CN114829589A

CN114829589A - 纯化的肠道病毒的组合物和使用谷胱甘肽亲和色谱的纯化方法

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Publication number: CN114829589A
Application number: CN202080087889.5A
Authority: CN
Inventors: E·M·柯蒂斯; S·康斯坦蒂尼迪斯; M·珀普里克; A·R·斯沃茨; M·D·温格
Original assignee: Merck Sharp and Dohme Ltd
Current assignee: Organon Pharma UK Ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2022-07-29
Also published as: US20210187049A1; BR112022012221A2; WO2021127155A1; AU2020405026A1; JP2023510133A; EP4077644A1; KR20220122678A; TW202138556A; AR120794A1; CA3162365A1; MX2022007679A

Abstract

本发明涉及纯化的肠道病毒的组合物、其药物组合物和用于纯化肠道病毒的谷胱甘肽亲和色谱方法。

Description

纯化的肠道病毒的组合物和使用谷胱甘肽亲和色谱的纯化方法

发明领域

本发明涉及纯化的肠道病毒的组合物和用于纯化肠道病毒的谷胱甘肽亲和色谱方法。

电子提交的序列表的引用

本申请的序列表经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为24943WOPCT-SEQLIST-17NOV2020.txt，创建日期为2020年11月17日，大小为17.6kb。经由EFS-Web提交的该序列表是说明书的一部分，并且通过引用整体并入本文。

发明背景

小核糖核酸病毒科的肠道病毒属是小型、无包膜、单链正义RNA病毒，其含有几种人类病原体，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、编号肠道病毒和鼻病毒[1]。除了充分研究的脊髓灰质炎病毒之外，已经涌现针对非脊髓灰质炎肠道病毒引起的疾病的疫苗和治疗剂的开发研究，所述非脊髓灰质炎肠道病毒例如EV-A71(手足口病)[2]、EV-D68(呼吸系统疾病)和柯萨奇病毒A24(急性出血性结膜炎)[3]。肠道病毒也已被评估用作溶瘤病毒免疫疗法[4]。来自野生型菌株的柯萨奇病毒A21(CVA21)由于其选择性感染和对过表达细胞表面受体ICAM-1的肿瘤的溶瘤作用，目前正在作为多种类型癌症的治疗在1b/2期临床试验中进行评估[5]。

对肠道病毒病毒疫苗和免疫疗法的不断增加的需求可能挑战常规生产平台。梯度超速离心通常用于富集完整的、含有基因组的衣壳和杂质清除，但是由于其低通量和劳动密集型方案，可能是纯化过程中的潜在瓶颈[6](图1A)。如重组腺相关病毒基因疗法纯化平台所证明的，从梯度超速离心向基于色谱的方法的转变可以提高可扩展性和生产率[7]。尚未证明色谱技术用于空(缺乏基因组；产物杂质)和完整(含有基因组；靶标产物)的肠道病毒颗粒分离。仍然需要基于色谱的梯度超速离心的替代方案，其能够除去空衣壳和污染杂质，以产生感染性的成熟病毒体的纯化组合物。这将使得肠道病毒纯化方法更适合于大规模工业生产。

发明简述

本发明提供纯化的CVA 21的组合物，其中基因组与感染性的比率小于约5000基因组/pfu；所述颗粒与感染性的比率小于约5000个颗粒/pfu；通过反相HPLC或UPLC测量的，VP0与VP2的比率小于约0.01；或通过CE-SDS测量的，总VP1+VP2+VP3+VP4峰面积/总峰面积为至少95％。本发明还提供包含上述纯化的组合物的药物组合物。本发明还提供通过施用本发明的药物组合物治疗癌症的方法。另一方面，本发明提供谷胱甘肽亲和色谱从一种或多种杂质中纯化肠道病毒的用途。在一个实施方案中，所述方法从感染的宿主细胞培养收获物中选择性捕获和富集含有基因组的完全成熟肠道病毒病毒体，从而除去一种或多种杂质，例如非感染性基因组缺乏的肠道病毒原衣壳、宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA(HC-DNA)和培养基相关杂质，例如牛血清白蛋白(BSA)。本发明还包括阴离子交换色谱从一种或多种杂质中纯化肠道病毒的用途。

附图简述

本发明的前述和其他目的、特征和优点将根据如附图中所示的本发明的各种实施方案的以下更具体的说明变得显而易见。

图1A-B：A：梯度超速离心过程的描述。首先浓缩澄清的细胞培养收获物以减少体积。在超速离心管中制备梯度，且将样品加载到顶部。在离心之后，将梯度分级，并合并所选择的级分。将合并的级分透析以除去梯度溶液。B：GSH亲和色谱过程的描述。将澄清的细胞培养收获物直接加载到GSH亲和柱上。洗涤柱以除去杂质并洗脱纯化的病毒。柱可以再生以备将来使用。

图2：肠道病毒形态发生和组装。由VP0+VP1+VP3组成的五个原聚体组装形成五聚体。空的原衣壳可以由游离五聚体的可逆组装形成。在12个五聚体在复制细胞器上缩合并衣壳化(encapsidate)新合成的基因组以形成原病毒体之后，VP0自催化切割以形成VP4+VP2，并且形成成熟的病毒体。成熟病毒体是唯一含有VP4的颗粒并且能够是感染性的，但是并非所有成熟病毒体都是感染性的。成熟病毒体可降解成A颗粒和A颗粒的空衣壳。改编自[10]。

图3：使用Akta Pure进行GSH亲和色谱色谱图操作且使用CVA21通过UNICORN软件进行分析的的示例性色谱。对于以mL计的GSH亲和色谱操作体积，在280nm处的吸光度(UV1_280，实线)迹线以mAU计，且电导率(Cond，虚线)迹线以mS/cm计。上图表示全色谱图。在上图的虚线框内描绘的下图表示洗涤、洗脱和洗提步骤。

图4：对使用CVA21的GSH亲和色谱法的银染的还原性12％丙烯酰胺Bis-Tris SDS-PAGE。在GSH流过(GSH FT)和洗涤(GSH W1-2)步骤中清除澄清收获物中的宿主细胞和培养基杂质。CVA21以高浓度和纯度(检测到痕量BSA)洗脱，仅观察到VP1-VP2-VP3病毒衣壳条带(VP4(7kDa)从凝胶上洗脱)和最小VP0。将GSH洗脱(GSH洗脱)样品与梯度超速离心纯化(UC纯)的CVA21进行比较。

图5：使用毛细管电泳定量western印迹(Protein Simple)对CVA21澄清收获物和GSH色谱流过(GSH FT)和洗脱(GSH洗脱)样品与超速离心纯化材料(UC纯)的相对比较。通过抗VP1多克隆抗体(pAb)检测总衣壳颗粒，并用抗VP4 pAb检测VP0/VP4信号比。具有高VP0/VP4比率的颗粒(大量含VP0的颗粒：空原衣壳、原病毒体、五聚体、原聚体)流过GSH色谱柱，而具有低VP0/VP4比率的病毒颗粒(大量含VP4的颗粒：仅成熟病毒体)从GSH色谱柱洗脱。与UC纯相比，GSH洗脱导致VP0/VP4比率降低10倍，表明成熟病毒颗粒纯度高。

图6A-B：GSH亲和洗脱的蔗糖梯度表征。将1mL的样品加载至15-42％w/v蔗糖梯度，并以230,000g旋转100min。取出12×1mL级分，空衣壳(原衣壳或降解的A颗粒)预期在级分5-8中，并且全衣壳(成熟病毒体或原病毒体)预期在级分9-12中。6A：对GSH亲和色谱纯化洗脱液的银染的还原性12％丙烯酰胺bis-Tris SDS-PAGE。可检测到病毒蛋白条带VP1-VP2-VP3(VP4未显示)，没有检测到VP0和空衣壳。6B：使用毛细管电泳定量western印迹(ProteinSimple)，用抗VP1多克隆抗体在蔗糖梯度级分中的总颗粒分布。GSH亲和色谱洗脱液含有约99.8％总颗粒的完全成熟病毒体群。

图7：通过用抗BSA一抗抗体的毛细管电泳定量western印迹(Protein Simple)检测的跨GSH亲和色谱级分的BSA清除率。通过样品中BSA的质量除以澄清的收获物中BSA的初始质量计算相对于澄清的收获物样品的BSA质量％。

图8：使用GSH Robocolumn和Tecan Freedom EVO 150的组9(参见表3)的GSH亲和色谱色谱图操作的示例性色谱图。显示了在280nm处的吸光度(实线)和估计的NaCl浓度(虚线)迹线。上图表示全色谱图。在上图的虚线框内描绘的下图，表示洗涤、洗脱和洗提步骤。洗脱级分在～61-CV取样。

图9A-B：对GSH亲和色谱纯化多种肠道病毒血清型的银染的还原性12％丙烯酰胺bis-Tris SDS-PAGE。显示了评价的肠病毒株(1-9)的澄清的细胞培养收获物(图9A)和GSH洗脱级分(图9B)的图像和标记。在埃可病毒1(1)、鼻病毒1B(2)、鼻病毒35(3)、柯萨奇病毒A13(4)、柯萨奇病毒A15(5)、柯萨奇病毒A18(6)、柯萨奇病毒A 20B(7)和柯萨奇病毒A 21(8,9)的GSH洗脱中可检测到的肠道病毒衣壳病毒蛋白(VP)条带。

图10：对不同上游条件产生的CVA 21的GSH亲和色谱的银染的还原性12％丙烯酰胺Bis-Tris SDS-PAGE。对于实验组1-5，显示了澄清的主体(CB)预稀释的100×和GSH洗脱(GSH)加载的纯样品。GSH洗脱样品中的病毒蛋白(VP)条带鉴定为VP0、VP1、VP2和VP3。在A组、C组和D组中检测到较高的VP0表明在整个GSH色谱步骤中空原衣壳清除率的差异。

图11：相对于超速离心纯化的病毒，用抗VP4 pAb检测的来自组1-5的澄清收获物和GSH洗脱样品的毛细管电泳定量western VP0/VP4信号比的比较。通过在GSH洗脱样品中观察到的VP0/VP4比率估计的空原衣壳/完全成熟病毒颗粒比率的差异表明跨越GSH色谱步骤中空原衣壳清除率的差异。

图12：描述了可规模化且稳健的肠道病毒纯化方法，其包括细胞培养收获物的澄清、收获之前任选的裂解步骤、GSH亲和色谱步骤、任选的阴离子交换(AEX)精制色谱步骤、溶液调节、阳离子交换(CEX)色谱步骤、使用切向流过滤(TFF)或尺寸排阻色谱(SEC)的缓冲液交换步骤和最终过滤步骤。显示了从各个单元操作转到下一步骤的产品的样品名称。

图13：使用批次4作为实例，用GSH、AEX、溶液调节、CEX、TFF和过滤步骤以产生纯化的病毒，对图12中纯化过程的银染的还原性12％丙烯酰胺Bis-Tris SDS-PAGE。所有样品均以纯净形式加载。在GSH洗脱、AEX FT和CEX进料样品中检测到VP0，但是在CEX洗脱中清除。CEX条带主要含有具有高VP0含量的空原衣壳。最终纯化的病毒具有高纯度，仅检测到VP1、VP2、VP3条带。

图14：对来自批次1-4的GSH洗脱、CEX洗脱和纯化的病毒样品的银染的还原性12％丙烯酰胺Bis-Tris SDS-PAGE。通过体积浓度因子归一化样品加载。来自批次1-3的GSH步骤清除VP0，但一些VP0保留在批次4中。如图14所示，CEX步骤清除空的原衣壳，并且来自批次1-4的最终纯化的病毒样品均具有相似的病毒蛋白分布和高纯度。在UC纯样品中可检测到微弱的VP0条带。

图15：相对于超速离心纯化的病毒，用抗VP4 pAb检测的来自批次1-4的澄清收获物、GSH洗脱和纯化的病毒样品的毛细管电泳定量western VP0/VP4信号比的比较。在GSH步骤中清除批次1-3的空原衣壳，而在CEX步骤中清除批次4的空原衣壳。批次1-4纯化的病毒空原衣壳/完全成熟病毒颗粒比率均比超速离心纯化的病毒低～10倍。

