KR20200106045A - 아데노-연관 바이러스 정제 방법 - Google Patents

아데노-연관 바이러스 정제 방법 Download PDF

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KR20200106045A
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크리스티안 피에들러
마인하르트 하슬라허
자드란카 코엔
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박스알타 인코퍼레이티드
박스앨타 게엠베하
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Abstract

아데노-연관 바이러스 (AAV) 산물을 생산하는 방법 그리고 아데노-연관 바이러스를 정제하는 방법은 본원에서 제공된다. AAV는 친화성 수지에 장입되고, 세정 단계는 착수되고, AAV는 친화성 수지로부터 용출된다. 다양한 완충액은 세정 단계 및 용출에서 사용을 위하여 개시된다.

Description

아데노-연관 바이러스 정제 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본원은 2017년 12월 29일 출원된 미국 가출원 번호 62/611,709에 우선권을 주장하고, 이의 개시내용은 본원에서 전체적으로 참고로 편입되어 있다.
기술 분야
본 발명은 아데노-연관 바이러스(AAV)를 정제시키는 물질 및 방법에 관련한다.
배경
아데노-연관 바이러스(AAV)는 선형 단일가닥 DNA 게놈을 패키징하는 소형, 비-외피 바이러스이다. AAV에 의한 생산적 감염이 헬퍼 바이러스, 예컨대, 예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스의 존재 하에서만 일어나기 때문에, AAV는 파보비리다에과 및 데펜도바이러스속에 속한다. 심지어 헬퍼 바이러스의 부재 하에서, AAV(혈청형 2)는 숙주 인간 게놈의 염색체 19q13.4로 통합함으로써 잠복을 달성할 수 있다. 부위-특이적 통합을 할 수 있다고 알려진 유일한 포유동물 DNA 바이러스가 있다 (Daya and Berns, Clinical Microbiology Reviews, pages 583-593 (2008)).
AAV가 임상에서 안전하게 사용되도록, AAV는 그것의 게놈 내에 몇 개의 위치에서 유전자적으로 변형되어 왔다. 예를 들어, Rep 유전자는 바이러스성 복제에 필요하고, 부위-특이적 통합에 필요한 요소는 많은 바이러스성 벡터내 AAV 게놈으로부터 제거되어 왔다. 그와 같은 재조합성 AAV(rAAV)는 염색체외 상태에서 실재하고 게놈성 DNA로의 초저 통합 효율을 갖는다. 숙주 세포에서 랜덤 돌연변이유발을 유도하는 rAAV의 가능성은, 전적으로 제거되지 않으면, 따라서 감소된다. 병원성의 부족 및 이들 특성 때문에, rAAV는 전-임상 및 임상 적용의 다중 양태에서 유전자 요법 벡터로서 큰 전망을 나타냈다.　신규한 혈청형 및 자기-상보성 벡터는 임상에서 시험중이다.　이들 진행 중인 벡터 개발과 함께, 계속된 노력은 높은 순도 및 효능을 가진 rAAV 벡터의 고역가 양을 효율적으로 생성할 수 있는 확장가능한 제조 공정에 집중하여 왔다.
인간 투여에 적합한 AAV 산물을 정제하는 효율적, 대규모 방법을 설계하기 위한 노력이 컸어도, 더 나은 AAV 정제 방법에 대한 요구가 남아 있다. AAV의 정제 동안 더욱 효율적으로 제거될 수 있는 숙주 세포 배양물 매트릭스로부터 다양한 다른 단백질 및 물질이 있다. 최종 AAV 산물로부터 숙주 세포 물질을 제거하기 위한 단계를 포함하는 AAV 정제 방법은 그러므로 요구된다.
개요
세포 배양물내 AAV 벡터 생성의 특성은 파괴된 세포로부터 물질을 포함하는 복합 매트릭스의 형성이다. 특히, 숙주 세포 단백질, 프로테아좀, 세포 파편 및 잠재적 바이러스-특이적 수용체는 파괴된 세포로부터 물질에서 종종 존재한다. 개시된 방법은 생리적으로 적용가능한 pH에서 더 큰 순도를 초래하는 조건에서 최종 AAV 산물로부터 숙주 세포 물질을 제거하기 위한 단계를 포함한다.
일 양태에서 하기 단계를 포함하는 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 정제하는 방법은 제공된다:
(a) 용액에서의 AAV와 친화성 수지 사이 결합을 허용하는 조건 하에서 AAV에 대해 표적화된 친화성 수지에 AAV 함유 용액을 장입하는 단계;
(b) 적어도 2회의 세정 단계를 착수하는 단계; 및
(c) 친화성 수지로부터 AAV를 용출하는 단계.
일부 구현예에서, 본 방법은 음이온 교환체와 AAV 함유 용액을 접촉시키고 음이온 교환체로부터 AAV 함유 용액을 용출시킨 다음 친화성 수지에 AAV 함유 용액을 장입시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 세정 단계들 중 적어도 하나는 친화성 수지에 유기 용매 또는 세제를 포함하는 완충액을 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl 및 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 히스티딘, 히스티딘-HCl, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 글리신, 타우린, MES-Na, 비스-트리스, 및 N-아세틸-D,L-트립토판 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 완충액은 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 염화마그네슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌-HCl 그리고 수크로스 및 글리세롤 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 타우린 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 및 히스티딘-HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl 및 DMSO를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행된다. 일부 구현예에서, 3회의 세정 단계는 수행된다. 일부 구현예에서, 3회의 세정 단계는 연속하여 수행된다.
일부 구현예에서, 유기 용매 또는 세제는 폴리소르베이트 80, 에틸렌 글리콜, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, DMSO, 수크로스, 또는 트레할로스이다. 일부 구현예에서, 세제는 트리톤 X100, 폴리소르베이트 80, 및 트리 (n-부틸) 포스페이트 (TNBP) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 비스-트리스를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 2000 mM 아세트산나트륨 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트 80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 500 mM 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 및 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다.
일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 친화성 수지에 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES-Na)의 약 50 내지 약 500 mM 나트륨 염, 약 3 내지 약 30 mM EDTA, 그리고 폴리소르베이트 80, DMSO 및 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP)를 포함하는 용매/세제 혼합물을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 또는 아르기닌-HCl 및 약 75 내지 약 500 mM 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 80 mM 아르기닌-HCl 및 약 50 내지 약 200 mM 염을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다.
일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 타우린, 및 0.2 내지 1.5% PEG(예를 들면, PEG 6000)을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 300 mM 글리신을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 150 mM 타우린, 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜, 및 0.05 내지 0.2% 옥틸글리코피라노시드를 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다.
일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 80 내지 약 400 mM 비스-트리스, 그리고 약 11:3:3 (중량 기준)의 비율로 약 트리톤-X100, 폴리소르베이트 80 및 TNBP를 포함하는 용매/세제 혼합물 약 10 내지 약 20 그램을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 5 내지 약 20 mmol 시트르산나트륨을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아르기닌-HCl, 약 50 내지 약 200 mM 리신 HCl, 약 50 내지 약 200 mM 히스티딘-HCl, 및 약 1mM 내지 약 4 mM N-아세틸-D,L-트립토판, 및 약 10% 내지 약 40% (w/w) 폴리소르베이트 80을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다.
일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 nM 내지 약 200mM NaAcetate 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 약 5.2 내지 약 6.8의 pH를 갖고;
제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 nM 내지 약 100mM 트리스HCl 및 약 50 nM 내지 약 200 nM의 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 약 7.5 내지 약 8.8의 pH를 갖고;
제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20mM 내지 100 mM 트리스HCl, 약 40% 내지 약 60%(w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다.
일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 nM 내지 약 200mM NaAcetate 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 약 5.2 내지 약 6.8의 pH를 갖고;
제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 nM 내지 약 100mM 트리스HCl 및 약 50 nM 내지 약 200 nM의 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 약 7.5 내지 약 8.8의 pH를 갖고;
제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20mM 내지 100 mM 트리스HCl, 약 40% 내지 약 60%(w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다.
일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다.
일부 구현예에서, 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액에서 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액에서 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 10 내지 약 30 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제4 완충액이 pH 약 6.5 내지 약 8.0인, 제4 세정 단계를 추가로 포함하다.
일부 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 0.1% 폴리소르베이트 80을 포함하고, 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 제2 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 50 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하고, 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아세트산나트륨 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트 80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제1 완충액은 pH 약 5.5 내지 약 6.5이고;
제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 10 내지 약 70 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 8.0 내지 약 9.0이고;
제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 10 내지 약 70 mM 트리스HCl 및 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 8.0 내지 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 10 내지 약 30 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제4 완충액이 pH 약 6.5 내지 약 8.0인, 제4 세정 단계를 추가로 포함하다.
일부 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 아세트산나트륨 및 약 0.1% 폴리소르베이트 80을 포함하고, 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 완충액은 약 50mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 제2 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 50 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하고, 제3 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 산성 성분은 제거된다. 일부 구현예에서, 산성 성분은 숙주 세포 DNA, 예컨대 HEK293 DNA이고, 여기에서 산성 성분은 qPCR에 의해 측정된 경우 AAV 항원의 마이크로그램당 250 pg 미만 값으로 감소된다. 일부 구현예에서, 산성 성분은 숙주 세포 DNA, 예컨대 HEK293 DNA이고, 여기에서 산성 성분은 ELISA에 의해 측정된 경우 AAV 항원의 마이크로그램당 250 pg 미만 값으로 감소된다.
일부 구현예에서, 용출은 경사 용출에 의해 용출 완충액의 전도도의 계속 선형 증가를 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 경사 용출에 의해 유기 용매의 농도의 계속 선형 증가를 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 에틸렌 글리콜, 염 예컨대 NaCl, 및 완충액 예컨대 트리스HCl을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기에서 pH는 적어도 7.0이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 750 mM이고, 완충액 농도는 약 50 mM이고, 에틸렌 글리콜은 50-60% (w/w)이다. 일부 구현예에서, pH는 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이고 완충액은 트리스HCl이다.
일부 구현예에서, 용출은 적어도 7.0의 pH에서 약 750mM NaCl 및 50-60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 적어도 약 55% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 적어도 7.8의 pH에서 약 50 mM 트리스 HCl, 약 750mM 내지 약 1250 mM NaCl 및 약 60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 용출은 적어도 약 8.0의 pH에서 약 2 mM 염화마그네슘, 약 50 mM 아르기닌-HCl, 약 750mM 내지 약 1000 mM NaCl 및 적어도 약 55% (w/w) 수크로스를 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 용출은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(a) 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 제5 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 8.5인, 단계; 및
(b) 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl, 약 40 내지 약 60% (w/w) 글리세롤, 및 약 500 내지 1000 mM 염을 포함하는 제2 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 제2 용출 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 8.5인, 단계.
일부 구현예에서, 단계는 연속하여 수행된다.
일부 구현예에서, 용출은 적어도 약 8.0의 pH에서 약 2 mM 염화마그네슘, 약 50 mM 아르기닌-HCl, 약 750mM 내지 약 1000 mM NaCl 및 적어도 약 50% (w/w) 글리세롤을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 용출은 적어도 약 7.8의 pH에서 약 2 mM 염화마그네슘, 약 50 mM 타우린, 약 600mM 내지 약 1000 mM NaCl, 약 0.05 내지 약 0.2% 옥틸글리코피라노시드, 및 약 60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(a) 약 20 내지 약 100 mM 트리스-HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 제5 완충액이 pH 약 8.0 내지 약 8.8인, 단계; 및
(b) 적어도 약 6.8의 pH에서 약 1 M 황산암모늄, 약 50 mM 트리스 HCl, 및 약 50% (v/v) 에틸렌 글리콜을 포함하는 제2 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계.
일부 구현예에서, 단계는 연속하여 수행된다.
일부 구현예에서, 용출은 적어도 약 6.8의 pH에서 약 1 M 황산암모늄, 약 50 mM 트리스 HCl, 및 약 50% (v/v) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 적어도 약 7.8의 pH에서 약 20% (w/w) 수크로스, 약 10% (w/w) 소르비톨, 약 5% (w/w) 만니톨 또는 약 5% (w/w) 수크로스, 약 15% (w/w) 글리세롤, 약 50 mM 히스티딘, 및 약 750 내지 약 1000 mM NaCl을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 용출은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(a) 약 20 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 80 내지 약 120 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 제5 완충액이 pH 약 8.0 내지 약 8.8인, 단계; 및
(b) 약 20 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 600 내지 약 900 mM NaCl, 및 약 5 내지 60% (w/w) DMSO를 포함하는 제2 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 제5 완충액이 pH 약 6.5 내지 약 8.5인, 단계.
일부 구현예에서, 단계는 연속하여 수행된다. 일부 구현예에서, 용출은 약 2.5의 pH에서 약 100 mM 글리신-HCl, 약 200 mM NaCl을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 용출 완충액은 약 8.0의 pH이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 8.0의 pH이다.
일부 구현예에서, 용출은 반대 이온 농도의 단계적 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 유기 용매 농도의 단계적 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액에서 염은 1가, 2가 또는 다가 음이온, 예컨대 클로라이드, 아세테이트, 설페이트, 및 시트레이트로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아세트산나트륨, 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 25 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 50 내지 약 200 mM NaCl을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 친화성 수지에 정제수를 적용한 다음, pH 약 1.7 내지 약 2.5에서 친화성 수지에 약 20 내지 약 50 mM HCl을 적용함으로써 용출을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 0.5-2.0mM 염산에서 0 내지 100% 20-50mM 염산/800-1200mM NaCl의 경사를 적용함으로써 용출을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 용출 단계로부터 수득된 AAV는 ≤99.9 %의 HC 불순물 준위를 갖는다. 일부 구현예에서, 용출 단계로부터 수득된 AAV는 ≤99.0 %의 HC 불순물 준위를 갖는다.
일부 구현예에서, AAV는 AAV8이고, 친화성 수지는 POROS™ CaptureSelect™ AAV8이고, 용출 완충액은 산성이고 에틸렌 글리콜을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, AAV는 AAV9이고, 친화성 수지는 POROS™ CaptureSelect™ AAV9이고, 용출 완충액은 산성이고 에틸렌 글리콜을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, AAV는 AAV8이고, 친화성 수지는 크로마토그래피 매트릭스에서 고정화된 ADK8 또는 ADK8/9 유형으로부터 AAV8에 대해 고정화된 단클론성 항체로 이루어지는 면역 친화성 수지이다. 일부 구현예에서, AAV는 AAV9이고, 친화성 수지는 크로마토그래피 매트릭스에서 고정화된 ADK9 또는 ADK8/9 유형으로부터 AAV9에 대해 고정화된 단클론성 항체로 이루어지는 면역 친화성 수지이다.
일부 구현예에서, 본 방법은 AAV 함유 용액으로부터 산성 하전된 오염물을 고갈시키는데 효과적인 양으로 하전된 그룹을 포함하는 필터와 AAV 함유 용액을 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 35 nm 초과 바이러스를 제거하기 위한 AAV 분획의 나노여과를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 촉모 겔을 포함하는 컬럼이 있는 AEX 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 연마 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 분획을 시험하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 특이적 ELISA는 AAV에 특이적인 샌드위치 ELISA이다.
또 다른 양태에서 제 1 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 AAV 산물은 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 세정 단계가 없는 비교 정제 프로토콜 (레인 6)과는 대조적으로 본원에서 기재된 다중 세정 단계가 있는 정제 프로토콜 (레인 4)에 따른 실질적으로 더 적은 열 충격 단백질(Heat Shock Protein) 70 kDa (HSP70)을 나타내는 웨스턴 블랏을 도시한다.
도 2는 레인 2에서 AAV8 단백질, 본원에서 기재된 다중 세정 단계가 있는 정제 프로토콜 (레인 4) 및 세정 단계가 없는 비교 정제 프로토콜 (레인 6)으로부터 AAV8-함유 용출액을 나타내는 SDS-PAGE 실버 스테인 겔을 도시한다.
도 3은 세정 단계가 없는 비교 정제 프로토콜 (레인 6)으로부터의 용출액보다 본원에서 기재된 다중 세정 단계가 있는 정제 프로토콜 (레인 4)에 따라 제조된 용출액에서 존재하는 더 많은 AAV8을 나타내는 웨스턴 블랏을 도시한다. AAV8 참조 샘플은 레인 2이다.
도 4는 AAV8을 발현시키는 HEK 293 세포로부터 세포 배양 배지의 (L) 초기 장입부터, AAV8에서 농축된 용출액 (E)까지 다양한 분획에서 존재하는 단백질을 나타내는 SDS-PAGE 실버 스테인 겔을 도시한다. 세정 단계 (W1, W2, 및 W3)로부터 통과액에서 AAV8의 손실이 거의 없었고 박리 (S) 동안 컬럼으로부터 용출된 AAV8은 거의 없었다.
도 5는 AAV8 항원에 대한 웨스턴 블랏을 도시한다. AAV8은 AAV8 (L)을 발현시키는 HEK 293 세포로부터 세포 배양 배지의 초기 장입에서 발현되었다. 실질적으로 더 적은 AAV8은 그 초기 장입 (FT) 및 후속적인 세정 단계 (W1, W2 및 W3)으로부터 통과액에서 존재하였다. AAV8은 용출액 (E, E2)에서 존재하였다. 재차, 실질적으로 더 적은 AAV8은 박리 (S) 동안 컬럼으로부터 용출되었다.
도 6은 실시예 3에 따른 분리 절차의 크로마토그램을 도시한다.
도 7은 실시예 11에 따른 분리 절차의 크로마토그램을 도시한다.
도 8은 실시예 11에 따른 용출액 및 다양한 세정 단계로부터 다양한 분획에서 존재하는 단백질을 나타내는 SDS-PAGE 실버 스테인 겔을 도시한다.
도 9는 실시예 12에 따른 분리 절차의 크로마토그램을 도시한다.
도 10은 실시예 12에 따른 용출액 및 다양한 세정 단계로부터 다양한 분획에서 존재하는 단백질을 나타내는 SDS-PAGE 실버 스테인 겔을 도시한다.
도 11은 실시예 13에 따른 분리 절차의 크로마토그램을 도시한다.
도 12는 실시예 13에 따른 용출액 및 다양한 세정 단계로부터 다양한 분획에서 존재하는 단백질을 나타내는 SDS-PAGE 실버 스테인 겔을 도시한다.
도 13은 실시예 14에 따른 분리 절차의 크로마토그램을 도시한다.
도 14는 실시예 14에서 기재된 바와 같은 용출액 및 세정 단계로부터 채집된 다양한 분획에서 존재하는 단백질을 나타내는 SDS-PAGE 실버 스테인 겔을 도시한다.
도 15는 실시예 14에서 기재된 바와 같은 용출액 및 세정 단계로부터 채집된 다양한 분획으로부터 AAV 항원에 대한 웨스턴 블랏을 도시한다.
도 16은 실시예 15에 따른 분리 절차의 크로마토그램을 도시한다.
도 17은 실시예 16에 따른 분리 절차의 크로마토그램을 도시한다.
도 18은 실시예 16에서 기재된 바와 같은 용출액 및 세정 단계로부터 채집된 다양한 분획으로부터 AAV 항원에 대한 웨스턴 블랏을 도시한다.
도 19는 실시예 17에 따른 분리 절차의 크로마토그램을 도시한다.
도 20은 실시예 17에서 기재된 바와 같은 용출액 및 세정 단계로부터 채집된 다양한 분획에서 존재하는 단백질을 나타내는 SDS-PAGE 실버 스테인 겔을 도시한다.
도 21은 실시예 18에서 기재된 용출 스크린으로부터 결과를 나타내는 크로마토그램을 도시한다.
상세한 설명
아데노-연관 바이러스(AAV) 산물을 생산하는 방법, AAV를 정제하는 방법, 그리고 엠프티(empty) AAV 캡시드 및 풀(full) AAV 캡시드를 포함하는 농축된 AAV 분획으로부터 풀 AAV 캡시드를 정제하는 방법은 본원에서 제공된다.
본 개시내용을 기재하는 맥락에서 (특히 하기 청구항들의 맥락에서) 용어 "한", "하나" 및 "상기", 그리고 유사한 지시대상의 용도는, 본원에서 달리 명시되지 않는 한 또는 맥락에 의해 분명히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 모두를 포함하도록 해석된다. 용어 "포함하는", "갖는", "포괄하는", 및 "함유하는"은 달리 지적되지 않는 한 개방형 용어 (즉, "비제한적으로, 포함하는" 의미)로서 해석된다.
본원에서 값들의 범위의 인용은, 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 범위 및 각각의 종점 내에 해당하는 각각의 별도 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 작용하기 위한 것일 뿐이고, 각각의 별도 값 및 종점은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 편입된다.
본원에서 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않는 한 또는 맥락에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적 언어 (예를 들면, "예컨대")의 용도는 본 개시내용을 더욱 양호하게 단지 설명하기 위한 것이고 달리 청구되지 않는 한 본 개시내용의 범위에 제한을 두지 않는다. 명세서에서 언어는 본 개시내용의 실시에 필수로서 임의의 비-청구된 요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 개시내용의 바람직한 구현예는, 본 개시내용 실시를 위하여 본 발명자들에게 알려진 최상의 방식을 포함하여, 본원에서 기재된다. 그 바람직한 구현예의 변이형은 전술한 설명 판독시 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 그와 같은 변이형을 적절하게 이용할 것을 예상하고, 본 발명자들은 본 개시내용이 본원에서 구체적으로 기재된 것과 달리 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 개시내용은 적용가능한 법에 의해 허용된 바와 같이 본원에 부가된 청구항에서 인용된 요지의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 이의 모든 가능한 변이형에서 상기-기재된 요소의 임의의 조합은 본원에서 달리 명시되지 않는 한 또는 맥락에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한 본 개시내용에 의해 포괄된다.
세포 배양물내 AAV 벡터 생성의 특성은 파괴된 세포로부터 물질을 포함하는 복합 매트릭스의 형성이다. 특히, 숙주 세포 단백질, 프로테아좀, 세포 파편 및 잠재적 바이러스-특이적 수용체는 파괴된 세포로부터 물질에서 종종 존재한다. 개시된 방법은 생리적으로 적용가능한 pH에서 더 큰 순도를 초래하는 조건에서 최종 AAV 산물로부터 숙주 세포 물질을 제거하기 위한 단계를 포함한다.
일 양태에서 아데노-연관 바이러스(AAV)를 정제하는 방법은 제공된다. 본 방법은 (a) 용액에서의 AAV와 친화성 수지 사이 결합을 허용하는 조건 하에서 AAV에 대해 표적화된 친화성 수지에 AAV 함유 용액을 장입하는 단계; (b) 적어도 2회의 세정 단계를 착수하는 단계; 및 (c) 친화성 수지로부터 AAV를 용출하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 방법에 의해 정제된 AAV는 AAV1 혈청형, AAV2 혈청형, AAV3 혈청형, AAV4 혈청형, AAV5 혈청형, AAV6 혈청형, AAV7 혈청형, AAV8 혈청형, AAV9 혈청형, AAV10 혈청형, AAV11 혈청형, AAV12 혈청형, AAV13 혈청형, AAAV 혈청형, BAAV 혈청형, AAV (VR-195) 혈청형, 및 AAV (VR-355) 혈청형이다. 일부 구현예에서, AAV는 유전공학에 의해 변형되고/거나 화학적으로 변형된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 음이온 교환체와 AAV-함유 용액을 접촉시키고 음이온 교환체로부터 AAV 함유 용액을 용출시킨 다음 AAV 함유 용액을 친화성 수지에 장입하는 단계를 추가로 포함한다. 음이온 교환체는 통과 방식으로 작동될 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 단계들 중 적어도 하나는 친화성 수지에 유기 용매 또는 세제를 포함하는 완충액을 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl 및 염, 예를 들면, NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 염화마그네슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌-HCl 그리고 수크로스 및 글리세롤 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 타우린 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 및 히스티딘-HCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl 및 DMSO를 포함한다.
일부 구현예에서, 완충액은 아르기닌-HCl 및 염, 예를 들면, NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 히스티딘 및 염, 예를 들면, NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 유기 용매는 DMSO이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행된다. 일부 구현예에서, 3회의 세정 단계는 수행된다. 일부 구현예에서, 3회의 세정 단계는 연속하여 수행된다.
