CN111655285A - 腺相关病毒的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了生产腺相关病毒(AAV)产物的方法和纯化腺相关病毒的方法。将AAV装载到亲和树脂上，进行洗涤步骤，并将AAV从亲和树脂中洗脱出来。公开了用于所述洗涤步骤和洗脱中的各种缓冲液。

Description

腺相关病毒的纯化方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年12月29日提交的美国临时申请第62/611,709号的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及纯化腺相关病毒(AAV)的材料和方法。

背景技术

腺相关病毒(AAV)是一种小型、无包膜病毒，其包装了线性单链DNA基因组。AAV属于细小病毒科(Parvoviridae)和依赖病毒属(Dependovirus)，因为AAV的生产性感染仅在辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)存在的情况下发生。即使在辅助病毒不存在的情况下，AAV病毒(血清型2)也可以通过整合入宿主人基因组的19q13.4号染色体来实现潜伏。所述AAV病毒是已知的唯一能够位点特异性整合的哺乳动物DNA病毒(Daya和Berns,ClinicalMicrobiology Reviews,第583–593页(2008))。

为了让AAV在临床上安全使用，已将AAV在其基因组的几个位置进行了遗传修饰。例如，在许多病毒载体中，Rep基因(其是病毒复制所需的)和位点特异性整合所需的元件已经从AAV基因组中消除。这种重组AAV(rAAV)以染色体外状态存在，并且整合到基因组DNA中的效率非常低。因此，rAAV在宿主细胞中诱导随机诱变的可能性即使没有完全消除也有所降低。由于这些特性和缺乏致病性，rAAV作为基因疗法载体在临床前和临床应用的多个方面显示出巨大的前景。新的血清型和自身互补载体正处于临床测试中。除了这些正在进行的载体开发以外，持续的努力还集中在可扩展的制造工艺上，所述工艺可以高效地产生高滴度的具有高纯度和高效力的rAAV载体。

尽管对设计高效、大规模的方法来纯化适合人施用的AAV产物作出的努力已经很大，但是仍然需要更好的AAV纯化方法。在AAV的纯化过程中，宿主细胞培养基质中的各种其它蛋白质和物质可以被更高效地去除。因此，需要包括从最终AAV产物中除去宿主细胞物质的步骤的AAV纯化方法。

发明内容

细胞培养中AAV载体产生的特征是形成复杂的基质，所述基质包含来自破裂细胞的物质。具体而言，宿主细胞蛋白质、蛋白酶体、细胞碎片和潜在的病毒特异性受体通常存在于来自破裂细胞的物质中。所公开的方法包括以下步骤：在于生理学适用的pH下导致更高纯度的条件下，从最终AAV产物中去除宿主细胞材料。

一方面，提供了纯化腺相关病毒(AAV)的方法，所述方法包括：

(a)在允许含有AAV的溶液中的AAV与亲和树脂之间结合的条件下，将所述溶液装载到针对AAV的亲和树脂上；

(b)进行至少两个洗涤步骤；以及

(c)从亲和树脂上洗脱AAV。

在一些实施方案中，所述方法还包括使含有AAV的溶液与阴离子交换剂接触，并在将含有AAV的溶液装载到亲和树脂上之前，从阴离子交换剂中洗脱含有AAV的溶液。

在一些实施方案中，洗涤步骤中的至少一个步骤包括将包含有机溶剂或去垢剂的缓冲液施加到亲和树脂。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl和盐。在一些实施方案中，缓冲液包含组氨酸、组氨酸-HCl、精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl、甘氨酸、牛磺酸、MES-Na、Bis-Tris和N-乙酰基-D,L-色氨酸中的一种或多种。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸钠。在一些实施方案中，缓冲液包含氯化镁。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl和乙二醇。在一些实施方案中，缓冲液包含蔗糖和甘油之一以及精氨酸-HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含牛磺酸和乙二醇。在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl和组氨酸-HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl和DMSO。

在一些实施例中，进行至少三个洗涤步骤。在一些实施例中，进行三个洗涤步骤。在一些实施例中，连续进行三个洗涤步骤。

在一些实施方案中，有机溶剂或去垢剂为聚山梨醇酯80、乙二醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、DMSO、蔗糖或海藻糖。在一些实施方案中，去垢剂包括Triton X100、聚山梨醇酯80和磷酸三(正丁)酯(TNBP)中的一种或多种。在一些实施方案中，缓冲液包含Bis-Tris。

在一些实施方案中，第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约2000mM的乙酸钠和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，并且所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约30至约200mM TrisHCl和约75至约500mM的盐，并且所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；并且

第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约30至约200mM TrisHCl和约30体积％至约75体积％的乙二醇，并且所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。

在一些实施方案中，第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约500mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸的钠盐(MES-Na)、约3至约30mM EDTA以及包含聚山梨醇酯80、DMSO和磷酸三(正丁)酯(TNBP)的溶剂/去垢剂混合物，并且所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约30至约200mM TrisHCl或精氨酸-HCl和约75至约500mM的盐，并且所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；并且

第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20至约80mM的精氨酸-HCl和约50至约200mM的盐，并且所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。

在一些实施方案中，第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约200mM的牛磺酸和0.2％至1.5％PEG(例如，PEG6000)，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约30至约300mM的甘氨酸，并且所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；并且

第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20至约150mM的牛磺酸、约30体积％至约75体积％的乙二醇和0.05％至0.2％的辛基吡喃葡糖苷，并且所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。

在一些实施方案中，第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约80至约400mM Bis-Tris和约10至约20克的溶剂/去垢剂混合物，所述溶剂/去垢剂混合物以约11:3:3(按重量计)的比例包含约Triton-X100、聚山梨醇酯80和TNBP，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约5至约20mmol的柠檬酸钠，其中所述第二缓冲的pH为约7.5至约9.2；以及

第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约50至约200mM的精氨酸-HCl、约50至约200mM的赖氨酸-HCl、约50至约200mM的组氨酸-HCl、和约1mM至约4mM的N-乙酰基-D,L-色氨酸和约10％(w/w)至约40％(w/w)的聚山梨醇酯80，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。

在一些实施方案中，第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50nM至约200mM的乙酸钠和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约20nM至约100mM TrisHCl和约50nM至约200nM的盐，其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约8.8；以及

第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20mM至约100mM TrisHCl和约40％(w/w)至约60％(w/w)的乙二醇，并且所述第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

在一些实施方案中，第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50nM至约200mM的乙酸钠和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约20nM至约100mM TrisHCl和约50nM至约200nM的盐，其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约8.8；以及

第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20mM至100mM TrisHCl、约40％(w/w)至约60％(w/w)的乙二醇，并且所述第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。

在一些实施方案中，盐的浓度不超过500mM。在一些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。在一些实施方案中，第三缓冲液中的盐浓度不超过500mM。在一些实施方案中，第三缓冲液中的盐浓度不超过200mM。

在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约10至约30mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且所述第四缓冲液的pH为约6.5至约8.0。

在一些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的乙酸钠、约0.1％的聚山梨醇酯80，并且所述第一缓冲液的pH为约6.0。在一些实施方案中，第二缓冲液包含约50mM TrisHCl和约125mM NaCl，并且所述第二缓冲液的pH为约8.5。在一些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM TrisHCl和约50体积％的乙二醇，并且所述第三缓冲液的pH为约8.5。

在一些实施方案中，第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约200mM的乙酸钠和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，并且所述第一缓冲液的pH为约5.5至约6.5；

第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约10至约70mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl，并且所述第二缓冲液的pH为约8.0至约9.0；并且

第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约10至约70mM TrisHCl和约30体积％至约75体积％的乙二醇，并且所述第三缓冲液的pH为约8.0至约9.0。在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约10至约30mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且所述第四缓冲液的pH为约6.5至约8.0。

在一些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的乙酸钠和约0.1％的聚山梨醇酯80，并且所述第一缓冲液的pH为约6.0。在一些实施方案中，第二缓冲液包含约50mMTrisHCl和约125mM NaCl，并且所述第二缓冲液的pH为约8.5。在一些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM TrisHCl和约50体积％的乙二醇，并且所述第三缓冲液的pH为约8.0。

在一些实施方案中，除去酸性组分。在一些实施方案中，酸性组分是宿主细胞DNA，例如HEK293 DNA，并且其中使酸性组分减少到如通过qPCR测量的低于250pg/微克AAV抗原的值。在一些实施方案中，酸性组分是宿主细胞DNA，诸如HEK293 DNA，并且其中使酸性组分减少至如通过ELISA所测量的低于250pg/微克AAV抗原的值。

在一些实施方案中，洗脱包括通过梯度洗脱施加电导率连续线性增加的洗脱缓冲液。在一些实施方案中，洗脱包括通过梯度洗脱施加浓度连续线性增加的有机溶剂。在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含乙二醇、盐诸如NaCl和缓冲液诸如TrisHCl，其中所述pH为至少7.0。在一些实施方案中，盐浓度为约750mM，缓冲液浓度为约50mM，乙二醇为50-60％(w/w)。在一些实施方案中，pH为约8.0。在一些实施方案中，盐是NaCl，缓冲液是TrisHCl。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与pH为至少7.0的包含约750mM NaCl和50-60％(w/w)的乙二醇的洗脱缓冲液接触。在一些实施方案中，洗脱缓冲液至少包含约55％(w/w)的乙二醇。在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约50mM Tris HCl、约750mM至约1250mM NaCl和约60％(w/w)的乙二醇，pH为至少7.8。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约2mM的氯化镁、约50mM的精氨酸-HCl、约750mM至约1000mM NaCl和至少约55％(w/w)的蔗糖，pH为至少约8.0。

在一些实施方案中，洗脱还包括

(a)使亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含约20至约100mM的精氨酸-HCl和约75至约250mM NaCl，并且所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.5；以及

(b)使亲和树脂与第二洗脱缓冲液接触，所述第二洗脱缓冲液包含约20至约100mM的精氨酸-HCl、约40至约60％(w/w)的甘油和约500至1000mM的盐，并且所述第二洗脱缓冲液的pH为约7.5至约8.5。

在一些实施方案中，连续进行所述步骤。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约2mM的氯化镁、约50mM的精氨酸-HCl、约750mM至约1000mM NaCl和至少约50％(w/w)的甘油，pH为至少约8.0。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约2mM的氯化镁、约50mM的牛磺酸、约600mM至约1000mM NaCl、约0.05％至约0.2％的辛基吡喃葡糖苷和约60％(w/w)的乙二醇，pH为至少约7.8。在一些实施方案中，洗脱还包括

(a)使亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含约20至约100mM Tris-HCl和约75至约250mM NaCl，并且所述第五缓冲液的pH为约8.0至约8.8；以及

(b)使所述亲和树脂与第二洗脱缓冲液接触，所述第二洗脱缓冲液包含约1M的硫酸铵、约50mM Tris HCl和约50％(v/v)的乙二醇，pH为至少约6.8。

在一些实施方案中，连续进行所述步骤。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约1M的硫酸铵、约50mM的Tris HCl和约50％(v/v)的乙二醇，pH为至少约6.8。在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约20％(w/w)的蔗糖、约10％(w/w)的山梨醇、约5％(w/w)的甘露醇或约5％(w/w)的蔗糖、约15％(w/w)的甘油、约50mM的组氨酸和约750至约1000mM NaCl，pH为至少约7.8。

在一些实施方案中，洗脱还包括

(a)使亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含约20至约100mM的组氨酸、约80至约120mM NaCl，并且所述第五缓冲液的pH为约8.0至约8.8；以及

(b)使亲和树脂与第二洗脱缓冲液接触，所述第二洗脱缓冲液包含约20至约100mM的组氨酸、约600至约900mM NaCl和约5％至60％(w/w)的DMSO，并且所述第五缓冲液的pH为约6.5至约8.5。

在一些实施方案中，连续进行所述步骤。在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约100mM的甘氨酸-HCl、约200mM NaCl，pH为约2.5。

在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。

在一些实施方案中，洗脱包括抗衡离子浓度的逐步增加。在一些实施方案中，洗脱包括有机溶剂浓度的逐步增加。在一些实施方案中，洗脱缓冲液中的盐选自单价、二价或多价阴离子，诸如氯化物、乙酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐。

在一些实施方案中，第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约200mM的乙酸钠、约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，并且所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约25至约100mM TrisHCl和约50至约200mM NaCl，并且所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；以及

第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20至约100mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl，并且所述第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。在一些实施方案中，所述方法还包括通过向亲和树脂施加纯化水，随后向亲和树脂施加pH为约1.7至约2.5的约20至约50mM HCl来进行洗脱。在一些实施方案中，所述方法还包括通过施加梯度为0％至100％的20-50mM的盐酸/于0.5-2.0mM盐酸中的800-1200mM NaCl来进行洗脱。

在一些实施方案中，从洗脱步骤获得的AAV的HC杂质水平≤99.9％。在一些实施方案中，从洗脱步骤获得的AAV的HC杂质水平≤99.0％。

在一些实施方案中，AAV是AAV8，亲和树脂是POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8，洗脱缓冲液是酸性的并且不包含乙二醇。在一些实施方案中，AAV是AAV9，亲和树脂是POROS^TMCaptureSelect^TM AAV9，洗脱缓冲液是酸性的并且不包含乙二醇。

在一些实施方案中，AAV是AAV8，亲和树脂是免疫亲和树脂，其由固定在色谱基质上的来自ADK8型或ADK8/9型的针对AAV8的固定化单克隆抗体组成。在一些实施方案中，AAV是AAV9，亲和树脂是免疫亲和树脂，其由固定在色谱基质上的来自ADK9型或ADK8/9型的针对AAV9的固定化单克隆抗体组成。

在一些实施方案中，所述方法还包括使含有AAV的溶液与包含带正电荷的基团的过滤器接触，所述带正电荷的基团有效地耗尽含有AAV的溶液中酸性带电荷的污染物。

在一些实施方案中，所述方法还包括对AAV级分的纳米过滤以去除大于35nm的病毒。

在一些实施方案中，所述方法还包括精细纯化步骤，所述精细纯化步骤包括用包含触须凝胶的柱子进行AEX色谱。

在一些实施方案中，所述方法还包括通过AAV特异性ELISA测试AAV级分。

在一些实施方案中，AAV特异性ELISA是对AAV特异的夹心ELISA。

在另一方面，提供了通过根据权利要求1至83中任一项的方法产生的AAV产物。

附图简述

图1描绘了蛋白质印迹，其显示根据具有本文所述的多个洗涤步骤的纯化方案(泳道4)，与没有所述洗涤步骤的比较纯化方案(泳道6)相比，热激蛋白70kDa(HSP70)显著更少。

图2描绘了SDS-PAGE银染凝胶，其显示泳道2中的AAV8蛋白、来自具有本文所述的多个洗涤步骤的纯化方案(泳道4)和没有所述洗涤步骤的比较纯化方案(泳道6)的含有AAV8的洗脱物。

图3描绘了蛋白质印迹，其显示根据具有本文所述的多个洗涤步骤的纯化方案制备的洗脱物(泳道4)中存在的AAV8比没有所述洗涤步骤的比较纯化方案的洗脱物(泳道6)中存在的AAV8多。AAV8参考样品处于第2泳道中。

图4描绘了SDS-PAGE银染凝胶，其显示了从来自表达AAV8的HEK 293细胞的细胞培养基的初始装载(L)到富含有AAV8的洗脱物(E)的各种级分中存在的蛋白质。在洗涤步骤(W1、W2和W3)的流出物中，AAV8损失很少，在反萃取(S)过程中，从柱中洗脱的AAV8很少。

图5描绘了针对AAV8抗原的蛋白质印迹。AAV8在来自表达AAV8的HEK 293细胞的细胞培养基的初始装载(L)中表达。来自初始装载(FT)和随后的洗涤步骤(W1、W2和W3)的流出物中存在显著更少的AAV8。AAV8存在于洗脱物(E,E2)中。同样，在反萃取(S)过程中，从柱中洗脱的AAV8也显著更少。

图6描绘了根据实施例3的分离程序的色谱图。

图7描绘了根据实施例11的分离程序的色谱图。

图8描绘了根据实施例11的SDS-PAGE银染凝胶，其显示了来自各洗涤步骤和各洗脱物的各种级分中存在的蛋白质。

图9描绘了根据实施例12的分离程序的色谱图。

图10描绘了根据实施例12的SDS-PAGE银染凝胶，其显示了来自各洗涤步骤和各洗脱物的各种级分中存在的蛋白质。

图11描绘了根据实施例13的分离过程的色谱图。

图12描绘了根据实施例13的SDS-PAGE银染凝胶，其显示了来自各洗涤步骤和各洗脱物的各种级分中存在的蛋白质。

图13描绘了根据实施例14的分离程序的色谱图。

图14描绘了SDS-PAGE银染凝胶，其显示了从如实施例14中描述的洗涤步骤和洗脱物中获取的各种级分中存在的蛋白质。

图15描绘了针对AAV抗原的蛋白质印迹，所述AAV抗原来自从如实施例14中所述的洗涤步骤和洗脱物获取的各种级分。

图16描绘了根据实施例15的分离程序的色谱图。

图17描绘了根据实施例16的分离程序的色谱图。

图18描绘了针对AAV抗原的蛋白质印迹，所述AAV抗原来自获自如实施例16中所述的洗涤步骤和洗脱物的各种级分。

图19描绘了根据实施例17的分离程序的色谱图。

图20描绘了SDS-PAGE银染凝胶，其显示了从如实施例17中描述的洗涤步骤和洗脱物中获取的各种级分中存在的蛋白质。

图21描绘了显示来自实施例18中描述的洗脱筛选的结果的色谱图。

具体实施方式

本文提供了产生腺相关病毒(AAV)产物的方法，纯化AAV的方法，以及从包含空AAV衣壳和全AAV衣壳的浓缩AAV级分中纯化全AAV衣壳的方法。

除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”以及类似的所指物被解释为涵盖单数和复数两者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。

除非本文另外说明，否则本文数值的范围的列举仅旨在用作单个地提及属于范围内的每个单独数值和每个端点的速记方法,并且将每个单独的数值和端点并入说明书，如同其在本文单个地列举一样。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法均能以任何合适的顺序进行。除非另有主张，否则本文提供的任何和所有的实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意图更好地阐明本公开，并且不会对本公开范围构成限制。说明书中的语言均不应解释为指出任何非要求保护的实施本公开的必需要素。

本文描述了本公开的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本公开的最佳模式。对于本领域的普通技术人员来说，在阅读了前面的描述之后，那些优选实施方案的变型将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员在适当情况下使用此类变型，并且发明人意图以不同于本文具体描述的方式实施该公开。因此，在适用法律允许的情况下，本公开包括在所附的权利要求中所引用主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则上述元素在其所有可能的变型中的任何组合都涵盖于本公开中。

细胞培养中AAV载体产生的特征是形成复杂的基质，所述基质包含来自破裂细胞的物质。具体而言，宿主细胞蛋白质、蛋白酶体、细胞碎片和潜在的病毒特异性受体通常存在于来自破裂细胞的物质中。所公开的方法包括以下步骤：在生理学适用的pH下导致更高纯度的条件下，从最终AAV产物中去除宿主细胞材料。

一方面，提供了一种纯化腺相关病毒(AAV)的方法。所述方法包括(a)在允许含有AAV的溶液中的AAV与亲和树脂之间结合的条件下，将所述溶液装载到针对AAV的亲和树脂上；(b)进行至少两个洗涤步骤；以及(c)从亲和树脂中洗脱AAV。

在一些实施方案中，通过本文所述的方法纯化的AAV具有AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、AAV10血清型、AAV11血清型、AAV12血清型、AAV13血清型、AAAV血清型、BAAV血清型、AAV(VR-195)血清型和AAV(VR-355)血清型。在一些实施方案中，AAV通过遗传工程改造来修饰和/或被化学修饰。

在一些实施方案中，所述方法还包括使含有AAV的溶液与阴离子交换剂接触，和从阴离子交换剂中洗脱含有AAV的溶液，之后将含有AAV的溶液装载到亲和树脂上。阴离子交换剂可以流通模式(flow-through mode)运行。在一些实施方案中，洗涤步骤中的至少一个步骤包括将包含有机溶剂或去垢剂的缓冲液施加到亲和树脂。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl和盐，例如NaCl。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸钠。在一些实施方案中，缓冲液包含氯化镁。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl和乙二醇。在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸-HCl以及蔗糖和甘油之一。在一些实施方案中，缓冲液包含牛磺酸和乙二醇。在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl和组氨酸-HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl和DMSO。

在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸-HCl和盐，例如NaCl。在一些实施方案中，缓冲液包含组氨酸和盐，例如NaCl。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl和乙二醇。在一些实施方案中，有机溶剂是乙二醇。在一些实施方案中，有机溶剂是DMSO。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐的浓度不超过500mM。在一些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。

在一些实施例中，进行至少三个洗涤步骤。在一些实施例中，进行三个洗涤步骤。在一些实施例中，连续进行三个洗涤步骤。

在一些实施方案中，有机溶剂或去垢剂为聚山梨醇酯80、乙二醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、DMSO、蔗糖或海藻糖。在一些实施方案中，去垢剂包括Triton X100、聚山梨醇酯80和磷酸三(正丁)酯(TNBP)中的一种或多种。在一些实施方案中，缓冲液包含Bis-Tris。

