TW202138556A - 經純化之腸病毒組合物及使用穀胱甘肽親和性層析之純化方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於經純化之腸病毒組合物、其醫藥組合物及用於純化腸病毒之穀胱甘肽親和性層析製程。

Description

經純化之腸病毒組合物及使用穀胱甘肽親和性層析之純化方法

本發明係關於經純化之腸病毒組合物及用於純化腸病毒之穀胱甘肽親和性層析製程。

以電子方式提交之序列表的引用 本申請案之序列表以ASCII格式之序列表形式經由EFS-Web以電子方式提交，文件名為24943WOPCT-SEQLIST-17NOV2020，創建日期為2020年11月17日，大小為17.5 kb。此經由EFS-Web提交之序列表為本說明書之一部分，且以全文引用之方式併入本文中。

小核糖核酸病毒科腸病毒屬為小型、無包膜、單股正義RNA病毒，其含有數種人類病原體，包括脊髓灰白質炎病毒、科沙奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒(echovirus)、編號腸病毒及鼻病毒[1]。除了經充分研究之脊髓灰質炎病毒以外，已湧現針對由非脊髓灰質炎腸病毒引起之疾病，諸如EV-A71 (手足口病)[2]、EV-D68 (呼吸道疾病)及科沙奇病毒A24 (急性出血性結膜炎)[3]之疫苗及治療劑的開發研究。腸病毒亦已經評估以用作溶瘤病毒免疫療法[4]。科沙奇病毒A21 (CVA21)來源於野生型病毒株，由於其選擇性感染及對過度表現細胞表面受體ICAM-1之腫瘤的溶瘤作用，目前正作為多種類型癌症之治療劑在1b/2期臨床試驗中進行評估[5]。

對腸病毒之病毒疫苗及免疫療法的需求不斷增加，可能對習知生產平台提出挑戰。梯度超速離心通常用於富集完整的、含有基因體之衣殼及清除雜質，但由於其低通量及勞力密集方案，可能為純化製程中之潛在瓶頸[6] (圖1A)。如重組腺相關病毒基因療法純化平台所證明，自梯度超速離心向基於層析之方法的轉變可能會提高可擴展性及生產率[7]。尚未展現空(缺少基因體；產物雜質)及完整(含有基因體；目標產物)腸病毒粒子分離之層析技術。仍需要基於層析之梯度超速離心替代方法，其能夠移除空衣殼及污染雜質，以產生經純化之感染性成熟病毒體的組合物。此將使得腸病毒純化製程能夠更適合大規模商業製造。

本發明提供經純化之CVA21組合物，其中基因體與感染性之比值小於約5000基因體/pfu；粒子與感染性之比值小於約5000粒子/pfu；如藉由逆相HPLC或UPLC所量測，VP0與VP2之比值小於約0.01；或如藉由CE-SDS所量測，VP1+VP2+VP3+VP4總峰面積/總峰面積為至少95%。本發明亦提供包含上述經純化之組合物的醫藥組合物。本發明亦提供一種藉由投與本發明之醫藥組合物治療癌症之方法。在另一態樣中，本發明提供穀胱甘肽親和性層析自一或多種雜質純化腸病毒之用途。在一個實施例中，該方法自經感染之宿主細胞培養收穫物中選擇性地捕獲及富集含有基因體之完整成熟腸病毒病毒體，從而移除一或多種雜質，諸如缺少基因體之非感染性腸病毒原衣殼、宿主細胞蛋白(HCP)、宿主細胞DNA (HC-DNA)及培養基相關雜質，諸如牛血清白蛋白(BSA)。本發明亦包含陰離子交換層析自一或多種雜質純化腸病毒之用途。

親和性層析為使用固定於固定相之親和性配體，用於自複雜的雜質溶液中選擇性結合及純化目標蛋白或生物分子的純化方法。穀胱甘肽(GSH)親和性層析由於固定化之穀胱甘肽配體與GST融合蛋白之相互作用而最初開發用於純化加重組穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)標籤之蛋白質[9]，但不適用於未加標籤之生物分子，諸如不含GST或任何類似的蛋白質序列之腸病毒。在本文中，吾等展示GSH親和性層析用於純化完全成熟腸病毒(例如CVA21)病毒體之用途。

經純化之完整成熟CVA21病毒特異性結合至穀胱甘肽樹脂，且可經由競爭性置換或高電導率溶液而用游離還原穀胱甘肽溶離。使用GSH親和性層析程序，在含血清培養基中自澄清的經感染之宿主細胞培養收穫物直接純化CVA21，具有高感染率(~100%)及雜質清除率(＞99.9% BSA及HCP減少)。出乎意料的是，發現成熟CVA21病毒體在穀胱甘肽層析溶離物中富集，而空CVA21原衣殼在裝載步驟期間流過。在較低pH值下以結合及溶離模式操作之額外陽離子交換層析步驟亦可進一步清除空原衣殼及殘餘雜質。

定義 為了使本發明更容易理解，下面特定地定義某些技術及科學術語。除非在本文件中其他地方特定地定義，否則本文所用之所有其他技術及科學術語均具有一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義。

除非上下文另外明確規定，否則如本文(包括隨附申請專利範圍)所用，諸如「一(a/an)」及「該」之詞語的單數形式包括其相應的複數個提及物。

術語「約」在修飾數量(例如mM或M)、效力(基因體/pfu、粒子/pfu)、純度(ng/ml)、物質或組合物之比率、溶液之pH值或表徵方法中之步驟的參數值或其類似物時，係指可能發生之數量變化，例如經由物質或組合物之製備、表徵及/或使用中涉及的典型量測、處理及取樣程序；經由此等程序中之儀器誤差；經由用於製造或使用組合物或執行程序之成分的製造、來源或純度的差異；及其類似物。在某些實施例中，「約」可意謂±0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%或10%之變化。

如本文所用，「x% (w/v)」等同於x g/100 ml (例如，5% w/v等於50 mg/ml)。

「CVA21」係指科沙奇病毒A 21。熟習此項技術者應理解，病毒在培養、繼代或繁殖時可能發生突變。CVA21可含有此等突變。CVA21之實例包括但不限於具有或不具有突變(例如，SEQ ID NO: 1或位置7274為C及/或位置7370為U之SEQ ID NO: 1)的Kuykendall病毒株(GenBank寄存編號AF546702及AF465515)及Coe病毒株(Lennette等人 Am J Hyg. 1958年11月;68(3):272-87.)。CVA21可為無此等突變或具有此等突變中之一或多者的同質或異質群體。

當提及腸病毒之屬或種時，熟習此項技術者應理解，病毒在培養、繼代或繁殖時可能發生突變。腸病毒可含有此等突變。特定腸病毒之實例包括但不限於GenBank或UnitPro資料庫中列出之具有或不具有突變的腸病毒。腸病毒可為無此等突變或具有此等突變中之一或多者的同質或異質群體。

「基因體與感染性之比」係指藉由基因體RT-qPCR分析所量測之CVA21 RNA基因體(基因體/ml)除以藉由空斑分析所量測之感染性(pfu/ml)。病毒空斑分析確定病毒樣本中空斑形成單位(pfu)之數目。熟習此項技術者可開發各種空斑分析來確定CVA21感染細胞株後之感染性(pfu/ml)。在一個實施例中，細胞株為SK-MEL-28細胞株(ATTC寄存編號HTB-72)。實例6中提供空斑分析之一個實例。基因體RT-qPCR分析使用RT-qPCR方法以靶向CVA21病毒蛋白基因之引子及探針量測每毫升之基因體複本(例如實例6)。

「粒子與感染性之比」係指藉由HPSEC分析所量測之CVA21 RNA基因體(粒子/ml)除以藉由空斑分析所量測之感染性(pfu/ml)。病毒空斑分析確定病毒樣本中空斑形成單位(pfu)之數目。熟習此項技術者可開發各種空斑分析來確定CVA21感染細胞株後之感染性(pfu/ml)。在一個實施例中，細胞株為SK-MEL-28細胞株(ATTC寄存編號HTB-72)。實例6中提供空斑分析之一個實例。病毒HPSEC分析確定CVA21之粒子濃度(粒子/ml)。實例6中提供此分析之一個實例。

「VP0與VP2之比」係指藉由逆相HPLC或UPLC方法所測定之CVA21 VP0蛋白與VP2蛋白的峰面積之比。實例6中描述該方法之一個實例。

「固定相」意謂一或多個穀胱甘肽配體可固定至的任何表面。固定相可為懸浮液、純化管柱、離散粒子之不連續相、盤、感測器、晶片、膠囊、濾筒、樹脂、珠粒、單片、凝膠、膜或過濾器等。形成固定相之材料的實例包括機械穩定的基質，諸如多孔或無孔珠粒、無機材料(例如多孔二氧化矽、可控孔度玻璃(CPG)及羥基磷灰石)、合成有機聚合物(例如聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯醯胺、陶瓷粒子及以上任一者之衍生物)及多醣(例如纖維素、瓊脂糖及葡聚糖)。參見Jansson, J. C.; Rydén, L.Protein Purification ; Wiley: New York, 1998。

將腸病毒「結合」至固定相意謂在適當條件(pH及/或電導率)下將相關腸病毒暴露於固定相，以便藉由腸病毒與固定在固定相上之穀胱甘肽之間的相互作用使腸病毒與固定相可逆地締合。

術語「平衡溶液」係指在將腸病毒裝載於固定相之前使固定相平衡的溶液。平衡溶液可包含鹽及緩衝劑中之一或多者，以及視情況存在之界面活性劑。在一個實施例中，平衡溶液與包含腸病毒之裝載溶液的條件相同。

術語「裝載溶液」為用於將包含相關腸病毒及一或多種雜質之組合物裝載於固定相上的溶液。裝載溶液可視情況進一步包含緩衝劑、鹽及界面活性劑中之一或多者。

當在本文中使用時，術語「洗滌溶液」係指在溶離相關腸病毒之前，用於洗滌或再平衡固定相的溶液。對於洗滌，洗滌溶液之電導率及/或pH值使得雜質(諸如空腸病毒原衣殼、BSA或HCP等)自固定相中移除。對於再平衡，洗滌溶液及溶離溶液可為相同的，但此並非必需的。洗滌溶液可包含鹽及緩衝劑中之一或多者，以及視情況存在之界面活性劑及/或還原劑(諸如PS-80及/或DTT)。

「溶離溶液」為用於自固定相中溶離相關腸病毒之溶液。溶離溶液可包含鹽、緩衝劑及游離還原穀胱甘肽中之一或多者、視情況存在之界面活性劑及/或還原劑(諸如DTT)。溶離溶液之游離還原穀胱甘肽(GSH)、鹽、緩衝劑中之一或多者的存在使得相關腸病毒自固定相中溶離。

「洗提溶液」為用於在再生管柱以供再次使用之前自固定相中解離強結合之組分的溶液。洗提溶液具有自固定相中移除基本上所有雜質及腸病毒所需的電導率及/或pH值。洗提溶液可包含鹽、緩衝液及GSH中之一或多者，以及視情況存在之界面活性劑及/或還原劑。

術語「電導率」係指水溶液在兩個電極之間傳導電流之能力。在溶液中，電流藉由離子傳輸流動。因此，隨著水溶液中存在之離子量的增加，溶液將具有較高的電導率。電導率之量測單位為mS/cm，且可使用例如GE Healthcare Akta System內銷售之電導率儀來量測。溶液之電導率可藉由改變其中的離子濃度來改變。舉例而言，可改變溶液中緩衝劑之濃度及/或鹽(例如NaCl或KCl)之濃度，以獲得所需電導率。較佳地，修改各種緩衝液之鹽濃度以獲得所需電導率，如下文實例。

「純化」相關腸病毒或「經純化之組合物」意謂藉由自組合物中(完全或部分)移除至少一種雜質來提高組合物中腸病毒之純度。雜質可為空原衣殼、BSA、宿主細胞組分(諸如血清、蛋白質或核酸)、細胞碎片、生長培養基等。該術語不意欲指完全不存在此類生物分子，或不存在水、緩衝劑或鹽，或包括腸病毒之醫藥調配物的組分。

如本文所用，「穀胱甘肽固定至固定相」係指穀胱甘肽經由一或多個反應性基團之共軛共價連接至固定相。在一個實施例中，穀胱甘肽固定相為經由穀胱甘肽之硫醇基共軛至固定相的穀胱甘肽。

「界面活性劑」為本質上具有兩親性之表面活性劑。

「成熟病毒體」、「完全成熟病毒體」、「完全成熟病毒」或「完全成熟病毒粒子」、「完全成熟腸病毒」、「成熟腸病毒」、「成熟病毒粒子」係指如圖2所述之成熟腸病毒病毒體[(VP4-VP2-VP3-VP1)₅ ]₁₂ +RNA。CVA21 VP1-VP4序列之實例描述於表11中。

根據圖2，「空衣殼」係指原衣殼[(VP0-VP3-VP1)₅ ]₁₂ 或降解的A粒子[(VP2-VP3-VP1)₅ ]₁₂ 。CVA21之VP0序列的一個實例在UnitPro資料庫寄存編號P22055中。

「完整衣殼」係指成熟病毒體或原病毒體[(VP0-VP3-VP1)₅ ]₁₂ + RNA，如圖2所述。

「VP1+VP2+VP3+VP4總峰面積/總峰面積」為CVA21之VP1、VP2、VP3及VP4病毒蛋白之峰面積之和除以毛細管電泳(CE)-SDS電泳圖中之總峰面積(偵測極限以上所有可定量峰之峰面積)。CE-SDS方法之一個實例在實例6中。

「雜質」係指與所需腸病毒不同的材料。雜質可為血清(亦即BSA)、宿主細胞蛋白(HCP)、宿主細胞DNA (HC-DNA)、非感染性病毒相關粒子，包括含有VP0之腸病毒(原聚體、五聚體、原病毒體、原衣殼)、含有VP2之腸病毒(A粒子或降解的A粒子)。在一個實施例中，所需腸病毒為完全成熟腸病毒(例如完全成熟CVA21)。

「TCID₅₀ /ml」(組織培養物感染劑量50%/mL)係指由接種物感染50%目標培養物時之稀釋度確定的接種物中感染性生物體的濃度。實例6中提供CVA21之TCID₅₀ 分析的一個實例。

如本文所用，「治療(Treat/treating)」癌症意謂向患有癌症或經診斷患有癌症之個體投與本發明之醫藥組合物，以實現至少一種積極的治療效果，諸如減少癌細胞之數目、減小腫瘤尺寸、降低癌細胞浸潤至外周器官中之速率或降低腫瘤轉移或腫瘤生長之速率。可以多種方式量測癌症中之積極治療效果(參見W. A. Weber,J. Nucl. Med. 50:1S-10S (2009))。