图16：如在H-Class BIOshell C4柱(Waters)上使用乙腈梯度反相检测的批次1纯化的病毒的示例性RP-HPLC色谱图。鉴定了病毒蛋白(VP1-4)，如通过质谱确认的。通过VP0:VP2峰面积比估计空原衣壳与完全成熟病毒体的比率。

图17：批次1-4和超速离心纯化的病毒(UC纯)的基因组(RT-qPCR)和颗粒(HPSEC)与感染性(空斑)的比率。分析结果参见表6。

图18：示例性的CE-SDS电泳图，显示批次4纯化的病毒样品中VP1、VP2、VP3和VP4的分离和相对迁移时间。

发明详述

亲和色谱是用于使用固定在固定相上的亲和配体从杂质的复杂溶液中选择性结合和纯化靶蛋白或生物分子的纯化方法。由于固定化的谷胱甘肽配体与GST融合蛋白的相互作用[9]，谷胱甘肽(GSH)亲和色谱最初被开发用于纯化重组谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标记的蛋白质，但不用于未标记的生物分子，例如不含GST或任何类似的蛋白质序列的肠道病毒。在本文中，我们证明了GSH亲和色谱用于纯化完全成熟的肠道病毒(例如CVA 21)病毒体的用途。

纯化的完全成熟CVA 21病毒特异性结合谷胱甘肽树脂，并且可通过竞争性置换或高电导率的溶液用游离的还原型谷胱甘肽洗脱。使用GSH亲和色谱程序，在含血清培养基中从澄清的感染宿主细胞培养收获物中直接纯化CVA21，具有高感染率(>100％)和杂质清除率(>99.9％BSA和HCP减少)。出乎意料地，发现在谷胱甘肽色谱洗脱中富集了成熟CVA21病毒体，并且空CVA21原衣壳在加载步骤期间流过。在较低pH下，以结合和洗脱模式操作的另外的阳离子交换色谱步骤也可提供空原衣壳和残留杂质的进一步清除。

定义

为了更容易理解本发明，下面具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文件中其他地方特别地定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

除非上下文另有明确的规定，否则如本文(包括附加权利要求书)使用的词语的单数形式例如“一”、“一个”和“该(所述)”包括其相应的复数指代。

当修饰量(例如mM或M)、效力(基因组/pfu、颗粒/pfu)、纯度(ng/ml)、物质或组合物的比率、溶液的pH或表征方法中的步骤的参数值等时，术语“约”指可能出现的数量变化，例如通过物质或组合物的制备、表征和/或使用中涉及的典型测量、处理和采样程序；通过这些程序中的仪器误差；通过用于制备或使用组合物或执行所述程序的成分的制备、来源或纯度的差异；等。在某些实施方案中，“约”可以指±0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％的变化。

如本文使用的“x％(w/v)”相当于x g/100mL(例如，5％w/v等于50mg/ml)。

“CVA21”指柯萨奇病毒A 21。本领域技术人员应当理解，病毒在培养、传代或繁殖时可能经历突变。CVA 21可含有这些突变。CVA 21的实例包括但不限于Kuykendall菌株(GenBank登录号AF 546702和AF 465515)和具有或不具有突变(例如，SEQ ID NO：1，或具有位置7274为C和/或位置7370为U的SEQ ID NO：1)的Coe菌株(Lennette等人，Am JHyg.1958Nov；68(3)：272-87)。CVA 21可以是不具有或者具有一个或多个这些突变的同源或异源群体。

当提及肠道病毒的属或种时，本领域技术人员应当理解，病毒在培养、传代或繁殖时可能经历突变。肠道病毒可含有这些突变。特定肠道病毒的实例包括但不限于GenBank或UnitPro数据库中列出的具有或不具有突变的那些。肠道病毒可以是不具有或者具有一个或多个这些突变的同源或异源群体。

“基因组与感染性的的比率”指如通过基因组RT-qPCR测定法测量的CVA21 RNA基因组(基因组/ml)除以如通过空斑测定法测量的感染性(pfu/ml)。病毒空斑测定法确定病毒样品中空斑形成单位(pfu)的数量。本领域技术人员可以开发各种空斑测定法以确定感染细胞系后CVA 21的感染性(pfu/ml)。在一个实施方案中，细胞系是SK-MEL-28细胞系(ATTC保藏HTB-72)。空斑测定法的实例提供在实施例6中。基因组RT-qPCR测定法使用RT-qPCR方法，用靶向CVA 21病毒蛋白基因的引物和探针，测量每ml的基因组拷贝数(例如实施例6)。

“颗粒与感染性的比率”指如通过HPSEC测定法测量的CVA21RNA基因组(颗粒/ml)除以如通过空斑测定法测量的感染性(pfu/ml)。病毒空斑测定法确定病毒样品中空斑形成单位(pfu)的数量。本领域技术人员可以开发各种空斑测定法以确定感染细胞系后CVA 21的感染性(pfu/ml)。在一个实施方案中，细胞系是SK-MEL-28细胞系(ATTC保藏HTB-72)。空斑测定法的实例提供在实施例6中。病毒HPSEC测定法确定CVA 21的颗粒浓度(颗粒/ml)。该测定法的实例提供在实施例6中。

“VP0与VP2的比率”指通过反相HPLC或UPLC方法测定的CVA21 VP0蛋白和VP2蛋白的峰面积的比率。该方法的实例描述在实施例6中。

“固定相”指一个或多个谷胱甘肽配体可以固定在其上的任何表面。固定相可以是悬浮液、纯化柱、离散颗粒的不连续相、板、传感器、芯片、胶囊、柱筒、树脂、珠粒、整料、凝胶、膜或过滤器等。用于形成固定相的材料的实例包括机械稳定的基质，例如多孔或无孔珠粒、无机材料(例如多孔二氧化硅、可控孔径玻璃(CPG)和羟基磷灰石)、合成的有机聚合物(例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒和任何上述物质的衍生物)和多糖(例如纤维素、琼脂糖和葡聚糖)。参见Jansson,J.C.；Rydén,L.Protein Purification；Wiley:New York,1998。

肠道病毒与固定相“结合”指在适当条件(pH和/或电导率)下将目标肠道病毒暴露于固定相，使得肠道病毒通过肠道病毒与固定相上固定的谷胱甘肽之间的相互作用与固定相可逆地缔合。

术语“平衡溶液”指在将肠道病毒加载到固定相上之前平衡固定相的溶液。平衡溶液可包含盐和缓冲剂中的一种或多种，以及任选的表面活性剂。在一个实施方案中，平衡溶液具有与包含肠道病毒的加载溶液相同的条件。

术语“加载溶液”是用于将包含目标肠道病毒和一种或多种杂质的组合物加载到固定相上的溶液。加载溶液可以任选地进一步包含缓冲剂、盐和表面活性剂中的一种或多种。

当在本文中使用时，术语“洗涤溶液”指用于在洗脱目标肠道病毒之前洗涤或重新平衡固定相的溶液。对于洗涤，洗涤溶液的电导率和/或pH使得杂质(例如空的肠病毒原衣壳、BSA或HCP等)从固定相中除去。对于再平衡，洗涤溶液和洗脱溶液可以是相同的，但这不是必需的。洗涤溶液可包含盐和缓冲液中的一种或多种，以及任选的表面活性剂和/或还原剂，例如PS-80和/或DTT。

“洗脱溶液”是用于从固定相洗脱目标肠道病毒的溶液。洗脱溶液可包含盐、缓冲液和游离还原型谷胱甘肽中的一种或多种，任选的表面活性剂和/或还原剂如DTT。洗脱溶液的游离还原型谷胱甘肽(GSH)、盐、缓冲液中的一种或多种的存在使得从固定相洗脱目标肠道病毒。

“洗提溶液”是用于在再生柱以供再使用之前从固定相解离强结合组分的溶液。洗提溶液具有从固定相中基本上除去所有杂质和肠道病毒所需的电导率和/或pH。洗提溶液可包含盐、缓冲剂和GSH中的一种或多种，以及任选的表面活性剂和/或还原剂。

术语“电导率”是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传输流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液将具有更高的电导率。电导率的测量单位是mS/cm，并且可以使用例如GE Healthcare Akta系统内销售的电导率计测量。可以通过改变其中的离子浓度来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如NaCl或KCl)的浓度，以实现期望的电导率。优选地，改变各种缓冲液的盐浓度以实现如以下实施例中所述的期望电导率。

“纯化”目标肠道病毒或“纯化的组合物”指通过从组合物中(完全或部分地)除去至少一种杂质来增加组合物中肠道病毒的纯度。杂质可以是空的原衣壳、BSA、宿主细胞组分如血清、蛋白质或核酸、细胞碎片、生长培养基等。该术语不旨在指完全不存在这样的生物分子或者不存在水、缓冲剂或盐或不存在包含肠道病毒的药物制剂的组分。

如本文使用的“谷胱甘肽固定在固定相上”指谷胱甘肽通过一个或多个反应性基团的缀合共价连接到固定相上。在一个实施方案中，谷胱甘肽固定相是通过谷胱甘肽的硫醇基缀合到与固定相的谷胱甘肽。

“表面活性剂”是本质上具有两亲性的表面活性试剂。

“成熟病毒体”、“完全成熟病毒体”、“完全成熟病毒”或“完全成熟病毒颗粒”、“完全成熟肠道病毒”、“成熟肠道病毒”、“成熟病毒颗粒”指如图2中所述的成熟肠道病毒病毒体[(VP4-VP2-VP3-VP1)₅]₁₂+RNA。CVA21 VP1-VP4序列的实例描述在表11中。

根据图2，“空衣壳”指原衣壳[(VP0-VP3-VP1)]₅]₁₂或降解的α-颗粒[(VP2-VP3-VP1)₅]₁₂。CVA 21的VP0序列的实例在UnitPro数据库登录号P22055中。

“完整衣壳”指如图2中描述的成熟病毒体或原病毒体[(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂+RNA。

“总VP1+VP2+VP3+VP4峰面积/总峰面积”是毛细管电泳(CE)-SDS电泳图中CVA21的VP1、VP2、VP3和VP4病毒蛋白的峰面积之和除以总峰面积(高于检测限的所有可定量峰的峰面积)。CE-SDS方法的实例在实施例6中。

“杂质”指不同于期望的肠道病毒的物质。杂质可以是血清(即BSA)、宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA(HC-DNA)、非感染性病毒相关颗粒，包括含VP0的肠道病毒(原聚体、五聚体、原病毒体、原衣壳)、含VP2的肠道病毒(α-颗粒或降解的α-颗粒)。在一个实施方案中，期望的肠道病毒是完全成熟肠道病毒(例如完全成熟CVA 21)。

“TCID₅₀/mL”(组织培养物感染剂量50％/mL)指由接种物感染50％的靶培养物时的稀释度确定的接种物中感染性生物体的浓度。CVA21的TCID₅₀测定的实例提供在实施例6中。

如本文使用的“治疗(treat)”或“处理(treating)”癌症指将本发明的药物组合物施用于患有癌症或诊断患有癌症的受试者，以获得至少一种积极的治疗效果，例如癌细胞数量减少、肿瘤尺寸减小、癌细胞浸润到外周器官中的速率降低或者肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低。可以以多种方式测量癌症中的积极治疗效果(参见W.A.Weber,J.Nucl.Med.50:1S-10S(2009))。

如本文使用的“每次治疗”指在一天内向患者施用本发明的药物组合物。药物组合物可以每天、间歇地(每周几天、每周一次、每两周一次、每三周一次等)施用。

CVA21的组合物和药物组合物

本发明还提供纯化的CVA 21的组合物和可药用赋形剂的药物组合物。CVA21可以是包含完全成熟CVA21病毒体[(VP4-VP2-VP3-VP1)₅]₁₂+RNA、空原衣壳[(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂、降解的A-颗粒[(VP2-VP3-VP1)₅]₁₂、A-颗粒[(VP2-VP3-VP1)₅]₁₂+RNA、原病毒体[(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂+RNA、原聚体(VP0-VP3-VP1)₁和五聚体(VP0-VP3-VP1)₅的混合物。在一个实施方案中，CVA 21包含完全成熟的CVA 21病毒体[(VP4-VP2-VP3-VP1)₅]₁₂+RNA。在一个实施方案中，CVA 21包含完全成熟的CVA 21病毒体[(VP4-VP2-VP3-VP1)₅]₁₂+RNA和空原衣壳[(VP0-VP3-VP1)₅]₁₂。