在一些实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约50至约2000mM的乙酸钠和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80的第一缓冲液，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约30至约200mM TrisHCl和约75至约500mM的盐的第二缓冲液，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；以及第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约30至约200mM TrisHCl和约30体积％至约75体积％的乙二醇的第三缓冲液，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，盐的浓度不超过500mM。在一些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。在一些实施方案中，第三缓冲液中的盐浓度不超过500mM。在一些实施方案中，第三缓冲液中的盐浓度不超过200mM。在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约10至约30mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且所述第四缓冲液的pH为约6.5至约8.0。在一些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的乙酸钠、约0.1％的聚山梨醇酯80，并且其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。在一些实施方案中，第二缓冲液包含约50mM TrisHCl和约125mMNaCl，其中所述第二缓冲液的pH为约8.5。在一些实施方案中，第三缓冲液包含约50mMTrisHCl和约50体积％的乙二醇，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.5。

在一些实施方案中，有机溶剂或去垢剂是聚山梨醇酯80、乙二醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、蔗糖或海藻糖。

在一些实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约50至约200mM的乙酸钠和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80的第一缓冲液，其中所述第一缓冲液的pH为约5.5至约6.5；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约10至约70mMTrisHCl和约75至约250mM NaCl，并且其中所述第二缓冲液的pH为约8.0至约9.0；以及第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约10至约70mM TrisHCl和约30体积％至约75体积％的乙二醇的第三缓冲液，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.0至约9.0。在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约10至约30mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且所述第四缓冲液的pH为约6.5至约8.0。在一些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的乙酸钠和约0.1％的聚山梨醇酯80，并且所述第一缓冲液的pH为约6.0。在一些实施方案中，第二缓冲液包含约50mMTrisHCl和约125mM NaCl，并且其中所述第二缓冲液的pH为约8.5。在一些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM TrisHCl和约50体积％的乙二醇，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.0。

在更多实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约500mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸的钠盐(MES-Na)、约3至约30mM EDTA，以及包含聚山梨醇酯80、DMSO和磷酸三(正丁)酯(TNBP)的溶剂/去垢剂混合物，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约30至约200mM TrisHCl或精氨酸-HCl和约75至约500mM的盐的第二缓冲液，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；以及第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20至约80mM的精氨酸-HCl和约50％(w/w)至约60％(w/w)的蔗糖的第三缓冲液，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，盐的浓度不超过500mM。在一些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。在一些实施方案中，第三缓冲液中的盐浓度不超过500mM。在一些实施方案中，第三缓冲液中的盐浓度不超过200mM。在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的精氨酸-HCl和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且其中所述第四缓冲液的pH为约7.5至约8.0。在一些实施方案中，第一洗脱步骤包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的精氨酸-HCl和约40％至约60％(w/w)的蔗糖的第一洗脱缓冲液，其中所述第一洗脱缓冲液的pH为约7.5至约8.5。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一洗脱步骤之后且在第二洗脱步骤之前进行的第五洗涤步骤，所述第五洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的精氨酸-HCl和约75至约250mM NaCl的第五缓冲液，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.5。在一些实施方案中，第二洗脱步骤包括向亲和树脂施加第二洗脱缓冲液，所述第二洗脱缓冲液包含约20至约100mM的精氨酸-HCl、约40％(w/w)至约60％(w/w)的甘油和约500至1000mM的盐(例如，NaCl)，并且其中所述第二洗脱缓冲液的pH为约7.5至约8.5。第五洗涤步骤可以有效地使第一洗脱步骤与第二洗脱步骤之间的前置效应(fronting effect)最小化，例如，提供仅由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液本身，而不是由可由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓的混合物引起的前置触发的洗脱。在一些实施方案中，所述方法还包括在第五洗涤步骤和第二洗脱步骤之后进行的第六洗涤步骤，所述第六洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的精氨酸-HCl和约75至约250mM NaCl的第六缓冲液，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.5。

在某些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸的钠盐(MES-Na)、约10mM EDTA以及约11g/kg的溶剂/去垢剂混合物，所述溶剂/去垢剂混合物包含约18克聚山梨醇酯80、3.5克DMSO和3.5克磷酸三(正丁)酯(TNBP)，并且其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。在某些实施方案中，第二缓冲液包含约50mM的精氨酸-HCl和约100mM NaCl，并且其中所述第二缓冲液的pH为约8.0。在某些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM的精氨酸-HCl和约50％(w/w)的蔗糖，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第四缓冲液包含约50mM的精氨酸-HCl和约100mM NaCl，并且其中所述第四缓冲液的pH为约8.0。在某些实施方案中，第五缓冲液包含约50mM的精氨酸-HCl和约100mM NaCl，并且其中所述第五缓冲液的pH为约8.0。在某些实施方案中，第六缓冲液包含约50mM的精氨酸-HCl和约100mM NaCl，并且其中所述第六缓冲液的pH为约8.0。

在一些实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约50至约200mM的牛磺酸和0.2％至1.5％PEG(例如，PEG 6000)的第一缓冲液，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约30至约300mM的甘氨酸的第二缓冲液，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；以及第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20至约150mM的牛磺酸、约30体积％至约75体积％的乙二醇和0.05％至0.2％的辛基吡喃葡糖苷，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，盐的浓度不超过500mM。在一些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且所述第四缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

在一些实施方案中，第一洗脱步骤包括向亲和树脂施加第一洗脱缓冲液，所述第一洗脱缓冲液包含约30至约70mM的牛磺酸、约50体积％至约70体积％的乙二醇、0.05％至0.2％的辛基吡喃葡糖苷和约600至约900mM NaCl，并且其中所述第一洗脱缓冲液的pH为约7.5至约8.5。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一洗脱步骤之后且在第二洗脱步骤之前进行的第五洗涤步骤，所述第五洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20至约100mMTrisHCl和约75至约250mM NaCl的第五缓冲液，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.8。第五洗涤步骤可以有效地使前置效应最小化。在一些实施方案中，第二洗脱步骤包括向亲和树脂施加第二洗脱缓冲液，所述第二洗脱缓冲液包含约30至约70mM TrisHCl、0.05至0.2M的硫酸铵和约40体积％至约60体积％的乙二醇，并且其中所述第二洗脱缓冲液的pH为约6.5至约7.5。第五洗涤步骤可以有效地使第一洗脱步骤与第二洗脱步骤之间的前置效应最小化，例如，提供仅由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液本身，而不是由可由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓的混合物引起的前置触发的洗脱。

在一些实施方案中，所述方法还包括在第五洗涤步骤和第二洗脱步骤之后进行的第六洗涤步骤，所述第六洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl的第六缓冲液，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

在某些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的牛磺酸和约0.5％的PEG 6000，其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。在某些实施方案中，第二缓冲液包含约100mM的甘氨酸，并且所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2。在某些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM的牛磺酸、约50％(w/w)的乙二醇和0.1％的辛基吡喃葡糖苷，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第四缓冲液包含约50mM TrisHCl和约125mM NaCl，并且其中所述第四缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第五缓冲液包含约50mM TrisHCl和约125mM NaCl，并且其中第五缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第六缓冲液包含约50mM TrisHCl和约125mM NaCl，并且其中第六缓冲液的pH为约8.5。

在一些实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约80至约400mM Bis-Tris，和约10至约20克的溶剂/去垢剂混合物，所述溶剂/去垢剂混合物以11:3:3(按重量计)的比例包含Triton-X100、聚山梨醇酯80和TNBP，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约5至约20mmol的柠檬酸钠的第二缓冲液，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；以及第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约50至约200mM的精氨酸-HCl、约50至约200mM的赖氨酸HCl、约50至约200mM的组氨酸-HCl、约1mM至约4mM的N-乙酰基-D,L-色氨酸和约10％(w/w)至约40％(w/w)的聚山梨醇酯80，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，盐的浓度不超过500mM。在一些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的组氨酸和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且其中所述第四缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

在一些实施方案中，第一洗脱步骤包括向亲和树脂施加第一洗脱缓冲液，所述第一洗脱缓冲液包含约15％至25％的蔗糖、5％至15％(w/w)的山梨醇、3％至7％(w/w)的甘露醇、10％至20％(w/w)的甘油、40至60mM的组氨酸和700至900mM的盐(例如，NaCl)，并且其中所述第一洗脱缓冲液的pH为约7.5至约8.5。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一洗脱步骤之后且在第二洗脱步骤之前进行的第五洗涤步骤，所述洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的组氨酸和约75至约250mM NaCl，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.8。在一些实施方案中，第二洗脱步骤包括向亲和树脂施加第二洗脱缓冲液，该第二洗脱缓冲液包含约30至约70mM TrisHCl、约700至约900mM的盐(例如，NaCl)和40％(w/w)至60％(w/w)的DMSO，并且其中所述第二洗脱缓冲液的pH为约7.5至约8.5。第五洗涤步骤可以有效地使第一洗脱步骤与第二洗脱步骤之间的前置效应最小化，例如，提供仅由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液本身，而不是由可由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓的混合物引起的前置触发的洗脱。在一些实施方案中，所述方法还包括在第五洗涤步骤和第二洗脱步骤之后进行的第六洗涤步骤，所述第六洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的组氨酸和约75至约250mM NaCl的第六缓冲液，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

在某些实施方案中，第一缓冲液包含约200mM Bis-Tris、约16至约17克的溶剂/去垢剂混合物，所述溶剂/去垢剂混合物以约11:3:3(按重量计)的比例包含约Triton-X100、聚山梨醇酯80和TNBP，其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。在一些实施方案中，第二缓冲液包含约10mM的柠檬酸钠，并且所述第二缓冲液的pH为约8.5。在一些实施方案中，第三缓冲液包含约100mM的精氨酸-HCl、约100mM的赖氨酸-HCl、约100mM的组氨酸-HCl、约2mM的N-乙酰基-D,L-色氨酸和约20％(w/w)的聚山梨醇酯80，并且所述第三缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第四缓冲液包含约50mM的组氨酸和约100mM NaCl，并且其中所述第四缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第五缓冲液包含约50mM的组氨酸和约100mM NaCl，并且其中所述第五缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第六缓冲液包含约50mM的组氨酸和约100mM NaCl，并且其中所述第六缓冲液的pH为约8.5。

在一些实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50nM至约200nM的乙酸纳和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20nM至约100nM TrisHCl和约50nM至约200nM的盐的第二缓冲液，其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约8.8；以及第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20mM至100mMTrisHCl、约40％(w/w)至60％(w/w)的乙二醇的第三缓冲液，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，盐的浓度不超过500mM。在一些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约10至约50mM TrisHCl和约75至约250mMNaCl的第四缓冲液，并且所述第四缓冲液的pH为约6.5至约8.0。在一些实施方案中，所述方法还包括第五洗涤步骤，其在第三洗涤步骤之后进行，并且包括向亲和树脂施加包含约20mM至约100mM TrisHCl、约50％(w/w)至约70％(w/w)的乙二醇和约500至约900mM NaCl的第五缓冲液，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.5。在一些实施方案中，所述方法还包括第六洗涤步骤，其在第五洗涤步骤之后进行，并且包括向亲和树脂施加包含约10mM至约50mM TrisHCl和约75mM至约250mM NaCl的第六缓冲液，并且其中所述第六缓冲液的pH为约7.0至约8.0。

在某些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的牛磺酸和约0.5％的PEG 6000，其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。在某些实施方案中，第二缓冲液包含约100mM的甘氨酸，并且所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2。在某些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM的牛磺酸、约50体积％的乙二醇和0.1％的辛基吡喃葡糖苷，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第四缓冲液包含约20mM TrisHCl和约150mM NaCl，并且其中所述第四缓冲液的pH为约7.4。在某些实施方案中，第五缓冲液包含约50mM TrisHCl、60％(w/w)的乙二醇和750mM NaCl，并且其中第五缓冲液的pH为约8.0。在某些实施方案中，第六缓冲液包含约20mM TrisHCl和约150mM NaCl，并且其中所述第六缓冲液的pH为约7.4。

在一些实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50nM至约200nM的乙酸纳和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20nM至约100nM TrisHCl和约50nM至约200nM的盐的第二缓冲液，其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约8.8；以及第三洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约20mM至100mMTrisHCl、约40％(w/w)至60％(w/w)的乙二醇的第三缓冲液，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，盐的浓度不超过500mM。在一些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。在一些实施方案中，所述方法还包括第四洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约10至约50mM TrisHCl和约75至约250mMNaCl的第四缓冲液，并且所述第四缓冲液的pH为约6.5至约8.0。在一些实施方案中，所述方法还包括第五洗涤步骤，其在第三洗涤步骤之后进行，并且包括向亲和树脂施加包含约20mM至约100mM TrisHCl、约50％(w/w)至约70％(w/w)的乙二醇和约500至约900mM NaCl的第五缓冲液，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.5。在一些实施方案中，所述方法还包括第六洗涤步骤，其在第五洗涤步骤之后进行，并且包括向亲和树脂施加包含约10mM至约50mM TrisHCl和约75mM至约250mM NaCl的第六缓冲液，并且其中所述第六缓冲液的pH为约7.0至约8.0。

在某些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的牛磺酸和约0.5％的PEG 6000，其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。在某些实施方案中，第二缓冲液包含约100mM的甘氨酸，并且所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2。在某些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM的牛磺酸、约50体积％的乙二醇和0.1％的辛基吡喃葡糖苷，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第四缓冲液包含约20mM TrisHCl和约150mM NaCl，并且其中所述第四缓冲液的pH为约7.4。在某些实施方案中，第五缓冲液包含约50mM TrisHCl、60％(w/w)的乙二醇和750mM NaCl，并且其中第五缓冲液的pH为约8.0。在某些实施方案中，第六缓冲液包含约20mM TrisHCl和约150mM NaCl，并且其中所述第六缓冲液的pH为约7.4。

在一些实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约50至约200mM的乙酸钠和0.05％至0.2％的聚山梨醇酯80的第一缓冲液施，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约25至约100mM TrisHCl和约50至200mM的盐第二缓冲液，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，所述方法还包括第三洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的TrisHCl和约75至约250mMNaCl的第三缓冲液，并且其中第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。在一些实施方案中，第一洗脱步骤包括向亲和树脂施加纯化水，随后施加pH为3.0至3.5的0.5至2mM HCl，随后施加包含约25至约100mM TrisHCl、约500至约1000mM NaCl和约25％(w/w)至约75％(w/w)的DMSO的缓冲液，并且其中所述缓冲液的pH为约7.5至约8.5。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一洗脱步骤之后且第二洗脱步骤之前进行的第四洗涤步骤，所述第四洗涤步骤包括向亲和树脂施加纯化水。在一些实施方案中，第二洗脱步骤包括向亲和树脂施加pH为约1.7至约2.5的约20至约50mM HCl。

在某些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的乙酸钠和约0.1％的聚山梨醇酯80，其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。在某些实施方案中，第二缓冲液包含约50mMTrisHCl、约125mM NaCl，并且所述第二缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM TrisHCl和约125mM NaCl，其中所述第三缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第一洗脱步骤包括向亲和树脂施加纯化水，随后施加pH为约3.2的1mM HCl，随后向亲和树脂施加包含约50mM TrisHCl、约750mM NaCl和约50％(w/w)的DMSO的缓冲液，并且其中所述缓冲液包含约8.0的pH。在某些实施方案中，第二洗脱步骤包括向亲和树脂施加pH为约2.0的约33mM HCl。

在一些实施方案中，进行至少三个洗涤步骤；第一洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约50至约200mM的乙酸钠和0.05％至0.2％的聚山梨醇酯80的第一缓冲液施，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；第二洗涤步骤包括向亲和树脂施加包含约25至约100mM TrisHCl和约50至200mM的盐第二缓冲液，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2。在一些实施方案中，盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。在一些实施方案中，所述方法还包括第三洗涤步骤，其在第一洗涤步骤之前进行，并且包括向亲和树脂施加包含约20至约100mM的盐酸和约75至约250mM NaCl的第三缓冲液，并且其中第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。在一些实施方案中，第一洗脱步骤包括向亲和树脂施加梯度为0％至100％的20-50mM的盐酸/于0.5-2.0mM的盐酸中的800-1200mM NaCl。在某些实施方案中，梯度为0％至100％的33mM的盐酸/于1mM的盐酸中的1000mM NaCl。在某些实施方案中，在第一洗脱步骤之前用纯化水进行洗涤。

在某些实施方案中，第一缓冲液包含约100mM的乙酸钠和约0.1％的聚山梨醇酯80，其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。在某些实施方案中，第二缓冲液包含约50mMTrisHCl、约125mM NaCl，并且所述第二缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第三缓冲液包含约50mM TrisHCl和约125mM NaCl，其中所述第三缓冲液的pH为约8.5。在某些实施方案中，第一洗脱步骤包括向亲和树脂施加包含约50mM TrisHCl、约750mM NaCl和约50％(w/w)的DMSO的缓冲液，并且其中所述缓冲液包含约8.0的pH。

在一些实施方案中，有机溶剂或去垢剂是聚山梨醇酯80、乙二醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、蔗糖或海藻糖。

在一些实施方案中，除去酸性组分。在一些实施方案中，酸性组分是宿主细胞DNA，诸如HEK293 DNA，并且酸性组分减少至如通过qPCR测量的低于250pg/微克AAV抗原的值。在一些实施方案中，酸性组分是宿主细胞DNA，诸如HEK293 DNA，并且其中使酸性组分减少至如通过ELISA所测量的低于250pg/微克AAV抗原的值。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含乙二醇、盐诸如NaCl和缓冲液诸如TrisHCl，其中所述pH为至少7.0。在一些实施方案中，盐浓度为约750mM，缓冲液浓度为约50mM，乙二醇为50-60％(w/w)。在一些实施方案中，乙二醇的浓度为至少55％(w/w)。在一些实施方案中，盐是NaCl，缓冲液是TrisHCl。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含糖诸如蔗糖、盐和缓冲液诸如精氨酸-HCl，其中pH为至少8.0。在一些实施方案中，盐浓度为约800mM在一些实施方案中，缓冲液浓度为约50mM。在一些实施方案中，糖是蔗糖，并且洗脱缓冲液包含50-60％(w/w)的蔗糖。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含1-3mM MgCl₂或约2mM MgCl₂。在一些实施方案中，盐是NaCl，缓冲液是精氨酸-HCl。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含乙二醇、盐诸如NaCl和牛磺酸，其中pH为至少7.0。在一些实施方案中，pH为8.0。在一些实施方案中，盐浓度为约750mM。在一些实施方案中，缓冲液浓度为约50mM。在一些实施方案中，乙二醇的浓度为50-70％(w/w)。在一些实施方案中，乙二醇的浓度为至少55％(w/w)。在一些实施方案中，洗脱缓冲液还包含0.05％至0.2％的辛基吡喃葡糖苷。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。

在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含(i)蔗糖、山梨醇、甘露醇和甘油的混合物，(ii)盐诸如NaCl，和(iii)缓冲液诸如组氨酸，其中pH为至少7.8。在一些实施方案中，盐浓度为约800mM。在一些实施方案中，缓冲液浓度为约50mM。在一些实施方案中，蔗糖的浓度为约20％(w/w)。在一些实施方案中，山梨醇的浓度为约10％(w/w)。在一些实施方案中，甘露醇的浓度为约5％(w/w)。在一些实施方案中，甘油的浓度为约15％(w/w)。在一些实施方案中，盐是NaCl，缓冲液是组氨酸。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。

在一些实施方案中，进行第二洗脱步骤，该步骤包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含(i)缓冲液，(ii)盐诸如NaCl，和(iii)50-60％(w/w)的乙二醇，其中pH为至少8.0。在一些实施方案中，盐浓度为约1000mM。在一些实施方案中，缓冲液浓度为约50mM。在一些实施方案中，乙二醇的浓度为60％(w/w)。在一些实施方案中，缓冲液是TrisHCl。在一些实施方案中，盐是NaCl，缓冲液是组氨酸。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。

在一些实施方案中，进行第二洗脱步骤，所述步骤包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含(i)缓冲液，(ii)盐诸如NaCl，和(iii)50-60％(v/v)的甘油，其中pH为至少8.0。在一些实施方案中，盐浓度为约800mM，缓冲液浓度为约50mM，甘油浓度为50％(v/v)。在一些实施方案中，盐是NaCl，缓冲液是精氨酸-HCl。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。在各个实施方案中，第五洗涤步骤在第一洗脱步骤之后且在第二洗脱步骤之前进行。第五洗涤步骤包括使亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含40-60mM的精氨酸-HCl和80-120mM NaCl，pH为7.5至8.5。第五洗涤步骤可以有效地使第一洗脱步骤与第二洗脱步骤之间的前置效应最小化，例如，提供仅由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液本身，而不是由可由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓的混合物引起的前置触发的洗脱。