如本文所用，「每次治療」係指在單日向患者投與本發明之醫藥組合物。醫藥組合物可每日、間歇性地投與(一週數天、一週一次、每兩週一次、每三週一次等)。

CVA21之組合物及醫藥組合物 本發明亦提供經純化之CVA21組合物及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。CVA21可為包含以下中之一或多者的混合物：完全成熟CVA21病毒體[(VP4-VP2-VP3-VP1)₅ ]₁₂ +RNA、空原衣殼[(VP0-VP3-VP1)₅ ]₁₂ 、降解的A粒子[(VP2-VP3-VP1)₅ ]₁₂ 、A粒子[(VP2-VP3-VP1)₅ ]₁₂ +RNA、原病毒體[(VP0-VP3-VP1)₅ ]₁₂ + RNA、原聚體(VP0-VP3-VP1)₁ 及五聚體(VP0-VP3-VP1)₅ 。在一個實施例中，CVA21包含完全成熟CVA21病毒體[(VP4-VP2-VP3-VP1)₅ ]₁₂ +RNA。在一個實施例中，CVA21包含完全成熟CVA21病毒體[(VP4-VP2-VP3-VP1)₅ ]₁₂ +RNA及空原衣殼[(VP0-VP3-VP1)₅ ]₁₂ 。

在一個實施例中，組合物之基因體與感染性之比值小於約5000基因體/pfu。在一個實施例中，組合物之基因體與感染性之比值小於約4000基因體/pfu。在一個實施例中，組合物之基因體與感染性之比值小於約3000基因體/pfu。在一個實施例中，組合物之基因體與感染性之比值小於約2000基因體/pfu。在一個實施例中，組合物之基因體與感染性之比值小於約1000基因體/pfu。在一個實施例中，基因體與感染性之比值為約200-2000基因體/pfu。在一個實施例中，組合物之基因體與感染性之比值小於約800基因體/pfu。在一個實施例中，基因體與感染性之比值為約400-700基因體/pfu。在另一個實施例中，基因體與感染性之比值為約400-800基因體/pfu。本發明亦提供CVA21之組合物，其中粒子與感染性之比值小於約5000粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約4000粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約3000粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約2000粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約1000粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約900粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約800粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約700粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約600粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值小於約500粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值為約200-600粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值為約200-500粒子/pfu。在一個實施例中，粒子與感染性之比值為約200-800粒子/pfu。

本發明提供經純化之CVA21的醫藥組合物，其中VP0與VP2之比值小於約0.01。在一個實施例中，VP0與VP2之比值為約0.0005-0.01。在一個實施例中，VP0與VP2之比值為約0.0005-0.005。在另一個實施例中，VP0與VP2之比值為約0.001-0.003。在另一個實施例中，VP1+VP2+VP3+VP4總峰面積/總峰面積為至少95%。在一個實施例中，宿主細胞DNA小於約10 ng/ml。在另一個實施例中，宿主細胞DNA小於約0.5 ng/ml。在另一個實施例中，組合物中宿主細胞DNA之量小於約10,000 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。在另一個實施例中，組合物中宿主細胞DNA之量為約0.05-10,000 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。在另一個實施例中，組合物中宿主細胞DNA之量為約0.05-10 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。在另一個實施例中，組合物中宿主細胞DNA之量為約0.05-1 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。在另一個實施例中，組合物中宿主細胞DNA之量為約100-10,000 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。在另一個實施例中，組合物中牛血清白蛋白之量小於約10 ng/ml。在一個實施例中，牛血清白蛋白小於約50,000 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。在另一個實施例中，牛血清白蛋白為約500-50,000 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。在另一個實施例中，牛血清白蛋白為約50-100或50-150 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。在另一個實施例中，牛血清白蛋白小於約150 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。

本發明之醫藥學上可接受之賦形劑包括例如溶劑、增積劑、緩衝劑、張力調節劑及防腐劑(參見例如Pramanick等人, Pharma Times, 45:65-77, 2013)。在一些實施例中，醫藥組合物可包含充當溶劑、增積劑、緩衝劑及張力調節劑中之一或多者的賦形劑(例如，生理鹽水中之氯化鈉可充當含水媒劑及張力調節劑)。

在一些實施例中，醫藥組合物包含含水媒劑作為溶劑。適合之媒劑包括例如無菌水、生理鹽水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水及林格氏溶液(Ringer's solution)。在一些實施例中，組合物為等張的。

醫藥組合物可包含增積劑。當醫藥組合物在投與前凍乾時，增積劑特別有用。在一些實施例中，增積劑為有助於在冷凍或噴霧乾燥期間及/或在儲存期間穩定及防止活性劑降解的保護劑。適合之增積劑為糖(單糖、二糖及多糖)，諸如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖及棉子糖。

醫藥組合物可包含緩衝劑。緩衝劑控制pH值，以抑制活性劑在加工、儲存及視情況復原期間的降解。適合之緩衝劑包括例如包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽之鹽。其他適合之緩衝劑包括例如胺基酸，諸如精胺酸、甘胺酸、組胺酸及離胺酸。緩衝劑可進一步包含鹽酸或氫氧化鈉。在一些實施例中，緩衝劑將組合物之pH值維持在4至9之範圍內。在一些實施例中，pH值大於(下限) 4、5、6、7或8。在一些實施例中，pH值小於(上限) 9、8、7、6或5。亦即，pH值在約4至9之範圍內，其中下限小於上限。

醫藥組合物可包含張力調節劑。適合之張力調節劑包括例如右旋糖、丙三醇、氯化鈉、甘油及甘露糖醇。

醫藥組合物可包含防腐劑。適合之防腐劑包括例如抗氧化劑及抗微生物劑。然而，在較佳實施例中，醫藥組合物係在無菌條件下製備且在一次性容器中，因此不需要包含防腐劑。

在一個態樣中，醫藥組合物係用於瘤內投與。在另一個實施例中，醫藥組合物係用於膀胱內投與。在一個實施例中，每次治療之劑量為至多約3E8 TCID₅₀ 或約5E7 pfu，視腫瘤之大小、位置及數目而定。在另一個實施例中，每次治療之劑量為約3E7至3E8 TCID₅₀ 或約5E6至5E7 pfu。增加或最大限度地增加病毒在整個腫瘤中之分佈的注射技術可提供改進的治療效果。舉例而言，在黑素瘤及其他實體腫瘤之治療中，可以劑量超分割模式注射多個病灶，自最大的病灶開始(2.0 mL注射至＞2.5 cm之腫瘤中，1.0 mL注射至1.5至2.5 cm中；0.5 mL注射至0.5至1.5 cm中)至最大4.0 mL。在初次注射CVA21後，任何直徑減小至＜0.5 cm之注射病灶可按照治療時程注射0.1 mL CVA21，直至病灶完全消失。在另一個實施例中，醫藥組合物係用於靜脈內投與。在一個實施例中，每次治療之劑量為約1E9 TCID₅₀ 或約1.5E8 pfu。

在另一態樣中，醫藥組合物之效力為約1E5至1E12 TCID₅₀ /ml或pfu/ml。在一個實施例中，醫藥組合物之效力為約1E6至1E12 TCID₅₀ /ml或pfu/ml。在一個實施例中，醫藥組合物之效力為約1E7至1E11 TCID₅₀ /ml或pfu/ml。在一個實施例中，醫藥組合物之效力為約1E7至8E7 TCID₅₀ /ml。在一個實施例中，醫藥組合物之效力為約5E7至8E7 TCID₅₀ /ml。在一個實施例中，醫藥組合物之效力為約7.5E7 TCID₅₀ /ml。CVA21病毒TCID50分析揭示於WO 2015/127501及實例6中。在另一態樣中，醫藥組合物之效力為5E6至5E7 pfu/ml。在另一態樣中，醫藥組合物之效力濃度為1E7至3E7 pfu/ml。在另一態樣中，醫藥組合物之效力濃度為1.1E7 pfu/ml。效力可藉由實例6中之空斑分析來量測。

治療癌症之方法 在另一態樣中，本發明提供一種治療患者之癌症的方法，其包含向患者投與本發明之醫藥組合物。在一個實施例中，醫藥組合物係瘤內投與。在另一個實施例中，醫藥組合物係膀胱內投與。在一個實施例中，每次治療之劑量為至多約3E8 TCID₅₀ 或約5E7 pfu。在一個實施例中，每次治療之劑量為至多約3E7 TCID₅₀ 或約5E6 pfu。在一個實施例中，每次治療之劑量為至多約1E8 TCID₅₀ 或約1.5E7 pfu。在另一個實施例中，醫藥組合物係靜脈內投與。在一個實施例中，每次治療之劑量為1E9 TCID₅₀ 或約1.5E8 pfu。在另一個實施例中，醫藥組合物係在間歇日投與。

可藉由本發明之醫藥組合物治療之癌症包括但不限於：心臟癌：肉瘤(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤)、黏液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤及畸胎瘤；肺癌：支氣管癌(鱗狀細胞、未分化的小細胞、未分化的大細胞、腺癌)、肺泡(細支氣管)癌、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨瘤錯構瘤、間皮瘤；胃腸道癌：食道(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰臟(導管腺癌、胰島素瘤、升糖素瘤、胃泌素瘤、類癌、血管活性腸肽瘤)、小腸(腺癌、淋巴瘤、類癌、卡波西氏肉瘤(Karposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)、大腸(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)結腸直腸；泌尿生殖道癌：腎臟(腺癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor) (腎母細胞瘤)、淋巴瘤、白血病)、膀胱及尿道(鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睪丸(精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質細胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣腫瘤、脂肪瘤)；肝癌：肝癌(肝細胞癌)、膽管癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤、血管瘤；骨癌：成骨性肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨外生骨疣)、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液性纖維瘤、骨樣骨瘤及巨細胞腫瘤；神經系統癌：顱骨(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃瘤、變形性骨炎)、腦膜(腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經膠質瘤病)、腦(星形細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、胚細胞瘤(松果體瘤)、多形神經膠母細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天性腫瘤)、脊髓神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)；婦科癌症：子宮(子宮內膜癌)、子宮頸(子宮頸癌、腫瘤前子宮頸發育不良)、卵巢(卵巢癌(漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、未分類癌)、粒層泡膜細胞瘤、塞特利氏-萊迪希氏細胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)、外陰(鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑素瘤)、陰道(透明細胞癌、鱗狀細胞癌、葡萄樣肉瘤(胚胎性橫紋肌肉瘤)、輸卵管(癌)、乳房；血液癌：血液(骨髓性白血病(急性及慢性)、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、骨髓增生性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群)；淋巴系造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、骨髓瘤及伯基特氏淋巴瘤(Burkett's lymphoma)；骨髓系造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群及前髓細胞性白血病；間葉細胞來源之腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；中樞及周邊神經系統之腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；及其他腫瘤，包括黑素瘤、皮膚(非黑素瘤)癌、間皮瘤(細胞)、精原細胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、甲狀腺濾泡癌及卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)。在一個實施例中，前述癌症為晚期、不可切除或轉移性的。

在一個實施例中，可藉由本發明之醫藥組合物治療之癌症包括但不限於：非小細胞肺癌、膀胱癌、黑素瘤、三陰性乳癌、肝細胞癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞癌及皮膚鱗狀細胞癌。

穀胱甘肽親和性層析 本發明提供一種使用穀胱甘肽親和性層析純化腸病毒之可擴展且穩健的方法(圖1B)。在一個實施例中，穀胱甘肽親和性層析固定相包含固定至固定相表面的穀胱甘肽(GSH)。穀胱甘肽(亦稱為L-穀胱甘肽、還原型穀胱甘肽或GSH)為人類細胞中具有生物活性之三肽(麩胺酸-半胱胺酸-甘胺酸)，用於控制氧化還原電位且參與許多細胞功能[8]。GSH具有以下化學結構及名稱：

(2S)-2-胺基-5-[[(2R)-1-(羧甲基胺基)-1-側氧基-3-硫基丙-2-基]胺基]-5-側氧基戊酸。

穀胱甘肽可經由使用馬來醯亞胺、鹵乙醯基、吡啶基二硫化物、環氧基或其他類似的基於巰基反應性之化學物質之SH基團的共軛而固定至固定相。參見Stenzel MH,ACS Macro Letters , 2, 14-18 (2013)。GSH樹脂亦經由數個供應商(Cytiva、Thermo、Qiagen、Sigma)市售。

在批次模式下，固定相在溶液中自由利用。為了以流動模式利用，固定相封裝至管柱、膠囊、濾筒、過濾器或其他支撐件中，且使用約1-500 cm/hr之流動速率。

在一個態樣中，本發明提供一種純化腸病毒之方法，其包含以下步驟： a.使用裝載溶液將腸病毒與固定相結合，其中穀胱甘肽已固定在固定相上； b.用溶離溶液自固定相溶離腸病毒。

在一個實施例中，在步驟(a)之前，用平衡溶液對固定相進行平衡。在一個實施例中，在步驟a)中流出一或多種雜質。

在該方法之另一態樣中，在步驟a)之後但在步驟(b)之前，其進一步包含步驟i)：用一或多種洗滌溶液洗滌固定相。在一個實施例中，從洗滌步驟中排除一或多種雜質。在另一個實施例中，步驟(i)包含用電導率高於平衡溶液或裝載溶液之洗滌溶液進行第一洗滌步驟。在另一個實施例中，步驟(i)包含第二洗滌步驟，其中洗滌溶液之電導率低於第一洗滌步驟中之洗滌溶液。在另一個實施例中，溶離溶液之電導率與第二洗滌步驟中之洗滌溶液相同。

在一個實施例中，裝載溶液、平衡溶液、洗滌溶液或溶離溶液包含鹽，較佳單價金屬離子鹽，諸如NaCl或KCl。在另一個實施例中，裝載溶液或平衡溶液包含約50-200 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，裝載溶液或平衡溶液包含約100 mM NaCl或KCl。

在一個實施例中，洗滌溶液包含約50-400 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，洗滌溶液包含約350-450 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，洗滌溶液包含約400-500 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，洗滌溶液包含約400 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，第一洗滌溶液包含約100-500 mM NaCl或KCl，且第二洗滌溶液包含約50-500 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，第一洗滌溶液包含約350-500 mM NaCl或KCl，且第二洗滌溶液包含約50-150 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，第一洗滌溶液包含約400 mM NaCl或KCl，且第二洗滌溶液包含約75 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，第二洗滌溶液包含約50-150 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，第二洗滌溶液包含約100 mM NaCl或KCl。

溶離步驟可使用具有高離子強度或高電導率、低pH值(例如pH值約5-7)或在游離GSH存在下或其組合之溶液進行。在一個實施例中，溶離溶液包含約0.5-1 M單價鹽，諸如NaCl或KCl。在一個實施例中，溶離溶液包含約0.5 M NaCl或KCl。在一個實施例中，溶離溶液包含約50-500 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，溶離溶液包含約0.1-100 mM穀胱甘肽。在另一個實施例中，溶離溶液包含約0.1-50 mM穀胱甘肽。在另一個實施例中，溶離溶液包含約0.1-25 mM穀胱甘肽。在另一個實施例中，溶離溶液中之穀胱甘肽為約1 mM。在一個實施例中，溶離溶液包含約0.5-5 mM穀胱甘肽及約75-150 mM NaCl或KCl。在一個實施例中，溶離溶液包含約0.5-25 mM穀胱甘肽及約50-500 mM NaCl或KCl。在另一個實施例中，溶離溶液包含約0.1-100 mM穀胱甘肽及約75-150 mM NaCl，及視情況存在之約0.001-1% w/v PS-80。在另一個實施例中，溶離溶液包含約100 mM NaCl、約1 mM穀胱甘肽及約0.005% w/v PS80。