일부 구현예에서, 유기 용매 또는 세제는 폴리소르베이트 80, 에틸렌 글리콜, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, DMSO, 수크로스, 또는 트레할로스이다. 일부 구현예에서, 세제는 트리톤 X100, 폴리소르베이트 80, 및 트리 (n-부틸) 포스페이트 (TNBP) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 비스-트리스를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 2000 mM 아세트산나트륨 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트 80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 500 mM 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고; 제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 및 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액에서 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액에서 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 10 내지 약 30 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제4 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 pH 약 6.5 내지 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 0.1% 폴리소르베이트 80을 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 50 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 유기 용매 또는 세제는 폴리소르베이트 80, 에틸렌 글리콜, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 또는 트레할로스이다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아세트산나트륨 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트 80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.5 내지 약 6.5이고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 10 내지 약 70 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 pH 약 8.0 내지 약 9.0이고; 제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 10 내지 약 70 mM 트리스HCl 및 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 8.0 내지 약 9.0이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 10 내지 약 30 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제4 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 pH 약 6.5 내지 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 아세트산나트륨 및 약 0.1% 폴리소르베이트 80을 포함하고, 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 완충액은 약 50mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 50 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는다.
더 많은 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES-Na)의 약 50 내지 약 500 mM 나트륨 염, 약 3 내지 약 30 mM EDTA, 그리고 폴리소르베이트 80, DMSO 및 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP)를 포함하는 용매/세제 혼합물을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 또는 아르기닌-HCl 및 약 75 내지 약 500 mM 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고; 제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 80 mM 아르기닌-HCl 및 약 50 내지 약 60% (w/w) 수크로스를 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액에서 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액에서 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제4 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 제1 용출 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl 및 약 40 내지 약 60% (w/w) 수크로스를 포함하는 제1 용출 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 용출 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 용출 단계 이후 및 제2 용출 단계 이전 발생하는 제5 세정 단계를 추가로 포함하고, 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다. 일부 구현예에서, 제2 용출 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl, 약 40 내지 약 60% (w/w) 글리세롤, 및 약 500 내지 1000 mM 염 (예를 들면, NaCl)을 포함하는 제2 용출 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 용출 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다. 제5 세정 단계는, 예를 들면, 제1 및 제2 용출 완충액의 혼합물에서 비롯할 수 있는 직면이 아닌 제1 및 제2 용출 완충액 자체에 의해서만 유발된 용출을 제공하는, 제1 및 제2 용출 단계 사이 직면하는 효과를 최소화하는데 효과적일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제5 세정 단계 및 제2 용출 단계 이후 발생하는 제6 세정 단계를 추가로 포함하고, 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제6 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES-Na)의 약 100 mM 나트륨 염, 약 10 mM EDTA, 그리고 약 18 그램의 폴리소르베이트 80, 3.5 그램 DMSO 및 3.5 그램의 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP)를 포함하는 약 11 g/kg의 용매/세제 혼합물을 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 50 mM 아르기닌-HCl 및 약 100 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 아르기닌-HCl 및 약 50 % (w/w) 수크로스를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 50 mM 아르기닌-HCl 및 약 100 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제5 완충액은 약 50 mM 아르기닌-HCl 및 약 100 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제6 완충액은 약 50 mM 아르기닌-HCl 및 약 100 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제6 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 타우린, 및 0.2 내지 1.5% PEG (예를 들면, PEG 6000)을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 300 mM 글리신을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고; 제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 150 mM 타우린, 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜, 및 0.05 내지 0.2% 옥틸글리코피라노시드를 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제4 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다.
일부 구현예에서, 제1 용출 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 70 mM 타우린, 약 50 내지 약 70 vol% 에틸렌 글리콜, 0.05 내지 0.2% 옥틸글리코피라노시드, 및 약 600 내지 약 900 mM NaCl을 포함하는 제1 용출 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 용출 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 용출 단계 이후 및 제2 용출 단계 이전 발생하는 제5 세정 단계를 추가로 포함하고, 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다. 제5 세정 단계는 직면하는 효과를 최소화하는데 효과적일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 용출 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 70 mM 트리스HCl, 0.05 내지 0.2 M 황산암모늄, 및 약 40 내지 약 60 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하는 제2 용출 완충액을 적용하는 단계를 포함하고 여기에서 제2 용출 완충액은 pH 약 6.5 내지 약 7.5이다. 제5 세정 단계는, 예를 들면, 제1 및 제2 용출 완충액의 혼합물에서 비롯할 수 있는 직면이 아닌 제1 및 제2 용출 완충액 자체에 의해서만 유발된 용출을 제공하는, 제1 및 제2 용출 단계 사이 직면하는 효과를 최소화하는데 효과적일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 제5 세정 단계 및 제2 용출 단계 이후 발생하는 제6 세정 단계를 추가로 포함하고, 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제6 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 타우린, 및 약 0.5% PEG 6000을 갖되 여기에서 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 100 mM 글리신을 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 타우린, 약 50% (w/w) 에틸렌 글리콜, 및 0.1% 옥틸글리코피라노시드를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제5 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제6 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제6 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 80 내지 약 400 mM 비스-트리스, 그리고 약 11:3:3 (중량 기준)의 비율로 트리톤-X100, 폴리소르베이트 80 및 TNBP를 포함하는 용매/세제 혼합물의 약 10 내지 약 20 그램을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 5 내지 약 20 mmol 시트르산나트륨을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고; 제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아르기닌-HCl, 약 50 내지 약 200 mM 리신 HCl, 약 50 내지 약 200 mM 히스티딘-HCl, 약 1mM 내지 약 4 mM N-아세틸-D,L-트립토판, 및 약 10% 내지 약 40% (w/w) 폴리소르베이트 80을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 히스티딘 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제4 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다.
일부 구현예에서, 제1 용출 단계는 친화성 수지에 약 15 내지 25% 수크로스, 5% 내지 15% (w/w) 소르비톨, 3% 내지 7% (w/w) 만니톨, 10% 내지 20% (w/w) 글리세롤, 40 내지 60 mM 히스티딘 및 700 내지 900 mM 염 (예를 들면, NaCl)을 포함하는 제1 용출 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 용출 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 용출 단계 이후 및 제2 용출 단계 이전 발생하는 제5 세정 단계를 추가로 포함하고, 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 히스티딘 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 제2 용출 단계는 친화성 수지에 약 30 내지 약 70 mM 트리스HCl, 약 700 내지 약 900 mM 염 (예를 들면, NaCl), 및 40% 내지 60% (w/w) DMSO를 포함하는 제2 용출 완충액을 적용하는 단계를 포함하고 여기에서 제2 용출 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다. 제5 세정 단계는, 예를 들면, 제1 및 제2 용출 완충액의 혼합물에서 비롯할 수 있는 직면이 아닌 제1 및 제2 용출 완충액 자체에 의해서만 유발된 용출을 제공하는, 제1 및 제2 용출 단계 사이 직면하는 효과를 최소화하는데 효과적일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제5 세정 단계 및 제2 용출 단계 이후 발생하는 제6 세정 단계를 추가로 포함하고, 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 히스티딘 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제6 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 200 mM 비스-트리스, 약 11:3:3 (중량 기준)의 비율로 약 트리톤-X100, 폴리소르베이트 80 및 TNBP를 포함하는 용매/세제 혼합물의 약 16 내지 약 17 그램을 포함하되 여기에서 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 완충액은 약 10 mmol 시트르산나트륨을 포함하고, 제2 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 완충액은 약 100 mM 아르기닌-HCl, 약 100 mM 리신-HCl, 약 100 mM 히스티딘-HCl, 약 2mM N-아세틸-D,L-트립토판, 및 약 20% (w/w) 폴리소르베이트 80을 포함하고, 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 50 mM 히스티딘 및 약 100 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제5 완충액은 약 50 mM 히스티딘 및 약 100 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제6 완충액은 약 50 mM 히스티딘 및 약 100 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제6 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 nM 내지 약 200mM NaAcetate 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 약 5.2 내지 약 6.8의 pH를 갖고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 nM 내지 약 100mM 트리스HCl 및 약 50 nM 내지 약 200 nM의 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 약 7.5 내지 약 8.8의 pH를 갖고; 제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20mM 내지 100 mM 트리스HCl, 약 40% 내지 약 60%(w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 10 내지 약 50 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제4 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 pH 약 6.5 내지 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제3 세정 단계 이후 발생하는, 그리고 친화성 수지에 약 20mM 내지 약 100 mM 트리스HCl, 약 50% 내지 약 70%(w/w) 에틸렌 글리콜, 및 약 500 내지 약 900 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제5 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제5 세정 단계 이후 발생하는, 그리고 친화성 수지에 약 10mM 내지 약 50 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제6 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제6 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제6 완충액은 pH 약 7.0 내지 약 8.0이다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 타우린, 및 약 0.5% PEG 6000을 포함하되 여기에서 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 100 mM 글리신을 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2를 갖는다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 타우린, 약 50 vol% 에틸렌 글리콜, 및 0.1% 옥틸글리코피라노시드를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 20 mM 트리스-HCl 및 약 150 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 약 7.4의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제5 완충액은 약 50 mM 트리스HCl, 60%(w/w) 에틸렌 글리콜, 및 750 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제6 완충액은 약 20 mM 트리스HCl 및 약 150 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제6 완충액은 약 7.4의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 nM 내지 약 200mM NaAcetate 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 약 5.2 내지 약 6.8의 pH를 갖고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 20 nM 내지 약 100mM 트리스HCl 및 약 50 nM 내지 약 200 nM의 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 약 7.5 내지 약 8.8의 pH를 갖고; 제3 세정 단계는 친화성 수지에 약 20mM 내지 100 mM 트리스HCl, 약 40% 내지 약 60%(w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 10 내지 약 50 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제4 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 pH 약 6.5 내지 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제3 세정 단계 이후 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 20mM 내지 약 100 mM 트리스HCl, 약 50% 내지 약 70%(w/w) 에틸렌 글리콜, 및 약 500 내지 약 900 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제5 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제5 세정 단계 이후 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 10mM 내지 약 50 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제6 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제6 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제6 완충액은 pH 약 7.0 내지 약 8.0이다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 타우린, 및 약 0.5% PEG 6000을 포함하되 여기에서 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 100 mM 글리신을 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 타우린, 약 50 vol% 에틸렌 글리콜, 및 0.1% 옥틸글리코피라노시드를 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 20 mM 트리스-HCl 및 약 150 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제4 완충액은 약 7.4의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제5 완충액은 약 50 mM 트리스HCl, 60%(w/w) 에틸렌 글리콜, 및 750 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제5 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제6 완충액은 약 20 mM 트리스HCl 및 약 150 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제6 완충액은 약 7.4의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아세트산나트륨, 및 0.05 내지 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 25 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 50 내지 200 mM 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제3 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 제1 용출 단계는 친화성 수지에 정제수를 적용한 다음, 3.0 내지 3.5의 pH에서 0.5 내지 2 mM HCl을 적용한 다음, 약 25 내지 약 100 mM 트리스HCl, 약 500 내지 약 1000 mM NaCl, 및 약 25% 내지 약 75% DMSO (w/w)를 포함하는 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 용출 단계 이후 및 제2 용출 단계 이전 발생하는 제4 세정 단계를 추가로 포함하고, 세정 단계는 친화성 수지에 정제수를 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용출 단계는 친화성 수지에 약 20 내지 약 50 mM HCl을 pH 약 1.7 내지 약 2.5에서 적용하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 아세트산나트륨, 및 약 0.1% 폴리소르베이트80을 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 50 mM 트리스HCl, 약 125 mM NaCl을 포함하고, 제2 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제1 용출 단계는 친화성 수지에 정제수를 적용한 다음, 약 3.2의 pH에서 1 mM HCl을 적용한 다음, 친화성 수지에 약 50 mM 트리스HCl, 약 750 mM NaCl, 및 약 50% DMSO (w/w)를 포함하는 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 완충액은 약 8.0의 pH를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 용출 단계는 친화성 수지에 약 33 mM HCl을 약 2.0의 pH에서 적용하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 3회의 세정 단계는 수행되고; 제1 세정 단계는 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아세트산나트륨, 및 0.05 내지 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고; 제2 세정 단계는 친화성 수지에 약 25 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 50 내지 200 mM 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 제1 세정 단계 이전 발생하는 그리고 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하는 제3 세정 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 제1 용출 단계는 친화성 수지에 0.5-2.0mM 염산에서 0 내지 100% 20-50mM 염산/800-1200mMNaCl의 경사를 적용하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 경사는 1mM 염산에서 0 내지 100% 33mM 염산/1000mMNaCl이다. 특정 구현예에서, 제1 용출 단계는 정제수를 이용한 세정이 선행된다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM 아세트산나트륨, 및 약 0.1% 폴리소르베이트80을 포함하고, 여기에서 제1 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 50 mM 트리스HCl, 약 125 mM NaCl을 포함하고, 제2 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 여기에서 제3 완충액은 약 8.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 제1 용출 단계는 친화성 수지에 약 50 mM 트리스HCl, 약 750 mM NaCl, 및 약 50% DMSO (w/w)를 포함하는 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 완충액은 약 8.0의 pH를 포함한다.
일부 구현예에서, 유기 용매 또는 세제는 폴리소르베이트 80, 에틸렌 글리콜, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 또는 트레할로스이다.
일부 구현예에서, 산성 성분은 제거된다. 일부 구현예에서, 산성 성분은 숙주 세포 DNA, 예컨대 HEK293 DNA이고, 산성 성분은 qPCR에 의해 측정된 경우 AAV 항원의 마이크로그램당 250 pg 미만 값으로 감소된다. 일부 구현예에서, 산성 성분은 숙주 세포 DNA, 예컨대 HEK293 DNA이고, 산성 성분은 ELISA에 의해 측정된 경우 AAV 항원의 마이크로그램당 250 pg 미만 값으로 감소된다.
일부 구현예에서, 용출은 에틸렌 글리콜, 염 예컨대 NaCl을 포함하는 용출 완충액, 및 완충액 예컨대 트리스HCl과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기에서 pH는 적어도 7.0이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 750 mM이고, 완충액 농도는 약 50 mM이고, 에틸렌 글리콜은 50-60% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 55% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이고 완충액은 트리스HCl이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 8.0이다.
일부 구현예에서, 용출은 당류, 예컨대 수크로스, 염을 포함하는 용출 완충액, 및 완충액, 예컨대 아르기닌-HCl과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기에서 pH는 적어도 8.0이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 800 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액 농도는 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, 당류는 수크로스이고 용출 완충액은 50-60% (w/w) 수크로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 1-3 mM MgCl2, 또는 약 2 mM MgCl2를 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이고 완충액은 아르기닌-HCl이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 8.0이다.
일부 구현예에서, 용출은 에틸렌 글리콜, 염 예컨대 NaCl, 및 타우린을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기에서 pH는 적어도 7.0이다. 일부 구현예에서, pH는 8.0이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 750 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액 농도는 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜은 농도는 50-70% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 55% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 0.05 - 0.2% 옥틸글리코피라노시드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 8.0이다.
일부 구현예에서, 용출은 (i) 수크로스, 소르비톨, 만니톨 및 글리세롤의 혼합물, (ii) 염 예컨대 NaCl, 및 (iii) 완충액 예컨대 히스티딘을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기에서 pH는 적어도 7.8이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 800 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액 농도는 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, 수크로스의 농도는 약 20% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 소르비톨의 농도는 약 10% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 만니톨의 농도는 약 5% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 글리세롤의 농도는 약 15% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이고 완충액은 히스티딘이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 8.0이다.
일부 구현예에서, (i) 완충액, (ii) 염 예컨대 NaCl, 및 (iii) 50-60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는 제2 용출 단계는 착수되고, 여기에서 pH는 적어도 8.0이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 1000 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액 농도는 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 60% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스 HCl이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이고 완충액은 히스티딘이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 8.0이다.
일부 구현예에서, (i) 완충액, (ii) 염 예컨대 NaCl, 및 (iii) 50-60% (v/v) 글리세롤을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는 제2 용출 단계는 착수되고, 여기에서 pH는 적어도 8.0이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 800 mM이고, 완충액 농도는 약 50 mM이고, 글리세롤의 농도는 50% (v/v)이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이고 완충액은 아르기닌-HCl이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 8.0이다. 다양한 구현예에서, 제5 세정 단계는 제1 용출 단계 이후 및 제2 용출 단계 이전 수행된다. 제5는 단계는 7.5 내지 8.5의 pH에서 40-60 mM 아르기닌-HCl 및 80-120 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다. 제5 세정 단계는, 예를 들면, 제1 및 제2 용출 완충액의 혼합물에서 비롯할 수 있는 직면이 아닌 제1 및 제2 용출 완충액 자체에 의해서만 유발된 용출을 제공하는, 제1 및 제2 용출 단계 사이 직면하는 효과를 최소화하는데 효과적일 수 있다.
일부 구현예에서, (i) 완충액, (ii) 염 예컨대 (NH4)2SO4, 및 (iii) 40-60% (v/v) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는 제2 용출 단계는 착수되고, 여기에서 pH는 적어도 8.0이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 1 M이고, 완충액 농도는 약 50 mM이고, 에틸렌 글리콜의 농도는 50% (v/v)이다. 일부 구현예에서, 염은 (NH4)2SO4이고 완충액은 트리스HCl이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 7.0이다. 다양한 구현예에서, 제5 세정 단계는 제1 용출 단계 이후 및 제2 용출 단계 이전 수행된다. 제5는 단계는 7.5 내지 8.5의 pH에서 40-60 mM 타우린, 50-70% (w/w) 에틸렌 글리콜, 600-900 mM NaCl, 및 0.05-0.2% 옥틸글리코피라노시드를 포함하는 제5 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다. 제5 세정 단계는, 예를 들면, 제1 및 제2 용출 완충액의 혼합물에서 비롯할 수 있는 직면이 아닌 제1 및 제2 용출 완충액 자체에 의해서만 유발된 용출을 제공하는, 제1 및 제2 용출 단계 사이 직면하는 효과를 최소화하는데 효과적일 수 있다.
일부 구현예에서, (i) 완충액, (ii) 염 예컨대 NaCl, 및 (iii) 50-60% (w/w) DMSO를 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는 제2 용출 단계는 착수되고, 여기에서 pH는 적어도 8.0이다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 1000 mM이다. 일부 구현예에서, 완충액 농도는 약 50 mM이다. 일부 구현예에서, DMSO의 농도는 50% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이고 완충액은 트리스HCl이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 8.0이다. 다양한 구현예에서, DMSO-함유 용출 완충액은 Capture Select AAV8 수지로부터 AAV8가 아닌 AAV9를 용출하는데 효과적이다. 다양한 구현예에서, DMSO-함유 용출 완충액은 Capture Select AAVx 수지로부터 AAV8 및 AAV9를 용출하는데 효과적이다. 다양한 구현예에서, DMSO-함유 용출 완충액은 Capture Select AAV8 수지로부터, AAV8이 아닌, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAAV, BAAV, AAV (VR-195) 및 AAV (VR-355) 중 하나 이상을 용출하는데 효과적이다. 다양한 구현예에서, DMSO-함유 용출 완충액은 Capture Select AAVx 수지로부터 임의의 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAAV, BAAV, AAV (VR-195) 및 AAV (VR-355)를 용출하는데 효과적이다.
다양한 구현예에서, 제5 세정 단계는 제1 용출 단계 이후 및 제2 용출 단계 이전 수행된다. 제5는 단계는 8.0 내지 8.8의 pH에서 40-60 mM 히스티딘 및 70-130 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다. 제5 세정 단계는, 예를 들면, 제1 및 제2 용출 완충액의 혼합물에서 비롯할 수 있는 직면이 아닌 제1 및 제2 용출 완충액 자체에 의해서만 유발된 용출을 제공하는, 제1 및 제2 용출 단계 사이 직면하는 효과를 최소화하는데 효과적일 수 있다.
일부 구현예에서, 용출은 경사 용출에 의해 용출 완충액의 전도도의 계속 선형 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 경사 용출에 의해 유기 용매의 농도의 계속 선형 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 적어도 7.0의 pH에서 약 750mM NaCl 및 50-60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 55% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 약 8.0의 pH이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 8.0의 pH이다.
일부 구현예에서, 용출은 반대 이온 농도의 단계적 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출은 유기 용매 농도의 단계적 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액에서 염은 1가, 2가 또는 다가 음이온, 예컨대 클로라이드, 아세테이트, 설페이트, 및 시트레이트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 용출 단계로부터 수득된 AAV는 ≤99.9 %의 HC 불순물 준위를 갖는다. 일부 구현예에서, 용출 단계로부터 수득된 AAV는 ≤99.0 %의 HC 불순물 준위를 갖는다.
일부 구현예에서, AAV는 AAV8이고, 친화성 수지는 POROS™ CaptureSelect™ AAV8이고, 여기에서 용출 완충액은 산성이고 에틸렌 글리콜을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, AAV는 AAV9이고, 친화성 수지는 POROS™ CaptureSelect™ AAV9이고, 여기에서 용출 완충액은 산성이고 에틸렌 글리콜을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, AAV는 AAV8이고, 여기에서 친화성 수지는 크로마토그래피 매트릭스에서 고정화된 ADK8 또는 ADK8/9 유형으로부터 AAV8에 대해 고정화된 단클론성 항체로 이루어지는 면역 친화성 수지이다. 일부 구현예에서, AAV는 AAV9이고, 여기에서 친화성 수지는 크로마토그래피 매트릭스에서 고정화된 ADK9 또는 ADK8/9 유형으로부터 AAV9에 대해 고정화된 단클론성 항체로 이루어지는 면역 친화성 수지이다.
일부 구현예에서, 본 방법은 AAV 함유 용액으로부터 산성 하전된 오염물을 고갈시키는데 효과적인 양으로 하전된 그룹을 포함하는 필터와 AAV 함유 용액을 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 35 nm 초과 바이러스를 제거하기 위해 AAV 분획의 나노여과를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 촉모 겔을 포함하는 컬럼이 있는 AEX 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 연마 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은, 예를 들면, AAV8에 특이적인 또는 AAV9에 특이적인 AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 분획을 시험하는 단계를 추가로 포함한다. AAV 특이적 ELISA는 AAV, 예를 들면, AAV8 또는 AAV9에 특이적인 샌드위치 ELISA일 수 있다.
또 다른 양태에서 본원에서 기재된 임의의 방법으로 생산된 AAV 산물은 제공된다.
AAV 입자, 예를 들면, AAV8 및 AAV9 입자는 복수의 정의된 세정 단계를 착수함으로써, 예를 들면, AAV-결합된 친화성 매트릭스에 세정 완충액을 적용함으로써 친화성 단계, 및 상기 바이러스의 감염성을 보유하기 위해 거의 중성 pH 조건에서 용출로 정제된다. 특정 구현예에서, 음이온 교환 단계는 친화성 단계에 앞서 포함된다. 음이온 교환체 단계는 통과 방식으로 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 친화성 단계에서 사용된 친화성 수지의 주기 시간에 영향을 가지고 있는 오염물은 고갈될 수 있다.
본 발명의 방법은 AAV의 더 높은 순도, 숙주 세포 단백질의 제거, 숙주 세포 DNA의 고갈, 잠재적인 바이러스 수용체의 제거, AAV가 (예를 들면, 세정 단계 동안) 리간드에서 결합되는 지질 외피 바이러스의 부분적 내지 완전한 불활성화, 및 (예를 들면, 용출 단계 동안) 액체상에서 지질 외피 바이러스의 부분적 내지 완전한 불활성화를 초래할 수 있다. 이론에 의한 구속됨의 바램 없이, 에틸렌 글리콜은 독자적으로, 또는 또 다른 첨가제와 조합으로, 그와 같은 지질 외피 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 예시적 첨가제는 비이온성 세제, 지방족 제제 (예를 들면, TnBP), 및 세제 (예를 들면, 폴리소르베이트 (예를 들면, Tween), 트리톤 X100, TnBP)를 포함한다. 예를 들어, 용매-세제 혼합물은 1% 트리톤 X100, 0.3% 트리-N-부틸 포스페이트, 및 0.3% TWEEN 80을 포함할 수 있다.
외피 바이러스의 불활성화는 바쿨로(Baculo) 형질감염 시스템이 사용되는 경우 특히 중요할 수 있다. 본원에서 기재된 다양한 구현예에 따른 용출은 낮은 pH 노출을 예방할 수 있고 AAV의 높은 효능을 보유할 수 있다. 추가 개선은 본원에서 기재된 다양한 구현예 및 실시예에 따라 연속하여 세정 단계 및 용출 단계를 착수하는 경우 나타날 수 있다.
"컬럼에서" 지질 외피 바이러스의 불활성화는, 아래 표 1에서 요약된 바와 같이, 상기 실시예 11, 12 및 13에서 다양한 친화성 크로마토그래피 실행에서 시험되었다.