在一些实施方案中，进行第二洗脱步骤，所述步骤包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含(i)缓冲液，(ii)盐诸如(NH₄)₂SO₄，和(iii)40-60％(v/v)的乙二醇，其中pH为至少8.0。在一些实施方案中，盐浓度为约1M，缓冲液浓度为约50mM，乙二醇浓度为50％(v/v)。在一些实施方案中，盐是(NH₄)₂SO₄,缓冲液是TrisHCl。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约7.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为7.0。在各个实施方案中，第五洗涤步骤在第一洗脱步骤之后且在第二洗脱步骤之前进行。第五洗涤步骤包括使亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含40-60mM的牛磺酸、50-70％(w/w)的乙二醇、600-900mM NaCl和0.05％至0.2％的辛基吡喃葡糖苷，pH为7.5至8.5。第五洗涤步骤可以有效地使第一洗脱步骤与第二洗脱步骤之间的前置效应最小化，例如，提供仅由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液本身，而不是由可由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓的混合物引起的前置触发的洗脱。

在一些实施方案中，进行第二洗脱步骤，所述步骤包括使亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含(i)缓冲液，(ii)盐诸如NaCl，和(iii)50-60％(w/w)的DMSO，其中pH为至少8.0。在一些实施方案中，盐浓度为约1000mM。在一些实施方案中，缓冲液浓度为约50mM。在一些实施方案中，DMSO的浓度为50％(w/w)。在一些实施方案中，盐是NaCl，缓冲液是TrisHCl。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。在各个实施方案中，含有DMSO的洗脱缓冲液有效地从CaptureSelect AAV8树脂中洗脱AAV9，但不能洗脱AAV8。在各个实施方案中，含有DMSO的洗脱缓冲液有效地从CaptureSelect AAVx树脂中洗脱AAV8和AAV9。在各个实施方案中，含有DMSO的洗脱缓冲液有效地从CaptureSelect AAV8树脂中洗脱AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAAV、BAAV、AAV(VR-195)和AAV(VR-355)中的一种或多种，但不能洗脱AAV8。在各个实施方案中，含有DMSO的洗脱缓冲液有效地从CaptureSelect AAVx树脂中洗脱AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAAV、BAAV、AAV(VR-195)和AAV(VR-355)中的任何一种。

在各个实施方案中，第五洗涤步骤在第一洗脱步骤之后且在第二洗脱步骤之前进行。第五洗涤步骤包括使亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含40-60mM的组氨酸和70-130mM NaCl，pH为8.0至8.8。第五洗涤步骤可以有效地使第一洗脱步骤与第二洗脱步骤之间的前置效应最小化，例如，提供仅由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液本身，而不是由可由第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓的混合物引起的前置触发的洗脱。

在一些实施方案中，洗脱包括通过梯度洗脱连续线性增加洗脱缓冲液的电导率。在一些实施方案中，洗脱包括通过梯度洗脱连续线性增加有机溶剂的浓度。在一些实施方案中，洗脱包括使亲和树脂与pH为至少7.0的包含约750mM NaCl和50-60％(w/w)的乙二醇的洗脱缓冲液接触。在一些实施方案中，乙二醇的浓度为至少55％(w/w)。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约8.0。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为8.0。

在一些实施方案中，洗脱包括抗衡离子浓度的逐步增加。在一些实施方案中，洗脱包括有机溶剂浓度的逐步增加。在一些实施方案中，洗脱缓冲液中的盐选自单价、二价或多价阴离子，诸如氯化物、乙酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐。在一些实施方案中，从洗脱步骤获得的AAV的HC杂质水平≤99.9％。在一些实施方案中，从洗脱步骤获得的AAV的HC杂质水平≤99.0％。

在一些实施方案中，AAV是AAV8，亲和树脂是POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8，洗脱缓冲液是酸性的并且不包含乙二醇。在一些实施方案中，AAV是AAV9，亲和树脂是POROS^TMCaptureSelect^TM AAV9，并且其中所述洗脱缓冲液是酸性的并且不包含乙二醇。在一些实施方案中，AAV是AAV8，并且其中亲和树脂是免疫亲和树脂，其由固定在色谱基质上的来自ADK8型或ADK8/9型的针对AAV8的固定化单克隆抗体组成。在一些实施方案中，AAV是AAV9，并且其中亲和树脂是免疫亲和树脂，其由固定在色谱基质上的来自ADK9型或ADK8/9型的针对AAV9的固定化单克隆抗体组成。

在一些实施方案中，所述方法还包括使含有AAV的溶液与包含带正电荷的基团的过滤器接触，所述带正电荷的基团有效地耗尽含有AAV的溶液中酸性带电荷的污染物。在一些实施方案中，所述方法还包括对AAV级分的纳米过滤以去除大于35nm的病毒。在一些实施方案中，所述方法还包括精细纯化步骤，所述精细纯化步骤包括用包含触须凝胶的柱子进行AEX色谱。在一些实施方案中，所述方法还包括通过AAV特异性ELISA，例如对AAV8持异或对AAV9特异的ELISA，测试AAV级分。AAV特异性ELISA可以是对AAV(例如AAV8或AAV9)特异的夹心ELISA。

在另一个方面，提供了一种通过本文描述的任何方法产生的AAV产物。

利用亲和步骤通过进行多个确定的洗涤步骤，例如通过将洗涤缓冲液施加到结合AAV的亲和基质，并在接近中性pH的条件下洗脱以保持所述病毒的感染性来纯化AAV颗粒，例如AAV8和AAV9颗粒。在某些实施方案中，在亲和步骤之前包括阴离子交换步骤。阴离子交换步骤可以以流通模式进行。在某些实施方案中，可以耗尽对亲和步骤中使用的亲和树脂的循环时间有影响的污染物。

本发明的方法可使得AAV病毒的纯度提高、宿主细胞蛋白质去除、宿主细胞DNA耗尽、潜在病毒受体去除、其中AAV结合在配体上的脂质包膜病毒部分地至完全地失活(例如，在洗涤步骤期间)，以及脂质包膜病毒在液相中部分地至完全地失活(例如，在洗脱步骤期间)。不希望受理论的束缚，乙二醇本身或与另一种添加剂结合，能够使此类脂质包膜病毒失活。示例性添加剂包括非离子去垢剂、脂肪族试剂(例如，TnBP)和去垢剂(例如，聚山梨醇酯(例如，Tween)、Triton X100、TnBP)。例如，溶剂-去垢剂混合物可包含1％的TritonX100、0.3％的磷酸三正丁酯和0.3％的TWEEN 80。

当使用Baculo转染系统时，包膜病毒的失活可以是特别重要的。根据本文所述的各个实施方案的洗脱能够防止低pH暴露并保持AAV的高效力。当根据本文描述的各个实施方案和实施例连续进行洗涤步骤和洗脱步骤时，可以看到进一步的改进。

在上述实施例11、实施例12和实施例13中，在各种亲和色谱运行中测试了“柱上”脂质包膜病毒的失活，如下面表1中所概述的。

表1：变体A、B和C中使用的溶剂去垢剂处理

含DMSO的缓冲液洗涤X缓冲液在接近中性pH(例如，pH 8.0)下在CaptureSelectAAV8树脂上可有效地触发AAV9但非AAV8的洗脱，这一结果令人惊讶。含有DMSO的缓冲液洗涤X缓冲液在接近中性pH(例如，pH 8.0)下在CaptureSelect AAVx树脂上可有效地触发各种AAVx的洗脱，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAAV、BAAV、AAV(VR-195)和AAV(VR-355)，这一结果令人惊讶。不希望受理论束缚，洗涤X缓冲液预期具有洗涤柱和/或使脂质包膜病毒失活或分解的活性。未预料到洗涤X缓冲液会差异地洗脱AAV9和AAV8。

亲和纯化步骤包括一个或多个洗涤步骤。一个或多个洗涤步骤之后可以是一个或多个洗脱步骤。在某些实施方案中，本公开的方法包括过滤步骤，其在亲和纯化步骤之前进行。

在培养宿主细胞(例如，HEK293细胞)以产生AAV颗粒(例如AAV8、AAV9等)后，浓缩和/或过滤澄清的无细胞培养物上清液，将病毒颗粒装载到亲和基质上。在某些实施方案中，将病毒颗粒被装载在pH范围为约7.4至约7.8的溶液中。在某些实施方案中，将病毒颗粒被装载在pH范围为约8.3至约8.7的溶液中。在某些实施方案中，将病毒颗粒被装载在pH为约8.5的溶液中。在某些实施方案中，pH为8.3至8.7，并且溶液包含NaCl和TrisHCl。在某些实施方案中，将病毒颗粒装载在pH为约8.5的包含约20mM TrisHCl和约150mM NaCl的溶液中。

可进行至少3个不同的洗涤步骤，每个步骤涉及相同或不同的缓冲液。在某些实施方案中，洗涤缓冲液是不同的。

在某些实施方案中，第一洗涤步骤使用第一缓冲液，其可以是基于乙酸钠(NaAcetate)的缓冲液。在某些实施方案中，第一洗涤步骤使用包含2-(N-吗啉代)乙磺酸的钠盐(MES-Na)、EDTA和包含聚山梨醇酯80、DMSO和磷酸三(正丁)酯(TNBP)的溶剂/去垢剂混合物的第一缓冲液。在某些实施方案中，第一洗涤步骤使用包含约50至约200mM的牛磺酸和0.2％至1.5％的PEG(例如，PEG 6000)的第一缓冲液。在某些实施方案中，第一洗涤步骤使用包含Bis-Tris以及包含Triton-X100、聚山梨醇酯80和TNBP的溶剂/去垢剂混合物的第一缓冲液。在某些实施方案中，第一洗涤步骤使用包含乙酸钠和聚山梨醇酯80的第一缓冲液。

在某些实施方案中，第二洗涤步骤使用第二缓冲液，其可以是包含氯化钠(NaCl)的基于Tris的缓冲液、基于甘氨酸的缓冲液、基于柠檬酸钠的缓冲液或包含NaCl的基于精氨酸-HCl的缓冲液。在某些实施方案中，第三洗涤步骤使用第三缓冲液，其可以是包含乙二醇和/或NaCl的基于Tris的缓冲液、基于牛磺酸的缓冲液或包含NaCl的基于精氨酸-HCl的缓冲液。另选地，可将山梨醇、甘露醇、木糖醇、蔗糖或海藻糖中的一种或多种与乙二醇结合使用或代替乙二醇。在某些实施方案中，任选的第四洗涤步骤或再平衡步骤在上文所列示的三个洗涤步骤之前进行。在任选的第四洗涤步骤中，使用第四缓冲液，其可以是包含NaCl的基于Tris的缓冲液。

在某些实施方案中，在从宿主细胞生产中亲和纯化含AAV的溶液之前，可以进行预纯化以除去一种或多种复杂的酸性蛋白质结构和宿主细胞DNA。预纯化可通过以流通模式进行阴离子交换来进行。预纯化步骤可以在本文所述的任何亲和纯化方法之前进行。以下物质中的一种或多种可通过预纯化这种含AAV的溶液来去除：组蛋白(例如，组蛋白H2A 1型，组蛋白H2B 1-B型，组蛋白H4，组蛋白H1.4)、60S核糖体蛋白(例如，60S核糖体蛋白L27、60S核糖体蛋白L6和60S核糖体蛋白L30)、细胞质肌动蛋白(例如，细胞质肌动蛋白1)、微管蛋白(例如，微管蛋白β-2A链)、异质核核糖核蛋白C、Rep68蛋白、HEK293层粘连蛋白受体37kDa形式(LamR 37kDa)和ATP依赖性分子伴侣HSC82。

洗涤步骤可以有效地从AAV和/或亲和基质的基体树脂中去除强结合的污染物。例如，缓冲液可包含以下中的一种或多种：TrisHCl、乙酸盐、磷酸盐、组氨酸、咪唑、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、牛磺酸、柠檬酸盐、HEPES、MES、MES-Na、硼酸盐、Bis-Tris、MOPS、N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、TAPS、TAPSO、MES、PIPES、TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸)、巴比妥钠(Veronal)、ADA(N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸)、ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)、Bis-Tris丙烷、BES(N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸)、DIPSO(3-(N,N-双[2-羟基乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸)、Trizma、HEPPSO(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物)、TEA、EPPS(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPBS(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(4-丁磺酸)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、确保pH范围和HEK-HCP的耗尽速率的单种氨基酸或两种或更多种氨基酸的任意组合，例如甘氨酸、精氨酸、色氨酸、氨基酸的衍生物，例如牛磺酸(氧化半胱氨酸)、N-乙酰基-色氨酸和甘氨酰甘氨酸。同时，洗涤步骤中使用的缓冲液基本上不会洗脱AAV。

在某些实施方案中，洗涤缓冲液还可包含有机溶剂或去垢剂。例如，有机溶剂或去垢剂可以是但不限于Tween 80、聚山梨醇酯80、Triton X100、磷酸三(正丁)酯(TNBP)、乙二醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、蔗糖或海藻糖。例如，去垢剂可以是但不限于非离子聚氧乙烯表面活性剂(例如，Brij 35)、4-壬基苯基-聚乙二醇(Arkopal N100)、辛基糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、洋地黄皂苷、6-环己基己基β-D-麦芽糖苷或辛基吡喃葡糖苷。例如，乙二醇可以是PEG，例如但不限于PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000(Macrogol)。例如，有机溶剂可以是但不限于甘油(1,2,3-丙三醇)和赤藓糖醇(内消旋-1,2,3,4-丁四醇)。

有机溶剂或去垢剂不必存在于所有使用的洗涤缓冲液中。然而，有机溶剂或去垢剂存在于至少一种所用的洗涤缓冲液中。在一些实施方案中，洗涤缓冲液，例如第一洗涤缓冲液，包含乙酸钠和Tween 80。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含Tween 80、DMSO和磷酸三(正丁)酯(TNBP)中的一种或多种。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包括Triton-X100、聚山梨醇酯80和TNBP中的一种或多种。在一些实施方案中，洗涤缓冲液，例如第三洗涤缓冲液，包含Tris和乙二醇。不希望受理论的束缚，洗涤缓冲液中的有机溶剂和去垢剂可有效去除强结合的宿主蛋白质和病毒受体，同时还能使脂质包膜病毒失活和/或分解。

第一缓冲液可包含约50至约2000mM的乙酸钠，或50至约250mM的乙酸钠，和约0.05％至约5％的聚山梨醇酯80或Tween 80，或0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80或Tween80，其中pH为5.2至6.8。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约50至约75mM、约75至约100mM、约90至约110mM、约100至约125mM、约125至约150mM的乙酸钠、约150至约175mM的乙酸钠、约175至约200mM的乙酸钠、约200至约250mM的乙酸钠、约250至约300mM的乙酸钠、约300至约350mM的乙酸钠、约350至约400mM的乙酸钠、约400至约450mM的乙酸钠、约450至约500mM的乙酸钠、约500至约550mM的乙酸钠、约550至约600mM的乙酸钠、约600至约650mM的乙酸钠、约650至约700mM的乙酸钠、约700至约750mM的乙酸钠、约750至约800mM的乙酸钠、约800至约850mM的乙酸钠、约850至约900mM的乙酸钠、约900至约950mM的乙酸钠、约950至约1000mM的乙酸钠、约1000至约1050mM的乙酸钠、约1050至约1100mM的乙酸钠、约1100至约1150mM的乙酸钠、约1150至约1200mM的乙酸钠、约1200至约1250mM的乙酸钠、约1250至约1300mM的乙酸钠、约1300至约1350mM的乙酸钠、约1350至约1400mM的乙酸钠、约1400至约1450mM的乙酸钠、约1450至约1500mM的乙酸钠、约1500至约1550mM的乙酸钠、约1550至约1600mM的乙酸钠、约1600至约1650mM的乙酸钠、约1650至约1700mM的乙酸钠、约1700至约1750mM的乙酸钠、约1750至约1800mM的乙酸钠、约1800至约1850mM的乙酸钠、约1850至约1900mM的乙酸钠、约1900至约1950mM的乙酸钠或约1950至约2000mM的乙酸钠。

在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约50至约500mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸的钠盐(MES-Na)、约3至约30mM EDTA以及包含聚山梨醇酯80、DMSO和磷酸三(正丁)酯(TNBP)的溶剂/去垢剂混合物。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约50至约75mM、约75至约100mM、约90至约110mM、约100至约125mM、约125至约150mM、约150至约175mM、约175至约200mM、约200至约250mM、约250至约300mM、约300至约350mM、约350至约400mM、约400至约450mM或约450至约500mM的MES-Na的钠盐。在某些实施方案中，第一缓冲液可包括约50、约75、约90mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM或约500mM的MES-Na的纳盐。

在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约50至约200mM的牛磺酸。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约50至约75mM、约75至约100mM、约90至约110mM、约100至约125mM、约125至约150mM、约150至约175mM、约175至约200mM的牛磺酸。在某些实施方案中，第一缓冲液可包括约50、约75、约90mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM的牛磺酸。

在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约80至约400mM Bis-Tris。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约80至约100mM、约90至约110mM、约100至约125mM、约125至约150mM、约150至约175mM、约175至约200mM、约200至约250mM、约250至约300mM、约300至约350mM、约350至约400mM Bis-Tris。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约50、约75、约90mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mMBis-Tris。

在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约50至约200mM的乙酸钠。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约50至约80mM、约70至约100mM、约80至约110mM、约90至约120mM、约100至约130mM、约120至约150mM、约140至约170mM、约170至约200mM的乙酸钠。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约60、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM或约160mM的乙酸钠。

在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约25mM的乙酸钠、约50mM的乙酸钠、约75mM的乙酸钠、约100mM的乙酸钠、约125mM的乙酸钠、约150mM的乙酸钠、约175mM的乙酸钠、约200mM的乙酸钠、约225mM的乙酸钠、约250mM的乙酸钠、约275mM的乙酸钠、约300mM的乙酸钠、约325mM的乙酸钠、约350mM的乙酸钠、约375mM的乙酸钠、约400mM的乙酸钠、约425mM的乙酸钠、约450mM的乙酸钠、约475mM的乙酸钠、约500mM的乙酸钠、约525mM的乙酸钠、约550mM的乙酸钠、约575mM的乙酸钠、约600mM的乙酸钠、约625mM的乙酸钠、约650mM的乙酸钠、约675mM的乙酸钠、约700mM的乙酸钠、约725mM的乙酸钠、约750mM的乙酸钠、约775mM的乙酸钠、约800mM的乙酸钠、约825mM的乙酸钠、约850mM的乙酸钠、约875mM的乙酸钠、约900mM的乙酸钠、约925mM的乙酸钠、约950mM的乙酸钠、约975mM的乙酸钠、约1000mM的乙酸钠、约1025mM的乙酸钠、约1050mM的乙酸钠、约1075mM的乙酸钠、约1100mM的乙酸钠、约1125mM的乙酸钠、约1150mM的乙酸钠、约1175mM的乙酸钠、约1200mM的乙酸钠、约1225mM的乙酸钠、约1250mM的乙酸钠、约1275mM的乙酸钠、约1300mM的乙酸钠、约1325mM的乙酸钠、约1350mM的乙酸钠、约1375mM的乙酸钠、约1400mM的乙酸钠、约1425mM的乙酸钠、约1450mM的乙酸钠、约1475mM的乙酸钠、约1500mM的乙酸钠、约1525mM的乙酸钠、约1550mM的乙酸钠、约1575mM的乙酸钠、约1600mM的乙酸钠、约1625mM的乙酸钠、约1650mM的乙酸钠、约1675mM的乙酸钠、约1700mM的乙酸钠、约1725mM的乙酸钠、约1750mM的乙酸钠、约1775mM的乙酸钠、约1800mM的乙酸钠、约1825mM的乙酸钠、约1850mM的乙酸钠、约1875mM的乙酸钠、约1900mM的乙酸钠、约1925mM的乙酸钠、约1950mM的乙酸钠、约1975mM的乙酸钠或约2000mM的乙酸钠。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约100mM或100mM的乙酸钠。

在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约0.05％至约0.08％、约0.08％至约0.11％、约0.11％至约0.14％、约0.14％至约0.17％或约0.17至约0.20％的聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约0.1％的聚山梨醇酯80或0.1％的聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约0.05％至约0.08％、约0.08％至约0.11％、约0.11％至约0.14％、约0.14％至约0.17％或约0.17％至约0.20％Tween 80。在某些实施方案中，第一缓冲液可包含约0.1％的Tween 80。在某些实施方案中，pH可为约5.2至约5.5、约5.5至约5.8、约5.8至约6.1、约6.1至约6.4或约6.4至约6.8。在某些实施方案中，第一缓冲液的pH为约6.0或为6.0。

在某些实施方案中，第一缓冲液包含螯合剂，例如EDTA。

第二缓冲液可包含约30至约200mM TrisHCl或30至约80mM TrisHCl和盐，其中第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2。在一些实施方案中，盐是NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。盐例如NaCl的浓度可为约75至约500mM。在一些实施方案中，盐浓度，例如NaCl浓度，为约75至约200mM。在一些实施方案中，盐浓度，例如NaCl浓度，不超过500mM。在一些实施方案中，盐浓度，例如NaCl浓度，不超过200mM。不希望受理论的束缚，不超过500mM或不超过200mM的盐浓度能够防止AAV在洗涤步骤期间洗脱，因为盐溶液的电导率太低而不能促成洗脱。