在一個實施例中，裝載溶液、平衡溶液、洗滌溶液及溶離溶液中之一或多者之pH值為約6.5-8.5。在另一個實施例中，裝載溶液、平衡溶液、洗滌溶液及溶離溶液中之一或多者之pH值為約7-8。在另一個實施例中，裝載溶液、平衡溶液、洗滌溶液及溶離溶液中之一或多者之pH值為約8。在另一個實施例中，裝載溶液、平衡溶液、洗滌溶液及溶離溶液中之一或多者之pH值為約6-9。在另一個實施例中，裝載溶液、平衡溶液、洗滌溶液及溶離溶液中之一或多者之pH值為約5-10。

在一個實施例中，裝載溶液、平衡溶液、洗滌溶液及溶離溶液中之一或多者進一步包含界面活性劑。在另一個實施例中，界面活性劑為PS-80或PS-20。在另一個實施例中，界面活性劑為約0.001-1% w/v PS-80。在另一個實施例中，界面活性劑為約0.001-0.1% w/v PS-80。在另一個實施例中，界面活性劑為約0.005 % w/v PS-80。在一個實施例中，裝載溶液、洗滌溶液及溶離溶液中之一或多者進一步包含EDTA或還原劑，諸如DTT或β-巰基乙醇。在另一個實施例中，還原劑為DTT。在另一個實施例中，DTT為約0.1-10 mM。在另一個實施例中，DTT為約0.1-5 mM。在另一個實施例中，DTT為約1 mM。

在一個實施例中，所需腸病毒為完全成熟腸病毒。在一個實施例中，所需腸病毒為完全成熟CVA21。在一個實施例中，至少完全成熟腸病毒在裝載溶液後與固定相結合。在一個實施例中，純化製程經由流過或洗滌步驟移除一或多種雜質，諸如血清(亦即BSA)、HCP、HC-DNA、非感染性病毒相關粒子，包括但不限於含有VP0之腸病毒(原聚體、五聚體、原病毒體、原衣殼)、含有VP2之腸病毒(A粒子或來自降解的A粒子的空衣殼)。在另一個實施例中，純化製程移除腸病毒原衣殼(例如CVA21原衣殼)。在另一個實施例中，純化製程產生包含高純度(＞99%純)完全成熟腸病毒(例如完全成熟CVA21病毒體)之組合物。

本發明之方法可與其他層析或純化步驟結合使用以移除雜質。在一個實施例中，純化製程經由流過或洗滌步驟移除一或多種細胞培養物雜質，諸如血清(亦即BSA)、HCP或HC-DNA。在另一個實施例中，純化製程經由流過或洗滌步驟移除一或多種雜質，諸如原聚體、五聚體、原病毒體、原衣殼、A粒子及降解的A粒子。

在一個實施例中，本發明之方法由以下步驟構成：a)將包含腸病毒之細胞培養基裝載至固定相，較佳裝載1-1000 L收穫培養基/L固定相，其中細胞培養基雜質及/或空原衣殼經由流過而純化，b)用洗滌溶液洗滌固定相以移除殘餘雜質，c)用包含較佳約0.1-50 mM還原型穀胱甘肽之溶離溶液自固定相溶離腸病毒，緩衝液體積較佳為管柱或膜體積之2-20倍。該方法可視情況包含額外步驟d)用洗提溶液洗提固定相，該洗提溶液自固定相中移除強結合之雜質，及e)再生固定相。在一個實施例中，洗提溶液包含約1-50或5-50 mM GSH。在另一個實施例中，洗提溶液包含約10 mM GSH。在一個實施例中，洗提溶液包含約500-1500或1000-2000 mM NaCl。

腸病毒 任何適合之腸病毒來源均可用於本發明之方法中[1]。腸病毒粒子可為脊髓灰質炎病毒、A型科沙奇病毒、B型科沙奇病毒、埃可病毒、鼻病毒及編號腸病毒。在一個實施例中，腸病毒為A型、B型或C型腸病毒。在一個實施例中，腸病毒為C型腸病毒。在一個實施例中，腸病毒為A型或B型科沙奇病毒。在另一個實施例中，腸病毒為A型科沙奇病毒。在一個實施例中，C型腸病毒為選自由以下型成之群的A型科沙奇病毒：CVA1、CVA11、CVA13、CVA15、CVA17、CVA18、CVA19、CVA20a、CVA20b、CVA20c、CVA21、CVA22及CVA24。在一個實施例中，A型科沙奇病毒係選自由CVA13、CVA15、CVA18、CVA20、CVA21及CVA24組成之群。此等病毒之各種適合之病毒株可自美國菌種保存中心(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209 USA獲得，諸如根據布達佩斯條約在下面提供之日期寄存的材料，且可根據布達佩斯條約之條款獲得：A型科沙奇病毒，病毒株CVA13，ATCC號：PTA-8854，2007年12月10日寄存；A型科沙奇病毒，病毒株CVA15 (G9)，ATCC號：PTA-8616，2007年8月15日寄存；A型科沙奇病毒，病毒株CVA18，ATCC號：PTA-8853，2007年12月20日寄存；及A型科沙奇病毒，病毒株CVA21 (Kuykendall)，ATCC號：PTA-8852，2007年12月20日寄存。文獻中提及之C型腸病毒下的其他A型科沙奇病毒包括但不限於CVA1 (GenBank寄存編號AF499635，Dalldorf等人, 1949)、CVA11 (GenBank寄存編號AF499636)、CVA17 (GenBank寄存編號AF499639)、CVA19 (GenBank寄存編號AF499641)、CVA20 (GenBank寄存編號AF499642)、CVA20a (Sickles等人, 1959)、CVA20b (Sickles等人, 1959)、CVA20c (Abraham及Cheever, 1963)、CVA22 (Sickles等人, 1959；(GenBank寄存編號AF499643)及CVA24 (Mirkovic等人, 1974；(GenBank寄存編號EF026081)。在一較佳實施例中，腸病毒為科沙奇病毒A21。

在另一個實施例中，腸病毒為B型腸病毒。在另一個實施例中，B型腸病毒為埃可病毒。在另一個實施例中，B型腸病毒為埃可病毒-1 (EV-1)。埃可病毒-1之實例包括GenBank寄存編號為AF029859、AF029859.2及AF250874之埃可病毒。

在另一個實施例中，腸病毒為B型科沙奇病毒。在另一個實施例中，B型科沙奇病毒為科沙奇病毒B3 (CVB3)或科沙奇病毒B4 (CVB4)。

在另一個實施例中，腸病毒為鼻病毒A、B或C。在另一個實施例中，腸病毒為鼻病毒A或B。在另一個實施例中，腸病毒為人類鼻病毒14 (HRV14)。在另一個實施例中，腸病毒為人類鼻病毒1B或35。人類鼻病毒1B之一個實例為Genbank寄存編號D00239.1。人類鼻病毒35之一個實例為Genbank寄存編號EU870473。目前對腸病毒形態發生及穀胱甘肽在衣殼組裝中之作用的理解總結詳見圖2。此外，具有轉殖基因插入之經基因修飾之腸病毒及不活化腸病毒均可用於本發明之方法中。

實例 呈現實例以更充分地說明本發明之各種實施例。此等實例決不應解釋為限制隨附申請專利範圍中所敍述之本發明之範疇。

實例1：用GSH親和性層析純化科沙奇病毒A21 所描述之GSH親和性層析程序[圖1B]係使用具有UNICORN系統控制軟體(Cytiva)之Akta Pure 150M FPLC系統(Cytiva)來進行。使用裝填有GSH Sepharose 4 Fast Flow樹脂之Cytiva 20 mL HiPrep管柱進行CVA21之純化。20 mL GSH管柱用5管柱體積(CV)之平衡溶液進行平衡，該平衡溶液含有15 mM Tris、150 mM NaCl、0.005% PS80，pH 7.5，流動速率為150 cm/hr且停留時間為4分鐘。將CVA21澄清的細胞培養收穫物以100 cm/hr之流動速率及6分鐘的停留時間裝載至管柱，直至達到200 CV之管柱裝載量。GSH管柱以150 cm/hr之流動速率用5 CV之洗滌1緩衝液洗滌，該緩衝液含有15 mM Tris、400 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 8.0，且隨後用5 CV之洗滌2緩衝液洗滌，該緩衝液含有15 mM Tris、100 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT，pH 8.0。經由用流動速率為150 cm/hr之移動相中的游離GSH自固定化之穀胱甘肽配體競爭性置換，所結合之CVA21粒子用3 CV之溶離溶液溶離，該溶離溶液含有15 mM Tris、100 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT、1 mM GSH，pH 8.0。GSH管柱用3 CV之緩衝液洗提，該緩衝液含有15 mM Tris、1000 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT、10 mM GSH，pH 8.0，且用0.1 N NaOH、1 M NaCl溶液再生，流動速率為150 cm/hr。在再平衡管柱之後，樹脂可重複使用以裝載額外的收穫物。

在UNICORN軟體中分析之層析圖描繪以mAU為單位之280 nm處之吸光度跡線(A280)及以mS/cm為單位之電導率跡線[圖3]。在澄清的細胞培養收穫物之裝載(GSH FT)過程中，A280信號沒有變化，表明雜質始終如一的流過，且隨著時間推移無法偵測到病毒粒子的穿透。用5 CV之含有400 mM NaCl之洗滌緩衝液(GSH W1)洗滌管柱，以移除弱或非特異性結合之雜質，直至A280達到基線。用洗滌2緩衝液(GSH W2)調理管柱後，用3 CV之含有1 mM游離還原型GSH之緩衝液(GSH Elute)溶離CVA21粒子，且觀察到相應的A280峰。來自澄清的收穫物之GSH溶離物的總體積濃度因數為67倍。用含有10 mM GSH及1 M NaCl之洗提溶液(GSH Strip)洗提管柱，且觀察到一個小峰。

澄清的收穫物及GSH層析溶離樣本藉由中位數組織培養物感染劑量(TCID50)分析法分析病毒感染性，藉由逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)分析法分析總病毒基因體，且藉由使用抗VP1抗體之毛細管電泳定量西方墨點法(Protein Simple)分析總粒子。GSH層析溶離產率係藉由GSH溶離產物中之病毒數量除以裝載的細胞培養收穫物中的病毒數量來計算。感染性及病毒基因體產率為約100%，而總粒子產率接近50% [表1]。此表明完整、成熟、感染性CVA21病毒體與固定化之GSH配體結合且自管柱溶離，回收率極高，同時清除一部分非感染性病毒粒子。 表1

病毒屬性	澄清的收穫物之GSH溶離產率
病毒感染性(TCID50 )	106%
病毒基因體(RT-qPCR)	93%
總病毒粒子(抗VP1西方墨點法)	49%

腸病毒感染之細胞通常會產生感染性成熟病毒體及非感染性病毒相關粒子，包括拆卸的原聚體或五聚體、原病毒體、空原衣殼、A粒子或降解的A粒子[圖2]。典型的經感染之細胞培養收穫物亦可含有宿主細胞相關雜質，包括宿主細胞蛋白及宿主細胞DNA，以及培養基相關雜質，包括牛血清白蛋白(BSA)。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)偵測GSH親和性層析級分中之病毒及雜質蛋白條帶。樣本製備純淨且與4×裝載染料(BioRad)及10×還原劑(BioRad)混合，隨後在70℃下加熱10分鐘以使樣本變性。將20 µL變性樣本添加至10孔12%丙烯醯胺Bis-Tris NuPAGE凝膠(Thermo)中，且使用Invitrogen凝膠盒及電源系統(Thermo)在200V下運作60分鐘。使用Pierce銀染套組(Thermo)對凝膠進行染色，且使用凝膠成像儀(BioRad)成像。

SDS-PAGE分析表明，澄清的收穫物含有高濃度的牛血清及宿主細胞蛋白雜質，該等雜質大部分在樣本裝載期間流過(GSH FT) [圖4]。在第一次洗滌過程中，移除額外的雜質(GSH W1)，且藉由第二次洗滌，僅偵測到微弱的BSA條帶(66.5 kDa) (GSH W2)。在GSH溶離物中可見以下CVA21病毒衣殼蛋白條帶，藉由其預期分子量(UniProt A0A0N9H7H0)所確定：VP1 (33.2 kDa)、VP2 (29.9 kDa)及VP3 (26.6 kDa)。VP4 (7.5 kDa)條帶由於其分子量小而自凝膠底部跑掉。另外，藉由SDS-PAGE可偵測到極微弱的VP0 (37.3 kDa)，表明GSH溶離物含有在基因體衣殼化後經過VP0裂解為VP2及VP4之病毒粒子。因此，SDS-PAGE證明GSH親和性層析選擇性地結合不含VP0之成熟CVA21病毒體，且有效清除雜質。

將經GSH親和性層析純化之病毒與藉由使用氯化銫(CsCl)梯度之習知超速離心(UC)製程純化之病毒進行比較[圖1A]。在UC步驟之前，使用300 kDa PES中空纖維過濾器(Repligen)藉由切向流過濾(TFF)將澄清的細胞培養收穫物濃縮100倍。在超速離心管中使用各種密度的CsCl溶液製備梯度，且將濃縮的細胞培養物溶解液添加至梯度的頂部。將樣本在67,000 g下離心5小時，合併所選的級分且跨越10 kDa膜透析至穩定緩衝溶液中。經由SDS-PAGE分析，在經UC純化之病毒泳道中可偵測到VP0及其他未知的蛋白質條帶[圖4]，表明樣本中存在空原衣殼及其他雜質。

經GSH親和性層析及UC純化之樣本係藉由毛細管電泳定量西方墨點法(Protein Simple)使用2種初級抗體進行分析：與VP1結合之抗VP1多株抗體及與VP4及VP0蛋白結合之抗VP4多株抗體。VP1存在於所有含有原聚體/五聚體次單元之病毒粒子中，且抗VP1峰面積用於估計總病毒粒子。VP0僅存在於空原衣殼、原病毒體及原聚體/五聚體次單元(含有VP0之腸病毒粒子)中，而具有VP4之粒子由基因體衣殼化後VP0裂解成VP2+VP4以形成完整的成熟病毒體而產生[圖2]。因此，使用VP0:VP4峰面積之比來估算含有VP0之腸病毒粒子:完全成熟病毒體之比。相對於UC純化樣本，分析澄清的收穫物及GSH層析FT及溶離物之總病毒粒子及含有VP0之粒子/完全成熟病毒體之比[圖5]。與UC純化樣本相比，在澄清的收穫物中，總粒子少約10倍，而含有VP0之粒子/完全成熟病毒體之相對比高約6倍。在GSH親和性層析裝載步驟期間，病毒粒子存在於GSH FT中，但此等粒子中含有VP0之粒子的含量較高。由於體積減小，GSH溶離物中總粒子相比澄清的收穫物增加約30倍，且VP0:VP4之比降低約60倍。與經UC純化之病毒相比，GSH溶離物之含有VP0之腸病毒粒子:完全成熟病毒體之比降低10倍。此證明GSH親和性層析選擇性地結合含有VP4之完全成熟病毒體粒子，同時流過具有VP0之粒子，且比梯度超速離心法更有效地清除空原衣殼。