在一个实施方案中，组合物的基因组与感染性的比率小于约5000基因组/pfu。在一个实施方案中，组合物的基因组与感染性的比率小于约4000基因组/pfu。在一个实施方案中，组合物的基因组与感染性的比率小于约3000基因组/pfu。在一个实施方案中，组合物的基因组与感染性的比率小于约2000基因组/pfu。在一个实施方案中，组合物的基因组与感染性的比率小于约1000基因组/pfu。在一个实施方案中，基因组与感染性的比率为约200-2000基因组/pfu。在一个实施方案中，组合物的基因组与感染性的比率小于约800基因组/pfu。在一个实施方案中，基因组与感染性的比率为约400-700基因组/pfu。在另一个实施方案中，基因组与感染性的比率为约400-800基因组/pfu。本发明还提供CVA 21的组合物，其中颗粒与感染性的比率小于约5000颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约4000颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约3000颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约2000颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约1000颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约900颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约800颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约700颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约600颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率小于约500颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率为约200-600颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率为约200-500颗粒/pfu。在一个实施方案中，颗粒与感染性的比率为约200-800颗粒/pfu。

本发明提供纯化的CVA 21的药物组合物，其中VP0与VP2之比小于约0.01。在一个实施方案中，VP0与VP2之比为约0.0005-0.01。在一个实施方案中，VP0与VP2之比为约0.0005-0.005。在另一个实施方案中，VP0与VP2之比为约0.001-0.003。在另一个实施方案中，总VP1+VP2+VP3+VP4峰面积/总峰面积为至少95％。在一个实施方案中，宿主细胞DNA小于约10ng/ml。在另一个实施方案中，宿主细胞DNA小于约0.5ng/ml。在另一个实施方案中，组合物中宿主细胞DNA的量小于约10,000pg/剂量，每剂量约5E7 pfu CVA 21。在另一个实施方案中，组合物中宿主细胞DNA的量为约0.05-10,000pg/剂量，每剂约5E7pfu CVA 21。在另一个实施方案中，组合物中宿主细胞DNA的量为约0.05-10pg/剂量，每剂量约5E7 pfuCVA 21。在另一个实施方案中，组合物中宿主细胞DNA的量为约0.05-1pg/剂量，每剂量约5E7 pfu CVA 21。在另一个实施方案中，组合物中宿主细胞DNA的量为约100-10,000pg/剂，每剂量约5E7 pfu CVA 21。在另一个实施方案中，组合物中牛血清白蛋白的量小于约10ng/ml。在一个实施方案中，牛血清白蛋白小于约50,000pg/剂量，每剂量约5E7 pfu CVA 21。在另一实施方案中，牛血清白蛋白为约500-50,000pg/剂量，每剂量约5E7 pfu CVA 21。在另一个实施方案中，牛血清白蛋白为约50-100或50-150pg/剂量，每剂量约5E7 pfu CVA 21。在另一个实施方案中，牛血清白蛋白小于约150pg/剂量，每剂量约5E7 pfu CVA 21。

本公开的可药用赋形剂包括例如溶剂、填充剂、缓冲剂、张力调节剂和防腐剂(参见例如，Pramanick等人,Pharma Times,45：65-77,201 3)。在一些实施方案中，药物组合物可包含赋形剂，其作为溶剂、填充剂、缓冲剂和张力调节剂中的一种或多种的发挥作用(例如，盐水中的氯化钠可充当水性载体和张力调节剂)。

在一些实施方案中，药物组合物包含水性媒介物作为溶剂。合适的媒介物包括例如无菌水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水和林格氏溶液。在一些实施方案中，组合物是等渗的。

药物组合物可包含填充剂。当药物组合物在施用之前冻干时，填充剂特别有用。在一些实施方案中，填充剂是保护剂，其有助于在冷冻或喷雾干燥期间和/或在储存期间稳定和防止活性剂的降解。合适的填充剂是糖(单糖、二糖和多糖)，例如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖和棉子糖。

药物组合物可包含缓冲剂。缓冲剂控制pH以抑制活性剂在加工、储存和任选地重构期间的降解。合适的缓冲剂包括例如包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐的盐。其他合适的缓冲剂包括例如氨基酸，例如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。缓冲剂可进一步包含盐酸或氢氧化钠。在一些实施方案中，缓冲剂将组合物的pH保持在4至9的范围内。在一些实施方案中，pH大于(下限)4、5、6、7或8。在一些实施方案中，pH小于(上限)9、8、7、6或5。也就是说，pH在约4至9的范围内，其中下限小于上限。

药物组合物可包含张力调节剂。合适的张力调节剂包括例如右旋糖、甘油、氯化钠、甘油和甘露醇。

药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂包括例如抗氧化剂和抗微生物剂。然而，在优选的实施方案中，药物组合物是在无菌条件下制备并且在一次性容器中，因此不需要包含防腐剂。

在一个方面，药物组合物用于肿瘤内施用。在另一个实施方案中，药物组合物用于膀胱内施用。在一个实施方案中，每次治疗的剂量多至约3E8 TCID₅₀或约5E7 pfu，这取决于肿瘤的大小、位置和数量。在另一个实施方案中，每次治疗的剂量为约3E7至3E8 TCID₅₀或约5E6至5E7 pfu。增加或最大化病毒在整个肿瘤中的分布的注射技术可以提供改善的治疗结果。例如，在黑素瘤和其他实体瘤的治疗中，可以以剂量超分割模式(dose hyper-fractionpattern)注射多个病灶，从最大病灶开始(2.0mL注射到＞2.5cm的肿瘤中，1.0mL注射到1.5至2.5cm，0.5mL注射到0.5至1.5cm)至最大4.0mL。在初始注射CVA 21之后，直径减小至＜0.5cm的任何经注射的病灶可按照治疗方案注射0.1ml的CVA21直至病灶完全消退。在另一个实施方案中，药物组合物用于静脉内施用。在一个实施方案中，每次治疗的剂量为约1E9TCID₅₀或约1.5E8 pfu。

在另一方面，药物组合物具有约1E5至1E12 TCID₅₀/ml或pfu/ml的效力。在一个实施方案中，药物组合物具有约1E6至1E12 TCID₅₀/ml或pfu/ml的效力。在一个实施方案中，药物组合物具有约1E7至1E11TCID₅₀/ml或pfu/ml的效力。在一个实施方案中，药物组合物具有约1E7至8E7 TCID₅₀/ml的效力。在一个实施方案中，药物组合物具有约5E7至8E7 TCID₅₀/ml的效力。在一个实施方案中，药物组合物具有约7.5E7TCID₅₀/ml的效力。CVA21病毒TCID₅₀测定法公开在WO 2015/127501和实施例6中。在另一方面，药物组合物具有5E6至5e7PFU/ml的效力。在另一方面，药物组合物具有1E7至3E7 pfu/ml的效力浓度。在另一方面，药物组合物具有1.1E7 pfu/ml的效力浓度。可以通过实施例6中的空斑测定法来测量效力。

治疗癌症的方法

在一个进一步的方面，本发明提供一种用于治疗患者的癌症的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗患者的癌症的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明提供药物组合物在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途。在一个实施方案中，药物组合物是肿瘤内施用。在另一个实施方案中，药物组合物是膀胱内施用。在一个实施方案中，每次治疗的剂量多至约3E8TCID₅₀或约5E7 pfu。在一个实施方案中，每次治疗的剂量多至约3E7TCID₅₀或约5E6 pfu。在一个实施方案中，每次治疗的剂量多至约1E8TCID₅₀或约1.5E7 pfu。在另一个实施方案中，药物组合物是静脉内施用。在一个实施方案中，每次治疗的剂量为1E9 TCID₅₀或约1.5E8 pfu。在一个进一步的实施方案中，药物组合物在间歇日(intermittent days)施用。

可以通过本发明的药物组合物治疗的癌症包括但不限于：心脏癌：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺癌：支气管癌(鳞状细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤；胃肠癌：食道癌(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺癌(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽瘤(vipoma))、小肠癌(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠癌(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)、结肠直肠癌；泌尿生殖道癌：肾(腺癌、维尔姆斯瘤(肾母细胞瘤)、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝癌：肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨癌：成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(osteochronfroma)(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统癌：颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜癌(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑癌(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科癌症：子宫癌(子宫内膜癌)、子宫颈癌(宫颈癌、肿瘤前宫颈发育不良)、卵巢癌(卵巢癌(浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌)、粒层-膜细胞瘤、塞尔托利-莱迪希细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴癌(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道癌(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)、乳腺；血液学癌症：血液(骨髓性白血病(急性和慢性)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)；淋巴谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和伯基特淋巴瘤；骨髓谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、皮肤(非黑素瘤)癌、间皮瘤(细胞)、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮瘤、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波西肉瘤。在一个实施方案中，前述癌症是晚期的、不可切除的或转移性的。

在一个实施方案中，可以通过本发明的药物组合物治疗的癌症包括但不限于：非小细胞肺癌、膀胱癌、黑素瘤、三阴性乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌和皮肤鳞状细胞癌。

谷胱甘肽亲和色谱

本发明提供了一种使用谷胱甘肽亲和色谱来纯化肠道病毒的可规模化且稳健的方法(图1B)。在一个实施方案中，谷胱甘肽亲和色谱固定相包含固定于固定相表面的谷胱甘肽(GSH)。谷胱甘肽(也称为L-谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽或GSH)是人细胞中用于控制氧化还原电位且参与许多细胞功能的生物活性三肽(谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸)[8]。GSH具有以下化学结构和名称：

(2S)-2-氨基-5-[[(2R)-1-(羧基甲基氨基)-1-氧代-3-硫烷基丙-2-基]氨基]-5-氧代戊酸。

谷胱甘肽可以通过使用马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、环氧基或其他类似的基于巯基反应性的化学物质的SH基团缀合而固定在固定相上。参见Stenzel MH,ACSMacro Letters,2,14-18(2013)。GSH树脂也可通过若干供应商(Cytiva,Thermo,Qiagen,Sigma)商业可获得。

在分批模式中，固定相在溶液中游离使用。为了以流动模式使用，将固定相包装到柱、胶囊、柱筒、过滤器或其他支持物中，并使用约1-500cm/hr的流速。

在一个方面，本发明提供一种纯化肠道病毒的方法，其包括以下步骤：

a.使用加载溶液将肠道病毒与固定相结合，其中谷胱甘肽固定在所述固定相上；

b.用洗脱溶液从所述固定相洗脱所述肠道病毒。

在一个实施方案中，在步骤(a)之前，用平衡溶液对固定相进行平衡。在一个实施方案中，一种或多种杂质存在于步骤a)的流过物(flowthrough)中。

在该方法的另一方面，在步骤a)之后但在步骤(b)之前，其还包括用一种或多种洗涤溶液洗涤固定相的步骤i)。在一个实施方案中，从洗涤步骤中除去一种或多种杂质。在另一个实施方案中，步骤(i)包括使用洗涤溶液的第一洗涤步骤，所述洗涤溶液的电导率高于平衡溶液或加载溶液。在另一个实施方案中，步骤(i)包括使用洗涤溶液的第二洗涤步骤，所述洗涤溶液的电导率低于第一洗涤步骤中的洗涤溶液。在一个进一步的实施方案中，洗脱溶液的电导率与第二洗涤步骤中的洗涤溶液相同。

在一个实施方案中，加载溶液、平衡溶液、洗涤溶液或洗脱溶液包含盐，优选一价金属离子盐，例如NaCl或KCl。在另一个实施方案中，加载溶液或平衡溶液包含约50-200mM的NaCl或KCl。在另一个实施方案中，加载溶液或平衡溶液包含约100mM的NaCl或KCl。

