 실시양태에서, DTT는 약 1 mM이다.

한 실시양태에서, 원하는 엔테로바이러스는 완전 성숙 엔테로바이러스이다. 한 실시양태에서, 원하는 엔테로바이러스는 완전 성숙 CVA21이다. 한 실시양태에서, 적어도 완전 성숙 엔테로바이러스는 용액 로딩 직후 정지상 용액에 결합한다. 한 실시양태에서, 정제 공정은 하나 이상의 불순물 예컨대 혈청 (즉 BSA), HCP, HC-DNA, VP0-함유 엔테로바이러스 (프로토머, 오량체, 프로비리온, 프로캡시드), VP2-함유 엔테로바이러스 (A-입자, 또는 분해된 A-입자로부터의 빈 캡시드)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 비감염성 바이러스-관련 입자를 통과 또는 세척 단계를 통해 제거한다. 추가 실시양태에서, 정제 공정은 엔테로바이러스 프로캡시드 (예를 들어, CVA21 프로캡시드)를 제거한다. 또 다른 실시양태에서, 정제 공정은 고순도 (>99% 순도) 완전 성숙 엔테로바이러스 (예를 들어, 완전 성숙 CVA21 비리온)를 포함하는 조성물을 발생시킨다.

본 발명의 방법은 불순물을 제거하기 위해 다른 크로마토그래피 또는 정제 단계와 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 정제 공정은 하나 이상의 세포 배양 불순물 예컨대 혈청 (즉 BSA), HCP, 또는 HC-DNA를 통과 또는 세척 단계를 통해 제거한다. 또 다른 실시양태에서, 정제 공정은 하나 이상의 불순물 예컨대 프로토머, 오량체, 프로비리온, 프로캡시드, A-입자, 및 분해된 A-입자를 통과 또는 세척 단계를 통해 제거한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 정제 단계 및/또는 본 발명의 실시양태에 의해 수득가능하거나 생성된 엔테로바이러스의 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법은, a) 엔테로바이러스를 포함하는 세포 배양 배지를 정지상에, 바람직하게는 1-1000L-수확물 배지/L-정지상의 로딩으로 로딩하는 단계이며, 여기서 세포 배양 배지 불순물 및/또는 빈 프로캡시드는 통과액을 통해 정제되는 것인 단계, b) 정지상을 세척 용액으로 세척하여 잔류 불순물을 제거하는 단계, c) 정지상으로부터 엔테로바이러스를 환원된 글루타티온, 바람직하게는 약 0.1-50 mM을 포함하는 용리 용액, 바람직하게는 컬럼 또는 막 부피의 2-20배의 완충제 부피로 용리시키는 단계로 구성된다. 방법은 임의로 추가 단계 d) 정지상으로부터 강하게 결합된 불순물을 제거하는 스트립 용액으로 정지상을 스트리핑하는 단계, 및 e) 정지상을 재생시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 스트립 용액은 약 1-50, 또는 5-50 mM GSH를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 스트립 용액은 약 10 mM GSH를 포함한다. 한 실시양태에서, 스트립 용액은 약 500-1500, 또는 1000-2000 mM NaCl을 포함한다.

엔테로바이러스

엔테로바이러스의 임의의 적합한 공급원이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다 [1]. 엔테로바이러스 입자는 폴리오바이러스, 군 A 콕사키바이러스, 군 B 콕사키바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 및 번호가 매겨진 엔테로바이러스일 수 있다. 한 실시양태에서, 엔테로바이러스는 군 A, B 또는 C 엔테로바이러스이다. 한 실시양태에서, 엔테로바이러스는 군 C 엔테로바이러스이다. 한 실시양태에서, 엔테로바이러스는 군 A 또는 B 콕사키바이러스이다. 또 다른 실시양태에서, 엔테로바이러스는 군 A 콕사키바이러스이다. 한 실시양태에서, 군 C 엔테로바이러스는 CVA1, CVA11, CVA13, CVA15, CVA17, CVA18, CVA19, CVA20a, CVA20b, CVA20c, CVA21, CVA22 및 CVA24로 이루어진 군으로부터 선택된 군 A 콕사키바이러스이다. 한 실시양태에서, 군 A 콕사키바이러스는 CVA13, CVA15, CVA18, CVA20, 및 CVA21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 바이러스의 다양한 적합한 균주는 미국 버지니아주 20110-2209 머내서스, 유니버서티 블러바드 10801 소재의, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 입수할 수 있으며, 예컨대 부다페스트 조약 하에 하기에 제공된 날짜에 기탁된 물질이며, 부다페스트 조약의 조건에 따라 이용가능하다: 콕사키 군 A 바이러스, 균주 CVA13, ATCC 번호: PTA- 8854, 2007년 12월 10일에 기탁; 콕사키 군 A 바이러스, 균주 CVA15 (G9), ATCC 번호: PTA-8616, 2007년 8월 15일에 기탁; 콕사키 군 A 바이러스, 균주 CVA18, ATCC 번호: PTA-8853, 2007년 12월 20일에 기탁; 및 콕사키 군 A 바이러스, 균주 CVA21 (쿠이켄달), ATCC 번호: PTA-8852, 2007년 12월 20일에 기탁. 문헌에 언급된 군 C 엔테로바이러스의 기타 군 A 콕사키 바이러스는 CVA1 (진뱅크 수탁 번호 AF499635, Dalldorf et al., 1949), CVA11 (진뱅크 수탁 번호 AF499636), CVA17 (진뱅크 수탁 번호 AF499639), CVA19 (진뱅크 수탁 번호 AF499641), CVA20 (진뱅크 수탁 번호 AF499642), CVA20a (Sickles et al., 1959), CVA20b (Sickles et al., 1959), CVA20c (Abraham and Cheever, 1963), CVA22 (Sickles et al., 1959; (진뱅크 수탁 번호 AF499643), 및 CVA24 (Mirkovic et al., 1974; (진뱅크 수탁 번호 EF026081)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 엔테로바이러스는 콕사키바이러스 A21이다.

또 다른 실시양태에서, 엔테로바이러스는 군 B 엔테로바이러스이다. 또 다른 실시양태에서, 군 B 엔테로바이러스는 에코바이러스이다. 또 다른 실시양태에서, 군 B 엔테로바이러스는 에코바이러스-1 (EV-1)이다. 에코바이러스-1의 예는 진뱅크 수탁 번호 AF029859, AF029859.2 및 AF250874를 가진 것들을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 엔테로바이러스는 군 B 콕사키바이러스이다. 추가 실시양태에서, 군 B 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 B3 (CVB3) 또는 콕사키바이러스 B4 (CVB4)이다. 추가 실시양태에서, 엔테로바이러스는 리노바이러스 A, B 또는 C이다. 또 다른 실시양태에서, 엔테로바이러스는 리노바이러스 A 또는 B이다. 다른 추가 실시양태에서, 엔테로바이러스는 인간 리노바이러스 14 (HRV14)이다. 다른 추가 실시양태에서, 엔테로바이러스는 인간 리노바이러스 1B 또는 35이다. 인간 리노바이러스 1B의 예는 진뱅크 수탁 번호 D00239.1이다. 인간 리노바이러스 35의 예는 진뱅크 수탁 번호 EU870473이다. 또 다른 실시양태에서, 엔테로바이러스는 에코바이러스 1, 리노바이러스 1B, 리노바이러스 35, 콕사키바이러스 A 13 (CVA13), 콕사키바이러스 A 15 (CVA15), 콕사키바이러스 A 18 (CVA18), 콕사키바이러스 A 20b (CVA20b), 또는 콕사키바이러스 A 21 (CVA21)이다. 엔테로바이러스 형태형성 및 캡시드 어셈블리에서 글루타티온의 역할에 대한 현재의 이해에 대한 요약이 도 2에 상세히 설명되어 있다. 더욱이, 트랜스진이 삽입된 유전자 변형 엔테로바이러스, 및 불활성화 엔테로바이러스가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

실시예

실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 보다 완전하게 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 첨부된 청구범위에 언급된 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다

실시예 1: GSH 친화성 크로마토그래피를 사용한 콕사키바이러스 A21의 정제

기재된 GSH 친화성 크로마토그래피 절차 [도 1b]는 유니콘 시스템 제어 소프트웨어 (시티바)와 Akta 퓨어 150M FPLC 시스템 (시티바)을 사용하여 수행하였다. CVA21 정제를 위해 GSH 세파로스(Sepharose) 4 패스트 플로우(Fast Flow) 수지로 채워진 시티바 20 mL HiPrep 컬럼을 사용하였다. 20 mL GSH 컬럼은 150 cm/hr의 유량 및 4분 체류 시간에서 15 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.005% w/v PS80, pH 7.5을 함유하는 평형화 용액의 5 컬럼 부피 (CV)로 평형화하였다. CVA21 정화된 세포 배양 수확물은 200-CV의 컬럼 로딩에 도달할 때까지 100 cm/hr의 유량 및 6분 체류 시간에서 컬럼에 로딩하였다. GSH 컬럼은 150 cm/hr의 유량에서 15 mM Tris, 400 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 8.0을 함유하는 5-CV의 세척 1 완충제 및 이어서 15 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, pH 8.0을 함유하는 5-CV의 세척 2 완충제로 세척하였다. 결합된 CVA21 입자는 150 cm/hr의 유량에서 이동상에서의 고정화된 글루타티온 리간드로부터 유리 GSH로의 경쟁적 치환을 통해 15 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, 1 mM GSH, pH 8.0을 함유하는 3-CV의 용리 용액으로 용리하였다. GSH 컬럼은 150 cm/hr의 유량에서 15 mM Tris, 1000 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, 10 mM GSH, pH 8.0을 함유하는 3-CV의 완충제로 스트리핑하고 0.1 N NaOH, 1 M NaCl 용액으로 재생시켰다. 수지는 컬럼을 재평형화한 후 추가 수확물을 로딩하는 데 재사용할 수 있다.

유니콘 소프트웨어에서 분석된 크로마토그램은 mAU로의 280 nm 흡광도 (A280) 트레이스 및 mS/cm로의 전도도 트레이스를 도시한다 [도 3]. A280 신호는 정화된 세포 배양 수확물의 로딩 (GSH FT) 동안 변하지 않았으며, 이는 시간이 지남에 따라 불순물의 일관된 통과 및 바이러스 입자의 검출불가능한 돌파를 나타낸다. A280이 기준선에 도달할 때까지 약하게 또는 비특이적으로 결합된 불순물을 제거하기 위해 컬럼을 400 mM NaCl 함유 세척 완충제 (GSH W1)의 5-CV로 세척하였다. 컬럼을 세척 2 완충제 (GSH W2)로 컨디셔닝한 직후, CVA21 입자는 3-CV의 1 mM 유리 환원된 GSH를 함유하는 완충제 (GSH 용리)로 용리하였으며, 상응하는 A280 피크가 관찰되었다. 정화된 수확물로부터의 GSH 용리의 전체 부피 농도 계수는 67배였다. 컬럼을 10 mM GSH 및 1 M NaCl을 함유하는 스트립 용액 (GSH 스트립)으로 스트리핑하고 작은 피크가 관찰되었다.