進行蔗糖梯度超速離心以確認經純化之GSH溶離樣本中僅存在完全成熟病毒體粒子。將1 mL GSH溶離樣本裝載於15-42% w/v連續蔗糖梯度之頂部，且在230,000 g下離心100分鐘。取12×1 mL級分，且藉由使用銀染之SDS-PAGE及使用抗VP1初級抗體之毛細管電泳定量西方墨點法進行分析。預期級分5-8含有空衣殼，而預期級分9-12含有完整衣殼。如SDS-PAGE凝膠中所示，在級分10-11中偵測到病毒蛋白VP1、VP2、VP3且無VP0，而在泳道5-8中未偵測到條帶[圖6A]。此表明GSH溶離物僅含有完全成熟病毒體，而沒有原病毒體或空衣殼。藉由VP1量測之各級分中總病毒粒子的分佈表明，GSH溶離樣本含有大於99%之完全成熟病毒體[圖6B]。

除了移除空原衣殼及其他病毒雜質以外，GSH親和性層析有效清除血清及宿主細胞雜質。BSA為細胞培養基中使用之牛血清的主要成分。在典型的具有血清之細胞培養基中，BSA濃度為約0.5-1.0 mg/mL，需要顯著降低以符合每劑量＜50 ng BSA之典型目標。GSH層析級分藉由毛細管電泳定量西方墨點法(Protein Simple)分析，且使用公開的程序[16]藉由抗BSA初級抗體(Bethyl)偵測[圖7]，其中初級培育時間為90分鐘且二級抗體培育時間為60分鐘。大於90%之初始BSA質量在GSH裝載步驟期間流過，且弱結合之BSA在2個洗滌步驟中移除。澄清的收穫物之GSH溶離殘餘BSA的減少百分比大於99.99%。亦評估藉由使用抗MRC-5初級抗體(Cygnus)之毛細管電泳西方墨點法量測之GSH溶離HCP清除率及藉由qPCR量測之HC-DNA清除率(參見分析實例6) [表2]。在澄清的收穫物中，HCP之減少百分比大於99.9%且HC-DNA之減少百分比大於99.8%。此等結果表明，GSH親和性層析可用於有效濃縮及純化成熟的感染性CVA21病毒體，同時清除非感染性空原衣殼、其他病毒雜質及細胞培養相關雜質。 表2

雜質	澄清的收穫物之GSH溶離減少%
牛血清白蛋白	99.993%
宿主細胞蛋白	99.986%
宿主細胞DNA	99.818%

實例2：藉由GSH親和性層析擴增及純化腸病毒 腸病毒為小RNA病毒科中之一個屬，由小型、正義、單股RNA病毒組成，具有類似的基因體及結構病毒特性。為了證明GSH親和性純化腸病毒，評估8種不同的血清型，涵蓋數個腸病毒物種，包括腸病毒B、腸病毒C、鼻病毒A及鼻病毒B。各種病毒株係購自美國菌種保存中心(ATCC)，且在使用細胞株A及/或B及上游條件A或D [表3]之兩個感染中，使用生產腸病毒常用之感染方案進行擴增。將細胞接種在經組織培養處理之通風燒瓶中的生長培養基中。接種後數天，傾倒生長培養基，且將1 mL腸病毒接種物添加至細胞層中。將燒瓶培育2小時，隨後向各燒瓶中添加39 mL生產培養基且根據上游條件進行培育。在目視檢查細胞病變效應後，藉由收集上清液來收穫燒瓶。燒瓶在-70℃下儲存，解凍且澄清，隨後用於GSH親和性層析純化。 表3

組	腸病毒血清型	縮寫	腸病毒物種	生產細胞株	上游條件
1	埃可病毒1	E1	腸病毒B	A	A
2	鼻病毒1B	RV1B	鼻病毒A	B	D
3	鼻病毒35	RV35	鼻病毒B	B	D
4	科沙奇病毒A 13	CVA13	腸病毒C	A	A
5	科沙奇病毒A 15	CVA15	腸病毒C	A	A
6	科沙奇病毒A 18	CVA18	腸病毒C	A	A
7	科沙奇病毒A 20b	CVA20b	腸病毒C	B	A
8	科沙奇病毒A 21	CVA21	腸病毒C	B	A
9	科沙奇病毒A 21	CVA21	腸病毒C	B	D

在Konstantinidis等人[17]中所述之製程中，在配備具有不鏽鋼注射器尖端之8通道液體操縱臂及偏心機器人操縱臂之Tecan Freedom EVO 150 (Tecan Group Ltd.)上，使用含有0.6 mL Glutathione Sepharose 4 Fast Flow樹脂之Opus Robocolumns (Repligen)進行GSH親和性層析。對於各純化組，用5 CV之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，pH 7.4之平衡溶液平衡0.6 mL管柱。將澄清的腸病毒樣本以50 CV之裝載量施加至管柱。管柱隨後用5 CV之洗滌1溶液洗滌，該溶液含有15 mM Tris、400 mM NaCl、1 mM DTT、0.005% PS80，pH 8.0，且隨後用5 CV之洗滌2溶液洗滌，該溶液含有15 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM DTT、0.005% PS80，pH 8.0。經由用移動相中之游離GSH自固定化之穀胱甘肽配體競爭性置換，所結合之腸病毒粒子用5 CV之溶離溶液溶離，該溶離溶液含有15 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM GSH、0.005% PS80，pH 8.0。管柱隨後用5 CV之洗提溶液洗提，該洗提溶液含有15 mM Tris、1000 mM NaCl、1 mM DTT、10 mM GSH、0.005% PS80，pH 8.0。所有階段均以4分鐘的停留時間進行，且每1/3 CV在透明平底96孔UV盤(Corning)中收集級分。

層析圖係通過量測所有級分在260 nm及280 nm處之吸光度，針對900/990 nm進行路徑長度校正，且彙總每一管柱所有級分之經路徑長度校正之吸光度來生成。圖8展示具有純化組9之A280及電導率跡線的例示性層析圖。在Robocolumn方法中，通常在60-65 CV之間觀察到溶離峰。藉由SDS-PAGE分析各純化組之澄清的收穫物及溶離份。將樣本與4×裝載染料及10×還原劑(BioRad)混合，隨後在70℃下變性10分鐘。將25 μL每一樣本及2 μL Mark-12蛋白梯(Invitrogen)裝載於1.0 mm 10泳道12%丙烯醯胺Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen)中，且在含有1×MOPS電泳運作緩衝液(Invitrogen)之凝膠盒及電源系統(Invitrogen)中在200V下電泳45分鐘。隨後使用Pierce銀染套組(Thermo Fisher Scientific)對凝膠進行染色，且使用凝膠成像儀(BioRad)成像。

實驗組1-9澄清的細胞培養收穫物[圖9A]及GSH溶離份[圖9B]之SDS-PAGE分析表明，GSH親和性層析可有效用於純化跨越一系列不同物種之腸病毒的多個血清型。在埃可病毒1 (1)、鼻病毒1B (2)、鼻病毒35 (3)、科沙奇病毒A 13 (4)、科沙奇病毒A 15 (5)、科沙奇病毒A 18 (6)、科沙奇病毒A 20b (7)及科沙奇病毒A 21 (8、9)之溶離物中可偵測到腸病毒衣殼病毒蛋白(VP)。雖然所有組使用習知的細胞培養方案進行腸病毒生產，但僅CVA21 (8,9)生產方法針對高滴度進行最佳化。在此實例中，來源於ATCC儲備液之其他腸病毒血清型(1-7)很少或沒有自原始小瓶進行處理。隨著血清型特異性方法之進一步最佳化，預期細胞培養滴度及藉由GSH親和性層析之回收得到改良。此外，上游條件可能會影響空原衣殼與GSH層析樹脂之結合，如組8-9 GSH溶離份中病毒蛋白條帶之不同分佈所證明。

實例3：使用不同上游條件產生之澄清的收穫物之CVA21的GSH親和性層析純化 在2個實驗中使用與實例1類似的程序以及使用上游細胞培養條件A-C產生之CVA21澄清收穫物來評估GSH親和性層析[表4]。在具有UNICORN系統控制軟體之Akta Pure 150M FPLC系統上使用裝填有GSH Sepharose 4 Fast Flow樹脂之20 mL HiPrep管柱。將CVA21澄清的細胞培養收穫物以100 cm/hr之流動速率裝載至管柱，直至達到200 CV之管柱裝載量。GSH管柱以150 cm/hr之流動速率用8 CV之GSH洗滌1緩衝液洗滌，該緩衝液含有15 mM Tris、400 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 8.0，且隨後用4 CV之GSH洗滌2緩衝液洗滌，該緩衝液含有15 mM Tris、75 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT，pH 8.0。所結合之CVA21粒子用4 CV之GSH溶離溶液溶離，該溶離溶液含有15 mM Tris、75 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT、1 mM GSH，pH 8.0，流動速率為150 cm/hr。GSH管柱用4 CV之GSH洗提緩衝液洗提，該緩衝液含有15 mM Tris、1000 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT、10 mM GSH，pH 8.0，且用0.1 N NaOH、1 M NaCl溶液再生，流動速率為150 cm/hr。 表4

實驗	實驗A	實驗B
實驗組	1	2	3	4	5
上游條件	B	A	B	C	A

澄清的收穫物及GSH溶離產物樣本藉由使用銀染之SDS-PAGE[圖10]及毛細管電泳抗VP4西方墨點法進行分析，以偵測相對於經超速離心純化之病毒的VP0:VP4之比[圖11]。SDS-PAGE分析顯示，所有組之GSH溶離物的雜質蛋白清除率相似，但GSH溶離樣本之VP0條帶(~37 kDa)相對於其他病毒蛋白條帶的強度不同。組1、3及4具有較高的VP0含量，而組2及5具有低VP0含量，表明跨越GSH層析步驟之空原衣殼清除率的差異。藉由抗VP4西方墨點法之相對於經超速離心純化之病毒的空原衣殼:完全成熟病毒粒子之比表明，所有組之VP0:VP4之比自澄清的收穫物至GSH溶離產物有所降低，但減小因數存在差異。在由上游條件A產生之組2及5中，空原衣殼:完全成熟病毒體之比顯著小於超速離心。此等結果表明，在一些上游條件下，一部分空原衣殼可與GSH樹脂結合，且可實施第二步驟，諸如陽離子交換(CEX)層析，以清除GSH溶離產物中殘餘的空原衣殼，以達到或超過經超速離心純化之病毒的純度。

實例4：使用涉及GSH親和性層析及CEX層析之製程純化腸病毒 使用圖12之製程，以大規模生物反應器細胞培養收穫物之CVA21純化為例，演示腸病毒之可擴展純化。純化製程涉及使由細胞培養基、宿主細胞碎片、血清雜質及腸病毒粒子組成之腸病毒細胞培養收穫物通過一或多個孔徑範圍為0.2-100 µm之澄清過濾器，以移除宿主細胞碎片。可使用一系列兩個澄清步驟，其中初級澄清步驟之過濾器孔徑為1-100 µm且二級澄清步驟之過濾器孔徑為0.2-5 µm。對於微載體細胞培養收穫物，初級澄清可涉及網袋或深度過濾器，以在二級澄清之前移除微載體。以目前使用CVA21之實例，澄清步驟用以100 L/m² -hr (LMH)串聯操作之2個過濾器連續運作：使用Clarisolve 60 HX (Millipore) 60 µm深度過濾器進行初級澄清以移除微載體及大細胞碎片，且使用Sartopure GF+ (Sartorius) 1.2 µm深度過濾器進行二級澄清以清除包括HC-DNA之較小細胞碎片。

在一些腸病毒細胞培養物中，病毒之溶解活性足以溶解細胞，而不需要溶解步驟。在其他腸病毒細胞培養物中，在澄清步驟之前，可實施溶解步驟，諸如用範圍介於0.01-2% w/v之PS-80、PS-20或其他界面活性劑進行清潔劑溶解，以完全溶解細胞。以目前使用CVA21之實例，不執行溶解步驟。

按照與實例1相似之程序，將澄清的收穫物直接裝載至GSH親和性層析管柱。對於GSH層析操作，將GSH固定化樹脂裝填至製造規模的層析管柱中，且用諸如Akta Pilot (Cytiva)或Akta Ready (Cytiva)之層析滑架操作。以目前使用CVA21之實例，在具有UNICORN系統控制軟體之Akta Pilot上使用裝填有GSH Sepharose 4 FF之14 cm直徑管柱。將CVA21澄清的細胞培養收穫物以100 cm/hr之流動速率裝載至管柱，直至150-200 CV之管柱裝載量。GSH管柱以150 cm/hr之流動速率用8 CV之GSH洗滌1緩衝液洗滌，該緩衝液含有15 mM Tris、400 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 8.0，且隨後用4 CV之GSH洗滌2緩衝液洗滌，該緩衝液含有15 mM Tris、150 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT，pH 8.0。所結合之CVA21粒子用4 CV之GSH溶離溶液溶離，該溶離溶液含有15 mM Tris、150 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT、1 mM GSH，pH 8.0，流動速率為150 cm/hr。GSH管柱用4 CV之GSH洗提緩衝液洗提，該緩衝液含有15 mM Tris、1000 mM NaCl、0.005% w/v PS-80、1 mM DTT、10 mM GSH，pH 8.0，且用0.1 N NaOH、1 M NaCl溶液再生，流動速率為150 cm/hr。