第二缓冲液可包含约30至约35mM、约35至约40mM、约40至约45mM、约45至约50mM、约50至约55mM、约55至约60mM、约60至约65mM、约65至约70mM、约70至约75mM或约75至约80mM TrisHCl。在某些实施方案中，第二缓冲液可包含约50mM TrisHCl或50mM TrisHCl。在某些实施方案中，第二缓冲液可包含约75至约100mM、约100至约125mM、约125至约150mM、约150至约175mM、约175至约200mM、约200至约225mM或约225至约250mM NaCl。在某些实施方案中，第二缓冲液可以包含约150mM NaCl或150mM NaCl。在某些实施方案中，第二缓冲液的pH可以是约7.5至约7.7、约7.7至约7.9、约7.9至约8.1、约8.1至约8.3、约8.3至约8.5、约8.5至约8.7、约8.7至约8.9或约8.9至约9.2。在某些实施方案中，第二缓冲液的pH可为约8.5或可为8.5。

第二缓冲液可包含约30至约35mM、约35至约40mM、约40至约45mM、约45至约50mM、约50至约55mM、约55至约60mM、约60至约65mM、约65至约70mM、约70至约75mM或约75至约80mM的精氨酸-HCl。在某些实施方案中，第二缓冲液可包含约50mM的精氨酸-HCl或50mM的精氨酸-HCl。在某些实施方案中，第二缓冲液可包含约75至约100mM、约100至约125mM、约125至约150mM、约150至约175mM、约175至约200mM、约200至约225mM或约225至约250mMNaCl。在某些实施方案中，第二缓冲液可以包含约150mM NaCl或150mM NaCl。在某些实施方案中，第二缓冲液的pH可以是约7.5至约7.7、约7.7至约7.9、约7.9至约8.1、约8.1至约8.3、约8.3至约8.5、约8.5至约8.7、约8.7至约8.9或约8.9至约9.2。在某些实施方案中，第二缓冲液的pH可为约8.5或可为8.5。

第二缓冲液可包含约50至约200mM的甘氨酸。在某些实施方案中，第二缓冲液可包含约50至约100mM、约70至约120mM、约100至约150mM、约120至约170mM、约150至约200mM的甘氨酸。在某些实施方案中，第二缓冲液的pH可以是约7.5至约7.7、约7.7至约7.9、约7.9至约8.1、约8.1至约8.3、约8.3至约8.5、约8.5至约8.7、约8.7至约8.9或约8.9至约9.2。在某些实施方案中，第二缓冲液的pH可为约8.5或可为8.5。

第二缓冲液可包含约50至约20mM的柠檬酸钠。在某些实施方案中，第二缓冲液可包含约5至约10mM、约7至约12mM、约10至约15mM、约12至约17mM、约15至约20mM的柠檬酸钠。在某些实施方案中，第二缓冲液的pH可以是约7.5至约7.7、约7.7至约7.9、约7.9至约8.1、约8.1至约8.3、约8.3至约8.5、约8.5至约8.7、约8.7至约8.9或约8.9至约9.2。在某些实施方案中，第二缓冲液的pH可为约8.5或可为8.5。

在某些实施方案中，第二缓冲液包含螯合剂，例如EDTA。

第三缓冲液可包含约30至约200mM TrisHCl和约30体积％至约75体积％的乙二醇，其中pH为约7.5至约9.2。第三缓冲液可包含约20至约80mM的精氨酸-HCl和约50至约200mM的盐，其中pH为约7.3至约8.8。第三缓冲液可包含约50mM TrisHCl和约50体积％的乙二醇，其中pH为约8.5。第三缓冲液可包含约20至约150mM的牛磺酸、约30体积％至约75体积％的乙二醇和0.05％至0.2％的辛基吡喃葡糖苷，其中pH为约7.3至约8.8。第三缓冲液可包含约50至约200mM的精氨酸-HCl、约50至约200mM的赖氨酸-HCl、约50至约200mM的组氨酸-HCl以及约1mM至约4mM的N-乙酰基-D,L-色氨酸和约10％(w/w)至约40％(w/w)的聚山梨醇酯80，其中pH为约7.3至约8.8。如果盐，例如NaCl，存在于第三缓冲液中，在某些实施方案中，盐的浓度不超过500mM，在某些实施方案中，盐的浓度不超过200mM。在某些实施方案中，盐是NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。在某些实施方案中，盐是NaCl。在某些实施方案中，可将山梨醇、甘露醇、木糖醇、蔗糖或海藻糖中的一种或多种与乙二醇结合使用或代替乙二醇。

不希望受到理论的束缚，AAV的洗脱程度受到第三缓冲液中乙二醇的量和盐的电导率的影响。与50％(w/w)的乙二醇相比，缓冲液中至少55％(w/w)的乙二醇量可显著增加洗脱量。因此，在给定的乙二醇浓度下，增加的NaCl浓度可以增加洗脱的程度和速率。在给定的乙二醇浓度下，用多价盐替代NaCl也可以增加洗脱的程度和速率。

不希望被理论束缚，如果盐是恒定的，例如750mM NaCl，那么增加乙二醇的量可以增加缓冲液的洗脱强度。如果乙二醇含量恒定，例如55％，那么增加盐的量可以增加缓冲液的洗脱强度。因此，在750mM NaCl中，随着乙二醇从40％(w/w)增至45％(w/w)增至50％(w/w)增至55％(w/w)增至60(w/w)，洗脱强度增加。

在盐含量不变的情况下，增加溶液中的乙二醇含量会降低电导率。增加乙二醇的量可降低盐在缓冲液中的溶解度的量。

在某些实施方案中，第三缓冲液可包含约30至约35mM、约35至约40mM、约40至约45mM、约45至约50mM、约50至约55mM、约55至约60mM、约60至约65mM、约65至约70mM、约70至约75mM、约75至约80mM、约80至约90mM、约90至约100mM、约100至约110mM、约110至约120mM、约120至约130mM、约130至约140mM、约140至约150mM、约150至约160mM、约160至约170mM、约170至约180mM、约180至约190mM或约190至约200mM TrisHCl。在某些实施方案中，第三缓冲液可包含约50mM或50mM TrisHCl。在某些实施方案中，第三缓冲液可包含约30体积％至约35体积％、35体积％至约40体积％、约40体积％至约45体积％、约45体积％至约50体积％、约48体积％至约52体积％、约50体积％至约55体积％、约55体积％至约60体积％、约60体积％至约65体积％、约65体积％至约70体积％或约70体积％至约75体积％的乙二醇。在某些实施方案中，第三缓冲液可包含约50％的乙二醇或50％的乙二醇。在某些实施方案中，第三缓冲液的pH可为约7.5至约7.7、约7.7至约7.9、约7.9至约8.1、约8.1至约8.3、约8.3至约8.5、约8.5至约8.7、约8.7至约8.9或约8.9至约9.2。在某些实施方案中，第三缓冲液的pH可为约8.5或可为8.5。

在某些实施方案中，第三缓冲液包含螯合剂，例如EDTA。

第四缓冲液可包含约10至约30mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl，其中pH为约6.5至约8.0。在某些实施方案中，第四缓冲液可包含约10至约15mM、约15至约20mM、约20至约25mM或约25至约30mM TrisHCl。在某些实施方案中，第四缓冲液可以包含约20mM或20mMTrisHCl。在某些实施方案中，第四缓冲液可包含约75至约100mM、约100至约125mM、约125至约150mM、约150至约175mM、约175至约200mM、约200至约225mM NaCl或约225至约250mMNaCl。在某些实施方案中，第二缓冲液可以包含约150mM NaCl或150mM NaCl。在某些实施方案中，第四缓冲液的pH可为约6.5至约6.9、约6.8至约7.2、约7.1至约7.5、约7.4至约7.9或约7.6至约8.0。在某些实施方案中，第四缓冲液的pH可为约7.4或可为7.4。

第四缓冲液可包含约20至约100mM的组氨酸和约75至约250mM NaCl，其中pH为约7.5至约8.8。在某些实施方案中，第四缓冲液可包含约20至约40mM、约40至约60mM、约60至约75mM或约75至约100mM的组氨酸。在某些实施方案中，第四缓冲液可以包含约20mM的组氨酸或20mM的组氨酸。在某些实施方案中，第四缓冲液可包含约75至约100mM、约100至约125mM、约125至约150mM、约150至约175mM、约175至约200mM、约200至约225mM NaCl或约225至约250mM NaCl。在某些实施方案中，第二缓冲液可以包含约150mM NaCl或150mM NaCl。在某些实施方案中，第四缓冲液的pH可为约7.5至约7.9、约7.8至约8.2、约8.1至约8.5、约8.4至约8.9或约8.6至约9.0。在某些实施方案中，第四缓冲液的pH可为约8.0或可为8.0。

在某些实施方案中，第四缓冲液包含螯合剂，例如EDTA。在某些实施方案中，可用包含螯合剂例如EDTA的缓冲液进行额外的洗涤。

在洗涤步骤之后，使用洗脱缓冲液洗脱AAV颗粒。洗脱缓冲液可包含约30至约200mM的缓冲液、约30体积％至约75体积％的乙二醇和约500mM至约2000mM的盐，其中洗脱缓冲液的pH为约7.3至约8.8。在一些实施方案中，乙二醇的浓度为至少50％(w/w)。在一些实施方案中，乙二醇的浓度为至少55％(w/w)。在一些实施方案中，乙二醇的浓度为至少60％(w/w)。在一些实施方案中，缓冲液是TrisHCl、甘氨酸、柠檬酸盐、精氨酸、磷酸甘氨酸-HCl、硫酸铵、氯化镁、硼酸盐、bis-Tris、MOPS、N,N-二羟乙基甘氨酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、TAPS、TAPSO、MES、PIPES、TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟基甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸)、巴比妥钠(Veronal)、ADA(N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸)、ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)、Bis-Tris丙烷、BES(N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸)、DIPSO(3-(N,N-双[2-羟基乙基]氨基)-2-羟基丙烷磺酸)、Trizma、HEPPSO(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙烷磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基丙烷磺酸)二水合物)、TEA、EPPS(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPBS(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(4-丁磺酸)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、确保pH范围和AAV的洗脱的单种氨基酸或两种或更多种氨基酸的任意组合，例如甘氨酸、精氨酸、色氨酸、氨基酸的衍生物，例如牛磺酸(氧化半胱氨酸)、N-乙酰色氨酸和甘氨酰甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液是TrisHCl。

在一些实施方案中，盐是NaCl、KCl、CaCl₂、CsCl、LiCl、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl或KCl、CaCl₂、CsCl、LiCl、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl和CsCl中的一种或多种的组合。在一些实施方案中，盐是NaCl。盐例如NaCl的浓度可为约500至约2000mM。在一些实施方案中，盐浓度为约500至约900mM、约750mM NaCl或为750mM NaCl。在一些实施方案中，当使用NaCl的浓度梯度时，目标浓度为2000mM。

在某些实施方案中，可将山梨醇、甘露醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、甘油(1,2,3-丙三醇)或赤藓糖醇(内消旋-1,2,3,4-丁四醇)中的一种或多种与乙二醇结合使用或代替乙二醇。在某些实施方案中，洗脱缓冲液可包含约30至约35mM、约35至约40mM、约40至约45mM、约45至约50mM、约50至约55mM、约55至约60mM、约60至约65mM、约65至约70mM、约70至约75mM或约75至约80mM TrisHCl。在某些实施方案中，洗脱缓冲液可包含约50mM TrisHCl或50mMTrisHCl。在某些实施方案中，洗脱缓冲液可以包含约30体积％至约35体积％、约35体积％至约40体积％、约40体积％至约45体积％、约45体积％至约50体积％、约48体积％至约52体积％、约50体积％至约55体积％、约55体积％至约60体积％、约60体积％至约65体积％、约65体积％至约70体积％或约70体积％至约75体积％的乙二醇。在某些实施方案中，洗脱缓冲液可以包含约50％的乙二醇或50％的乙二醇。在某些实施方案中，乙二醇的浓度为至少55％(w/w)。在某些实施方案中，乙二醇的浓度为至少56％(w/w)。在某些实施方案中，乙二醇的浓度为至少57％(w/w)。在某些实施方案中，乙二醇的浓度为至少58％(w/w)。在某些实施方案中，洗脱缓冲液可包含约500至约700mM、约550至约750mM、约600至约800mM、约650至约850mM、约700至约900mM、约750至约950mM、约800至约1000mM NaCl、约900至约1100mMNaCl、约1000至约1200mM NaCl、约1100至约1300mM NaCl、约1200至约1400mM NaCl、约1300至约1500mM NaCl、约1400至约1600mM NaCl、约1500至约1700mM NaCl、约1600至约1800mMNaCl、约1700至约1900mM NaCl、约1800至约2000mM NaCl。在某些实施方案中，洗脱缓冲液可包含约750mM NaCl或750mM NaCl。pH可为7.3至7.6。pH可为7.5至7.8。pH可为7.7至8.0。pH可为7.9至8.2。pH可为8.1至8.4。pH可为8.3至8.6。pH可为8.5至8.8。

在某些实施方案中，利用包含有机溶剂的洗脱缓冲液进行洗脱。例如，有机溶剂可包括以下的一种或多种：多元醇(例如，乙二醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇)、甘油、蔗糖、海藻糖或多元醇的组合。缓冲液的pH范围可在7.5与8.5之间。不希望受到理论的束缚，如果例如AAV的产生涉及杆状病毒对Sf9昆虫细胞的转染，则有机溶剂可以使能产生的脂质包膜病毒失活。亲和洗脱物可包含有机溶剂(例如，多元醇诸如乙二醇)，其可在随后的超速离心步骤中以可调节的密度梯度使用。

洗涤缓冲液或洗脱缓冲液中的任何有机溶剂都能够使脂质包膜病毒分解或失活。这种失活可以通过柱上失活和液态失活的组合来进行。在一些实施方案中，洗脱缓冲液和/或洗涤缓冲液中的有机溶剂的浓度为约50％(w/w)至约80％(w/w)，以确保脂质包膜病毒的分解或失活。在一些实施方案中，浓度为约50％(w/w)。在一些实施方案中，浓度为约55％(w/w)。在某些实施方案中，乙二醇的浓度为约56％(w/w)。在某些实施方案中，乙二醇的浓度为约57％(w/w)。在某些实施方案中，乙二醇的浓度为约58％(w/w)。在某些实施方案中，乙二醇的浓度为约59％(w/w)。在一些实施方案中，浓度为约60％(w/w)。在一些实施方案中，浓度为约65％(w/w)。在一些实施方案中，浓度为约70％(w/w)。在一些实施方案中，浓度为约75％(w/w)。在一些实施方案中，洗脱缓冲液和/或洗涤缓冲液中的有机溶剂的浓度为约40％(w/w)，以确保脂质包膜病毒的分解或失活。在一些实施方案中，洗脱缓冲液和/或洗涤缓冲液中的有机溶剂的浓度为约30％(w/w)，以确保脂质包膜病毒的分解或失活。在一些实施方案中，洗脱缓冲液或洗涤缓冲液中的有机溶剂可使杆状病毒失活或分解。

在一些实施方案中，第一缓冲液的pH为约5.8至约6.2，并且包含约90至约110mM的乙酸钠和约0.09％至约0.11％的聚山梨醇酯80/Tween 80，第二缓冲液的pH为约8.2至约8.8，并且包含约45至约55mM TrisHCl和约110至约135mM NaCl，第三缓冲液的pH为约8.2至约8.8，并且包含约45至约55mM TrisHCl和约45％至约55％的乙二醇，任选的第四缓冲液的pH为约7.2至约7.6，并且包含约15至约25mM TrisHCl和约135至约165mM NaCl。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约7.8至约8.2，并且包含约45至约55mM TrisHCl、约45％至约55％的乙二醇和约650至约850mM NaCl。可使用各种体积，诸如约2倍柱体积至约15倍柱体积、约3倍柱体积至约7倍柱体积、约4倍柱体积至约8倍柱体积、约5倍柱体积至约10倍柱体积或者约7倍柱体积至约12倍柱体积。可使用约5倍柱体积或5倍柱体积的第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液、第四缓冲液和洗脱缓冲液中的每一种。或者，可使用约10倍柱体积或10倍柱体积的第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液、第四缓冲液和洗脱缓冲液中的每一种。例如，当柱体积为约2ml至约3ml时，可使用10倍柱体积。可进一步延长洗涤步骤的时间以提高AAV纯度。

在一些实施方案中，第一缓冲液的pH为约7.2至约7.6，并且包含约15至约25mMTrisHCl和约135至约165mM NaCl，第二缓冲液的pH为约5.8至约6.2，并且包含约90至约110mM的乙酸钠和约0.09％至约0.11％的聚山梨醇酯80，第三缓冲液的pH为约8.2至约8.8，并且包含约45至约55mM TrisHCl和约110至约135mM NaCl，第四缓冲液的pH为约7.5至约8.5，并且包含约45至约55mM TrisHCl和约45％至约55％的乙二醇，洗脱缓冲液的pH为约7.8至约8.2，并且包含约45至约55mM TrisHCl、约45％至约55％的乙二醇和约650至约850mM NaCl。可使用约10倍柱体积或10倍柱体积的每种洗涤缓冲液。

在一些实施方案中，第一缓冲液的pH为约7.2至约7.6，并且包含约15至约25mMTrisHCl和约135至约165mM NaCl，第二缓冲液的pH为约5.8至约6.2，并且包含约90至约110mM的乙酸钠和约0.09％至约0.11％的聚山梨醇酯80，第三缓冲液的pH为约8.2至约8.8，并且包含约45至约55mM TrisHCl和约110至约135mM NaCl，第四缓冲液的pH为约7.5至约8.5，并且包含约45至约55mM TrisHCl和约45％至约55％的乙二醇。洗脱是以梯度进行的，所述梯度始于pH为约7.8至约8.2，并且包含约45至约55mM TrisHCl、约45％至约55％的乙二醇和约650至约850mM NaCl的第一洗脱缓冲液并终于pH为约7.8至约8.2并且包含约45至约55mM TrisHCl、约45％至约55％的乙二醇和约1900至约2100mM NaCl的第二洗脱缓冲液。可使用约10倍柱体积或10倍柱体积的每种洗涤缓冲液。可以用10倍柱体积的梯度进行洗脱。

在某些实施方案中，包含AAV颗粒的溶液经历离子交换色谱。在某些实施方案中，离子交换是阴离子交换。在某些实施方案中，阴离子交换色谱载体不仅可以从细胞培养物中除去残留的颗粒污染物，还可以除去酸性杂质和病毒颗粒。在某些实施方案中，阴离子交换色谱能够除去蛋白酶和/或宿主细胞DNA。在某些实施方案中，可用基于膜的分离(例如杂交膜-阴离子交换色谱)来进行离子交换色谱。在某些实施方案中，例如以流通模式或结合/洗脱模式使用纯AEX色谱。在某些实施方案中，阴离子交换载体可以是但不限于

STREAMLINE Q XL^TM、POROS 50PI^TM、Q SEPHAROSE^TM、Emphase^TM AEX HybridPurifier、Nuvia Q、POROS 50HQ、Capto Q、Capto Q impress、Unosphere Q、Q Ceramic

F、

Q、

Super Q、混合模式AEX树脂(例如，Capto Adhere、Capto adhere impress和MEP Hypercell)，以及任何DEAE、TMAE、叔胺或季胺，或基于PEI的树脂。在某些实施方案中，阴离子交换载体是

Q。

在某些实施方案中，来自HEK293细胞或任何使用的宿主细胞的DNA不用Benzonase和/或DNA酶处理。本文所述的阴离子交换剂和洗涤步骤可以有效地除去这种DNA，使得不需要用Benzonase或DNA酶处理。

AAV通常通过阴离子交换步骤从流通级分中回收(取决于pH)。另选地，AAV能用于结合/洗脱方法。应进行流通法或结合/洗脱法以排除宿主细胞杂质，所述杂质在比AAV更高的电导率(在恒定的pH下)或更低的pH(在恒定的电导率下)下洗脱出来。当以结合/洗脱模式操作时，缓冲液的pH和组成有效地触发产物的洗脱，但不触发酸性宿主细胞杂质的洗脱。不希望受理论束缚，每个结合和洗脱步骤都可在微环境中产生力，使得在非结合条件下的流通法可以比结合/洗脱法引起更少的AAV损伤或分解。

在各个实施方案中，AAV(例如AAV8和AAV9)的产率，在本文所述的纯化步骤之后并且如通过ITR-qPCR测定以重量/体积所测量的，比通过不进行洗涤步骤的比较程序获得的产率高至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。

在各个实施方案中，AAV(例如AAV8和AAV9)的产率，在本文所述的纯化步骤之后并且如通过ITR-qPCR测定以重量/重量所测量的，比通过不进行洗涤步骤的比较程序获得的产率高至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。

在某些实施方案中，本文所述的生产和纯化AAV的方法使蛋白质杂质的数量与通过无相同洗涤方案的比较程序获得的产率相比减少了超过约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％。令人惊讶地发现，本文所述的生产和纯化AAV的方法将蛋白质杂质的数量减少了至少25％。令人惊讶地发现，当AAV颗粒的溶液在装载到亲和基质上之前暴露于阴离子交换色谱时，本文描述的生产和纯化AAV的方法将蛋白质杂质的数量减少了至少75％。例如，实施例2的表7中的数据显示蛋白质杂质的数量从20减少至14(没有预先阴离子交换)和从20减少到4(有预先阴离子交换)。