在一个实施方案中，洗涤溶液包含约50-400mM的NaCl或KCl。在另一个实施方案中，洗涤溶液包含约350-450mM的NaCl或KCl。在另一个实施方案中，洗涤溶液包含约400-500mM的NaCl或KCl。在一个进一步的实施方案中，洗涤溶液包含约400mM的NaCl或KCl。在一个进一步的实施方案中，第一洗涤溶液包含约100-500mM NaCl或KCl，且第二洗涤溶液包含约50-500mM的NaCl或KCl。在一个进一步的实施方案中，第一洗涤溶液包含约350-500mM的NaCl或KCl，且第二洗涤溶液包含约50-150mM的NaCl或KCl。在另一实施方案中，第一洗涤溶液包含约400mM NaCl或KCl，且第二洗涤溶液包含约75mM的NaCl或KCl。在一个进一步的实施方案中，第二洗涤溶液包含约50-150mM的NaCl或KCl。在一个进一步的实施方案中，第二洗涤溶液包含约100mM的NaCl或KCl。

洗脱步骤可以用具有高离子强度或高电导率、低pH(例如pH约5-7)或在游离GSH存在下或其组合的溶液进行。在一个实施方案中，洗脱溶液包含约0.5-1M的一价盐，例如NaCl或KCl。在一个实施方案中，洗脱溶液包含约0.5M的NaCl或KCl。在一个实施方案中，洗脱溶液包含约50-500mM的NaCl或KCl。在另一个实施方案中，洗脱溶液包含约0.1-100mM的谷胱甘肽。在另一个实施方案中，洗脱溶液包含约0.1-50mM的谷胱甘肽。在另一个实施方案中，洗脱溶液包含约0.1-25mM的谷胱甘肽。在另一个实施方案中，洗脱溶液中的谷胱甘肽为约1mM。在一个实施方案中，洗脱溶液包含约0.5-5mM的谷胱甘肽和约75-150mM的NaCl或KCl。在一个实施方案中，洗脱溶液包含约0.5-25mM的谷胱甘肽和约50-500mM的NaCl或KCl。在另一个实施方案中，洗脱溶液包含约0.1-100mM的谷胱甘肽和约75-150mM的NaCl，和任选的约0.001-1％w/v的PS-80。在仍然一个进一步的实施方案中，洗脱溶液包含约100mM的NaCl、约1mM的谷胱甘肽和约0.005％w/v的PS80。

在一个实施方案中，加载溶液、平衡溶液、洗涤溶液和洗脱溶液中的一种或多种具有约6.5-8.5的pH。在另一个实施方案中，加载溶液、平衡溶液、洗涤溶液和洗脱溶液中的一种或多种具有约7-8的pH。在另一个实施方案中，加载溶液、平衡溶液、洗涤溶液和洗脱溶液中的一种或多种具有约8的pH。在一个进一步的实施方案中，加载溶液、平衡溶液、洗涤溶液和洗脱溶液中的一种或多种具有约6-9的pH。在仍然一个进一步的实施方案中，加载溶液、平衡溶液、洗涤溶液和洗脱溶液中的一种或多种具有约5-10的pH。

在一个实施方案中，加载溶液、平衡溶液、洗涤溶液和洗脱溶液中的一种或多种还包含表面活性剂。在另一个实施方案中，表面活性剂是PS-80或PS-20。在另一个实施方案中，表面活性剂为约0.001-1％w/v的PS-80。在另一个实施方案中，表面活性剂为约0.001-0.1％w/v的PS-80。在另一个实施方案中，表面活性剂为约0.005％w/v的PS-80。在一个实施方案中，加载溶液、洗涤溶液和洗脱溶液中的一种或多种还包含EDTA或还原剂例如DTT或β-巯基乙醇。在另一个实施方案中，还原剂为DTT。在另一个实施方案中，DTT为约0.1-10mM。在另一个实施方案中，DTT为约0.1-5mM。在另一个实施方案中，DTT为约1mM。

在一个实施方案中，期望的肠道病毒是完全成熟肠道病毒。在一个实施方案中，期望的肠道病毒是完全成熟的CVA 21。在一个实施方案中，在加载溶液时，至少完全成熟肠道病毒与固定相结合。在一个实施方案中，纯化过程通过流过或洗涤步骤除去一种或多种杂质，例如血清(即BSA)、HCP、HC-DNA、非感染性病毒相关颗粒，包括但不限于含VP0的肠道病毒(原聚体、五聚体、原病毒、原衣壳)、含VP2的肠道病毒(A颗粒或来自降解的A颗粒的空衣壳)。在一个进一步的实施方案中，纯化过程除去肠道病毒原衣壳(例如CVA 21原衣壳)。在另一个实施方案中，纯化过程产生包含高纯度(>99％纯度)完全成熟肠道病毒(例如完全成熟CVA 21病毒体)的组合物。

本发明的方法可以与其他色谱或纯化步骤结合使用以除去杂质。在一个实施方案中，纯化过程通过流过或洗涤步骤除去一种或多种细胞培养杂质，例如血清(即BSA)、HCP或HC-DNA。在另一个实施方案中，纯化过程通过流过或洗涤步骤除去一种或多种杂质，例如原聚体、五聚体、原病毒体、原衣壳、A-颗粒和降解的A-颗粒。在另一方面，本发明提供通过前述纯化步骤和/或本发明的实施方案可获得或产生的肠道病毒的组合物。

在一个实施方案中，本发明的方法由以下步骤构成：a)将包含肠道病毒的细胞培养基加载至固定相，优选以1-1000L-收获培养基/L-固定相加载，其中通过流过物纯化细胞培养基杂质和/或空原衣壳，b)用洗涤溶液洗涤固定相以除去残留杂质，c)用洗脱溶液从固定相洗脱肠道病毒，所述洗脱溶液包含还原型谷胱甘肽，优选约0.1-50mM，缓冲液体积优选为柱或膜体积的2-20倍。所述方法可任选地包括另外的步骤d)用从固定相中除去强结合杂质的洗提溶液洗提固定相，和e)再生固定相。在一个实施方案中，洗提溶液包含约1-50或5-50mM的GSH。在另一个实施方案中，洗提溶液包含约10mM的GSH。在一个实施方案中，洗提溶液包含约500-1500或1000-2000mM的NaCl。

肠道病毒

任何合适的肠道病毒来源均可用于本发明的方法中[1]。肠道病毒颗粒可以是脊髓灰质炎病毒、A组柯萨奇病毒、B组柯萨奇病毒、埃可病毒、鼻病毒和编号肠道病毒。在一个实施方案中，肠道病毒是A、B或C组肠道病毒。在一个实施方案中，肠病毒是C组肠病毒。在一个实施方案中，肠道病毒是A组或B组柯萨奇病毒。在另一个实施方案中，肠病毒是A组柯萨奇病毒。在一个实施方案中，C组肠道病毒是选自CVA1、CVA11、CVA13、CVA15、CVA17、CVA18、CVA19、CVA20a、CVA20b、CVA20c、CVA21、CVA22和CVA24的A组柯萨奇病毒。在一个实施方案中，A组柯萨奇病毒选自CVA 13、CVA 15、CVA 18、CVA20和CVA 21。这些病毒的各种合适的毒株都可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，Va.20110-2209USA获得，例如在下文提供的日期根据布达佩斯条约保藏的材料，并且可根据布达佩斯条约的条款获得：柯萨奇A组病毒，菌株CVA13，ATCC号：PTA-8854，2007年12月10日保藏；柯萨奇A组病毒，菌株CVA15(G9)，ATCC号：PTA-8616，2007年8月15日保藏；柯萨奇A组病毒，菌株CVA18，ATCC号：PTA-8853，2007年12月20日保藏；和柯萨奇A组病毒，菌株CVA21(Kuykendall)，ATCC号：PTA-8852，2007年12月20日保藏。文献中提及的其他C组肠道病毒下的A组柯萨奇病毒包括但不限于CVA1(GenBank登录号AF499635，Dalldorf等，1949)、CVA11(GenBank登录号AF499636)、CVA17(GenBank登录号AF499639)、CVA19(GenBank登录号AF499641)、CVA20(GenBank登录号AF499642)、CVA20a(Sickles等，1959)、CVA20b(Sickles等，1959)、CVA20c(Abraham和Cheever，1963)、CVA22(Sickles等，1959；(GenBank登录号AF499643)和CVA24(Mirkovic等，1974；(GenBank登录号EF026081)。在一个优选的实施方案中，肠道病毒是柯萨奇病毒A21。

在另一个实施方案中，肠道病毒是B组肠道病毒。在另一个实施方案中，所述B组肠道病毒是埃可病毒。在另一个实施方案中，所述B组肠道病毒是埃可病毒-1(EV-1)。埃可病毒-1的实例包括GenBank登录号为AF029859、AF029859.2和AF250874的那些。

在另一个实施方案中，肠病毒是B组柯萨奇病毒。在另一个实施方案中，B组柯萨奇病毒是柯萨奇病毒B3(CVB3)或柯萨奇病毒B4(CVB4)。在一个进一步的实施方案中，肠道病毒是鼻病毒A、B或C。在另一个实施方案中，肠道病毒是鼻病毒A或B。在仍然另一个实施方案中，肠道病毒是人鼻病毒14(HRV14)。在仍然一个进一步的实施方案中，肠道病毒是人鼻病毒1B或35。人鼻病毒1B的实例是Genbank登录号D00239.1。人鼻病毒35的实例是Genbank登录号EU 870473。在仍然另一个实施方案中，肠道病毒是埃可病毒1、鼻病毒1B、鼻病毒35、柯萨奇病毒A13(CVA13)、柯萨奇病毒A15(CVA15)、柯萨奇病毒A18(CVA18)、柯萨奇病毒A 20b(CVA20b)或柯萨奇病毒A 21(CVA21)。目前对肠道病毒形态发生和谷胱甘肽在衣壳装配中的作用的理解的概述详述在图2中。此外，具有转基因插入的遗传修饰的肠道病毒和灭活的肠道病毒可用于本发明的方法中。

实施例

提供实施例是为了更全面地说明本发明的各种实施方案。这些实施例决不应被解释为限制所附权利要求中所述的本发明的范围。

实施例1：用GSH亲和色谱纯化柯萨奇病毒A21

使用具有UNICORN系统控制软件(Cytiva)的Akta Pure 150MFPLC系统(Cytiva)进行所述GSH亲和色谱程序[图1B]。使用装有GSH Sepharose 4Fast Flow树脂的Cytiva 20mLHiPrep柱纯化CVA 21。将20mL GSH柱用5个柱体积(CV)的含有15mM Tris、150mM NaCl、0.005％w/v PS80，pH 7.5的平衡溶液以150cm/hr的流速和4min保留时间平衡。将CVA 21澄清的细胞培养收获物以100cm/hr的流速和6min的保留时间加载到柱中，直至达到200-CVs的柱加载。将GSH柱以150cm/hr的流速用5-CV的含有15mM Tris、400mM NaCl、0.005％w/vPS-80，pH 8.0的洗涤1缓冲液洗涤，然后用5-CV的含有15mM Tris、100mM NaCl、0.005％w/vPS-80、1mM DTT，pH 8.0的洗涤2缓冲液洗涤。将结合的CVA 21颗粒用3-CV的含有15mMTris、100mM NaCl、0.005％w/vPS-80、1mM DTT、1mM GSH、pH 8.0的洗脱溶液洗脱，通过在流动相中用游离GSH以150cm/hr的流速从固定化谷胱甘肽配体竞争性置换。用含有15mMTris、1000mM NaCl、0.005％w/v PS-80、1mM DTT、10mM GSH，pH 8.0的3-CV缓冲液洗提GSH柱，并用0.1N NaOH、1M NaCl溶液以150cm/hr的流速再生。在再平衡柱之后，可以重新使用树脂以加载另外的收获物。

在UNICORN软件中分析的色谱图描绘了以mAU为单位的在280nm处的吸光度迹线(A280)和以mS/cm为单位的电导率迹线[图3]。在澄清的细胞培养收获物的加载(GSH FT)期间，A280信号没有变化，表明杂质的一致流过和病毒颗粒随时间的不可检测的穿透。用5-CV的含有400mM NaCl的洗涤缓冲液(GSH W1)洗涤柱，以除去弱或非特异性结合的杂质，直至A280达到基线。在用洗涤2缓冲液(GSH W2)调节柱时，用3-CV的含有1mM的游离还原GSH的缓冲液(GSH Elute)洗脱CVA 21颗粒，并观察到相应的A280峰。来自澄清的收获物的GSH洗脱物的总体积浓缩因子为67倍。用含有10mM GSH和1M NaCl的洗提溶液(GSH洗提)洗提柱，并观察到小峰。

