TW201718623A - ＦkpＡ之純化及其用於製備重組多肽之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於製備極高純度級別之FKBP型肽基-脯胺醯基順反異構酶(FkpA)多肽的方法。亦提供超純FkpA及其使用方法，例如用於免疫分析中以顯示FkpA自在細菌中所製備之生物製品中移除。此外，本發明提供純化在過表現一或多種伴侶蛋白之細菌中所產生之多肽(例如多特異性抗體)的方法。該等方法包括親和層析、混合模式層析及疏水相互作用層析。在一些態樣中，本發明提供多肽(例如多特異性抗體)之組合物，其基本上不含產物特異性雜質。

Description

FkpA之純化及其用於製備重組多肽之用途 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2015年8月20日申請之美國臨時專利申請案第62/207,910號；2015年8月20日申請之美國臨時專利申請案第62/207,908號；及2015年8月26日申請之美國臨時專利申請案第62/210,378號之權益；該等申請案各自之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
ASCII文本文件上序列表之提交
以下在ASCII文本文件上之提交的內容以全文引用之方式併入本文中：序列表之電腦可讀形式(CRF)(文件名：P32953-WO_SL.txt，記錄日期：2016年8月10日，大小：58,547KB)。
本發明提供用於製備極高純度級別之FKBP型肽基-脯胺醯基順反異構酶(FkpA)多肽的方法。亦提供超純FkpA及其使用方法，例如用於免疫分析中以顯示細菌中所製備之生物製品中的FkpA的移除或減少。在一些實施例中，本發明提供用於自包含多肽及至少一種雜質之組合物中純化多肽(例如多特異性抗體)的方法，及包含藉由該等方法純化之產物的調配物。在一些實施例中，雜質為產物特異性雜質；例如多特異性抗體之前驅體、聚集物及/或變異體。
常常改變在發酵條件下藉由在細菌宿主細胞中表現而大批製備之真核多肽之製備產率及品質，以改良所分泌之異多聚體蛋白質(例如抗體)之適當組裝及摺疊。諸如FKBP型肽基-脯胺醯基順反異構酶(FkpA)之伴侶蛋白之過表現促進在細菌宿主細胞中產生之異源蛋白質(諸如抗體) 之適當摺疊及溶解。FkpA催化寡肽中之脯胺酸醯亞胺肽鍵的順反異構化(Missiakas,D.等人，Molecular Microbiology(1996)21(4),871-884)。
對於向人類患者投與可接受之重組生物醫藥蛋白，重要的是自最終生物製品中移除由製造及純化製程產生之殘餘雜質或使其減少至較小量。此等製程組分包括培養基蛋白質、免疫球蛋白親和配位體、病毒、內毒素、DNA及宿主細胞蛋白質。此等宿主細胞雜質包括製程特異性宿主細胞蛋白質(HCP)，其為生物產物中衍生自重組DNA技術之製程相關雜質，例如伴侶蛋白，諸如FkpA、DsbA及DsbC，其過表現以促進蛋白質摺疊。雖然HCP典型地小量地存在於最終原料藥中(百萬分率或每毫克指定重組多肽之奈克數)，但應認識到HCP為不希望的且其量應減至最少。舉例而言，美國食品及藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)要求旨在用於活體內人類用途之生物醫藥應儘可能不含外來雜質，且需要用於偵測及定量潛在雜質(諸如HCP)之測試。此外，國際協調會議(International Conference on Harmonization，ICH)提供了關於測試程序之指南及生物技術/生物製品之接受準則。該等指南針對HCP建議利用能夠偵測廣泛範圍之蛋白質雜質的靈敏免疫分析。已研發用於偵測免疫球蛋白、DNA、內毒素、病毒及總HCP(例如總大腸桿菌(E.coli)蛋白質(ECP)或總CHO蛋白質(CHOP))之分析物及試劑，但此類分析物及試劑可能不會精確地偵測輔助蛋白雜質，諸如FkpA。當前不存在對於諸如FkpA之蛋白質的偵測及定量具有充足特異性及敏感性之商業試劑或分析方法，該等蛋白質在細菌中典型地不以高水準表現，但在重組細菌宿主細胞中可過表現以促進生物產物之摺疊及分泌。
在不存在具有充足一致性、靈敏性、特異性或效率之現有分析及試劑之情況下，尤其需要用於偵測FkpA之試劑、方法及套組。本文所描述之發明滿足以上所描述之需要中的某些，且提供其他益處。此外，多特異性抗體之製備具有獨特的產物特異性雜質，諸如未配對抗體臂及錯誤組裝之抗體。因此，需要研發針對多特異性抗體之純化流程，從而移除此等產物特異性雜質。
本文所引用之包括專利申請案及公開案之所有參考文獻係 以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供用於自包含FkpA多肽之細胞溶解產物中純化FkpA多肽的方法，該方法包括a)藉由離心使細胞溶解產物澄清，b)將經澄清之包含FkpA多肽之細胞溶解產物施加至陽離子交換層析材料，c)使FkpA多肽自陽離子交換層析材料溶離，以產生包含FkpA多肽之陽離子交換洗出液，d)將包含FkpA多肽之陽離子交換洗出液施加至疏水相互作用層析(HIC)材料，e)使FkpA多肽自HIC材料溶離以產生HIC洗出液，f)將包含FkpA多肽之HIC洗出液施加至尺寸排阻層析材料，g)收集來自尺寸排阻層析之包含經純化之FkpA多肽的級分。在一些實施例中，包含FkpA多肽之溶解產物在約pH 6.0下。
在一些實施例中，陽離子交換層析材料為強陽離子交換劑。在一些實施例中，強陽離子交換劑包含磺丙基。在一些實施例中，磺丙基鍵聯至交聯型瓊脂糖。在一些實施例中，在溶離之前將陽離子交換材料在25mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)中洗滌。在一些實施例中，使用鹽梯度使FkpA自陽離子層析材料溶離。在一些實施例中，鹽梯度為線性梯度。在一些實施例中，鹽梯度為在9個管柱體積內約25mM MES、300mM NaCl至25mM MES 300mM NaCl之0-30%梯度。在一些實施例中，將陽離子交換洗出液收集於級分中。在一些實施例中，在疏水相互作用層析之前藉由尺寸排阻層析分析級分。在一些實施例中，選擇包含至少約25% FkpA之級分用於進一步純化。
在本發明之一些實施例中，HIC材料包含丁基部分。在一些實施例中，丁基部分鍵聯至交聯型瓊脂糖。在一些實施例中，陽離子交換洗出液在HIC之前經調節以包含約0.6M硫酸鈉及約50mM PO4，約pH 7。在一些實施例中，在溶離之前將FkpA結合之HIC材料用40mM磷酸鹽、300mM硫酸鈉，pH 7.0洗滌。在一些實施例中，使用水使FkpA自HIC材料溶離。在一些實施例中，將HIC洗出液收集於級分中。在一些實施例中，彙集包含FkpA之級分。在一些實施例中，彙集包含至少約25% FkpA之級分。
在本發明之一些實施例中，尺寸排阻層析材料包含交聯型瓊脂糖及右旋糖酐之球形複合物。在一些實施例中，將尺寸排阻流穿物收集於級分中。在一些實施例中，在尺寸排阻層析之前將HIC洗出液濃縮。在一些實施例中，在尺寸排阻層析之前將HIC洗出液濃縮約6倍至約10倍。在一些實施例中，彙集包含FkpA之尺寸排阻級分。
在以上實施例之一些實施例中，FkpA多肽為大腸桿菌FkpA多肽。在一些實施例中，FkpA多肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。在一些實施例中，FkpA多肽之胺基酸序列與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少約80%一致性。在一些實施例中，FkpA表現於細胞中。在一些實施例中，細胞為原核細胞。在一些實施例中，細胞為大腸桿菌細胞。在一些實施例中，細胞經工程改造以按大於FkpA之內源性表現的水準表現FkpA。在一些實施例中，使用微流化器溶解細胞。
在一些態樣中，本發明提供一種包含藉由本文所描述之方法純化之FkpA多肽的組合物。在一些實施例中，組合物包含至少約98%之FkpA多肽(例如98%之單聚FkpA多肽；例如如藉由尺寸排阻層析所量測)。在一些實施例中，組合物包含低於約2%之低分子量物質。在一些實施例中，組合物包含不超過約5%之高分子量物質。在一些實施例中，組合物包含低於約2%之高分子量物質。在一些實施例中，FkpA多肽(例如單聚FkpA)之百分比係藉由尺寸排阻層析來偵測。在一些實施例中，組合物包含低於約5%、約4%、約3%、約2%、約1%之雜質或實質上不含雜質。在一些實施例中，雜質為相對於FkpA之高分子量及/或低分子量多肽物質。在一些實施例中，雜質為以下中之一或多者：大腸桿菌蛋白質(ECP)、FkpA之聚集物、FkpA之片段、核酸或細胞培養基組分。
在以上組合物之一些實施例中，經純化之FkpA對一或多個冷凍-解凍循環而言為穩定的。在一些實施例中，FkpA對三個冷凍-解凍循環而言為穩定的。在一些實施例中，組合物在冷凍-解凍之後包含至少約70%之FkpA。在一些實施例中，組合物在冷凍-解凍之後包含至少約80%之FkpA。
在以上組合物之一些實施例中，組合物中之FkpA多肽的純 度係藉由層析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳或西方墨點分析(western blot analysis)中之一或多者來量測。在一些實施例中，組合物中之FkpA多肽的純度係藉由高效液相層析(HPLC)來量測。在一些實施例中，組合物中之FkpA多肽的純度係藉由尺寸排阻層析(SEC)來量測。在一些實施例中，組合物中之FkpA多肽的純度係藉由SDS凝膠電泳使用螢光成像或銀染色來量測。在一些實施例中，組合物中之非FkpA多肽的存在係藉由由凝膠電泳鑑別到存在如藉由西方墨點分析所示與抗FkpA抗體不具免疫反應性之物質來進行鑑別。在一些實施例中，組合物中之FkpA多肽之聚集物的存在係藉由根據西方墨點分析存在分子量大於天然FkpA之物質來進行鑑別。
在一些態樣中，本發明提供用於產生特異性結合FkpA之抗體的方法，其包括將動物暴露於包含藉由本文所描述之方法純化之FkpA的組合物或對其進行免疫。在一些實施例中，用於產生特異性結合FkpA之抗體的方法包括將動物暴露於如本文所描述之FkpA的組合物或對其進行免疫。在一些實施例中，該方法進一步包括收集動物之血清，其中血清包含特異性結合FkpA之抗體。在一些實施例中，血清包含特異性結合FkpA之多株抗體。在其他實施例中，自血清分離一或多種單株抗體。在一些實施例中，動物為山羊、兔、小鼠、豚鼠、倉鼠、大鼠、驢或雞。
在一些態樣中，本發明提供包含特異性結合FkpA之多株抗體的組合物，其中多株抗體係藉由將動物對包含藉由本文所描述之方法中之任一者純化之FkpA的組合物進行免疫而產生。在一些實施例中，多株抗體係藉由將動物對如本文所描述之經純化FkpA組合物進行免疫而產生。在一些實施例中，自動物之血清收集多株抗體。在其他實施例中，本發明提供特異性結合FkpA之單株抗體，其中單株抗體係藉由將動物對包含藉由本文所描述之方法中之任一者純化之FkpA的組合物進行免疫而產生。在一些實施例中，單株抗體係藉由將動物對如本文所描述之經純化FkpA組合物進行免疫而產生。在一些實施例中，動物為山羊、兔、小鼠、豚鼠、倉鼠、大鼠、驢或雞。
在一些態樣中，本發明提供用於純化特異性結合FkpA之抗體的方法，其包括使包含抗FkpA抗體之組合物與硫酸銨接觸，達至約60% 之硫酸銨最終濃度，將溶液離心，移除上清液及將集結粒溶解於磷酸鹽緩衝液中。在一些實施例中，磷酸鹽緩衝液包含約50mM磷酸鈉，約pH 7.0。在一些實施例中，用於純化特異性結合FkpA之抗體的方法包括a)使包含抗FkpA抗體之組合物與硫酸銨接觸，達至約60%之硫酸銨最終濃度，將溶液離心，移除上清液且將集結粒溶解於磷酸鹽緩衝液中以產生抗FkpA抗體溶液；b)將抗FkpA抗體溶液施加至親和層析材料，c)使抗體自親和材料溶離以產生包含抗FkpA抗體之親和洗出液；及d)對親和洗出液進行尺寸排阻層析，其中自尺寸排阻層析收集包含純化抗體之級分。在一些實施例中，磷酸鹽緩衝液包含約50mM磷酸鈉，約pH 7.0。在一些實施例中，親和層析材料包含鍵聯至層析介質之經純化FkpA。在一些實施例中，層析介質為交聯右旋糖酐。在一些實施例中，藉由本文所描述之方法中之任一者純化FkpA。在一些實施例中，FkpA衍生自本文所描述之組合物中之任一者。在一些實施例中，FkpA共價鍵聯至層析介質。在一些實施例中，FkpA鍵聯至使用甘油基可控孔度玻璃(甘油基-CPG)之層析介質。在一些實施例中，抗FkpA抗體係使用約pH 2.0之磷酸鹽緩衝鹽水自親和管柱溶離。在一些實施例中，溶離彙集物係收集至約1M Tris，約pH 8.0中。在一些實施例中，尺寸排阻層析材料包含交聯型瓊脂糖及右旋糖酐之球形複合物。在一些實施例中，交聯型瓊脂糖及右旋糖酐之球形複合物具有針對分子量在10,000道爾頓(dalton)與600,000道爾頓之間的分子的分離範圍。在一些實施例中，將尺寸排阻流穿物收集於級分中。在一些實施例中，彙集包含抗FkpA抗體之尺寸排阻級分。在一些實施例中，抗體為多株抗體。在一些實施例中，抗體係根據本文所描述之方法中之任一者來製備。在一些實施例中，低於約1%之抗體特異性結合非FkpA化合物。在一些實施例中，本發明提供藉由本文所描述之方法中之任一者純化的經分離之抗FkpA抗體。