정화된 수확물 및 GSH 크로마토그래피 용리 샘플은 바이러스 감염가의 경우 중앙 조직 배양 감염 용량 (TCID50) 검정, 총 바이러스 게놈의 경우 역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-qPCR) 검정, 및 총 입자의 경우 항-VP1 항체를 사용한 모세관 전기영동 정량적 웨스턴 블롯 (프로테인 심플)에 의해 분석하였다. GSH 크로마토그래피 용리 수율은 GSH 용리 생성물의 바이러스 수량을 로딩된 세포 배양 수확물의 수량으로 나누어 계산하였다. 감염가 및 바이러스 게놈 수율은 약 100%였으며 한편 총 입자 수율은 거의 50%였다 [표 1]. 이는 고정화된 GSH 리간드에 결합된 완전 성숙 감염성 CVA21 비리온이 탁월한 회수율로 컬럼으로부터 용리되었으며, 한편 비감염성 바이러스 입자의 부분이 청소되었음을 시사한다.

<표 1>

엔테로바이러스에 감염된 세포는 전형적으로 역어셈블리된 프로토머 또는 오량체, 프로비리온, 빈 프로캡시드, A-입자, 또는 분해된 A-입자를 포함한 비감염성 바이러스-관련 입자 및 감염성 성숙 비리온 둘 다를 생성한다 [도 2]. 전형적인 감염된 세포 배양 수확물은 또한 숙주-세포 단백질 및 숙주-세포 DNA를 포함한, 숙주-세포 관련 불순물, 및 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함한, 배양 배지-관련 불순물을 포함할 수 있다. 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 전기영동 (SDS-PAGE)을 사용하여 GSH 친화성 크로마토그래피 분획에서 바이러스 및 불순물 단백질 밴드를 검출하였다. 샘플을 순수하게 준비하고 4x 로딩 염료 (바이오라드(BioRad)) 및 10x 환원제 (바이오라드)와 혼합한 후 70℃에서 10분 동안 가열하여 샘플을 변성시켰다. 20 μL의 변성된 샘플을 10-웰 12% 아크릴아미드 Bis-Tris NuPAGE 겔 (써모)에 첨가하고 인비트로겐(Invitrogen) 겔 박스 및 전원 공급 시스템 (써모)을 사용하여 200V에서 60분 동안 러닝시켰다. 겔은 피어스(Pierce) 은 염색 키트 (써모)를 사용하여 염색하고 겔 이미저 (바이오라드)를 사용하여 영상화하였다.

SDS-PAGE의 분석은 정화된 수확물이 고농도의 소 혈청 및 숙주-세포 단백질 불순물을 함유하였으며 이는 대부분 샘플 로드 (GSH FT) 동안 통과하여 흐른다는 것을 보여주었다 [도 4]. 추가 불순물은 제1 세척 동안 제거되었으며 (GSH W1), 제2 세척에 의해, 단지 BSA (66.5 kDa)의 희미한 밴드만 검출되었다 (GSH W2). 하기 CVA21 바이러스 캡시드 단백질 밴드를 그의 예상 분자량 (유니프롯 A0A0N9H7H0)에 의해 결정된 바와 같이 GSH 용리에서 볼 수 있었다: VP1 (33.2 kDa), VP2 (29.9 kDa), 및 VP3 (26.6 kDa). VP4 (7.5 kDa) 밴드는 그의 작은 분자량으로 인해 겔 바닥에서 흘러 넘쳤다. 게다가, 매우 희미한 VP0 (37.3 kDa)가 SDS-PAGE에 의해 검출될 수 있었으며, 이는 GSH 용리가 게놈의 캡시드화 후에 VP2 및 VP4로의 VP0 절단을 겪는 바이러스 입자를 함유하였음을 의미한다. 따라서, SDS-PAGE는 GSH 친화성 크로마토그래피가 불순물을 효율적으로 청소하면서 VP0을 함유하지 않는 성숙 CVA21 비리온에 선택적으로 결합한다는 것을 입증하였다.

GSH 친화성 크로마토그래피 정제된 바이러스를 염화세슘 (CsCl) 구배를 사용하여 통상적인 초원심분리 (UC) 공정에 의해 정제된 바이러스와 비교하였다 [도 1a]. UC 단계 전에, 정화된 세포 배양 수확물을 300 kDa PES 중공사 필터 (레플리젠(Repligen))를 사용하여 접선-흐름 여과 (TFF)에 의해 100배 농축하였다. 구배는 CsCl의 다양한 밀도 용액을 사용하여 초원심분리기 관에서 준비하고 농축된 세포 배양 용해물을 구배 상단에 첨가하였다. 샘플을 67,000 g에서 5시간 동안 원심분리하고 선택된 분획을 풀링하고 10 kDa 막을 가로질러 안정화 완충제 용액으로 투석하였다. SDS-PAGE 분석을 통해, VP0 및 기타 미지의 단백질 밴드가 UC 정제된 바이러스 레인에서 검출가능하였으며 [도 4], 이는 샘플 중의 빈 프로캡시드 및 기타 불순물의 존재를 나타내는 것이다.

GSH 친화성 크로마토그래피 및 UC 정제된 샘플은 2가지 1차 항체를 사용하여 모세관 전기영동 정량적 웨스턴 블롯 (프로테인 심플)에 의해 분석하였다: VP1에 결합하는 항-VP1 폴리클로날 항체 및 VP4 및 VP0 단백질 둘 다에 결합하는 항-VP4 폴리클로날 항체. VP1은 프로토머/오량체 서브유닛을 함유하는 모든 바이러스 입자에 존재하며 항-VP1 피크 면적을 사용하여 총 바이러스 입자를 추정하였다. VP0은 빈 프로캡시드, 프로비리온, 및 프로토머/오량체 서브유닛 (VP0-함유 엔테로바이러스 입자)에만 존재하며, 한편 VP4를 가진 입자는 완전 성숙 비리온을 형성하기 위한 게놈의 캡시드화 후 VP2+VP4로의 VP0 절단으로부터 발생한다 [도 2]. 따라서, VP0:VP4 피크 면적의 비를 사용하여 VP0-함유 엔테로바이러스 입자:완전 성숙 비리온 비를 추정하였다. 정화된 수확물과 GSH 크로마토그래피 FT 및 용리의 총 바이러스 입자 및 VP0-함유 입자/완전 성숙 비리온 비를 UC 퓨어 샘플과 비교하여 분석하였다 [도 5]. 정화된 수확물에서, UC 퓨어 샘플보다 VP0-함유 입자/완전 성숙 비리온의 상대 비가 ~6배 더 높은 ~10배 더 적은 총 입자가 있었다. GSH 친화성 크로마토그래피 로딩 단계 동안, 바이러스 입자가 GSH FT에 존재하였으나, 이들 입자는 VP0-함유 입자 함량이 높았다. GSH 용리액의 총 입자는 부피 감소로 인해 정화된 수확물에서 ~30배 증가하였으며, VP0:VP4 비는 ~60배 만큼 감소되었다. UC 정제된 바이러스와 비교하여, GSH 용리액은 VP0-함유 엔테로바이러스 입자:완전 성숙 비리온 비가 10배 더 낮았다. 이는 GSH 친화성 크로마토그래피가 VP4를 함유하는 완전 성숙 비리온 입자에 선택적으로 결합하며, 한편 VP0를 가진 입자는 통과하여 흐르고, 구배 초원심분리 방법보다 더 효율적으로 빈 프로캡시드를 청소한다는 것을 입증하였다.

수크로스 구배 초원심분리를 진행하여 정제된 GSH 용리 샘플에 완전 성숙 비리온 입자만 존재하는지 확인하였다. 1 mL의 GSH 용리 샘플을 15-42% w/v 연속 수크로스 구배 상단에 로딩하고 100분 동안 230,000 g에서 원심분리하였다. 12x1 mL 분획을 취하고 항-VP1 1차 항체를 사용하여 은 염색 및 모세관 전기영동 정량적 웨스턴과 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 분획 5-8은 빈 캡시드를 함유할 것으로 예상되었으며, 한편 분획 9-12는 완전 캡시드를 함유할 것으로 예상되었다. SDS-PAGE 겔에 나타낸 바와 같이, 바이러스 단백질 VP1, VP2, VP3은 분획 10-11에서 검출되고 어떠한 VP0도 검출되지 않았으며, 한편 레인 5-8에서는 어떠한 밴드도 검출되지 않았다 [도 6a]. 이것은 GSH 용리액이 완전 성숙 비리온만을 함유하고 어떠한 프로비리온이나 빈 캡시드도 함유하지 않음을 나타냈다. VP1에 의해 측정된 분획에 걸친 총 바이러스 입자의 분포는 GSH 용리 샘플이 99% 초과의 완전 성숙 비리온을 함유함을 입증하였다 [도 6b].

빈 프로캡시드 및 기타 바이러스 불순물을 제거하는 것 외에도, GSH 친화성 크로마토그래피는 혈청 및 숙주 세포 불순물을 효율적으로 청소하였다. BSA는 세포 배양 배지에서 사용되는 소 혈청의 주요 성분이다. 혈청을 가진 전형적인 세포 배양 배지에서, BSA 농도는 약 0.5-1.0 mg/mL이며 용량당 <50 ng BSA의 전형적인 목표를 충족하기 위해서는 상당한 감소가 필요하다. GSH 크로마토그래피 분획은 모세관 전기영동 정량적 웨스턴 블롯 (프로테인 심플)에 의해 분석하고 90분의 1차 인큐베이션 시간 및 60분의 2차 항체 인큐베이션 시간으로 공개된 절차 [16]를 사용하여 항-BSA 1차 항체 (베틸(Bethyl))에 의해 검출하였다 [도 7]. 초기 BSA 질량의 90% 초과가 GSH 로딩 단계 동안 통과하여 흘렀고, 약하게 결합된 BSA는 2회의 세척 단계에서 제거되었다. 정화된 수확물로부터의 GSH 용리 잔류 BSA의 퍼센트 감소는 99.99% 초과였다. 항-MRC-5 1차 항체 (시그너스(Cygnus))를 사용한 모세관 전기영동 웨스턴 블롯에 의해 측정한 GSH 용리 HCP 청소율, 및 qPCR (분석 실시예 6 참조)에 의해 측정한 HC-DNA 청소율을 또한 평가하였다 [표 2]. 정화된 수확물로부터의 퍼센트 감소는 HCP의 경우 99.9% 초과였고 HC-DNA의 경우 99.8% 초과였다. 이들 결과는 GSH 친화성 크로마토그래피가 성숙 감염성 CVA21 비리온의 효율적인 농축 및 정제에 활용되며, 한편 비감염성 빈 프로캡시드, 기타 바이러스 불순물, 및 세포 배양 관련 불순물을 청소할 수 있음을 확립한다.

<표 2>

실시예 2: GSH 친화성 크로마토그래피를 사용한 엔테로바이러스의 증폭 및 정제

엔테로바이러스는 유사한 게놈 및 구조적 바이러스 특성을 공유하는 작고, 양성 센스, 단일 가닥 RNA 바이러스로 이루어진 피코르나바이러스(Picornavirus) 과 내의 속이다. 엔테로바이러스의 GSH 친화성 정제를 입증하기 위해, 엔테로바이러스 B, 엔테로바이러스 C, 리노바이러스 A, 및 리노바이러스 B를 포함한 몇몇 엔테로바이러스 종을 포함하는 8종의 상이한 혈청형을 평가하였다. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 다양한 균주를 구매하고 엔테로바이러스 생산에 통상적인 감염 프로토콜을 사용하여 세포주 A 및/또는 B 및 상류 조건 A 또는 D [표 3]를 사용하여 두 가지 감염에서 증폭시켰다. 세포를 성장 배지에서 조직 배양-처리된 통기 플라스크에 플랜팅하였다. 플랜팅 후 수일에, 성장 배지를 경사분리하고 1 mL의 엔테로바이러스 접종물을 세포층에 첨가하였다. 플라스크를 2시간 동안 인큐베이션한 후 39 mL의 생산 배지를 각각의 플라스크에 첨가하고 상류 조건에 따라 인큐베이션하였다. 플라스크는 세포변성 효과에 대한 육안 검사 후에 상청액을 수집함으로써 수확하였다. 플라스크를 -70℃에서 보관하고, 해동하고, GSH 친화성 크로마토그래피 정제에서 사용하기 전에 정화시켰다.