通过用于病毒感染性的中值组织培养感染剂量(TCID₅₀)测定法、用于总病毒基因组的逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定法和用于总颗粒的使用抗VP1抗体的毛细管电泳定量western印迹(Protein Simple)分析澄清的收获物和GSH色谱洗脱样品。通过GSH洗脱产物中的病毒量除以加载的细胞培养收获物中的量来计算GSH色谱洗脱产率。感染性和病毒基因组产率为约100％，而总颗粒产率接近50％[表1]。这表明完全、成熟、感染性CVA21病毒体与固定的GSH配体结合，并且以优异的回收率从柱上洗脱，而一定比例的非感染性病毒颗粒被清除。

表1

病毒属性	自澄清的收获物的GSH洗脱产率
		病毒感染性(TCID<sub>50</sub>)	106％
病毒基因组(RT-qPCR)	93％
		总病毒颗粒(抗-VP1 Western)	49％

肠道病毒感染的细胞通常产生感染性成熟病毒体和非感染性病毒相关颗粒，包括分解的原聚体或五聚体、原病毒体、空原衣壳、A-颗粒或降解的A-颗粒[图2]。典型的受感染细胞培养收获物还可含有宿主细胞相关杂质，包括宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA，以及培养基相关杂质，包括牛血清白蛋白(BSA)。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)检测GSH亲和色谱级分中的病毒和杂质蛋白条带。制备纯的以及与4×上样染料(BioRad)和10×还原剂(BioRad)混合样品，之后在70℃下加热10min以使样品变性。将20μL的变性样品加入10孔12％丙烯酰胺Bis-Tris NuPAGE凝胶(Thermo)中，并使用Invitrogen凝胶盒和电源系统(Thermo)在200V下运行60min。使用Pierce银染试剂盒(Thermo)对凝胶染色，并使用凝胶成像仪(BioRad)成像。

SDS-PAGE分析显示澄清的收获物含有高浓度的牛血清和宿主细胞蛋白质杂质，其在样品加载期间主要流过(GSH FT)[图4]。在第一次洗涤期间除去另外的杂质(GSH W1)，并且通过第二次洗涤，仅检测到BSA(66.5kDa)的微弱条带(GSH W2)。在GSH洗脱液中可见以下CVA21病毒衣壳蛋白条带，通过其预期分子量(UniProt A0A0N9H7H0)所测定的：VP1(33.2kDa)、VP2(29.9kDa)和VP3(26.6kDa)。VP4(7.5kDa)条带由于其分子量小而从凝胶底部流出。此外，通过SDS-PAGE可检测到非常微弱的VP0(37.3kDa)，表明GSH洗脱液含有在基因组衣壳化后经历VP0裂解成VP2和VP4的病毒颗粒。因此，SDS-PAGE证实GSH亲和色谱选择性结合不含VP0的成熟CVA 21病毒体，具有有效的杂质清除率。

将GSH亲和色谱纯化的病毒与通过使用氯化铯(CsCl)梯度的常规超速离心(UC)方法纯化的病毒进行比较[图1A]。在UC步骤之前，使用300kDa PES中空纤维过滤器(Repligen)通过切向流过滤(TFF)将澄清的细胞培养收获物浓缩100倍。使用各种密度的CsCl溶液在超速离心管中制备梯度，并将浓缩的细胞培养裂解物加入到梯度的顶部。将样品以67,000g离心5hr，将选择的级分合并，并通过10kDa膜透析到稳定缓冲溶液中。通过SDS-PAGE分析，在UC纯化的病毒泳道中可检测到VP0和其他未知蛋白质条带[图4]，表明样品中存在空原衣壳和其他杂质。

通过毛细管电泳定量western印迹(Protein Simple)分析GSH亲和色谱和UC纯化的样品，使用2种一级抗体：结合VP1的抗VP1多克隆抗体以及结合VP4和VP0蛋白两者的抗VP4多克隆抗体。VP1存在于含有原聚体/五聚体亚基的所有病毒颗粒中，并且抗VP1峰面积用于估计总病毒颗粒。VP0仅存在于空的原衣壳、原病毒体和原聚体/五聚体亚基(含有VP0的肠道病毒颗粒)中，而具有VP4的颗粒由在基因组的衣壳化后VP0裂解成VP2+VP4以形成完整的成熟病毒体而产生[图2]。因此，VP0:VP4峰面积的比率用于估计含VP0的肠道病毒颗粒:完全成熟病毒体的比率。相对于UC纯样品，分析澄清的收获物和GSH色谱FT和洗脱物的总病毒颗粒和含VP0的颗粒/完全成熟病毒体的比例[图5]。与UC纯样品相比，在澄清的收获物中，总颗粒少～10倍，含VP0的颗粒/完全成熟病毒体的相对比率高6倍。在GSH亲和色谱加载步骤期间，病毒颗粒存在于GSH FT中，但是这些颗粒具有高的含VP0颗粒含量。由于体积减小，GSH洗脱物中的总颗粒相比澄清的收获物增加约30倍，并且VP0:VP4的比率降低约60倍。与UC纯化的病毒相比，GSH洗脱液具有低10倍的含VP0的肠道病毒颗粒：完全成熟病毒体比率。这证实GSH亲和色谱选择性地结合含有VP4的完全成熟病毒体颗粒，同时流过具有VP0的颗粒，并且比梯度超速离心方法更有效地清除空原衣壳。

进行蔗糖梯度超速离心以证实在纯化的GSH洗脱样品中仅存在完全成熟的病毒体颗粒。将1mL GSH洗脱样品加载到15-42％w/v的连续蔗糖梯度上，并以230,000g离心100min。取12×1mL级分，并通过银染的SDS-PAGE和使用抗VP1一级抗体的毛细管电泳定量western分析。预期级分5-8含有空衣壳，而预期级分9-12含有完整衣壳。如SDS-PAGE凝胶所示，在级分10-11中检测到病毒蛋白VP1、VP2、VP3且无VP0，而在泳道5-8中未检测到条带[图6A]。这表明GSH洗脱物仅含有完全成熟的病毒体，而不含原病毒体或空衣壳。通过VP1测量的级分中总病毒颗粒的分布表明GSH洗脱样品含有超过99％的完全成熟病毒体[图6B]。

除了去除空的原衣壳和其他病毒杂质之外，GSH亲和色谱有效地清除血清和宿主细胞杂质。BSA是细胞培养基中使用的牛血清的主要组分。在具有血清的典型细胞培养基中，BSA浓度为约0.5-1.0mg/mL，并且需要显著降低以满足每剂量<50ng BSA的典型靶标。通过毛细管电泳定量western印迹(Protein Simple)分析GSH色谱级分，并使用公开的程序[16]用抗BSA一级抗体(Bethyl)[图7]检测，其中一级抗体孵育时间为90min，二级抗体孵育时间为60min。在GSH加载步骤期间，大于90％的初始BSA物质流过，并且在2个洗涤步骤中除去弱结合的BSA。来自澄清的收获物的GSH洗脱残留BSA的减少百分比大于99.99％。还评估了通过用抗MRC-5一抗(Cygnus)的毛细管电泳western印迹测量的GSH洗脱HCP清除率和通过qPCR测量的HC-DNA清除率(参见分析实施例6)[表2]。对于HCP，来自澄清的收获物的百分比减少大于99.9％，并且对于HC-DNA，大于99.8％。这些结果表明，GSH亲和色谱可用于有效浓缩和纯化成熟的感染性CVA 21病毒体，同时清除非感染性空原衣壳、其它病毒杂质和细胞培养物相关杂质。

表2

杂质	来自澄清收获物的GSH洗脱减少％
		牛血清蛋白	99.993％
宿主细胞蛋白	99.986％
		宿主细胞DNA	99.818％

实施例2：用GSH亲和色谱扩增和纯化肠道病毒

肠道病毒是小核糖核酸病毒科内的一个属，由共享相似基因组和结构病毒特性的小的正义单链RNA病毒组成。为了证明肠道病毒的GSH亲和性纯化，评估了涵盖几种肠道病毒物种(包括肠道病毒B、肠道病毒C、鼻病毒A和鼻病毒B)的8种不同血清型。各种菌株购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在使用细胞系A和/或B和上游条件A或D[表3]的两个感染中，使用生产肠道病毒常用的感染方案进行扩增。将细胞接种在组织培养物处理的通气烧瓶中的生长培养基中。在接种后几天，倾析生长培养基，并将1mL的肠道病毒接种物加入细胞层中。将烧瓶培养2小时，之后向每个烧瓶中加入39mL的生产培养基，并根据上游条件培养。在目测检查细胞病变效应之后，通过收集上清液收获烧瓶。将烧瓶储存在-70℃下，解冻并澄清，然后用于GSH亲和色谱纯化。

表3

组	肠道病毒血清型	缩写	肠道病毒种	生产细胞系	上游条件
						1	埃可病毒1	E1	肠道病毒B	A	A
2	鼻病毒1B	RV1B	鼻病毒A	B	D
						3	鼻病毒35	RV35	鼻病毒B	B	D
4	柯萨奇病毒A13	CVA13	肠道病毒C	A	A
						5	柯萨奇病毒A15	CVA15	肠道病毒C	A	A
6	柯萨奇病毒A18	CVA18	肠道病毒C	A	A
						7	柯萨奇病毒A 20b	CVA20b	肠道病毒C	B	A
8	柯萨奇病毒A 21	CVA21	肠道病毒C	B	A
						9	柯萨奇病毒A 21	CVA21	肠道病毒C	B	D

在Konstantinidis等[17]所述的方法，在装有具有不锈钢注射器尖端的8通道液体处理臂和偏心机器人操纵臂(Tecan Group Ltd.)的Tecan Freedom EVO 150上，使用含有0.6mL谷胱甘肽琼脂糖4快速流动树脂(Repligen)的Opus Robocolumns进行GSH亲和色谱。对于每个纯化组，将0.6mL柱用5-CV的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)的平衡溶液平衡。将澄清的肠道病毒样品以50-CV的加载量施加到柱上。然后，用5-CV的含有15mM Tris、400mM NaCl、1mM DTT、0.005％w/v PS80，pH 8.0的洗涤1溶液洗涤柱，然后用5-CV的含有15mM Tris、150mM NaCl、1mM DTT、0.005％w/v PS80，pH 8.0的洗涤2溶液洗涤柱。通过在流动相中用游离GSH竞争性置换固定的谷胱甘肽配体，用5CV的含有15mM Tris、150mM NaCl、1mM DTT、1mM GSH、0.005％w/vPS80，pH 8.0的洗脱溶液洗脱结合的肠道病毒颗粒。然后，用5-CV的含有15mM Tris、1000mM NaCl、1mM DTT、10mM GSH、0.005％w/vPS80，pH 8.0的洗提溶液洗提柱。所有相以4min的保留时间进行，并且每1/3CV在透明平底96W UV板(Corning)中收集级分。

通过测量所有级分在260nm和280nm处的光学吸光度，针对900/990nm校正路径长度，并汇编每个柱的所有级分的路径长度校正的吸光度来产生色谱图。图8显示具有来自纯化组9的A280和电导率迹线的示例色谱图。在Robocolumn方法中，通常在60-65-CV之间观察到洗脱峰。通过SDS-PAGE测定每个纯化组的澄清的收获物和洗脱级分。将样品与4×上样染料和10×还原剂(BioRad)混合，然后在70℃下变性10分钟。将25uL每个样品和2uL的Mark-12蛋白梯(Invitrogen)加载到1.0mm 10泳道12％丙烯酰胺Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)中，并在含有1×MOPS电泳运行缓冲液(Invitrogen)的凝胶盒和电源系统(Invitrogen)中，在200V下电泳45分钟。然后，使用Pierce银染试剂盒(Thermo FisherScientific)将凝胶染色，并使用凝胶成像仪(BioRad)成像。