在一些實施例中，本發明提供用於定量樣品中之FkpA的方法，其包括使用偵測系統偵測樣品中之FkpA及將在樣品中偵測到之FkpA的量與對一或多個濃度之超純FkpA參考標準物之偵測相比較。在一些實施例中，超純FkpA參考標準物包含至少約95%、約96%、約97%或約98%之單聚FkpA多肽。在一些實施例中，超純FkpA參考標準物係藉由本文所 描述之方法中之任一者來製備，或包含本文所描述之FkpA組合物中之任一者。在一些實施例中，偵測系統為免疫分析。在一些實施例中，免疫分析包含特異性結合超純FkpA參考標準物之抗體。
在一些實施例中，本發明提供用於分析重組多肽樣品中FkpA之存在及/或量的方法，其包括使用免疫分析偵測樣品中之FkpA及將在樣品中偵測到之FkpA的量與對一或多個濃度之超純FkpA參考標準物之偵測相比較。在一些實施例中，超純FkpA參考標準物包含至少約98%之單聚FkpA多肽。在一些實施例中，超純FkpA參考標準物係藉由本文所描述之方法中之任一者來製備。在一些實施例中，免疫分析包含特異性結合超純FkpA參考標準物之抗體。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體為多株抗體。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體在免疫分析中用作捕獲抗體。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體係用作偵測抗體。在一些實施例中，偵測抗體結合至偵測劑。在一些實施例中，偵測劑為辣根過氧化物酶。在一些實施例中，特異性結合FkpA之抗體係根據本文所描述之方法中之任一者來製備。在一些實施例中，FkpA為大腸桿菌FkpA。在一些實施例中，樣品包含在宿主細胞中製備之重組多肽。在一些實施例中，宿主細胞為大腸桿菌細胞。在一些實施例中，宿主細胞過表現FkpA。在一些實施例中，樣品為細胞溶解產物。在一些實施例中，樣品係獲自重組多肽製劑且其中重組多肽製劑已經受一或多個層析純化步驟。在一些實施例中，重組多肽製劑為最終純化產物。在一些實施例中，含於重組多肽樣品中之重組多肽為抗體或免疫黏附素。在一些實施例中，抗體為多特異性抗體、雙特異性抗體、半抗體或抗體片段。在一些實施例中，重組多肽為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些實施例中，本發明提供用於偵測樣品中之FkpA的免疫分析方法，其中樣品係獲自來自宿主細胞株之重組多肽製劑，該方法包括：(a)使結合FkpA之捕獲抗體與樣品接觸，藉此產生樣品-捕獲抗體組合物質；(b)使結合FkpA之偵測抗體與樣品-捕獲抗體組合物質接觸；及(c)偵測與樣品-捕獲抗體組合物質結合之抗體。在一些實施例中，免疫分析進一步包括使用標準滴定曲線定量所結合之偵測抗體的含量。在一些實施例 中，免疫分析進一步包括基於所結合之偵測抗體之含量計算存在於樣品中之FkpA的量。在一些實施例中，存在於樣品中之FkpA的量係藉由將標準滴定曲線與用超純FkpA組合物產生之標準滴定曲線相比較來進行測定。在一些實施例中，超純FkpA組合物包含至少約98%之FkpA多肽(例如單聚FkpA)。在一些實施例中，組合物中之超純FkpA係藉由本文所描述之方法中之任一者來製備。在一些實施例中，捕獲抗體特異性結合超純FkpA。在一些實施例中，偵測抗體特異性結合超純FkpA。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體為多株抗體。在一些實施例中，結合FkpA之第二偵測抗體結合至辣根過氧化物酶。在一些實施例中，多株抗體係根據本文所描述之方法中之任一者而產生。在一些實施例中，偵測系統為夾心分析。在一些實施例中，夾心分析為酶聯免疫吸附分析(ELISA)。在一些實施例中，FkpA為大腸桿菌FkpA。在一些實施例中，重組多肽製劑或宿主細胞株係獲自大腸桿菌。在一些實施例中，宿主細胞株表現外源性FkpA。在一些實施例中，樣品為細胞溶解產物。在一些實施例中，樣品係獲自重組多肽製劑且其中重組多肽製劑已經受一或多個層析純化步驟。在一些實施例中，重組多肽製劑為最終純化產物。
在一些實施例中，使用免疫分析來分析抗體或免疫黏附素之製備。在一些實施例中，抗體為多特異性抗體、雙特異性抗體、半抗體或抗體片段。在一些實施例中，抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體，其包含結合IL13之第一結合域及結合IL17之第二結合域。在一些實施例中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的 重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，IL17為人類IL17。在一些實施例中，第二結合域結合人類IL17AA、IL17FF及IL17AF。在一些實施例中，IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之胺基酸序列且IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的的VL序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施例中，本發明提供一種用於包含由細菌細胞製備重組多肽之醫藥組合物的品質分析，該品質分析包括對醫藥組合物之樣品進行如本文所描述之免疫分析，以偵測醫藥組合物中FkpA之存在或量。在一些實施例中，如藉由免疫分析所測定，在醫藥組合物中偵測到之FkpA的量不超過約30ppm、約25ppm、約20ppm、約15ppm、約14ppm、約13ppm、約12ppm、約11ppm、約10ppm、約9ppm、約8ppm、約7ppm、約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm。在一些實施例中，細菌細胞為大腸桿菌細胞。在一些實施例中，細菌細胞表現外源性FkpA。在一些實施例中，樣品為細胞溶解產物。在一些實施例中，樣品係獲自重組多肽製劑且其中重組多肽製劑已經受一或多個層析純化步驟。在一些實施例中，重組多肽製劑為最終 純化產物。在一些實施例中，重組多肽為抗體或免疫黏附素。在一些實施例中，抗體為多特異性抗體、雙特異性抗體、半抗體或抗體片段。在一些實施例中，重組多肽為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些實施例中，本發明提供一種用於雙特異性抗體之品質分析，該雙特異性抗體包含結合IL13之第一結合域及結合IL17之第二結合域。在一些實施例中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，IL17為人類IL17。在一些實施例中，第二結合域結合人類IL17AA、IL17FF及IL17AF。在一些實施例中，IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之胺基酸序列且IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的的VL序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中， 雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，該分析進一步包括偵測醫藥組合物中之DsbA及/或DsbC的量的步驟。在一些實施例中，DsbA之量不超過約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm。在一些實施例中，如藉由免疫分析所測定，DsbC之量不超過約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm。
在一些實施例中，本發明提供用於偵測包含由細菌細胞製備之重組多肽之醫藥組合物中之FkpA的套組，該套組包含藉由本文所描述之方法中之任一者製備之抗FkpA抗體或本文所描述之抗FkpA抗體之組合物中之任一者。在一些實施例中，套組進一步包含在產生用於定量樣品中之FkpA的標準曲線時用作參考標準物及/或用作陽性對照的超純FkpA。在一些實施例中，超純FkpA係根據本文所描述之方法中之任一者來製備。
在一些態樣中，本發明提供包含重組多肽之組合物，其中重組多肽係在表現內源性FkpA之宿主細胞中製備，其中組合物包含濃度不超過約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm之FkpA。在一些實施例中，FkpA之濃度係藉由免疫分析來測定。在一些實施例中，FkpA之濃度係藉由本文所描述之免疫分析中之任一者來測定。在一些實施例中，重組多肽係在經工程改造以表現外源性FkpA之宿主細胞中製備，其中組合物包含不超過約15ppm、約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm之FkpA。在一些實施例中，重組多肽為抗體。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，組合物包含至少約0.1ppm之FkpA。在一些實施例中，宿主細胞表現外源性FkpA，其中組合物包含不超過約13ppm。在一些實施例中，宿主細胞表現外源性FkpA，其中組合物包含不超過約0.7ppm。在一些實施例中，宿主細胞表現外源性 FkpA，其中組合物包含不超過約6ppm。
在一些實施例中，本發明提供包含雙特異性抗體之組合物，其中雙特異性抗體包含結合IL13之第一結合域及結合IL17之第二結合域。在一些實施例中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，IL17為人類IL17。在一些實施例中，第二結合域結合人類IL17AA、IL17FF及IL17AF。在一些實施例中，IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之胺基酸序列且IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的的VL序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，DsbA之量不超過約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、 約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm。在一些實施例中，DsbA之量係藉由免疫分析來測定。在一些實施例中，DsbC之量不超過約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm。在一些實施例中，DsbC之量係藉由免疫分析來測定。在一些實施例中，組合物實質上不含FkpA。在一些實施例中，組合物實質上不含DsbA。在一些實施例中，組合物實質上不含DsbC。