將GSH溶離產物直接裝載至視情況存在之精製陰離子交換(AEX)層析步驟，該步驟以流過模式操作，用於清除額外的殘餘雜質。AEX層析步驟可使用常見的AEX層析介質，諸如POROS 50HQ (ThermoFisher)、Capto Q (Cytiva)或Nuvia Q (BioRad)或其他AEX固定相。對於大規模AEX層析操作，將AEX樹脂裝填至製造規模的層析管柱中，且以50-300 cm/hr之流動速率用諸如Akta Pilot之層析滑架運作。AEX管柱在3-5 CV AEX平衡緩衝液中進行平衡，該平衡緩衝液由pH值為6-9且單價鹽濃度為50-500 mM之溶液構成。將含GSH溶離產物之pH值為6-9且單價鹽濃度為50-500 mM之溶液裝載至AEX管柱，隨後用AEX平衡緩衝液進行1-3 CV追逐。腸病毒粒子流過，而包括HC-DNA及雜質蛋白之雜質與AEX樹脂結合。管柱用3-5 CV AEX洗提緩衝液洗提，該緩衝液由pH值為6-9且單價鹽濃度為500-1500 mM之溶液構成，且用含有0.1-0.5 N氫氧化鈉之溶液再生。AEX緩衝溶液可含有界面活性劑，諸如PS-80、PS-20或其他類似的界面活性劑，其濃度為0.001-1% w/v。以目前使用CVA21之實例，裝填有POROS 50HQ樹脂之5 cm直徑管柱在具有UNICORN系統控制軟體之Akta Pilot上以200 cm/hr之流動速率運作。AEX管柱用4 CV之AEX平衡緩衝液進行平衡，該平衡緩衝液由15 mM Tris、150 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 8.0組成。將含有CVA21粒子之GSH溶離產物裝載至管柱，直至裝載25-30 CV，且用2 CV AEX平衡緩衝液追逐。CVA21粒子流過，而殘餘雜質與管柱結合。AEX管柱用4 CV之AEX洗提緩衝液洗提，該洗提緩衝液含有15 mM Tris、1000 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 8.0，且用4 CV之0.5 N NaOH溶液再生。若在無AEX之情況下滿足最終經純化之組合物中所需的殘餘雜質規格，則可省略AEX層析步驟。在此情況下，將GSH溶離產物轉入溶液調整步驟。

在溶液調整步驟中，將AEX FT或GSH溶離(若不進行AEX)產物調整到與後續CEX層析步驟中與CEX層析樹脂結合相容的溶液條件。AEX FT或GSH溶離產物最初在pH值為6-9且單價鹽濃度為50-500 mM之溶液中。必要時，將0.5-1.5 M調整緩衝溶液(由諸如檸檬酸鹽之緩衝物種組成，pH 3.5-6.0)及2-5 M調整單價鹽溶液(諸如NaCl)之濃縮儲備溶液摻入AEX FT中，使溶液pH值降至pH 3.5-6.0且使單價鹽濃度增加至50-500 mM。若AEX FT已處於CEX步驟之裝載溶液的目標pH值或單價鹽濃度，則可能不需要一種或兩種調整溶液。以目前使用CVA21之實例，將1 M檸檬酸鈉pH 4.0溶液及5 M NaCl溶液摻入最初在pH 8.0及150 mM NaCl下之AEX FT中，目標為在pH ~4.1下最終檸檬酸鈉濃度為50 mM且最終NaCl濃度為400 mM。在混合下，將濃縮的儲備溶液經5-10分鐘緩慢添加至AEX FT產物。將此經溶液調整之樣本稱為CEX進料且代表目標CEX裝載溶液。

以結合-溶離模式之CEX層析步驟作為清除空原衣殼之第二步驟來實施，以提高製程穩健性、清除殘餘雜質且提供額外的體積減少。CEX步驟可使用常見的層析介質，諸如POROS 50HS (ThermoFisher)、Capto S (Cytiva)或Nuvia S (BioRad)或其他CEX固定相。對於大規模CEX層析操作，將CEX樹脂裝填至大規模的層析管柱中，且以50-300 cm/hr之流動速率用諸如Akta Pilot之層析滑架運作。CEX管柱在3-5 CV CEX平衡緩衝液中進行平衡，該平衡緩衝液由pH值為3.5-6.0且單價鹽濃度為50-500 mM之溶液構成。將含CEX進料之pH值為3.5-6.0且單價鹽濃度為50-500 mM之CEX裝載溶液裝載至CEX管柱。腸病毒粒子與CEX樹脂結合，而一些殘餘雜質可能會流過。CEX管柱用3-5 CV之CEX洗滌緩衝溶液洗滌，該洗滌緩衝溶液由pH值為3.5-6.0且單價鹽濃度為100-600 mM之溶液構成，以移除殘餘雜質。使用3-5 CV的CEX溶離緩衝溶液自CEX管柱選擇性地溶離完全成熟病毒體，該溶離緩衝溶液由pH值為3.5-6.0且單價鹽濃度為200-1000 mM NaCl之溶液構成，而空原衣殼仍與CEX樹脂結合。用3-5 CV CEX洗提緩衝液溶離空原衣殼及其他殘餘雜質，該洗提緩衝液由pH值為4.0-8.0且單價鹽濃度為500-1500毫米之溶液構成，且用含有0.1-0.5 N氫氧化鈉之溶液對CEX管柱進行再生。CEX緩衝溶液可含有界面活性劑，諸如PS-80、PS-20或其他類似的界面活性劑，其濃度為0.001-1% w/v。以目前使用CVA21之實例，裝填有POROS 50HS樹脂之5 cm直徑管柱在具有UNICORN系統控制軟體之Akta Pilot上以200 cm/hr之流動速率運作。用4 CV之CEX平衡緩衝液平衡CEX管柱，該平衡緩衝液由50 mM檸檬酸鈉、400 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 4.0組成。將含有CVA21粒子之CEX進料產物裝載至管柱，直至裝載25-30 CV。用4 CV之CEX洗滌緩衝液洗滌管柱，該洗滌緩衝液由25 mM檸檬酸鈉、500 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 4.0組成。用4 CV之CEX溶離緩衝液自CEX管柱選擇性地溶離完全成熟CVA21病毒體，該溶離緩衝液由25 mM檸檬酸鈉、800 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 4.0組成。用4 CV之CEX洗提緩衝液溶離空CVA21原衣殼，該洗提緩衝液由25 mM檸檬酸鈉、1000 mM NaCl、0.005% w/v PS-80，pH 7.0組成，且用4 CV之0.5 N NaOH溶液對管柱進行再生。

由經純化之完全成熟腸病毒病毒體組成之CEX溶離產物經由脫鹽模式下之切向流過濾(TFF)或尺寸排阻層析(SEC)，藉由超濾/透濾(UF/DF)進行緩衝液交換至穩定緩衝液中。對於TFF，腸病毒粒子藉由分子量截斷值為約50-500 kDa之中空纖維或濾筒截留，而其他小溶液組分則通過膜滲透。TFF可以依約1,000-8,000 s^-1 之交叉流剪切速率，約0.1-10 psig之跨膜壓力(TMP)及約5-60 L/m² -hr之滲透通量來操作。CEX溶離產物經過5-10個透濾體積透濾至1×穩定緩衝溶液中，該穩定緩衝溶液由約pH 6-8之緩衝物質組成。UF步驟可在DF之前或之後進行。視情況存在之中和步驟可在TFF之前執行，其中CEX溶離產物稀釋2-5倍成為2-5×濃縮的穩定緩衝溶液中。在TFF之前，可視情況採用由孔徑為約0.1-1 µm之過濾器組成之過濾步驟。為了採用SEC進行緩衝液交換，將CEX溶離產物裝載至裝填有諸如Sephadex (Cytiva)之樹脂的SEC管柱，且使用諸如Akta Pilot之層析系統，以脫鹽模式進行操作。以目前使用CVA21之實例，藉由稀釋3倍成為3×濃縮的穩定緩衝溶液中來中和CEX溶離產物。在生成TFF進料溶液之前，使用Durapore 0.22 µm過濾器(Millipore)過濾中和的CEX溶離產物。首先將TFF進料溶液濃縮2-3倍，且隨後使用Spectrum 300 kDa中空纖維過濾器(Repligen)，以2000 s^-1 之交叉流，1-2 psig之TMP及20-40 LMH之滲透通量進行緩衝液交換至1×穩定緩衝溶液中。

用經過緩衝液交換之TFF或SEC溶離產物執行最後的過濾步驟。使用0.1-0.5 µm之過濾器孔徑。將含最終經純化之腸病毒組合物的穩定緩衝溶液冷凍且儲存在＜-60℃下。以目前使用CVA21之實例，使用Durapore 0.22 µm過濾器(Millipore)。

由上游細胞培養條件A及B產生之4個批次已示範說明於上文詳述之CVA21純化製程中[表6]。舉例而言，採用細胞培養條件B之批次4的純化製程中間樣本藉由使用銀染色之SDS-PAGE進行特徵分析[圖13]。GSH溶離產物證實對殘餘蛋白質雜質之高度純化，僅出現VP0、VP1、VP2、VP3 (VP4，7 kDa，流出凝膠)及RNA可偵測條帶。VP0及VP2含量之組合顯示，GSH溶離產物含有空的原衣殼及成熟病毒體之分佈。AEX洗提及CEX FT中已清除痕量之殘餘雜質。CEX溶離產物僅具有高濃度之VP1、VP2、VP3及可見之RNA條帶，證實空原衣殼之清除及完全成熟病毒體之純淨組成。空衣殼溶離於CEX洗提樣本中，由高VP0含量所證明。在CEX溶離產物中和且過濾之後，在TFF緩衝液交換及最終過濾步驟之前，VP條帶分佈保持恆定。跨越GSH及CEX層析步驟之空斑感染性、RT-qPCR基因體及HPSEC粒子(參見實例6中之分析方法)步驟產率證實高產率之純化製程[表5]。此等結果證明經純化之成熟病毒體組合物的穩健生產，其涉及能夠移除空原衣殼(GSH、CEX)、清除殘餘雜質(GSH、AEX、CEX)及減少製程體積(GSH、CEX、TFF)之多個單元操作。 表5

批次4 步驟產率	空斑 感染性	RT-qPCR 基因體	HPSEC 粒子
澄清的收穫物至GSH溶離物步驟產率	85%	84%	n/a
GSH溶離物至CEX溶離物步驟產率	83%	87%	77%

實例5：由4個大規模批次涉及GSH親和性層析及CEX層析產生之經純化之CVA21組合物與經超速離心純化之CVA21組合物進行比較 由細胞培養條件A及B產生且使用圖13中詳述之製程純化的四種經純化之CVA21組合物以及使用超速離心(UC Pure，圖1A)產生之經純化之病毒藉由SDS-PAGE [圖14]、毛細管電泳抗VP4西方墨點法[圖15]及包括空斑效力、基因體RT-qPCR、HPSEC、RP-HPLC、CE-SDS、HC-DNA qPCR及BSA ELISA在內的數種分析法進行表徵[表6]。關於各分析法之詳細說明，參見實例6中之分析方法。使用市售BSA ELISA套組(Cygnus)進行BSA分析。 表6

經純化之病毒批次	上游條件	空斑效力(pfu/mL)	RT-qPCR 基因體(基因體/mL)	HPSEC 粒子(粒子/mL)	RP-HPLC VP0:VP2峰值比	CE-SDS VP純度 (面積%)	qPCR HC-DNA (ng/mL)	ELISA 殘餘BSA (ng/mL)
批次1	A	4.09E+09	1.91E+12	1.60E+12	0.12%	＞95%	＜0.02	＜5
批次2	A	2.77E+09	1.46E+12	1.39E+12	0.19%	＞95%	＜0.02	＜5
批次3	A	2.90E+09	1.76E+12	1.61E+12	0.16%	＞95%	＜0.02	＜5
批次4	B	1.13E+10	5.67E+12	3.10E+12	n/a	＞95%	＜0.02	＜5
UC Pure	n/a	1.21E+09	1.14E+12	7.80E+11	3.1%	＞95%	0.755	＜5

使用銀染之SDS-PAGE及抗VP4西方墨點法之分析證明，GSH溶離產物中批次1-3之空原衣殼清除，而批次4相對於UC純化病毒具有高VP0含量。然而，CEX步驟清除空原衣殼，在所有批次中，在最終經純化之病毒組合物中，CEX溶離產物中空原衣殼:完全成熟病毒比率比UC純化CVA21低約10倍。此外，使用H-Class BIOshell C4管柱(Waters)進行逆相HLPC (RP-HPLC)分析法，以批次1層析圖為例，藉由量測2次注射平均之VP0:VP2峰面積信號比來評估經純化之病毒樣本的含有VP0之粒子:含有VP2之粒子之比[圖16]。批次1-3之RP-HPLC結果比經UC純化之病毒低約10倍，從而印證抗VP4西方墨點分析。

由於改進的製程滴度及產率，批次1-4之經純化之組合物的空斑效力、RT-qPCR基因體及HPSEC粒子濃度高於UC純化。SDS-PAGE及CE-SDS分析法證明批次1-4中蛋白質純度高，HC-DNA及BSA分析法均＜LOQ (定量限)且證明HC-DNA清除率與UC純化組合物相比有所提高。在假設劑量為5E+07 pfu/劑量之情況下，批次1-4實現＜1 pg HC-DNA/劑量及＜100 pg BSA/劑量，比＜10 ng HC-DNA/劑量及＜50 ng BSA/劑量之典型指導值低數個數量級[表7]。 表7

經純化之病毒 批次	每劑量之HC-DNA  (pg DNA/劑量)	每劑量之BSA (pg BSA/劑量)
批次1	＜0.2	＜61
批次2	＜0.4	＜90
批次3	＜0.3	＜86
批次4	＜0.1	＜22
UC Pure	31.2	＜206

總粒子及基因體與感染性粒子之比值為追蹤製程一致性及經純化之病毒品質的重要產物屬性。總粒子與感染性粒子之比可在1:1至10⁷ :1之範圍內，且視計算該值時使用之單個病毒及分析法而定[18]。批次1-4之分別以基因體/pfu及粒子/pfu為單位之基因體及粒子與感染性之比低於UC純化病毒，表示產物品質得到提高[圖17]。此等分析結果證實一種更穩健及可擴展的製程，能夠產生病毒效力、成熟病毒體純度及殘餘雜質清除率相對於藉由習知超速離心方法或其他方法產生之現有組合物有所提高的CVA21組合物。

實例6：CVA21純化病毒分析法 逆相HPLC或UPLC分析程序 具有UV及螢光(FLR)偵測器之一般HPLC或UPLC系統適用於在逆相層析條件下分離CVA21衣殼蛋白。典型的層析系統由Waters ACQUITY UPLC系統組成，包括四元(或二元)泵、樣本管理器、管柱組件、FLR偵測器及TUV偵測器。典型的使用管柱為Millipore (Sigma-Aldrich) BIOshell IgG C4管柱，孔徑為1000Å，粒度為2.7 µm。2.1×100 mm尺寸的管柱(目錄63288-U)足以分離所有衣殼病毒體蛋白。不同尺寸或其他供應商之類似尺寸的管柱可實現同等的分離效率。典型的管柱溫度維持在80℃，但可使用65-85℃之管柱溫度範圍，而對病毒體蛋白分離無明顯影響。使用280 nm處之激發及352 nm處之發射記錄FLR偵測。在220 nm及280 nm處記錄雙重UV偵測。在一些情況下，亦記錄260 nm處之UV偵測。在分析過程中，樣本管理器溫度維持在約8℃。