在某些实施方案中，当阴离子交换和具有洗涤步骤的亲和纯化都如本文所提供的那样进行时，本文所述的生产和纯化AAV的方法提供了至少为98.0％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％或99.2％的AAV(例如，AAV8和AAV9)的纯度。在某些实施方案中，当具有洗涤步骤的亲和纯化如本文所提供的那样进行时，本文所述的生产和纯化AAV的方法提供了至少为96.0％、96.1％、96.2％、96.3％、96.4％、96.5％、96.6％、96.7％、96.8％、96.9％、97.0％、97.1％、97.2％、97.3％、97.4％、97.5％、97.6％、97.7％、97.8％、97.9％或98.0％的AAV(例如，AAV8和AAV9)的纯度。

有利的是，所述方法可扩展至大体积的起始材料，例如细胞培养物。在某些实施方案中，本文提供的方法是能够从至少500L或约500L、至少600L或约600L、至少700L或约700L、至少800L或约800L、至少900L或约900L或至少1000L或约1000L的体积纯化AAV的大规模方法。在某些实施方案中，所述方法可扩展至至少1250L或约1250L、至少1500L或约1500L、至少2000L或约2000L、至少2500L或约2500L、至少3000L或约3000L、至少4000L或约4000L、至少5000L或约5000L、至少6000L或约6000L、至少7000L或约7000L、至少8000L或约8000L、至少9000L或约9000L、至少10,000L或约10,000L或更大的最小体积的起始材料(例如，细胞培养物)。例如，利用约1000L或约10,000L或25,000L或更大的最小体积的产生AAV的细胞培养物进行所述方法。

本文所述的生产和纯化AAV的方法也是有利的，因为所述方法导致高滴度的AAV产生。在某些实施方案中，包含至少约10¹⁰个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约10¹¹个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约10¹²个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约10¹³个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约10¹⁴个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约10¹⁵个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约10¹⁶个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约10¹⁷个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约2x 10¹⁶个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。在某些实施方案中，包含至少约5x 10¹⁷个病毒颗粒(vp)的AAV产物由约1000L的起始材料(例如，细胞培养物)产生。

本文描述的方法的另一个有利方面是所述方法产生高纯度的AAV产物。在某些实施方案中，通过本公开的方法生产的AAV产物基本上不含一种或多种污染物：宿主细胞蛋白质、宿主细胞的细胞核酸(例如，游离宿主细胞DNA和游离质粒DNA)、质粒DNA、空病毒衣壳、热激蛋白70(HSP70)、乳酸脱氢酶(LDH)、蛋白酶体、污染物非-AAV病毒(例如，脂质包膜病毒)、宿主细胞培养成分(例如，抗生素)、支原体、热原、细菌内毒素、细胞碎片(例如，由膜脂质、蛋白质和其它生物聚合物组成的碎片)和外源因子(adventitious agent)。当根据本文所述的生产和纯化AAV的方法纯化AAV时，可能检测不到以下杂质中的一种或多种或甚至全部所述杂质：组蛋白H2A 1型、组蛋白H2B 1-B型、组蛋白H4、热激蛋白70kDa 1A、丙酮酸激酶PKM、延伸因子2、ATP-柠檬酸合酶、组蛋白H1.4、免疫球蛋白重链恒定区γ1(来自酸性洗脱方法的固定化配体)、60S核糖体蛋白L27、果糖二磷酸醛缩酶A、71kDa热激同源蛋白、细胞质肌动蛋白1、S-甲酰基谷胱甘肽水解酶、天冬酰胺合成酶(谷氨酰胺水解)、L-乳酸脱氢酶B链、微管蛋白β-2A链、X染色体RNA结合基序蛋白、60S核糖体蛋白L6、细胞质苏氨酸tRNA连接酶、免疫球蛋白κ恒定区、60S核糖体蛋白L30、含WD重复序列的蛋白1、腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase)、异质核核糖核蛋白C、蛋白Rep68、西梅脱寡肽酶(thimetoligopeptidase)、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶、ATP依赖性分子伴侣HSC82。根据本文所述的生产和纯化阴离子AAV的方法，在洗涤步骤之前添加阴离子交换步骤也可导致以下物质检测不到：组蛋白H1.4、60S核糖体蛋白L27、细胞质肌动蛋白1、微管蛋白β-2A链、60S核糖体蛋白L6、60S核糖体蛋白L30、异质核核糖核蛋白C、蛋白Rep68和ATP依赖性分子伴侣HSC82。

在示例性实施方案中，本公开的方法提供了其中至少50％或约50％的在起始材料(例如，细胞培养物)中发现的污染物已被去除的纯化的AAV产物。在示例性实施方案中，本公开的方法提供了其中至少60％或约60％的在起始材料(例如，细胞培养物)中发现的污染物已被去除的纯化的AAV产物。在示例性实施方案中，本公开的方法提供了其中至少70％或约70％的在起始材料(例如，细胞培养物)中发现的污染物已被去除的纯化的AAV产物。在示例性实施方案中，本公开的方法提供了其中至少80％或约80％的在起始材料(例如，细胞培养物)中发现的污染物已被去除的纯化的AAV产物。在示例性实施方案中，本公开的方法提供了其中至少90％或约90％的在起始材料(例如，细胞培养物)中发现的污染物已被去除的纯化的AAV产物。

在某些实施方案中，通过本公开的方法生产的AAV产物适于给人施用。在某些实施方案中，AAV是重组AAV(rAAV)。在某些实施方案中，通过本公开的方法生产的AAV产物是无菌的和/或具有良好制造规范(GMP)级别。在某些实施方案中，通过本公开的方法生产的AAV产物符合美国药典第1046章或欧洲药典关于基因治疗药物产品的要求，或者符合美国食品和药物管理局(USFDA)或欧洲药品管理局(EMA)的要求。

另外，由本文所述方法生产的AAV产物具有很强的效力。AAV产物(例如AAV8或AAV9产物)的效力可以用以下术语来描述：(1)体内生物效能(例如，小鼠中活性蛋白的产生)，其以每mL小鼠血浆的单位(FIX或FVIII)给出；或(2)体外生物效能。体外生物效能测试测量AAV载体感染表达目标蛋白质并将其分泌到培养基中的细胞(例如，HepG2细胞)的潜力，并通过ELISA技术和/或酶活性测定量。测量体内和体外生物效能的合适方法是本领域已知的，并且也本文中进行了描述。

在另外的实施方案中，由本文所述方法生产的AAV产物显示出优异的比活性。AAV的“比活性”用qPCR与μg AAV8的比率来表示。在示例性实施方案中，由本文所述方法生产的AAV产物显示了每μgAAV的载体基因组的优异比率，证明了AAV产物具有大量的“完整”病毒颗粒。在某些实施方案中，本公开的方法包括通过AAV特异性ELISA测试AAV级分。在某些实施方案中，AAV特异性ELISA足以提供关于AAV级分的效力的代表性读数，因为AAV级分中的大多数衣壳是完整衣壳。

rAAV颗粒的来源

关于本公开的方法，AAV可以是任何AAV血清型。在一些实施方案中，通过本文所述的方法纯化的AAV是AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、AAV10血清型、AAV11血清型、AAV12血清型、AAV13血清型、AAAV血清型、BAAV血清型、AAV(VR-195)血清型和AAV(VR-355)血清型。在某些实施方案中，AAV是野生型。在某些实施方案中，对AAV进行遗传工程改造和/或化学修饰。在某些实施方案中，AAV包含经修饰的衣壳，例如经遗传工程改造或化学修饰的AAV衣壳。在某些实施方案中，通过本文所述方法纯化的AAV颗粒是AAV8血清型。

关于本发明的方法，在示例性方面，AAV级分是浓缩的AAV级分。在某些实施方案中，AAV级分包含至少1x 10¹⁰个AAV衣壳/mL、1x 10¹¹个AAV衣壳/mL或1x 10¹²个AAV衣壳/mL。在某些实施方案中，AAV级分包含至少1x 10¹²个AAV衣壳/mL。AAV衣壳可能包括空的AAV衣壳和完整的AAV衣壳。

在某些实施方案中，AAV级分代表由转染的宿主细胞产生的AAV级分。在某些实施方案中，AAV级分代表从包含用三重质粒系统转染的宿主细胞的细胞培养物中收获的上清液，其中所述系统的一个质粒包含目标基因或cDNA，一个质粒编码衣壳蛋白VP1、衣壳蛋白VP2和/或衣壳蛋白VP3。在某些实施方案中，VP1、VP2和/或VP3是AAV8VP1、AAV8 VP2和/或AAV8 VP3。在某些实施方案中，VP1、VP2和/或VP3是AAV9 VP1、AAV9 VP2和/或AAV9 VP3。用于rAAV生产目的的三重质粒转染是本领域已知的。参见，例如，Qu等人，2015,同上，以及Mizukami等人，"A Protocol for AAV vector production and purification.”博士学位论文，Division of Genetic Therapeutics,Center for Molecular Medicine,1998；和Kotin等人，Hum Mol Genet 20(R1):R2-R6(2011)。在某些实施方案中，转染可使用无机化合物，例如磷酸钙，或有机化合物，聚乙烯亚胺(PEI)，或非化学手段，例如电穿孔来进行。在某些实施方案中，宿主细胞是贴壁细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是悬浮细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是HEK293细胞或Sf9细胞。在某些实施方案中，细胞培养物包含不含血清和蛋白质的培养基。在某些实施方案中，培养基是化学成分确定的，并且不含动物来源的组分，例如水解产物。在某些实施方案中，包含rAAV颗粒的级分代表包含用三重质粒系统转染的HEK293细胞的级分。在某些实施方案中，美国临时申请第62/417,775号和国际申第请PCT/US2017/059967号中描述了包含rAAV颗粒的级分。

附加步骤

本公开的方法包括本文公开的步骤的任意组合，并且可以可选地与一个或多个附加步骤组合。因此，在示例性方面，本公开的方法还包括用本文所述的三重质粒系统转染宿主细胞的步骤。在示例性方面，本公开的方法包括从细胞培养物中收获上清液，所述细胞培养物包含用三重质粒系统转染的宿主细胞，例如HEK293细胞。在示例性方面，转染和收获步骤在本文所述的超速离心步骤之前进行。

本公开的方法可包括另外的其它附加步骤，所述步骤可进一步提高AAV的纯度并去除其它不想要的成分和/或浓缩级分和/或为后续步骤调节级分。附加步骤可以在上述超速离心步骤之前或之后进行。

在示例性方面，所述方法包括深度过滤步骤。在示例性方面，所述方法包括使用过滤器(其包含纤维素和硅藻土并具有约500L/m²的最小渗透度)对转染的HEK293细胞培养物上清液的级分进行深度过滤。在示例性方面，所述方法还包括使用最小孔径为约0.2μm的过滤器。在示例性方面，深度过滤之后是通过最小孔径为约0.2μm的过滤器进行的过滤。在示例性方面，洗涤深度过滤器和最小孔径为约0.2μm的过滤器之一或两者，并收集洗涤物。在示例性方面，将洗涤物合并在一起，并与深度过滤和利用最小孔径为约0.2μm的过滤器过滤后获得的滤液组合。

在示例性方面，本公开的方法包括一个或多个色谱步骤。在示例性方面，所述方法包括负色谱步骤，由此不想要的组分与色谱树脂结合，并且所需的AAV不与色谱树脂结合。在示例性方面，所述方法包括负阴离子交换(AEX)色谱步骤，或以“非结合模式”进行的AEX色谱步骤。实施例2描述了这样的步骤。“非结合模式”的有利方面包括该程序的进行和后续测定的进行相对容易。

因此，在示例性实施方案中，纯化AAV粒子的方法包括在允许AAV流动通过AEX色谱柱或膜的条件下，通过将包含AAV颗粒的级分施加到AEX色谱柱或膜来对所述级分进行负阴离子交换(AEX)色谱，以及收集AAV颗粒。在示例性方面，将所述级分施加到具有装载缓冲液的AEX色谱柱或膜，所述装载缓冲液包含约100mM至约150mM的盐，例如NaCl，任选地，其中所述装载缓冲液的pH为约8至约9。在示例性方面，所述装载缓冲液包含约115mM至约130mM的盐，例如NaCl，任选地，其中所述装载缓冲液包含约120mM至约125mM的盐，例如NaCl。在示例性方面，负AEX步骤在本文所述的超速离心步骤之前进行。

在示例性方面，本公开的方法包括使用超滤/渗滤系统浓缩AAV级分。在示例性方面，本公开的方法包括一个或多个切向流过滤(TFF)步骤。在示例性方面，AAV级分经历超滤/渗滤。在示例性方面，在包括进行负AEX色谱的步骤之前，在包括进行负AEX色谱的步骤之后，或者在包括进行负AEX色谱之前和之后，用超滤/渗滤系统浓缩AAV级分。在示例性方面，TFF步骤在本文所述的超速离心步骤之前进行。

在示例性方面，本公开的方法包括过滤包含rAAV颗粒的级分，以去除该级分中具有比rAAV颗粒大的尺寸的病毒。

在示例性方面，本公开的方法包括一个或多个质量控制步骤，例如，测量在工艺的一个或多个步骤之后(例如，在每个步骤之后)获得的AAV级分的效力或比活性的步骤。在示例性方面，本公开的方法包括对AAV特异的ELISA。在示例性方面，ELISA是夹心ELISA。在示例性方面，夹心ELISA包含对AAV表位特异的抗体。在示例性方面，AAV表位是存在于组装的AAV衣壳上的构象表位。如本文所论述的，ELISA可代替qPCR作为测定AAV级分的效力的方法。在示例性方面，本公开的方法包括通过AAV特异性ELISA测试AAV级分，并且所述方法不包括通过定量PCR测量效力的方法。在示例性方面，AAV特异性ELISA足以提供关于AAV级分的效力的代表性读数，因为AAV级分中的大多数衣壳是完整衣壳。

在示例性方面，在本公开的一个或多个步骤之后，本公开的方法包括对AAV特异的ELISA。在示例性方面，本公开的方法包括通过AAV特异性ELISA测试深度过滤后获得的AAV级分，以测定该级分中AAV的比活性。在示例性方面，本公开的方法包括通过AAV特异性ELISA，测试在使用超滤/渗滤系统浓缩AAV级分后获得的AAV级分，以测定该级分中AAV的比活性。在示例性方面，本公开的方法包括通过AAV特异性ELISA测试切向流过滤(TFF)步骤后获得的AAV级分，以测定该级分中AAV的比活性。在示例性方面，本公开的方法包括通过AAV特异性ELISA测试负阴离子交换(AEX)色谱后获得的AAV级分，以测定该级分中AAV的比活性。在示例性方面，本公开的方法包括通过AAV特异性ELISA测试在精细纯化(polish)步骤后获得的AAV级分，以测定该级分中AAV的比活性。

本文还提供了通过本公开的方法生产的AAV产物。在示例性方面，AAV产物包含由约1000L起始材料(例如，细胞培养物)产生的至少约10¹²个病毒颗粒(vp)，或由约1000L起始材料(例如，细胞培养物)产生的至少约10¹³个病毒颗粒(vp)。在示例性方面，AAV产物是通过在无转基因质粒的情况下转染rep-cap和Ad辅助质粒产生的空衣壳。纯化的空质粒可用于从患者血液中耗尽或去除对AAV抗原特异的抗体。

在示例性方面，本公开的AAV产物是高纯度的、高效力的并且适于人临床使用。在示例性方面，AAV产物包括同质群体和高纯度的AAV颗粒。在示例性方面，AAV产物包含全长载体DNA。在示例性实施方案中，AAV产物基本上不含不想要的污染物，包括但不限于含有截短或不完整载体DNA的AAV颗粒、具有不完全的蛋白质组成和寡聚化结构的AAV颗粒，或污染性病毒，例如非AAV病毒、脂质包膜病毒。在示例性实施方案中，AAV产物含有大量相关蛋白质的编码cDNA。在示例性方面，本公开的AAV产物适于向人施用。在示例性方面，AAV产物是无菌的和/或具有良好制造规范(GMP)级别。在示例性方面，所述AAV产物符合美国药典第1046章或欧洲药典关于基因治疗药物产品的要求，或者符合美国食品和药物管理局(USFDA)或欧洲药品管理局(EMA)的要求。在示例性方面，AAV产物是用于直接向人施用而几乎无需或无需加工或处理的即用型产品。

给出以下实施例仅仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

以下实施例描述了用三重质粒系统转染HEK293细胞系以产生包含编码相关蛋白质的核酸的rAAV颗粒的示例性方法。

将贴壁的HEK293细胞在悬浮条件下于商购可得的培养基中生长，所述培养基是化学成分确定的，并且不含动物来源的成分、蛋白质和血清，例如如PCT/US2017/059967的段落[00146]–[00150]中所述的。用以下三种质粒转染细胞：(1)辅助质粒，其提供生产性AAV感染所必需的辅助病毒功能，(2)repcap-质粒，其携带关于病毒衣壳生成、复制和包装的所有信息，和(3)包含相关基因(GOI)的质粒，其被包装到所得的rAAV颗粒中。在转染后3-5天的时期内，携带相关基因的rAAV颗粒存在于HEK293细胞系中。

例如，如PCT/US2017/059967的段落[00151]–[00155]、表1和表2中所述，收获转染的HEK293细胞培养物的上清液。例如，如PCT/US2017/059967的段落[00156]–[00160]段、表3和表4所述，对收获的上清液进行浓缩和调节(渗滤)。例如，如PCT/US2017/059967的段落[00161]-[00165]和表5所述，对渗滤的浓缩物进行负色谱。

实施例2

在用含有相关蛋白质和AAV8-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV8。将澄清的无细胞培养物上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下(即在包含125mM NaCl和50mM TrisHCl，pH 8.5的溶液中)装载到膜吸附器(MustangQ；Pall部件号XT140MSTGQP05)上。通过用25％的HCl将含AAV8的流出物调节至在7.4与7.8之间的pH范围来获得pH调节后的装载物。

进行了以下测试程序。首先，将包含POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8亲和基质(目录号195338010；Thermo Fisher)的ID为32mm，床高为59mm，体积为47.45ml的柱用至少5倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH7.4进行平衡。将pH调节后的装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8亲和基质(目录号195338010；Thermo Fisher)的柱上。然后用五倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4(任选的第四缓冲液)对柱进行再平衡。

然后用五倍柱体积的洗涤物1(W1):100mM的乙酸钠和0.1％的Tween80，pH 6.0洗涤该柱。然后用五倍柱体积的洗涤2(W2):50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用五倍柱体积的洗涤物3(W3):50mM TrisHCl和50％的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。

通过将五倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上进行洗脱：50mM TrisHCl、50％的乙二醇和750mM NaCl，pH 8.0。然后将五倍柱体积的下列第二洗脱缓冲液施加到柱上：50mM TrisHCl、50％的乙二醇和2000mM NaCl。

上述步骤的线性流速均为60cm/h。

进行了以下比较程序。将包含POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8亲和基质(目录号195338010；Thermo Fisher)的ID为10mm，床高为2.5mm，体积为1.96ml的柱用至少10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4进行平衡。将pH调节后的装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8亲和基质(目录号195338010；Thermo Fisher)的柱上。然后用10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH7.4对该柱进行再平衡。

使用以下TBS缓冲液进行洗涤步骤：20mM TrisHCl/150mM NaCl/pH 7.4。作为替代，用10倍柱体积的pH为3.0的100mM的柠檬酸钠进行洗脱。

表2中更详细地描述了上述测试和比较程序，其中“CV”表示在该步骤中加入的溶液的柱体积数。

表2：

使用表3中以重量/体积所示的数据进行以下测定。在振荡U型管密度计DMA 4500M(Anton Paar)上测量洗脱缓冲液的密度。

用ELISA测量AAV8抗原的量。用AAV-8滴定ELISA试剂盒(物品号PRAAV8；Progen(Heidelberg,Germany)在TECAN机器人系统上进行ELISA。简言之，将对组装的AAV8衣壳(ADK8)上的构象表位特异的单克隆抗体包被到微量滴定条上，并用于从AAV级分中捕获AAV8颗粒。通过两个步骤检测捕获的AAV8颗粒。在第一步骤中，将对ADK8抗体特异的缀合有生物素的单克隆抗体与(ADK8和ADK8抗体的)免疫复合物结合。将链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物添加到与缀合有生物素的单克隆抗体结合的免疫复合物中，所述链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物与生物素反应。加入过氧化物酶底物溶液，并发生与结合的AAV颗粒量成比例的颜色反应。在450nm处用光度测量法测量颜色反应。

使用ITR-qPCR测定，通过对在编码相关基因(例如，人因子VIII或人因子IX)的载体中发现的反向串联重复序列进行定量来测定基因组拷贝滴度。HEK-HCP是通过ELISA对残留的宿主细胞蛋白质的测量。通过比色活性测定法测定LDH。

AAV8配体渗漏ELISA(酶联免疫吸附测定)被设计成用于检测1ng/mL AAV8亲和配体，所述配体可能存在于用POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8亲和介质纯化的产物中，所述介质含有AAV8亲和配体作为捕获剂。AAV8配体渗漏ELISA可用作帮助最佳纯化工艺的开发和过程流(in-process stream)及最终产品的常规质量控制的工具。

“配体渗漏ELISA/AAV8-抗原”的量反映了计算为配体的纳克数/微克的AAV8的“配体渗漏ELISA”与“AAV8抗原”的比率。

在体外生物效能测定中，病毒载体AAV8感染肝靶细胞系，所述细胞系随后向培养基中分泌功能性、可测量的编码的蛋白质。在第一步骤中，通过AAV8感染转导HepG2靶细胞。在孵育期间，编码的蛋白质被释放到细胞上清液中。在第二步骤中，通过活性测定法直接测量进入细胞培养物上清液中的编码的蛋白质的活性。AAV8样品的测量以相对于参考材料的百分比给出。所述方法允许定量评估AAV8基因治疗载体的生物功能。

表3：

测试程序的ITR-qPCR的步骤产率为105.3％，而比较程序的步骤产率为71.2％。测试程序的体外生物效能为0.45，而比较程序的体外生物效能为0.33。

还利用表4中以重量/重量显示的数据进行了所述测定。

表4.