<표 3>

GSH 친화성 크로마토그래피는 문헌 [Konstantinidis et al.] [17]에 기재된공정으로 스테인리스 스틸 주사기 팁을 가진 8-채널 액체 취급 아암 및 편심 로봇 조작기 아암 (테칸 그룹 리미티드(Tecan Group Ltd))이 장착된 테칸 프리덤 EVO 150에서 0.6 mL의 글루타티온 세파로스 4 패스트 플로우 수지 (레플리젠)를 함유하는 오푸스(Opus) 로보컬럼을 사용하여 수행하였다. 각각의 정제 아암에 대해, 0.6 mL 컬럼을 인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.4의 5-CV의 평형화 용액으로 평형화하였다. 정화된 엔테로바이러스 샘플을 50-CV의 로딩으로 컬럼에 적용하였다. 이어서 컬럼을 15 mM Tris, 400 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.005% w/v PS80, pH 8.0을 함유하는 5-CV의 세척 1 용액 및 이어서 15 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.005% w/v PS80, pH 8.0을 함유하는 세척 2 용액으로 세척하였다. 결합된 엔테로바이러스 입자는 이동상에서의 고정화된 글루타티온 리간드로부터 유리 GSH로의 경쟁적 치환을 통해 15 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM GSH, 0.005% w/v PS80, pH 8.0을 함유하는 5-CV의 용리 용액으로 용리하였다. 이어서 컬럼은 15 mM Tris, 1000 mM NaCl, 1 mM DTT, 10 mM GSH, 0.005% w/v PS80, pH 8.0을 함유하는 스트립 용액 5-CV로 스트리핑하였다. 모든 단계를 4분의 체류 시간에서 수행하였으며, 투명한 편평한 바닥 96w UV 플레이트 (코닝(Corning))에서 1/3 CV마다 분획을 수집하였다.

크로마토그램은 260 nm 및 280 nm에서 모든 분획의 광학 흡광도를 측정하고 900/990 nm에 대해 경로길이 보정하고, 컬럼당 모든 분획에 대한 경로길이 보정된 흡광도를 컴파일링함으로써 생성되었다. 도 8은 A280을 사용한 예시적인 크로마토그램 및 정제 아암 (9)의 전도도 트레이스를 나타낸다. 용리 피크는 전형적으로 로보컬럼 방법 내에서 60-65-CV 사이에서 관찰되었다. 각각의 정제 아암에 대한 정화된 수확물 및 용리 분획을 SDS-PAGE에 의해 검정하였다. 샘플을 4X 로딩 염료 및 10x 환원제 (바이오라드)와 혼합한 다음에 70℃에서 10분 동안 변성시켰다. 샘플당 25 uL 및 2 uL의 마크(Mark)-12 단백질 사다리 (인비트로겐)를 1.0 mm 10-레인 12% 아크릴아미드 Bis-Tris NuPAGE 겔 (인비트로겐)에 로딩하고 200 V에서 45분 동안 1X MOPS 전기영동 러닝 완충제 (인비트로겐)를 함유하는 겔 박스 및 전원 공급 시스템 (인비트로겐)에서 전기영동하였다. 이어서 겔을 피어스 은 염색 키트 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 염색하고 겔 이미저 (바이오라드)를 사용하여 영상화하였다.

실험 아암 1-9 정화된 세포 배양 수확물 [도 9a] 및 GSH 용리 분획 [도 9b]의 SDS-PAGE 분석은 GSH 친화성 크로마토그래피가 상이한 종의 범위에 걸쳐 엔테로바이러스의 여러 혈청형을 정제하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 입증한다. 엔테로바이러스 캡시드 바이러스 단백질 (VP)은 에코바이러스 1 (1), 리노바이러스 1B (2), 리노바이러스 35 (3), 콕사키바이러스 A 13 (4), 콕사키바이러스 A 15 (5), 콕사키바이러스 A 18 (6), 콕사키바이러스 A 20b (7), 및 콕사키바이러스 A 21 (8, 9)의 용리에서 검출가능하다. 모든 아암이 엔테로바이러스 생산을 위해 통상적인 세포 배양 프로토콜을 사용했지만, CVA21 (8,9) 생산 방법만 고역가에 최적화되었다. 이 예에서 ATCC 스톡으로부터 공급된 다른 엔테로바이러스 혈청형 (1-7)은 원래 바이알로부터 거의 또는 어떠한 처리도 겪지 않았다. 개선된 세포 배양 역가 및 GSH-친화성 크로마토그래피에 의한 회수는 혈청형 특이적 방법의 추가 최적화로 예상된다. 더욱이, 상류 조건은 아암 8-9 GSH 용리 분획에서 바이러스 단백질 밴드의 상이한 분포에 의해 입증된 바와 같이 빈 프로캡시드가 GSH 크로마토그래피 수지에 결합하는 데 영향을 미칠 수 있다.

실시예 3: 상이한 상류 조건으로 생성된 정화된 수확물을 사용한 CVA21의 GSH 친화성 크로마토그래피 정제

GSH 친화성 크로마토그래피는 상류 세포 배양 조건 A-C를 사용하여 생성된 CVA21 정화된 수확물을 사용하여 실시예 1에서와 유사한 절차를 사용하여 2개의 실험에 걸쳐 평가되었다 [표 4]. GSH 세파로스 4 패스트 플로우 수지로 채워진 20 mL HiPrep 컬럼을 유니콘 시스템 제어 소프트웨어와 Akta 퓨어 150M FPLC 시스템 상에서 사용하였다. CVA21 정화된 세포 배양 수확물은 200-CV의 컬럼 로딩에 도달할 때까지 100 cm/hr의 유량에서 로딩하였다. GSH 컬럼을 150 cm/hr의 유량에서 15 mM Tris, 400 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 8.0을 함유하는 8-CV의 GSH 세척 1 완충제 및 이어서 15 mM Tris, 75 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, pH 8.0을 함유하는 4-CV의 GSH 세척 2 완충제로 세척하였다. 결합된 CVA21 입자는 150 cm/hr의 유량에서 15 mM Tris, 75 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, 1 mM GSH, pH 8.0을 함유하는 4-CV의 GSH 용리 용액으로 용리하였다. GSH 컬럼은 150 cm/hr의 유량에서 15 mM Tris, 1000 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, 10 mM GSH, pH 8.0을 함유하는 4-CV의 GSH 스트립 완충제로 스트리핑하고 0.1 N NaOH, 1 M NaCl 용액으로 재생시켰다.

<표 4>

정화된 수확물 및 GSH 용리 생성물 샘플을 은 염색 [도 10] 및 모세관 전기영동 항-VP4 웨스턴을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하여 초원심분리 정제된 바이러스에 대한 VP0:VP4 비를 검출하였다 [도 11]. SDS-PAGE의 분석은 GSH 용리에서 불순물 단백질 청소율이 모든 아암에 대해 유사하였으나, GSH 용리 샘플은 다른 바이러스 단백질 밴드와 비교하여 VP0 밴드 (~37 kDa)의 상이한 강도를 가졌다. 아암 1, 3 및 4는 더 높은 VP0 함량을 가졌으며, 한편 아암 2 및 5는 낮은 VP0 함량을 가졌는데, 이는 GSH 크로마토그래피 단계에 걸쳐 빈 프로캡시드 청소율의 차이를 나타낸다. 항-VP4 웨스턴에 의한 초원심분리 정제된 바이러스에 대한 빈 프로캡시드:완전 성숙 바이러스 입자 비는 VP0:VP4 비가 모든 아암에 대해 정화된 수확물로부터 GSH 용리 생성물로 감소했음을 입증하였으나, 감소 인자에는 차이가 있었다. 상류 조건 A로부터 생성된 아암 2 및 5에서, 빈 프로캡시드:완전 성숙 비리온 비는 초원심분리의 비보다 상당히 낮았다. 이들 결과는 일부 상류 조건 하에, 빈 프로캡시드의 분획이 GSH 수지에 결합할 수 있고, 제2 단계 예컨대 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피를 실시하여 GSH 용리 생성물 중 잔류 빈 프로캡시드를 청소함으로써 초원심분리 정제된 바이러스의 순도를 충족하거나 초과할 수 있음을 입증한다.

실시예 4: GSH 친화성 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피를 포함하는 공정을 사용한 엔테로바이러스의 정제

엔테로바이러스의 확장가능한 정제는 대규모 생물반응기 세포 배양 수확물로부터의 CVA21 정제를 예로 들어 도 12의 공정을 사용하여 입증하였다. 정제 공정은 숙주 세포 파편을 제거하기 위해 0.2-100 μm의 기공 크기 범위를 가진 하나 또는 여러 개의 정화 필터를 통한 세포 배양 배지, 숙주 세포 파편, 혈청 불순물, 및 엔테로바이러스 입자로 이루어진 엔테로바이러스 세포 배양물의 수확을 포함한다. 1-100 μm의 필터 기공 크기로의 1차 정화 단계 및 0.2-5 μm의 필터 기공 크기로의 2차 정화 단계로, 일련의 두 가지 정화 단계를 사용할 수 있다. 미세담체 세포 배양물로부터의 수확물의 경우, 1차 정화는 2차 정화 전에 미세담체를 제거하기 위한 메쉬 백 또는 심층 필터를 포함할 수 있다. CVA21을 사용한 현 실시예에서, 정화 단계는 100 L/m²-hr (LMH)에서 작동하는 일련의 2개의 필터로 연속적으로 진행하였다: 클래리솔브(Clarisolve) 60 HX (밀리포어(Millipore)) 60 μm 심층 필터를 사용한 1차 정화로 미세담체 및 대형 세포 파편을 제거하고, 사르토퓨어(Sartopure) GF+ (사르토리우스(Sartorius)) 1.2 μm 심층 필터를 사용한 2차 정화로 HC-DNA를 포함한 더 작은 세포 잔해를 청소한다.

일부 엔테로바이러스 세포 배양에서, 바이러스의 용해 활성은 세포를 용해하기에 충분하며 어떠한 용해 단계도 필요하지 않다. 다른 엔테로바이러스 세포 배양에서, PS-80, PS-20 또는 0.01-2% w/v 범위의 기타 계면활성제를 사용한 세제 용해와 같은 용해 단계를 세포를 완전히 용해하기 위해 정화 단계 전에 실시할 수 있다. CVA21을 사용한 현 실시예에서, 어떠한 용해 단계도 수행되지 않았다.