Figure pct00001
DMSO 함유 완충액 세정 X 완충액은 중성 pH (예를 들면, pH 8.0) 가까이에서 CaptureSelect AAV8 수지에 AAV8이 아닌 AAV9의 용출을 유발시키는데 효과적일 수 있고, 그 결과는 놀라웠다. DMSO 함유 완충액 세정 X 완충액은 중성 pH (예를 들면, pH 8.0) 가까이에서 CaptureSelect AAVx 수지에, 비제한적으로, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAAV, BAAV, AAV (VR-195), 및 AAV (VR-355)를 포함하는, 다양한 AAV의 용출을 유발시키는데 효과적일 수 있고, 그 결과는 놀라웠다. 이론에 의한 구속됨의 바램 없이, 세정 X 완충액은 컬럼의 세정 및/또는 지질-외피 바이러스의 불활성화 또는 분해의 활성을 갖는 것으로 기대된다. 세정 X 완충액이 AAV8보다 AAV9를 차별적으로 용출시킬 것이라는 기대는 없었다.
친화성 정제 단계는 하나 이상의 세정 단계를 포함한다. 하나 이상의 세정 단계는 하나 이상의 용출 단계가 뒤따를 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은, 친화성 정제 단계에 앞서 발생하는, 여과 단계를 포함한다.
AAV 입자 (예를 들면, AAV8, AAV9, 등)을 생산하기 위해, 숙주 세포, 예를 들면, HEK293 세포 배양 후, 그리고 정화된 무세포 배양 상청액이 농축되고/거나 여과된 후, 바이러스성 입자는 친화성 매트릭스에 장입된다. 특정 구현예에서, 바이러스성 입자는 약 7.4 내지 약 7.8 범위의 pH를 갖는 용액에서 장입된다. 특정 구현예에서, 바이러스성 입자는 약 8.3 내지 약 8.7 범위의 pH를 갖는 용액에서 장입된다. 특정 구현예에서, 바이러스성 입자는 약 8.5의 pH를 갖는 용액에서 장입된다. 특정 구현예에서, pH는 8.3 내지 8.7이고 용액은 NaCl 및 트리스HCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스성 입자는 약 20 mM 트리스HCl 및 약 150 mM NaCl을 포함하는, 그리고 약 8.5의 pH를 갖는 용액에서 장입된다.
동일한 또는 상이한 완충액을 각각 연루하는, 적어도 3회의 상이한 세정 단계는 착수될 수 있다. 특정 구현예에서, 세정 완충액은 상이하다.
특정 구현예에서, 제1 세정 단계는, 아세트산나트륨 (NaAcetate)계 완충액일 수 있는, 제1 완충액을 사용한다. 특정 구현예에서, 제1 세정 단계는 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES-Na)의 나트륨 염, EDTA, 및 폴리소르베이트 80, DMSO 및 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP)를 포함하는 용매/세제 혼합물을 포함하는 제1 완충액을 사용한다. 특정 구현예에서, 제1 세정 단계는 약 50 내지 약 200 mM 타우린, 및 0.2 내지 1.5% PEG (예를 들면, PEG 6000)을 포함하는 제1 완충액을 사용한다. 특정 구현예에서, 제1 세정 단계는 비스-트리스, 및 트리톤-X100, 폴리소르베이트 80 및 TNBP를 포함하는 용매/세제 혼합물을 포함하는 제1 완충액을 사용한다. 특정 구현예에서, 제1 세정 단계는 아세트산나트륨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 제1 완충액을 사용한다.
특정 구현예에서, 제2 세정 단계는, 염화나트륨 (NaCl)을 포함하는 트리스계 완충액, 글리신-계 완충액, 시트르산나트륨-계 완충액, 또는 NaCl을 포함하는 아르기닌-HCl계 완충액일 수 있는, 제2 완충액을 사용한다. 특정 구현예에서, 제3 세정 단계는, 에틸렌 글리콜 및/또는 NaCl을 포함하는 트리스-계 완충액, 타우린-계 완충액, 또는 NaCl을 포함하는 아르기닌-HCl계 완충액일 수 있는, 제3 완충액을 사용한다. 대안적으로, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 또는 트레할로스 중 하나 이상은 에틸렌 글리콜과 함께 또는 에틸렌 글리콜 대신 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 선택적인 제4 세정 단계, 또는 재평형화 단계는 상기 열거된 3개의 세정 단계에 앞서 수행된다. 선택적인 제4 세정 단계에서, NaCl을 포함하는 트리스-계 완충액일 수 있는, 제4 완충액은 사용된다.
특정 구현예에서, 예비-정제는, 숙주 세포 생산으로부터 AAV-함유 용액의 친화성 정제에 앞서, 복합 산성 단백질 구조물 및 숙주 세포 DNA 중 하나 이상을 제거하기 위해 착수될 수 있다. 예비-정제는 통과 방식에서 음이온 교환으로 수행될 수 있다. 예비-정제 단계는 본원에서 기재된 임의의 친화성 정제 방법 이전 착수될 수 있다. 하기의 더 많은 것들 중 하나는 그와 같은 AAV-함유 용액의 예비-정제로 제거될 수 있다: 히스톤 (예를 들면, 히스톤 H2A 유형 1, 히스톤 H2B 유형 1-B, 히스톤 H4, 히스톤 H1.4), 60S 리보솜 단백질 (예를 들면, 60S 리보솜 단백질 L27, 60S 리보솜 단백질 L6 및 60S 리보솜 단백질 L30), 세포질 액틴 (예를 들면, 세포질 액틴 1), 튜불린 (예를 들면, 튜불린 베타-2A 사슬), 이종성 핵 리보핵단백질 C, Rep68 단백질, HEK293 라미닌 수용체 37 kDa 형태 (LamR 37kDa) 및 ATP-의존적 분자 샤페론 HSC82.
세정 단계는 친화성 매트릭스의 원료 수지 및/또는 AAV로부터 강하게-결합된 오염물을 제거하는데 효과적일 수 있다. 예를 들어, 완충액은 트리스HCl, 아세테이트, 포스페이트, 히스티딘, 이미다졸, 리신, 아르기닌, 글리신, 타우린, 시트레이트, HEPES, MES, MES-Na, 보레이트, 비스-트리스, MOPS, 비신, 트리신, TAPS, TAPSO, MES, PIPES, TES (2-[[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄설폰산),나트륨 바르비탈 (Veronal),ADA(N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산), ACES(N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산), 비스-트리스 프로판, BES(N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), DIPSO(3-(N,N-비스[2-히드록시에틸]아미노)-2-히드록시프로판설폰산), Trizma, HEPPSO(4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-(2-히드록시프로판설폰산)),POPSO(피페라진-1,4-비스(2-히드록시프로판설폰산) 탈수물),TEA, EPPS ( 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산),HEPBS(N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산), AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올),AMPSO(N-(1,1-디메틸-2-히드록시에틸)-3-아미노-2-히드록시프로판설폰산), HEK-HCP의 고갈율 및 pH 범위를 확보하는 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산의 임의의 조합, 예를 들어 글리신, 아르기닌, 트립토판, 아미노산의 유도체, 예를 들면, 타우린 (산화된 시스테인), N-아세틸-트립토판, 및 글리실글리신 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 동시에, 세정 단계에서 사용된 완충액은 AAV를 실질적으로 용출시키지 않는다.
특정 구현예에서, 세정 완충액은 유기 용매 또는 세제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매 또는 세제는, 비제한적으로, Tween 80, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X100, 트리 (n-부틸) 포스페이트 (TNBP), 에틸렌 글리콜, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 또는 트레할로스일 수 있다. 예를 들어, 세제는, 비제한적으로, 비이온성 폴리옥시에틸렌 계면활성제 (예를 들면, Brij 35), 4-노닐페닐-폴리에틸렌 글리콜 (Arkopal N100), 옥틸글코시드, n-도데실 β-D-말토시드, 디기토닌, 6-사이클로헥실헥실 β-D-말토시드, 또는 옥틸글리코피라노시드일 수 있다. 예를 들어, 에틸렌 글리콜은 PEG, 예컨대 비제한적으로, PEG 2000, PEG4000, PEG6000 (Macrogol)일 수 있다. 예를 들어, 유기 용매는, 비제한적으로, 글리세롤 (1,2,3-프로판트리올), 및 에리트리톨 (메소-1,2,3,4-부탄테트롤)일 수 있다.
유기 용매 또는 세제는 사용된 모든 세정 완충액에서 존재할 필요는 없다. 그러나, 유기 용매 또는 세제는 사용된 세정 완충액 중 적어도 하나에서 존재한다. 일부 구현예에서, 세정 완충액, 예를 들면, 제1 세정 완충액은 아세트산나트륨 및 Tween 80 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 완충액은 Tween 80, DMSO 및 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 완충액은 트리톤-X100, 폴리소르베이트 80 및 TNBP 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 완충액, 예를 들면, 제3 세정 완충액은 트리스 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 이론에 의한 구속됨의 바램 없이, 세정 완충액에서 유기 용매 및 세제는 강하게 결합된 숙주 단백질 및 바이러스 수용체를 제거하는데 효과적이고, 반면 또한 지질 외피 바이러스를 불활성시키고/거나 분해시킨다.
제1 완충액은, 5.2 내지 6.8의 pH로, 약 50 내지 약 2000 mM 아세트산나트륨, 또는 50 내지 약 250 mM 아세트산나트륨, 및 약 0.05 내지 약 5% 폴리소르베이트 80 또는 Tween 80 또는 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트 80 또는 Tween 80을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 50 내지 약 75 mM; 약 75 내지 약 100 mM; 약 90 내지 약 110 mM; 약 100 내지 약 125 mM; 약 125 내지 약 150 mM 아세트산나트륨; 약 150 내지 약 175 mM 아세트산나트륨; 약 175 내지 약 200 mM 아세트산나트륨; 약 200 내지 약 250 mM 아세트산나트륨; 약 250 내지 약 300 mM 아세트산나트륨; 약 300 내지 약 350 mM 아세트산나트륨; 약 350 내지 약 400 mM 아세트산나트륨; 약 400 내지 약 450 mM 아세트산나트륨; 약 450 내지 약 500 mM 아세트산나트륨; 약 500 내지 약 550 mM 아세트산나트륨; 약 550 내지 약 600 mM 아세트산나트륨; 약 600 내지 약 650 mM 아세트산나트륨; 약 650 내지 약 700 mM 아세트산나트륨; 약 700 내지 약 750 mM 아세트산나트륨; 약 750 내지 약 800 mM 아세트산나트륨; 약 800 내지 약 850 mM 아세트산나트륨; 약 850 내지 약 900 mM 아세트산나트륨; 약 900 내지 약 950 mM 아세트산나트륨; 약 950 내지 약 1000 mM 아세트산나트륨; 약 1000 내지 약 1050 mM 아세트산나트륨; 약 1050 내지 약 1100 mM 아세트산나트륨; 약 1100 내지 약 1150 mM 아세트산나트륨; 약 1150 내지 약 1200 mM 아세트산나트륨; 약 1200 내지 약 1250 mM 아세트산나트륨; 약 1250 내지 약 1300 mM 아세트산나트륨; 약 1300 내지 약 1350 mM 아세트산나트륨; 약 1350 내지 약 1400 mM 아세트산나트륨; 약 1400 내지 약 1450 mM 아세트산나트륨; 약 1450 내지 약 1500 mM 아세트산나트륨; 약 1500 내지 약 1550 mM 아세트산나트륨; 약 1550 내지 약 1600 mM 아세트산나트륨; 약 1600 내지 약 1650 mM 아세트산나트륨; 약 1650 내지 약 1700 mM 아세트산나트륨; 약 1700 내지 약 1750 mM 아세트산나트륨; 약 1750 내지 약 1800 mM 아세트산나트륨; 약 1800 내지 약 1850 mM 아세트산나트륨; 약 1850 내지 약 1900 mM 아세트산나트륨; 약 1900 내지 약 1950 mM 아세트산나트륨; 또는 약 1950 내지 약 2000 mM 아세트산나트륨을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES-Na)의 약 50 내지 약 500 mM 나트륨 염, 약 3 내지 약 30 mM EDTA, 그리고 폴리소르베이트 80, DMSO 및 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP)를 포함하는 용매/세제 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 MES-Na의 약 50 내지 약 75 mM; 약 75 내지 약 100 mM; 약 90 내지 약 110 mM; 약 100 내지 약 125 mM; 약 125 내지 약 150 mM; 약 150 내지 약 175 mM; 약 175 내지 약 200 mM; 약 200 내지 약 250 mM; 약 250 내지 약 300 mM; 약 300 내지 약 350 mM; 약 350 내지 약 400 mM; 약 400 내지 약 450 mM; 또는 약 450 내지 약 500 mM 나트륨 염을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 MES-Na의 약 50; 약 75; 약 90 mM; 약 100 mM; 약 125 mM; 약 150 mM; 약 175 mM; 약 200 mM; 약 250 mM; 약 300 mM; 약 350 mM; 약 400 mM; 약 450 mM; 또는 약 500 mM 나트륨 염을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 50 내지 약 200 mM 타우린을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 50 내지 약 75 mM; 약 75 내지 약 100 mM; 약 90 내지 약 110 mM; 약 100 내지 약 125 mM; 약 125 내지 약 150 mM; 약 150 내지 약 175 mM; 약 175 내지 약 200 mM 타우린을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 50; 약 75; 약 90 mM; 약 100 mM; 약 125 mM; 약 150 mM; 약 175 mM; 약 200 mM 타우린을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 80 내지 약 400 mM 비스-트리스를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 80 내지 약 100 mM; 약 90 내지 약 110 mM; 약 100 내지 약 125 mM; 약 125 내지 약 150 mM; 약 150 내지 약 175 mM; 약 175 내지 약 200 mM; 약 200 내지 약 250 mM; 약 250 내지 약 300 mM; 약 300 내지 약 350 mM; 약 350 내지 약 400 mM 비스-트리스를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 50; 약 75; 약 90 mM; 약 100 mM; 약 125 mM; 약 150 mM; 약 175 mM; 약 200 mM; 약 250 mM; 약 300 mM; 약 350 mM; 약 400 mM 비스-트리스를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 50 내지 약 200 mM 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 50 내지 약 80 mM; 약 70 내지 약 100 mM; 약 80 내지 약 110 mM; 약 90 내지 약 120 mM; 약 100 내지 약 130 mM; 약 120 내지 약 150 mM; 약 140 내지 약 170 mM; 약 170 내지 약 200 mM 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 60; 약 70 mM; 약 80 mM; 약 90 mM; 약 100 mM; 약 110 mM; 약 120 mM; 약 130 mM; 약 140 mM; 약 150 mM; 또는 약 160 mM 아세트산나트륨을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 25 mM 아세트산나트륨, 약 50 mM 아세트산나트륨, 약 75 mM 아세트산나트륨, 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 125 mM 아세트산나트륨, 약 150 mM 아세트산나트륨, 약 175 mM 아세트산나트륨, 약 200 mM 아세트산나트륨, 약 225 mM 아세트산나트륨, 약 250 mM 아세트산나트륨, 약 275 mM 아세트산나트륨, 약 300 mM 아세트산나트륨, 약 325 mM 아세트산나트륨, 약 350 mM 아세트산나트륨, 약 375 mM 아세트산나트륨, 약 400 mM 아세트산나트륨, 약 425 mM 아세트산나트륨, 약 450 mM 아세트산나트륨, 약 475 mM 아세트산나트륨, 약 500 mM 아세트산나트륨, 약 525 mM 아세트산나트륨, 약 550 mM 아세트산나트륨, 약 575 mM 아세트산나트륨, 약 600 mM 아세트산나트륨, 약 625 mM 아세트산나트륨, 약 650 mM 아세트산나트륨, 약 675 mM 아세트산나트륨, 약 700 mM 아세트산나트륨, 약 725 mM 아세트산나트륨, 약 750 mM 아세트산나트륨, 약 775 mM 아세트산나트륨, 약 800 mM 아세트산나트륨, 약 825 mM 아세트산나트륨, 약 850 mM 아세트산나트륨, 약 875 mM 아세트산나트륨, 약 900 mM 아세트산나트륨, 약 925 mM 아세트산나트륨, 약 950 mM 아세트산나트륨, 약 975 mM 아세트산나트륨, 약 1000 mM 아세트산나트륨, 약 1025 mM 아세트산나트륨, 약 1050 mM 아세트산나트륨, 약 1075 mM 아세트산나트륨, 약 1100 mM 아세트산나트륨, 약 1125 mM 아세트산나트륨, 약 1150 mM 아세트산나트륨, 약 1175 mM 아세트산나트륨, 약 1200 mM 아세트산나트륨, 약 1225 mM 아세트산나트륨, 약 1250 mM 아세트산나트륨, 약 1275 mM 아세트산나트륨, 약 1300 mM 아세트산나트륨, 약 1325 mM 아세트산나트륨, 약 1350 mM 아세트산나트륨, 약 1375 mM 아세트산나트륨, 약 1400 mM 아세트산나트륨, 약 1425 mM 아세트산나트륨, 약 1450 mM 아세트산나트륨, 약 1475 mM 아세트산나트륨, 약 1500 mM 아세트산나트륨, 약 1525 mM 아세트산나트륨, 약 1550 mM 아세트산나트륨, 약 1575 mM 아세트산나트륨, 약 1600 mM 아세트산나트륨, 약 1625 mM 아세트산나트륨, 약 1650 mM 아세트산나트륨, 약 1675 mM 아세트산나트륨, 약 1700 mM 아세트산나트륨, 약 1725 mM 아세트산나트륨, 약 1750 mM 아세트산나트륨, 약 1775 mM 아세트산나트륨, 약 1800 mM 아세트산나트륨, 약 1825 mM 아세트산나트륨, 약 1850 mM 아세트산나트륨, 약 1875 mM 아세트산나트륨, 약 1900 mM 아세트산나트륨, 약 1925 mM 아세트산나트륨, 약 1950 mM 아세트산나트륨, 약 1975 mM 아세트산나트륨, 또는 약 2000 mM 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 100 mM, 또는 100 mM 아세트산나트륨을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 0.05 내지 약 0.08%; 약 0.08 내지 약 0.11%; 약 0.11 내지 약 0.14%; 약 0.14 내지 약 0.17%; 또는 약 0.17 내지 약 0.20% 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 0.1%, 또는 0.1% 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 0.05 내지 약 0.08%; 약 0.08 내지 약 0.11%; 약 0.11 내지 약 0.14%; 약 0.14 내지 약 0.17%; 또는 약 0.17 내지 약 0.20% Tween 80을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 0.1% Tween 80을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, pH는 약 5.2 내지 약 5.5; 약 5.5 내지 약 5.8; 약 5.8 내지 약 6.1; 약 6.1 내지 약 6.4; 또는 약 6.4 내지 약 6.8일 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 완충액은 약 6.0, 또는 6.0의 pH를 갖는다.
특정 구현예에서, 제1 완충액은 킬레이트제, 예를 들면, EDTA를 포함한다.
제2 완충액은 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl, 또는 30 내지 약 80 mM 트리스HCl, 및 염을 포함할 수 있고, 제2 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 9.2이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 또는 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 염, 예를 들면, NaCl의 농도는 약 75 내지 약 500 mM일 수 있다. 일부 구현예에서, 염 농도, 예를 들면, NaCl 농도는 약 75 내지 약 200 mM이다. 일부 구현예에서, 염 농도, 예를 들면, NaCl 농도는 500 mM을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 염 농도, 예를 들면, NaCl 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 이론에 의한 구속됨의 바램 없이, 500 mM을 초과하지 않는, 또는 200 mM을 초과하지 않는 염 농도는 염 용액의 전도도가 용출을 일으키기에 너무 낮기 때문에 세정 단계 동안 AAV의 용출을 예방할 수 있다.
제2 완충액은 약 30 내지 약 35 mM; 약 35 내지 약 40 mM; 약 40 내지 약 45 mM; 약 45 내지 약 50 mM; 약 50 내지 약 55 mM; 약 55 내지 약 60 mM; 약 60 내지 약 65 mM; 약 65 내지 약 70 mM; 약 70 내지 약 75 mM; 또는 약 75 내지 약 80 mM 트리스HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 50 mM, 또는 50 mM 트리스HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 75 내지 약 100 mM; 약 100 내지 약 125 mM; 약 125 내지 약 150 mM; 약 150 내지 약 175 mM; 약 175 내지 약 200 mM; 약 200 내지 약 225 mM; 또는 약 225 내지 약 250 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 150 mM, 또는 150 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액의 pH는 약 7.5 내지 약 7.7; 약 7.7 내지 약 7.9; 약 7.9 내지 약 8.1; 약 8.1 내지 약 8.3; 약 8.3 내지 약 8.5; 약 8.5 내지 약 8.7; 약 8.7 내지 약 8.9; 또는 약 8.9 내지 약 9.2일 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액의 pH는 약 8.5, 또는 8.5일 수 있다.
제2 완충액은 약 30 내지 약 35 mM; 약 35 내지 약 40 mM; 약 40 내지 약 45 mM; 약 45 내지 약 50 mM; 약 50 내지 약 55 mM; 약 55 내지 약 60 mM; 약 60 내지 약 65 mM; 약 65 내지 약 70 mM; 약 70 내지 약 75 mM; 또는 약 75 내지 약 80 mM 아르기닌-HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 50 mM, 또는 50 mM 아르기닌-HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 75 내지 약 100 mM; 약 100 내지 약 125 mM; 약 125 내지 약 150 mM; 약 150 내지 약 175 mM; 약 175 내지 약 200 mM; 약 200 내지 약 225 mM; 또는 약 225 내지 약 250 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 150 mM, 또는 150 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액의 pH는 약 7.5 내지 약 7.7; 약 7.7 내지 약 7.9; 약 7.9 내지 약 8.1; 약 8.1 내지 약 8.3; 약 8.3 내지 약 8.5; 약 8.5 내지 약 8.7; 약 8.7 내지 약 8.9; 또는 약 8.9 내지 약 9.2일 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액의 pH는 약 8.5, 또는 8.5일 수 있다.
제2 완충액은 약 50 내지 약 200 mM 글리신을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 50 내지 약 100 mM; 약 70 내지 약 120 mM; 약 100 내지 약 150 mM; 약 120 내지 약 170 mM; 약 150 내지 약 200 mM 글리신을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액의 pH는 약 7.5 내지 약 7.7; 약 7.7 내지 약 7.9; 약 7.9 내지 약 8.1; 약 8.1 내지 약 8.3; 약 8.3 내지 약 8.5; 약 8.5 내지 약 8.7; 약 8.7 내지 약 8.9; 또는 약 8.9 내지 약 9.2일 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액의 pH는 약 8.5, 또는 8.5일 수 있다.
제2 완충액은 약 50 내지 약 20 mM 시트르산나트륨을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액은 약 5 내지 약 10 mM; 약 7 내지 약 12 mM; 약 10 내지 약 15 mM; 약 12 내지 약 17 mM; 약 15 내지 약 20 mM 시트르산나트륨을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액의 pH는 약 7.5 내지 약 7.7; 약 7.7 내지 약 7.9; 약 7.9 내지 약 8.1; 약 8.1 내지 약 8.3; 약 8.3 내지 약 8.5; 약 8.5 내지 약 8.7; 약 8.7 내지 약 8.9; 또는 약 8.9 내지 약 9.2일 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 완충액의 pH는 약 8.5, 또는 8.5일 수 있다.
특정 구현예에서, 제2 완충액은 킬레이트제, 예를 들면, EDTA를 포함한다.
제3 완충액은, pH 약 7.5 내지 약 9.2로, 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 및 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 제3 완충액은, pH 약 7.3 내지 약 8.8로, 약 20 내지 약 80 mM 아르기닌-HCl 및 약 50 내지 약 200 mM 염을 포함할 수 있다. 제3 완충액은, 약 8.5의 pH로, 약 50 mM 트리스HCl 및 약 50 vol% 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 제3 완충액은, pH 약 7.3 내지 약 8.8로, 약 20 내지 약 150 mM 타우린, 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜, 및 0.05 내지 0.2% 옥틸글리코피라노시드를 포함할 수 있다. 제3 완충액은, pH 약 7.3 내지 약 8.8로, 약 50 내지 약 200 mM 아르기닌-HCl, 약 50 내지 약 200 mM 리신 HCl, 약 50 내지 약 200 mM 히스티딘-HCl, 및 약 1mM 내지 약 4 mM N-아세틸-D,L-트립토판, 및 약 10% 내지 약 40% (w/w) 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 염, 예를 들면, NaCl이 제3 완충액에서 존재하면, 특정 구현예에서 염의 농도는 500 mM을 초과하지 않고 특정 구현예에서, 염의 농도는 200 mM을 초과하지 않는다. 특정 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 또는 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합이다. 특정 구현예에서, 염은 NaCl이다. 특정 구현예에서, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 또는 트레할로스 중 하나 이상은 에틸렌 글리콜과 함께 또는 에틸렌 글리콜 대신 사용될 수 있다.