在一些實施例中，本發明提供包含雙特異性抗體之組合物，其中重組多肽係藉由包括以下步驟之方法來製備：a)向宿主細胞中引入i)編碼第一重鏈及第一輕鏈之核酸，其中該第一重鏈及該第一輕鏈形成第一抗原結合域；ii)編碼第二重鏈及第二輕鏈之核酸，其中該第二重鏈及該第二輕鏈形成第二抗原結合域；iii)編碼FkpA多肽之核酸；其中第一重鏈及第二重鏈形成Fc結構域；及b)純化抗體，其中組合物包含小於約5ppm之FkpA。在一些實施例中，本發明提供一種包含雙特異性抗體之組合物，其中雙特異性抗體係藉由包括以下步驟之方法來製備：a)向第一宿主細胞中引入i)編碼第一重鏈及第一輕鏈之核酸，其中該第一重鏈及該第一輕鏈形成第一抗原結合域；ii)編碼FkpA多肽之核酸；b)向第二宿主細胞中引入i)編碼第二重鏈及第二輕鏈之核酸，其中該第二重鏈及該第二輕鏈形成第二抗原結合域；ii)編碼FkpA多肽之核酸；b)分離第一抗原結合域及第二結合域；c)在第一抗原結合域及第二抗原結合域組裝以形成雙特異性抗體之條件下將第一抗原結合域與第二抗原結合域組合；及b)純化雙特異性抗體，其中組合物包含小於約5ppm之FkpA。在一些實施例中，組合物包含小於約1ppm之FkpA。在一些實施例中，宿主細胞為原核宿主細胞。在一些實施例中，第一宿主細胞及第二宿主細胞為原核宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacterium)。在一些實施例中，革蘭氏陰性細菌為大腸桿菌。在一些實施例中，FkpA為大腸桿菌FkpA。在一些實施例中，雙特異性抗體包含結合IL13之第一結合域及結合IL17之第二結合域。在一些實施例中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺 基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一結合域包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，IL17為人類IL17。在一些實施例中，第二結合域結合人類IL17AA、IL17FF及IL17AF。在一些實施例中，其中IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之胺基酸序列且IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的的VL序列。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，雙特異性抗體之第二結合域包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，組合物包含不超過約15ppm之DsbA。在一些實施例中，組合物包含不超過約5ppm之DsbA。在一些實施例中，組合物包含不超過約15ppm之DsbC。在一些實施例中，組合物包含不超過約5ppm之DsbC。在一些實施例中，DsbA係藉由免疫分析來測定。在一些實施例中，DsbC係藉由免疫分析來量測。
本發明提供用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化多肽的方法，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對組合物進行親和層析以產生親和洗出液，b)對親和洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對混合模式洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含多肽之級分，其中該方法使組合物中產物特異性雜質之量減少。在一些實施例中，混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。在一些實施例中，親和層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，混合模式層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，HIC係以流穿模式進行。
本發明提供用於自包含多特異性抗體及雜質之組合物中純化多特異性抗體的方法，其中多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對組合物進行蛋白質A層析以產生蛋白質A洗出液，b)對蛋白質A洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對混合模式洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含多特異性抗體之級分，其中該方法使組合物中產物特異性雜質之量減少。在一些實施例中，混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。在一些實施例中，親和層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，混合模式層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，HIC係以流穿模式進行。
在一些態樣中，本發明提供用於自包含多特異性抗體及雜質之組合物中純化多特異性抗體的方法，其中多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，其中多特異性抗體之各臂係分開製備，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對多特異性抗體之各臂進行蛋白質A層析以產生多特異性抗體之各臂的蛋白質A洗出液，b)在足以產生包含多特異性抗體之組合物的條件下形成包含多特異性抗體之各臂之蛋白質A洗出液的混合物，c)對包含多特異性抗體之組合物進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及d)對混合模式洗出液進行疏水相互作用層析(HIC)且收集包含多特異性抗體之級分，其中該方法使組合物中產物特異性雜質之量減少。在一些實施例中，混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。在一些實施例中，親和層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，混合模式層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，疏水相互作用層析係以流穿模式 進行。在一些實施例中，在疏水相互作用層析之前對混合模式洗出液進行陰離子交換層析。在一些實施例中，陰離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
在以上態樣之一些實施例中，該方法進一步包括對包含多特異性抗體之疏水相互作用層析級分進行陽離子交換層析且收集包含多特異性抗體之級分的步驟。在一些實施例中，陽離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
在一些態樣中，本發明提供用於自包含多肽及一或多種雜質之組合物中純化該多肽的方法，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對組合物進行親和層析以產生親和洗出液，b)對親和洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含多肽之級分，其中該方法使組合物中產物特異性雜質之量減少。
在一些態樣中，本發明提供用於自包含多特異性抗體及雜質之組合物中純化多特異性抗體的方法，其中多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對組合物進行蛋白質A層析以產生蛋白質A洗出液，b)對蛋白質A洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含多特異性抗體之級分，其中該方法使組合物中產物特異性雜質之量減少。
在一些態樣中，本發明提供用於自包含多特異性抗體及雜質之組合物中純化多特異性抗體的方法，其中多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，其中多特異性抗體之各臂係分開製備，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對多特異性抗體之各臂進行蛋白質A層析以產生多特異性抗體之各臂的蛋白質A洗出液，b)在足以產生包含多特異性抗體之組合物的條件下形成包含多特異性抗體之各臂之蛋白質A洗出液的混合物，c)對包含多特異性抗體之組合物進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及d)對混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出 液，e)對陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析中，且收集包含多特異性抗體之級分且收集包含多特異性抗體之級分，其中該方法使組合物中產物特異性雜質之量減少。
在以上態樣之一些實施例中，混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。在一些實施例中，親和層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，混合模式層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，陰離子交換層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，疏水相互作用層析係以流穿模式進行。在一些實施例中，該方法進一步包括對包含多特異性抗體之疏水相互作用層析級分進行陽離子交換層析的步驟。在一些實施例中，陽離子交換層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，該方法進一步包括對包含多特異性抗體之疏水相互作用層析級分進行超濾的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包括對包含多特異性抗體之陽離子交換級分進行超濾的步驟。在一些實施例中，超濾依序包括第一超濾、透濾及第二超濾。
在一些態樣中，本發明提供一種用於自包含多肽及一或多種雜質之組合物中純化該多肽的方法，該方法包括：a)對組合物進行親和層析以產生親和洗出液，b)對親和洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對陰離子交換洗出液進行羥磷灰石層析且收集包含多肽之級分，其中該方法使組合物中之產物特異性雜質的量減少。在一些實施例中，本發明提供一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化多特異性抗體的方法，其中多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對組合物進行蛋白質A層析以產生蛋白質A洗出液，b)對蛋白質A洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對陰離子交換洗出液進行羥磷灰石層析且收集包含多特異性抗體之級分，其中該方法使組合物中之產物特異性雜質的量減少。在一些實施例中，本發明提供一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化多特異性抗體的方法，其中多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單 元，其中多特異性抗體之各臂係分開產生，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對多特異性抗體之各臂進行蛋白質A層析以產生多特異性抗體之各臂的蛋白質A洗出液，b)在足以產生包含該多特異性抗體之組合物的條件下形成包含多特異性抗體之各臂之蛋白質A洗出液的混合物c)對包含該多特異性抗體之組合物進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及d)對混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，e)對陰離子交換洗出液進行羥磷灰石層析且收集包含多特異性抗體之級分且收集包含多特異性抗體之級分，其中該方法使組合物中之產物特異性雜質的量減少。在一些實施例中，混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。在一些實施例中，親和層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，蛋白質A層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，混合模式層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，陰離子交換層析係以結合及溶離模式進行。在一些實施例中，羥磷灰石層析係以流穿模式進行。
在以上態樣及實施例之一些實施例中，蛋白質A層析包含鍵聯至瓊脂糖之蛋白質A。在一些實施例中，蛋白質A層析為MabSelectTM、MabSelect SuReTM及MabSelect SuReTM LX、ProSep®-vA、ProSep® Ultra Plus、蛋白質ASepharose® Fast Flow或Toyopearl® AF-rProtein A層析。在一些實施例中，蛋白質A層析使用以下中之一或多者：蛋白質A平衡緩衝液、蛋白質A加載緩衝液或蛋白質A洗滌緩衝液，其中平衡緩衝液、加載緩衝液及/或洗滌緩衝液在約pH 7與約pH 8之間。在一些實施例中，蛋白質A平衡緩衝液為約pH 7.7。在一些實施例中，蛋白質A平衡緩衝液包含約25mM Tris及約25mM NaCl。在一些實施例中，蛋白質A層析係在加載之後用平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，多特異性抗體係藉由pH梯度自蛋白質A層析溶離。在一些實施例中，多特異性抗體係藉由將具有低pH值之蛋白質A溶離緩衝液施加至蛋白質A層析而自蛋白質A溶離。在一些實施例中，蛋白質A溶離緩衝液包含約150mM乙酸，約pH 2.9。在一些實施例中，蛋白質A洗出液係在洗出液之OD280大於約0.5之情況下彙集。