实验组1-9澄清的细胞培养收获物[图9A]和GSH洗脱级分[图9B]的SDS-PAGE分析证实，GSH亲和色谱可有效地用于纯化一系列不同物种的肠道病毒的多种血清型。肠道病毒衣壳病毒蛋白(VP)在埃可病毒1(1)、鼻病毒1B(2)、鼻病毒35(3)、柯萨奇病毒A13(4)、柯萨奇病毒A15(5)、柯萨奇病毒A18(6)、柯萨奇病毒A 20b(7)和柯萨奇病毒A 21(8,9)的洗脱物中是可检测的。虽然所有组使用常规细胞培养方案用于肠病毒生产，但仅CVA21(8,9)生产方法针对高滴度进行了优化。在该实施例中，源自ATCC原液的其他肠道病毒血清型(1-7)经历很少或不经历来自原始小瓶的加工。随着血清型特异性方法的进一步优化，预期通过GSH-亲和色谱改善细胞培养物滴度和回收率。此外，上游条件可能影响空原衣壳与GSH色谱树脂的结合，如通过组8-9GSH洗脱级分中病毒蛋白条带的不同分布所证实的。

实施例3：使用不同上游条件产生的澄清的收获物对CVA 21的GSH亲和色谱纯化

使用与实施例1类似的程序，使用上游细胞培养条件A-C产生的CVA 21澄清的收获物，在2个实验中评价GSH亲和色谱[表4]。在具有UNICORN系统控制软件的Akta Pure 150MFPLC系统上，使用填充有GSH Sepharose 4Fast Flow树脂的20mL HiPrep柱。将CVA 21澄清的细胞培养收获物以100cm/hr的流速加载到柱中，直至达到200-CV的柱加载。将GSH柱以150cm/hr的流速用8-CV的含有15mM Tris、400mM NaCl、0.005％w/v PS-80，pH 8.0的GSH洗涤1缓冲液洗涤，然后用4-CV的含有15mM Tris、75mM NaCl、0.005％w/v PS-80、1mM DTT，pH8.0的GSH洗涤2缓冲液洗涤。将结合的CVA 21颗粒用4-CV的含有15mM Tris、75mM NaCl、0.005％w/v PS-80、1mM DTT、1mM GSH、pH 8.0的GSH洗脱溶液以150cm/hr的流速洗脱。用4-CV的含有15mM Tris、1000mM NaCl、0.005％w/v PS-80、1mM DTT、10mM GSH，pH 8.0的GSH洗提缓冲液洗提GSH柱，并用0.1N NaOH、1M NaCl溶液以150cm/hr的流速再生。

表4

通过使用银染的SDS-PAGE[图10]和毛细管电泳抗VP4 western分析澄清的收获物和GSH洗脱产物样品，以检测相对于超速离心纯化的病毒的VP0:VP4的比率[图11]。SDS-PAGE分析显示，对于所有组，GSH洗脱中的杂质蛋白清除都是相似的，但是GSH洗脱样品相对于其他病毒蛋白条带具有不同强度的VP0条带(～37kDa)。第1、3和4组具有较高的VP0含量，而第2和5组具有低VP0含量，表明在整个GSH色谱步骤中空原衣壳清除率的差异。通过抗VP4western，相对于超速离心纯化的病毒，空原衣壳:完全成熟病毒颗粒的比率表明，对于所有组，VP0:VP4的比率从澄清的收获物到GSH洗脱产物降低，但降低因子存在差异。在由上游条件A产生的第2和5组中，空原衣壳:完全成熟病毒体比率显著小于超速离心的比率。这些结果证实，在一些上游条件下，一部分空原衣壳可以与GSH树脂结合，并且可以实施第二步骤，例如阳离子交换(CEX)色谱，以清除GSH洗脱产物中残留的空原衣壳，以满足或超过超速离心纯化的病毒的纯度。

实施例4：使用涉及GSH亲和色谱和CEX色谱的方法纯化肠道病毒

使用图12中的方法，以从大规模生物反应器细胞培养收获物中纯化CVA 21为例，证实了肠道病毒的可规模化纯化。纯化过程涉及使由细胞培养基、宿主细胞碎片、血清杂质和肠道病毒颗粒组成的肠道病毒细胞培养收获物通过一个或多个孔径范围为0.2-100μm的澄清过滤器，以除去宿主细胞碎片。可以使用一系列的两个澄清步骤，其中初次澄清步骤具有1-100μm的过滤器孔径，并且二次澄清步骤具有0.2-5μm的过滤器孔径。对于来自微载体细胞培养物的收获物，初次澄清可以涉及网袋或深度过滤器以在二次澄清之前除去微载体。在使用CVA 21的本实施例中，用2个以100L/m2·hr(LMH)操作的串联过滤器连续进行澄清步骤：用Clarisolve 60HX(Millipore)60μm深度过滤器进行初次澄清，以除去微载体和大的细胞碎片，和用Sartopure GF+(Sartorius)1.2μm深度过滤器进行二次澄清，以清除包括HC-DNA的较小细胞碎片。

在一些肠道病毒细胞培养物中，病毒的裂解活性足以裂解细胞，并且不需要裂解步骤。在其他肠道病毒细胞培养物中，可以在澄清步骤之前实施裂解步骤，例如用范围为0.01％-2％w/v的PS-80、PS-20或其他表面活性剂的洗涤剂裂解，以完全裂解细胞。在使用CVA 21的本实施例中，不进行裂解步骤。

按照与实施例1中类似的程序，将澄清的收获物直接加载到GSH亲和色谱柱上。对于GSH色谱操作，将GSH固定的树脂填充到制备规模的色谱柱中，并用色谱滑动架(chromatography skid)例如Akta Pilot(Cytiva)或Akta Ready(Cytiva)操作。在使用CVA21的本实施例中，在具有UNICORN系统控制软件的Akta Pilot上使用填充有GSH Sepharose4FF的14cm直径柱。将CVA 21澄清的细胞培养收获物以100cm/hr的流速加载到柱上，直至柱加载量为150-200CV。将GSH柱以150cm/hr的流速用8-CV的含有15mM Tris、400mM NaCl、0.005％w/v PS-80，pH 8.0的GSH洗涤1缓冲液洗涤，然后用4-CV的含有15mM Tris、150mMNaCl、0.005％w/v PS-80、1mM DTT，pH 8.0的GSH洗涤2缓冲液洗涤。将结合的CVA 21颗粒用4-CV的含有15mM Tris、150mM NaCl、0.005％w/v PS-80、1mM DTT、1mM GSH，pH 8.0的GSH洗脱溶液以150cm/hr的流速洗脱。将GSH柱用4-CV的含有15mM Tris、1000mM NaCl、0.005％w/v PS-80、1mM DTT、10mM GSH，pH 8.0的GSH洗提缓冲液洗提，并用0.1N NaOH、1M NaCl溶液以150cm/hr的流速再生。

将GSH洗脱产物直接加载到以流过模式操作的任选的精制阴离子交换(AEX)色谱步骤中，用于另外的残留杂质清除。AEX色谱步骤可以使用常见的AEX色谱介质，例如POROS50HQ(ThermoFisher)、Capto Q(Cytiva)或Nuvia Q(BioRad)或其他AEX固定相。对于大规模AEX色谱操作，将AEX树脂填充到制造规模的色谱柱中，并用色谱滑动架例如Akta Pilot以50-300cm/hr的流速运行。AEX柱在由pH 6-9的溶液和50-500mM的单价盐浓度组成的3-5CVAEX平衡缓冲液中平衡。将pH 6-9和单价盐浓度为50-500mM的溶液中的GSH洗脱产物加载到AEX柱上，接着用AEX平衡缓冲液进行1-3CV追踪。肠道病毒颗粒流过，而包括HC-DNA和杂质蛋白的杂质与AEX树脂结合。用由pH 6-9的溶液和500-1500mM的一价盐浓度组成的3-5CVAEX洗提缓冲液洗提柱，并用含有0.1-0.5N氢氧化钠的溶液再生。AEX缓冲溶液可以含有浓度为0.001-1％w/v的表面活性剂，例如PS-80、PS-20或其他类似的表面活性剂。在使用CVA21的当前实施例中，在具有UNICORN系统控制软件的Akta Pilot上以200cm/hr的流速运行填充有POROS 50HQ树脂的5cm直径柱。AEX柱用4-CV的由15mM Tris、150mM NaCl、0.005％w/v PS-80，pH 8.0组成的AEX平衡缓冲液平衡。将含有CVA 21颗粒的GSH洗脱产物加载到柱上，直到加载25-30CV，并用2-CV AEX平衡缓冲液追踪。CVA 21颗粒流过，而残留杂质结合到柱上。将AEX柱用4-CV的含有15mM Tris、1000mM NaCl、0.005％w/v PS-80，pH 8.0的AEX洗提缓冲液洗提，并用4-CV的0.5N NaOH溶液再生。如果在没有AEX的情况下满足最终纯化的组合物中期望的残留杂质规格，则可以省略AEX色谱步骤。在这种情况下，GSH洗脱产物被送到溶液调节步骤。

在溶液调节步骤中，将AEX FT或GSH洗脱(如果不进行AEX)产物调节至与在随后的CEX色谱步骤中与CEX色谱树脂结合相容的溶液条件。最初，AEX FT或GSH洗脱产物在pH 6-9和50-500mM的一价盐浓度溶液中。如果需要，将pH 3.5-6.0的由缓冲物质例如柠檬酸盐组成的0.5-1.5M调节缓冲溶液和2-5M调节一价盐溶液例如NaCl的浓缩储备溶液掺入AEX FT中，以使溶液pH降至pH 3.5-6.0，并将一价盐浓度增加至50-500mM。如果AEX FT已经处于CEX步骤的加载溶液的目标pH或单价盐浓度，则可能不需要一种或两种调节溶液。在使用CVA21的当前实施例中，将1M柠檬酸钠，pH 4.0溶液和5M NaCl溶液掺入AEX FT，最初在pH8.0和150mM NaCl下，至靶标在pH～4.1下最终柠檬酸钠浓度为50mM且最终NaCl浓度为400mM。在混合下，在5-10分钟内，将浓缩的储备溶液缓慢加入AEX FT产物中。将该溶液调节的样品称为CEX进料，并且代表目标CEX加载溶液。

实施以结合-洗脱模式操作的CEX色谱步骤，以改善作为空原衣壳清除的第二步骤的过程稳健性，以清除残留杂质，并提供额外的体积减少。CEX步骤可以使用常见的色谱介质，例如POROS 50HS(ThermoFisher)、Capto S(Cytiva)或Nuvia S(BioRad)或其他CEX固定相。对于大规模CEX色谱操作，将CEX树脂填充到大规模色谱柱中，并用色谱滑动架例如AktaPilot以50-300cm/hr的流速运行。将CEX柱用由pH 3.5-6.0的溶液和50-500mM的单价盐浓度组成的3-5CV CEX平衡缓冲液中平衡。将在pH 3.5-6.0和一价盐浓度为50-500mM的CEX加载溶液中的CEX进料加载到CEX柱中。肠道病毒颗粒与CEX树脂结合，而一些残留杂质可能流过。用3-5-CV的CEX洗涤缓冲溶液洗涤CEX柱，以除去残留杂质，所述CEX洗涤缓冲溶液由pH3.5-6.0的溶液和100-600mM的一价盐浓度组成。使用3-5-CV的由pH 3.5-4.8的溶液和200-1000mM NaCl的单价盐浓度组成的CEX洗脱缓冲溶液从CEX柱选择性洗脱完全成熟的病毒体，而空的原衣壳保持与CEX树脂结合。用3-5CV CEX洗提缓冲液洗脱空的原衣壳和其它残留杂质，所述CEX洗提缓冲液由pH 4.0-8.0的溶液和500-1500mM的单价盐浓度组成，并用含有0.1-0.5N氢氧化钠的溶液再生CEX柱。CEX缓冲溶液可以含有浓度为0.001-1％w/v的表面活性剂，例如PS-80、PS-20或其他类似的表面活性剂。在使用CVA21的当前实施例中，在具有UNICORN系统控制软件的Akta Pilot上，以200cm/hr的流速运行填充有POROS 50HS树脂的5cm直径柱。将CEX柱用4-CV的由50mM柠檬酸钠、400mM NaCl、0.005％w/v PS-80，pH 4.0组成的CEX平衡缓冲液平衡。将含有CVA 21颗粒的CEX进料产物加载到柱中，直到加载量为25-30CV。用4-CV的由25mM柠檬酸钠、500mM NaCl、0.005％w/v PS-80，pH 4.0组成的CEX洗涤缓冲液洗涤柱。用4-CV的由25mM柠檬酸钠、800mM NaCl、0.005％w/v PS-80，pH 4.0组成的CEX洗脱缓冲液从CEX柱选择性洗脱完全成熟的CVA21病毒体。用4-CV的由25mM柠檬酸钠、1000mM NaCl、0.005％w/v PS-80，pH 7.0组成的CEX洗提缓冲液洗脱空CVA21原衣壳，所述CEX洗提缓冲液，用4-CV的0.5N NaOH溶液再生所述柱。