정화된 수확물은 실시예 1과 유사한 절차에 따라 GSH 친화성 크로마토그래피 컬럼에 직접 로딩한다. GSH 크로마토그래피 작업을 위해, GSH 고정화된 수지는 제조 규모 크로마토그래피 컬럼에 채워지고 크로마토그래피 스키드 예컨대 Akta 파일롯(Pilot) (시티바) 또는 Akta 레디(Ready) (시티바)로 작동되었다. CVA21을 사용한 현 실시예에서, GSH 세파로스 4 FF로 채워진 직경 14 cm 컬럼을 유니콘 시스템 제어 소프트웨어와 Akta 파일롯 상에서 사용하였다. CVA21 정화된 세포 배양 수확물은 150-200 CV의 컬럼 로딩이 될 때까지 100 cm/hr의 유량에서 컬럼에 로딩하였다. GSH 컬럼은 150 cm/hr의 유량에서 15 mM Tris, 400 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 8.0을 함유하는 8-CV의 GSH 세척 1 완충제 및 이어서 15 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, pH 8.0을 함유하는 4-CV의 GSH 세척 2 완충제로 세척하였다. 결합된 CVA21 입자는 150 cm/hr의 유량에서 15 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, 1 mM GSH, pH 8.0을 함유하는 4-CV의 GSH 용리 용액으로 용리하였다. GSH 컬럼은 150 cm/hr의 유량에서 15 mM Tris, 1000 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, 1 mM DTT, 10 mM GSH, pH 8.0을 함유하는 4-CV의 GSH 스트립 완충제로 스트리핑하고 0.1 N NaOH, 1 M NaCl 용액으로 재생시켰다.

GSH 용리 생성물은 추가적인 잔류 불순물 청소를 위해 통과 모드로 작동되는 임의적 연마 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 단계에 직접 로딩한다. AEX 크로마토그래피 단계는 통상적인 AEX 크로마토그래피 매질 예컨대 POROS 50HQ (써모피셔), 캡토(Capto) Q (시티바) 또는 누비아(Nuvia) Q (바이오라드) 또는 기타 AEX 정지상을 사용할 수 있다. 대규모 AEX 크로마토그래피 작업의 경우, AEX 수지는 제조 규모 크로마토그래피 컬럼에 패킹되고 크로마토그래피 스키드 예컨대 Akta 파일롯으로 50-300 cm/hr의 유량에서 진행한다. AEX 컬럼은 pH 6-9 및 50-500 mM의 1가 염 농도의 용액으로 구성된 3-5 CV AEX 평형화 완충제에서 평형화한다. pH 6-9 및 50-500 mM의 1가 염 농도의 용액에서 GSH 용리 생성물을 AEX 컬럼에 로딩한 후 1-3 CV의 AEX 평형화 완충제로 추적한다. 엔테로바이러스 입자가 통과하여 흐르며 한편 HC-DNA 및 불순물 단백질을 포함한 불순물이 AEX 수지에 결합한다. 컬럼은 pH 6-9 및 500-1500 mM의 1가 염 농도의 용액으로 구성된 3-5 CV AEX 스트립 완충제로 스트리핑하고 0.1-0.5N 수산화나트륨을 함유하는 용액으로 재생시킨다. AEX 완충제 용액은 계면활성제 예컨대 0.001-1% w/v 농도의 PS-80, PS-20 또는 기타 유사한 계면활성제를 함유할 수 있다. CVA21을 사용한 현 실시예에서, POROS 50HQ 수지로 채워진 5 cm 직경의 컬럼은 200 cm/hr의 유량에서 유니콘 시스템 제어 소프트웨어와 Akta 파일롯 상에서 진행하였다. AEX 컬럼은 15 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 8.0으로 이루어진 4-CV의 AEX 평형화 완충제로 평형화하였다. CVA21 입자를 함유하는 GSH 용리 생성물을 25-30 CV의 로딩까지 컬럼에 로딩하고 2-CV AEX 평형화 완충제로 추적하였다. CVA21 입자가 통과하여 흐르며 한편 잔류 불순물이 컬럼에 결합하였다. AEX 컬럼은 15 mM Tris, 1000 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 8.0을 함유하는 4-CV의 AEX 스트립 완충제로 스트리핑하였고 4-CV의 0.5 N NaOH 용액으로 재생시켰다. AEX 없이 최종 정제된 조성물의 원하는 잔류 불순물 사양이 충족되는 경우 AEX 크로마토그래피 단계를 생략할 수 있다. 이 상황에서, GSH 용리 생성물은 용액 조정 단계로 향한다.

용액 조정 단계에서, AEX FT 또는 GSH 용리 (AEX가 수행되지 않은 경우) 생성물은 후속 CEX 크로마토그래피 단계에서 CEX 크로마토그래피 수지에의 결합에 적합한 용액 조건으로 조정된다. AEX FT 또는 GSH 용리 생성물은 초기에 pH 6-9 및 50-500 mM의 1가 염 농도의 용액에 있다. 필요한 경우, pH 3.5-6.0의 시트레이트와 같은 완충제 종으로 이루어진 0.5-1.5 M 조정 완충제 용액 및 NaCl과 같은 2-5 M 조정 1가 염 용액의 농축 스톡 용액을 AEX FT에 스파이킹하여 용액 pH를 pH 3.5-6.0으로 낮추고 1가 염 농도를 50-500 mM으로 증가시킨다. AEX FT가 이미 CEX 단계에 대한 로딩 용액의 목표 pH 또는 1가 염 농도에 있는 경우 하나 또는 둘 다의 조정 용액이 필요하지 않을 수 있다. CVA21을 사용하는 현 실시예에서, 1 M 시트르산나트륨, pH 4.0 용액 및 5 M NaCl 용액을, pH ~4.1에서 50 mM의 최종 시트르산나트륨 농도 및 400 mM의 최종 NaCl 농도를 목표로 하여, 초기에 pH 8.0 및 150 mM NaCl에서 AEX FT에 스파이킹한다. 농축된 스톡 용액을 혼합하면서 5-10분에 걸쳐 AEX FT 생성물에 천천히 첨가하였다. 이 용액 조정된 샘플은 지정된 CEX 공급물이었으며 목표 CEX 로딩 용액을 나타냈다.

결합-용리 모드로 작동되는 CEX 크로마토그래피 단계를 실시하여, 빈 프로캡시드 청소를 위한 2차 단계로서 공정 견고성을 개선하고, 잔류 불순물을 청소하고, 추가 부피 감소를 제공한다. CEX 단계는 통상적인 크로마토그래피 예컨대 POROS 50HS (써모피셔), 캡토 S (시티바) 또는 누비아 S (바이오라드) 또는 기타 CEX 정지상을 사용할 수 있다. 대규모 CEX 크로마토그래피 작업의 경우, CEX 수지는 대규모 크로마토그래피 컬럼에 채우고 크로마토그래피 스키드 예컨대 Akta 파일롯으로 50-300 cm/hr의 유량에서 진행한다. CEX 컬럼은 pH 3.5-6.0 및 50-500 mM의 1가 염 농도의 용액으로 구성된 3-5 CV CEX 평형화 완충제에서 평형화한다. pH 3.5-6.0 및 50-500 mM의 1가 염 농도에서 CEX 로딩 용액 중 CEX 공급물을 CEX 컬럼에 로딩한다. 엔테로바이러스 입자는 CEX 수지에 결합하며 한편 일부 잔류 불순물은 통과하여 흐를 수 있다. CEX 컬럼은 pH 3.5-6.0 및 100-600 mM의 1가 염 농도의 용액으로 구성된 3-5-CV의 CEX 세척 완충제 용액으로 세척하여, 잔류 불순물을 제거한다. 완전 성숙 비리온은 pH 3.5-4.8 및 200-1000 mM NaCl의 1가 염 농도의 용액으로 구성된 3-5-CV의 CEX 용리 완충제 용액을 사용하여 CEX 컬럼으로부터 선택적으로 용리되며, 한편 빈 프로캡시드는 CEX 수지에 결합된 상태로 남아 있다. 빈 프로캡시드 및 기타 잔류 불순물은 pH 4.0-8.0 및 500-1500 mM의 1가 염 농도의 용액으로 구성된 3-5 CV CEX 스트립 완충제로 용리되며 CEX 컬럼은 0.1-0.5 N 수산화나트륨을 포함하는 용액으로 재생시킨다. CEX 완충제 용액은 계면활성제 예컨대 0.001-1% w/v 농도의 PS-80, PS-20 또는 기타 유사한 계면활성제를 함유할 수 있다. CVA21을 사용한 현 실시예에서, POROS 50HS 수지로 채워진 5 cm 직경의 컬럼은 200 cm/hr의 유량에서 유니콘 시스템 제어 소프트웨어와 Akta 파일롯 상에서 진행하였다. CEX 컬럼은 50 mM 시트르산나트륨, 400 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 4.0으로 이루어진 4-CV의 CEX 평형화 완충제로 평형화하였다. CVA21 입자를 함유하는 CEX 공급 생성물을 25-30 CV의 로딩까지 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 25 mM 시트르산나트륨, 500 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 4.0으로 이루어진 4-CV의 CEX 세척 완충제로 세척하였다. 완전 성숙 CVA21 비리온은 25 mM 시트르산나트륨, 800 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 4.0으로 이루어진 4-CV의 CEX 용리 완충제를 사용하여 CEX 컬럼으로부터 선택적으로 용리되었다. 빈 CVA21 프로캡시드를 25 mM 시트르산나트륨, 1000 mM NaCl, 0.005% w/v PS-80, pH 7.0으로 이루어진 4-CV의 CEX 스트립 완충제로 용리하고 컬럼을 4-CV의 0.5 N NaOH 용액으로 재생시켰다.

정제된 완전 성숙 엔테로바이러스 비리온으로 이루어진 CEX 용리 생성물은 탈염 모드로 접선-흐름 여과 (TFF) 또는 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 통해 한외여과/정용여과 (UF/DF)에 의해 안정화 완충제로 완충제 교환된다. TFF의 경우, 엔테로바이러스 입자는 약 50-500 kDa의 분자량 컷오프를 가진 중공사 또는 카세트에 의해 유지되며, 한편 다른 작은 용액 성분은 막을 통해 투과된다. TFF는 약 1,000-8,000 s^-1의 직교류 전단 속도, 약 0.1-10 psig의 막횡단 압력 (TMP), 및 약 5-60 L/m²-hr의 투과 유량에서 작동될 수 있다. CEX 용리 생성물은 약 pH 6-8에서 완충제 종으로 이루어진 1x 안정화 완충제 용액으로 5-10 정용부피(diavolume)로 정용여과된다. UF 단계는 DF 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 임의적 중화 단계는 CEX 용리 생성물이 2-5x 농축된 안정화 완충제 용액으로 2-5배 희석되는 TFF 전에 수행할 수 있다. TFF 전에 약 0.1-1 μm의 공극 크기를 가진 필터로 이루어진 임의적 여과 단계를 사용할 수 있다. SEC와의 완충제 교환을 위해, CEX 용리 생성물을 수지 예컨대 세파덱스(Sephadex) (시티바)로 채워진 SEC 컬럼에 로딩하고 크로마토그래피 스키드 예컨대 Akta 파일롯을 사용하여 탈염 모드로 작동시킨다. CVA21을 사용한 현 실시예에서, CEX 용리 생성물은 3x 농축된 안정화 완충제 용액으로 3배 희석하여 중화되었다. 중화된 CEX 용리 생성물을 TFF 공급 용액을 생성하기 전에 듀라포어(Durapore) 0.22 μm 필터 (밀리포어)를 사용하여 여과하였다. TFF 공급 용액을 초기에 2-3배 농축한 다음에, 스펙트럼 300 kDa 중공사 필터 (레플리젠)를 사용하여 2000 s^-1의 직교류, 1-2 psig의 TMP, 및 20-40 LMH의 투과 유량에서 완충제를 1x 안정화 완충제 용액으로 교환하였다.