在以上態樣及實施例之一些實施例中，混合模式層析包含四級胺及疏水部分。在一些實施例中，混合模式層析包含鍵聯至高度交聯型 瓊脂糖之四級胺及疏水部分。在一些實施例中，混合模式層析包含N-苯甲基-n-甲基乙醇胺。在一些實施例中，混合模式層析為CaptoTM adhere層析。在一些實施例中，混合模式層析使用以下中之一或多者：混合模式預平衡緩衝液、混合模式平衡緩衝液、混合模式加載緩衝液或混合模式洗滌緩衝液，其中混合模式預平衡緩衝液、混合模式平衡緩衝液及/或混合模式洗滌緩衝液在約pH 6與約pH 7之間。在一些實施例中，混合模式預平衡緩衝液、混合模式平衡緩衝液及/或混合模式洗滌緩衝液為約pH 6.5。在一些實施例中，混合模式預平衡緩衝液包含約500mM乙酸鹽。在一些實施例中，混合模式平衡緩衝液包含約50mM乙酸鹽。在一些實施例中，混合模式層析係在加載之後用洗滌緩衝液洗滌。在一些實施例中，多特異性抗體係藉由pH梯度自混合模式層析溶離。在一些實施例中，多特異性抗體係藉由將具有低pH值之混合模式溶離緩衝液施加至混合模式陰離子交換層析而自混合模式層析溶離。在一些實施例中，混合模式溶離緩衝液包含約25mM乙酸鹽，約pH 5.2。在一些實施例中，混合模式洗出液係在洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
在以上態樣及實施例之一些實施例中，疏水相互作用層析(HIC)包含疏水部分。在一些實施例中，疏水相互作用層析包含苯基部分。在一些實施例中，疏水相互作用層析包含鍵聯至交聯型瓊脂糖之疏水部分。在一些實施例中，疏水相互作用層析包含鍵聯至交聯型瓊脂糖之苯基部分或丁基部分。在一些實施例中，疏水相互作用層析為苯基Sepharose®層析或丁基Sepharose®層析。在一些實施例中，疏水相互作用交換層析使用以下中之一或多者：HIC平衡緩衝液、HIC加載緩衝液或HIC洗滌緩衝液，其中HIC平衡緩衝液、HIC加載緩衝液及/或HIC洗滌緩衝液在約pH 5與約pH 6之間。在一些實施例中，HIC平衡緩衝液、加載緩衝液及/或洗滌緩衝液為約pH 5.5。在一些實施例中，HIC平衡緩衝液及洗滌緩衝液包含約170mM乙酸鹽。在一些實施例中，HIC加載緩衝液為50mM Tris、100mM乙酸鈉，pH約5.5。
在一些實施例中，疏水相互作用層析包含己基部分。在一些實施例中，疏水相互作用層析包含鍵聯至羥基化甲基丙烯酸系聚合物之疏 水部分。在一些實施例中，疏水相互作用層析包含鍵聯至羥基化甲基丙烯酸系聚合物之己基部分。在一些實施例中，疏水相互作用層析為TOYOPEARL®己基650C。在一些實施例中，疏水相互作用交換層析使用以下中之一或多者：HIC平衡緩衝液、HIC加載緩衝液或HIC洗滌緩衝液，其中HIC平衡緩衝液、HIC加載緩衝液及/或HIC洗滌緩衝液在約pH 6與約pH 8之間。在一些實施例中，HIC平衡緩衝液、加載緩衝液及/或洗滌緩衝液為約pH 7.0。在一些實施例中，HIC平衡緩衝液及洗滌緩衝液包含約50mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)及125mM乙酸鹽。
在一些實施例中，疏水相互作用層析係在加載之後用HIC洗滌緩衝液洗滌。在一些實施例中，疏水相互作用洗出液係在洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
在以上態樣及實施例之一些實施例中，陰離子交換層析包含四級胺。在一些實施例中，陰離子交換層析包含鍵聯至交聯型瓊脂糖之四級胺。在一些實施例中，混合模式陰離子交換層析為Q Sepharose® Fast Flow(QSFF)層析。在一些實施例中，陰離子交換層析使用以下中之一或多者：陰離子交換預平衡緩衝液、陰離子交換平衡緩衝液或陰離子交換加載緩衝液，其中陰離子交換預平衡緩衝液、陰離子交換平衡緩衝液及/或陰離子交換加載緩衝液在約pH 8與約pH 9之間。在一些實施例中，陰離子交換預平衡緩衝液、陰離子交換平衡緩衝液及/或陰離子交換加載緩衝液為約pH 8.5。在一些實施例中，陰離子交換預平衡緩衝液包含約50mM Tris、500mM乙酸鈉。在一些實施例中，陰離子交換平衡緩衝液包含約50mM Tris。在一些實施例中，陰離子交換層析係在加載之後用陰離子交換平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，多特異性抗體係藉由鹽梯度自陰離子交換層析溶離。在一些實施例中，多特異性抗體係藉由將具有增加之鹽濃度的陰離子交換溶離緩衝液施加至陰離子交換層析而自陰離子交換層析溶離。在一些實施例中，陰離子交換溶離緩衝液包含約50mM Tris、100mM乙酸鈉，約pH 8.5。在一些實施例中，陰離子交換洗出液係在洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
在以上態樣及實施例之一些實施例中，羥磷灰石層析為陶瓷 羥磷灰石層析。在一些實施例中，羥磷灰石層析為CHT I型陶瓷羥磷灰石層析。在一些實施例中，羥磷灰石層析使用羥磷灰石緩衝液A或羥磷灰石緩衝液B中之一或多者，其中羥磷灰石緩衝液B與羥磷灰石緩衝液A相比具有較高電導率。在一些實施例中，羥磷灰石緩衝液A為平衡緩衝液，其包含約10mM磷酸鈉，約pH 6.8。在一些實施例中，羥磷灰石緩衝液B包含約10mM磷酸鈉及約1M氯化鈉，約pH 6.8。在一些實施例中，多肽或多特異性抗體係使用羥磷灰石緩衝液B/羥磷灰石緩衝液A之梯度自羥磷灰石層析溶離。在一些實施例中，梯度為線性梯度。在一些實施例中，梯度自約0%羥磷灰石緩衝液B增加至約100%羥磷灰石緩衝液B。在一些實施例中，梯度在約20個管柱體積中自0%羥磷灰石緩衝液B增加至100%羥磷灰石緩衝液B。在一些實施例中，羥磷灰石洗出液係在洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
在以上態樣及實施例之一些實施例中，陽離子交換層析包含羧酸部分或磺酸部分。在一些實施例中，羧酸部分或磺酸部分為磺丙基、磺乙基、磺異丁基或羧基部分。在一些實施例中，陽離子交換層析包含鍵聯至交聯型瓊脂糖之羧酸部分或磺酸部分。在一些實施例中，陽離子交換材料為POROS® HS 50、POROS® HS 20、SO3 Monolith、S Ceramic HyperD®、磺丙基-Sepharose® Fast Flow(SPSFF)、SP-Sepharose® XL(SPXL)、CM Sepharose® Fast Flow、CaptoTM S、Fractogel® EMD Se Hicap、Fractogel® EMD SO3 -或Fractogel® EMD COO-。在一些實施例中，陽離子交換加載密度為小於約20g/L。在一些實施例中，陽離子交換層析使用以下中之一或多者：陽離子交換預平衡緩衝液、陽離子交換平衡緩衝液、陽離子交換加載緩衝液或陽離子交換洗滌緩衝液，其中陽離子交換預平衡緩衝液、陽離子交換平衡緩衝液、陽離子交換加載緩衝液及/或陽離子交換洗滌緩衝液在約pH 5.0與約pH 6.0之間。在一些實施例中，陽離子交換陽離子交換平衡緩衝液、陽離子交換加載緩衝液及/或陽離子交換洗滌緩衝液為約pH 5.5。在一些實施例中，陽離子交換平衡緩衝液包含50mM乙酸鈉。在一些實施例中，陽離子交換洗滌緩衝液包含50mM乙酸鈉。在一些實施例中，陽離子交換層析係在加載之後用平衡緩衝液洗滌。在一些實施例中，多特異性抗體係藉 由鹽梯度自陽離子交換層析溶離。在一些實施例中，多特異性抗體係藉由將具有增加之鹽濃度的陽離子交換溶離緩衝液施加至陽離子交換層析而自陽離子交換層析溶離。在一些實施例中，陽離子交換溶離緩衝液包含500mM乙酸鈉(pH 5.8)。在一些實施例中，溶離為10%至100%陽離子交換溶離緩衝液之梯度溶離。在一些實施例中，陽離子交換洗出液係在洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
在以上態樣及實施例之一些實施例中，多特異性抗體之臂係在細胞中製備。在一些實施例中，細胞為原核細胞。在一些實施例中，原核細胞係在大腸桿菌細胞中。在一些實施例中，細胞經工程改造以表現一或多種伴侶蛋白。在一些實施例中，伴侶蛋白為FkpA、DsbA或DsbC中之一或多者。在一些實施例中，伴侶蛋白為大腸桿菌伴侶蛋白。在一些實施例中，細胞在蛋白質A層析之前經溶解以產生包含多特異性抗體或多特異性抗體之臂的細胞溶解產物。在一些實施例中，使用微流化器溶解細胞。在一些實施例中，在層析之前添加聚乙烯亞胺(PEI)至細胞溶解產物中。在一些實施例中，添加PEI至溶解產物中，達至約0.4%之最終濃度。在一些實施例中，藉由離心使細胞溶解產物澄清。
在以上態樣及實施例之一些實施例中，產物特異性雜質為以下中之一或多者：未配對抗體臂、抗體同二聚體、聚集物、高分子量物質(HMW)、低分子量物質(LMW)、酸性變異體或鹼性變異體。在一些實施例中，該等方法使組合物中之以下中之任一者的量減少：大腸桿菌蛋白質(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出蛋白質A、核酸、細胞培養基組分或病毒雜質。
在一些實施例中，多特異性抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體之第一條臂結合IL13。在一些實施例中，IL13為人類IL13。在一些實施例中，IL13包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸序列。在一些實施例中，多特異性抗體之第一條臂包含：包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的HVR-L2 及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，多特異性抗體之第一條臂包含：包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的VL序列。在一些實施例中，多特異性抗體之第一條臂包含含有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，多特異性抗體之第一條臂包含含有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，多特異性抗體之第一條臂包含含有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，抗體之第二條臂結合IL17。在一些實施例中，IL17為人類IL17。在一些實施例中，IL17包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在一些實施例中，多特異性抗體之第二條臂包含：包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，多特異性抗體之第二條臂包含：包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VL序列。在一些實施例中，多特異性抗體之第二條臂包含含有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，多特異性抗體之第二條臂包含含有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中，多特異性抗體之第二條臂包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的輕鏈。
在一些態樣中，本發明提供一種包含藉由本文所描述之方法中之任一者純化之多特異性抗體的組合物，其中組合物包含不超過約5%、4%、3%、2%或1%之產物特異性雜質。在一些實施例中，產物特異性雜質為以下中之一或多者：未配對抗體臂、抗體同二聚體、聚集物、高分子量物質(HMW)、低分子量物質(LMW)、酸性變異體或鹼性變異體。在一些實施例中，組合物包含小於約組合物包含不超過約5%、4%、3%、2%或1%之在該組合物中之以下中之任一者：大腸桿菌蛋白質(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出蛋白質A、核酸、細胞培養基組分或病毒雜質。