이론에 의한 구속됨의 바램 없이, AAV의 용출의 정도는 제3 완충액에서 염의 전도도 및 에틸렌 글리콜의 양 둘 모두에 의해 영향받는다. 완충액에서 적어도 55% (w/w) 에틸렌 글리콜의 양은, 50% (w/w) 에틸렌 글리콜과 비교된 경우, 용출의 양을 상당히 증가시킬 수 있다. 따라서, 주어진 에틸렌 글리콜 농도에서, 증가된 NaCl 농도는 용출의 정도 및 비율을 증가시킬 수 있다. 주어진 에틸렌 글리콜 농도에서, 다가 염에 의한 NaCl의 대체는 또한 용출의 정도 및 비율을 증가시킬 수 있다.
이론에 의한 구속됨의 바램 없이, 염이 일정, 예를 들면, 750mM NaCl이면, 에틸렌 글리콜의 증가량은 완충액의 용출 강도를 증가시킬 수 있다. 에틸렌 글리콜 함량이 일정, 예를 들면, 55%이면, 염의 증가량은 완충액의 용출 강도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 용출 강도는 750 mM NaCl에서 40% 내지 45% 내지 50% 내지 55% 내지 60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 증가시킨다.
일정한 염 함량으로 용액의 에틸렌 글리콜 함량을 증가시키는 것은 전도도를 낮출 수 있다. 에틸렌 글리콜의 증가된 양은 완충액에서 염의 용해도의 양을 낮출 수 있다.
특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 30 내지 약 35 mM; 약 35 내지 약 40 mM; 약 40 내지 약 45 mM; 약 45 내지 약 50 mM; 약 50 내지 약 55 mM; 약 55 내지 약 60 mM; 약 60 내지 약 65 mM; 약 65 내지 약 70 mM; 약 70 내지 약 75 mM; 약 75 내지 약 80 mM; 약 80 내지 약 90 mM; 약 90 내지 약 100 mM; 약 100 내지 약 110 mM; 약 110 내지 약 120 mM; 약 120 내지 약 130 mM; 약 130 내지 약 140 mM; 약 140 내지 약 150 mM; 약 150 내지 약 160 mM; 약 160 내지 약 170 mM; 약 170 내지 약 180 mM; 약 180 내지 약 190 mM; 또는 약 190 내지 약 200 mM 트리스HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 50 mM, 또는 50 mM 트리스HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 30 내지 약 35 vol%; 35 내지 약 40 vol%; 약 40 내지 약 45 vol%; 약 45 내지 약 50 vol%; 약 48 내지 약 52 vol%; 약 50 내지 약 55 vol%; 약 55 내지 약 60 vol%; 약 60 내지 약 65 vol%; 약 65 내지 약 70 vol%; 또는 약 70 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제3 완충액은 약 50%, 또는 50% 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제3 완충액의 pH는 약 7.5 내지 약 7.7; 약 7.7 내지 약 7.9; 약 7.9 내지 약 8.1; 약 8.1 내지 약 8.3; 약 8.3 내지 약 8.5; 약 8.5 내지 약 8.7; 약 8.7 내지 약 8.9; 또는 약 8.9 내지 약 9.2일 수 있다. 특정 구현예에서, 제3 완충액의 pH는 약 8.5, 또는 8.5일 수 있다.
특정 구현예에서, 제3 완충액은 킬레이트제, 예를 들면, EDTA를 포함한다.
제4 완충액은, pH 약 6.5 내지 약 8.0으로, 약 10 내지 약 30 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 10 내지 약 15 mM; 약 15 내지 약 20 mM; 약 20 내지 약 25 mM; 또는 약 25 내지 약 30 mM 트리스HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 20 mM, 또는 20 mM 트리스HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 75 내지 약 100 mM; 약 100 내지 약 125 mM; 약 125 내지 약 150 mM; 약 150 내지 약 175 mM; 약 175 내지 약 200 mM; 약 200 내지 약 225 mM NaCl; 또는 약 225 내지 약 250 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 150 mM, 또는 150 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 pH, 약 6.5 내지 약 6.9; 약 6.8 내지 약 7.2; 약 7.1 내지 약 7.5; 약 7.4 내지 약 7.9; 또는 약 7.6 내지 약 8.0일 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 7.4, 또는 7.4의 pH를 가질 수 있다.
제4 완충액은, pH 약 7.5 내지 약 8.8로, 약 20 내지 약 100 mM 히스티딘 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 20 내지 약 40 mM; 약 40 내지 약 60 mM; 약 60 내지 약 75 mM; 또는 약 75 내지 약 100 mM 히스티딘을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 20 mM, 또는 20 mM 히스티딘을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 75 내지 약 100 mM; 약 100 내지 약 125 mM; 약 125 내지 약 150 mM; 약 150 내지 약 175 mM; 약 175 내지 약 200 mM; 약 200 내지 약 225 mM NaCl; 또는 약 225 내지 약 250 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 150 mM, 또는 150 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 pH, 약 7.5 내지 약 7.9; 약 7.8 내지 약 8.2; 약 8.1 내지 약 8.5; 약 8.4 내지 약 8.9; 또는 약 8.6 내지 약 9.0일 수 있다. 특정 구현예에서, 제4 완충액은 약 8.0, 또는 8.0의 pH를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 제4 완충액은 킬레이트제, 예를 들면, EDTA를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 세정은 킬레이트제, 예를 들면, EDTA를 포함하는 완충액으로 수행될 수 있다.
세정 단계 이후, AAV 입자는 용출 완충액을 사용하여 용출된다. 용출 완충액은 약 30 내지 약 200 mM 완충액, 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜, 및 약 500 mM 내지 약 2000 mM 염을 포함할 수 있고, 용출 완충액은 pH 약 7.3 내지 약 8.8이다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 50% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 55% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 60% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl, 글리신, 시트레이트, 아르기닌, 포스페이트 글리신-HCl, 황산암모늄, 염화마그네슘, 보레이트, 비스-트리스, MOPS, 바이신, 트리신, TAPS, TAPSO, MES, PIPES, TES (2-[[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄설폰산),나트륨 바르비탈 (Veronal), ADA(N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산), ACES(N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산), 비스-트리스 프로판, BES(N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), DIPSO(3-(N,N-비스[2-히드록시에틸]아미노)-2-히드록시프로판설폰산), Trizma, HEPPSO(4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-(2-히드록시프로판설폰산)),POPSO(피페라진-1,4-비스(2-히드록시프로판설폰산) 탈수물), TEA, EPPS ( 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산),HEPBS(N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산), AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올), AMPSO(N-(1,1-디메틸-2-히드록시에틸)-3-아미노-2-히드록시프로판설폰산), AAV의 pH 및 용출을 확보하기 위한 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산의 임의의 조합, 예를 들어 글리신, 아르기닌, 트립토판, 아미노산의 유도체, 예를 들면, 타우린 (산화된 시스테인), N-아세틸-트립토판, 및 글리실글리신이다. 일부 구현예에서, 완충액은 트리스HCl이다.
일부 구현예에서, 염은 NaCl, KCl, CaCl2, CsCl, LiCl, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 또는 KCl, CaCl2, CsCl, LiCl, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, 및 CsCl 중 하나 이상의 조합이다. 일부 구현예에서, 염은 NaCl이다. 염, 예를 들면, NaCl의 농도는 약 500 내지 약 2000 mM일 수 있다. 일부 구현예에서, 염 농도는 약 500 내지 약 900 mM, 약 750 mM NaCl, 또는 750 mM NaCl이다. 일부 구현예에서, NaCl의 농도 경사가 사용되는 경우, 상기 표적 농도는 2000 mM이다.
특정 구현예에서, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 수크로스, 트레할로스, 글리세롤 (1,2,3-프로판트리올), 또는 에리트리톨 (메소-1,2,3,4-부탄테트롤) 중 하나 이상은 에틸렌 글리콜과 함께 또는 에틸렌 글리콜 대신 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 용출 완충액은 약 30 내지 약 35 mM; 약 35 내지 약 40 mM; 약 40 내지 약 45 mM; 약 45 내지 약 50 mM; 약 50 내지 약 55 mM; 약 55 내지 약 60 mM; 약 60 내지 약 65 mM; 약 65 내지 약 70 mM; 약 70 내지 약 75 mM; 또는 약 75 내지 약 80 mM 트리스HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용출 완충액은 약 50 mM, 또는 50 mM 트리스HCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용출 완충액은 약 30 내지 약 35 vol%; 약 35 내지 약 40 vol%; 약 40 내지 약 45 vol%; 약 45 내지 약 50 vol%; 약 48 내지 약 52 vol%; 약 50 내지 약 55 vol%; 약 55 내지 약 60 vol%; 약 60 내지 약 65 vol%; 약 65 내지 약 70 vol%; 또는 약 70 내지 약 75 vol%의 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용출 완충액은 약 50%, 또는 50% 에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 55% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 56% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 57% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 적어도 58% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 용출 완충액은 약 500 내지 약 700 mM; 약 550 내지 약 750 mM; 약 600 내지 약 800 mM; 약 650 내지 약 850 mM; 약 700 내지 약 900 mM; 약 750 내지 약 950 mM; 약 800 내지 약 1000 mM NaCl; 약 900 내지 약 1100 mM NaCl; 약 1000 내지 약 1200 mM NaCl; 약 1100 내지 약 1300 mM NaCl; 약 1200 내지 약 1400 mM NaCl; 약 1300 내지 약 1500 mM NaCl; 약 1400 내지 약 1600 mM NaCl; 약 1500 내지 약 1700 mM NaCl; 약 1600 내지 약 1800 mM NaCl; 약 1700 내지 약 1900 mM NaCl; 약 1800 내지 약 2000 mM NaCl을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용출 완충액은 약 750 mM, 또는 750 mM NaCl을 포함할 수 있다. pH는 7.3 내지 7.6일 수 있다. pH는 7.5 내지 7.8일 수 있다. pH는 7.7 내지 8.0일 수 있다. pH는 7.9 내지 8.2일 수 있다. pH는 8.1 내지 8.4일 수 있다. pH는 8.3 내지 8.6일 수 있다. pH는 8.5 내지 8.8일 수 있다.
특정 구현예에서, 용출은 유기 용매를 포함하는 용출 완충액을 사용하여 착수된다. 예를 들어, 유기 용매는 폴리올 (예를 들면, 에틸렌 글리콜, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 글리세롤, 수크로스, 트레할로스, 또는 폴리올의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 완충액은 pH 범위 7.5 내지 8.5일 수 있다. 이론에 의한 구속됨의 바램 없이, 유기 용매는, 예를 들어, AAV의 생산이 Sf9 곤충 세포의 배큘로바이러스 형질감염을 연루시키면 생산될 수 있는 지질-외피 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 친화성 용출액은 후기 초원심분리 단계에서 조정가능한 밀도 경사로 사용될 수 있는 유기 용매 (예를 들면, 폴리올 예컨대 에틸렌 글리콜)을 함유할 수 있다.
세정 완충액에서 또는 용출 완충액에서 임의의 유기 용매는 지질 외피 바이러스를 분해 또는 불활성화시킬 수 있다. 그와 같은 불활성화는 컬럼에서 불활성화 및 액체 상태 불활성화의 조합에 의해 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 용출 완충액 및 또는 세정 완충액에서 유기 용매는 지질 외피 바이러스의 분해 또는 불활성화를 확보하기 위해 농도 약 50% (w/w) 내지 약 80% (w/w)를 갖는다. 일부 구현예에서, 농도는 약 50% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 농도는 약 55% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 약 56% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 약 57% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 약 58% (w/w)이다. 특정 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 농도는 약 59% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 농도는 약 60% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 농도는 약 65% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 농도는 약 70% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 농도는 약 75% (w/w)이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액 및 또는 세정 완충액에서 유기 용매는 지질 외피 바이러스의 분해 또는 불활성화를 확보하기 위해 농도 약 40% (w/w)를 갖는다. 일부 구현예에서, 용출 완충액 및 또는 세정 완충액에서 유기 용매는 지질 외피 바이러스의 분해 또는 불활성화를 확보하기 위해 농도 약 30% (w/w)를 갖는다. 일부 구현예에서, 용출 완충액 또는 세정 완충액에서 유기 용매는 배큘로바이러스를 불활성화 또는 분해시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 완충액은 pH 약 5.8 내지 약 6.2이고 약 90 내지 약 110 mM 아세트산나트륨 및 약 0.09 내지 약 0.11% 폴리소르베이트 80/Tween 80을 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 8.2 내지 약 8.8이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl 및 약 110 내지 약 135 mM NaCl을 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 8.2 내지 약 8.8이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl 및 약 45 내지 약 55% 에틸렌 글리콜을 포함하고, 선택적인 제4 완충액은 pH 약 7.2 내지 약 7.6이고 약 15 내지 약 25 mM 트리스HCl 및 약 135 내지 약 165 mM NaCl을 포함한다. 특정 구현예에서, 용출 완충액은 pH 약 7.8 내지 약 8.2이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl, 약 45 내지 약 55% 에틸렌 글리콜 및 약 650 내지 약 850 mM NaCl을 포함한다. 다양한 용적, 예컨대 약 2개 컬럼 용적 내지 약 15개 컬럼 용적, 약 3개 컬럼 용적 내지 약 7개 컬럼 용적, 약 4개 컬럼 용적 내지 약 8개 컬럼 용적, 약 5개 컬럼 용적 내지 약 10개 컬럼 용적, 또는 약 7개 컬럼 용적 내지 약 12개 컬럼 용적은 사용될 수 있다. 각 제1, 제2, 제3, 제4, 및 용출 완충액의 약 5개 컬럼 용적, 또는 5개 컬럼 용적은 사용될 수 있다. 대안적으로, 각 제1, 제2, 제3, 제4, 및 용출 완충액의 약 10개 컬럼 용적, 또는 10개 컬럼 용적은 사용될 수 있다. 예를 들어, 컬럼 용적이 약 2 ml 내지 약 3 ml인 경우 10개 컬럼 용적은 사용될 수 있다. 세정 단계의 시간 연장은 AAV 순도를 개선하기 위해 추가로 착수될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 완충액은 pH 약 7.2 내지 약 7.6이고 약 15 내지 약 25 mM 트리스HCl 및 약 135 내지 약 165 mM NaCl을 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 5.8 내지 약 6.2이고 약 90 내지 약 110 mM 아세트산나트륨 및 약 0.09 내지 약 0.11% 폴리소르베이트 80을 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 8.2 내지 약 8.8이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl 및 약 110 내지 약 135 mM NaCl을 포함하고, 제4 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl 및 약 45 내지 약 55% 에틸렌 글리콜을 포함하고, 용출 완충액은 pH 약 7.8 내지 약 8.2이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl, 약 45 내지 약 55% 에틸렌 글리콜 및 약 650 내지 약 850 mM NaCl을 포함한다. 각 세정 완충액의 약 10개 컬럼 용적, 또는 10개 컬럼 용적은 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 완충액은 pH 약 7.2 내지 약 7.6이고 약 15 내지 약 25 mM 트리스HCl 및 약 135 내지 약 165 mM NaCl을 포함하고, 제2 완충액은 pH 약 5.8 내지 약 6.2이고 약 90 내지 약 110 mM 아세트산나트륨 및 약 0.09 내지 약 0.11% 폴리소르베이트 80을 포함하고, 제3 완충액은 pH 약 8.2 내지 약 8.8이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl 및 약 110 내지 약 135 mM NaCl을 포함하고, 제4 완충액은 pH 약 7.5 내지 약 8.5이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl 및 약 45 내지 약 55% 에틸렌 글리콜을 포함한다. 용출은 pH 약 7.8 내지 약 8.2이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl, 약 45 내지 약 55% 에틸렌 글리콜 및 약 650 내지 약 850 mM NaCl을 포함하는 제1 용출 완충액으로 시작하는 그리고 pH 약 7.8 내지 약 8.2이고 약 45 내지 약 55 mM 트리스HCl, 약 45 내지 약 55% 에틸렌 글리콜 및 약 1900 내지 약 2100 mM NaCl을 포함하는 제2 용출 완충액으로 종료하는 경사로 수행된다. 각 세정 완충액의 약 10개 컬럼 용적, 또는 10개 컬럼 용적은 사용될 수 있다. 용출은 경사의 10개 컬럼 용적으로 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, AAV 입자를 함유하는 용액은 이온 교환 크로마토그래피를 겪는다. 특정 구현예에서, 이온 교환은 음이온 교환이다. 특정 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 지지재는 세포 배양물로부터 잔류 입자 오염물 뿐만 아니라 산성 불순물 및 바이러스 입자를 제거할 수 있다. 특정 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 프로테아제 및/또는 숙주 세포 DNA를 제거할 수 있다. 특정 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피는 막-기반 분리, 예를 들면, 하이브리드 막-음이온 교환 크로마토그래피로 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 순수 AEX 크로마토그래피는, 예를 들면, 통과 방식 또는 결합/용출 방식에서 사용된다. 특정 구현예에서, 음이온 교환 지지재는, 비제한적으로 Mustang®Q, STREAMLINE Q XL™,　POROS 50 PI™, Q SEPHAROSE™, Emphase™ AEX Hybrid Purifier, Nuvia Q, POROS 50 HQ, Capto Q, Capto Q impress, Unosphere Q, Q Ceramic HYPERD® F, TOYOPEARL® Q, TOYOPEARL® Super Q, 혼합된 방식 AEX 수지 (예를 들면, Capto Adhere, Capto adhere impress, 및 MEP Hypercell), 및 임의의 DEAE, TMAE, 삼차 또는 사차 아민, 또는 PEI-기반 수지일 수 있다. 특정 구현예에서, 음이온 교환 지지재는 Mustang® Q이다.
특정 구현예에서, HEK293 세포, 또는 사용된 임의의 숙주 세포로부터 DNA는 벤조나제 및/또는 DNase로 처리되지 않는다. 본원에서 기재된 음이온 교환체 및 세정 단계는 벤조나제 또는 DNase로 처리될 필요가 없도록 그와 같은 DNA를 제거하는데 효과적일 수 있다.
AAV는 (pH에 좌우되는) 통과 분획에서 음이온 교환 단계로부터 일반적으로 회수된다. 대안적으로, AAV는 결합/용출 방법에서 사용될 수 있다. 통과 방법 또는 결합/용출 방법 어느 한쪽은 AAV보다 더 높은 전도도에서 (일정한 pH에서) 또는 더 낮은 pH에서 (일정한 전도도에서) 용출하는 숙주 세포 불순물을 배제하도록 수행되어야 한다. 결합/용출 방식으로 작동하는 경우, 완충액의 pH 및 조성은 산성 숙주 세포 불순물이 아닌 생산물의 용출을 유발시키는데 효과적이다. 이론에 의한 구속됨의 바램 없이, 각각의 결합 및 용출 단계는 비-결합 조건에서 통과 방법이 결합/용출 방법보다 AAV의 더 적은 손상 또는 분해를 야기할 수 있도록 미세환경에서 힘을 쏟을 수 있다.
다양한 구현예에서, 본원에서 기재된 정제 단계 이후 그리고 중량/용적으로서 ITR-qPCR 검정에 의해 측정된 경우, AAV, 예를 들면, AAV8 및 AAV9의 수율은 세정 단계가 수행되지 않은 비교 절차에 의해 수득된 것보다 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 또는 65% 더 크다.
다양한 구현예에서, 본원에서 기재된 정제 단계 이후 그리고 중량/중량으로서 ITR-qPCR 검정에 의해 측정된 경우, AAV, 예를 들면, AAV8 및 AAV9의 수율은 세정 단계가 수행되지 않은 비교 절차에 의해 수득된 것보다 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 또는 65% 더 크다.
특정 구현예에서, 본원에서 기재된 AAV의 생산 및 정제 방법은 동일한 세정 프로토콜 없이 비교 절차에 의해 수득된 것보다 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 더 크게 단백질 불순물의 수를 감소시킨다. 본원에서 기재된 AAV의 생산 및 정제 방법이 적어도 25%만큼 단백질 불순물의 수를 감소시킨다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. AAV 입자의 용액이 친화성 매트릭스속 장입에 앞서 음이온 교환 크로마토그래피에 노출된 경우 본원에서 기재된 AAV의 생산 및 정제 방법이 적어도 75%만큼 단백질 불순물의 수를 감소시킨다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 예를 들어, 실시예 2의 표 7에서 데이터는 단백질 불순물의 수가 (사전 음이온 교환 없이) 20에서 14로 그리고 (사전 음이온 교환으로) 20에서 4로 감소되는 것을 나타낸다.
특정 구현예에서, 본원에서 기재된 AAV의 생산 및 정제 방법은 세정 단계가 있는 음이온 교환 및 친화성 정제 모두가 본원에서 제공된 바와 같이 수행되는 경우, 적어도 98.0%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 또는 99.2%인 AAV, 예를 들면, AAV8 및 AAV9의 순도를 제공한다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 AAV의 생산 및 정제 방법은 세정 단계가 있는 친화성 정제가 본원에서 제공된 바와 같이 수행되는 경우 적어도 96.0%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97.0%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.9%, 또는 98.0%인 AAV, 예를 들면, AAV8 및 AAV9의 순도를 제공한다.
유익하게는, 본 방법은 개시 물질, 예를 들면, 세포 배양물의 큰 용적까지 확장가능하다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 적어도 또는 약 500 L, 적어도 또는 약 600 L, 적어도 또는 약 700 L, 적어도 또는 약 800 L, 적어도 또는 약 900 L, 또는 적어도 또는 약 1000 L의 용적으로부터 AAV를 정제할 수 있는 대규모 방법이다. 특정 구현예에서, 본 방법은 적어도 또는 약 1250 L, 적어도 또는 약 1500 L, 적어도 또는 약 2000 L, 적어도 또는 약 2500 L, 적어도 또는 약 3000 L, 적어도 또는 약 4000 L, 적어도 또는 약 5000 L, 적어도 또는 약 6000 L, 적어도 또는 약 7000 L, 적어도 또는 약 8000 L, 적어도 또는 약 9000 L, 적어도 또는 약 10,000 L, 또는 초과의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)의 최소 용적까지 확장가능하다. 예를 들어, 본 방법은 AAV를 생산하는 약 1000 L 또는 약 10,000 L 또는 25,000 L 또는 초과의 세포 배양물의 최소 용적으로 수행된다.
본원에서 기재된 AAV의 생산 및 정제 방법은, 본 방법이 고역가 AAV 생산을 초래하기 때문에, 또한 유리하다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1010 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1011 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1012 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1013 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1014 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1015 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1016 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 1017 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 2 x 1016 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 구현예에서, 적어도 약 5 x 1017 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된다.