用于测试程序的ITR-qPCR的步骤产率为127.4％，而比较程序的步骤产率为72.4％。产率和纯度的提高，加上不必使用会降低AAV8感染性和生物效能的极端条件是令人惊讶的。同样地，令人惊讶的是，测试程序除去了大部分杂质而又没有从亲和配体上洗脱出产物，尤其是在存在明显更大的产物与杂质(纯化前存在的)的非特异性结合和复合物的条件下。

当使用具有洗涤步骤的测试程序而非比较程序时，进行SDS-PAGE分析以确定热激蛋白70kDa(HSP70)是否减少。使用以1:2000稀释的作为一抗的抗Hsp70抗体(Abcam，目录号ab79852)(持续2小时)和以1:1000稀释的作为二抗的山羊抗兔IgG(H+L)AP缀合物(Sigma，目录号A8025)(持续1小时)进行蛋白质印迹。结果如图1所示。在比较泳道4(测试程序)与泳道6(比较程序)时，利用测试程序观察到HSP70的显著减少。泳道2显示20ng的HSP70，泳道4显示4ng的HSP70。

进行SDS-PAGE银染测定以确定存在的杂质的总体水平。结果如图2所示。泳道2代表AAV8参考，并显示3个特征条带。根据测试程序和比较程序纯化洗脱物(190μg/ml)。在泳道4中显示测试程序的结果。在泳道6中显示比较程序的结果。对于比较程序观察到的杂质显著多于对于测试程序观察到的杂质。

用12％的抗AAV抗体进行蛋白质印迹，以测定根据测试和比较程序纯化后回收的AAV8的水平和纯度。用针对AAV的VP1、VP2和VP3的单克隆抗体作为一抗，用山羊抗小鼠ALP抗体(Sigma，目录号A4656)作为二抗进行蛋白质印迹。结果如图3所示。泳道2显示了AAV参考(130ng，对应于60μg/ml)，其中VP1、VP2和VP3各有3个条带。泳道4显示了根据测试程序的洗脱物(190μg/ml AAV8抗原)，泳道6显示了根据比较程序的洗脱物。根据蛋白质印迹，与比较程序相比，测试程序的产率更高。

进行LC-MS(rp-HPLC-UV-ESI-MS/MS)以确定各种宿主细胞杂质的身份和量。使用胰蛋白酶消化样品。使用RP柱(ZORBAX 300SB-C18柱，0.5x150mm,3.5μm)在HPLC系统上分离所得肽混合物，随后，在Q-Exactive HF质谱仪上分析肽。使用软件Proteome Discoverer分析数据以鉴定样品中的蛋白质。

将Agilent HPLC1209(1200capHPLC)与LC 3D系统(修订版B.04.03-SP2(105))的ChemStation一起使用。所述HPLC法为PEPMAP_CAP_170.M。洗脱剂A为0.1％(v/v)的于去离子水中的HCOOH，洗脱剂B为0.08％(v/v)的于乙腈中的HCOOH。下表5中提供了关于HPLC的详细信息：

表5：

下表6中提供了关于MS的详细信息：

表6：

进行了3种不同的纯化模式。一个包括本实施例的比较程序，另一个包括本实施例的测试程序(其包括在亲和纯化前通过MustangQ进行的阴离子交换纯化)，第三个根据测试程序进行，但没有通过MustangQ进行阴离子交换纯化。下表7概述了总体结果。

表7：

在上表中，纯度反映了相对于所有蛋白质的总AUC的与AAV8衣壳相关的曲线下面积(AUC)百分比。

下表8-10列出了比较程序(表8)、事先进行阴离子交换的测试程序(表9)和事先未进行阴离子交换的测试程序(表10)的每种蛋白质的AUC值和通过LC/MS鉴定的肽的数量。

表8：比较程序

表9：事先进行阴离子交换的测试程序

表10：事先未进行阴离子交换的测试程序

利用与事先阴离子交换偶联的测试程序检测到的蛋白质最少。如果没有阴离子交换，纯度会降低，检测到的蛋白质数量增加。对于比较程序观察到检测到的蛋白质的纯度最低并且数量最多。

实施例3

在用含有相关蛋白质和AAV8-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV8。将澄清的无细胞培养物上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。未用25％的HCl将所获得的含AAV8的流出物的pH调节至在7.4与7.8之间的pH范围。作为替代，通过在包含125mM NaCl和50mM TrisHCl，pH 8.5的装载缓冲液中使含AAV-8的流出物复原来形成装载物。

除了不必包括pH调节步骤的固有有利方面以外，具有pH 8.5允许提高亲和力性能的鲁棒性，并防止杂质与产物或树脂的非特异性结合。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV8。所述测定表明在各洗涤步骤中损失了多少AAV8。进行了以下测试程序。首先，将包含POROS^TMCaptureSelect^TM AAV8亲和基质(目录号195338010，Thermo Fisher)的ID为10mm，床高为25mm，体积为1.96ml的柱用至少5倍柱体积的20mM的TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4进行平衡。将装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8亲和基质(目录号195338010，Thermo Fisher)的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。然后用10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH7.4对该柱进行再平衡。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物1(W1)：100mM的乙酸钠和0.1％的Tween80，pH 6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl和50％的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。从W1、W2和W3中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

通过将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上进行洗脱：50mM TrisHCl,50％的乙二醇和750mM NaCl，pH 8.0。

表11中更详细地描述了上述测试程序。

表11：

通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP的ELISA中的每一种测定所获取的样品，以评估产率和步骤中是否可能发生了损失。表12显示了在表11中列出的洗涤、洗脱和洗脱后步骤的所有级分中通过ITR qPCR测定的AAV8的分布。

表12：

下表13显示了在表11中列出的洗涤、洗脱和洗脱后步骤的所有级分中通过ELISA测定的AAV8的分布。

表13：

下表14显示了仅在装载和洗脱步骤中通过ELISA测定存在的HEK 293HCP的量的测定结果。

表14：

图6中显示了与表12-14中的数据相关的色谱图。

还通过SDS-PAGE和12％银染测定上述样品以检测总蛋白质。结果如图4所示，其中该图中显示了每条泳道的标签。AAV8条带在洗脱物(E)和50％的洗脱物稀释(E2)泳道中清晰可见。在洗涤条带流出物样品(W1、W2和W3)和反萃取(S)流出物样品中几乎看不到AAV8。因此，所述方法高效地去除了AAV8，而在洗涤过程中没有显著损失，或者洗脱后AAV8保留在柱上。

然后通过SDS-PAGE和针对AAV抗原的蛋白质印迹测定样品。一抗为针对AAV的VP1、VP2和VP3的单克隆抗体，而二抗为与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体。结果如图5所示，每个泳道使用与图4相同的标签。AAV8在洗涤和反萃取步骤中的损失最小。

实施例4

在用含有相关蛋白和AAV9-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV9。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下(即在包含125mM NaCl和50mM TrisHCl，pH8.5的溶液中)装载到膜吸附器(MustangQ；Pall部件号XT140MSTGQP05)上。通过用25％的HCl将含AAV9的流出物调节至在7.4与7.8之间的pH范围，可获得pH调节后的装载物。

进行了以下测试程序。首先，将包含POROS^TM CaptureSelect^TM AAV9亲和基质(目录号A27354；Thermo Fisher)的ID为32mm，床高为59mm，积为47.45ml的柱用至少五倍柱体积20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4进行平衡。将pH调节后的装载物施加到包含POROS^TMCaptureSelect^TM AAV9亲和树脂(目录号A27354；Thermo Fisher)的柱上。然后用五倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4(任选的第四缓冲液)对柱进行再平衡。

然后用五倍柱体积的洗涤物1(W1)：100mM的乙酸钠和0.1％的Tween80，pH 6.0洗涤该柱。然后用五倍柱体积的洗涤物2(W2)：50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用五倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl和50％的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。

通过将五倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上来进行洗脱：50mM TrisHCl,50％的乙二醇和750mM NaCl，pH 8.0。然后将五倍柱体积的以下第二洗脱缓冲液加到该柱：50mM TrisHCl,50％的乙二醇和2000mM NaCl。

上述步骤的线性流速均为60cm/h。

进行了以下比较程序。将包含POROS^TM CaptureSelect^TM AAV9亲和树脂(目录号A27354；Thermo Fisher)的ID为10mm，床高为2.5mm，体积为1.96ml的柱用至少10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4进行平衡。将pH调节后的装载物施加到包含POROS^TMCaptureSelect^TM AAV9亲和树脂(目录号A27354；Thermo Fisher)的柱上。然后用10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4对该柱进行再平衡。

使用以下TBS缓冲液进行洗涤步骤：20mM TrisHCl/150mM NaCl/pH 7.4。作为替代，用10倍柱体积的100mM的柠檬酸钠，pH 3.0进行洗脱。

表15中更详细地描述了上述测试和比较程序，其中“CV”指示在该步骤中加入的溶液的柱体积数。

表15：

在所有缓冲液中，50％的乙二醇重量/重量(w/w)

在振荡U型管密度计DMA 4500M(Anton Paar)上测量洗脱缓冲液的密度。

用ELISA测量AAV9抗原的量。用AAV-9滴定ELISA试剂盒(物品号PRAAV9；Progen(Heidelberg,Germany)在TECAN机器人系统上进行ELISA。简言之，将对组装的AAV9衣壳(ADK9)上的构象表位特异的单克隆抗体包被到微量滴定条上，并用于从AAV级分中捕获AAV9颗粒。通过两个步骤检测捕获的AAV9颗粒。在第一步骤中，将对ADK9抗体特异的缀合有生物素的单克隆抗体与(ADK9和ADK9抗体的)免疫复合物结合。将链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物添加到与缀合有生物素的单克隆抗体结合的免疫复合物中，所述链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物与生物素反应。加入过氧化物酶底物溶液，并发生与结合的AAV颗粒量成比例的颜色反应。在450nm处用光度测量法测量颜色反应。

使用ITR-qPCR测定，通过对在编码相关基因(例如，人因子VIII或人因子IX)的载体中发现的反向串联重复序列进行定量来测定基因组拷贝滴度。HEK-HCP是通过ELISA对残留的宿主细胞蛋白质的测量。通过比色活性测定法测定LDH。

AAV9配体渗漏ELISA(酶联免疫吸附测定)可检测1ng/mL AAV9亲和配体，所述配体可能存在于用POROS^TM CaptureSelect^TM AAV9亲和介质纯化的产物中，所述介质含有AAV9亲和配体作为捕获剂。AAV9配体渗漏ELISA可用作帮助最佳纯化工艺的开发和过程流及最终产品的常规质量控制的工具。“配体渗漏ELISA/AAV9-抗原”的量反映了计算为配体的纳克数/微克的AAV9的“配体渗漏ELISA”与“AAV9抗原”的比率。

在体外生物效能测定中，病毒载体AAV9感染肝靶细胞系，所述细胞系随后向培养基中分泌功能性、可测量的编码的蛋白质。在第一步骤中，通过AAV9感染转导HepG2靶细胞。在孵育期间，编码的蛋白质被释放到细胞上清液中。在第二步骤中，通过活性测定法直接测量进入细胞培养物上清液中的编码的蛋白质的活性。AAV9样品的测量以相对于参考材料的百分比给出。所述方法允许定量评估AAV9基因治疗载体的生物功能。

当使用具有洗涤步骤的测试程序而非比较程序时，进行SDS-PAGE分析以确定热激蛋白70kDa(HSP70)是否减少。使用以1:2000稀释的作为一抗的抗Hsp70抗体(Abcam，目录号ab79852)(持续2小时)和以1:1000稀释的作为二抗的山羊抗兔igG(H+L)AP缀合物(Sigma，目录号A8025)(持续1小时)进行蛋白质印迹。

进行SDS-PAGE银染测定以确定存在的杂质的总体水平。

用12％的抗AAV抗体进行蛋白质印迹，以测定根据测试和比较程序纯化后回收的AAV9的水平和纯度。用针对AAV9的VP1、VP2和VP3的单克隆抗体作为一抗，用山羊抗小鼠ALP抗体(Sigma，目录号A4656)作为二抗进行蛋白质印迹。

进行LC-MS(rp-HPLC-UV-ESI-MS/MS)以确定各种宿主细胞杂质的身份和量。使用胰蛋白酶消化样品。使用RP柱(ZORBAX 300SB-C18柱，0.5x150mm,3.5μm)在HPLC系统上分离所得肽混合物，随后，在Q-Exactive HF质谱仪上分析肽。使用软件Proteome Discoverer分析数据以鉴定样品中的蛋白质。

将Agilent HPLC1209(1200capHPLC)与LC 3D系统(修订版B.04.03-SP2(105))的ChemStation一起使用。所述HPLC为PEPMAP_CAP_170.M。洗脱剂A为于去离子水中的0.1％(v/v)的HCOOH，洗脱剂B为于乙腈中的0.08％(v/v)的HCOOH。下表16中提供了关于HPLC的详细信息：

表16：

下表17中提供了关于MS的详细信息：

表17：

进行了3种不同的纯化模式。一个模式包括本实施例的比较程序，另一个模式包括本实施例的测试程序(其包括在亲和纯化前通过MustangQ进行的阴离子交换纯化)，第三个模式根据测试程序进行，但没有通过MustangQ进行阴离子交换纯化。

实施例5

在用含有相关蛋白和AAV9-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV9。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。未用25％的HCl将所获得的含AAV9的流出物的pH调节至在7.4与7.8之间的pH范围。作为替代，通过在pH为8.5的包含125mM NaCl和50mM的TrisHCl的装载缓冲液中重建含AAV-8的流出物来形成装载物。

除了不必包括pH调节步骤的固有有利方面以外，具有pH 8.5能够允许提高亲和力性能的鲁棒性，并防止杂质与产物或树脂的非特异性结合。

在不同的点从不同的洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV9。该测定表明在不同的洗涤步骤中损失了多少AAV9。进行了以下测试程序。首先，将包含POROS^TM CaptureSelect^TM AAV9亲和基质(目录号A27354；Thermo Fisher)的ID为10mm，床高为25mm，积为1.96ml的柱用至少五倍柱体积20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4进行平衡。将装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAV9亲和基质(目录号A27354；ThermoFisher)的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。然后用10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mMNaCl，pH 7.4对该柱进行再平衡。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物1(W1)：100mM的乙酸钠和0.1％的Tween80，pH 6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl和50％的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。从W1、W2和W3中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

通过将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上进行洗脱：50mM TrisHCl,50％的乙二醇和750mM NaCl，pH 8.0。

表18中更详细地描述了上述测试程序。

表18：

通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP的ELISA中的每一种测定所获取的样品，以评估产率和步骤中是否可能发生了损失。

还通过SDS-PAGE和12％银染测定上述样品以检测总蛋白质。

然后通过SDS-PAGE和针对AAV9抗原的蛋白质印迹测定样品。一抗为针对AAV9的VP1、VP2和VP3的单克隆抗体，而二抗为与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体。

实施例6

在用含有相关蛋白和AAV9-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV9。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下(即在包含125mM NaCl和50mM TrisHCl，pH8.5的溶液中)装载到膜吸附器(MustangQ；Pall部件号XT140MSTGQP05)上。通过用25％的HCl将含AAV9的流出物调节至在7.4与7.8之间的pH范围，可获得pH调节后的装载物。

进行了以下测试程序。首先，将含有固定在树脂(“ADK8/9亲和树脂”)上的抗完整AAV8/9抗体(目录号03-651161，American Research Products,Inc.,Waltham,MA)的ID为32mm，床高为59mm，体积为47.45ml的柱用至少5倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH7.4进行平衡。向含有ADK8/9亲和树脂的柱上施加pH调节后的装载物。然后用五倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4(任选的第四缓冲液)对柱进行再平衡。

然后用五倍柱体积的洗涤物1(W1)：100mM的乙酸钠和0.1％的Tween80，pH 6.0洗涤该柱。然后用五倍柱体积的洗涤物2(W2)：50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用五倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl和50％的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。

通过将五倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上来进行洗脱：50mM TrisHCl,50％的乙二醇和750mM NaCl，pH 8.0。然后将五倍柱体积的以下第二洗脱缓冲液加到该柱：50mM TrisHCl,50％的乙二醇和2000mM NaCl。

上述步骤的线性流速均为60cm/h。

进行了以下比较程序。将含有ADK8/9亲和树脂的ID为10mm，床高为2.5mm以及体积为1.96ml的柱用至少10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4进行平衡。向含有ADK8/9亲和树脂的柱上施加pH调节后的装载物。然后用10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4对该柱进行再平衡。

使用以下TBS缓冲液进行洗涤步骤：20mM TrisHCl/150mM NaCl/pH 7.4。作为替代，用10倍柱体积的100mM的柠檬酸钠，pH3.0进行洗脱。

表1中更详细地描述了上述测试和比较程序，其中“CV”指示在该步骤中加入的溶液的柱体积数。

在振荡U型管密度计DMA 4500M(Anton Paar)上测量洗脱缓冲液的密度。

用ELISA测量AAV9抗原的量。用AAV-9滴定ELISA试剂盒(物品号PRAAV9；Progen(Heidelberg,Germany)在TECAN机器人系统上进行ELISA。简言之，将对AAV9衣壳特异的单克隆抗体(AAV8/9抗体(“ADK8/9抗体”，目录号03-651161，American Research Products,Inc.,Waltham,MA))包被到微量滴定条上，并用于从AAV级分中捕获AAV9颗粒。通过两个步骤检测捕获的AAV9颗粒。在第一步骤中，对ADK8/9抗体特异的缀合有生物素的单克隆抗体与(ADK8/9和ADK8/9抗体的)免疫复合物结合。将链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物添加到与缀合有生物素的单克隆抗体结合的免疫复合物中，所述链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物与生物素反应。加入过氧化物酶底物溶液，并发生与结合的AAV颗粒量成比例的颜色反应。在450nm处用光度测量法测量颜色反应。

使用ITR-qPCR测定，通过对在编码相关基因(例如，人因子VIII或人因子IX)的载体中发现的反向串联重复序列进行定量来测定基因组拷贝滴度。HEK-HCP是通过ELISA对残留的宿主细胞蛋白质的测量。通过比色活性测定法测定LDH。

AAV8/9配体渗漏ELISA(酶联免疫吸附测定)可检测可能存在于用ADK8/9亲和树脂纯化的产物中的亲和配体。

在体外生物效能测定中，病毒载体AAV9感染肝靶细胞系，所述细胞系随后向培养基中分泌功能性、可测量的编码的蛋白质。在第一步骤中，通过AAV9感染转导HepG2靶细胞。在孵育期间，编码的蛋白质被释放到细胞上清液中。在第二步骤中，通过活性测定直接测量进入细胞培养物上清液中的编码的蛋白质的活性。AAV9样品的测量以相对于参考材料的百分比给出。所述方法允许定量评估AAV9基因治疗载体的生物功能。

当使用具有洗涤步骤的测试程序而非比较程序时，进行SDS-PAGE分析以确定热激蛋白70kDa(HSP70)是否减少。使用以1:2000稀释的作为一抗的抗Hsp70抗体(Abcam，目录号ab79852)(持续2小时)和以1:1000稀释的作为二抗的山羊抗兔igG(H+L)AP缀合物(Sigma，目录号A8025)(持续1小时)进行蛋白质印迹。

进行SDS-PAGE银染测定以确定存在的杂质的总体水平。

用12％的抗AAV抗体进行蛋白质印迹，以测定根据测试和比较程序纯化后回收的AAV9的水平和纯度。用针对AAV9的VP1、VP2和VP3的单克隆抗体作为一抗，用山羊抗小鼠ALP抗体(Sigma，目录号A4656)作为二抗进行蛋白质印迹。

进行LC-MS(rp-HPLC-UV-ESI-MS/MS)以确定各种宿主细胞杂质的身份和量。使用胰蛋白酶消化样品。使用RP柱(ZORBAX 300SB-C18柱，0.5x150mm,3.5μm)在HPLC系统上分离所得肽混合物，随后，在Q-Exactive HF质谱仪上分析肽。使用软件Proteome Discoverer分析数据以鉴定样品中的蛋白质。