圖1顯示來自用於純化FkpA之填充有強陽離子交換介質SP Sepharose® Fast Flow(GE)的重力流管柱之級分的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如右側所示。
圖2顯示使用分步溶離來純化FkpA之SP Sepharose® Fast Flow(GE)層析的層析圖。
圖3A及3B顯示來自使用分步溶離來純化FkpA之SP Sepharose® Fast Flow(GE)層析之級分3-13(圖3A)及14-23(圖3B)的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如右側所示。
圖4顯示使用梯度溶離來純化FkpA之SP Sepharose® Fast Flow(GE)層析的層析圖。
圖5顯示來自用於純化FkpA之填充有陰離子交換層析介質Q Sepharose® Fast Flow(GE)及疏水相互作用層析(HIC)介質苯基Sepharose® Fast Flow(低取代)(GE)的重力流管柱之級分的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如下方所示。
圖6顯示用於純化FkpA之填充有疏水相互作用層析(HIC)介質丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow(GE)的重力流管柱之級分的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如下方所示。
圖7A及7B顯示用於純化FkpA之填充有疏水相互作用層析(HIC)介質丁基Sepharose® 4 Fast Flow(GE)的重力流管柱之級分的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如右側所示。
圖8顯示用於純化FkpA之填充有疏水相互作用層析(HIC)介質丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow(GE)的重力流管柱之級分的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如下方所示。
圖9顯示用於純化FkpA之丁基-S Sepharose® Fast Flow(GE)層析的層析圖。
圖10A顯示來自用於純化FkpA之填充有丁基-S Sepharose®材料的重力流管柱之級分的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如所示。圖10B顯示來自用於純化FkpA之填充有丁基-S Sepharose®材料的重力流管柱之級分的使用SYPRO Ruby成像之SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)。泳道1-空白，泳道2-精密標準物，泳道3-空白，來自級分22-50 10μL樣品之泳道4-SP，泳道5-空白，泳道6-F-T/W 20 10μL樣品，泳道7-空白，泳道8-PW洗出液20μL樣品，泳道9-空白，泳道10-彙集後20μL樣品。
圖11顯示自FkpA之丁基-S Sepharose®純化彙集之級分的高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析(SEC)層析圖。
圖12顯示用於純化FkpA之Superdex 200(GE)層析之操作1的層析圖。
圖13A顯示來自用於純化FkpA之Superdex 200操作1之級分的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。圖13B顯示來自用於純化FkpA之Superdex 200操作1之級分的用SYPRO Ruby成像之SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如圖13B底部所示。
圖14顯示來自用於純化FkpA之Superdex 200操作1之級分37的用SYPRO Ruby成像之SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點法。泳道標記如所示。
圖15顯示用於純化FkpA之Superdex 200之操作2的層析圖。
圖16顯示自用於純化FkpA之Superdex 200操作2彙集之級分37-44的高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析(SEC)的層析圖。
圖17顯示自用於純化FkpA之Superdex 200操作1彙集之級分35-40及自Superdex 200操作2-4彙集之級分37-44的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如所示。
圖18顯示超純FkpA在0-3次冷凍-解凍之後的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如所示。
圖19A顯示超純FkpA在0次冷凍-解凍之後之高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析(SEC)的層析圖。圖19B顯示超純FkpA在3次冷凍-解凍之後之高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析(SEC)的層析圖。
圖20顯示使用兔A、B及C之免疫前血清及抗血清直接結合ELJSA之結果。空心圓形表示來自兔A之免疫前血清，空心方形表示來 自兔B之免疫前血清，空心三角形表示來自兔C之免疫前血清，空心菱形表示來自兔A之抗血清，實心圓形表示來自兔B之抗血清，實心方形表示來自兔C之抗血清。
圖21顯示ASP抗FkpA抗體之SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如所示。
圖22顯示使用ASP抗FkpA抗體直接結合ELISA之結果。
圖23顯示使用ASP抗FkpA抗體之夾心ELISA的結果。空心圓形表示釋至1：60之偵測抗體稀，空心方形表示稀釋至1：80之偵測抗體，空心三角形表示稀釋至1：100之偵測抗體，空心菱形表示稀釋至1：110之偵測抗體。
圖24顯示ASP抗FkpA抗體之親和純化的層析圖。
圖25顯示AF-純化抗FkpA抗體之Superdex 200純化的層析圖。
圖26A顯示AF-純化抗FkpA抗體之Superdex 200純化之級分41-63的高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析(SEC)層析圖。圖26B顯示AF-純化抗FkpA抗體之Superdex 200純化之級分64-86的高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析(SEC)層析圖。
圖27顯示使用AF抗FkpA抗體之夾心ELISA的結果。空心圓形表示稀釋至1：2000之偵測抗體，空心方形表示稀釋至1：4000之偵測抗體，空心三角形表示稀釋至1：6000之偵測抗體，空心菱形表示稀釋至1：8000之偵測抗體。
圖28A顯示使用ASP抗FkpA抗體之夾心ELISA的結果。圖28B顯示使用AF抗FkpA抗體之夾心ELISA的結果。
圖29顯示AF抗FkpA抗體之高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析的層析圖。
圖30顯示AF-純化抗FkpA抗體在0-3次冷凍-解凍之後的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。泳道標記如所示。
圖31A顯示AF-純化抗FkpA抗體在0次冷凍-解凍之後的高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析(SEC)的層析圖。圖31B顯示AF-純化抗 FkpA抗體在3次冷凍-解凍之後的高效液相層析(HPLC)尺寸排阻層析(SEC)的層析圖。
圖32顯示AF抗FkpA抗體之冷凍解凍穩定性樣品的功能測試。
圖33顯示使用來自兔A、B及C之後續血液的ASP抗FkpA抗體之夾心ELISA的結果。空心圓形表示經親和純化之包被抗體，空心方形表示未溶解之包被抗體，空心三角形表示溶解之包被抗體。
圖34顯示在-70℃及2-8℃下隨時間推移對超純FkpA之對照穩定性的監測。
圖35A顯示當在0.2%魚膠、1mg/mL ApoMab或緩衝液C中稀釋至3ng/mL時隨時間推移對超純FkpA之對照穩定性的監測。圖35B顯示當在0.2%魚膠、1mg/mL ApoMab或緩衝液C中稀釋至15ng/mL時隨時間推移對超純FkpA之對照穩定性的監測。
圖36顯示使用不同FkpA標準物之夾心ELISA的結果。空心圓形表示超純FkpA標準物，空心方形表示MyBioSource FkpA標準物目錄號MBS1037402，空心三角形表示MyBioSource FkpA標準物目錄號MBS1182120。
圖37A及37B顯示在混合-模式陰離子交換(CaptoTM Adhere，圖37B)及傳統離子交換(QSFF，37A)樹脂上關於產物相關雜質之解析的高通量篩檢。
圖38A及38B顯示關於在疏水相互作用層析樹脂上在乙酸鈉中之產物結合能力的高通量篩檢結果。
圖39顯示關於在疏水相互作用層析樹脂上在乙酸鈉存在下流穿物中之FkpA含量的高通量篩檢結果。WP HI-Propyl、Toyopearl® PPG-600M、Toyopearl®苯基-650M、Toyopearl®醚-650M歸因於次最佳清除率而未執行完整測試。
圖40A、40B、40C及40D分別顯示雙特異性抗體製備方法1、2、3及4之流程圖。
本發明提供用於產生FkpA之超純組合物的方法。使用此類組合物來產生對FkpA具高度特異性且敏感之抗體。該等抗體進而適用於偵測在細菌發酵培養物中製備之重組多肽中的FkpA，在該等細菌發酵培養物中FkpA被表現以促進重組多肽摺疊及組裝。舉例而言，在諸如包括多特異性抗體之抗體的重組多肽之醫藥調配物的研製中，該等抗體可適用於釋放分析。
在一些態樣中，本發明提供在表現外源性FkpA之宿主細胞中製備的重組多肽之組合物，其中組合物包含不超過約10ppm、約9ppm、約8ppm、約7ppm、約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm或約1ppm之FkpA。在一些實施例中，重組多肽為多特異性抗體，諸如結合IL13及IL17之雙特異性抗體。
在一些態樣中，本發明提供用於純化多特異性抗體之方法，該等方法包括以下依序進行之步驟：對包含多特異性抗體之組合物進行a)蛋白質A層析，b)混合模式層析及c)疏水相互作用層析。在一些態樣中，本發明提供用於純化多特異性抗體之方法，其中多特異性抗體之個別臂係在分開的培養物中製備且藉由蛋白質A層析進行純化。經純化之抗體臂然後經組裝以製備多特異性抗體。經組裝之多特異性抗體然後依次經受混合模式陰離子交換層析及疏水相互作用層析。
在一些實施例中，本發明提供包含多特異性抗體，其基本上不含產物特異性雜質，諸如未配對抗體臂、同二聚體、聚集物、低分子量物質、酸性及鹼性變異體。在一些實施例中，組合物基本上不含製程特異性雜質，諸如大腸桿菌蛋白質及DNA及伴侶蛋白，包括FkpA、DsbA及DsbC。
I. 定義
術語「偵測」在本文中在廣義上用於包括對靶分子之定性與定量量測。偵測包括鑑別樣品中僅僅存在靶分子以及測定靶分子是否以可偵測含量存在於樣品中。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換地用於指任何長度之胺基酸的聚合物。聚合物可為直鏈或分枝鏈，其可包含經修飾胺基酸， 且其可藉由非胺基酸間斷開。術語亦涵蓋已天然地或藉由干預進行修飾之胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷醯化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組分結合。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。如本文所用之術語「多肽」及「蛋白質」特定而言涵蓋抗體。
「經純化」之多肽(例如抗體或免疫黏附素等)意謂多肽之純度已增加，使得其以比其存在於其天然環境及/或當在實驗室條件下最初合成及/或擴增時更純之形式存在。純度為相對術語且未必為平均絕對純度。
如本文所用，「超純FkpA」係指組合物中之蛋白質至少約95%為所需蛋白質FkpA的FkpA組合物。在一些實例中，超純FkpA包含至少約96%、97%、98%、99%或99.5%之FkpA。在一些實施例中，FkpA純度係藉由SEC測定。