완충제 교환된 TFF 또는 SEC 용리 생성물을 사용하여 최종 여과 단계를 수행한다. 0.1-0.5 μm의 필터 기공 크기가 사용된다. 안정화 완충제 용액에서 최종 정제된 엔테로바이러스 조성물을 동결시키고 <-60℃에서 보관한다. CVA21을 사용하는 현 실시예에서, 듀라포어 0.22 μm 필터 (밀리포어)를 사용하였다.

상기에 기재한 CVA21 정제 공정은 상류 세포 배양 조건 A 및 B로부터 생산된 4개 배치에 대해 입증되었다 [표 6]. 예로서, 세포 배양 조건 B를 가진 배치 4에 대한 정제 공정 중간 샘플은 은 염색과 SDS-PAGE에 의해 특성화되었다 [도 13]. GSH 용리 생성물은 VP0, VP1, VP2, VP3 (VP4, 7kDa, 겔에서 흘러 넘침), 및 RNA 검출가능한 밴드만으로 잔류 단백질 불순물의 높은 정제를 입증하였다. VP0 및 VP2 함량의 조합은 GSH 용리 생성물이 빈 프로캡시드 및 성숙 비리온의 분포를 함유함을 나타내었다. AEX 스트립 및 CEX FT에서 미량의 잔류 불순물이 청소되었다. CEX 용리 생성물은 고농도의 단지 VP1, VP2, VP3을 가지고, RNA 밴드가 육안으로 확인가능하였으며, 이는 빈 프로캡시드의 청소 및 완전 성숙 비리온의 순수한 조성을 확인시켜 주었다. CEX 스트립 샘플에서 빈 캡시드가 용리되었으며, 이는 높은 VP0 함량에 의해 입증되었다. VP 밴드 분포는 CEX 용리 생성물이 중화되고 여과된 다음 TFF 완충제 교환 및 최종 여과 단계 후에 일정하게 유지되었다. GSH 및 CEX 크로마토그래피 단계에 걸쳐 플라크 감염가, RT-qPCR 게놈, 및 HPSEC 입자 (실시예 6의 분석법 참조) 단계 수율은 높은 수율의 정제 공정을 확인시켜 주었다 [표 5]. 이들 결과는 빈 프로캡시드 (GSH, CEX)를 제거하고, 잔류 불순물 (GSH, AEX, CEX)을 청소하고 공정 부피 (GSH, CEX, TFF)를 감소시킬 수 있는 여러 유닛 작업이 수반되는 성숙 비리온의 정제된 조성물의 강력한 생산을 입증한다.

<표 5>

실시예 5: 초원심분리 정제된 CVA21 조성물과 비교한 GSH 친화성 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피를 포함하는 4개의 대규모 배치로부터 생성된 CVA21의 정제된 조성물

세포 배양 조건 A 및 B로부터 생성되고 도 13에 상세히 기재된 공정을 사용하여 정제된 CVA21의 4가지 정제된 조성물 뿐만 아니라 초원심분리를 사용하여 생성된 정제된 바이러스 (UC 퓨어, 도 1a)는 SDS-PAGE [도 14], 모세관 전기영동 항-VP4 웨스턴 [도 15], 및 플라크 효능, 게놈 RT-qPCR, HPSEC, RP-HPLC, CE-SDS, HC-DNA qPCR, 및 BSA ELISA를 포함한 몇몇 검정 [표 6]에 의해 특성화되었다. 각각의 검정에 대한 상세한 설명은 실시예 6의 분석법을 참조한다. BSA 분석에는 상업적으로 이용가능한 BSA ELISA 키트 (시그너스)를 사용하였다.

<표 6>

은 염색 및 항-VP4 웨스턴과 SDS-PAGE에 의한 분석은 GSH 용리 생성물의 배치 1-3에 대한 빈 프로캡시드 청소를 입증하며, 한편 배치 4는 UC 퓨어 바이러스와 비교하여 높은 VP0 함량을 가진다. 그러나, CEX 단계는 빈 프로캡시드를 청소하고 모든 배치에서, 빈 프로캡시드:완전 성숙 바이러스 비는 최종 정제된 바이러스 조성물의 CEX 용리 생성물에서 UC 퓨어 CVA21보다 ~10배 낮았다. 더욱이, H-클래스 바이오쉘 C4 컬럼 (워터스)을 사용한 역상 HLPC (RP-HPLC) 검정을 사용하여, 배치 1 크로마토그램을 예로 사용하여, 평균 2회 주입으로부터 VP0:VP2 피크 면적 신호의 비를 측정함으로써 정제된 바이러스 샘플의 VP0-함유 입자:VP2-함유 입자 비를 평가하였다 [도 16]. 배치 1-3의 RP-HPLC 결과는 UC 정제된 바이러스보다 ~10x 낮았으며, 이는 항-VP4 웨스턴 분석을 보강한다.

배치 1-4의 정제된 조성물의 플라크 효능, RT-qPCR 게놈, 및 HPSEC 입자 농도는 개선된 공정 역가 및 수율로 인해 UC 퓨어보다 더 높았다. SDS-PAGE, 및 CE-SDS 검정은 배치 1-4에서 높은 단백질 순도를 입증하고, HC-DNA 및 BSA 검정은 모두 <LOQ (정량 한계)였으며 UC 퓨어 조성물과 비교하여 개선된 HC-DNA 청소를 입증한다. 5E+07 pfu/용량의 가정된 용량으로, 배치 1-4는 <1pg HC-DNA/용량 및 <100 pg BSA/용량을 달성하였으며, 이는 <10 ng HC-DNA/용량 및 <50 ng BSA/용량의 전형적인 지침보다 몇 자릿수 더 낮다 [표 7].

<표 7>

총 입자 및 게놈 대 감염성 입자 비는 공정 일관성 및 정제된 바이러스 품질을 추적하기 위한 중요한 제품 속성이다. 감염성 입자에 대한 총 비는 1:1 내지 10⁷:1 범위일 수 있으며 값 계산에 사용된 개별 바이러스 및 분석 검정에 따라 다르다 [18]. 배치 1-4에 대해 각각 게놈/pfu 및 입자/pfu로의 게놈 및 입자 대 감염가 비는 UC 퓨어 바이러스보다 낮았으며, 이는 개선된 생성물 품질을 의미한다 [도 17]. 이들 분석 결과는 통상적인 초원심분리 방법 또는 기타 방법에 의해 생산된 기존 조성물과 비교하여 개선된 바이러스 효능, 성숙 비리온 순도, 및 잔류 불순물 청소율을 갖는 CVA21 조성물을 생산할 수 있는 보다 강력하고 확장가능한 공정을 확인해 준다.

실시예 6: CVA21 정제된 바이러스 분석 검정

역상 HPLC 또는 UPLC 검정 절차

UV 및 형광 (FLR) 검출기를 사용하는 일반 HPLC 또는 UPLC 시스템은 역상 크로마토그래피 조건 하에 CVA21 캡시드 단백질을 분리하는 데 사용하기에 적합하다. 전형적인 크로마토그래피 시스템은 4원 (또는 2원) 펌프, 샘플 관리기, 컬럼 구성요소, FLR 검출기 및 TUV 검출기를 포함한 워터스 액쿼티(ACQUITY) UPLC 시스템으로 이루어진다. 사용되는 전형적인 컬럼은 1000 Å 기공 크기와 2.7 μm 입자 크기를 가진 밀리포어(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 바이오쉘 IgG C4 컬럼이다. 2.1 x 100 mm 크기의 컬럼 (카탈로그 63288-U)은 모든 캡시드 비리온 단백질의 분리에 충분하다. 다른 공급업체로부터의 상이한 크기 또는 유사한 크기를 가진 컬럼은 동등한 분리 효율성을 달성할 수 있다. 전형적인 컬럼 온도는 80℃로 유지되나, 65 - 85℃의 컬럼 온도 범위는 비리온 단백질 분리에 대한 관찰가능한 영향 없이 사용할 수 있다. FLR 검출은 280 nm에서의 여기 및 352 nm에서의 방출을 사용하여 기록된다. 이중 UV 검출은 220 nm와 280 nm 둘 다에서 기록된다. 일부 경우에, 260 nm에서의 UV 검출이 또한 기록된다. 샘플 관리기 온도는 분석 동안 약 8℃로 유지된다.

구배 용리에는 두 개의 이동상이 사용된다. 제1 이동상은 HPLC-등급 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 이루어지고 (이동상 A); 제2 이동상은 아세토니트릴 중 0.1% TFA이다 (이동상 B). CVA21 정제된 바이러스 샘플의 분석에 사용된 이동상 구배 및 유량은 표 8에 도시하였다. 도 16의 예에서 확인된 바이러스 단백질 피크는 질량 분석법에 의해 확인되었다. 주입된 샘플에 따라 구배 설정이 변형될 수 있으며, 시스템 압력 한계에 따라, 0.2 내지 0.5 mL/min의 유량이 사용될 수 있다. 바이러스 단백질 피크 체류 시간은 시스템, 컬럼, 및 방법에 따라 달라질 수 있으나, 상대적 피크 순서는 동일하게 유지될 것으로 예상된다. 약 5-50 μL의 CVA21 정제된 샘플을 HPLC 분석을 위한 사전 희석 또는 환원 없이 직접 주입한다. 샘플이 너무 묽은 경우 (약 0.1 μg 미만 주입) 또는 분석법의 검출 한계 미만인 경우, 원심 필터 농축기 예컨대 아미콘 (Amicon) (밀리포어) 또는 비바스핀 (사르토리우스) 필터를 사용하여 샘플을 검정의 이상적인 범위로 농축할 수 있다.

<표 8>

CE-SDS 검정 절차

CVA21 성숙 비리온 캡시드는 4개의 바이러스 단백질인 VP4, VP3, VP2 및 VP1로 구성된다. CE-SDS는 그의 상이한 분자량을 기준으로 4개의 VP를 분리, 확인 및 정량화하고 상대 % 피크 면적 및 상대 이동 시간을 수득하는 데 사용된다. 상기 검정은 또한 빈 프로캡시드에 대한 마커인 VP0을 검출할 수 있다. CE-SDS 로딩 용액은 50 μL의 CVA21 샘플을 마우리스(Maurice) CE-SDS 플러스 키트 시약 (프로테인 심플)을 사용하여 47 μL의 1X 샘플 완충제, 2 μL의 2-메르캅토에탄올 및 1 μL의 10X 내부 표준물 (10 kDa 단백질)로 구성된 50 μL의 마스터 믹스와 혼합하여 제조한다. 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열하고, 벤치탑에 1분 동안 배치하여 냉각시킨 다음에, 1,000 g에서 1분 동안 볼텍싱한다. 로딩 용액은 할당된 웰에서 50 uL를 피펫팅하여 96 웰 플레이트로 옮기고 플레이트를 원심분리기 플레이트 어댑터를 사용하여 5분 동안 1,000 g에서 원심분리하였다. 샘플 플레이트를 마우리스 CE-SDS 플러스 키트 분리 카트리지 (프로테인 심플)를 가진 마우리스 인스트루먼트(Maurice Instrument) (프로테인 심플)에 배치하고 50 μL의 로딩 용액을 4600V에서 120초 동안 주입하고 5750V에서 35분 동안 분리한다. 배치 4로부터 정제된 바이러스 샘플의 4개 VP의 분리를 나타내는 전형적인 전기영동도 (약 10 μg 주입을 가짐)가 도 18에 제시된다. 바이러스 단백질 예상 상대 이동 시간 및 % 피크 면적을 표 9에 나타냈다. 예상 상대 이동 시간은 주어진 분리에 대해 최대 5%까지 이동할 수 있다. % VP 순도는 약 5%의 정량 검출 한계로 VP1-4의 % 피크 면적을 합산하여 계산된다. 샘플이 너무 묽은 경우 (약 1 μg 미만 주입) 또는 분석법의 검출 한계 미만인 경우, 원심 필터 농축기 예컨대 아미콘 (밀리포어) 또는 비바스핀 (사르토리우스) 필터를 사용하여 샘플을 검정의 이상적인 범위로 농축할 수 있다.