将Agilent HPLC1209(1200capHPLC)与LC 3D系统(修订版B.04.03-SP2(105))的ChemStation一起使用。所述HPLC为PEPMAP_CAP_170.M。洗脱剂A为于去离子水中的0.1％(v/v)的HCOOH，洗脱剂B为于乙腈中的0.08％(v/v)的HCOOH。下表19中提供了关于HPLC的详细信息：

表19：

下表20中提供了关于MS的详细信息：

表20：

进行了3种不同的纯化模式。一个模式包括本实施例的比较程序，另一个模式包括本实施例的测试程序(其包括在亲和纯化前通过MustangQ进行的阴离子交换纯化)，第三个模式根据测试程序进行，但没有通过MustangQ进行阴离子交换纯化。

实施例7

在用含有相关蛋白和AAV9-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV9。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒100kDa进行渗滤。将病毒颗粒在非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。未用25％的HCl将所获得的含AAV9的流出物的pH调节至在7.4与7.8之间的pH范围。作为替代，通过在包含125mM NaCl和50mM TrisHCl，pH 8.5的装载缓冲液中重建含AAV9的流出物来形成装载物。

除了不必包括pH调节步骤的固有有利方面以外，具有pH 8.5能够允许提高亲和力性能的鲁棒性，并防止杂质与产物或树脂的非特异性结合。

在不同的点从不同的洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV9。该测定表明在不同的洗涤步骤中损失了多少AAV9。进行了以下测试程序。首先，用至少5倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4平衡含有ADK8/9亲和树脂的ID为10mm，床高为25mm以及体积为1.96ml的柱。向含有ADK8/9亲和树脂的柱上施加pH调节后的装载物。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。然后用10倍柱体积的20mM TrisHCl和150mM NaCl，pH 7.4对该柱进行再平衡。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物1(W1)：100mM的乙酸钠和0.1％的Tween80，pH 6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl和50％的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。从W1、W2和W3中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

通过将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上进行洗脱：50mM TrisHCl,50％的乙二醇和750mM NaCl，pH 8.0。

表21中更详细地描述了上述测试程序。

表21：

通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP的ELISA中的每一种测定所获取的样品，以评估产率和步骤中是否可能发生了损失。

还通过SDS-PAGE和12％银染测定上述样品以检测总蛋白质。

然后通过SDS-PAGE和针对AAV9抗原的蛋白质印迹测定样品。一抗为针对AAV9的VP1、VP2和VP3的单克隆抗体，而二抗为与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体。

实施例8

用AAV-8滴定ELISA试剂盒(物品号PRAAV8；Progen(Heidelberg,Germany)在TECAN机器人系统上进行AAV8 ELISA。将对组装的AAV8衣壳(ADK8)上的构象表位特异的单克隆抗体涂覆到微量滴定条上，并用于从AAV级分中捕获AAV8颗粒。通过两个步骤检测捕获的AAV8颗粒。在第一步骤中，将对ADK8抗体特异的缀合有生物素的单克隆抗体与免疫复合物结合。将链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物添加到与缀合有生物素的单克隆抗体结合的免疫复合物中，所述链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物与生物素反应。加入过氧化物酶底物溶液，并发生与结合的AAV颗粒量成比例的颜色反应。在450nm处用光度测量法测量颜色反应。

实施例9

对于实施例中进行的ITR-qPCR测定，进行以下程序。使用基于TaqMan的qPCR，利用引物和荧光标记的探针测定载体基因组滴度(vg)/毫升(ml)，所述探针检测载体基因组的ITR序列内的序列。为了检测AAV颗粒中的ITR特异性序列，对样品进行了不同的处理。用DNA酶I处理样品，随后用蛋白酶K处理样品，使得从衣壳中释放出scAAV基因组。然后，进行限制性酶消化以解析AAV ITR T-形结构。

用单切割限制酶将用作参考材料的质粒线性化，然后从琼脂糖凝胶中进一步纯化。在UV分光光度计中3次测量凝胶提取的DNA的UV A260吸光度，以μg/ml为单位计算DNA浓度的平均值。

为了确定线性化标准质粒的拷贝数/ml，考虑到潜藏序列中每个单个核苷酸的精确质量，以克/mol为单位计算ds DNA的分子量。

通过线性回归的质粒标准曲线拟合来计算测试品中的载体基因组滴度(以载体基因组/mL为单位)。

实施例10

在用含有相关蛋白质和AAV8-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV8。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒300kDa进行渗滤。将病毒颗粒在针对AAV8的非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。用包含100mM的精氨酸，200mM NaCl，pH 8.0的稀释缓冲液稀释所获得的含AAV8的流出物，以制备用于AAV8-亲和基质的装载物。将含精氨酸的装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8亲和基质(Thermo Fisher，目录号A30793)的柱上。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV8。所述测定表明在各洗涤步骤中损失了多少AAV8。进行了以下测试程序。首先，用至少10倍柱体积的20mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5平衡含有ADK8/9亲和树脂的ID为10mm，床高为25mm以及体积为2.04ml的柱。将装载物施加至含有ADK8/9亲和树脂的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。然后用10倍柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5对柱进行再平衡(洗涤1，W1)。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤2(W2)：100mM的乙酸钠和0.1％的Tween80，pH 6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤3(W3)：50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤4(W4)：50mM TrisHCl和50％的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。从W2、W3和W4中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293HCP抗原的ELISA进行测定。

通过首先将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上来进行洗脱：50mMTrisHCl,60％(w/w)的乙二醇和750mM NaCl，pH 8.0。随后不进行洗涤步骤。通过接着将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上，继续进行洗脱：50mM TrisHCl、60％(w/w)的乙二醇和1000mM NaCl，pH 8.0。然后用20mM Tris HCl，pH 7.4洗涤该柱。然后，通过向柱施加10倍柱体积的包含100mM甘氨酸和200mM NaCl，pH 2.5的溶液来使柱再生。

表22中更详细地描述了上述测试程序。

表22：

实施例11

在用含有相关蛋白质和AAV8-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV8。通过使用Megatron MT3000(Pall)从30L收获等分试样中破碎细胞，随后在a)深度过滤器PDP8区域(0.5m²)、b)深度过滤器V100区域(0.5m²)和c)Kleenpak胶囊0.2μm区域(0.15m²)上过滤含有AAV8的溶液。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒300kDa进行渗滤。将病毒颗粒在针对AAV8的非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。用包含100mM的精氨酸、200mMNaCl，pH 8.0的稀释缓冲液将所获得的含有AAV8的流出物以1:2稀释，以制备用于AAV8-亲和基质的装载物。将含精氨酸的装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8亲和基质的柱(Thermo Fisher，目录号A30793；ID为10mm，床高为26mm，体积为2.04ml)上。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV8。所述测定表明在各洗涤步骤中损失了多少AAV8。进行了以下测试程序。首先，用至少10倍柱体积的50mM的精氨酸-HCl和100mM NaCl，pH 8.0平衡包含ADK8/9亲和树脂的ID为10mm，床高为25mm以及体积为2.04ml的柱。将装载物施加至含有ADK8/9亲和树脂的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。然后用10倍柱体积的50mM的精氨酸-HCl和100mM NaCl，pH 8.0对柱进行再平衡(洗涤1，W1)。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：100mM的MES-钠、10mM EDTA和11.2g/kg S/DII溶液(18.0g Tween 80、3.4g DMSO和3.6g TnBP)，pH 6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM的精氨酸-HCl和100mM NaCl，pH 8.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物4(W4)：50mM的精氨酸-HCl和50％的蔗糖，pH 8.5洗涤该柱。从W2、W3和W4中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

通过首先将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上来进行洗脱:50mM的精氨酸-HCl、55％(w/w)的蔗糖、2mM MgCl₂和800mM NaCl，pH 8.0。然后用10倍柱体积的洗液物5(W5)：50mM的精氨酸-HCl和100mM NaCl，pH 8.0洗涤该柱。通过接着将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上，继续进行洗脱：50mM的精氨酸-HCl、50％(v/v)的甘油和800mM NaCl，pH 8.0。然后用50mM的精氨酸-HCl和100mM NaCl，pH 8.0洗涤该柱。然后，通过向柱施加10倍柱体积的包含100mM的甘氨酸和200mM NaCl，pH 2.7的溶液来使柱再生。

表23中更详细地描述了上述测试程序。在所有步骤中均应用39cm/h的线性流速。

表23：

在上述装载步骤中，在Mustang Q柱中进行1:2稀释，以将装载物调节至接近平衡缓冲液的基质的条件。进行该步骤以研究缓冲物质对AAV8与配体结合的影响。任何新引入的化合物都能具有潜在的竞争性质和/或其潜在地能触发洗脱。

通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP的ELISA中的每一种测定所获取的样品，以评估产率和步骤中是否可能发生了损失。与上述实施例相关的色谱图如图7所示。下表24显示了在上述步骤中的每个步骤中获取的样品，其中每种组分的产率如表25所示。

表24：

“洗涤5”步骤减小了洗脱中的前置效应。

表25：

还通过SDS-PAGE和12％银染测定上述样品以检测总蛋白质。SDS-PAGE测定结果如图8所示。

实施例12

在用含有相关蛋白质和AAV8-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV8。通过使用Megatron MT3000(Pall)从30L收获等分试样中破碎细胞，随后在a)深度过滤器PDP8区域(0.5m²)、b)深度过滤器V100区域(0.5m²)和c)Kleenpak胶囊0.2μm区域(0.15m²)上过滤含有AAV8的溶液。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒300kDa进行渗滤。将病毒颗粒在针对AAV8的非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。将装载物施加到含有POROS^TMCaptureSelect^TM AAV8亲和基质的柱(Thermo Fisher,目录号A30793；ID为10mm，床高为26mm，体积为2.04ml)上。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV8。所述测定表明在各洗涤步骤中损失了多少AAV8。进行了以下测试程序。首先，用至少10倍柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5平衡含有ADK8/9亲和树脂的ID为10mm，床高为25mm以及体积为2.04ml的柱。将装载物施加至含有ADK8/9亲和树脂的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。然后用10倍柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5对柱进行再平衡(洗涤1，W1)。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：100mM的牛磺酸，125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：100mM的甘氨酸，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物4(W4)：50mM的牛磺酸,50％(w/w)的乙二醇，0.1％的辛基吡喃葡糖苷，pH 8.5洗涤该柱。从W2、W3和W4中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

通过首先将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上来进行洗脱：50mM的牛磺酸，60％(w/w)的乙二醇，750mM NaCl，0.1％的辛基吡喃葡糖苷，pH 8.0。然后用10倍柱体积的洗涤物5(W5)：50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。通过接着将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上，继续进行洗脱：1M(NH₄)₂SO₄,50mM TrisHCl和50％(v/v)的乙二醇，pH 7.0。然后用50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后，通过向柱施加10倍柱体积的包含100mM的甘氨酸和200mM NaCl，pH 2.7的溶液来使柱再生。

表26中更详细地描述了上述测试程序。在所有步骤中均应用39cm/h的线性流速。

表26：

通过ITR qPCR以及针对AAV抗原的ELISA(如上文实施例8中所述的)和针对HEK293HCP的ELISA中的每一种来测定所获取的样品，以评估产量和步骤中是否可能发生了损失。与上述实例相关的色谱图如图9所示。下表27显示了在上述步骤中的每个步骤中获取的样品，其中每种组分的产率如表28所示。

表27：

“洗涤5”步骤减小了洗脱中的前置效应。

表28：

还通过SDS-PAGE和12％银染测定上述样品以检测总蛋白质。SDS-PAGE测定结果如图10所示。

实施例13

在用含有相关蛋白质和AAV8-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV8。通过使用Megatron MT3000(Pall)从30L收获等分试样中破碎细胞，随后在a)深度过滤器PDP8区域(0.5m²)、b)深度过滤器V100区域(0.5m²)和c)Kleenpak胶囊0.2μm区域(0.15m²)上过滤含有AAV8的溶液。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒300kDa进行渗滤。将病毒颗粒在针对AAV8的非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。用稀释缓冲液[100mM的组氨酸，200mM NaCl,pH 8.5]以1:2稀释所获得的含有AAV8的流出物，加入另外4g聚山梨醇酯80/kg以制备用于AAV8-亲和的装载物。将含有组氨酸的装载物施加到包含POROS^TMCaptureSelect^TM AAV8亲和基质的柱(目录号A30793,Thermo Fisher；ID为10mm，床高为26mm，体积为2.04ml)上。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV8。所述测定表明在各洗涤步骤中损失了多少AAV8。进行了以下测试程序。首先，用至少10倍柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5平衡含有ADK8/9亲和树脂的ID为10mm，床高为26mm以及体积为2.04ml的柱。将装载物施加至含有ADK8/9亲和树脂的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA(如上述实施例9中所述的)和针对HEK293 HCP抗原的ELISA(如上述实施例8中所述的)进行测定。然后用10倍柱体积的50mM的组氨酸和100mM NaCl，pH 8.5对柱进行再平衡(洗涤1，W1)。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR以及针对AAV抗原的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：200mM Bis-Tris,16.6g S/D溶液(Triton X-100；聚山梨醇酯80；TNBP＝10.87；3.31:3.01(按重量计)，pH 6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：10mM的柠檬酸钠，pH 8.5洗涤柱。然后用10倍柱体积的洗涤物4(W4)：100mM的精氨酸-HCl，100mM的赖氨酸-HCl，100mM的组氨酸-HCl，2mM的N-乙酰基-D,L-色氨酸，pH 8.5和20％(w/w)的聚山梨醇酯80洗涤该柱。从W2、W3和W4中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)进行测定。

通过首先将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上来进行洗脱：20％(w/w)的蔗糖，10％(w/w)的山梨醇，5％(w/w)的甘露醇(蔗糖)，15％(w/w)的甘油，50mM的组氨酸，800mM NaCl，pH 8.0。然后用10倍柱体积的洗涤物5(W5)：50mM的组氨酸和100mM NaCl，pH8.5洗涤该柱。通过接着将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上，继续进行洗脱：50mMTrisHCl，750mM NaCl和50％(w/w)DMSO，pH 8.0。然后用50mM的组氨酸和100mM NaCl，pH8.5洗涤该柱。然后，通过向柱施加10倍柱体积的包含100mM的甘氨酸和200mM NaCl，pH2.7的溶液来使柱再生。

表29中更详细地描述了上述测试程序。在所有步骤中均应用39cm/h的线性流速。

表29：

“洗涤5”步骤减小了洗脱中的前置效应。在第二洗脱步骤(洗脱2)中未观察到AAV8的洗脱。对于AAV8，DMSO可能仍然适合作为洗涤缓冲液和/或缓冲液，以潜在地使脂质包膜病毒失活或分解。

通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)中的每一种测定所获取的样品，以评估产量和步骤中是否可能发生了损失。与上述实例相关的色谱图如图11所示。下表30显示了在上述步骤中的每个步骤中获取的样品，其中每种组分的产率如表31所示。

出乎意料的是，在多元醇和一定量的盐存在下，在接近中性的条件下，从CaptureSelect AAV8树脂中洗脱出AAV8。树脂制造商提出洗脱将需要低于pH 3.5的酸性条件。同样令人惊讶的是，可用糖、糖醇和/或糖和糖醇的混合物来触发洗脱。同样地，出乎意料的是，DMSO作为极性溶剂不能从Capture Select AAV8树脂中洗脱AAV8。

表30：

“洗涤5”步骤减小了洗脱中的前置效应。在第二洗脱步骤(洗脱2)中未观察到AAV8的洗脱。

表31：

还通过SDS-PAGE和12％银染测定上述样品以检测总蛋白质。SDS-PAGE测定结果如图12所示。

实施例14

用含有相关蛋白质和AAV2-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV2。用150mM NaCl、20mM TrisHCl，pH 7.4稀释AAV2样品，以提供装载物。将装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAVX亲和基质的柱(目录号：A36739,Thermo Fisher；ID为10mm，床高为25mm，体积为1.96ml)上。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV2。该测定表明在不同的洗涤步骤中损失了多少AAV2。进行了以下测试程序。首先，用至少10倍柱体积的20mM TrisHCl,150mM NaCl，pH 7.4平衡含有ADK8/9亲和树脂的ID为10mm，床高为25mm以及体积为1.96ml的柱。将装载物施加至含有ADK8/9亲和树脂的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)进行测定。然后用10倍柱体积的20mM TrisHCl,150mM NaCl，pH 7.4对柱进行再平衡(洗涤1，W1)。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：100mM的乙酸钠，0.1％的聚山梨醇酯80，pH6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl,125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物4(W4)：50mM TrisHCl,50％(w/w)的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物5(W5)：50mM TrisHCl,60％(w/w)的乙二醇+750mM NaClpH 8.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物6(W6)：20mM TrisHCl,150mM NaCl,pH 7.4洗涤该柱。从W2、W3和W4中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)进行测定。

通过首先将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上来进行洗脱：100mM的甘氨酸-HCl,200mM NaCl,pH 2.5。然后用10倍柱体积的洗涤物7(W7)：20mM TrisHCl,150mMNaCl，pH 7.4洗涤该柱。用10倍柱体积的50mM的磷酸pH 2.0对柱进行反萃取，用10倍柱体积的洗涤物8(W8)：20mM TrisHCl,150mM NaCl，pH 7.4洗涤柱，然后用10倍柱体积的50mM磷酸pH 2.0对该柱进行反萃取。

表32中更详细地描述了上述测试程序。在所有步骤中均应用39cm/h的线性流速。

表32：

通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)中的每一种测定所获取的样品，以评估产量和步骤中是否可能发生了损失。与上述实例相关的色谱图如图13所示。下表33显示了在上述步骤中的每个步骤中获取的样品，其中每种组分的产率如表34所示。

表33：

表34：

还通过SDS-PAGE和12％银染测定上述样品以检测总蛋白质。SDS-PAGE测定的结果如图14所示(见泳道2-11)。

然后通过SDS-PAGE和针对AAV抗原的蛋白质印迹测定样品。一抗为针对AAV的VP1、VP2和VP3的单克隆抗体，而二抗为与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体。蛋白质印迹测定的结果如图15所示(见泳道2-11)。

实施例15

用含有相关蛋白和AAV9-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV9。用150mM NaCl,20mM TrisHCl,pH 7.4稀释AAV9样品，以提供装载物。将装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAVX亲和基质的柱(目录号：A36739,Thermo Fisher；ID为10mm，床高为25mm，体积为1.96ml)上。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV9。所述测定表明在各洗涤步骤中损失了多少AAV9。进行了以下测试程序。首先，用至少10倍柱体积的20mM TrisHCl,150mM NaCl，pH 7.4平衡含有ADK8/9亲和树脂的ID为10mm，床高为25mm以及体积为1.96ml的柱。将装载物施加至含有ADK8/9亲和树脂的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)进行测定。然后用10倍柱体积的20mM TrisHCl,150mM NaCl，pH 7.4对柱进行再平衡(洗涤1，W1)。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：100mM的乙酸钠，0.1％的聚山梨醇酯80，pH6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl,125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物4(W4)：50mM TrisHCl,50％(w/w)的乙二醇，pH 8.5洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物5(W5)：50mM TrisHCl,60％(w/w)的乙二醇+750mM NaClpH 8.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物6(W6)：20mM TrisHCl,150mM NaCl,pH 7.4洗涤该柱。从W2、W3和W4中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)进行测定。

通过首先将10倍柱体积的以下洗脱缓冲液施加到柱上来进行洗脱：100mM的甘氨酸HCl,200mM NaCl,pH 2.5。然后用10倍柱体积的洗涤物7(W7)：20mM TrisHCl,150mMNaCl，pH 7.4洗涤该柱。用10倍柱体积的50mM的磷酸pH 2.0对柱进行反萃取，用10倍柱体积的洗涤物8(W8)：20mM TrisHCl,150mM NaCl，pH 7.4洗涤柱，然后用10倍柱体积的50mM磷酸pH 2.0对该柱进行反萃取。

表35中更详细地描述了上述测试程序。在所有步骤中均应用39cm/h的线性流速。

表35：

通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP的ELISA(如上述实施例8和9中所述的)中的每一种测定所获取的样品，以评估产量和步骤中是否可能发生了损失。与上述实例相关的色谱图如图16所示。下表36显示了在上述步骤中的每个步骤中获取的样品，其中每种组分的产率如表37所示。

表36：

表37：

还通过SDS-PAGE和12％银染测定上述样品以检测总蛋白质。SDS-PAGE测定的结果如图14所示(见泳道12-20)。

然后通过SDS-PAGE和针对AAV抗原的蛋白质印迹测定样品。一抗为针对AAV的VP1、VP2和VP3的单克隆抗体，而二抗为与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠抗体。蛋白质印迹测定的结果如图15所示(见泳道12-20)。