본원에서 기재된 방법의 또 다른 이점은 본 방법이 고도로 순수한 AAV 산물을 산출한다는 점이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 산물은 하나 이상의 오염물이 실질적으로 없다: 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 핵산 (예를 들면, 자유 숙주 세포 DNA 및 자유 플라스미드 DNA), 플라스미드 DNA, 엠프티 바이러스성 캡시드, 열 충격 단백질 70 (HSP70), 락테이트 탈수소효소 (LDH), 프로테아좀, 오염물 비-AAV 바이러스 (예를 들면, 지질-외피 바이러스), 숙주 세포 배양물 성분 (예를 들면, 항생제), 마이코플라스마, 발열원, 박테리아 내독소, 세포 파편 (예를 들면, 막 지질, 단백질 및 다른 생물학적 폴리머로 구성된 파편), 및 우발적 제제. AAV가 본원에서 기재된 AAV의 생산 및 정제 방법에 따라 정제되는 경우 하나 이상의, 또는 심지어 모든 하기 불순물은 검출불가능할 수 있다: 히스톤 H2A 유형 1, 히스톤 H2B 유형 1-B, 히스톤 H4, 열 충격 70 kDa 단백질 1A, 피루베이트 키나제 PKM, 연신 인자 2, ATP-시트레이트 신타제, 히스톤 H1.4, 면역글로불린 중 상수 감마 1 (산성 용출 방법으로부터 고정화된 리간드), 60S 리보솜 단백질 L27, 푸룩토스-비스포스페이트 알돌라제 A, 열 충격 동족 71 kDa 단백질, 세포질 액틴 1, S-포르밀글루타티온 가수분해효소, 아스파라긴 합성효소 (글루타민 가수분해), L-락테이트 탈수소효소 B 사슬, 튜불린 베타-2A 사슬, X-염색체 RNA-결합 모티프 단백질, 60S 리보솜 단백질 L6, 세포질 트레오닌 tRNA 리가제, 면역글로불린 카파 상수, 60S 리보솜 단백질 L30, WD 반복부-함유 단백질 1, 아데노실호모시스테이나제, 이종성 핵 리보핵단백질 C, 단백질 Rep68, 티메트 올리고펩티다아제, D-3-포스포글리세레이트 탈수소효소, ATP-의존적 분자 샤페론 HSC82. 본원에서 기재된 음이온 AAV의 생산 및 정제 방법에 따른, 세정 단계에 앞서 음이온 교환 단계의 부가는 또한 하기를 검출불가능하게 할 수 있다: 히스톤 H1.4, 60S 리보솜 단백질 L27, 세포질 액틴 1, 튜불린 베타-2A 사슬, 60S 리보솜 단백질 L6, 60S 리보솜 단백질 L30, 이종성 핵 리보핵단백질 C, 단백질 Rep68, 및 ATP-의존적 분자 샤페론 HSC82.
예시적 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)에서 발견된 오염물의 적어도 또는 약 50%가 제거되는 정제된 AAV 산물을 제공한다. 예시적 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)에서 발견된 오염물의 적어도 또는 약 60%가 제거되는 정제된 AAV 산물을 제공한다. 예시적 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)에서 발견된 오염물의 적어도 또는 약 70%가 제거되는 정제된 AAV 산물을 제공한다. 예시적 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)에서 발견된 오염물의 적어도 또는 약 80%가 제거되는 정제된 AAV 산물을 제공한다. 예시적 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)에서 발견된 오염물의 적어도 또는 약 90%가 제거되는 정제된 AAV 산물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 산물은 인간에게 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, AAV는 재조합성 AAV (rAAV)이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 산물은 멸균이고/거나 우량 제조 기준 (GMP) 등급이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 산물은 미국 식품의약국 (USFDA) 또는 유럽 의약청 (EMA)에 의해 위임된 바와 같이 또는 유전자 요법 의약품에 관한 유럽 약전 또는 미국 약전 1046장에서 제시된 요건을 만족한다.
추가적으로, 본원에서 기재된 방법으로부터 생산된 AAV 산물은 고도로 강력하다. AAV 산물, 예를 들면, AAV8 또는 AAV9 산물의 효능은 (1) 마우스 혈장의 mL당 유닛 (FIX 또는 FVIII)로서 주어지는 생체내 생물효능 (예를 들면, 마우스내 활성 단백질의 생산); 또는 (2) 시험관내 생물효능의 관점에서 기재될 수 있다. 시험관내 생물효능 시험은, 배지 속에 관심 단백질을 발현 및 분비하는 세포, 예를 들면, HepG2 세포를 감염시키기 위한, 그리고 ELISA 기술에 의한 양 및/또는 효소 활성을 결정하기 위한 AAV 벡터의 잠재력을 측정한다. 생체내 및 시험관내 생물효능의 적합한 측정 방법은 당해 기술에 공지되어 있고 본원에서 또한 기재된다.
추가 구현예에서, 본원에서 기재된 방법으로부터 생산된 AAV 산물은 우월한 특이적 활성을 입증한다. AAV의 "특이적 활성"은 qPCR 대 μg AAV8의 비로 제시된다. 예시적 구현예에서, 본원에서 기재된 방법으로부터 생산된 AAV 산물은 AAV 산물이 "전체" 바이러스 입자의 많은 양을 갖는다는 것을 입증하는 AAV의 μg 당 벡터 게놈의 우월한 비를 입증한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 분획을 시험하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, AAV 분획에서 다수의 캡시드가 풀(full) 캡시드이기 때문에, AAV-특이적 ELISA는 AAV 분획의 효능에 관하여 대표적인 판독을 제공하는데 충분하다.
rAAV 입자의 공급원
본 개시내용의 방법에 관하여, AAV는 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 방법에 의해 정제된 AAV는 AAV1 혈청형, AAV2 혈청형, AAV3 혈청형, AAV4 혈청형, AAV5 혈청형, AAV6 혈청형, AAV7 혈청형, AAV8 혈청형, AAV9 혈청형, AAV10 혈청형, AAV11 혈청형, AAV12 혈청형, AAV13 혈청형, AAAV 혈청형, BAAV 혈청형, AAV (VR-195) 혈청형, 및 AAV (VR-355) 혈청형, 또는 키메라 AAV 벡터이다. 특정 구현예에서, AAV는 야생형이다. 특정 구현예에서, AAV는 유전공학에 의해 변형되고/거나 화학적으로 변형된다. 특정 구현예에서, AAV는 변형된 캡시드, 예를 들면, 유전적으로 조작된 또는 화학적으로-변형된 AAV 캡시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 방법에 의해 정제된 AAV 입자는 AAV8 혈청형이다.
본 발명의 방법에 관하여, AAV 분획은 예시적 양태에서 농축된 AAV 분획이다. 특정 구현예에서, AAV 분획은 적어도 1 x 1010, 1 x 1011 또는 1 x 1012 AAV 캡시드/mL를 포함한다. 특정 구현예에서, AAV 분획은 적어도 1 x 1012 AAV 캡시드/mL를 포함한다. AAV 캡시드는 엠프티 AAV 캡시드 및 풀 AAV 캡시드를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, AAV 분획은 형질감염된 숙주 세포에 의해 생산된 AAV 분획을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 분획은 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 수확된 상청액을 나타내고, 여기에서 시스템의 1개 플라스미드는 관심 유전자 또는 cDNA를 포함하고, 1개 플라스미드는 캡시드 단백질 VP1, 캡시드 단백질 VP2 및/또는 캡시드 단백질 VP3을 인코딩한다. 특정 구현예에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3은 AAV8 VP1, AAV8 VP2, 및/또는 AAV8 VP3이다. 특정 구현예에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3은 AAV9 VP1, AAV9 VP2, 및/또는 AAV9 VP3이다. rAAV 생산의 목적을 위한 3중 플라스미드 형질감염은 당해 기술에 공지되어 있다. 참고, 예를 들면, Qu 등, 2015, 상동, 및 Mizukami 등, "A Protocol for AAV vector production and purification." PhD dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998; 및 Kotin 등, Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011). 특정 구현예에서, 형질감염은 무기 화합물, 예를 들면, 인산칼슘, 또는 유기 화합물, 폴리에틸렌이민 (PEI), 또는 비-화학적 수단, 예를 들면, 전기천공을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 부착 세포이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 현탁 세포이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 Sf9 세포이다. 특정 구현예에서, 세포 배양물은 혈청 및 단백질이 없는 배양 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 배지는 화학적으로 정의되고 동물 유래된 성분, 예를 들면, 가수분해물이 없다. 특정 구현예에서, rAAV 입자를 포함하는 분획은 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 HEK293 세포를 포함하는 분획을 나타낸다. 특정 구현예에서, rAAV 입자를 포함하는 분획은 미국 가출원 번호 62/417,775 및 국제 출원 번호 PCT/US2017/059967에서 기재된다.
추가의 단계
본 개시내용의 방법은 본원에서 개시된 단계들의 임의의 조합을 포함하고, 하나 이상의 추가의 단계와 선택적으로 조합될 수 있다. 따라서, 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 본원에서 기재된 바와 같이 3중 플라스미드 시스템으로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 추가로 포함한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은, 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 숙주 세포, 예를 들면, HEK293 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 상청액을 수확하는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 형질감염 및 수확 단계는 본원에서 기재된 초원심분리 단계에 앞서 발생한다.
본 개시내용의 방법은 또 다른 추가의 단계를 포함할 수 있고, 이는 AAV의 순도를 추가로 증가시킬 수 있고 다른 원치않는 성분을 제거할 수 있고/거나 분획을 농축시킬 수 있고/거나 후속적인 단계를 위한 분획을 조건화할 수 있다. 추가의 단계는 상기 기재된 초원심분리 단계 이전 또는 이후 발생할 수 있다.
예시적 양태에서, 본 방법은 심층 여과 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 방법은 형질감염된 HEK293 세포 배양물 상청액의 분획을, 셀룰로스 및 펄라이트를 포함하고 약 500L/m2의 최소 투과성을 갖는 필터를 사용하여 심층 여과시키는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 방법은 약 0.2 μm의 최소 기공 크기를 갖는 필터의 사용을 추가로 포함한다. 예시적 양태에서, 심층 여과는 약 0.2 μm의 최소 기공 크기를 갖는 필터를 통한 여과가 뒤따른다. 예시적 양태에서, 심층 필터 및 약 0.2 μm의 최소 기공 크기를 갖는 필터의 한쪽 또는 양쪽은 세정되고 세정물은 수집된다. 예시적 양태에서, 세척물은 함께 풀링되고 심층 여과 및 약 0.2 μm의 최소 기공 크기를 갖는 필터를 이용한 여과시 수득된 여과물과 조합된다.
예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 방법은 음성 크로마토그래피 단계를 포함하고 이에 의해 원치않는 성분은 크로마토그래피 수지에 결합하고 원하는 AAV는 크로마토그래피 수지에 결합하지 않는다. 예시적 양태에서, 본 방법은 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 단계, 또는 "비-결합 방식"에서 AEX 크로마토그래피 단계를 포함한다. 실시예 2는 그와 같은 단계를 기재한다. "비-결합 방식"의 이점은 절차 수행의 그리고 후속적인 검정 실시에서 상대적 용이함을 포함한다.
따라서, 예시적 구현예에서, AAV 입자를 정제하는 방법은 AAV가 AEX 크로마토그래피 컬럼 또는 막을 통과하는 조건 하에서 AEX 크로마토그래피 컬럼 또는 막에 분획을 적용함으로써 AAV 입자를 포함하는 분획에서 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피를 수행하는 단계 및 AAV 입자를 수집하는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 분획은 약 100 mM 내지 약 150 mM 염, 예를 들면, NaCl을 포함하는 장입 완충액을 가진 AEX 크로마토그래피 컬럼 또는 막에 적용되고, 선택적으로, 장입 완충액의 pH는 약 8 내지 약 9이다. 예시적 양태에서, 장입 완충액은 약 115 mM 내지 약 130 mM 염, 예를 들면, NaCl을 포함하고, 선택적으로, 장입 완충액은 약 120 mM 내지 약 125 mM 염, 예를 들면, NaCl을 포함한다. 예시적 양태에서, 음성 AEX 단계는 본원에서 기재된 초원심분리 단계에 앞서 발생한다.
예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 한외여과/정용여과 시스템을 사용하여 AAV 분획을 농축시키는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 1 초과 접선 유동 여과 (TFF) 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, AAV 분획은 한외여과/정용여과를 경험한다. 예시적 양태에서, AAV 분획은 음성 AEX 크로마토그래피 수행을 포함하는 단계 이전, 음성 AEX 크로마토그래피 수행을 포함하는 단계 이후, 또는 음성 AEX 크로마토그래피 수행을 포함하는 이전 및 이후 한외여과/정용여과 시스템으로 농축된다. 예시적 양태에서, TFF 단계는 본원에서 기재된 초원심분리 단계에 앞서 발생한다.
예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 분획에서 rAAV 입자보다 더 큰 크기의 바이러스를 제거하기 위해 rAAV 입자를 포함하는 분획의 여과를 포함한다.
예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 품질관리 단계, 예를 들면, 공정의 하나 이상의 단계 이후 (예를 들면, 각각의 단계 이후) 수득된 AAV 분획의 효능 또는 특이적 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 AAV에 특이적인 ELISA를 포함한다. 예시적 양태에서, ELISA는 샌드위치 ELISA이다. 예시적 양태에서, 샌드위치 ELISA는 AAV 에피토프에 특이적인 항체를 포함한다. 예시적 양태에서, AAV 에피토프는 조립된 AAV 캡시드에서 존재하는 형태적 에피토프이다. 본원에서 논의된 바와 같이, ELISA는 AAV 분획의 효능을 결정하기 위한 방식으로서 qPCR을 대체할 수 있다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 분획을 시험하는 단계를 포함하고 본 방법은 정량적 PCR을 통한 효능의 측정 방법을 포함하지 않는다. 예시적 양태에서, AAV 분획에서 다수의 캡시드가 풀 캡시드이기 때문에, AAV-특이적 ELISA는 AAV 분획의 효능에 관한 대표적인 판독을 제공하는데 충분하다.
예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 단계 이후 AAV에 특이적인 ELISA를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 그 분획에서 AAV의 특이적 활성을 결정하기 위해 AAV-특이적 ELISA를 통한 심층 여과 이후 수득된 AAV 분획을 시험하는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 그 분획에서 AAV의 특이적 활성을 결정하기 위해 AAV-특이적 ELISA를 통한 한외여과/정용여과 시스템을 사용하여 AAV 분획의 농축 이후 수득된 AAV 분획을 시험하는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 그 분획에서 AAV의 특이적 활성을 결정하기 위해 AAV-특이적 ELISA를 통한 접선 유동 여과 (TFF) 단계 이후 수득된 AAV 분획을 시험하는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 그 분획에서 AAV의 특이적 활성을 결정하기 위해 AAV-특이적 ELISA를 통한 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 이후 수득된 AAV 분획을 시험하는 단계를 포함한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 방법은 그 분획에서 AAV의 특이적 활성을 결정하기 위해 AAV-특이적 ELISA를 통한 연마 단계 이후 수득된 AAV 분획을 시험하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법에 의해 생산된 AAV 산물은 본원에서 추가로 제공된다. 예시적 양태에서, AAV 산물은 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된 적어도 약 1012 바이러스 입자 (vp) 또는 약 1000 L의 개시 물질 (예를 들면, 세포 배양물)로부터 생산된 적어도 약 1013 바이러스 입자 (vp)를 포함한다. 예시적 양태에서, AAV 산물은, 이식유전자 플라스미드 없이 rep-cap 및 Ad 헬퍼 플라스미드의 형질감염에 의해 생성된, 엠프티 캡시드이다. 정제된 엠프티 플라스미드는 환자의 혈액으로부터 AAV 항원에 특이적인 항체를 고갈 또는 제거하는데 사용될 수 있다.
예시적 양태에서, 본 개시내용의 AAV 산물은 인간내 임상 용도에 고도로 순수하고, 고도로 강력하고 적합하다. 예시적 양태에서, AAV 산물은 균질한 모집단 및 높은 순도의 AAV 입자를 포함한다. 예시적 양태에서, AAV 산물은 전장 벡터 DNA를 포함한다. 예시적 구현예에서, AAV 산물은, 비제한적으로, 절단된 또는 불완전한 벡터 DNA를 함유하는 AAV 입자, 불완전한 단백질 조성 및 올리고머화된 구조를 가진 AAV 입자, 또는 오염 바이러스, 예를 들면, 비 AAV, 지질 외피 바이러스를 포함하는, 원치않는 오염물이 실질적으로 없다. 예시적 구현예에서, AAV 산물은 관심 단백질의 인코딩 cDNA의 많은 양을 함유한다. 예시적 양태에서, 본 개시내용의 AAV 산물은 인간에게 투여에 적합하다. 예시적 양태에서, AAV 산물은 멸균이고/거나 우량 제조 기준 (GMP) 등급이다. 예시적 양태에서, AAV 산물은 미국 식품의약국 (USFDA) 또는 유럽 의약청 (EMA)에 의해 위임된 바와 같이 또는 유전자 요법 의약품에 관한 유럽 약전 또는 미국 약전 1046장에서 제시된 요건에 순응한다. 예시적 양태에서, AAV 산물은 가공 또는 취급이 거의 없이 인간에게 직접적인 투여를 위하여 사용 준비된 산물이다.
하기 실시예는 본 발명을 단지 설명하기 위해 주어지고 어떤 식으로든 그것의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
하기 실시예는 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 입자를 생산하기 위해 3중 플라스미드 시스템으로 HEK293 세포주를 형질감염시키는 예시적 방법을 기재한다.
부착 HEK293 세포는, 예를 들어 PCT/US2017/059967의 단락 [00146] - [00150]에서 기재된 바와 같이, 화학적으로-정의되고 동물-유래된 성분, 단백질 및 혈청이 없는 상업적으로-이용가능한 배양 배지에서 현탁 조건에서 성장되었다. 세포는 3개의 플라스미드: (1) 생산적 AAV 감염에 필수적인 헬퍼 바이러스성 기능을 제공하는, 헬퍼 플라스미드, (2) 바이러스의 캡시드 생성, 복제 및 패키징에 관한 모든 정보를 가지고 있는, repcap-플라스미드, 및 (3) 수득한 rAAV 입자 속에 패키징되는, 관심 유전자 (GOI)를 함유하는 플라스미드로 형질감염되었다. 관심 유전자를 가지고 있는 rAAV 입자는 형질감염후 3-5 일의 기간 동안 HEK293 세포주에 있다.
형질감염된 HEK293 세포 배양물의 상청액은 예를 들어 PCT/US2017/059967의 단락 [00151] - [00155], 표 1 및 표 2에서 기재된 바와 같이 수확되었다. 수확된 상청액은 예를 들어 PCT/US2017/059967의 단락 [00156] - [00160], 표 3 및 표 4에서 기재된 바와 같이 농축되었고 조건화되었다 (정용여과되었다). 음성 크로마토그래피는 예를 들어 PCT/US2017/059967의 단락 [00161] - [00165] 및 표 5에서 기재된 바와 같이 정용여과된 농축물에서 수행되었다.
실시예 2
AAV8 생산은 AAV8-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되었고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 (Pall Omega T-Series Cassette) 100kDa로 정용여과되었다. 바이러스성 입자는 비결합 조건에서, 즉 pH 8.5에서 125 mM NaCl 및 50 mM 트리스HCl을 포함하는 용액에서 막 흡착기 (MustangQ; 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입되었다. pH 조건화된 장입은 25% HCl을 사용하여 7.4 내지 7.8 pH 범위로 AAV8 함유 통과액을 조정함으로써 수득되었다.
하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 59 mm 및 용적 47.45ml인, POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화성 매트릭스 (Cat. No. 195338010; Thermo Fisher) ID 32mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 5개 컬럼 용적으로 평형화되었다. pH 조건화된 장입은 POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화성 매트릭스 (Cat. No. 195338010; Thermo Fisher)를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 5개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (선택적인 제4 완충액).
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 1 (W1): 100mM 아세트산나트륨 및 0.1% Tween80의 5개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 2 (W2): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 5개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl 및 50% 에틸렌 글리콜의 5개 컬럼 용적으로 세정되었다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 5개 컬럼 용적을 적용함으로써 착수되었다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜 및 750mM NaCl. 하기 이차 용출 완충액의 5개 컬럼 용적은 그 다음 컬럼에 적용되었다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜, 및 2000mM NaCl.
상기 단계에 대한 선형 유량은 60 cm/h이었다.
하기 비교 절차는 착수되었다. 층 높이 2.5 mm 및 용적 1.96ml인, POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화성 매트릭스 (Cat. No. 195338010; Thermo Fisher) ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화되었다. pH 조건화된 장입은 POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화성 매트릭스 (Cat. No. 195338010; Thermo Fisher)를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다.
세정 단계는 하기 TBS 완충액: 20mM 트리스HCl / 150mM NaCl / pH 7.4를 사용함으로써 수행되었다. 대신에 용출은 pH 3.0에서 100 mM 시트르산나트륨의 10개 컬럼 용적으로 수행되었다.
상기 시험 및 비교 절차는, 단계에서 첨가된 용액의 컬럼 용적의 수를 나타내는 "CV"로, 표 2에서 더 자세히 기재된다.
Figure pct00002
하기 검정은 표 3에서 중량/용적으로 표시된 데이터로 수행되었다. 용출 완충액의 밀도는 진동 U-튜브 밀도계 DMA 4500M (Anton Paar)에서 측정되었다.
ELISA는 AAV8 항원의 양을 측정하는데 사용되었다. ELISA는 TECAN Roboter 시스템에서 AAV-8 적정 ELISA 키트 (Art. No. PRAAV8; Progen (Heidelberg, Germany)로 수행되었다. 간단히, 조립된 AAV8 캡시드 (ADK8)에서 형태적 에피토프에 특이적인 단클론성 항체는 미세적정 박리물에 코팅되었고 AAV 분획으로부터 AAV8 입자를 포획하는데 사용되었다. 포획 AAV8 입자는 2 단계로 검출되었다. 제1 단계에서, ADK8 항체에 특이적인 비오틴-컨쥬게이션된 단클론성 항체는 (ADK8 및 ADK8 항체의) 면역 복합체에 결합되었다. 스트렙타비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트는 비오틴-컨쥬게이션된 단클론성 항체에 결합된 면역 복합체에 첨가되었고 스트렙타비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트는 비오틴과 반응하였다. 퍼옥시다제 기질 용액은 첨가되었고 결합된 AAV 입자의 양에 비례하는 발색 반응은 발생한다. 발색 반응은 450 nm에서 광도계로 측정된다.
ITR-qPCR 검정은 관심 유전자에 대하여 인코딩하는 벡터 (예를 들면, 인간 인자 VIII 또는 인간 인자 IX)에서 발견된 역전된 연쇄 반복부를 정량화함으로써 게놈 카피 역가를 결정하는데 사용되었다. HEK-HCP는 ELISA에 의한 잔류 숙주 세포 단백질의 측정이다. LDH는 비색계 활성 검정에 의해 결정되었다.
AAV8 리간드 누출 ELISA (효소 연결된 면역-흡수제 검정)은, 포획제로서 AAV8 친화성 리간드를 함유하는, POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화성 배지로 정제된 생성물에서 존재할 수 있는 1 ng/mL AAV8 친화성 리간드의 검출을 위하여 설계된다. AAV8 리간드 누출 ELISA는 최적의 정제 공정 개발 및 공정중 스트림 뿐만 아니라 최종 산물의 일상적 품질관리를 돕기 위한 도구로서 사용될 수 있다.
"리간드 누출 ELISA / AAV8 - 항원" 양은 리간드의 나노그램 / AAV8의 마이크로그램으로서 계산된 "리간드 누출 ELISA" 대 "AAV8 항원"의 비를 반영한다.
시험관내 생물효능 검정에서, 바이러스성 벡터 AAV8은 간 표적 세포주를 감염시키고, 후속으로 기능적, 측정가능한 인코딩된 단백질을 배지에 분비한다. 제1 단계에서 HepG2 표적 세포는 AAV8에 의해 형질도입 감염된다. 인큐베이션 시간 동안, 인코딩된 단백질은 세포 상청액에 방출된다. 제2 단계에서 세포 배양물 상청액에 인코딩된 단백질의 활성은 활성 검정에 의해 직접적으로 측정된다. AAV8 샘플의 측정은 참조 물질에 대한 백분율로서 주어진다. 본 방법은 AAV8 유전자 요법 벡터의 생물학적 기능의 정량적 평가를 허용한다.
Figure pct00003
시험 절차 동안 ITR-qPCR에 대한 STEP 수율은 105.3%이었던 반면 비교 절차의 것은 71.2%이었다. 시험 절차에 대한 시험관내 생물효능은 0.45이었던 반면 비교 절차의 것은 0.33이었다.
검정은 표 4에서 중량/중량으로 표시된 데이터로 또한 수행되었다.
Figure pct00004
시험 절차 동안 ITR-qPCR에 대한 STEP 수율은 127.4%이었던 반면 비교 절차의 것은 72.4%이었다. AAV8 감염성 및 생물효능을 저하시킬 극단적 조건을 사용하지 않음과 조합된, 수율 및 순도의 개선은 놀라웠다. 또한, 시험 절차가, 특히 정제 이전 존재하였던 불순물과 생산물의 실질적으로 더 큰 비-특이적 결합 및 복합체가 있는 조건 하에서, 친화성 리간드로부터 생산물의 또한 용출 없이 대부분의 불순물을 제거하였다는 것은 놀라웠다.