使用兩個移動相進行梯度溶離。第一移動相由含0.1%三氟乙酸(TFA)之HPLC級水組成(移動相A)；第二移動相為含0.1% TFA之乙腈(移動相B)。用於分析CVA21純化病毒樣本之移動相梯度及流動速率描述於表8中。藉由質譜分析確認圖16之實例中鑑別之病毒蛋白峰。視注入之樣本而定，可修改梯度設置，且視系統壓力限制而定，可使用0.2至0.5 mL/min之流動速率。病毒蛋白峰滯留時間可視系統、管柱及方法而變化，但相對峰序預計會保持不變。約5-50 µL CVA21純化樣本直接注入，無需預稀釋或還原即可進行HPLC分析。若樣本太稀(小於約0.1 µg注入量)或低於分析方法之偵測極限，則可使用離心式過濾濃縮器，諸如Amicon (Millipore)或Vivaspin (Sartorius)過濾器將樣本濃縮至分析的理想範圍。 表8

時間	流動速率(mL/min)	移動相A %	移動相B %
0	0.4	75	25
0.5	0.4	75	25
4.5	0.4	60	40
10.5	0.4	54	46
11.0	0.4	20	80
11.5	0.4	75	25
12.5	0.4	75	25

CE-SDS分析程序 CVA21成熟病毒體衣殼由4種病毒蛋白構成，亦即VP4、VP3、VP2及VP1。CE-SDS用於基於4種VP之不同分子量對其進行分離、鑑別及定量，獲得相對峰面積%及相對遷移時間。該分析亦可偵測VP0，其為空原衣殼之標誌物。使用Maurice CE-SDS Plus套組試劑(Protein Simple)，藉由將50 µL CVA21樣本與50 µL由47 µL 1×樣本緩衝液、2 µL 2-巰基乙醇及1 µL 10×內標(10 kDa蛋白)構成之主混合物混合來製備CE-SDS裝載溶液。將樣本在70℃下加熱10分鐘，置於實驗台上1分鐘以冷卻，且隨後在1,000 g下渦旋1分鐘。藉由在指定的孔中移液50 μL來將裝載溶液轉移至96孔盤中，且使用離心機盤適配器在1,000 g下將盤離心5分鐘。將樣本盤與Maurice CE-SDS Plus套組分離濾筒(Protein Simple)一起置於Maurice儀器(Protein Simple)中，在4600V下注入50 µL裝載溶液120秒且在5750V下分離35分鐘。顯示批次4之經純化之病毒樣本之4種VP的分離的典型電泳圖(具有約10 µg注入量)展示於圖18中。病毒蛋白預期的相對遷移時間及峰面積%展示於表9中。對於給定的分離，預期的相對遷移時間可偏移高達5%。VP純度%係由VP1-4之峰面積%的總和來計算，定量偵測極限為約5%。若樣本太稀(小於約1 µg注入量)或低於分析方法之偵測極限，則可使用離心式過濾濃縮器，諸如Amicon (Millipore)或Vivaspin (Sartorius)過濾器將樣本濃縮至分析的理想範圍。 表9

病毒蛋白	預期的相對遷移時間	實例批次4 峰面積%
VP4	0.93	8 %
VP3	1.23	26 %
VP2	1.31	37 %
VP1	1.38	29 %
VP0	1.39	＜5 %

HPSEC分析程序 HPSEC分析在Agilent 1260或更高系列上進行。該系統由用於注入之盤式自動進樣器及四元泵組成。HPSEC分析程序使用自Tosoh Bioscience LLC獲得之TSKgel G5000PWxl (7.5×300 mm，17 µm)管柱(目錄號0005764)來進行。該系統使用牛血清白蛋白(Pierce)進行校準。使用含有10 mM Bis-Tris、0.6 M NaCl，pH 6.9之移動相平衡HPSEC系統，注入CVA21樣本(大於約1 µg)且在等度溶離下以0.4 mL/min之流動速率進行解析。樣本注入後之總溶離時間為30℃下35分鐘。使用DAD UV偵測器獲取280 nm處之吸光度。Wyatt Astra-7軟體將UV A₂₈₀ 峰面積直接轉換為病毒質量，病毒濃度按照以下所示之公式來計算： 病毒濃度(µg/mL) = 病毒質量(µg)/注入體積(mL)

使用具有算法之信息學工具，基於所有病毒蛋白之RNA序列及胺基酸序列計算280 nm處之CVA21完全成熟病毒體消光係數(=5.48) [ExPASy伺服器上之蛋白質鑑別及分析工具, E. Gasteiger, C. Hoogland, A. Gattiker, S. Duvaud, M.R.Wilkins, R.D. Appel, A. Bairoch; The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press 2005 (信息學工具：https://web.expasy.org/protparam)；或Determination of Extinction Coefficient, V. Murugaiah, Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products 2011 (信息學工具：「Quest Calculate™ RNA Molecular Weight Calculator.」 AAT Bioquest, Inc, 2020年5月06日, https://www.aatbio.com/tools/calculate-RNA-molecular-weight-mw]。為了獲得病毒粒子濃度，粒子數與注入體積有關。計算病毒粒子計數之公式如下所示： 粒子計數(每mL) = [病毒濃度(g/mL)/ *Mw (Da)]×亞佛加厥常數(6.02E+23粒子-mol^-1 ) *CVA21完全成熟病毒(衣殼蛋白+RNA) Mw (8203 Kda)係使用實例7中MVSS01之蛋白質及RNA序列計算得出。

若樣本太稀(小於約1 µg注入量)或低於分析方法之偵測極限，則可使用離心式過濾濃縮器，諸如Amicon (Millipore)或Vivaspin (Sartorius)過濾器將樣本濃縮至分析的理想範圍。

空斑分析程序 空斑分析測定CVA21感染SK-Mel-28細胞後之感染性(pfu/mL)。在此方法中，將SK-Mel-28細胞以5.0E+05個細胞/孔接種於12孔細胞培養盤中，且在37℃、5% CO₂ 下培育24±4小時。細胞隨後用CVA21樣本感染，且在37℃、5% CO₂ 下培育90至105分鐘，以使病毒吸附。在吸附期後，添加覆蓋物(1%甲基纖維素，1.5 mL/孔)，且將經感染之細胞盤放回培育箱72±2小時。在此培育後，移除覆蓋物，將細胞盤用PBS/DPBS洗滌兩次且用80%甲醇固定。隨後用庫馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)染色溶液對盤進行染色，該染色溶液與所有未感染之黏附細胞結合。經感染之細胞不會黏附於盤表面且留下間隙，其稱為空斑。盤上之空斑係用燈箱手動計數。滴度計算係藉由將空斑數乘以各自的稀釋因子來進行，且以空斑/mL表示。用於此計算之至少兩個孔的空斑數幾何平均值在每孔約5至55個空斑的範圍內。

RT-qPCR病毒基因體定量分析(GQA)程序 藉由蛋白酶K/十二烷基硫酸鈉消化溶解樣本。隨後藉由苯酚:氯仿:異戊醇分離及乙酸鈉/異丙醇沈澱提取核酸，隨後用乙醇洗滌且再懸浮於水中。將再懸浮之核酸添加至含有靶向CVA21 VP1基因之引子及雙重標記探針的1步定量反轉錄PCR (RT-qPCR)反應中，該反應係針對GenBank寄存編號AF465515.1所設計。藉由整個擴增循環中之螢光增加來監測擴增。基因體複本數係藉由對含有VP1基因目標區域之合成RNA的標準曲線進行內插法來確定，範圍介於1E+11基因體複本/毫升至1E+07基因體複本/毫升。

殘餘宿主細胞DNA分析程序 藉由蛋白酶K/十二烷基硫酸鈉消化溶解樣本。隨後藉由苯酚:氯仿:異戊醇分離及乙酸鈉/異丙醇沈澱提取核酸，隨後用乙醇洗滌且再懸浮於水中。將再懸浮之核酸添加至含有靶向人類LINE-1轉位酶域之3'保守區的引子及雙重標記探針的定量PCR (qPCR)反應中，該反應係針對NCBI參考寄存編號NM_001164835.1所設計。藉由整個擴增循環中之螢光增加來監測擴增。宿主細胞DNA濃度係藉由對經純化之MRC-5 DNA的標準曲線進行內插法來確定，範圍介於2E+02 ng DNA/mL至2E-02 ng DNA/mL。

病毒TCID₅₀ 分析 將96孔組織培養盤中SK-Mel-28細胞之匯合單層接種於CVA21之10倍連續稀釋液(100 µL/孔，一式四份)，且在37℃、5% CO₂ 環境中培育72小時。將小鼠血清在含有2%胎牛血清(FCS)之DMEM中連續稀釋10倍，範圍介於1:10² 至1:10⁸ 。在倒置顯微鏡下對各孔之細胞病變效應(CPE)進行目測評分。具有可偵測之CPE的孔評為陽性，且使用Karber法(Dougherty 1964)計算50%病毒端點滴度。

實例7：CVA21病毒序列 科沙奇病毒A21之原型Kuykendall 病毒株在GenBank中描述為AF465515。最初的臨床試驗批次MelTrial病毒1係由上述原型病毒株藉由空斑純化、在SK-MEL-28細胞中擴增及藉由蔗糖梯度純化而得到。

在以上實例中使用之主病毒毒種儲備CVA21 MVSS-01係由MelTrial病毒1藉由空斑純化及在MRC-5細胞中擴增而得到。對此病毒之完整基因體序列進行分析[表10]。 表10