當在提及多肽時使用時，「FkpA」蛋白質係指細菌FKBP型肽基-脯胺醯基順反異構酶。FkpA為周質蛋白二硫化物異構酶I，其展現順/反肽基-脯胺醯基異構酶(PPIase)及伴侶蛋白活性。
如本文所用，「FkpA」亦可稱為FKBP型肽基-脯胺醯基順反異構酶(FkpA)周質蛋白二硫化物異構酶I。一示例性FkpA蛋白質為大腸桿菌FkpA。SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2提供大腸桿菌FkpA之胺基酸序列。大腸桿菌FkpA基因之核酸序列由(SEQ ID NO：3)提供。在一些實施例中，大腸桿菌FkpA係指由藉由EcoGene登錄號EG12900描述之fkpA基因編碼的蛋白質。在一些實施例中，大腸桿菌FkpA係指具有由NCBI RefSeq登錄號NP_417806描述之序列的蛋白質。其他FkpA蛋白質為此項技術中已知的。FkpA蛋白質之實例可包括但不限於鮑氏志賀氏菌(S.boydii)肽基-脯胺醯基異構酶(NCBI RefSeq編號WP_000838252)、楊氏檸檬酸桿菌(C.youngae)肽基-脯胺醯基異構酶(NCBI RefSeq編號WP_006687366)、產酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)肽基-脯胺醯基異構酶(NCBI RefSeq編號WP_004125943)、腸道沙門氏菌(S.enterica)肽基-脯胺醯基異構酶(NCBI RefSeq編號WP_000838233)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肽基-脯胺醯基異構酶(NCBI RefSeq編號WP_019704642)、釀酒酵母FPR3p(NCBI RefSeq編號NP_013637)、小家鼠Fkpbla(NCBI RefSeq編號NP_032045)、小家鼠Fkpb2(NCBI RefSeq編號NP_032046)、智人FKBP2(NCBI RefSeq編號NP_001128680)及黑腹果蠅CG14715(NCBI RefSeq編號NP_650101)。在一些實施例中，本發明之FkpA蛋白質與大腸桿菌FkpA具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之一致性。在某些實施例中，大腸桿菌FkpA包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
當提及多肽時使用時，「Dsb」蛋白質係指細菌二硫化物氧化還原酶。細菌二硫化物氧化還原酶為二硫鍵家族之酶的成員。Dsb家族之成員包括DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及DsbG。在肽出現在細胞周質中時DsbA形成鏈內二硫鍵，而DsbC在細胞周質中在氧化蛋白質摺疊期間充當二硫鍵異構酶。
如本文所用，「DsbA」亦可稱為周質蛋白二硫化物異構酶I。一示例性DsbA蛋白質為大腸桿菌DsbA。大腸桿菌DsbA之胺基酸序列由NCBI登錄號NP_418297提供，而大腸桿菌dsbA基因之核酸序列由NCBI登錄號NC_000913.3或EcoGene：EG11297提供。
如本文所用，「DsbC」亦可稱為周質蛋白二硫化物異構酶II。一示例性DsbC蛋白質為大腸桿菌DsbC。大腸桿菌DsbC之胺基酸序列由NCBI登錄號NP_417369.1提供，而大腸桿菌DsbC基因之核酸序列由NCBI登錄號NC_000913.3或EcoGene：EG11070提供。
「樣品」係指較大量之材料的一小部分。一般而言，對樣品執行根據本文所描述之方法進行的測試。樣品典型地獲自重組多肽製劑，該重組多肽製劑例如獲自所培養之在本文中亦稱為「產物細胞株」的表現重組多肽之細胞株，或來自所培養之宿主細胞。如本文所用，「宿主細胞」不含用於表現所關注之重組多肽或產物之基因。樣品可獲自例如但不限於所收穫之細胞培養物流體、純化製程中之某一步驟的製程中彙集物或最終純化產物。
「捕獲抗體」係指特異性結合樣品中之靶分子的抗體。在某些條件下，捕獲抗體與靶分子形成複合物，使得抗體-靶分子複合物可與樣品之其餘部分分離開。在某些實施例中，此類分離可包括洗掉樣品中不結合捕獲抗體之物質或材料。在某些實施例中，捕獲抗體可附接於固體支撐物表面，諸如但不限於板或珠粒。
「偵測抗體」係指特異性結合樣品中或樣品-捕獲抗體組合物質中之靶分子的抗體。在某些條件下，偵測抗體與靶分子或與靶分子-捕獲抗體複合物形成複合物。偵測抗體能夠直接通過可擴增之標記物，或間接地例如通過使用經標記且結合偵測抗體之另一抗體來進行偵測。對於直接標記，偵測抗體典型地結合至可藉由一些手段偵測之部分，例如包括但不限於，生物素或釕。
術語「標記物」或「可偵測標記物」係指可鍵聯至所要偵測或定量之物質(例如抗體)的任何化學基團或部分。典型地，標記物為可偵測標記物，其適合用於物質之靈敏偵測或定量。可偵測標記物之實例包括但不限於冷光標記物，例如螢光、磷光、化學發光、生物發光及電化學發光標記物、放射性標記物、酶、粒子、磁性體、電活性物質及類似物。或者，可偵測標記物可藉由參與特異性結合反應來傳達其存在之信號。此類標記物之實例包括半抗原、抗體、生物素、鏈黴親和素、His-標籤、氮基三乙酸、麩胱甘肽S-轉移酶、麩胱甘肽及類似物。
術語「偵測手段」係指用於通過信號報導來偵測可偵測抗體之存在的部分或技術，該信號報導然後在分析中被讀出。典型地，偵測手段採用擴增經固定之標記物的試劑，該經固定之標記物為諸如捕獲至微量滴定板上之標記物，例如親和素或鏈黴親和素-HRP。
「光致發光」係指使得材料在彼材料吸收光(或者稱為電磁輻射)之後發冷光的製程。螢光及磷光為兩種不同類型之光致發光。
「化學發光」製程涉及藉由化學反應產生冷光物質。「電化學發光」或「ECL」為使得物質(例如抗體)在彼物質在適當之周圍化學環境中暴露於電化學能後發冷光的製程。
「結合」所關注之抗原(例如宿主細胞蛋白質)的抗體為以足 夠的親和力結合抗原以使得抗體適合作為分析試劑(例如作為捕獲抗體或作為偵測抗體)的抗體。典型地，此類抗體不顯著地與其他多肽交叉反應。
關於多肽與靶分子之結合，術語「特異性結合」特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基或「與特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基特異性結合」或者「對特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基具特異性」意謂可量測地不同於非特異性相互作用的結合。特異性結合可例如藉由與對照分子之結合相比測定靶分子之結合來量測，其通常為具有類似結構之不具有結合活性的分子。在一些實施例中，本發明提供一種特異性結合FkpA之多株抗體的製劑。舉例而言，多株抗體製劑中至少約95%、約96%、約97%、約98%或約99%之抗體結合所需多肽(例如FkpA)。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗體及抗原)之間的1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可藉由解離常數(Kd)來表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法來量測，包括本文所描述之彼等。
「活性的」或「活性」出於本文之目的係指保留天然或天然存在之多肽的生物及/或免疫活性之多肽的形式，其中「生物」活性係指由天然或天然存在之多肽引起的除誘導產生針對天然或天然存在之多肽所具有之抗原決定基的抗體的能力以外的生物功能(抑制或刺激)，而「免疫」活性係指誘導產生針對天然或天然存在之多肽所具有之抗原決定基的抗體的能力。
術語「拮抗劑」係在廣義上使用，且包括部分或完全阻斷、抑制或中和天然多肽之生物活性的任何分子。以類似方式，術語「促效劑」係在廣義上使用且包括模擬天然多肽之生物活性的任何分子。適合之促效劑或拮抗劑分子特定而言包括促效劑或拮抗劑抗體或抗體片段、天然多肽之片段或胺基酸序列變異體等。用於鑑別多肽之促效劑或拮抗劑的方法可包括使多肽與候選促效劑或拮抗劑分子接觸及量測通常與多肽相關之一或多種生物活性的可偵測變化。
本文之術語「抗體」係在廣義上使用且特定而言涵蓋單株抗體、多株抗體、半抗體、由至少兩個完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需生物活性。術語「免疫球蛋白」(Ig)在本文中與抗體可互換使用。
抗體為天然存在之免疫球蛋白分子，其具有變化之結構，該等變化之結構全部係基於免疫球蛋白摺疊。舉例而言，IgG抗體具有兩條「重」鏈及兩條「輕」鏈，該兩個重鏈與該兩個輕鏈經二硫鍵鍵結以形成功能抗體。作為另一實例，藉由一或多個二硫鍵鍵聯之一條重鏈及一條輕鏈形成功能半抗體。各重鏈及輕鏈本身包含「恆定」(C)及「可變」(V)區。V區決定抗體之抗原結合特異性，而C區提供結構支撐及在與免疫效應子非抗原特異性相互作用中之特異性功能。抗體或抗體之抗原結合片段的抗原結合特異性為抗體與特定抗原特異性結合之能力。
抗體之抗原結合特異性係藉由V區之結構特徵來測定。在可變域之110-胺基酸跨度上可變性不均勻分佈。替代地，V區由具有15-30個胺基酸之稱為構架區(FR)之相對不變的延伸段組成，該等相對不變的延伸段由各9-12個胺基酸長之稱為「高變區」之具有極大可變性的較短區域分隔開。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FR，其大部分採取β-摺疊組態，由三個高變區連接，該三個高變區形成連接β-摺疊結構且在一些情況下形成β-摺疊結構之一部分的環。各鏈中之高變區藉由FR而緊密相鄰地保持在一起，且與另一條鏈之高變區一起有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如參與抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
各V區典型地包含三個互補決定區(「CDR」，其各自含有「高變環」)及四個構架區。因此，抗體結合位點(以實質親和力與特定所需抗原結合所需之最小結構單元)將典型地包括三個CDR及分散在其間以保持及呈現呈適當構象之CDR的至少三個、較佳四個構架區。經典四鏈抗體具有由VH及VL結構域合作確定之抗原結合位點。某些抗體(諸如駱駝及鯊 魚抗體)缺少輕鏈且依賴於僅由重鏈形成之結合位點。可製備單域工程改造免疫球蛋白，其中結合位點係在不存在VH與VL之間的合作的情況下單獨由重鏈或輕鏈形成。
術語「可變」係指以下事實：抗體之間可變域之某些部分的序列非常不同，且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性中。然而，在抗體之可變域中可變性不均勻分佈。其集中於在輕鏈與重鏈可變域中稱為高變區之三個區段中。可變域之更高度保守的部分稱為構架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FR，其大部分採取β-摺疊組態，由三個高變區連接，該三個高變區形成連接β-摺疊結構且在一些情況下形成β-摺疊結構之一部分的環。各鏈中之高變區藉由FR而緊密相鄰地保持在一起，且與另一條鏈之高變區一起有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如參與抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
術語「高變區」當在本文中使用時係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區可包含「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如在VL中圍繞約殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)，及在VH中圍繞約31-35B(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))及/或「高變環」之彼等殘基(例如VL中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)，及VH中之26-32(H1)、52A-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之高變區殘基以外之彼等可變域殘基。
「鉸鏈區」在抗體或半抗體之情形下通常定義為自人類IgG1之Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol.22：161-206(1985))。其他IgG同型之鉸鏈區可藉由將形成重鏈間S-S鍵之第一個及最後一個半胱胺酸殘基放置在相同位置來與IgG1序列比對。