SDS-PAGE 분석은 비교 절차 대신 세정 단계가 있는 시험 절차를 사용하는 경우 열 충격 단백질 70 kDa (HSP70)에서 감소가 있었는지를 결정하기 위해 수행되었다. 웨스턴 블랏은 2 시간 동안 1:2000 희석에서 일차 항체로서 항-Hsp70 항체 (Abcam, 카탈로그 번호 ab79852), 및 1 시간 동안 1:1000 희석에서 이차 항체 (Sigma, 카탈로그 번호 A8025)로서 염소 항-토끼 igG (H+L) AP 컨쥬게이트를 사용하여 수행되었다. 결과는 도 1에서 도시된다. 레인 6 (비교 절차)와 레인 4 (시험 절차) 비교에서, HSP70에서의 실질적인 감소는 시험 절차로 관측되었다. 레인 2는 HSP70의 20 ng을 도시하고 레인 4는 HSP70의 4 ng을 도시한다.
SDS-PAGE 실버 스테인 검정은 존재하는 불순물의 전체적인 수준을 결정하기 위해 수행되었다. 결과는 도 2에서 도시된다. 레인 2는 AAV8 참조를 나타내고 3개의 특징적 밴드를 도시한다. 용출액 (190 μg/ml)는 시험 절차 및 비교 절차 둘 모두에 따라 정제되었다. 시험 절차로부터의 결과는 레인 4에서 도시된다. 비교 절차의 결과는 레인 6에서 도시된다. 시험 절차보다 비교 절차로 보여진 불순물이 실질적으로 더 많다.
12% 항-AAV 항체를 가진 웨스턴 블랏은 시험 및 비교 절차에 따른 정제 이후 회수된 AAV8의 수준 및 순도를 결정하기 위해 수행되었다. 웨스턴 블랏은 일차 항체로서 AAV의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 단클론성 항체로, 이차 항체로서 염소 항-마우스 ALP 항체 (Sigma, 카탈로그 번호 A4656)으로 수행되었다. 결과는 도 3에서 도시된다. 레인 2는 각각의 VP1, VP2 및 VP3에 대하여 3개의 밴드를 가진 AAV 참조 (130 ng, 60 μg/ml에 해당)을 도시한다. 레인 4는 시험 절차에 따른 용출액 (190 μg/ml AAV8 항원)을 도시하고 레인 6은 비교 절차에 따른 용출액을 도시한다. 웨스턴 블랏에 따라, 수율은 비교 절차에 대하여 시험 절차로 더 높다.
LC-MS는 다양한 숙주 세포 불순물의 정체성 및 양을 결정하기 위해 수행되었다 (rp-HPLC-UV-ESI-MS/MS). 샘플은 효소 트립신을 사용하여 소화되었다. 수득된 펩티드 혼합물은 RP 컬럼 (ZORBAX 300SB-C18 컬럼, 0.5x150mm, 3.5μm)를 사용하는 HPLC 시스템에서 분리되었고, 후속으로, 펩티드는 Q-Exactive HF 질량 분광분석기에서 분석되었다. 데이터는 샘플에서 단백질을 동정하기 위해 소프트웨어 Proteome Discoverer를 사용하여 분석되었다.
Agilent HPLC1209 (1200 capHPLC)는 LC 3D 시스템용 ChemStation (Rev. B.04.03-SP2 (105))와 함께 사용되었다. HPLC 방법은 PEPMAP_CAP_170.M이었다. 용출액 A는 탈이온수내 0.1% (v/v) HCOOH이었고 용출액 B는 아세토니트릴내 0.08% (v/v) HCOOH이었다. HPLC에 관한 세부사항은 하기 표 5에서 제공된다:
Figure pct00005
MS에 관한 세부사항은 하기 표 6에서 제공된다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
3개 상이한 방식의 정제는 착수되었다. 하나는 본 실시예의 비교 절차를 포함하였고, 또 다른 것은 (친화성 정제 이전 MustangQ에 의한 음이온 교환 정제를 포함하였던) 본 실시예의 시험 절차를 포함하였고, 세번째는 MustangQ에 의한 음이온 교환 정제 없이 시험 절차에 따라 수행되었다. 아래 표 7은 전체적인 결과를 요약한다.
Figure pct00009
상기 표에서, 순도는 모든 단백질의 총 AUC에 비하여 AAV8 캡시드와 연관된 퍼센트 곡선하 면적 (AUC)를 반영한다.
하기 표 8-10은, 각각의 단백질에 대하여, 비교 절차용 LC/MS에 의해 동정된 펩티드의 수 및 AUC 값 (표 8), 사전 음이온 교환이 있는 시험 절차 (표 9), 및 사전 음이온 교환이 없는 시험 절차 (표 10)을 열거한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
최소 단백질은 사전 음이온 교환과 커플링된 시험 절차로 검출되었다. 음이온 교환 없이 순도는 감소되고 검출된 단백질의 수는 증가한다. 검출된 단백질의 최저 순도 및 최대 수는 비교 절차로 도시된다.
실시예 3
AAV8 생산은 AAV8-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되었고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 100kDa로 정용여과되었다. 바이러스성 입자는 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입되었다. 수득된 AAV8 함유 통과액은 25% HCl을 사용하여 7.4 내지 7.8 pH 범위로 pH 조정되지 않았다. 대신에, 장입은 8.5의 pH에서 125 mM NaCl 및 50 mM 트리스HCl을 포함하는 장입 완충액에서 AAV-8 함유 통과액을 재구성함으로써 형성되었다.
pH 조정 단계를 포함하지 않아도 되는 이점 이외에, pH 8.5를 가지고 있는 것은 산물 또는 수지 어느 한쪽에 불순물의 미특이적 결합의 예방 및 친화성 성능에서의 개선된 강건성을 허용한다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV8이 샘플에서 존재하였는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV8이 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 25 mm 및 용적 1.96 ml인, POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화성 매트릭스 (Cat. No. 195338010. Thermo Fisher) ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 5개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입은 POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화성 매트릭스 (Cat. No. 195338010. Thermo Fisher)를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다. 통과액의 샘플은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 1 (W1): 100mM 아세트산나트륨 및 0.1% Tween80의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 2 (W2): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl 및 50% 에틸렌 글리콜의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W1, W2 및 W3의 용출액으로부터의 샘플은 채집되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 적용함으로써 착수되었다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜 및 750mM NaCl.
상기 시험 절차는 표 11에서 더 자세히 기재된다.
Figure pct00020
채집된 샘플은 각각의 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가하였다. 표 12는 표 11에서 열거된 세정, 용출 및 후-용출 단계의 모든 분획에서 ITR qPCR에 의해 검정된 AAV8의 분포를 나타낸다.
Figure pct00021
Figure pct00022
하기 표 13은 표 11에서 열거된 세정, 용출 및 후-용출 단계의 모든 분획에서 ELISA에 의해 검정된 AAV8의 분포를 나타낸다.
Figure pct00023
Figure pct00024
하기 표 14는 단지 장입 및 용출 단계에서 ELISA에 의해 존재하는 HEK 293 HCP의 양을 결정하기 위한 검정의 결과를 나타낸다.
Figure pct00025
Figure pct00026
표 12-14에서 데이터와 연관된 크로마토그램은 도 6에서 도시된다.
상기 샘플은 총 단백질을 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 12% 실버 스테인에 의해 또한 검정되었다. 결과는 도 내에서 명시된 각각의 레인용 표지로 도 4에서 도시된다. AAV8 밴드는 용출액 (E) 및 50% 용출액 희석 (E2) 레인에서 분명히 가시적이다. 매우 적은 AAV8은 세정 밴드 통과액 샘플 (W1, W2 및 W3)에서 그리고 박리 (S) 통과액 샘플에서 보여진다. 따라서, 본 방법은 세정 동안 실질적인 손실 없이 또는 용출 이후 컬럼에 AAV8이 남아있는 것 없이 AAV8을 효율적으로 제거한다.
샘플은 그 다음 AAV 항원에 대한 웨스턴 블랏 및 SDS-PAGE에 의해 검정되었다. 일차 항체는 AAV의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 단클론성 항체인 반면 이차 항체는 알칼리성 포스파타제와 커플링된 염소 항-마우스이다. 결과는 도 4에서처럼 사용된 각각의 레인용 동일한 표지로 도 5에서 도시된다. 세정 및 박리 단계에서 AAV8의 손실은 최소이다.
실시예 4
AAV9 생산은 AAV9-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 100kDa로 정용여과된다. 바이러스성 입자는 비결합 조건에서, 즉 pH 8.5에서 125 mM NaCl 및 50 mM 트리스HCl을 포함하는 용액에서 막 흡착기 (MustangQ; 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입된다. pH 조건화된 장입은 25% HCl을 사용하여 7.4 내지 7.8 pH 범위로 AAV9 함유 통과액을 조정함으로써 수득된다.
하기 시험 절차는 착수된다. 먼저, 층 높이 59 mm 및 용적 47.45ml인, POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화성 수지 (Cat. No. A27354; Thermo Fisher) ID 32mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 5개 컬럼 용적으로 평형화된다. pH 조건화된 장입은 POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화성 수지 (Cat. No. A27354; Thermo Fisher)를 함유하는 컬럼에 적용된다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 5개 컬럼 용적으로 재-평형화된다. (선택적인 제4 완충액).
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 1 (W1): 100mM 아세트산나트륨 및 0.1% Tween80의 5개 컬럼 용적으로 세정된다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 2 (W2): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 5개 컬럼 용적으로 세정된다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl 및 50% 에틸렌 글리콜의 5개 컬럼 용적으로 세정된다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 5개 컬럼 용적을 적용함으로써 착수된다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜 및 750mM NaCl. 하기 이차 용출 완충액의 5개 컬럼 용적은 그 다음 컬럼에 적용된다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜, 및 2000mM NaCl.
상기 단계에 대한 선형 유량은 60 cm/h이다.
하기 비교 절차는 착수된다. 층 높이 2.5 mm 및 용적 1.96ml인, POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화성 수지 (Cat. No. A27354; Thermo Fisher) ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화된다. pH 조건화된 장입은 POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화성 수지 (Cat. No. A27354; Thermo Fisher)를 함유하는 컬럼에 적용된다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화된다.
세정 단계는 하기 TBS 완충액: 20mM 트리스HCl / 150mM NaCl / pH 7.4를 사용함으로써 수행된다. 대신에 용출은 pH 3.0에서 100 mM 시트르산나트륨의 10개 컬럼 용적으로 수행된다.
상기 시험 및 비교 절차는, 단계에서 첨가된 용액의 컬럼 용적의 수를 명시하는 "CV"로, 표 15에서 더 자세히 기재된다.
Figure pct00027
용출 완충액의 밀도는 진동 U-튜브 밀도계 DMA 4500M (Anton Paar)에서 측정된다.
ELISA는 AAV9 항원의 양을 측정하는데 사용된다. ELISA는 TECAN Roboter 시스템에서 AAV-9 적정 ELISA 키트 (Art. No. PRAAV9; Progen (Heidelberg, Germany)로 수행된다. 간단히, 조립된 AAV9 캡시드 (ADK9)에서 형태적 에피토프에 특이적인 단클론성 항체는 미세적정 박리물에 코팅되고 AAV 분획으로부터 AAV9 입자를 포획하는데 사용된다. 포획 AAV9 입자는 2 단계로 검출된다. 제1 단계에서, ADK9 항체에 특이적인 비오틴-컨쥬게이션된 단클론성 항체는 (ADK9 및 ADK9 항체의) 면역 복합체에 결합된다. 스트렙타비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트는 비오틴-컨쥬게이션된 단클론성 항체에 결합된 면역 복합체에 첨가되고 스트렙타비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트는 비오틴과 반응한다. 퍼옥시다제 기질 용액은 첨가되고 결합된 AAV 입자의 양에 비례하는 발색 반응은 발생한다. 발색 반응은 450 nm에서 광도계로 측정된다.
ITR-qPCR 검정은 관심 유전자에 대하여 인코딩하는 벡터 (예를 들면, 인간 인자 VIII 또는 인간 인자 IX)에서 발견된 역전된 연쇄 반복부를 정량화함으로써 게놈 카피 역가를 결정하는데 사용된다. HEK-HCP는 ELISA에 의한 잔류 숙주 세포 단백질의 측정이다. LDH는 비색계 활성 검정에 의해 결정된다.
AAV9 리간드 누출 ELISA (효소 연결된 면역-흡수제 검정)은, 포획제로서 AAV9 친화성 리간드를 함유하는, POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화성 배지로 정제된 생성물에서 존재할 수 있는 1 ng/mL AAV9 친화성 리간드를 검출할 수 있다. AAV9 리간드 누출 ELISA는 최적의 정제 공정 개발 및 공정중 스트림 뿐만 아니라 최종 산물의 일상적 품질관리를 돕기 위한 도구로서 사용될 수 있다. "리간드 누출 ELISA / AAV9 - 항원" 양은 리간드의 나노그램 / AAV9의 마이크로그램으로서 계산된 "리간드 누출 ELISA" 대 "AAV9 항원"의 비를 반영한다.
시험관내 생물효능 검정에서, 바이러스성 벡터 AAV9는 간 표적 세포주를 감염시키고, 후속으로 배지 속에 기능적, 측정가능한 인코딩된 단백질을 분비시킨다. 제1 단계에서 HepG2 표적 세포는 AAV9에 의해 형질도입 감염된다. 인큐베이션 시간 동안 인코딩된 단백질은 세포 상청액에 방출된다. 제2 단계에서 세포 배양물 상청액 속에 인코딩된 단백질의 활성은 활성 검정에 의해 직접적으로 측정된다. AAV9 샘플의 측정은 참조 물질에 대한 백분율로서 주어진다. 본 방법은 AAV9 유전자 요법 벡터의 생물학적 기능의 정량적 평가를 허용한다.
SDS-PAGE 분석은 비교 절차 대신 세정 단계가 있는 시험 절차를 사용하는 경우 열 충격 단백질 70 kDa (HSP70)에서 감소가 있었는지를 결정하기 위해 수행된다. 웨스턴 블랏은 2 시간 동안 1:2000 희석에서 일차 항체로서 항-Hsp70 항체 (Abcam, 카탈로그 번호 ab79852), 및 1 시간 동안 1:1000 희석에서 이차 항체 (Sigma, 카탈로그 번호 A8025)로서 염소 항-토끼 igG (H+L) AP 컨쥬게이트를 사용하여 수행되었다.
SDS-PAGE 실버 스테인 검정은 존재하는 불순물의 전체적인 수준을 결정하기 위해 수행된다.
12% 항-AAV 항체를 이용한 웨스턴 블랏은 시험 및 비교 절차에 따른 정제 이후 회수된 AAV9의 수준 및 순도를 결정하기 위해 수행된다. 웨스턴 블랏은 일차 항체로서 AAV9의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 단클론성 항체로, 이차 항체로서 염소 항-마우스 ALP 항체 (Sigma, 카탈로그 번호 A4656)으로 수행된다.
LC-MS는 다양한 숙주 세포 불순물의 정체성 및 양을 결정하기 위해 수행된다 (rp-HPLC-UV-ESI-MS/MS). 샘플은 효소 트립신을 사용하여 소화된다. 수득된 펩티드 혼합물은 RP 컬럼 (ZORBAX 300SB-C18 컬럼, 0.5x150mm, 3.5μm)을 사용하는 HPLC 시스템에서 분리되고, 후속으로, 펩티드는 Q-Exactive HF 질량 분광분석기에서 분석된다. 데이터는 소프트웨어 Proteome Discoverer를 사용하여 분석되어 샘플에서 단백질을 동정한다.
Agilent HPLC1209 (1200 capHPLC)는 LC 3D 시스템용 ChemStation (Rev. B.04.03-SP2 (105))와 사용된다. HPLC 방법은 PEPMAP_CAP_170.M이다. 용출액 A는 탈이온수내 0.1% (v/v) HCOOH이고 용출액 B는 아세토니트릴내 0.08% (v/v) HCOOH이다. HPLC에 관한 세부사항은 하기 표 16에서 제공된다:
Figure pct00028
MS에 관한 세부사항은 하기 표 17에서 제공된다:
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
3회의 상이한 방식의 정제는 수행된다. 하나는 본 실시예의 비교 절차를 포함하고, 또 다른 것은 (친화성 정제 이전 MustangQ에 의한 음이온 교환 정제를 포함하는) 본 실시예의 시험 절차를 포함하고, 세번째는 MustangQ에 의한 음이온 교환 정제 없이 시험 절차에 따라 수행된다.
실시예 5
AAV9 생산은 AAV9-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발된다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 100kDa로 정용여과된다. 바이러스성 입자는 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입된다. 수득된 AAV9 함유 통과액은 25% HCl을 사용하여 7.4 내지 7.8 pH 범위로 pH 조정되지 않는다. 대신에, 장입은 8.5의 pH에서 125 mM NaCl 및 50 mM 트리스HCl을 포함하는 장입 완충액에서 AAV-8 함유 통과액을 재구성함으로써 형성된다.
pH 조정 단계를 포함하지 않아도 되는 이점 이외에, pH 8.5를 가지고 있는 것은 산물 또는 수지 어느 한쪽에 불순물의 미특이적 결합의 예방 및 친화성 성능에서의 개선된 강건성을 허용할 수 있다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV9가 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집된다. 검정은 얼마나 많은 AAV9가 다양한 세정 단계에서 손실되는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 25 mm 및 용적 1.96 ml인, POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화성 수지 (Cat. No. A27354; Thermo Fisher) ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 5개 컬럼 용적으로 평형화된다. 장입은 POROS™ CaptureSelect™ AAV9 친화성 수지 (Cat. No. A27354; Thermo Fisher)를 함유하는 컬럼에 적용된다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정된다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화된다. 통과액의 샘플은 생략되고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정된다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 1 (W1): 100mM 아세트산나트륨 및 0.1% Tween80의 10개 컬럼 용적으로 세정된다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 2 (W2): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정된다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl 및 50% 에틸렌 글리콜의 10개 컬럼 용적으로 세정된다. 각각의 W1, W2 및 W3의 용출액으로부터 샘플은 채집되고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정된다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 적용함으로써 착수된다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜 및 750mM NaCl.
상기 시험 절차는 표 18에서 더 자세히 기재된다.
Figure pct00032
채집된 샘플은 각각의 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가한다.
상기 샘플은 총 단백질을 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 12% 실버 스테인에 의해 또한 검정된다.
샘플은 그 다음 AAV9 항원에 대한 웨스턴 블랏 및 SDS-PAGE에 의해 검정된다. 일차 항체는 AAV9의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 단클론성 항체인 반면 이차 항체는 포스파타제와 커플링된 염소 항-마우스이다.
실시예 6
AAV9 생산은 AAV9-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발된다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 100kDa로 정용여과된다. 바이러스성 입자는 비결합 조건에서, 즉 pH 8.5에서 125 mM NaCl 및 50 mM 트리스HCl을 포함하는 용액에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입된다. pH 조건화된 장입은 25% HCl을 사용하여 7.4 내지 7.8 pH 범위로 AAV9 함유 통과액을 조정함으로써 수득된다.
하기 시험 절차는 착수된다. 먼저, 층 높이 59 mm 및 용적 47.45ml인, 수지 ("ADK8/9 친화성 수지") ID 32mm에서 고정화된 항-온전한 AAV8/9 항체 (Cat. No. 03-651161, American Research Products, Inc., Waltham, MA)를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 5개 컬럼 용적으로 평형화된다. pH 조건화된 장입은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용된다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 5개 컬럼 용적으로 재-평형화된다 (선택적인 제4 완충액).
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 1 (W1): 100mM 아세트산나트륨 및 0.1% Tween80의 5개 컬럼 용적으로 세정된다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 2 (W2): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 5개 컬럼 용적으로 세정된다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl 및 50% 에틸렌 글리콜의 5개 컬럼 용적으로 세정된다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 5개 컬럼 용적을 적용함으로써 착수된다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜 및 750mM NaCl. 하기 이차 용출 완충액의 5개 컬럼 용적은 그 다음 컬럼에 적용된다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜, 및 2000mM NaCl.
상기 단계에 대한 선형 유량은 60 cm/h이다.
하기 비교 절차는 착수된다. 층 높이 2.5 mm 및 용적 1.96ml인, ADK8/9 친화성 수지, ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화된다. pH 조건화된 장입은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용된다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화된다.
세정 단계는 하기 TBS 완충액: 20mM 트리스HCl / 150mM NaCl / pH 7.4를 사용함으로써 수행된다. 대신에 용출은 pH 3.0에서 100 mM 시트르산나트륨의 10개 컬럼 용적으로 수행된다.
상기 시험 및 비교 절차는, 단계에서 첨가된 용액의 컬럼 용적의 수를 명시하는 "CV"로, 표 1에서 더 자세히 기재된다.
용출 완충액의 밀도는 진동 U-튜브 밀도계 DMA 4500M (Anton Paar)에서 측정된다.
ELISA는 AAV9 항원의 양을 측정하는데 사용된다. ELISA는 TECAN Roboter 시스템에서 AAV-9 적정 ELISA 키트 (Art. No. PRAAV9; Progen (Heidelberg, Germany)로 수행된다. 간단히, AAV9 캡시드에 특이적인 단클론성 항체 (AAV8/9 항체 ("ADK8/9 항체", Cat. No. 03-651161, American Research Products, Inc., Waltham, MA))는 미세적정 박리물에 코팅되고 AAV 분획으로부터 AAV9 입자를 포획하는데 사용된다. 포획 AAV9 입자는 2 단계로 검출된다. 제1 단계에서, ADK8/9 항체에 특이적인 비오틴-컨쥬게이션된 단클론성 항체는 (ADK8/9 및 ADK8/9 항체의) 면역 복합체에 결합된다. 스트렙타비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트는 비오틴-컨쥬게이션된 단클론성 항체에 결합된 면역 복합체에 첨가되고 스트렙타비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트는 비오틴과 반응한다. 퍼옥시다제 기질 용액은 첨가되고 결합된 AAV 입자의 양에 비례하는 발색 반응은 발생한다. 발색 반응은 450 nm에서 광도계로 측정된다.
ITR-qPCR 검정은 관심 유전자에 대하여 인코딩하는 벡터 (예를 들면, 인간 인자 VIII 또는 인간 인자 IX)에서 발견된 역전된 연쇄 반복부를 정량화함으로써 게놈 카피 역가를 결정하는데 사용된다. HEK-HCP는 ELISA에 의한 잔류 숙주 세포 단백질의 측정이다. LDH는 비색계 활성 검정에 의해 결정된다.
AAV8/9 리간드 누출 ELISA (효소 연결된 면역-흡수제 검정)은 ADK8/9 친화성 수지로 정제된 산물에서 존재할 수 있는 친화성 리간드를 검출할 수 있다.
시험관내 생물효능 검정에서, 바이러스성 벡터 AAV9는 간 표적 세포주를 감염시켜, 후속으로 배지 속에 기능적, 측정가능한 인코딩된 단백질을 분비시킨다. 제1 단계에서 HepG2 표적 세포는 AAV9에 의해 형질도입 감염된다. 인큐베이션 시간 동안 인코딩된 단백질은 세포 상청액에 방출된다. 제2 단계에서 세포 배양물 상청액 속에 인코딩된 단백질의 활성은 활성 검정에 의해 직접적으로 측정된다. AAV9 샘플의 측정은 참조 물질에 비한 백분율로서 주어진다. 본 방법은 AAV9 유전자 요법 벡터의 생물학적 기능의 정량적 평가를 허용한다.
SDS-PAGE 분석은 비교 절차 대신 세정 단계가 있는 시험 절차를 사용하는 경우 열 충격 단백질 70 kDa (HSP70)에서 감소가 있었는지를 결정하기 위해 수행된다. 웨스턴 블랏은 2 시간 동안 1:2000 희석에서 일차 항체로서 항-Hsp70 항체 (Abcam, 카탈로그 번호 ab79852), 및 1 시간 동안 1:1000 희석에서 이차 항체 (Sigma, 카탈로그 번호 A8025)로서 염소 항-토끼 igG (H+L) AP 컨쥬게이트를 사용하여 수행된다.
SDS-PAGE 실버 스테인 검정은 존재하는 불순물의 전체적인 수준을 결정하기 위해 수행된다.
12% 항-AAV 항체를 이용한 웨스턴 블랏은 시험 및 비교 절차에 따른 정제 이후 회수된 AAV9의 수준 및 순도를 결정하기 위해 수행된다. 웨스턴 블랏은 일차 항체로서 AAV9의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 단클론성 항체로, 이차 항체로서 염소 항-마우스 ALP 항체 (Sigma, 카탈로그 번호 A4656)으로 수행된다.