MVSS-01之RNA序列

5´-UUAAAACAGCUCUGGGGUUGUUCCCACCCCAGAGGCCCACGUGGCGGCUAG UACUCUGGUAUUACGGUACCUUUGUACGCCUGUUUUGUAUCCCUUCCCCCGUAACUUUAGAAGCUUAUCAAAGGUUCAAUAGCAGGGGUACAAACCAGUACCUCUACGAACAAGCACUUCUGUUUCCCCGGUGAUAUCACAUAGACUGUACCCACGGUCAAAAGUGAUUGAUCCGUUAUCCGCUUGAGUACUUCGAGAAGCCUAGUAUCACCUUGGAAUCUUCGAUGCGUUGCGCUCAACACUCUGCCCCGAGUGUAGCUUAGGCUGAUGAGUCUGGGCACUCCCCACCGGCGACGGUGGCCCAGGCUGCGUUGGCGGCCUACCCAUGGCUGAUGCCGUGGGACGCUAGUUGUGAACAAGGUGUGAAGAGCCUAUUGAGCUACUCAAGAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACCACGGAGCAACCGCUCACAACCCAGUGAGUAGGUUGUCGUAAUGCGUAAGUCUGUGGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCCCUUUAUAUUCAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAAUUUACAAAUUGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCACCCAGUAUUGUGCAAUAUAUUUGAGUGUUUCUUUCAUAAGCCUUAUUAACAUCACAUUUUUAAUCACAAUAAACAGUGCAAAUGGGGGCUCAAGUUUCAACGCAAAAGACCGGUGCGCACGAGAAUCAAAACGUGGCAGCCAAUGGAUCCACCAUUAAUUACACUACUAUCAACUAUUACAAAGACAGUGCGAGUAAUUCCGCUACUAGACAAGACCUCUCCCAAGAUCCAUCAAAAUUCACAGAACCGGUUAAGGACUUAAUGUUGAAAACAGCACCAGCUCUAAACUCGCCUAACGUGGAAGCAUGUGGGUACAGUGACCGUGUGAGGCAAAUCACUUUAGGCAACUCGACUAUUACUACACAAGAAGCAGCCAAUGCUAUUGUUGCUUACGGUGAAUGGCCCACUUACAUAAAUGAUUCAGAAGCUAAUCCGGUAGAUGCACCCACUGAGCCAGAUGUUAGUAGCAACCGGUUUUACACCCUAGAAUCGGUGUCUUGGAAGACCACUUCAAGGGGAUGGUGGUGGAAGUUACCAGAUUGUUUGAAGGACAUGGGAAUGUUUGGUCAGAAUAUGUACUAUCACUACUUGGGGCGCUCUGGUUACACCAUUCAUGUCCAGUGCAACGCUUCAAAAUUUCACCAAGGGGCGUUAGGAGUUUUUCUGAUACCAGAGUUUGUCAUGGCUUGCAACACUGAGAGUAAAACGUCAUACGUUUCAUACAUCAAUGCAAAUCCUGGUGAGAGAGGCGGUGAGUUUACGAACACCUACAAUCCGUUAAAUACAGACGCCAGUGAGGGCAGAAAGUUUGCAGCAUUGGAUUAUUUGCUGGGUUCUGGUGUUCUAGCAGGAAACGCCUUUGUGUACCCGCACCAGAUCAUCAACCUACGUACCAACAACAGUGCAACAAUUGUGGUGCCAUACGUAAACUCACUUGUGAUUGAUUGUAUGGCAAAACACAAUAACUGGGGCAUUGUCAUAUUACCACUGGCACCCUUGGCCUUUGCCGCAACAUCGUCACCACAGGUGCCUAUUACAGUGACCAUUGCACCCAUGUGUACAGAAUUCAAUGGGUUGAGAAACAUCACCGUCCCAGUACAUCAAGGGUUGCCGACAAUGAACACACCUGGUUCCAAUCAAUUCCUUACAUCUGAUGACUUCCAGUCGCCCUGUGCCUUACCUAAUUUUGAUGUUACUCCACCAAUACACAUACCCGGGGAAGUAAAGAAUAUGAUGGAACUAGCUGAAAUUGACACAUUGAUCCCAAUGAACGCAGUGGACGGGAAGGUGAACACAAUGGAGAUGUAUCAAAUACCAUUGAAUGACAAUUUGAGCAAGGCACCUAUAUUCUGUUUAUCCCUAUCACCUGCUUCUGAUAAACGACUGAGCCGCACCAUGUUGGGUGAAAUCCUAAAUUAUUACACCCAUUGGACGGGGUCCAUCAGGUUCACCUUUCUAUUUUGUGGUAGUAUGAUGGCCACUGGUAAACUGCUCCUCAGCUAUUCCCCACCGGGAGCUAAACCACCAACCAAUCGCAAGGAUGCAAUGCUAGGCACACACAUCAUCUGGGACCUAGGGUUACAAUCCAGUUGUUCCAUGGUUGCACCGUGGAUCUCCAACACAGUGUACAGACGGUGUGCACGUGAUGACUUCACUGAGGGCGGAUUUAUAACUUGCUUCUAUCAAACUAGAAUUGUGGUACCUGCUUCAACCCCUACCAGUAUGUUCAUGUUAGGCUUUGUUAGUGCGUGUCCAGACUUCAGUGUCAGACUGCUUAGGGACACUCCCCAUAUUAGUCAAUCGAAACUAAUAGGACGUACACAAGGCAUUGAAGACCUCAUUGACACAGCGAUAAAGAAUGCCUUAAGAGUGUCCCAACCACCCUCGACCCAGUCAACUGAAGCAACUAGUGGAGUGAAUAGCCAGGAGGUGCCAGCUCUAACUGCUGUGGAAACAGGAGCAUCUGGUCAAGCAAUCCCCAGUGAUGUGGUGGAAACUAGGCACGUGGUAAAUUACAAAACCAGGUCUGAAUCGUGUCUUGAGUCAUUCUUUGGGAGAGCUGCGUGUGUCACAAUCCUAUCCUUGACCAACUCCUCCAAGAGCGGAGAGGAGAAAAAGCAUUUCAACAUAUGGAAUAUUACAUACACCGACACUGUCCAGUUACGCAGAAAAUUAGAGUUUUUCACGUAUUCCAGGUUUGAUCUUGAAAUGACUUUUGUAUUCACAGAGAACUAUCCUAGUACAGCCAGUGGAGAAGUGCGAAACCAGGUGUACCAGAUCAUGUAUAUUCCACCAGGGGCACCCCGCCCAUCAUCCUGGGAUGACUACACAUGGCAAUCCUCUUCAAACCCUUCCAUCUUCUACAUGUAUGGAAAUGCACCUCCACGGAUGUCAAUUCCUUACGUAGGGAUUGCCAAUGCCUAUUCACACUUCUACGAUGGCUUUGCACGGGUGCCACUUGAGGGUGAGAACACCGAUGCUGGCGACACGUUUUACGGUUUAGUGUCCAUAAAUGAUUUUGGAGUUUUAGCAGUUAGAGCAGUAAACCGCAGUAAUCCACAUACAAUACACACAUCUGUGAGAGUGUACAUGAAACCAAAACACAUUCGGUGUUGGUGCCCCAGACCUCCUCGAGCUGUAUUAUACAGGGGAGAGGGAGUGGACAUGAUAUCCAGUGCAAUUCUACCUCUGACCAAGGUAGACUCAAUUACCACUUUUGGGUUUGGUCAUCAGAACAAAGCAGUGUACGUUGCCGGUUACAAGAUUUGCAACUACCACCUAGCAACCCCAAGUGAUCACUUGAAUGCAAUUAGUAUGUUAUGGGACAGGGAUUUAAUGGUGGUGGAAUCUAGAGCCCAGGGAACUGAUACCAUCGCCAGAUGUAGUUGCAGGUGUGGAGUUUACUAUUGUGAAUCUAGGAGGAAGUACUACCCUGUCACUUUUACUGGCCCAACGUUUCGAUUCAUGGAAGCAAACGACUACUAUCCAGCAAGAUACCAGUCUCACAUGCUGAUAGGGUGCGGAUUUGCAGAACCCGGGGACUGCGGUGGGAUACUGAGGUGCACUCAUGGGGUAAUUGGUAUCAUUACUGCAGGAGGUGAAGGGGUAGUAGCCUUUGCUGACAUUAGAGACCUCUGGGUGUAUGAAGAGGAGGCCAUGGAACAGGGAAUAACAAGCUACAUCGAAUCUCUCGGCACAGCCUUUGGCGCAGGGUUCACCCACACAAUCAGUGAGAAAGUGACUGAAUUGACAACAAUGGUUACCAGCACUAUCACAGAAAAACUACUGAAAAACUUGGUGAAAAUAGUGUCGGCUCUAGUGAUUGUUGUGAGAAAUUAUGAGGACACUACCACGAUCCUUGCAACACUAGCACUACUCGGGUGUGAUAUAUCUCCUUGGCAAUGGUUGAAGAAGAAGGCAUGUGACUUACUAGAGAUUCCUUAUGUGAUGCGCCAAGGUGAUGGGUGGAUGAAGAAAUUCACAGAGGCGUGCAAUGCAGCUAAAGGCUUAGAGUGGAUUAGCAACAAAAUUUCCAAGUUUAUAGAUUGGUUGAAGUGUAAAAUUAUCCCAGACGCUAAGGACAAGGUGGAAUUUCUCACCAAGUUGAAACAGCUAGACAUGUUGGAAAAUCAAAUUGCAACCAUCCACCAAUCUUGCCCCAGCCAAGAACAACAAGAGAUUCUUUUCAACAAUGUGAGAUGGCUAGCAGUCCAGUCCCGUCGGUUUGCACCAUUAUACGCUGUGGAGGCACGCCGAAUUAACAAAAUGGAGAGCACAAUAAACAAUUAUAUACAGUUCAAGAGCAAACACCGUAUUGAACCAGUAUGUAUGCUCAUUCAUGGGUCACCAGGGACGGGUAAAUCUAUAGCUACUUCAUUAAUAGGUAGAGCAAUAGCAGAGAAGGAAAGCACAUCAGUCUAUUCAAUGCCACCUGACCCAUCUCACUUUGAUGGCUAUAAACAACAAGGGGUAGUGAUUAUGGACGACCUAAACCAAAACCCCGAUGGUAUGGACAUGAAACUGUUUUGCCAAAUGGUAUCAACAGUGGAGUUUAUUCCUCCAAUGGCCUCAUUAGAGGAGAAGGGCAUUUUGUUUACAUCUGAUUAUGUCCUGGCUUCUACCAACUCUCAUUCAAUUGUACCACCCACAGUGGCUCACAGUGAUGCCUUAACCAGACGAUUUGCAUUUGAUGUGGAGGUUUACACGAUGUCUGAACAUUCAGUCAAAGGCAAACUGAAUAUGGCCACGGCCACUCAAUUGUGUAAGGAUUGUCCAACACCUGCAAAUUUUAAAAAGUGUUGCCCUCUCGUUUGUGGAAAGGCCUUGCAAUUAAUGGACAGGUACACCAGACAAAGGUUCACUGUAGAUGAGAUUACCACAUUAAUCAUGAAUGAGAAAAACAGAAGGGCCAAUAUCGGCAAUUGCAUGGAAGCCUUGUUUCAAGGACCAUUAAGGUAUAAAGAUUUGAAGAUCGAUGUGAAGACAGUUCCCCCCCCUGAGUGCAUCAGUGAUUUGUUACAAGCAGUGGAUUCUCAAGAGGUUAGGGAUUACUGUGAGAAGAAAGGCUGGAUCGUUAACGUUACUAGCCAGAUUCAACUAGAAAGGAACAUCAAUAGGGCCAUGACUAUACUCCAAGCUGUUACCACAUUCGCAGCAGUCGCAGGAGUAGUGUAUGUAAUGUACAAACUCUUCGCCGGUCAACAGGGUGCAUACACUGGCUUGCCAAACAAAAAACCCAAUGUCCCUACUAUCAGAGUCGCUAAAGUCCAGGGGCCAGGAUUUGACUACGCAGUGGCAAUGGCAAAAAGAAACAUAGUUACUGCAACCACCACCAAGGGUGAAUUUACCAUGCUAGGGGUGCAUGAUAAUGUAGCAAUAUUGCCAACCCAUGCCGCUCCAGGAGAAACCAUUAUUAUUGAUGGGAAAGAAGUAGAGAUCCUAGAUGCCAGAGCCUUAGAAGAUCAAGCGGGAACCAAUCUUGAGAUCACCAUUAUUACUCUAAAAAGAAAUGAGAAGUUUAGAGACAUCAGAUCACAUAUUCCCACCCAAAUUACUGAAACUAACGAUGGAGUGUUGAUCGUGAACACUAGCAAGUACCCCAAUAUGUAUGUCCCCGUUGGUGCUGUGACCGAACAGGGAUAUCUUAAUCUCAGUGGACGUCAAACUGCUCGCACUUUAAUGUACAACUUUCCAACAAGGGCAGGCCAGUGCGGAGGAAUCAUCACUUGUACUGGCAAAGUCAUUGGGAUGCAUGUUGGCGGGAACGGUUCACAUGGGUUUGCAGCAGCCCUCAAGCGAUCAUACUUCACUCAAAAUCAGGGCGAAAUCCAGUGGAUGAGGUCAUCAAAAGAAGUGGGGUACCCCAUUAUAAAUGCCCCAUCCAAGACAAAGUUAGAACCCAGUGCUUUCCACUAUGUUUUUGAAGGUGUUAAGGAACCAGCUGUACUCACUAAGAAUGACCCCAGACUAAAAACAGAUUUUGAAGAAGCCAUCUUUUCUAAAUAUGUGGGGAACAAAAUUACUGAAGUGGACGAGUACAUGAAAGAAGCAGUGGAUCACUAUGCAGGACAGUUAAUGUCACUGGAUAUCAACACAGAACAGAUGUGCCUGGAGGAUGCCAUGUACGGCACCGAUGGUCUUGAGGCCCUGGAUCUUAGCACUAGUGCUGGAUAUCCUUAUGUUGCAAUGGGGAAAAAGAAAAGAGACAUUCUAAAUAAACAGACCAGAGAUACUAAGGAGAUGCAGAGACUUUUAGAUACCUAUGGAAUCAAUCUACCAUUAGUCACGUACGUGAAAGAUGAACUCAGGUCAAAGACUAAAGUGGAACAAGGAAAGUCAAGAUUGAUUGAAGCUUCCAGCCUUAAUGAUUCAGUUGCAAUGAGAAUGGCCUUUGGCAAUCUUUACGCAGCUUUCCACAAGAAUCCAGGUGUGGUGACAGGAUCAGCAGUUGGUUGUGACCCAGAUUUGUUUUGGAGUAAGAUACCAGUGCUAAUGGAAGAAAAACUCUUCGCUUUUGACUACACAGGGUAUGAUGCCUCACUCAGCCCUGCUUGGUUUGAAGCUCUUAAAAUGGUGUUAGAAAAAAUUGGAUUUGGCAGUAGAGUAGACUAUAUAGACUACCUGAACCACUCUCACCACCUUUACAAAAACAAGACUUAUUGUGUCAAAGGCGGCAUGCCAUCCGGCUGCUCUGGCACCUCAAUUUUCAACUCAAUGAUUAACAACCUGAUCAUUAGGACGCUUUUACUGAGAACCUACAAGGGCAUAGACUUGGACCAUUUAAAAAUGAUUGCCUAUGGUGAUGACGUGAUAGCUUCCUACCCCCAUGAGGUUGACGCUAGUCUCCUAGCCCAAUCAGGAAAAGACUAUGGACUAACCAUGACUCCAGCAGAUAAAUCAGUAACCUUUGAAACAGUCACAUGGGAGAAUGUAACAUUUCUGAAAAGAUUUUUCAGAGCAGAUGAGAAGUAUCCAUUCCUGGUGCAUCCAGUGAUGCCAAUGAAAGAAAUUCACGAAUCAAUCAGAUGGACCAAGGACCCUAGAAACACACAGGAUCACGUACGCUCGUUGUGCCUAUUAGCUUGGCACAACGGUGAAGAAGAAUACAAUAAAUUUUUAGCUAAAAUCAGAAGUGUGCCAAUUGGAAGAGCUUUAUUGCUCCCAGAGUACUCUACAUUGUACCGCCGAUGGCUCGACUCAUUUUAGUAACCCUACCUCAGUCGGAUUGGAUUGGGUUACACUGUUGUAGGGGUAAAUUUUUCUUUAAUUCGGAG (SEQ ID NO: 1)

表11

4種病毒衣殼蛋白之胺基酸序列

VP1 GIEDLIDTAIKNALRVSQPPSTQSTEATSGVNSQEVPALTAVETGASGQAIPSDVVETRHVVNYKTRSESCLESFFGRAACVTILSLTNSSKSGEEKKHFNIWNITYTDTVQLRRKLEFFTYSRFDLEMTFVFTENYPSTASGEVRNQVYQIMYIPPGAPRPSSWDDYTWQSSSNPSIFYMYGNAPPRMSIPYVGIANAYSHFYDGFARVPLEGENTDAGDTFYGLVSINDFGVLAVRAVNRSNPHTIHTSVRVYMKPKHIRCWCPRPPRAVLYRGEGVDMISSAILPLTKVDSITTF (SEQ ID NO:2)

VP2 SPNVEACGYSDRVRQITLGNSTITTQEAANAIVAYGEWPTYINDSEANPVDAPTEPDVSSNRFYTLESVSWKTTSRGWWWKLPDCLKDMGMFGQNMYYHYLGRSGYTIHVQCNASKFHQGALGVFLIPEFVMACNTESKTSYVSYINANPGERGGEFTNTYNPLNTDASEGRKFAALDYLLGSGVLAGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVVPYVNSLVIDCMAKHNNWGIVILPLAPLAFAATSSPQVPITVTIAPMCTEFNGLRNITVPVHQ (SEQ ID NO: 3)

VP3 GLPTMNTPGSNQFLTSDDFQSPCALPNFDVTPPIHIPGEVKNMMELAEIDTLIPMNAVDGKVNTMEMYQIPLNDNLSKAPIFCLSLSPASDKRLSRTMLGEILNYYTHWTGSIRFTFLFCGSMMATGKLLLSYSPPGAKPPTNRKDAMLGTHIIWDLGLQSSCSMVAPWISNTVYRRCARDDFTEGGFITCFYQTRIVVPASTPTSMFMLGFVSACPDFSVRLLRDTPHISQSKLIGRTQ (SEQ ID NO:4)

VP4 MGAQVSTQKTGAHENQNVAANGSTINYTTINYYKDSASNSATRQDLSQDPSKFTEPVKDLMLKTAPALN (SEQ ID NO: 5)

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美國臨時專利申請案第62/951,078號以全文引用的方式併入本文中。本文中所引用之所有參考文獻均以引用的方式併入，引用程度如同各個別出版物、資料庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利特定且單獨地指示以引用的方式併入一般。申請人遵循37 C.F.R. §1.57(b)(1)，此以引用方式併入之表述旨在關於每一個別出版物、資料庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利，其中每一者均依照37 C.F.R. §1.57(b)(2)明確鑑別，即使此類引用沒有緊接著以引用方式併入之專用表述。在本說明書內包括以引用的方式併入之專用表述(若存在)不會以任何方式弱化此以引用的方式併入之一般陳述。在本文中引用參考文獻不旨在承認該參考文獻為相關先前技術，亦不構成對此等出版物或文獻之內容或日期的任何承認。當參考文獻關於所主張之術語提供之定義與本說明書中所提供之定義衝突時，應使用本說明書中所提供之定義來解釋所主張發明。

本發明之前述及其他目標、特徵及優點將根據如隨附圖式所示之本發明之各種實施例的以下更具體描述而顯而易見。

圖1A-B：A：梯度超速離心製程之描述。首先濃縮澄清的細胞培養收穫物以減少體積。在超速離心管中製備梯度，且將樣本裝載於頂部。離心後，對梯度進行分級分離，且合併所選級分。對合併之級分進行透析，以移除梯度溶液。B：GSH親和性層析製程之描述。將澄清的細胞培養收穫物直接裝載於GSH親和管柱。洗滌管柱以移除雜質，且溶離經純化之病毒。管柱可經再生以備將來使用。