Fc區之「下部鉸鏈區」通常定義為緊鄰C端位置至鉸鏈區之一段殘基，亦即Fc區之殘基233至239。在本發明之前，通常將FcγR結合歸因於IgG Fc區之下部鉸鏈區中的胺基酸殘基。
人類IgG Fc區之「CH2結構域」通常自IgG之約殘基231延伸至約340。CH2結構域為獨特的，因為其不與另一結構域緊密地配對。更確切些，兩個N-鍵聯分枝鏈碳水化合物鏈插入完整天然IgG分子之兩個CH2結構域之間。已推測碳水化合物可提供結構域-結構域配對之替代物且幫助穩定CH2結構域。(Burton,Molec.Immunol.22：161-206(1985))。
「CH3結構域」包含Fc區中C端至CH2結構域之一段殘基(亦即IgG之約胺基酸殘基341至約胺基酸殘基447)。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳包含其抗原結合區。抗體片段之實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段；雙功能抗體；串聯雙功能抗體(taDb)、線性抗體(例如美國專利第5,641,870號，實例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；單臂抗體、單可變域抗體、微抗體、單鏈抗體分子；由抗體片段形成之多特異性抗體(例如包括但不限於Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、di-scFv、bi-scFv或串聯(di,tri)-scFv))；及雙特異性T細胞銜接子(BiTE)。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個稱為「Fab」片段之相同抗原結合片段及殘餘「Fc」片段(名稱反映容易結晶之能力)。Fab片段由整個L鏈以及H鏈之可變區結構域(VH)及一條重鏈之第一恆定域(CH1)組成。胃蛋白酶處理抗體產生單一大F(ab’)2片段，其大致對應於具有二價抗原結合活性之經二硫鍵鍵聯之兩個Fab片段且仍能夠交聯抗原。Fab’片段與Fab片段之不同在於在CH1結構域之羧基末端具有額外的幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。在本文中Fab’-SH為恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab’的名稱。最初產生呈Fab’片段對之形式的F(ab’)2抗體片段，其間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學偶合亦為已知的。
「Fv」為含有完整抗原-識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此區域由緊密、非共價締合之一個重鏈及一個輕鏈可變域的二聚體組成。正是在此組態中，各可變域之三個高變區相互作用以確定VH-VL二聚 體之表面上的抗原結合位點。總起來說，六個高變區賦予抗體抗原-結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含對抗原具特異性之三個高變區之半個Fv)亦具有識別及結合抗原之能力，不過親和力比整個結合位點低。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab’片段與Fab片段之不同在於在重鏈CH1結構域之羧基末端具有幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。在本文中Fab’-SH為恆定域之半胱胺酸殘基帶有至少一個游離硫醇基之Fab’的名稱。最初產生呈Fab’片段對之形式的F(ab’)2抗體片段，其間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學偶合亦為已知的。
任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」均可基於其恆定域之胺基酸序列分配至稱為κ及λ之兩種明顯不同之類型中之一者中。
視其重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，抗體可分配至不同類別中。存在五種主要類別之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於抗體之不同類別的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之亞單位結構及三維組態為熟知的。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL結構域，其中此等結構域存在於單一多肽鏈中。在一些實施例中，Fv多肽進一步包含VH與VL結構域之間使scFv能夠形成為抗原結合所需之結構的多肽連接子。關於scFv之評述，參見Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含與同一多肽鏈(VH-VL)中之輕鏈可變域(VL)連接之重鏈可變域(VH)。藉由使用太短而不允許同一鏈上之兩個結構域之間配對的連接子，迫使結構域與另一條鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)中。
如本文所用之術語「半抗體」或「半聚體(hemimer)」係指單價抗原結合多肽。在某些實施例中，半抗體或半聚體包含VH/VL單元及視情況存在之免疫球蛋白恆定域之至少一部分。在某些實施例中，半抗體或半聚體包含與免疫球蛋白輕鏈相關聯之免疫球蛋白重鏈，或其抗原結合片段。在某些實施例中，半抗體或半聚體具單特異性，亦即與單一抗原或抗原決定基結合。在某些此類實施例中，半抗體與IL-13結合而不與IL-17結合。在某些其他實施例中，半抗體與IL-17結合而不與IL-13結合。熟習此項技術者將容易地瞭解，半抗體可具有由例如源於駱駝科之單一可變域組成之抗原結合域。
術語「VH/VL單元」係指抗體中包含至少一個VH HVR及至少一個VL HVR之抗原-結合區。在某些實施例中，VH/VL單元包含至少一個、至少兩個或全部三個VH HVR及至少一個、至少兩個或全部三個VL HVR。在某些實施例中，VH/VL單元進一步包含構架區(FR)之至少一部分。在一些實施例中，VH/VL單元包含三個VH HVR及三個VL HVR。在一些此類實施例中，VH/VL單元包含至少一個、至少兩個、至少三個或全部四個VH FR及至少一個、至少兩個、至少三個或全部四個VL FR。
術語「多特異性抗體」係在廣義上使用且特定而言涵蓋包含含有多抗原決定基特異性(亦即能夠與一個生物分子上之兩個或更多個不同之抗原決定基特異性結合或能夠與兩個或更多個不同生物分子上之抗原決定基特異性結合)之抗原結合域的抗體。在一些實施例中，多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)之抗原結合域包含兩個VH/VL單元，其中第一VH/VL單元與第一抗原決定基特異性結合，且第二VH/VL單元與第二抗原決定基特異性結合，其中各VH/VL單元包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。此類多特異性抗體包括但不限於全長抗體；具有兩個或更多個VL及VH結構域之抗體；諸如Fab、Fv、dsFv、scFv之抗體片段；雙功能抗體；雙特異性雙功能抗體及三功能抗體；已共價或非共價鍵聯之抗體片段。進一步包含重鏈恆定區之至少一部分及/或輕鏈恆定區之至少一部分的VH/VL單元亦可稱為「半聚體」或「半抗體」。在一些實施例中，半抗體包含單一重鏈可變區之至少一部分及單一輕鏈可變區之至少一部分。在一些此類實施例 中，包含兩個半抗體且與兩種抗原結合之雙特異性抗體包含：第一半抗體，其與第一抗原或第一抗原決定基結合但不與第二抗原或第二抗原決定基結合；及第二半抗體，其與第二抗原或第二抗原決定基結合而不與第一抗原或第一抗原決定基結合。根據一些實施例，多特異性抗體為IgG抗體，其以5M至0.001pM、3M至0.001pM、1M至0.001pM、0.5M至0.001pM或0.1M至0.001pM之親和力與各抗原或抗原決定基結合。在一些實施例中，半聚體包含充足的重鏈可變區之部分以允許與第二半聚體形成分子內二硫鍵。在一些實施例中，半聚體包含杵突變(Knob mutation)或臼突變(hole mutation)，例如以允許與包含互補臼突變或杵突變之第二半聚體或半抗體異二聚化。以下進一步論述杵突變及臼突變。
「雙特異性抗體」為包含能夠與一個生物分子上之兩個不同抗原決定基特異性結合或能夠與兩個不同生物分子上之抗原決定基特異性結合的抗原結合域的多特異性抗體。雙特異性抗體在本文中亦可稱為具有「雙重特異性」或為「雙重特異性的」。除非另外指出，否則在雙特異性抗體名稱中列舉由雙特異性抗體結合之抗原的順序為任意的。換句話說，在一些實施例中，術語「抗IL-13/IL-17雙特異性抗體」及「抗IL-17/IL-13雙特異性抗體」可為可互換使用的。在一些實施例中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中各半抗體包含單一重鏈可變區及視情況存在之重鏈恆定區的至少一部分，及單一輕鏈可變區及視情況存在之輕鏈恆定區的至少一部分。在某些實施例中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中各半抗體包含單一重鏈可變區及單一輕鏈可變區而不包含超過一個單一重鏈可變區且不包含超過一個單一輕鏈可變區。在一些實施例中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中各半抗體包含單一重鏈可變區及單一輕鏈可變區，且其中第一半抗體與第一抗原結合而不與第二抗原結合，且第二半抗體與第二抗原結合而不與第一抗原結合。
如本文所用之術語「杵入臼」或「KnH」技術係指在活體外或活體內藉由在相互作用之界面將突起(杵)引入一個多肽中且將空腔(臼)引入另一多肽中而引導兩個多肽配對在一起的技術。舉例而言，已在抗體之Fc：Fc結合界面、CL：CH1界面或VH/VL界面處引入KnH(參見例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431及Zhu等人，1997，Protein Science 6：781-788)。在一些實施例中，KnH在多特異性抗體之製造期間驅使兩個不同重鏈配對在一起。舉例而言，在Fc區中具有KnH之多特異性抗體可進一步包含鍵聯至各Fc區之單一可變域，或進一步包含與類似或不同輕鏈可變域配對之不同重鏈可變域。KnH技術亦可用於使兩個不同受體胞外結構域配對在一起或使任何其他多肽序列包含不同目標識別序列(例如包括親和體、肽體及其他Fc融合物)配對。
如本文所用之術語「杵突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將突起(杵)引入多肽中的突變。在一些實施例中，另一多肽具有臼突變(參見例如US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、US 7,695,936、US 8,216,805、WO2011/133886、WO2013055958，其各自以全文引用之方式併入本文中)。
如本文所用之術語「臼突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將空腔(臼)引入多肽中的突變。在一些實施例中，另一多肽具有杵突變(參見例如US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、US 7,695,936、US 8,216,805，其各自以全文引用之方式併入本文中)。
表述「單域抗體」(sdAb)或「單可變域(SVD)抗體」泛指單一可變域(VH或VL)可使得抗原結合之抗體。換言之，單一可變域不需要與另一可變域相互作用來識別靶標抗原。單域抗體之實例包括衍生自駱駝(美洲駝(lama)及駱駝)及軟骨魚(例如護士鯊(nurse shark))之彼等及由重組方法衍生自人類及小鼠抗體之彼等(Nature(1989)341：544-546；Dev Comp Immunol(2006)30：43-56；Trend Biochem Sci(2001)26：230-235；Trends Biotechnol(2003)：21：484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；FEBS Lett(1994)339：285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