LC-MS는 다양한 숙주 세포 불순물의 정체성 및 양을 결정하기 위해 수행된다 (rp-HPLC-UV-ESI-MS/MS). 샘플은 효소 트립신을 사용하여 소화된다. 수득된 펩티드 혼합물은 RP 컬럼 (ZORBAX 300SB-C18 컬럼, 0.5x150mm, 3.5μm)를 사용하는 HPLC 시스템에서 분리되고, 후속으로, 펩티드는 Q-Exactive HF 질량 분광분석기에서 분석된다. 데이터는 소프트웨어 Proteome Discoverer를 사용하여 분석되어 샘플에서 단백질을 동정한다.
Agilent HPLC1209 (1200 capHPLC)는 LC 3D 시스템용 ChemStation (Rev. B.04.03-SP2 (105))와 사용된다. HPLC 방법은 PEPMAP_CAP_170.M이다. 용출액 A는 탈이온수내 0.1% (v/v) HCOOH이고 용출액 B는 아세토니트릴내 0.08% (v/v) HCOOH이다. HPLC에 관한 세부사항은 하기 표 19에서 제공된다:
Figure pct00033
MS에 관한 세부사항은 하기 표 20에서 제공된다:
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
3회 상이한 방식의 정제는 수행된다. 하나는 본 실시예의 비교 절차를 포함하고, 또 다른 것은 (친화성 정제 이전 MustangQ에 의한 음이온 교환 정제를 포함하는) 본 실시예의 시험 절차를 포함하고, 세번째는 MustangQ에 의한 음이온 교환 정제 없이 시험 절차에 따라 수행된다.
실시예 7
AAV9 생산은 AAV9-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발된다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 100kDa로 정용여과된다. 바이러스성 입자는 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입된다. 수득된 AAV9 함유 통과액은 25% HCl을 사용하여 7.4 내지 7.8 pH 범위로 pH 조정되지 않는다. 대신에, 장입은 8.5의 pH에서 125 mM NaCl 및 50 mM 트리스HCl을 포함하는 장입 완충액에서 AAV9- 함유 통과액을 재구성함으로써 형성된다.
pH 조정 단계를 포함하지 않아도 되는 이점 이외에, pH 8.5를 가지고 있는 것은 산물 또는 수지 어느 한쪽에 불순물의 미특이적 결합의 예방 및 친화성 성능에서의 개선된 강건성을 허용할 수 있다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV9가 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집된다. 검정은 얼마나 많은 AAV9가 다양한 세정 단계에서 손실되는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수된다. 먼저, 층 높이 25 mm 및 용적 1.96 ml인, ADK8/9 친화성 수지 ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 적어도 5개 컬럼 용적으로 평형화된다. 장입은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용된다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정된다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl 및 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화된다. 통과액의 샘플은 생략되고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정된다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 1 (W1): 100mM 아세트산나트륨 및 0.1% Tween80의 10개 컬럼 용적으로 세정된다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 2 (W2): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정된다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl 및 50% 에틸렌 글리콜의 10개 컬럼 용적으로 세정된다. 각각의 W1, W2 및 W3의 용출액으로부터 샘플은 채집되고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정된다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 적용함으로써 착수된다: 50mM 트리스HCl, 50% 에틸렌 글리콜 및 750mM NaCl.
상기 시험 절차는 표 21에서 더 자세히 기재된다.
Figure pct00037
채집된 샘플은 각각의 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가한다.
상기 샘플은 총 단백질을 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 12% 실버 스테인에 의해 또한 검정된다.
샘플은 그 다음 AAV9 항원에 대한 웨스턴 블랏 및 SDS-PAGE에 의해 검정된다. 일차 항체는 AAV9의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 단클론성 항체인 반면 이차 항체는 포스파타제와 커플링된 염소 항-마우스이다.
실시예 8
AAV8 ELISA는 TECAN Roboter 시스템에서 AAV-8 적정 ELISA 키트 (Art. No. PRAAV8; Progen(Heidelberg, Germany)로 수행되었다. 조립된 AAV8 캡시드 (ADK8)에서 형태적 에피토프에 특이적인 단클론성 항체는 미세적정 박리물에 코팅되었고 AAV 분획으로부터 AAV8 입자를 포획하는데 사용되었다. 포획 AAV8 입자는 2 단계로 검출되었다. 제1 단계에서, ADK8 항체에 특이적인 비오틴-컨쥬게이션된 단클론성 항체는 면역 복합체에 결합되었다. 스트렙타비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트는 비오틴-컨쥬게이션된 단클론성 항체에 결합된 면역 복합체에 첨가되었고 스트렙타비딘 퍼옥시다제 컨쥬게이트는 비오틴과 반응하였다. 퍼옥시다제 기질 용액은 첨가되었고 결합된 AAV 입자의 양에 비례하는 발색 반응은 발생한다. 발색 반응은 450 nm에서 광도계로 측정되었다.
실시예 9
본 실시예에서 수행된 ITR-qPCR 검정에 대하여, 하기 절차는 착수되었다. 벡터 게놈 역가 (vg) / 밀리리터 (ml)는 벡터 게놈의 ITR 서열 내에서 서열을 검출하는 형광으로 표지된 프로브 및 프라이머가 있는 TaqMan 기반 qPCR을 사용하여 결정되었다. AAV 입자에서 ITR-특이적 서열 검출을 위하여 샘플은 상이한 처리를 받았다. 샘플은 DNAse I로 그리고 후속으로 프로테이나제 K로 처리되어 이로써 scAAV 게놈은 캡시드로부터 방출되었다. 그 다음, 제한 효소 소화는 수행되어 AAV ITR T-형상 구조를 분해시켰다.
참조 물질로서 사용된 플라스미드는 단일 컷터 제한 효소로 선형화되었고 운트 아가로스 겔로부터 추가로 정제되었다. 겔-추출된 DNA의 UV A260 흡광도는, μg /mL로 계산된 DNA 농도의 평균 값으로, UV 분광측정기에서 3회 측정되었다.
선형화된 표준 플라스미드에 대하여 카피 수를 결정하기 위해, ds DNA의 분자량은 기저 서열의 각각의 개별 뉴클레오타이드에 대한 정확한 질량을 고려하여 그램 / 몰로 계산되었다.
(벡터 게놈 / mL로) 시험품에서 벡터 게놈 역가는 선형 회귀로 적합화하는 플라스미드 표준 곡선을 통해 계산되었다.
실시예 10
AAV8 생산은 AAV8-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되었고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 300kDa로 정용여과되었다. 바이러스성 입자는 AAV8용 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입되었다. 수득된 AAV8 함유 통과액은 pH 8.0에서 100 mM 아르기닌, 200 mM NaCl을 포함하는 희석 완충액으로 희석되어 AAV8-친화성 매트릭스용 장입물을 제조하였다. 아르기닌-함유 장입물은 POROSTM CaptureSelectTM AAV8 친화성 매트릭스 (Thermo Fisher, 카탈로그 번호 A30793)을 함유하는 컬럼에 적용되었다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV8이 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV8이 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 25 mm 및 용적 2.04 ml인, ADK8/9 친화성 수지 ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 8.5에서 20mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입물은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (세정 1, W1). 통과액의 샘플은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 2 (W2): 100mM 아세트산나트륨 및 0.1% Tween80의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 4 (W4): 50mM 트리스HCl 및 50% 에틸렌 글리콜의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W2, W3 및 W4의 용출액으로부터 샘플은 채집되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 먼저 적용함으로써 착수되었다: 50mM 트리스HCl, 60% (w/w) 에틸렌 글리콜 및 750mM NaCl. 세정 단계는 후속으로 수행되지 않았다. 용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 다음에 적용함으로써 계속되었다: 50mM 트리스HCl, 60% (w/w) 에틸렌 글리콜 및 1000mM NaCl. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20 mM 트리스 HCl로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 2.5에서 컬럼에 100 mM 글리신 및 200 mM NaCl을 포함하는 용액의 10개 컬럼 용적을 적용함으로써 재생되었다.
상기 시험 절차는 표 22에서 더 자세히 기재된다.
Figure pct00038
실시예 11
AAV8 생산은 AAV8-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 30L 수확 분취액으로부터 세포는 메가트론(Megatron) MT3000(팔)을 사용한 다음, a)심층 필터 PDP8 면적 0.5m2 b) 심층 필터 V100 면적: 0.5m2 및 c) 클린팩(Kleenpak) 캡슐 0.2μm 면적 0.15m2로 AAV8 함유 용액을 여과시킴으로써 파괴되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되었고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 300kDa로 정용여과되었다. 바이러스성 입자는 AAV8용 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입되었다. 수득된 AAV8 함유 통과액은 pH 8.0에서 100 mM 아르기닌, 200 mM NaCl을 포함하는 희석 완충액으로 1:2 희석되어 AAV8-친화성 매트릭스용 장입물을 제조하였다. 아르기닌-함유 장입물은 POROSTM CaptureSelectTM AAV8 친화성 매트릭스 (Thermo Fisher, 카탈로그 번호 A30793; ID 10mm, 층 높이 26mm, 용적 2.04ml)를 함유하는 컬럼에 적용되었다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV8이 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV8이 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 25 mm 및 용적 2.04 ml인, ADK8/9 친화성 수지 ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 8.0에서 50mM 아르기닌-HCl 및 100mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입물은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.0에서 50mM 아르기닌-HCl 및 100mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (세정 1, W1). 통과액의 샘플은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 2 (W2): 100mM MES-나트륨, 10 mM EDTA, 및 11.2 g/kg S/D II 용액 (18.0 g Tween 80, 3.4g DMSO, 및 3.6g TnBP)의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.0에서 세정 3 (W3): 50mM 아르기닌-HCl 및 100mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 4 (W4): 50mM 아르기닌-HCl 및 50% 수크로스의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W2, W3 및 W4의 용출액으로부터 샘플은 채집되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 먼저 적용함으로써 착수되었다: 50mM 아르기닌-HCl, 55% (w/w) 수크로스, 2 mM MgCl2, 및 800mM NaCl. 컬럼은 그 다음 pH 8.0에서 세정 5 (W5): 50mM 아르기닌-HCl 및 100mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 다음에 적용함으로써 계속되었다: 50mM 아르기닌-HCl, 50% (v/v) 글리세롤, 및 800mM NaCl. 컬럼은 그 다음 pH 8.0에서 50mM 아르기닌-HCl 및 100mM NaCl로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 2.7에서 컬럼에 100 mM 글리신 및 200 mM NaCl을 포함하는 용액의 10개 컬럼 용적을 적용함으로써 재생되었다.
상기 시험 절차는 표 23에서 더 자세히 기재된다. 39 cm/h의 선형 유량은 모든 단계에서 적용되었다.
Figure pct00039
상기 장입 단계에서, Mustang Q 컬럼내 1:2 희석은 실시되어 평형 완충액의 매트릭스에 가까운 조건으로 장입을 조정하였다. 이 단계는 리간드에 AAV8의 결합 관점에서 완충액 서브스턴스의 영향을 조사하기 위해 실행되었다. 임의의 신규 도입된 화합물은 잠재적인 경쟁적 특성을 가질 수 있고/거나 용출을 잠재적으로 유발시킬 수 있다.
채집된 샘플은 각각의 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가하였다. 상기 실시예와 연관된 크로마토그램은 도 7에서 도시된다. 하기 표 24는, 표 25에서 나타난 각각의 성분의 수율로, 각각의 상기 단계에서 채집된 샘플을 나타낸다.
Figure pct00040
"세정 5" 단계는 용출에서 직면하는 효과를 감소시켰다.
Figure pct00041
상기 샘플은 총 단백질을 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 12% 실버 스테인에 의해 또한 검정되었다. SDS-PAGE 검정 결과는 도 8에서 도시된다.
실시예 12
AAV8 생산은 AAV8-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 30L 수확 분취액으로부터 세포는 메가트론 Megatron MT3000(팔)을 사용한 다음, a) 심층 필터 PDP8 면적 0.5m2 b) 심층 필터 V100 면적: 0.5m2 및 c) 클린팩 캡슐 0.2μm 면적 0.15m2로 AAV8 함유 용액을 여과함으로써 파괴되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되었고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 300kDa로 정용여과되었다. 바이러스성 입자는 AAV8용 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입되었다. 장입물은 POROSTM CaptureSelectTM AAV8 친화성 매트릭스 (Thermo Fisher, 카탈로그 번호 A30793; ID 10mm, 층 높이 26mm, 용적 2.04ml)를 함유하는 컬럼에 적용되었다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV8이 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV8이 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 25 mm 및 용적 2.04 ml인, ADK8/9 친화성 수지 ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 8.5에서 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입물은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (세정 1, W1). 통과액의 샘플은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 2 (W2): 100mM 타우린, 125 mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 100mM 글리신의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 4 (W4): 50mM 타우린, 50% (w/w) 에틸렌 글리콜, 0.1% 옥틸글리코피라노시드의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W2, W3 및 W4의 용출액으로부터 샘플은 채집되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 먼저 적용함으로써 착수되었다: 50mM 타우린, 60% (w/w) 에틸렌 글리콜, 750 mM NaCl, 0.1% 옥틸글리코피라노시드. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 5 (W5): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 용출은 pH 7.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 다음에 적용함으로써 계속되었다: 1 M (NH4)2SO4, 50 mM 트리스HCl 및 50% (v/v) 에틸렌 글리콜. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 50mM 트리스HCl 및 125 mM NaCl로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 2.7에서 컬럼에 100 mM 글리신 및 200 mM NaCl을 포함하는 용액의 10개 컬럼 용적을 적용함으로써 재생되었다.
상기 시험 절차는 표 26에서 더 자세히 기재된다. 39 cm/h의 선형 유량은 모든 단계에서 적용되었다.
Figure pct00042
채집된 샘플은 각각의 ITR qPCR 및 AAV 항원에 대한 (상기 실시예 8에서 기재된 바와 같이) ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가하였다. 상기 실시예와 연관된 크로마토그램은 도 9에서 도시된다. 하기 표 27은, 표 28에서 나타난 각각의 성분의 수율로, 각각의 상기 단계에서 채집된 샘플을 나타낸다.
Figure pct00043
"세정 5" 단계는 용출에서 직면하는 효과를 감소시켰다.
Figure pct00044
상기 샘플은 총 단백질을 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 12% 실버 스테인에 의해 또한 검정되었다. SDS-PAGE 검정 결과는 도 10에서 도시된다.
실시예 13
AAV8 생산은 AAV8-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 30L 수확 분취액으로부터 세포는 메가트론 MT3000(팔)을 사용한 다음, a) 심층 필터 PDP8 면적 0.5m2 b) 심층 필터 V100 면적: 0.5m2 및 c) 클린팩 캡슐 0.2μm 면적 0.15m2로 AAV8 함유 용액을 여과시킴으로써 파괴되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되었고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 300kDa로 정용여과되었다. 바이러스성 입자는 AAV8용 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입되었다. 수득된 AAV8 함유 통과액은 희석 완충액 [100mM 히스티딘, 200mM NaCl, pH 8.5]로 1:2 희석되었고 추가의 4g 폴리소르베이트 80 /kg은 첨가되어 AAV8-친화성용 장입물을 제조하였다. 히스티딘-함유 장입물은 POROS™ CaptureSelect™ AAV8 친화성 매트릭스 (Cat. No. A30793, Thermo Fisher; ID 10mm, 층 높이 26mm, 용적 2.04ml)를 함유하는 컬럼에 적용되었다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV8이 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV8이 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 26 mm 및 용적 2.04 ml인, ADK8/9 친화성 수지 ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 8.5에서 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입물은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 (상기 실시예 9에서 기재된 바와 같이) ITR qPCR 및 AAV 항원에 대한 ELISA, 그리고 (상기 실시예 8에서 기재된 바와 같이) HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 50mM 히스티딘 및 100mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (세정 1, W1). 통과액의 샘플은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 2 (W2): 200mM 비스-트리스, 16.6 g S/D 용액 (트리톤 X-100; 폴리소르베이트 80; TNBP = 10.87; 3.31:3.01 (중량 기준)의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 10mM Na-시트레이트의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음, 20% (w/w) 폴리소르베이트 80과, pH 8.5에서, 세정 4 (W4):100 mM 아르기닌-HCl, 100 mM 리신-HCl, 100 mM 히스티딘-HCl, 2 mM N-아세틸-D,L-트립토판의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W2, W3 및 W4의 용출액으로부터 샘플은 채집되었고 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 먼저 적용함으로써 착수되었다: 20% (w/w) 수크로스, 10% (w/w) 소르비톨, 5% (w/w) 만니톨 (수크로스), 15% (w/w) 글리세롤, 50mM 히스티딘, 800 mM NaCl. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 5 (W5): 50mM 히스티딘 및 100 mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 용출은 pH 8.0에서 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 다음에 적용함으로써 계속되었다: 50 mM 트리스HCl, 750 mM NaCl, 및 50% (w/w) DMSO. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 50mM 히스티딘 및 100 mM NaCl로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 2.7에서 컬럼에 100 mM 글리신 및 200 mM NaCl을 포함하는 용액의 10개 컬럼 용적을 적용함으로써 재생되었다.
상기 시험 절차는 표 29에서 더 자세히 기재된다. 39 cm/h의 선형 유량은 모든 단계에서 적용되었다.
Figure pct00045
Figure pct00046
"세정 5" 단계는 용출에서 직면하는 효과를 감소시켰다. AAV8의 용출은 제2 용출 단계 (용출 2)에서 보여졌다. AAV8에 대하여, DMSO는 지질-외피 바이러스를 잠재적으로 불활성화 또는 분해하기 위해 완충액으로서 및/또는 세정 완충액으로서 여전히 적합할 수 있다.
채집된 샘플은 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) 각각의 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가하였다. 상기 실시예와 연관된 크로마토그램은 도 11에서 도시된다. 하기 표 30은, 표 31에서 나타난 각각의 성분의 수율을 가진, 각각의 상기 단계에서 채집된 샘플을 나타낸다.
Capture Select AAV8 수지로부터 AAV8의 용출이 폴리올 및 염의 특정 양의 존재 하에서 중성 가까기에 발생한다는 것은 예상밖이다. 수지 제조자는 용출이 3.5의 pH 미만 산성 조건을 요구할 것을 제안하였다. 용출이 당류, 당 알코올류 및/또는 당류와 당 알코올류의 혼합물로 유발될 수 있다는 것이 또한 놀라웠다. 또한, 극성 용매로서 DMSO가 Capture Select AAV8 수지로부터 AAV8을 용출할 수 없다는 것은 예상 밖이었다.
Figure pct00047
"세정 5" 단계는 용출에서 직면하는 효과를 감소시켰다. 어떠한 AAV8의 용출도 제2 용출 단계 (용출 2)에서 나타나지 않았다.
Figure pct00048
상기 샘플은 총 단백질을 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 12% 실버 스테인에 의해 또한 검정되었다. SDS-PAGE 검정 결과는 도 12에서 도시된다.
실시예 14
AAV2 생산은 AAV2-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. AAV2 샘플은 150mM NaCl, 20mM 트리스HCl, pH 7.4로 희석되어 장입물을 제공하였다. 장입물은 POROS™ CaptureSelect™ AAVX 친화성 매트릭스 (Cat. No.: A36739, Thermo Fisher; ID 10mm, 층 높이 25mm, 용적 1.96ml)를 함유하는 컬럼에 적용되었다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV2가 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV2가 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 25 mm 및 용적 1.96 ml인, ADK8/9 친화성 수지 ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입물은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (세정 1, W1). 통과액의 샘플은 생략되었고 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 2 (W2): 100mM NaAcetate, 0.1% 폴리소르베이트 80의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl, 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 4 (W4): 50mM 트리스HCl, 50%(w/w) 에틸렌 글리콜의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.0 세정 5 (W5): 50mM 트리스HCl ,60%(w/w) 에틸렌 글리콜 + 750mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4 세정 6 (W6): 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W2, W3 및 W4의 용출액으로부터 샘플은 채집되었고 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 먼저 적용함으로써 착수되었다: 100mM 글리신-HCl, 200mM NaCl, pH 2.5. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 세정 7 (W7): 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 50mM 인산 pH 2.0의 10개 컬럼 용적으로 박리되었고, pH 7.4에서 세정 8 (W8): 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었고, 그 다음 10개 컬럼 용적 50mM 인산 pH 2.0으로 박리되었다.
상기 시험 절차는 표 32에서 더 자세히 기재된다. 39 cm/h의 선형 유량은 모든 단계에서 적용되었다.
Figure pct00049
채집된 샘플은 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) 각각의 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가하였다. 상기 실시예와 연관된 크로마토그램은 도 13에서 도시된다. 하기 표 33은, 표 34에서 나타난 각각의 성분의 수율로, 각각의 상기 단계에서 채집된 샘플을 나타낸다.
Figure pct00050
Figure pct00051
상기 샘플은 총 단백질을 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 12% 실버 스테인에 의해 또한 검정되었다. SDS-PAGE 검정의 결과는 도 14에서 도시된다 (참고 레인 2-11).
샘플은 그 다음 AAV 항원에 대한 웨스턴 블랏 및 SDS-PAGE에 의해 검정되었다. 일차 항체는 AAV의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 단클론성 항체인 반면 이차 항체는 알칼리성 포스파타제로 커플링된 염소 항-마우스이다. 웨스턴 블랏 검정의 결과는 도 15에서 도시된다 (참고 레인 2-11).
실시예 15
AAV9 생산은 AAV9-, VP1, -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. AAV9 샘플은 150mM NaCl, 20mM 트리스HCl, pH 7.4로 희석되어 장입물을 제공하였다. 장입물은 POROS™ CaptureSelect™ AAVX 친화성 매트릭스 (Cat. No.: A36739, Thermo Fisher; ID 10mm, 층 높이 25mm, 용적 1.96ml)를 함유하는 컬럼에 적용되었다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV9가 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV9가 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 25 mm 및 용적 1.96 ml인, ADK8/9 친화성 수지 ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입물은 ADK8/9 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (세정 1, W1). 통과액의 샘플은 생략되었고 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 2 (W2): 100mM NaAcetate, 0.1% 폴리소르베이트 80의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl, 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 4 (W4): 50mM 트리스HCl, 50%(w/w) 에틸렌 글리콜의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.0 세정 5 (W5): 50mM 트리스HCl, 60%(w/w) 에틸렌 글리콜 + 750mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 세정 6 (W6): 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl, pH 7.4의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W2, W3 및 W4의 용출액으로부터 샘플은 채집되었고 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 컬럼에 하기 용출 완충액의 10개 컬럼 용적을 먼저 적용함으로써 착수되었다: 100mM 글리신 HCl, 200mM NaCl, pH 2.5. 컬럼은 그 다음 pH 7.4에서 세정 7 (W7): 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 50mM 인산 pH 2.0의 10개 컬럼 용적으로 박리되었고, pH 7.4에서 세정 8 (W8): 20mM 트리스HCl, 150mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었고, 그 다음 10개 컬럼 용적 50mM 인산 pH 2.0으로 박리되었다.
상기 시험 절차는 표 35에서 더 자세히 기재된다. 39 cm/h의 선형 유량은 모든 단계에서 적용되었다.
Figure pct00052
채집된 샘플은 (상기 실시예 8 및 9에서 기재된 바와 같이) 각각의 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가하였다. 상기 실시예와 연관된 크로마토그램은 도 16에서 도시된다. 하기 표 36은, 표 37에서 나타난 각각의 성분의 수율로, 각각의 상기 단계에서 채집된 샘플을 나타낸다.
Figure pct00053
Figure pct00054
상기 샘플은 총 단백질을 검출하기 위해 SDS-PAGE 및 12% 실버 스테인에 의해 또한 검정되었다. SDS-PAGE 검정의 결과는 도 14에서 도시된다 (참고 레인 12-20).
샘플은 그 다음 AAV 항원에 대한 웨스턴 블랏 및 SDS-PAGE에 의해 검정되었다. 일차 항체는 AAV의 VP1, VP2 및 VP3에 대한 단클론성 항체인 반면 이차 항체는 알칼리성 포스파타제로 커플링된 염소 항-마우스이다. 웨스턴 블랏 검정의 결과는 도 15에서 도시된다 (참고 레인 12-20).
실시예 16
본 실시예는, 산성 글리신 또는 인산의 사용에 비하여, AAV9로 향상되는 용출 조건을 입증한다.