<표 9>

HPSEC 검정 절차

HPSEC 검정은 아질런트 시리즈(Agilent Series) 1260 또는 그 초과에서 수행한다. 시스템은 주입용 플레이트 오토샘플러 및 4원 펌프로 이루어진다. HPSEC 검정 절차는 토소 바이오사이언스 엘엘씨(Tosoh Bioscience LLC) (Cat#0005764)로부터 입수한 TSKgel G5000PWxl (7.5 x 300 mm, 17 μm) 컬럼을 사용하여 수행한다. 시스템은 소 혈청 알부민 (피어스)을 사용하여 보정된다. 10 mM Bis-Tris, 0.6 M NaCl, pH 6.9를 함유하는 이동상을 사용하여 HPSEC 시스템을 평형화하고 CVA21 샘플을 주입하고 (약 1 μg 초과) 등용매 용리 하에 0.4 mL/분의 유량에서 분해한다. 샘플 주입 후 총 용리 시간은 30℃에서 35분이다. DAD UV 검출기를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 획득한다. 와이어트 아스트라(Wyatt Astra)-7 소프트웨어는 UV A₂₈₀ 피크 면적을 바이러스 질량으로 직접 변환하고, 바이러스 농도는 하기에 나타낸 수학식에 따라 계산된다.

바이러스 농도 (μg/mL) = 바이러스 질량 (μg)/주입 부피 (mL)

280 nm에서 CVA21 완전 성숙 비리온 소멸 계수 (=5.48)는 모든 바이러스 단백질의 RNA 서열 및 아미노산 서열을 기반으로 하여 알고리즘을 가진 정보학 도구를 사용하여 계산되었다 [Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, E. Gasteiger, C. Hoogland, A. Gattiker, S. Duvaud, M.R.Wilkins, R.D. Appel, A. Bairoch; The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press 2005 (Informatics tool: https://web.expasy.org/protparam); or Determination of Extinction Coefficient, V. Murugaiah, Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products 2011 (Informatics tool: "Quest Calculate^TM RNA Molecular Weight Calculator." AAT Bioquest, Inc, 06 May. 2020, https://www.aatbio.com/tools/calculate-RNA-molecular-weight-mw]. 바이러스 입자 농도를 구하기 위해, 입자 수는 주입 부피와 상관시켰다. 바이러스 입자 수를 계산하는 수학식은 아래에 나타냈다:

입자 수 (mL당) = [바이러스 농도 (g/mL)/ *Mw (Da)] x 아보가드로 상수 (6.02E+23 입자-mol^-1)

*CVA21 완전 성숙 바이러스 (캡시드 단백질 + RNA) Mw (8203 Kda)는 실시예 7에서 MVSS01의 단백질 및 RNA 서열을 사용하여 계산되었다.

샘플이 너무 묽은 경우 (약 0.1 μg 미만 주입) 또는 분석법의 검출 한계 미만인 경우, 원심 필터 농축기 예컨대 아미콘 (밀리포어) 또는 비바스핀 (사르토리우스) 필터를 사용하여 샘플을 검정의 이상적인 범위로 농축할 수 있다.

플라크 검정 절차

플라크 검정은 SK-Mel-28 세포 감염 후 CVA21의 감염가 (pfu/mL)를 결정한다. 이 방법에서, SK-Mel-28 세포를 12-웰 세포 배양 플레이트에 5.0E+05 세포/웰로서 시딩하고, 37℃, 5% CO₂에서 24 ± 4시간 동안 인큐베이션한다. 이어서 세포를 CVA21 샘플로 감염시키고 37℃, 5% CO₂에서 90 내지 105분 동안 인큐베이션하여 바이러스 흡착을 허용한다. 흡착 기간 후, 오버레이 (1.5 mL/웰로서 1% 메틸 셀룰로오스)를 첨가하고, 감염된 세포 플레이트를 72 ± 2시간 동안 인큐베이터로 복귀시킨다. 이 인큐베이션 후, 오버레이를 제거하고, 세포 플레이트를 PBS/DPBS로 2회 세척하고 80% 메탄올로 고정한다. 이어서 플레이트는 감염되지 않은 모든 부착 세포에 결합하는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염색 용액으로 염색한다. 감염된 세포는 플레이트 표면에 부착되지 않고 플라크로서 지정된 갭을 남길 것이다. 플레이트 상의 플라크는 라이트 박스로 수동으로 육안으로 계수한다. 역가 계산은 플라크 수에 각각의 희석 계수를 곱하여 수행하며 플라크/mL로 표시하였다. 웰당 약 5 내지 55개의 플라크 범위로 플라크 수를 가진 적어도 2개의 웰의 기하 평균이 이 계산에서 사용된다.

RT-qPCR 바이러스 게놈 정량 검정 (GQA) 절차

샘플을 프로테이나제 K/소듐 도데실 술페이트 분해에 의해 용해시킨다. 이어서 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 분리 및 아세트산 나트륨/이소프로판올 침전에 의해 핵산을 추출한 후, 에탄올 세척 및 물에 재현탁한다. 재현탁된 핵산은 진뱅크 수탁 AF465515.1에 대해 설계된, CVA21 VP1 유전자를 표적으로 하는 이중-표지 프로브 및 프라이머를 함유하는 1-단계 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR) 반응에 첨가한다. 증폭을 증폭 주기에 걸친 형광 증가에 의해 모니터링한다. 게놈 카피 수는 1E+11 게놈 카피/mL 내지 1E+07 게놈 카피/mL의 범위의 VP1 유전자 표적 영역을 함유하는 합성 RNA의 표준 곡선에 대한 보간법에 의해 결정한다.

잔류 숙주 세포 DNA 검정 절차

샘플을 프로테이나제 K/소듐 도데실 술페이트 분해에 의해 용해시킨다. 이어서 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 분리 및 아세트산 나트륨/이소프로판올 침전에 의해 핵산을 추출한 후, 에탄올 세척 및 물에 재현탁한다. 재현탁된 핵산은 NCBI 참조 수탁 NM_001164835.1에 대해 설계된, 인간 LINE-1 트랜스포사제 도메인의 3' 보존 영역을 표적으로 하는 이중-표지 프로브 및 프라이머를 함유하는 정량적 PCR (qPCR) 반응에 첨가한다. 증폭을 증폭 주기에 걸친 형광 증가에 의해 모니터링한다. 숙주 세포 DNA 농도를 2E+02 ng DNA/mL 내지 2E-02 ng DNA/mL의 범위의 정제된 MRC-5 DNA의 표준 곡선에 대한 보간법에 의해 결정한다.

바이러스 TCID₅₀ 검정

96-웰 조직 배양 플레이트에 있는 SK-Mel-28 세포의 전면생장 단층에 CVA21의 10배 연속 희석액 (4중으로 100 μL/웰)을 접종하고 37℃에서 5% CO₂ 환경에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 마우스 혈청을 2% 우태아 혈청 (FCS)을 함유하는 DMEM에서 1:10² 내지 1:10⁸ 범위로 10배 연속 희석하였다. 도립 현미경 하에서 시각적으로 세포변성 효과 (CPE)에 대해 웰의 점수를 매겼다. 검출가능한 CPE를 갖는 웰은 양성으로 점수가 매겨졌으며 50% 바이러스 종점 역가는 카버(Karber) 방법을 사용하여 계산하였다 (Dougherty 1964).

실시예 7: CVA21 바이러스 서열

콕사키바이러스 A21의 원형 쿠이켄달 균주는 진뱅크에 AF465515로 기재되어 있다. 초기 임상 시험 배치 멜트라이얼(MelTrial) 바이러스 1은 플라크 정제, SK-MEL-28 세포의 확장 및 수크로스 구배에 의한 정제를 통해 상기 원형 균주로부터 유래되었다.

상기 실시예에서 사용된 마스터 바이러스 시드 스톡 CVA21 MVSS-01은 MRC-5 세포에서 플라크 정제 및 확장에 의해 멜트라이얼 바이러스 1로부터 유래되었다. 이 바이러스의 완전 게놈 서열을 분석하였다 [표 10].

<표 10>

<표 11>

참고문헌:

미국 가출원 번호 62/951,078은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 간행물, 데이터베이스 항목 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 유전자ID 항목), 특허 출원, 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 참조로 포함된다. 참조에 의한 이러한 포함 진술은 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라 출원인에 의해, 그러한 인용이 참조에 의한 전용 진술에 바로 인접하지 않더라도, 각각의 그리고 모든 개별 간행물, 데이터베이스 항목 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 유전자ID 항목), 특허 출원, 또는 특허에 관한 것으로 의도된 것이며, 이 각각은 37 C.F.R. §1.57(b)(2)를 준수하여 분명히 확인된다. 명세서 내에, 만약에 있다면, 참조에 의한 포함에 대한 전용 진술의 포함은, 참조에 의한 포함에 대한 이러한 일반적인 진술을 어떠한 식으로든 약화시키지 않는다. 본원에 참고문헌의 인용은 참고문헌이 적절한 선행 기술임을 인정하기 위한 것도 아니며, 이들 간행물이나 문서의 내용이나 날짜에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다. 참고문헌이 본 명세서에 제공된 정의와 충돌하는 청구된 용어에 대한 정의를 제공하는 정도로, 본 명세서에 제공된 정의는 청구된 발명을 해석하는 데 사용되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Merck Sharp & Dohme Corp. Curtis, Erik M. Konstantinidis, Spyridon Poplyk, Murphy Swartz, Andrew Ryan Wenger, Marc D. <120> PURIFIED COMPOSITIONS OF ENTEROVIRUSES AND METHODS OF PURIFICATION WITH GLUTATHIONE AFFINITY CHROMATOGRAPHY <130> 24943-WO-PCT <150> US 62/951,078 <151> 2019-12-20 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7405 <212> RNA <213> Coxsackievirus A 21 <400> 1 uuaaaacagc ucugggguug uucccacccc agaggcccac guggcggcua guacucuggu 60 auuacgguac cuuuguacgc cuguuuugua ucccuucccc cguaacuuua gaagcuuauc 120 aaagguucaa uagcaggggu acaaaccagu accucuacga acaagcacuu cuguuucccc 180 ggugauauca cauagacugu acccacgguc aaaagugauu gauccguuau ccgcuugagu 240 acuucgagaa gccuaguauc accuuggaau cuucgaugcg uugcgcucaa cacucugccc 300 cgaguguagc uuaggcugau gagucugggc acuccccacc ggcgacggug gcccaggcug 360 cguuggcggc cuacccaugg cugaugccgu gggacgcuag uugugaacaa ggugugaaga 420 gccuauugag cuacucaaga guccuccggc cccugaaugc ggcuaauccu aaccacggag 480 caaccgcuca caacccagug aguagguugu cguaaugcgu aagucugugg cggaaccgac 540 uacuuugggu guccguguuu cccuuuauau ucauacuggc ugcuuauggu gacaauuuac 600 aaauuguuac cauauagcua uuggauuggc cacccaguau ugugcaauau auuugagugu 660 uucuuucaua agccuuauua acaucacauu uuuaaucaca auaaacagug caaauggggg 720 cucaaguuuc aacgcaaaag accggugcgc acgagaauca aaacguggca gccaauggau 780 ccaccauuaa uuacacuacu aucaacuauu acaaagacag ugcgaguaau uccgcuacua 840 gacaagaccu cucccaagau ccaucaaaau ucacagaacc gguuaaggac uuaauguuga 900 aaacagcacc agcucuaaac ucgccuaacg uggaagcaug uggguacagu gaccguguga 960 ggcaaaucac uuuaggcaac ucgacuauua cuacacaaga agcagccaau gcuauuguug 1020 cuuacgguga auggcccacu uacauaaaug auucagaagc uaauccggua gaugcaccca 1080 cugagccaga uguuaguagc aaccgguuuu acacccuaga aucggugucu uggaagacca 1140 cuucaagggg augguggugg aaguuaccag auuguuugaa ggacauggga auguuugguc 1200 agaauaugua cuaucacuac uuggggcgcu cugguuacac cauucauguc cagugcaacg 1260 cuucaaaauu ucaccaaggg gcguuaggag uuuuucugau accagaguuu gucauggcuu 1320 gcaacacuga gaguaaaacg ucauacguuu cauacaucaa ugcaaauccu ggugagagag 1380 gcggugaguu uacgaacacc uacaauccgu uaaauacaga cgccagugag ggcagaaagu 1440 uugcagcauu ggauuauuug cuggguucug guguucuagc aggaaacgcc uuuguguacc 1500 cgcaccagau caucaaccua cguaccaaca acagugcaac aauuguggug ccauacguaa 1560 acucacuugu gauugauugu auggcaaaac acaauaacug gggcauuguc auauuaccac 1620 uggcacccuu ggccuuugcc gcaacaucgu caccacaggu gccuauuaca gugaccauug 1680 cacccaugug uacagaauuc aauggguuga gaaacaucac cgucccagua caucaagggu 1740 ugccgacaau gaacacaccu gguuccaauc aauuccuuac aucugaugac uuccagucgc 1800 ccugugccuu accuaauuuu gauguuacuc caccaauaca cauacccggg gaaguaaaga 1860 auaugaugga acuagcugaa auugacacau ugaucccaau gaacgcagug gacgggaagg 1920 ugaacacaau ggagauguau caaauaccau ugaaugacaa uuugagcaag gcaccuauau 1980 ucuguuuauc ccuaucaccu gcuucugaua aacgacugag ccgcaccaug uugggugaaa 2040 uccuaaauua uuacacccau uggacggggu ccaucagguu caccuuucua uuuuguggua 2100 guaugauggc cacugguaaa cugcuccuca gcuauucccc accgggagcu aaaccaccaa 2160 ccaaucgcaa ggaugcaaug cuaggcacac acaucaucug ggaccuaggg uuacaaucca 2220 guuguuccau gguugcaccg uggaucucca acacagugua cagacggugu gcacgugaug 2280 acuucacuga gggcggauuu auaacuugcu ucuaucaaac uagaauugug guaccugcuu 2340 caaccccuac caguauguuc auguuaggcu uuguuagugc guguccagac uucaguguca 2400 gacugcuuag ggacacuccc cauauuaguc aaucgaaacu aauaggacgu acacaaggca 2460 uugaagaccu cauugacaca gcgauaaaga augccuuaag agugucccaa ccacccucga 2520 cccagucaac ugaagcaacu aguggaguga auagccagga ggugccagcu cuaacugcug 2580 uggaaacagg agcaucuggu caagcaaucc ccagugaugu gguggaaacu aggcacgugg 2640 uaaauuacaa aaccaggucu gaaucguguc uugagucauu cuuugggaga gcugcgugug 2700 ucacaauccu auccuugacc aacuccucca agagcggaga ggagaaaaag cauuucaaca 2760 uauggaauau uacauacacc gacacugucc aguuacgcag aaaauuagag uuuuucacgu 2820 auuccagguu ugaucuugaa augacuuuug uauucacaga gaacuauccu aguacagcca 2880 guggagaagu gcgaaaccag guguaccaga ucauguauau uccaccaggg gcaccccgcc 2940 caucauccug ggaugacuac acauggcaau ccucuucaaa cccuuccauc uucuacaugu 3000 auggaaaugc accuccacgg augucaauuc cuuacguagg gauugccaau gccuauucac 3060 acuucuacga uggcuuugca cgggugccac uugaggguga gaacaccgau gcuggcgaca 3120 cguuuuacgg uuuagugucc auaaaugauu uuggaguuuu agcaguuaga gcaguaaacc 3180 gcaguaaucc acauacaaua cacacaucug ugagagugua caugaaacca aaacacauuc 3240 gguguuggug ccccagaccu ccucgagcug uauuauacag gggagaggga guggacauga 3300 uauccagugc aauucuaccu cugaccaagg uagacucaau uaccacuuuu ggguuugguc 3360 aucagaacaa agcaguguac guugccgguu acaagauuug caacuaccac cuagcaaccc 3420 caagugauca cuugaaugca auuaguaugu uaugggacag ggauuuaaug gugguggaau 3480 cuagagccca gggaacugau accaucgcca gauguaguug caggugugga guuuacuauu 3540 gugaaucuag gaggaaguac uacccuguca cuuuuacugg cccaacguuu cgauucaugg 3600 aagcaaacga cuacuaucca gcaagauacc agucucacau gcugauaggg ugcggauuug 3660 cagaacccgg ggacugcggu gggauacuga ggugcacuca ugggguaauu gguaucauua 3720 cugcaggagg ugaaggggua guagccuuug cugacauuag agaccucugg guguaugaag 3780 aggaggccau ggaacaggga auaacaagcu acaucgaauc ucucggcaca gccuuuggcg 3840 caggguucac ccacacaauc agugagaaag ugacugaauu gacaacaaug guuaccagca 3900 cuaucacaga aaaacuacug aaaaacuugg ugaaaauagu gucggcucua gugauuguug 3960 ugagaaauua ugaggacacu accacgaucc uugcaacacu agcacuacuc gggugugaua 4020 uaucuccuug gcaaugguug aagaagaagg caugugacuu acuagagauu ccuuauguga 4080 ugcgccaagg ugaugggugg augaagaaau ucacagaggc gugcaaugca gcuaaaggcu 4140 uagaguggau uagcaacaaa auuuccaagu uuauagauug guugaagugu aaaauuaucc 4200 cagacgcuaa ggacaaggug gaauuucuca ccaaguugaa acagcuagac auguuggaaa 4260 aucaaauugc aaccauccac caaucuugcc ccagccaaga acaacaagag auucuuuuca 4320 acaaugugag auggcuagca guccaguccc gucgguuugc accauuauac gcuguggagg 4380 cacgccgaau uaacaaaaug gagagcacaa uaaacaauua uauacaguuc aagagcaaac 4440 accguauuga accaguaugu augcucauuc augggucacc agggacgggu aaaucuauag 4500 cuacuucauu aauagguaga gcaauagcag agaaggaaag cacaucaguc uauucaaugc 4560 caccugaccc aucucacuuu gauggcuaua aacaacaagg gguagugauu auggacgacc 4620 uaaaccaaaa ccccgauggu auggacauga aacuguuuug ccaaauggua ucaacagugg 4680 aguuuauucc uccaauggcc ucauuagagg agaagggcau uuuguuuaca ucugauuaug 4740 uccuggcuuc uaccaacucu cauucaauug uaccacccac aguggcucac agugaugccu 4800 uaaccagacg auuugcauuu gauguggagg uuuacacgau gucugaacau ucagucaaag 4860 gcaaacugaa uauggccacg gccacucaau uguguaagga uuguccaaca ccugcaaauu 4920 uuaaaaagug uugcccucuc guuuguggaa aggccuugca auuaauggac agguacacca 4980 gacaaagguu cacuguagau gagauuacca cauuaaucau gaaugagaaa aacagaaggg 5040 ccaauaucgg caauugcaug gaagccuugu uucaaggacc auuaagguau aaagauuuga 5100 agaucgaugu gaagacaguu ccccccccug agugcaucag ugauuuguua caagcagugg 5160 auucucaaga gguuagggau uacugugaga agaaaggcug gaucguuaac guuacuagcc 5220 agauucaacu agaaaggaac aucaauaggg ccaugacuau acuccaagcu guuaccacau 5280 ucgcagcagu cgcaggagua guguauguaa uguacaaacu cuucgccggu caacagggug 5340 cauacacugg cuugccaaac aaaaaaccca augucccuac uaucagaguc gcuaaagucc 5400 aggggccagg auuugacuac gcaguggcaa uggcaaaaag aaacauaguu acugcaacca 5460 ccaccaaggg ugaauuuacc augcuagggg ugcaugauaa uguagcaaua uugccaaccc 5520 augccgcucc aggagaaacc auuauuauug augggaaaga aguagagauc cuagaugcca 5580 gagccuuaga agaucaagcg ggaaccaauc uugagaucac cauuauuacu cuaaaaagaa 5640 augagaaguu uagagacauc agaucacaua uucccaccca aauuacugaa acuaacgaug 5700 gaguguugau cgugaacacu agcaaguacc ccaauaugua uguccccguu ggugcuguga 5760 ccgaacaggg auaucuuaau cucaguggac gucaaacugc ucgcacuuua auguacaacu 5820 uuccaacaag ggcaggccag ugcggaggaa ucaucacuug uacuggcaaa gucauuggga 5880 ugcauguugg cgggaacggu ucacaugggu uugcagcagc ccucaagcga ucauacuuca 5940 cucaaaauca gggcgaaauc caguggauga ggucaucaaa agaagugggg uaccccauua 6000 uaaaugcccc auccaagaca aaguuagaac ccagugcuuu ccacuauguu uuugaaggug 6060 uuaaggaacc agcuguacuc acuaagaaug accccagacu aaaaacagau uuugaagaag 6120 ccaucuuuuc uaaauaugug gggaacaaaa uuacugaagu ggacgaguac augaaagaag 6180 caguggauca cuaugcagga caguuaaugu cacuggauau caacacagaa cagaugugcc 6240 uggaggaugc cauguacggc accgaugguc uugaggcccu ggaucuuagc acuagugcug 6300 gauauccuua uguugcaaug gggaaaaaga aaagagacau ucuaaauaaa cagaccagag 6360 auacuaagga gaugcagaga cuuuuagaua ccuauggaau caaucuacca uuagucacgu 6420 acgugaaaga ugaacucagg ucaaagacua aaguggaaca aggaaaguca agauugauug 6480 aagcuuccag ccuuaaugau ucaguugcaa ugagaauggc cuuuggcaau cuuuacgcag 6540 cuuuccacaa gaauccaggu guggugacag gaucagcagu ugguugugac ccagauuugu 6600 uuuggaguaa gauaccagug cuaauggaag aaaaacucuu cgcuuuugac uacacagggu 6660 augaugccuc acucagcccu gcuugguuug aagcucuuaa aaugguguua gaaaaaauug 6720 gauuuggcag uagaguagac uauauagacu accugaacca cucucaccac cuuuacaaaa 6780 acaagacuua uugugucaaa ggcggcaugc cauccggcug cucuggcacc ucaauuuuca 6840 acucaaugau uaacaaccug aucauuagga cgcuuuuacu gagaaccuac aagggcauag 6900 acuuggacca uuuaaaaaug auugccuaug gugaugacgu gauagcuucc uacccccaug 6960 agguugacgc uagucuccua gcccaaucag gaaaagacua uggacuaacc augacuccag 7020 cagauaaauc aguaaccuuu gaaacaguca caugggagaa uguaacauuu cugaaaagau 7080 uuuucagagc agaugagaag uauccauucc uggugcaucc agugaugcca augaaagaaa 7140 uucacgaauc aaucagaugg accaaggacc cuagaaacac acaggaucac guacgcucgu 7200 ugugccuauu agcuuggcac aacggugaag aagaauacaa uaaauuuuua gcuaaaauca 7260 gaagugugcc aauuggaaga gcuuuauugc ucccagagua cucuacauug uaccgccgau 7320 ggcucgacuc auuuuaguaa cccuaccuca gucggauugg auuggguuac acuguuguag 7380 ggguaaauuu uucuuuaauu cggag 7405 <210> 2 <211> 298 <212> PRT <213> Coxsackievirus A 21 <400> 2 Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Arg Val 1 5 10 15 Ser Gln Pro Pro Ser Thr Gln Ser Thr Glu Ala Thr Ser Gly Val Asn 20 25 30 Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu Thr Gly Ala Ser Gly 35 40 45 Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Val Glu Thr Arg His Val Val Asn Tyr 50 55 60 Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe Phe Gly Arg Ala Ala 65 70 75 80 Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser Lys Ser Gly Glu Glu 85 90 95 Lys Lys His Phe Asn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Thr Val Gln 100 105 110 Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser Arg Phe Asp Leu Glu 115 120 125 Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser Thr Ala Ser Gly Glu 130 135 140 Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile Pro Pro Gly Ala Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln Ser Ser Ser Asn Pro 165 170 175 Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro Arg Met Ser Ile Pro 180 185 190 Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser His Phe Tyr Asp Gly Phe Ala 195 200 205 Arg Val Pro Leu Glu Gly Glu Asn Thr Asp Ala Gly Asp Thr Phe Tyr 210 215 220 Gly Leu Val Ser Ile Asn Asp Phe Gly Val Leu Ala Val Arg Ala Val 225 230 235 240 Asn Arg Ser Asn Pro His Thr Ile His Thr Ser Val Arg Val Tyr Met 245 250 255 Lys Pro Lys His Ile Arg Cys Trp Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Val 260 265 270 Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Val Asp Met Ile Ser Ser Ala Ile Leu Pro 275 280 285 Leu Thr Lys Val Asp Ser Ile Thr Thr Phe 290 295 <210> 3 <211> 272 <212> PRT <213> Coxsackievirus A 21 <400> 3 Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Arg Gln Ile 1 5 10 15 Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ala Ile 20 25 30 Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn Asp Ser Glu Ala Asn 35 40 45 Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser Ser Asn Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser Arg Gly Trp Trp Trp 65 70 75 80 Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met Phe Gly Gln Asn Met 85 90 95 Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr Ile His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly Val Phe Leu Ile Pro 115 120 125 Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys Thr Ser Tyr Val Ser 130 135 140 Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly Glu Phe Thr Asn Thr 145 150 155 160 Tyr Asn Pro Leu Asn Thr Asp Ala Ser Glu Gly Arg Lys Phe Ala Ala 165 170 175 Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala Gly Asn Ala Phe Val 180 185 190 Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Ser Ala Thr Ile 195 200 205 Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp Cys Met Ala Lys His 210 215 220 Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala Pro Leu Ala Phe Ala 225 230 235 240 Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val Thr Ile Ala Pro Met 245 250 255 Cys Thr Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr Val Pro Val His Gln 260 265 270 <210> 4 <211> 240 <212> PRT <213> Coxsackievirus A 21 <400> 4 Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn Gln Phe Leu Thr Ser 1 5 10 15 Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn Phe Asp Val Thr Pro 20 25 30 Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met Met Glu Leu Ala Glu 35 40 45 Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp Gly Lys Val Asn Thr 50 55 60 Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn Leu Ser Lys Ala Pro 65 70 75 80 Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp Lys Arg Leu Ser Arg 85 90 95 Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr His Trp Thr Gly Ser 100 105 110 Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met Met Ala Thr Gly Lys 115 120 125 Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys Pro Pro Thr Asn Arg 130 135 140 Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp Asp Leu Gly Leu Gln 145 150 155 160 Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser Asn Thr Val Tyr Arg 165 170 175 Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly Phe Ile Thr Cys Phe 180 185 190 Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr Pro Thr Ser Met Phe 195 200 205 Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe Ser Val Arg Leu Leu 210 215 220 Arg Asp Thr Pro His Ile Ser Gln Ser Lys Leu Ile Gly Arg Thr Gln 225 230 235 240 <210> 5 <211> 69 <212> PRT <213> Coxsackievirus A 21 <400> 5 Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln 1 5 10 15 Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr 20 25 30 Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln 35 40 45 Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr 50 55 60 Ala Pro Ala Leu Asn 65