实施例16

本实施例表明，相对于使用酸性甘氨酸或磷酸，AAV9的洗脱条件得到了增强。

用含有相关蛋白和AAV9-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV9。通过使用Megatron MT3000(Pall)从30L收获等分试样中破碎细胞，随后在a)深度过滤器PDP8区域(0.5m²)、b)深度过滤器V100区域(0.5m²)和c)Kleenpak胶囊0.2μm区域(0.15m²)上过滤含有AAV9的溶液。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用PallOmega T-系列盒300kDa进行渗滤。将病毒颗粒在针对AAV9的非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。将装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TMAAVX亲和基质(Thermo Fisher，目录号A36739,Thermo Fisher)的ID为16mm，床高为50mm，体积为10.0ml的柱上，随后利用如所指示的柱体积进行缓冲步骤。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV9。所述测定表明在各洗涤步骤中损失了多少AAV9。进行了以下测试程序。首先，用至少5倍柱体积的50mM Tris HCl,125mM NaCl，pH 8.5平衡该柱。将装载物施加至含有亲和树脂的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。然后用5倍柱体积的50mM TrisHCl、125mM NaCl，pH 8.5对柱进行再平衡(洗涤1，W1)。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用5倍柱体积的洗涤物2(W2)：100mM的乙酸钠，0,1％的聚山梨醇酯80，pH 6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl,125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。从W2和W3中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

通过首先施加20倍柱体积的纯化水，然后施加20倍柱体积的1mM HCl，pH 3.2，然后施加20倍柱体积的50mM TrisHCl,750mM NaCl,50％的DMSO(w/w)，pH 8.0来进行洗脱。用20倍柱体积的纯化水洗涤该柱，然后用10倍柱体积的33mM HCl，pH 2.0进行洗涤。

表38中更详细地描述了上述测试程序。在所有步骤中均应用39cm/h的线性流速。

表38：

通过ITR qPCR以及针对AAV抗原的ELISA(如上文实施例8中所述的)和针对HEK293HCP的ELISA中的每一种来测定所获取的样品，以评估产量和步骤中是否可能发生了损失。与上述实例相关的色谱图如图17所示。下表39显示了在上述步骤中的每个步骤中获取的样品，其中某些组分的产率如表40所示。

表39：

表40：

还通过SDS-PAGE和蛋白质印迹测定了上述样品，结果如图18所示。

能使用1mM盐酸从Capture select AAVx洗脱AAV9，其益处是仅将极少量的游离酸引入水性体系。接近中性pH的进一步洗脱程序能用含有DMSO的缓冲水溶液(750mM NaCl,50mM TrisHCl,50％w/w的二甲基亚砜)进行。如果将含有DMSO的洗脱物应用于使用蔗糖梯度的超速离心，则DMSO可能是有益的。与严苛的洗脱条件(100mM(pH值低于3)和/或大量的氯化钠或氯化镁)相比，两种洗脱策略都可能具有改善的特性，以保持从AAVX树脂洗脱期间所有AAV亚型的生物效能。

实施例17

本实施例表明，相对于使用酸性甘氨酸或磷酸，AAV9的洗脱条件得到了增强。

用含有相关蛋白(FIX-padua，双链)和AAV9-.VP1、-VP2和-VP3的编码cDNA的三重质粒系统转染后，在HEK293细胞系中产生AAV9。通过使用Megatron MT3000(Pall)从30L收获等分试样中破碎细胞，随后在a)深度过滤器PDP8区域(0.5m²)、b)深度过滤器V100区域(0.5m²)和c)Kleenpak胶囊0.2μm区域(0.15m²)上过滤含有AAV9的溶液。将澄清的无细胞培养上清液浓缩，用Pall Omega T-系列盒300kDa进行渗滤。将病毒颗粒在针对AAV9的非结合条件下装载到膜吸附器(MustangQ.Pall部件号XT140MSTGQP05)上。将装载物施加到含有POROS^TM CaptureSelect^TM AAVX亲和基质的柱(Thermo Fisher，目录号A36739；10mm，床高为28mm，体积为2.2ml)上。

在各点从各洗涤和洗脱步骤中获取样品，以测定样品中存在多少AAV9。所述测定表明在各洗涤步骤中损失了多少AAV9。进行了以下测试程序。首先，用至少10倍柱体积的50mM TrisHCl,125mM NaCl，pH 8.5平衡包含亲和树脂的ID为10mm，柱高为28mm以及体积为2.2ml的柱。将装载物施加至含有亲和树脂的柱上。保存装载到柱上的一部分样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。然后用10倍柱体积的50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5对柱进行再平衡(洗涤1，W1)。保存流出物的样品，随后通过ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

然后用10倍柱体积的洗涤物2(W2)：100mM的乙酸钠和0.1％的聚山梨醇酯80，pH6.0洗涤该柱。然后用10倍柱体积的洗涤物3(W3)：50mM TrisHCl和125mM NaCl，pH 8.5洗涤该柱。然后用30倍柱体积的纯化水洗涤该柱(洗涤4(W4))。从W2、W3和W4中的每一个的洗脱物中获取样品，并根据ITR qPCR、针对AAV抗原的ELISA和针对HEK293 HCP抗原的ELISA进行测定。

通过首先施加20倍柱体积的梯度为0％至100％的33mM的盐酸/于1mM的盐酸中的1000mM NaCl来进行洗脱。

表41中更详细地描述了上述测试程序。在所有步骤中均应用39cm/h的线性流速。

表41：

通过ITR qPCR以及针对AAV抗原的ELISA(如上文实施例8中所述的)和针对HEK293HCP的ELISA中的每一种来测定所获取的样品，以评估产量和步骤中是否可能发生了损失。与上述实例相关的色谱图如图19所示。银染如图20所示。

洗脱的AAV9的生物效能为0.51BPU。

实施例18

针对不同的洗脱缓冲液，评估各种树脂类型的洗脱性质。制备多元醇洗脱缓冲液，其包含50％的乙二醇(w/w),50mM TrisHCl,750-2000mM NaCl,pH 8.0。制备酸性洗脱缓冲液，其包含100mM的甘氨酸(pH 2.5),100mM的柠檬酸钠(pH 3.0)和50mM的磷酸(pH 2.0)。制备含有MgCl2的洗脱缓冲液，其包含2M MgCl₂和50mM TrisHCl，pH 7.4。

测试了几种树脂。结果如下表42所示。在该表中，“是”表示AAV8能用潜在“洗脱缓冲液”以大于装载物的10％的量从树脂中洗脱，而“否”表示AAV能用“潜在洗脱缓冲液”以小于装载物的1％的量从树脂中洗脱。

表42：

¹Thermo Fisher Scientific

²该树脂通过将来自Progen AG的单克隆抗体类型ADK8以0.94mg/ml树脂的密度固定至CNBr-SepharoseFastFlow亲和树脂上来制备。

³GE Healthcare

测试了各种缓冲液的从上述Capture Select AAV8树脂中洗脱AAV8的能力。结果如下表43所示。

表43：

还测试了表44中列出的洗脱缓冲液，以确定它们是否能令人满意地从可从ThermoFisher Scientific获得的Capture

AAV9中洗脱AAV。

表44。

将表44中描述的每种潜在洗脱缓冲液都作为洗脱筛选的一部分连续应用，以确定哪些洗脱缓冲液能在Capture select AAVx上使用。筛选从具有潜在最低洗脱强度的洗脱缓冲液开始，以具有潜在最高洗脱强度的缓冲液结束。色谱图如图21所示。这是能在Capture select AAVx上应用洗脱选项的实例。

本文所引用的所有参考文献、包括出版物、专利申请和专利特此通过引用并入，其并入程度等同于每篇参考文献单个地且具体地指示以引用方式并入，并且以其全文在本文得以陈述。

Claims (84)

1.一种纯化腺相关病毒(AAV)的方法，所述方法包括

(a)在允许含有AAV的溶液中的AAV与亲和树脂之间结合的条件下，将所述溶液装载到针对AAV的亲和树脂上；

(b)进行至少两个洗涤步骤；以及

(c)从所述亲和树脂中洗脱所述AAV。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括使所述含有AAV的溶液与阴离子交换剂接触，以及从所述阴离子交换剂中洗脱所述含有AAV的溶液，之后将所述含有AAV的溶液装载到所述亲和树脂上。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述洗涤步骤中的至少一个包括向所述亲和树脂施加包含有机溶剂或去垢剂的缓冲液。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含TrisHCl和盐。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含组氨酸、组氨酸-HCl、精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl、甘氨酸、牛磺酸、MES-Na、Bis-Tris和N-乙酰基-D,L-色氨酸中的一种或多种。

6.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述盐是NaCl。

7.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含乙酸钠。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含氯化镁。

9.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含TrisHCl和乙二醇。

10.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含蔗糖和甘油之一以及精氨酸-HCl。

11.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含牛磺酸和乙二醇。

12.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl和组氨酸-HCl。

13.如权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含TrisHCl和DMSO。

14.如权利要求1所述的方法，其中进行至少3个洗涤步骤。

15.如权利要求8所述的方法，其中进行3个洗涤步骤。

16.如权利要求9所述的方法，其中连续进行所述3个洗涤步骤。

17.如权利要求3所述的方法，其中所述有机溶剂或去垢剂为聚山梨醇酯80、乙二醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、DMSO、蔗糖或海藻糖。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述去垢剂包含Triton X100、聚山梨醇酯80和磷酸三(正丁)酯(TNBP)中的一种或多种。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述缓冲液包含Bis-Tris。

20.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约2000mM的乙酸钠和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

其中所述第二洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约30至约200mM TrisHCl和约75至约500mM的盐，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；并且

其中所述第三洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约30至约200mM TrisHCl和约30体积％至约75体积％的乙二醇，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。

21.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约500mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸的钠盐(MES-Na)、约3至约30mM EDTA以及含有聚山梨醇酯80、DMSO和磷酸三(正丁)酯(TNBP)的溶剂/去垢剂混合物，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

其中所述第二洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约30至约200mM TrisHCl或精氨酸-HCl和约75至约500mM的盐，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；并且

其中所述第三洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20至约80mM的精氨酸-HCl和约50至约200mM的盐，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。

22.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约200mM的牛磺酸和0.2％至1.5％的PEG(例如，PEG 6000)，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

其中所述第二洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加包含约30至约300mM的甘氨酸的第二缓冲液，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；并且

其中所述第三洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20至约150mM的牛磺酸、约30体积％至约75体积％的乙二醇和0.05％至0.2％的辛基吡喃葡糖苷，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。

23.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约80至约400mM Bis-Tris和约10至约20克的溶剂/去垢剂混合物，所述溶剂/去垢剂混合物以约11:3:3(按重量计)的比例包含约Triton-X100、聚山梨醇酯80和TNBP，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

其中所述第二洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约5至约20mmol的柠檬酸钠，并且其中所述第二缓冲的pH为约7.5至约9.2；并且

其中所述第三洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约50至约200mM的精氨酸-HCl、约50至约200mM的赖氨酸HCl、约50至约200mM的组氨酸-HCl以及约1mM至约4mM的N-乙酰基-D,L-色氨酸和约10％(w/w)至约40％(w/w)的聚山梨醇酯80，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.3至约8.8。

24.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50nM至约200mM的乙酸纳和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

其中所述第二洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约20nM至约100mM TrisHCl和约50nM至约200nM的盐，其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约8.8；并且

其中所述第三洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20mM至100mM TrisHCl、约40％(w/w)至约60％(w/w)的乙二醇，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

25.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50nM至约200mM的乙酸纳和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

其中所述第二洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约20nM至约100mM TrisHCl和约50nM至约200nM的盐，其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约8.8；并且

其中所述第三洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20mM至100mM TrisHCl、约40％(w/w)至约60％(w/w)的乙二醇，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

26.如权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述盐选自NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl、乙酸钠以及NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂、柠檬酸钠、LiCl、CsCl和乙酸钠中的一种或多种的组合。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述盐是NaCl。

28.如权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述盐的浓度不超过500mM。

29.如权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述盐的浓度不超过200mM。

30.如权利要求20至29中任一项所述的方法，其中所述第三缓冲液中的盐浓度不超过500mM。

31.如权利要求20至29中任一项所述的方法，其中所述第三缓冲液中的盐浓度不超过200mM。

32.如权利要求20至31中任一项所述的方法，所述方法还包括第四洗涤步骤，所述第四洗涤步骤在所述第一洗涤步骤之前进行，并且包括向所述亲和树脂施加包含约10至约30mMTrisHCl和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且其中所述第四缓冲液的pH为约6.5至约8.0。

33.如权利要求20至32中任一项所述的方法，其中所述第一缓冲液包含约100mM的乙酸钠、约0.1％的聚山梨醇酯80，并且其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。

34.如权利要求20至33中任一项所述的方法，其中所述第二缓冲液包含约50mMTrisHCl和约125mM NaCl，并且其中所述第二缓冲液的pH为约8.5。

35.如权利要求20至34中任一项所述的方法，其中所述第三缓冲液包含约50mMTrisHCl和约50体积％的乙二醇，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.5。

36.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约200mM的乙酸钠和约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.5至约6.5；

其中所述第二洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约10至约70mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl，并且其中所述第二缓冲液的pH为约8.0至约9.0；并且

其中所述第三洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约10至约70mM TrisHCl和约30体积％至约75体积％的乙二醇，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.0至约9.0。

37.如权利要求36所述的方法，所述方法还包括第四洗涤步骤，所述第四洗涤步骤在所述第一洗涤步骤之前进行，并且包括向所述亲和树脂施加包含约10至约30mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl的第四缓冲液，并且其中所述第四缓冲液的pH为约6.5至约8.0。

38.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述第一缓冲液包含约100mM的乙酸钠和约0.1％的聚山梨醇酯80，并且其中所述第一缓冲液的pH为约6.0。

39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述第二缓冲液包含约50mMTrisHCl和约125mM NaCl，并且其中所述第二缓冲液的pH为约8.5。

40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其中所述第三缓冲液包含约50mMTrisHCl和约50体积％的乙二醇，并且其中所述第三缓冲液的pH为约8.0。

41.如权利要求40所述的方法，其中除去酸性组分。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述酸性组分是宿主细胞DNA，诸如HEK293 DNA，并且其中使所述酸性组分减少到如通过qPCR测量的低于250pg/微克AAV抗原的值。

43.如权利要求41所述的方法，其中所述酸性组分是宿主细胞DNA，诸如HEK293 DNA，并且其中使所述酸性组分减少至如通过ELISA所测量的低于250pg/微克AAV抗原的值。

44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中洗脱包括通过梯度洗脱施加电导率连续线性增加的洗脱缓冲液。

45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中洗脱包括通过梯度洗脱施加浓度连续线性增加的有机溶剂。

46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含乙二醇、盐诸如NaCl和缓冲液诸如TrisHCl，其中所述pH为至少7.0。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述盐浓度为约750mM，所述缓冲液浓度为约50mM，并且所述乙二醇为50-60％(w/w)。

48.如权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述pH为约8.0。

49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述盐是NaCl，并且所述缓冲液是TrisHCl。

50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约750mM NaCl和50-60％(w/w)的乙二醇，pH为至少7.0。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含至少约55％(w/w)的乙二醇。

52.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约50mM Tris HCl、约750mM至约1250mM NaCl和约60％(w/w)的乙二醇，pH为至少7.8。

53.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约2mM的氯化镁、约50mM的精氨酸-HCl、约750mM至约1000mMNaCl和至少约55％(w/w)的蔗糖，pH为至少约8.0。

54.如权利要求53所述的方法，其中洗脱还包括

(a)使所述亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含约20至约100mM的精氨酸-HCl和约75至约250mM NaCl，并且其中所述第五缓冲液的pH为约7.5至约8.5；以及

(b)使所述亲和树脂与第二洗脱缓冲液接触，所述第二洗脱缓冲液包含约20至约100mM的精氨酸-HCl、约40％(w/w)至约60％(w/w)的甘油和约500至1000mM的盐，并且其中所述第二洗脱缓冲液的pH为约7.5至约8.5。

55.如权利要求54所述的方法，其中连续进行所述步骤。

56.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约2mM的氯化镁、约50mM的精氨酸-HCl、约750mM至约1000mMNaCl和至少约50％(w/w)的甘油，pH为至少约8.0。

57.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约2mM的氯化镁、约50mM的牛磺酸、约600mM至约1000mM NaCl、约0.05％至约0.2％的辛基吡喃葡糖苷和约60％(w/w)的乙二醇，pH为至少约7.8。

58.如权利要求57所述的方法，其中洗脱还包括

(a)使所述亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含约20至约100mM Tris-HCl和约75至约250mM NaCl，并且其中所述第五缓冲液的pH为约8.0至约8.8；以及

(b)使所述亲和树脂与第二洗脱缓冲液接触，所述第二洗脱缓冲液包含约1M的硫酸铵、约50mM Tris HCl和约50％(v/v)的乙二醇，pH为至少约6.8。

59.如权利要求58所述的方法，其中连续进行所述步骤。

60.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约1M的硫酸铵、约50mM Tris HCl和约50％(v/v)的乙二醇，pH为至少约6.8。

61.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约20％(w/w)的蔗糖、约10％(w/w)的山梨醇、约5％(w/w)的甘露醇或约5％(w/w)的蔗糖、约15％(w/w)的甘油、约50mM的组氨酸和约750至约1000mMNaCl，pH为至少约7.8。

62.如权利要求61所述的方法，其中洗脱还包括

(a)使所述亲和树脂与第五缓冲液接触，所述第五缓冲液包含约20至约100mM的组氨酸、约80至约120mM NaCl，并且其中所述第五缓冲液的pH为约8.0至约8.8；以及

(b)使所述亲和树脂与第二洗脱缓冲液接触，所述第二洗脱缓冲液包含约20至约100mM的组氨酸、约600至约900mM NaCl和约5％(w/w)至60％(w/w)的DMSO，并且其中所述第五缓冲液的pH为约6.5至约8.5。

63.如权利要求62所述的方法，其中连续进行所述步骤。

64.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中洗脱包括使所述亲和树脂与洗脱缓冲液接触，所述洗脱缓冲液包含约100mM的甘氨酸-HCl、约200mM NaCl，pH为约2.5。

65.如权利要求50至63中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH为约8.0。

66.如权利要求50至63中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH为8.0。

67.如权利要求1至66中任一项所述的方法，其中洗脱包括抗衡离子浓度的逐步增加。

68.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中洗脱包括有机溶剂浓度的逐步增加。

69.如权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液中的盐选自单价、二价或多价阴离子，诸如氯化物、乙酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐。

70.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第一缓冲液，所述第一缓冲液包含约50至约200mM的乙酸钠、约0.05％至约0.2％的聚山梨醇酯80，并且其中所述第一缓冲液的pH为约5.2至约6.8；

其中所述第二洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第二缓冲液，所述第二缓冲液包含约25至约100mM TrisHCl和约50至约200mM NaCl，并且其中所述第二缓冲液的pH为约7.5至约9.2；并且

其中所述第三洗涤步骤包括向所述亲和树脂施加第三缓冲液，所述第三缓冲液包含约20至约100mM TrisHCl和约75至约250mM NaCl，并且其中所述第三缓冲液的pH为约7.5至约8.8。

71.如权利要求70所述的方法，所述方法还包括通过向所述亲和树脂施加纯化水，随后向所述亲和树脂施加约20至约50mM的pH为约1.7至约2.5的HCl来进行洗脱。

72.如权利要求70所述的方法，所述方法还包括通过施加梯度为0％至100％的20-50mM的盐酸/于0.5-2.0mM盐酸中的800-1200mM NaCl来进行洗脱。

73.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中从所述洗脱步骤获得的所述AAV的HC杂质水平≤99.9％。

74.如权利要求1至73中任一项所述的方法，其中从所述洗脱步骤获得的所述AAV的HC杂质水平≤99.0％。

75.如权利要求1至74中任一项所述的方法，其中所述AAV是AAV8，所述亲和树脂是POROS^TMCaptureSelect^TMAAV8，并且其中所述洗脱缓冲液是酸性的并且不包含乙二醇。

76.如权利要求1至74中任一项所述的方法，其中所述AAV是AAV9，所述亲和树脂是POROS^TMCaptureSelect^TMAAV9，并且其中所述洗脱缓冲液是酸性的并且不包含乙二醇。

77.如权利要求1至76中任一项所述的方法，其中所述AAV是AAV8，并且其中所述亲和树脂是免疫亲和树脂，所述免疫亲和树脂由固定在色谱基质上的来自ADK8型或ADK8/9型的针对AAV8的固定化单克隆抗体组成。

78.如权利要求1至76中任一项所述的方法，其中所述AAV是AAV9，并且其中所述亲和树脂是免疫亲和树脂，所述免疫亲和树脂由固定在色谱基质上的来自ADK9型或ADK8/9型的针对AAV9的固定化单克隆抗体组成。

79.如权利要求1至78中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述含有AAV的溶液与包含带正电荷的基团的过滤器接触，所述带正电荷的基团有效地耗尽所述含有AAV的溶液中酸性带电荷的污染物。

80.如权利要求1至79中任一项所述的方法，所述方法还包括对AAV级分的纳米过滤以去除大于35nm的病毒。

81.如权利要求1至80中任一项所述的方法，所述方法还包括精细纯化步骤，所述精细纯化步骤包括用包含触须凝胶的柱进行AEX色谱。

82.如权利要求1至81中任一项所述的方法，所述方法还包括通过AAV特异性ELISA测试AAV级分。

83.如权利要求82所述的方法，其中所述AAV特异性ELISA是对AAV特异的夹心ELISA。

84.一种AAV产物，所述AAV产物由根据权利要求1至83中任一项所述的方法生产。

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