AAV9 생산은 AAV9-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA를 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 30L 수확 분취액으로부터 세포는 메가트론 MT3000(팔)을 사용한 다음, a) 심층 필터 PDP8 면적 0.5m2, b) 심층 필터 V100 면적: 0.5m2 및 c) 클린팩 캡슐 0.2μm 면적 0.15m2로 AAV9 함유 용액을 여과시킴으로써 파괴되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되었고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 300kDa로 정용여과되었다. 바이러스성 입자는 AAV9용 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입되었다. 장입물은 POROS™ CaptureSelect™ AAVX 친화성 매트릭스 (Thermo Fisher, 카탈로그 번호 A36739, Thermo Fisher) ID 16mm, 층 높이 50mm, 용적 10.0ml를 함유하는 컬럼에 적용된 다음 지시된 대로 컬럼 용적으로 완충액 단계가 뒤따랐다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV9가 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV9가 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 컬럼은 pH 8.5에서 50mM 트리스 HCl, 125mM NaCl의 적어도 5개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입물은 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 50mM 트리스HCl, 125mM NaCl의 5개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (세정 1, W1). 통과액의 샘플은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 2 (W2): 100mM NaAcetate, 0,1% 폴리소르베이트80의 5개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl, 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W2 및 W3의 용출액으로부터 샘플은 채집되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 pH 3.2에서 정제수의 20개 컬럼 용적, 그 다음 1 mM HCl의 20개 컬럼 용적, 및 그 다음 pH 8.0에서 50mM 트리스HCl,750mM NaCl, 50 % DMSO (w/w)의 20개 컬럼 용적을 먼저 적용함으로써 착수되었다. 컬럼은 pH 2.0에서 정제수의 20개 컬럼 용적 이어서 33mM HCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다.
상기 시험 절차는 표 38에서 더 자세히 기재된다. 39 cm/h의 선형 유량은 모든 단계에서 적용되었다.
Figure pct00055
채집된 샘플은 각각의 ITR qPCR 및 AAV 항원에 대한 (상기 실시예 8에서 기재된 바와 같이) ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가하였다. 상기 실시예와 연관된 크로마토그램은 도 17에서 도시된다. 하기 표 39는, 표 40에서 나타난 특정 성분의 수율로, 각각의 상기 단계에서 채집된 샘플을 나타낸다.
Figure pct00056
Figure pct00057
상기 샘플은, 도 18에서 도시된 결과로, SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅에 의해 또한 검정되었다.
AAV9는 수성 시스템에 유리 산의 초저량만을 도입하는 이점을 가지고 있는 1mM 염산을 가진 Capture select AAVx로부터 용출될 수 있다. 중성 pH 근처 추가 용출 절차는 DMSO 함유 수성 완충액 용액 (750mM NaCl, 50mM 트리스HCl, 50%w/w 디메틸설폭시드)로 수행될 수 있다. DMSO-함유 용출액이 수크로스 경사를 사용하는 초원심분리에 적용되면 DMSO는 유익할 수 있다. 양쪽 용출 전략은 가혹한 용출 조건 pH 3 미만에서 100mM 및/또는 다량의 염화나트륨 또는 염화마그네슘에 비교하여 모든 AAV 아형에 대한 AAVX 수지로부터 용출 동안 생물효능을 유지하기 위해 개선된 특성을 잠재적으로 갖는다.
실시예 17
본 실시예는, 산성 글리신 또는 인산의 사용에 비하여, AAV9로 향상되는 용출 조건을 입증한다.
AAV9 생산은 AAV9-. VP1. -VP2 및 -VP3 그리고 관심 단백질의 인코딩 cDNA (FIX-padua, 이중가닥)을 함유하는 3중 플라스미드 시스템으로 형질감염 이후 HEK293 세포주에서 개발되었다. 30L 수확 분취액으로부터 세포는 메가트론 MT3000(팔)을 사용한 다음, a) 심층 필터 PDP8 면적 0.5m2 b) 심층 필터 V100 면적: 0.5m2 및 c) 클린팩 캡슐 0.2μm 면적 0.15m2로 AAV9 함유 용액을 여과시킴으로써 파괴되었다. 정화된 무세포 배양 상청액은 농축되었고 팔 오메가 T-시리즈 카셋트 300kDa로 정용여과되었다. 바이러스성 입자는 AAV9용 비결합 조건에서 막 흡착기 (MustangQ. 팔 부품 번호 XT140MSTGQP05)에 장입되었다. 장입물은 POROSTM CaptureSelectTM AAVX 친화성 매트릭스 (Thermo Fisher, 카탈로그 번호 A36739; 10mm, 층 높이 28mm, 용적 2.2ml)를 함유하는 컬럼에 적용되었다.
다양한 세정 및 용출 단계로부터 샘플은 얼마나 많은 AAV9가 샘플에서 존재하는지를 검정하기 위해 다양한 지점에서 채집되었다. 검정은 얼마나 많은 AAV9가 다양한 세정 단계에서 손실되었는지를 나타낸다. 하기 시험 절차는 착수되었다. 먼저, 층 높이 28 mm 및 용적 2.2 ml인, 친화성 수지 ID 10mm를 함유하는 컬럼은 pH 8.5에서 50mM 트리스HCl, 125mM NaCl의 적어도 10개 컬럼 용적으로 평형화되었다. 장입물은 친화성 수지를 함유하는 컬럼에 적용되었다. 컬럼에 장입된 샘플의 일 부분은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 재-평형화되었다 (세정 1, W1). 통과액의 샘플은 생략되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 의해 나중에 검정되었다.
컬럼은 그 다음 pH 6.0에서 세정 2 (W2): 100mM NaAcetate 및 0.1% 폴리소르베이트80의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 pH 8.5에서 세정 3 (W3): 50mM 트리스HCl 및 125mM NaCl의 10개 컬럼 용적으로 세정되었다. 컬럼은 그 다음 정제수 (세정 4 (W4))의 30개 컬럼 용적으로 세정되었다. 각각의 W2, W3 및 W4의 용출액으로부터 샘플은 채집되었고 ITR qPCR, AAV 항원에 대한 ELISA, 및 HEK293 HCP 항원에 대한 ELISA에 따라 검정되었다.
용출은 1mM 염산에서 0 내지 100% 33mM 염산 / 1000mMNaCl의 경사의 20개 컬럼 용적을 먼저 적용함으로써 착수되었다.
상기 시험 절차는 표 41에서 더 자세히 기재된다. 39 cm/h의 선형 유량은 모든 단계에서 적용되었다.
Figure pct00058
채집된 샘플은 각각의 ITR qPCR 및 AAV 항원에 대한 (상기 실시예 8에서 기재된 바와 같이) ELISA 및 HEK293 HCP에 대한 ELISA에 의해 검정되어 수율 그리고 손실이 단계에서 발생하였을지를 평가하였다. 상기 실시예와 연관된 크로마토그램은 도 19에서 도시된다. 실버 스테인은 도 20에서 도시된다.
용출된 AAV9의 생물효능은 0.51 BPU이었다.
실시예 18
다양한 수지 유형의 용출 특성은 상이한 용출 완충액에 관하여 평가되었다. 50% 에틸렌 글리콜 (w/w), 50mM 트리스HCl, 750-2000mM NaCl, pH 8.0을 포함하는 폴리올 용출 완충액은 제조되었다. 100mM 글리신 pH 2.5, 100mM Na-시트레이트 pH 3.0, 및 50mM 인산 pH 2.0을 포함하는 산성 용출 완충액은 제조되었다. pH 7.4에서 2M MgCl2 및 50mM 트리스HCl을 포함하는 MgCl2-함유 용출 완충액은 제조되었다.
몇 개의 수지는 시험되었다. 결과는 아래 표 42에서 나타난다. 표에서 "유"는 AAV8이 장입물의 10% 초과의 양으로 잠재적인 "용출 완충액"과 수지로부터 용출될 수 있음을 나타내고, 반면 "무"는 AAV가 장입물의 1% 미만의 양에서 "잠재적인 용출" 완충액과 수지로부터 용출될 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00059
다양한 완충액은 상기 Capture Select AAV8 수지로부터 AAV8을 용출하는 그것의 능력에 대하여 시험되었다. 결과는 아래 표 43에서 나타난다.
Figure pct00060
표 44에서 열거된 용출 완충액은 Thermo Fisher Scientific으로부터 이용가능한 Capture Select® AAV9로부터 AAV 용출에 대하여 이들이 만족스러웠는지를 결정하기 위해 또한 시험되었다.
Figure pct00061
표 44에서 기재된 바와 같이 각각의 잠재적인 용출 완충액은 용출 완충액이 Capture select AAVx에서 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 용출 스크린의 일부로서 연속하여 적용되었다. 스크린은 잠재적으로 최저 용출 강도를 가진 용출 완충액으로 개시하였고 잠재적으로 최고 용출 강도를 가진 완충액으로 종료한다. 크로마토그램은 도 21에서 도시된다. 이것은 용출 옵션이 Capture select AAVx에 적용될 수 있는 예이다.
본원에서 인용된, 공보, 특허 출원, 및 특허를 포함하는, 모든 참조문헌은 각각의 참조문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조로 통합되도록 지시되었고 본원에서 전체적으로 제시된 것처럼 동일한 정도로 참고로 이로써 편입된다.

Claims (84)

  1. 하기 단계를 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV)의 정제 방법:
    (a) 용액에서의 상기 AAV와 상기 친화성 수지 사이 결합을 허용하는 조건 하에서 AAV에 대해 표적화된 친화성 수지에 AAV 함유 용액을 장입하는 단계;
    (b) 적어도 2회의 세정 단계를 착수하는 단계; 및
    (c) 상기 친화성 수지로부터 상기 AAV를 용출하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 AAV 함유 용액을 음이온 교환체와 접촉시키는 단계 및 상기 음이온 교환체로부터 상기 AAV 함유 용액을 용출시킨 다음 상기 친화성 수지에 상기 AAV 함유 용액을 장입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세정 단계들 중 적어도 하나가 상기 친화성 수지에 유기 용매 또는 세제를 포함하는 완충액을 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 트리스HCl 및 염을 포함하는, 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 히스티딘, 히스티딘-HCl, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 글리신, 타우린, MES-Na, 비스-트리스, 및 N-아세틸-D,L-트립토판 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 염이 NaCl인, 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 아세트산나트륨을 포함하는, 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 염화마그네슘을 포함하는, 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 트리스HCl 및 에틸렌 글리콜을 포함하는, 방법.
  10. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 아르기닌-HCl과, 수크로스 및 글리세롤 중 어느 하나를 포함하는, 방법.
  11. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 타우린 및 에틸렌 글리콜을 포함하는, 방법.
  12. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 및 히스티딘-HCl을 포함하는, 방법.
  13. 제 3 항에 있어서, 상기 완충액이 트리스HCl 및 DMSO를 포함하는, 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 적어도 3회의 세정 단계가 수행되는, 방법.
  15. 제 8 항에 있어서, 3회의 세정 단계가 수행되는, 방법.
  16. 제 9 항에 있어서, 상기 3회의 세정 단계가 연속하여 수행되는, 방법.
  17. 제 3 항에 있어서, 상기 유기 용매 또는 세제가 폴리소르베이트 80, 에틸렌 글리콜, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, DMSO, 수크로스, 또는 트레할로스인, 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 세제가 트리톤 X100, 폴리소르베이트 80, 및 트리 (n-부틸) 포스페이트 (TNBP) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 완충액이 비스-트리스를 포함하는, 방법.
  20. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 50 내지 약 2000 mM 아세트산나트륨 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트 80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제1 완충액이 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
    상기 제2 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 500 mM 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제2 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
    상기 제3 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 및 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제3 완충액이 pH 약 7.3 내지 약 8.8인, 방법.
  21. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계가 상기 친화성 수지에 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES-Na)의 약 50 내지 약 500 mM 나트륨 염, 약 3 내지 약 30 mM EDTA, 그리고 폴리소르베이트 80, DMSO 및 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP)를 포함하는 용매/세제 혼합물을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제1 완충액이 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
    상기 제2 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 30 내지 약 200 mM 트리스HCl 또는 아르기닌-HCl 및 약 75 내지 약 500 mM 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제2 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
    상기 제3 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 20 내지 약 80 mM 아르기닌-HCl 및 약 50 내지 약 200 mM 염을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제3 완충액이 pH 약 7.3 내지 약 8.8인, 방법.
  22. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 타우린, 및 0.2 내지 1.5% PEG (예를 들면, PEG 6000)을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고 여기에서 상기 제1 완충액이 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
    상기 제2 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 30 내지 약 300 mM 글리신을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제2 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
    상기 제3 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 20 내지 약 150 mM 타우린, 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜, 및 0.05 내지 0.2% 옥틸글리코피라노시드를 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제3 완충액이 pH 약 7.3 내지 약 8.8인, 방법.
  23. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 80 내지 약 400 mM 비스-트리스, 그리고 약 트리톤-X100, 폴리소르베이트 80 및 TNBP를 약 11:3:3 (중량 기준)의 비율로 포함하는 약 10 내지 약 20 그램의 용매/세제 혼합물을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고 여기에서 상기 제1 완충액이 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
    상기 제2 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 5 내지 약 20 mmol 시트르산나트륨을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제2 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
    상기 제3 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아르기닌-HCl, 약 50 내지 약 200 mM 리신 HCl, 약 50 내지 약 200 mM 히스티딘-HCl, 및 약 1mM 내지 약 4 mM N-아세틸-D,L-트립토판, 그리고 약 10% 내지 약 40% (w/w) 폴리소르베이트 80을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제3 완충액이 pH 약 7.3 내지 약 8.8인, 방법.
  24. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 50 nM 내지 약 200mM NaAcetate 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제1 완충액이 약 5.2 내지 약 6.8의 pH를 갖고;
    상기 제2 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 20 nM 내지 약 100mM 트리스HCl 및 약 50 nM 내지 약 200 nM의 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제2 완충액이 약 7.5 내지 약 8.8의 pH를 갖고;
    상기 제3 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 20mM 내지 100 mM 트리스HCl, 약 40% 내지 약 60%(w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제3 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 8.8인, 방법.
  25. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 50 nM 내지 약 200mM NaAcetate 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제1 완충액이 약 5.2 내지 약 6.8의 pH를 갖고;
    상기 제2 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 20 nM 내지 약 100mM 트리스HCl 및 약 50 nM 내지 약 200 nM의 염을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제2 완충액이 약 7.5 내지 약 8.8의 pH를 갖고;
    상기 제3 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 20mM 내지 100 mM 트리스HCl, 약 40% 내지 약 60%(w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제3 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 8.8인, 방법.
  26. 제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염이 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 아세트산나트륨, 및 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, 시트르산나트륨, LiCl, CsCl, 및 아세트산나트륨 중 하나 이상의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 염이 NaCl인, 방법.
  28. 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염의 농도가 500 mM을 초과하지 않는, 방법.
  29. 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염의 농도가 200 mM을 초과하지 않는, 방법.
  30. 제 20 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 완충액내 염의 농도가 500 mM을 초과하지 않는, 방법.
  31. 제 20 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 완충액내 염의 농도가 200 mM을 초과하지 않는, 방법.
  32. 제 20 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계 이전 실시하는, 상기 친화성 수지에 약 10 내지 약 30 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 상기 제4 완충액이 pH 약 6.5 내지 약 8.0인, 방법.
  33. 제 20 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 완충액이 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 0.1% 폴리소르베이트 80을 포함하고, 상기 제1 완충액이 약 6.0의 pH를 갖는, 방법.
  34. 제 20 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 완충액이 약 50 mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 상기 제2 완충액이 약 8.5의 pH를 갖는, 방법.
  35. 제 20 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 완충액이 약 50 mM 트리스HCl 및 약 50 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하고, 상기 제3 완충액이 약 8.5의 pH를 갖는, 방법.
  36. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아세트산나트륨 및 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트 80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제1 완충액이 pH 약 5.5 내지 약 6.5이고;
    상기 제2 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 10 내지 약 70 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제2 완충액이 pH 약 8.0 내지 약 9.0이고;
    상기 제3 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 10 내지 약 70 mM 트리스HCl 및 약 30 내지 약 75 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제3 완충액이 pH 약 8.0 내지 약 9.0인, 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계 이전에 실시하는,상기 친화성 수지에 약 10 내지 약 30 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제4 완충액을 적용하는 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 상기 제4 완충액이 pH 약 6.5 내지 약 8.0인, 방법.
  38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, 상기 제1 완충액이 약 100 mM 아세트산나트륨 및 약 0.1% 폴리소르베이트 80을 포함하고, 상기 제1 완충액이 약 6.0의 pH를 갖는, 방법.
  39. 제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 완충액이 약 50mM 트리스HCl 및 약 125 mM NaCl을 포함하고, 상기 제2 완충액이 약 8.5의 pH를 갖는, 방법.
  40. 제 36 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 완충액이 약 50 mM 트리스HCl 및 약 50 vol% 에틸렌 글리콜을 포함하고, 상기 제3 완충액이 약 8.0의 pH를 갖는, 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 산성 성분이 제거되는, 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 산성 성분이 숙주 세포 DNA, 예컨대 HEK293 DNA이고, 상기 산성 성분이 qPCR에 의해 측정된 경우 AAV 항원의 마이크로그램당 250 pg 미만 값으로 감소되는, 방법.
  43. 제 41 항에 있어서, 상기 산성 성분이 숙주 세포 DNA, 예컨대 HEK293 DNA이고, 상기 산성 성분이 ELISA에 의해 측정된 경우 AAV 항원의 마이크로그램당 250 pg 미만 값으로 감소되는, 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 경사 용출에 의해 용출 완충액의 전도도의 지속적 선형 증가를 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 경사 용출에 의해 유기 용매의 농도의 지속적 선형 증가를 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 에틸렌 글리콜, 염 예컨대 NaCl, 및 완충액 예컨대 트리스HCl을 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 pH가 적어도 7.0인, 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 염 농도가 약 750 mM이고, 상기 완충액 농도가 약 50 mM이고, 상기 에틸렌 글리콜이 50-60% (w/w)인, 방법.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서, 상기 pH가 약 8.0인, 방법.
  49. 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염이 NaCl이고 상기 완충액이 트리스HCl인, 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 적어도 7.0의 pH에서 약 750mM NaCl 및 50-60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 용출 완충액이 적어도 약 55% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는, 방법.
  52. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 적어도 7.8의 pH에서 약 50 mM 트리스 HCl, 약 750mM 내지 약 1250 mM NaCl 및 약 60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  53. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 적어도 약 8.0의 pH에서 약 2 mM 염화마그네슘, 약 50 mM 아르기닌-HCl, 약 750mM 내지 약 1000 mM NaCl 및 적어도 약 55% (w/w) 수크로스를 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 용출이 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 상기 제5 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 8.5인, 단계; 및
    (b) 약 20 내지 약 100 mM 아르기닌-HCl, 약 40 내지 약 60% (w/w) 글리세롤, 및 약 500 내지 1000 mM 염을 포함하는 제2 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 용출 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 8.5인, 단계.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 단계가 연속하여 수행되는, 방법.
  56. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 적어도 약 8.0의 pH에서 약 2 mM 염화마그네슘, 약 50 mM 아르기닌-HCl, 약 750mM 내지 약 1000 mM NaCl 및 적어도 약 50% (w/w) 글리세롤을 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 적어도 약 7.8의 pH에서 약 2 mM 염화마그네슘, 약 50 mM 타우린, 약 600mM 내지 약 1000 mM NaCl, 약 0.05 내지 약 0.2% 옥틸글리코피라노시드, 및 약 60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 용출이 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 약 20 내지 약 100 mM 트리스-HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 상기 제5 완충액이 pH 약 8.0 내지 약 8.8인, 단계; 및
    (b) 적어도 약 6.8의 pH에서 약 1 M 황산암모늄, 약 50 mM 트리스 HCl, 및 약 50% (v/v) 에틸렌 글리콜을 포함하는 제2 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 단계가 연속하여 수행되는, 방법.
  60. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 적어도 약 6.8의 pH에서 약 1 M 황산암모늄, 약 50 mM 트리스 HCl, 및 약 50% (v/v) 에틸렌 글리콜을 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 적어도 약 7.8의 pH에서 약 20% (w/w) 수크로스, 약 10% (w/w) 소르비톨, 약 5% (w/w) 만니톨 또는 약 5% (w/w) 수크로스, 약 15% (w/w) 글리세롤, 약 50 mM 히스티딘, 및 약 750 내지 약 1000 mM NaCl을 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 용출이 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    (a) 약 20 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 80 내지 약 120 mM NaCl을 포함하는 제5 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 상기 제5 완충액이 pH 약 8.0 내지 약 8.8인, 단계; 및
    (b) 약 20 내지 약 100 mM 히스티딘, 약 600 내지 약 900 mM NaCl, 및 약 5 내지 60% (w/w) DMSO를 포함하는 제2 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계로서, 상기 제5 완충액이 pH 약 6.5 내지 약 8.5인, 단계.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 단계가 연속하여 수행되는, 방법.
  64. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 약 2.5의 pH에서 약 100 mM 글리신-HCl, 약 200 mM NaCl을 포함하는 용출 완충액과 상기 친화성 수지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  65. 제 50 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 완충액이 약 8.0의 pH인, 방법.
  66. 제 50 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 완충액이 8.0의 pH인, 방법.
  67. 제 1 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 반대 이온 농도의 단계적 증가를 포함하는, 방법.
  68. 제 1 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서, 용출이 유기 용매 농도의 단계적 증가를 포함하는, 방법.
  69. 제 1 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 완충액내 상기 염이 1가, 2가 또는 다가 음이온, 예컨대 클로라이드, 아세테이트, 설페이트, 및 시트레이트로부터 선택되는, 방법.
  70. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 제1 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 50 내지 약 200 mM 아세트산나트륨, 약 0.05 내지 약 0.2% 폴리소르베이트80을 포함하는 제1 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제1 완충액이 pH 약 5.2 내지 약 6.8이고;
    상기 제2 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 25 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 50 내지 약 200 mM NaCl을 포함하는 제2 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제2 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 9.2이고;
    상기 제3 세정 단계가 상기 친화성 수지에 약 20 내지 약 100 mM 트리스HCl 및 약 75 내지 약 250 mM NaCl을 포함하는 제3 완충액을 적용하는 단계를 포함하고, 여기에서 상기 제3 완충액이 pH 약 7.5 내지 약 8.8인, 방법.
  71. 제 70 항에 있어서, 상기 친화성 수지에 정제수를 적용한 다음, pH 약 1.7 내지 약 2.5에서 상기 친화성 수지에 약 20 내지 약 50 mM HCl을 적용함으로써 용출을 추가로 포함하는, 방법.
  72. 제 70 항에 있어서, 0.5-2.0mM 염산에서 0 내지 100% 20-50mM 염산/800-1200mM NaCl의 경사를 적용함으로써 용출을 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제 1 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 단계로부터 수득된 상기 AAV가 ≤99.9 %의 HC 불순물 준위를 갖는, 방법.
  74. 제 1 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 단계로부터 수득된 상기 AAV가 ≤99.0 %의 HC 불순물 준위를 갖는, 방법.
  75. 제 1 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV8이고, 상기 친화성 수지가 POROS™ CaptureSelect™ AAV8이고, 상기 용출 완충액이 산성이며 에틸렌 글리콜을 포함하지 않는, 방법.
  76. 제 1 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV9이고, 상기 친화성 수지가 POROS™ CaptureSelect™ AAV9이고, 상기 용출 완충액이 산성이며 에틸렌 글리콜을 포함하지 않는, 방법.
  77. 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV8이고, 상기 친화성 수지가 크로마토그래피 매트릭스에서 고정화된 ADK8 또는 ADK8/9 유형으로부터 AAV8에 대해 고정화된 단클론성 항체로 이루어지는 면역 친화성 수지인, 방법.
  78. 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV가 AAV9이고, 상기 친화성 수지가 크로마토그래피 매트릭스에서 고정화된 ADK9 또는 ADK8/9 유형으로부터 AAV9에 대해 고정화된 단클론성 항체로 이루어지는 면역 친화성 수지인, 방법.
  79. 제 1 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 AAV 함유 용액으로부터 산성 하전된 오염물을 고갈시키는데 효과적인 양으로 하전된 그룹을 포함하는 필터와 상기 AAV 함유 용액을 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제 1 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서, 35 nm 초과 바이러스를 제거하기 위해 AAV 분획의 나노여과를 추가로 포함하는, 방법.
  81. 제 1 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 촉모 겔을 포함하는 컬럼이 있는 AEX 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 연마 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  82. 제 1 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 분획을 시험하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  83. 제 82 항에 있어서, 상기 AAV 특이적 ELISA가 AAV에 특이적인 샌드위치 ELISA인, 방법.
  84. 제 1 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된, AAV 산물.













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