Claims (50)

1. VP0, VP1, VP2, VP3, VP4 및 CVA21 RNA를 포함하는 정제된 콕사키바이러스 A 21 (CVA21)을 포함하는 조성물이며, 여기서 VP0 대 VP2 비가 약 0.01 미만인 조성물.
2. 제1항에 있어서, VP0 대 VP2 비가 약 0.0005-0.005인 조성물.
3. 제1항에 있어서, VP0 대 VP2 비가 약 0.001-0.003인 조성물.
4. 정제된 CVA21을 포함하는 조성물이며, 여기서 게놈 대 감염가 비가 약 5000 게놈/pfu 미만인 조성물.
5. 제4항에 있어서, 게놈 대 감염가 비가 약 200-2000 게놈/pfu인 조성물.
6. 제4항에 있어서, 게놈 대 감염가 비가 약 200-800 게놈/pfu인 조성물.
7. 정제된 CVA21을 포함하는 조성물이며, 여기서 입자 대 감염가 비가 약 5000 입자/pfu 미만인 조성물.
8. 제7항에 있어서, 입자 대 감염가 비가 약 200-2000 입자/pfu인 조성물.
9. 제7항에 있어서, 입자 대 감염가 비가 약 200-600 입자/pfu인 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 총 VP1+VP2+VP3+VP4 피크 면적/총 피크 면적이 적어도 95%인 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 양이 약 10,000 pg/용량 미만, 용량당 약 5E7 pfu CVA21인 조성물.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 숙주 세포 DNA의 양이 약 0.05-10 pg/용량, 용량당 약 5E7 pfu CVA21인 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 소 혈청 알부민의 양이 약 50,000 pg/용량 미만, 용량당 약 5E7 pfu CVA21인 조성물.
14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 소 혈청 알부민의 양이 약 50-150 pg/용량, 용량당 약 5E7 pfu CVA21인 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CVA21이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 1E5 내지 1E12 TCID₅₀/ml 또는 pfu/ml의 효능을 갖는 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
18. 제17항에서 있어서, 치료당 최대 약 3E8 TCID₅₀ 또는 5E7 pfu의 용량으로 환자에게 종양내 투여되는 것인, 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
19. 제18항에 있어서, 용량이 제약 조성물의 치료당 약 3E7 내지 약 3E8 TCID₅₀ 또는 약 5E6 내지 약 5E7 pfu인 제약 조성물.
20. 제17항에 있어서, 치료당 약 1E9 TCID₅₀ 또는 1.5E8 pfu의 용량인, 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
21. (a) 엔테로바이러스를 로딩 용액을 사용하여 정지상에 결합시키는 단계이며, 여기서 글루타티온이 정지상에 고정화된 것인 단계;
    (b) 정지상으로부터의 엔테로바이러스를 용리 용액으로 용리시키는 단계
    를 포함하는, 엔테로바이러스를 정제하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 단계 (a) 전에, 정지상이 평형화 용액으로 평형화되는 것인 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 단계 (a) 후에 및 단계 (b) 전에 정지상을 하나 이상의 세척 용액으로 세척하는 단계 (i)를 추가로 포함하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 단계 (i)이 평형화 용액 또는 로딩 용액보다 높은 전도도를 갖는 세척 용액을 사용한 제1 세척 단계를 포함하는 것인 방법.
25. 제24항에 있어서, 단계 (i)이 제1 세척 단계에서의 세척 용액보다 낮은 전도도를 갖는 세척 용액을 사용한 제2 세척 단계를 포함하는 것인 방법.
26. 제25항에 있어서, 용리 용액의 전도도가 제2 세척 단계의 세척 용액과 동일한 것인 방법.
27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 용액, 평형화 용액, 하나 이상의 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상이 약 5-10의 pH를 갖는 것인 방법.
28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 용액, 평형화 용액, 하나 이상의 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상이 약 6-9의 pH를 갖는 것인 방법.
29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 용액, 평형화 용액, 하나 이상의 세척 용액 및 용리 용액 중 하나 이상이 계면활성제를 추가로 포함하는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 계면활성제가 PS-80 또는 PS-20인 방법.
31. 제29항에 있어서, 계면활성제가 약 0.001-1% w/v PS-80인 방법.
32. 제29항에 있어서, 계면활성제가 약 0.001-0.1 % w/v PS-80인 방법.
33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 용액 또는 평형화 용액이 약 50-200 mM 1가 염을 포함하는 것인 방법.
34. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 세척 용액이 약 50-500 mM 1가 염을 포함하는 것인 방법.
35. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세척 용액이 약 350-500 mM NaCl 또는 KCl을 포함하고 제2 세척 용액이 약 50-200 mM NaCl 또는 KCl을 포함하는 것인 방법.
36. 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 용액이 약 50-500 mM의 1가 염을 포함하는 것인 방법.
37. 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 용액이 약 50-200 mM의 NaCl 또는 KCl을 포함하는 것인 방법.
38. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 용액이 약 0.1-100 mM 글루타티온을 포함하는 것인 방법.
39. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 용액이 약 0.1-25 mM 글루타티온을 포함하는 것인 방법.
40. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 용액이 약 0.5-5 mM 글루타티온 및 75-150 mM NaCl 또는 KCl을 포함하는 것인 방법.
41. 제21항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 또는 용리 용액이 EDTA, DTT 및 2-메르캅토에탄올 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
42. (a) 엔테로바이러스를 로딩 용액을 사용하여 음이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계,
    (b) 통과액으로부터 엔테로바이러스를 수집하는 단계
    를 포함하는, 엔테로바이러스를 정제하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 로딩 용액이 약 pH 6-9에서 약 50-500 mM 1가 염 농도를 포함하는 것인 방법.
44. 제21항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 성숙 엔테로바이러스가 정제되는 것인 방법.
45. 제21항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로바이러스가 군 B 또는 C 엔테로바이러스인 방법.
46. 제21항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로바이러스가 에코바이러스, 리노바이러스 A, B 또는 C인 방법.
47. 제21항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로바이러스가 에코바이러스 1, 리노바이러스 1B, 리노바이러스 35, 콕사키바이러스 A 13 (CVA13), 콕사키바이러스 A 15 (CVA15), 콕사키바이러스 A 18 (CVA18), 콕사키바이러스 A 20 (CVA20), 또는 콕사키바이러스 A 21 (CVA21)인 방법.
48. 제21항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로바이러스가 CVA1, CVA11, CVA13, CVA15, CVA17, CVA18, CVA19, CVA20a, CVA20b, CVA20c, CVA21, CVA22 또는 CVA24인 방법.
49. 제48항에 있어서, 엔테로바이러스가 CVA21인 방법.
50. 제49항의 방법에 의해 제조된 CVA21의 정제된 조성물.

Images