通过超滤/渗滤(UF/DF)，经由切向流过滤(TFF)或尺寸排阻色谱(SEC)以脱盐模式将由纯化的完全成熟肠道病毒病毒体组成的CEX洗脱产物进行缓冲液交换到稳定缓冲液中。对于TFF，肠道病毒颗粒被截留分子量为约50-500kDa的中空纤维或盒保留，而其他小溶液组分渗透通过膜。TFF可以以约1,000-8,000s^-1的交叉流剪切速率(crossflow shearrate)，约0.1-10psig的跨膜压力(TMP)和约5-60L/m²-hr的渗透通量下操作。将CEX洗脱产物以5-10个渗滤体积渗滤到由约pH 6-8的缓冲物质组成的1x稳定缓冲溶液中。可以在DF之前或之后进行UF步骤。可以在TFF之前进行任选的中和步骤，其中将CEX洗脱产物2-5倍稀释到2-5x浓缩的稳定缓冲溶液中。在TFF之前，可以使用由孔径为约0.1-1μm的过滤器组成的任选的过滤步骤。对于与SEC的缓冲液交换，将CEX洗脱产物加载到填充有树脂如Sephadex(Cytiva)的SEC柱上，并使用色谱滑动架例如Akta Pilot以脱盐模式操作。在使用CVA21的当前实施例中，通过将CEX洗脱产物稀释3倍至3x浓缩的稳定缓冲溶液中来中和CEX洗脱产物。在产生TFF进料溶液之前，使用Durapore0.22μm过滤器(Millipore)过滤中和的CEX洗脱产物。最初，将TFF进料溶液浓缩2-3倍，然后使用Spectrum 300kDa中空纤维过滤器(Repligen)以2000s^-1的交叉流、1-2psig的TMP和20-40LMH的渗透通量，将缓冲液交换到1x稳定缓冲溶液中。

用缓冲液交换的TFF或SEC洗脱产物进行最终过滤步骤。使用0.1-0.5μm的过滤器孔径。将稳定缓冲溶液中的最终纯化的肠道病毒组合物冷冻并储存在<-60℃。在使用CVA21的当前实施例中，使用Durapore 0.22μm过滤器(Millipore)。

对于由上游细胞培养条件A和B产生的4批次，示例说明了上文详述的CVA 21纯化方法[表6]。作为一个实例，通过用银染的SDS-PAGE表征采用细胞培养条件B的批次4的纯化方法中间体样品[图13]。GSH洗脱产物证实残留蛋白质杂质的高度纯化，仅具有VP0、VP1、VP2、VP3(VP4，7kDa，洗脱凝胶)和RNA可检测条带。VP0和VP2含量的组合表明GSH洗脱产物含有空原衣壳和成熟病毒体的分布。在AEX洗提和CEX FT中清除痕量的残留杂质。CEX洗脱产物仅具有高浓度的可见VP1、VP2、VP3和RNA条带，证实了空原衣壳和完全成熟病毒体的纯组合物的清除。空衣壳在CEX洗提样品中洗脱，由高VP0含量所证明。在TFF缓冲液交换和最终过滤步骤之前，在CEX洗脱产物被中和并过滤之后，VP条带分布保持恒定。跨越GSH和CEX色谱步骤中的空斑感染性、RT-qPCR基因组和HPSEC颗粒(参见实施例6中的分析方法)步骤产率证实了高产率的纯化方法[表5]。这些结果证实成熟病毒体的纯化组合物的稳健产生，其涉及能够去除空原衣壳(GSH、CEX)、清除残留杂质(GSH、AEX、CEX)和减少工艺体积(GSH、CEX、TFF)的多个单元操作。

表5

实施例5：由涉及GSH亲和色谱和CEX色谱的4个大规模批次生产的纯化的CVA 21的组合物与超速离心纯化的CVA 21组合物的比较

通过SDS-PAGE[图14]、毛细管电泳抗VP4 western[图15]和几种测定法(包括空斑效力、基因组RT-qPCR、HPSEC、RP-HPLC、CE-SDS、HC-DNA qPCR和BSA ELISA)[表6]表征由细胞培养条件A和B产生并使用图13中详述的方法纯化的四种纯化的CVA 21的组合物以及使用超速离心产生的纯化的病毒(UC纯，图1A)。对于每个测定的详细描述，参见实施例6中的分析方法。使用市售BSA ELISA试剂盒(Cygnus)进行BSA分析。

表6

用银染和抗VP4 western的SDS-PAGE分析证实了GSH洗脱产物中批次1-3的空原衣壳清除，而批次4相对于UC纯病毒具有高VP0含量。然而，CEX步骤清除了空原衣壳，并且在所有批次中，空原衣壳:完全成熟病毒的比率比最终纯化的病毒组合物中CEX洗脱产物中的UC纯CVA21低～10倍。此外，使用H-Class BIOshell C4柱(Waters)的反相HLPC(RP-HPLC)测定法，使用批次1的色谱图作为实例，通过测量来自2次注射的平均值的VP0:VP2峰面积信号的比率来评估纯化的病毒样品的含VP0的颗粒:含VP2的颗粒的比率[图16]。批次1-3的RP-HPLC结果比UC纯化的病毒低～10倍，证实了抗VP4 western分析。

由于改进的过程滴度和产率，批次1-4的纯化组合物的空斑效力、RT-qPCR基因组和HPSEC颗粒浓度高于UC纯。SDS-PAGE和CE-SDS测定法证实在批次1-4中的高蛋白质纯度，并且HC-DNA和BSA测定法均<LOQ(定量限)，且与UC纯组合物相比证实了改善的HC-DNA清除率。假设剂量为5E+07pfu/剂量，批次1-4达到<1pg HC-DNA/剂量和<100pg BSA/剂量，比<10ng HC-DNA/剂量和<50ng BSA/剂量的典型指导值低数个数量级[表7]。

表7

总颗粒和基因组与感染性颗粒的比率是追踪过程一致性和纯化病毒质量的重要产品属性。总颗粒与感染性颗粒的比率可以在1：1至10⁷：1的范围内，取决于用于计算该值使用的各个病毒和分析测定法[18]。批次1-4分别以基因组/pfu和颗粒/pfu计的基因组和颗粒与感染性的比率低于UC纯病毒，表明改善的产品质量[图17]。这些分析结果证实，相对于通过常规超速离心方法或其它方法产生的现有组合物，能够产生具有改善的病毒效力、成熟病毒体纯度和残留杂质清除率的CVA 21组合物的更稳健和可规模化的方法。

实施例6：

CVA21纯化病毒分析测定

反相HPLC或UPLC测定法程序

具有UV和荧光(FLR)检测器的通用HPLC或UPLC系统适用于在反相色谱条件下分离CVA 21衣壳蛋白。典型的色谱系统由Waters ACQUITY UPLC系统组成，包括四元(或二元)泵、样品管理器、柱组件、FLR检测器和TUV检测器。使用的典型柱是Millipore(Sigma-Aldrich)BIOshell IgG C4柱，其孔径为

粒径为2.7μm。2.1×100mm大小的柱(目录63288-U)足以分离所有衣壳病毒体蛋白。来自其他供应商的具有不同尺寸或类似尺寸的柱可以实现相等的分离效率。典型的柱温保持在80℃，但是可以使用65-85℃的柱温范围，而不会对病毒体蛋白质分离产生可观察到的影响。使用在280nm处的激发和在352nm处的发射报告FLR检测。在220nm和280nm处报告双UV检测。在一些情况下，还报告在260nm处的UV检测。在分析期间，样品管理器温度保持在约8℃。

两种流动相用于梯度洗脱。第一流动相由在HPLC级水中的0.1％三氟乙酸(TFA)组成(流动相A)；第二流动相是在乙腈中的0.1％TFA(流动相B)。用于分析CVA21纯化病毒样品的流动相梯度及流速描绘在表8中。通过质谱法确认图16中的实施例中鉴定的病毒蛋白峰。可以根据注射的样品修改梯度设置，并且可以根据系统压力限制使用0.2至0.5mL/min的流速。病毒蛋白峰保留时间可以根据系统、柱和方法而改变，但预期相对峰顺序保持不变。直接注射约5-50μL的CVA 21纯化的样品，无需预稀释或还原用于HPLC分析。如果样品太稀(小于约0.1μg注射)或低于分析方法的检测限，则可以使用离心过滤浓缩器例如Amicon(Millipore)或Vivaspin(Sartorius)过滤器将样品浓缩至理想的测定范围。

表8

时间	流速(mL/min)	流动相A％	流动相B％
				0	0.4	75	25
0.5	0.4	75	25
				4.5	0.4	60	40
10.5	0.4	54	46
				11.0	0.4	20	80
11.5	0.4	75	25
				12.5	0.4	75	25

CE-SDS测定法程序

CVA21成熟病毒体衣壳由4种病毒蛋白VP4、VP3、VP2和VP1构成。基于其不同的分子量，使用CE-SDS分离、鉴定和定量4种VP，并获得相对峰面积％和相对迁移时间。该测定法还可以检测VP0，其是空原衣壳的标志物。通过使用Maurice CE-SDS Plus试剂盒试剂(Protein Simple)，将50μL的CVA 21样品与50μL的由47μL的1×样品缓冲液、2μL的2-巯基乙醇和1μL的10×内标(10kDa蛋白质)组成的主混合物混合来制备CE-SDS加载溶液。将样品在70℃下加热10分钟，置于台面上1min以冷却，然后以1,000g涡旋1min。通过在指定的孔中移液50uL将加载溶液转移到96孔板中，并使用离心板适配器将板以1,000g离心5min。将样品板置于具有Maurice CE-SDS Plus试剂盒分离柱(Protein Simple)的Maurice仪器(Protein Simple)中，并将50μL的加载溶液在4600V下注射120sec，并在5750V下分离35min。显示来自批次4的纯化病毒样品的4个VP的分离的典型电泳图(具有约10μg注射)显示在图18中。病毒蛋白预期的相对迁移时间和峰面积％显示在表9中。对于给定的间隔，预期的相对迁移时间可以偏移多至5％。通过VP1-4的％峰面积的总和计算VP％纯度，定量的检测限为约5％。如果样品太稀(小于约1μg注射)或低于分析方法的检测限，则可以使用离心过滤浓缩器例如Amicon(Millipore)或Vivaspin(Sartorius)过滤器将样品浓缩至理想的测定范围。

表9

HPSEC测定法程序

HPSEC测定法在Agilent系列1260或更高版本上进行。该系统由用于注射的板自动取样器和四元泵组成。使用获自Tosoh Bioscience LLC(目录号0005764)的TSKgel G5000PW×1(7.5×300mm，17μm)柱进行HPSEC测定法程序。使用牛血清白蛋白(Pierce)校准系统。使用含有10mM Bis-Tris，0.6M NaCl，pH 6.9的流动相平衡HPSEC系统，注射CVA 21样品(大于约1μg)，在等度洗脱下以0.4ml/min的流速溶解。样品注射后的总洗脱时间为在30℃下35min。使用DAD UV检测器获得在280nm处的吸光度。Wyatt Astra-7软件将UV A₂₈₀峰面积直接转换为病毒质量，按照以下所示的等式计算病毒浓度：

病毒浓度(μg/mL)＝病毒质量(μg)/注射体积(mL)