圖2：腸病毒形態發生及組裝。由VP0+ VP1 +VP3組成之五個原聚體組裝形成五聚體。空原衣殼可由游離五聚體之可逆組裝形成。在12個五聚體在複製細胞器上縮合且衣殼化包裹新合成之基因體以形成原病毒體後，VP0經自身催化裂解以形成VP4+VP2，且形成成熟病毒體。成熟病毒體為唯一含有VP4之粒子且能夠具有感染性，但並非所有成熟病毒體均可具有感染性。成熟病毒體可降解成A粒子及A粒子之空衣殼。改編自[10]。

圖3：使用Akta Pure進行GSH親和性層析層析圖操作且使用CVA21藉由UNICORN軟體進行分析之例示性層析。對於以mL為單位之GSH親和性層析操作體積，280 nm處之吸光度(UV 1_280，實線)跡線以mAU為單位，且電導率(Cond，虛線)跡線以mS/cm為單位。上圖表示完整的層析圖。下圖為上圖虛線框內所描繪的，表示洗滌、溶離及洗提步驟。

圖4：使用CVA21之GSH親和性層析製程之使用銀染的還原性12%丙烯醯胺Bis-Tris SDS-PAGE。澄清收穫物中之宿主細胞及培養基雜質在GSH流過(GSH FT)及洗滌(GSH W1-2)步驟中清除。CVA21以高濃度及高純度(偵測到痕量BSA)溶離，僅觀察到VP1-VP2-VP3病毒衣殼條帶(VP4 (7 kDa)自凝膠上跑掉)及極少的VP0。GSH溶離(GSH Elute)樣本與經梯度超速離心純化(UC Pure)之CVA21進行比較。

圖5：使用毛細管電泳定量西方墨點法(Protein Simple)將CVA21澄清收穫物及GSH層析流過(GSH FT)及溶離(GSH Elute)樣本與經超速離心純化之材料(UC Pure)進行相對比較。藉由抗VP1多株抗體(pAb)偵測總衣殼粒子，且藉由抗VP4 pAb偵測VP0/VP4信號比。VP0/VP4比率高之粒子(含有大量VP0之粒子：空原衣殼、原病毒體、五聚體、原聚體)流過GSH層析管柱，而VP0/VP4比率低之病毒粒子(含有大量VP4之粒子：僅成熟病毒體)自GSH層析管柱溶離。與UC Pure相比，GSH溶離使得VP0/VP4比率降低10倍，表明成熟病毒粒子純度高。

圖6A-B：GSH親和力溶離物之蔗糖梯度表徵。將1 mL樣本裝載至15-42% w/v蔗糖梯度，且以230,000 g旋轉100分鐘。取12×1 mL級分，空衣殼(原衣殼或降解的A粒子)預期在級分5-8中，而完整衣殼(成熟病毒體或原病毒體)預期在級分9-12中。6A：GSH親和性層析純化溶離物之使用銀染的還原性12%丙烯醯胺Bis-Tris SDS-PAGE。可偵測到病毒蛋白條帶VP1-VP2-VP3 (VP4圖中未示)，未偵測到VP0及空衣殼。6B：使用抗VP1多株抗體之毛細管電泳定量西方墨點法(Protein Simple)在蔗糖梯度級分中之總粒子分佈。GSH親和性層析溶離物含有完整的成熟病毒體群，約占總粒子之99.8%。

圖7：藉由使用抗BSA初級抗體之毛細管電泳定量西方墨點法(Protein Simple)偵測之跨越GSH親和性層析級分的BSA清除率。相對於澄清收穫樣本之BSA質量%藉由樣本中BSA之質量除以澄清收穫物中BSA之初始質量來計算。

圖8：使用GSH Robocolumn及Tecan Freedom EVO 150之組9(參見表3)之GSH親和性層析層析圖操作的例示性層析圖。展示280 nm處之吸光度(實線)及估計的NaCl濃度(虛線)跡線。上圖表示完整的層析圖。下圖為上圖虛線框內所描繪的，表示洗滌、溶離及洗提步驟。溶離份在~61-CV取樣。

圖9A-B：多種腸病毒血清型之GSH親和性層析純化之使用銀染的還原性12%丙烯醯胺Bis-Tris SDS-PAGE。展示所評估之腸病毒株(1-9)及標記之澄清細胞培養收穫物(圖9A)及GSH溶離份(圖9B)的影像。在埃可病毒1 (1)、鼻病毒1B (2)、鼻病毒35 (3)、科沙奇病毒A 13 (4)、科沙奇病毒A 15 (5)、科沙奇病毒A 18 (6)、科沙奇病毒A 20b (7)及科沙奇病毒A 21 (8、9)之GSH溶離中可偵測腸病毒衣殼病毒蛋白(VP)條帶。

圖10：在不同上游條件下產生之CVA21之GSH親和性層析之使用銀染的還原性12%丙烯醯胺Bis-Tris SDS-PAGE。展示實驗組1-5之澄清本體(CB)預稀釋100倍及GSH溶離(GSH)裝載之純樣本。GSH溶離樣本中之病毒蛋白(VP)條帶鑑別為VP0、VP1、VP2及VP3。組A、C及D中偵測到較高VP0，表明跨越GSH層析步驟的空原衣殼清除率存在差異。

圖11：相對於經超速離心純化之病毒，用抗VP4 pAb偵測之來自組1-5之澄清收穫物及GSH溶離樣本之毛細管電泳定量西方VP0/VP4信號比的比較。在GSH溶離樣本中觀察到的VP0/VP4比所估計之空原衣殼/完整成熟病毒粒子比的差異表明跨越GSH層析步驟之空原衣殼清除率的差異。

圖12：描述一種可擴展且穩健的腸病毒純化製程，涉及細胞培養收穫物之澄清、收穫前視情況存在之溶解步驟、GSH親和性層析步驟、視情況存在之陰離子交換(AEX)精製層析步驟、溶液調整、陽離子交換(CEX)層析步驟、使用切向流過濾(TFF)或尺寸排阻層析(SEC)之緩衝液交換步驟及最終過濾步驟。展示各單元操作中轉入下一步驟之產物的樣本名稱。

圖13：使用批次4為例，藉由GSH、AEX、溶液調整、CEX、TFF及過濾步驟產生經純化之病毒的圖12中純化製程之使用銀染的還原性12%丙烯醯胺Bis-Tris SDS-PAGE。所有樣本均純淨裝載。在GSH溶離、AEX FT及CEX進料樣本中偵測到VP0，但在CEX溶離中清除。CEX條帶主要含有空原衣殼，VP0含量高。最終純化之病毒具有高純度，僅偵測到VP1、VP2、VP3條帶。

圖14：批次1-4之GSH溶離樣本、CEX溶離樣本及經純化之病毒樣本的使用銀染的還原性12%丙烯醯胺Bis-Tris SDS-PAGE。樣本裝載量藉由體積濃度因數標準化。批次1-3之GSH步驟清除VP0，但批次4中保留一些VP0。如圖14所示，CEX步驟清除空原衣殼，且批次1-4之最終純化之病毒樣本均具有類似的病毒蛋白分佈及高純度。在UC純化樣本中可偵測到微弱的VP0條帶。

圖15：相對於經超速離心純化之病毒，用抗VP4 pAb偵測之來自批次1-4之澄清收穫樣本、GSH溶離樣本及經純化之病毒樣本之毛細管電泳定量西方VP0/VP4信號比的比較。批次1-3空原衣殼跨越GSH步驟清除，而批次4空原衣殼跨越CEX步驟清除。批次1-4經純化之病毒空原衣殼/完整成熟病毒粒子比均比經超速離心純化之病毒低約10倍。

圖16：在H-Class BIOshell C4管柱(Waters)上使用乙腈梯度逆相所偵測之批次1經純化之病毒的例示性RP-HPLC層析圖。如藉由質譜分析所確認，鑑別出病毒蛋白(VP1-4)。藉由VP0:VP2峰面積比估算空原衣殼與完整成熟病毒體之比。

圖17：批次1-4及經超速離心純化之病毒(UC Pure)之基因體(RT-qPCR)及粒子(HPSEC)與感染性(空斑)之比。分析結果參見表6。

圖18：展示批次4經純化之病毒樣本中VP1、VP2、VP3及VP4之分離及相對遷移時間的例示性CE-SDS電泳圖。

Claims (49)

1. 一種包含經純化之科沙奇病毒(Coxsackievirus)A 21 (CVA21)之組合物，其包含VP0、VP1、VP2、VP3、VP4及CVA21 RNA，其中VP0與VP2之比值小於約0.01。
2. 如請求項1之組合物，其中該VP0與VP2之比值為約0.0005-0.005。
3. 如請求項1之組合物，其中該VP0與VP2之比值為約0.001-0.003。
4. 一種包含經純化之CVA21的組合物，其中基因體與感染性之比值小於約5000基因體/pfu。
5. 如請求項4之組合物，其中該基因體與感染性之比值為約200-2000基因體/pfu。
6. 如請求項4之組合物，其中該基因體與感染性之比值為約200-800基因體/pfu。
7. 一種包含經純化之CVA21的組合物，其中粒子與感染性之比值小於約5000粒子/pfu。
8. 如請求項7之組合物，其中該粒子與感染性之比值為約200-2000粒子/pfu。
9. 如請求項7之組合物，其中該粒子與感染性之比值為約200-600粒子/pfu。
10. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中VP1+VP2+VP3+VP4總峰面積/總峰面積為至少95%。
11. 如請求項1至10中任一項之組合物，其中該組合物中宿主細胞DNA之量小於約10,000 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。
12. 如請求項1至10中任一項之組合物，其中該組合物中該宿主細胞DNA之量為約0.05-10 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。
13. 如請求項1至12中任一項之組合物，其中該組合物中牛血清白蛋白之量小於約50,000 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。
14. 如請求項1至12中任一項之組合物，其中該組合物中該牛血清白蛋白之量為約50-150 pg/劑量，每劑量約5E7 pfu CVA21。
15. 如請求項1至14中任一項之組合物，其中該CVA21包含SEQ ID NO: 1中之核苷酸序列。
16. 如請求項1至15中任一項之組合物，其中該組合物之效力為1E5至1E12 TCID₅₀ /ml或pfu/ml。
17. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至16中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
18. 一種如請求項17之醫藥組合物在製造用於治療患者之癌症之藥物中的用途，其中該藥物用於向該患者瘤內投與，每次治療劑量為至多約3E8 TCID₅₀ 或5E7 pfu。
19. 如請求項18之用途，其中該每次治療劑量為約3E7至約3E8 TCID₅₀ 或約5E6至約5E7 pfu。
20. 一種以如請求項17之醫藥組合物在製造用於治療患者之癌症之藥物中的用途，其中該藥物用於向該患者靜脈內投與，每次治療劑量為約1E9 TCID₅₀ 或1.5E8 pfu。
21. 一種純化腸病毒之方法，其包含以下步驟： (a)    使用裝載溶液將該腸病毒與固定相結合，其中讓穀胱甘肽固定在該固定相上； (b)    使用溶離溶液自該固定相溶離該腸病毒。
22. 如請求項21之方法，其中在步驟(a)之前，該固定相使用平衡溶液進行平衡。
23. 如請求項21或22之方法，其進一步在步驟(a)之後且在步驟(b)之前包含步驟(i)，使用一或多種洗滌溶液洗滌該固定相。
24. 如請求項23之方法，其中步驟(i)包含用電導率高於該平衡溶液或裝載溶液之洗滌溶液進行第一洗滌步驟。
25. 如請求項24之方法，其中步驟(i)包含用電導率低於該第一洗滌步驟之洗滌溶液的洗滌溶液進行第二洗滌步驟。
26. 如請求項25之方法，其中該溶離溶液之電導率與該第二洗滌步驟之洗滌溶液相同。
27. 如請求項21至26中任一項之方法，其中該裝載溶液、平衡溶液、該一或多種洗滌溶液及該溶離溶液中之一或多者的pH值為約5-10。
28. 如請求項21至27中任一項之方法，其中該裝載溶液、平衡溶液、該一或多種洗滌溶液及該溶離溶液中之一或多者的pH值為約6-9。
29. 如請求項21至28中任一項之方法，其中該裝載溶液、平衡溶液、該一或多種洗滌溶液及該溶離溶液中之一或多者進一步包含界面活性劑。
30. 如請求項29之方法，其中該界面活性劑為PS-80或PS-20。
31. 如請求項29之方法，其中該界面活性劑為約0.001-1% w/v PS-80。
32. 如請求項29之方法，其中該界面活性劑為約0.001-0.1 % w/v PS-80。
33. 如請求項21至32中任一項之方法，其中該裝載溶液或平衡溶液包含約50-200 mM單價鹽。
34. 如請求項21至32中任一項之方法，其中該一或多種洗滌溶液包含約50-500 mM單價鹽。
35. 如請求項21至32中任一項之方法，其中第一洗滌溶液包含約350-500 mM NaCl或KCl，且第二洗滌溶液包含約50-200 mM NaCl或KCl。
36. 如請求項21至35中任一項之方法，其中該溶離溶液包含約50-500 mM單價鹽。
37. 如請求項21至35中任一項之方法，其中該溶離溶液包含約50-200 mM NaCl或KCl。
38. 如請求項21至37中任一項之方法，其中該溶離溶液包含約0.1-100 mM穀胱甘肽。
39. 如請求項21至37中任一項之方法，其中該溶離溶液包含約0.1-25 mM穀胱甘肽。
40. 如請求項21至37中任一項之方法，其中該溶離溶液包含約0.5-5 mM穀胱甘肽及75-150 mM NaCl或KCl。
41. 如請求項21至40中任一項之方法，其中該洗滌或溶離溶液進一步包含EDTA、DTT及2-巰基乙醇中之一或多者。
42. 一種純化腸病毒之方法，其包含以下步驟： (a)    使用裝載溶液將該腸病毒裝載至陰離子交換管柱， (b)    從流出物中收集該腸病毒。
43. 如請求項42之方法，其中該裝載溶液包含約50-500 mM單價鹽濃度，pH值為約6-9。
44. 如請求項21至43中任一項之方法，其中純化完全成熟腸病毒。
45. 如請求項21至44中任一項之方法，其中該腸病毒為B或C型腸病毒。
46. 如請求項21至45中任一項之方法，其中該腸病毒為埃可病毒(Echovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)A、B或C。
47. 如請求項21至44中任一項之方法，其中該腸病毒為埃可病毒1、鼻病毒1B、鼻病毒35、科沙奇病毒A 13 (CVA13)、科沙奇病毒A 15 (CVA15)、科沙奇病毒A 18 (CVA18)、科沙奇病毒A 20 (CVA20)、科沙奇病毒A 21 (CVA21)或科沙奇病毒A 24 (CVA24)。
48. 如請求項21至44中任一項之方法，其中該腸病毒為CVA1、CVA11、CVA13、CVA15、CVA17、CVA18、CVA19、CVA20a、CVA20b、CVA20c、CVA21、CVA22或CVA24。
49. 如請求項48之方法，其中該腸病毒為CVA21。

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