基于所有病毒蛋白的RNA序列和氨基酸序列，使用具有算法的信息学工具，计算在280nm处的CVA21完全成熟病毒体消光系数(＝5.48)[Protein Identification andAnalysis Tools on the ExPASy Server,E.Gasteiger,C.Hoogland,A.Gattiker,S.Duvaud,M.R.Wilkins,R.D.Appel,A.Bairoch；The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press 2005(Informatics tool:https://web.expasy.org/protparam)；或Determination of Extinction Coefficient,V.Murugaiah,Handbook of Analysis ofOligonucleotides and Related Products 2011(Informatics tool:"QuestCalculate^TMRNA Molecular Weight Calculator."AAT Bioquest,Inc,06May.2020,https://www.aatbio.com/tools/calculate-RNA-molecular-weight-mw]。为了获得病毒颗粒浓度，颗粒数与注射体积有关。计算病毒颗粒计数的等式如下所示：

颗粒计数(每mL)＝[病毒浓度(g/mL]/*Mw(Da)]x Avogadro常数(6.02E+23颗粒-mol^-1)

*使用实施例7中MVSS01的蛋白质和RNA序列计算CVA21完全成熟病毒(衣壳蛋白+RNA)Mw(8203kDa)

如果样品太稀(小于约1μg注射)或低于分析方法的检测限，则可以使用离心过滤浓缩器例如Amicon(Millipore)或Vivaspin(Sartorius)过滤器将样品浓缩至理想的测定范围。

空斑测定法程序

空斑测定法确定感染SK-Mel-28细胞之后CVA 21的感染性(pfu/mL)。在该方法中，将SK-Mel-28细胞以5.0E+05个细胞/孔接种在12孔细胞培养板中，并在37℃，5％CO₂下孵育24±4小时。然后，用CVA 21样品感染细胞，并在37℃，5％CO₂下孵育90-105分钟以使病毒吸附。在吸附期之后，加入覆盖层(1％甲基纤维素，1.5ml/孔)，并将感染的细胞板放回培养箱中72±2小时。在该孵育之后，除去覆盖层，将细胞板用PBS/DPBS洗涤两次，并用80％甲醇固定。然后，将板用考马斯亮蓝染色溶液染色，所述考马斯亮蓝染色液结合所有未感染的粘附细胞。感染的细胞不会粘附到板表面，并留下称为空斑的间隙。用灯箱人工目视计数板上的空斑。通过将空斑数乘以各自的稀释因子来进行滴度计算，并表示为空斑/mL。将具有在每孔约5至55个空斑范围内的空斑数量的至少两个孔的几何平均值用于该计算。

RT-qPCR病毒基因组定量测定法(GQA)程序

通过蛋白酶K/十二烷基硫酸钠消化裂解样品。然后，通过苯酚:氯仿:异戊醇分离和乙酸钠/异丙醇沉淀提取核酸，接着乙醇洗涤并再悬浮于水中。将再悬浮的核酸加入到1步定量逆转录PCR(RT-qPCR)反应中，该反应含有针对GenBank登录AF465515.1设计的靶向CVA21 VP1基因的引物和双标记探针。通过扩增循环中荧光的增加来监测扩增。通过针对含有VP1基因靶区域的合成RNA的标准曲线的内插法来确定基因组拷贝数，其范围为1E+11基因组拷贝/mL至1E+07基因组拷贝/mL。

残余宿主细胞DNA测定法程序

通过蛋白酶K/十二烷基硫酸钠消化裂解样品。然后，通过苯酚:氯仿:异戊醇分离和乙酸钠/异丙醇沉淀提取核酸，接着乙醇洗涤并再悬浮于水中。将再悬浮的核酸加入到定量PCR(qPCR)反应中，该反应含有针对NCBI参考登录NM_001164835.1设计的靶向人LINE-1转座酶结构域的3'保守区的引物和双标记探针。通过扩增循环中荧光的增加来监测扩增。通过针对纯化的MRC-5DNA的标准曲线的内插法来确定宿主细胞DNA浓度，范围为2E+02ngDNA/mL至2E-02ng DNA/mL。

病毒TCID₅₀测定法

用CVA 21的10倍系列稀释液(100μL/孔，一式四份)接种96孔组织培养板中的SK-Mel-28细胞的汇合单层，并在37℃下，在5％CO₂环境中培养72小时。将小鼠血清在含有2％胎牛血清(FCS)的DMEM中从1:10²至1:10⁸连续稀释10倍。在倒置显微镜下目视对孔的细胞病变效应(CPE)进行评分。将具有可检测CPE的孔评分为阳性，并使用Karber方法(Dougherty1964)计算50％病毒终点滴度。

实施例7：CVA21病毒序列

柯萨奇病毒A21的原型Kuykendall菌株在Genbank中描述为AF465515。通过空斑纯化、在SK-MEL-28细胞中扩增和通过蔗糖梯度纯化，从上述原型菌株衍生初始临床试验批次MelTrial病毒1。

在上述实施例中使用的主病毒种子原液CVA21 MVSS-01是通过空斑纯化和在MRC-5细胞中扩增而衍生自MelTrial病毒1。分析该病毒的完整基因组序列[表10]。

表10

表11

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将美国临时专利申请号62/951,078的全部内容通过引用并入本文中。将本文引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被特别地和单独地指出通过引用并入一样。申请人遵循37 C.F.R.§1.57(b)(1)意欲该通过引用并入的陈述涉及各个和每个单独出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，其中各自均遵照37C.F.R.§1.57(b)(2)明确鉴定，即使这样的引用不直接接近通过引用并入的专用声明。在说明书中包括通过引用并入的专用声明(如果有的话)不会以任何方式削弱通过引用并入的这种一般陈述。本文对参考文献的引用并不旨在承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。在参考文献提供与本说明书中提供的定义冲突的所要求保护的术语的定义的情况下，本说明书中提供的定义应当用于解释所要求保护的发明。

Claims

1.一种组合物，其包含纯化的柯萨奇病毒A 21(CVA21)，所述柯萨奇病毒A 21包含VP0、VP1、VP2、VP3、VP4和CVA21 RNA，其中VP0与VP2的比率小于约0.01。

2.权利要求1的组合物，其中VP0与VP2的比率为约0.0005-0.005。

3.权利要求1的组合物，其中VP0与VP2的比率为约0.001-0.003。

4.一种包含纯化的CVA21的组合物，其中基因组与感染性的比率小于约5000基因组/pfu。

5.权利要求4的组合物，其中所述基因组与感染性的比率为约200-2000基因组/pfu。

6.权利要求4的组合物，其中所述基因组与感染性的比率为约200-800基因组/pfu。

7.一种包含纯化的CVA21的组合物，其中颗粒与感染性的比率小于约5000颗粒/pfu。

8.权利要求7的组合物，其中所述颗粒与感染性的比率为约200-2000颗粒/pfu。

9.权利要求7的组合物，其中所述颗粒与感染性的比率为约200-600颗粒/pfu。

10.权利要求1-9中任一项的组合物，其中总VP1+VP2+VP3+VP4峰面积/总峰面积为至少95％。

11.权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述组合物中宿主细胞DNA的量小于约10,000pg/剂量，每个剂量具有约5E7 pfu CVA21。

12.权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述组合物中宿主细胞DNA的量为约0.05-10pg/剂量，每个剂量具有约5E7 pfu CVA21。

13.权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述组合物中牛血清白蛋白的量小于约50,000pg/剂量，每个剂量具有约5E7 pfu CVA21。

14.权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述组合物中牛血清白蛋白的量为约50-150pg/剂量，每个剂量具有约5E7 pfu CVA21。

15.权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述CVA21包含SEQ ID NO：1中的核苷酸序列。

16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中所述组合物具有1E5至1E12 TCID₅₀/ml或pfu/ml的效力。

17.一种药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项的组合物和可药用赋形剂。

18.权利要求17的药物组合物，其用于治疗患者的癌症，其中将所述药物组合物以每次治疗多至约3E8 TCID₅₀或5E7 pfu的剂量肿瘤内施用于所述患者。

19.权利要求18的药物组合物，其中所述剂量为每次治疗约3E7至约3E8 TCID₅₀或约5E6至约5E7 pfu的所述药物组合物。

20.权利要求17的药物组合物，其用于治疗患者的癌症，其中将所述药物组合物的剂量为每次治疗约1E9 TCID₅₀或1.5E8 pfu。

21.一种纯化肠道病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使用加载溶液将肠道病毒与固定相结合，其中谷胱甘肽固定在所述固定相上；

(b)用洗脱溶液从所述固定相洗脱所述肠道病毒。

22.权利要求21的方法，其中在步骤(a)之前，用平衡溶液平衡所述固定相。

23.权利要求21或22的方法，还包括在步骤(a)之后且在步骤(b)之前用一种或多种洗涤溶液洗涤所述固定相的步骤(i)。

24.权利要求23的方法，其中步骤(i)包括使用洗涤溶液的第一洗涤步骤，所述洗涤溶液的电导率高于平衡溶液或加载溶液。

25.权利要求24的方法，其中步骤(i)包括使用洗涤溶液的第二洗涤步骤，所述洗涤溶液的电导率低于第一洗涤步骤中的洗涤溶液。

26.权利要求25的方法，其中洗脱溶液的电导率与所述第二洗涤步骤中的洗涤溶液相同。

27.权利要求21-26中任一项的方法，其中所述加载溶液、平衡溶液、一种或多种洗涤溶液和洗脱溶液中，一种或多种具有约5-10的pH。

28.权利要求21-27中任一项的方法，其中所述加载溶液、平衡溶液、一种或多种洗涤溶液和洗脱溶液中，一种或多种具有约6-9的pH。

29.权利要求21-28中任一项的方法，其中所述加载溶液、平衡溶液、一种或多种洗涤溶液和洗脱溶液中，一种或多种还包含表面活性剂。

30.权利要求29的方法，其中所述表面活性剂为PS-80或PS-20。

31.权利要求29的方法，其中所述表面活性剂为约0.001-1％w/v的PS-80。

32.权利要求29的方法，其中所述表面活性剂为约0.001-1％w/v的PS-80。

33.权利要求21-32中任一项的方法，其中所述加载溶液或平衡溶液包含约50-200mM的一价盐。

34.权利要求21-32中任一项的方法，其中所述一种或多种洗涤溶液包含约50-500mM的一价盐。

35.权利要求21-32中任一项的方法，其中第一洗涤溶液包含约350-500mM的NaCl或KCl，且第二洗涤溶液包含约50-200mM的NaCl或KCl。

36.权利要求21-35中任一项的方法，其中所述洗脱溶液包含约50-500mM的一价盐。

37.权利要求21-35中任一项的方法，其中所述洗脱溶液包含约50-200mM的NaCl或KCl。

38.权利要求21-37中任一项的方法，其中所述洗脱溶液包含约0.1-100mM的谷胱甘肽。

39.权利要求21-37中任一项的方法，其中所述洗脱溶液包含约0.1-25mM的谷胱甘肽。

40.权利要求21-37中任一项的方法，其中所述洗脱溶液包含约0.5-5mM的谷胱甘肽和75-150mM的NaCl或KCl。

41.权利要求21-40中任一项的方法，其中所述洗涤或洗脱溶液还包含EDTA、DTT和2-巯基乙醇中的一种或多种。

42.一种纯化肠道病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使用加载溶液将肠道病毒加载到阴离子交换柱，

(b)从流过物收集所述肠道病毒。

43.权利要求42的方法，其中所述加载溶液包含在pH约6-9下约50-500mM的一价盐浓度。

44.权利要求21至43中任一项的方法，其中完全成熟肠道病毒是纯化的。

45.权利要求21至44中任一项的方法，其中所述肠道病毒是B组或C组肠道病毒。

46.权利要求21至45中任一项的方法，其中所述肠道病毒是埃可病毒、鼻病毒A、鼻病毒B或鼻病毒C。

47.权利要求21-44中任一项的方法，其中所述肠道病毒是埃可病毒1、鼻病毒1B、鼻病毒35、柯萨奇病毒A 13(CVA13)、柯萨奇病毒A 15(CVA15)、柯萨奇病毒A 18(CVA18)、柯萨奇病毒A 20(CVA20)或柯萨奇病毒A 21(CVA21)。

48.权利要求21至44中任一项的方法，其中所述肠道病毒为CVA1、CVA11、CVA13、CVA15、CVA17、CVA18、CVA19、CVA20a、CVA20b、CVA20c、CVA21、CVA22或CVA24。

49.权利要求48的方法，其中所述肠道病毒为CVA21。

50.通过权利要求49的方法制备的纯化的CVA21组合物。