如本文所用之術語「單株抗體」係指獲自實質上均質之抗體群體的抗體，亦即除了在單株抗體之製備期間可能出現之可能的變異體(此類變異體通常以少量存在)，包含該群體之個別抗體為相同的及或結合相同之抗原決定基。與典型地包括針對不同決定位(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比之下，各單株抗體係針對抗原上之單一決定位。除其特異 性之外，單株抗體為有利的，因為其未由其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體之特性為獲自實質上均質之抗體群體，且不應視為需要藉由任何特定方法來製備抗體。舉例而言，要根據本文所提供之方法使用的單株抗體可藉由Kohler等人，Nature 256：495(1975)首次描述之雜交瘤法而製得，或可藉由重組DNA法(參見例如美國專利第4,816,567號)而製得。「單株抗體」亦可使用描述於例如Clackson等，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)人中之技術自噬菌體抗體文庫中分離。
本文中之單株抗體特定而言包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之對應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之對應序列一致或同源，以及此類抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文所關注之嵌合抗體包括「靈長類動物化」抗體，其包含衍生自非人類靈長類動物(例如舊大陸猴，諸如狒狒、恆河猴或食蟹猴)之可變域抗原-結合序列及人類恆定區序列(美國專利第5,693,780號)。
非人類(例如鼠)抗體之「人類化」形式為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在極大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之高變區的殘基由具有所需特異性、親和力及能力之來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種之高變區(供體抗體)的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基由對應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個且典型地兩個可變域，其中全部或實質上全部之高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等且全部或實質上全部之FR為人類免疫球蛋白序列之彼等，除了如上文所提及之FR取代。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區之至少一部分，典型地為人類免疫球蛋白之恆定區。關於其他細節，參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
出於本文之目的，「完整抗體」為包含重鏈及輕鏈可變域以及Fc區之抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。較佳地，完整抗體具有一或多種效應功能。
「天然抗體」通常為約150,000道爾頓之異四聚體醣蛋白，由兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈組成。各輕鏈藉由一個共價二硫鍵鍵聯至重鏈，同時在不同免疫球蛋白同型之重鏈間二硫鍵之數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔開之鏈內二硫鍵。各重鏈在一個末端具有可變域(VH)，隨後為許多恆定域。各輕鏈在一個末端具有可變域(VL)且在其另一末端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。鹹信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。
「裸抗體」為一種抗體(如本文所定義)，其不與異源分子(諸如細胞毒性部分或放射性標記物)結合。
如本文所用，術語「免疫黏附素」命名將異源蛋白質之結合特異性(「黏附素」)與免疫球蛋白恆定域之效應功能組合起來的分子。在結構上，免疫黏附素包含含有所需結合特異性之胺基酸序列(該胺基酸序列不為抗體之抗原識別及結合位點(即與抗體之恆定區相比為「異源的」))與免疫球蛋白恆定域序列(例如IgG之CH2及/或CH3序列)的融合。示例性黏附素序列包括包含與所關注之蛋白質結合的受體或配位體之一部分的連續胺基酸序列。黏附素序列亦可為結合所關注之蛋白質但不為受體或配位體序列的序列(例如肽體中之黏附素序列)。此類多肽序列可藉由各種方法加以選擇或鑑別，包括噬菌體展示技術及高通量分選方法。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可獲自任何免疫球蛋白，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1及IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
在一些實施例中，抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)的彼等生物活性，且隨抗體同型之變化而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性 細胞毒性；Fc受體結合；抗體-依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體之下調。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指分子在補體存在下溶解靶標之能力。補體活化路徑係藉由補體系統之第一組分(C1q)結合於與同源抗原複合之分子(例如多肽(例如抗體))來啟動。為評估補體活化，可執行例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所描述之CDC分析。
「抗體-依賴性細胞介導的細胞毒性」及「ADCC」係指細胞-介導之反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞及巨噬細胞)識別靶細胞上所結合之抗體且隨後引起靶細胞之溶解。用於調節ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)之第464頁上之表3中。為評估所關注之分子的ADCC活性，可執行活體外ADCC分析，諸如描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中之彼等。適用於此類分析之效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，所關注之分子的ADCC活性可在活體內進行評估，例如在諸如揭示Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656(1998)中之彼等的動物模型中進行評估。
「人類效應細胞」為表現一或多個FcR且執行效應功能之白細胞。在一些實施例中，細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白細胞之實例包括外周血單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性粒細胞；其中PBMC及NK細胞為較佳的。
術語「Fc受體」或「FcR」用於描述與抗體之Fc區結合的受體。在一些實施例中，FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括對偶變異體及或者此等受體之剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要在其胞漿域方面有所不 同之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)(參見Daëron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR評述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。本文中之術語「FcR」涵蓋其他FcR(包括將來要鑑別之彼等)。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源性核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括原代轉型細胞及由其衍生之子代，而不考慮傳數次數。子代之核酸含量可能不與親本細胞完全相同，但可含有突變。本文包括具有與關於最初轉型細胞中所篩選或選擇的相同之功能或生物活性的突變子代。
如本文所用之術語「雜質」係指不同於所需多肽產物之材料或物質。在某些實施例中，多肽產物包含抗體，包括雙特異性抗體。雜質包括但不限於：宿主細胞物質，諸如大腸桿菌宿主細胞蛋白質(ECP)；浸出蛋白質A；核酸；所需多肽之變異體、片段、聚集物或衍生物；另一多肽；內毒素；病毒；細胞培養基組分等。在一些實例中，雜質可為來自例如但不限於以下之宿主細胞蛋白質(HCP)：細菌細胞，諸如大腸桿菌細胞(例如ECP)、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、真菌細胞。在一些實施例中，雜質可為切短之FkpA及/或FkpA之聚集物。在一些實施例中，雜質可指用於促進多特異性抗體之表現、摺疊或組裝之輔助蛋白；例如伴侶蛋白，諸如FkpA、DsbA及DsbC。在一些實施例中，雜質可指產物特異性多肽，諸如單臂抗體及錯誤組裝之抗體、包括鹼性變異體及酸性變異體之抗體變異體及聚集物。
「經分離」之核酸係指已與天然環境之組分分離的核酸分子。經分離之核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該 核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性的一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以此項技術中之技術範圍內的各種方式來達成，例如使用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體之公眾可獲得之電腦軟體來達成。熟習此項技術者可確定適合用於比對序列之參數，包括為在所比較之序列的全長上達成最大比對所需之任何算法。在某些實施例中，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.授權，且源代碼已在美國版權局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)與用戶文檔一起提交，其中其登記在美國版權登記號TXU510087下。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.,South San Francisco,California公開獲得，或可由源代碼編譯而來。ALIGN-2程式應經編譯在包括數位UNIX V4.0D之UNIX作業系統上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況中，給定胺基酸序列A對、與或針對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(其或者可用片語具有或包含對、與或針對給定胺基酸序列B之某一胺基酸序列一致性%的給定胺基酸序列A來表述)係如下計算：100乘以分數X/Y
其中X為在A與B之程式ALIGN-2之比對中，由該序列比對程式記為一致匹配之胺基酸殘基的數目，並且其中Y為B中之胺基酸殘基的總數目。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對B之胺基酸序列一致性%將不等於B對A之胺基酸序列一致性%。除非另外特別陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值均如前一段落中所描述使用ALIGN-2電腦程式而獲得。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別VH及VL)的可變 域通常具有類似結構，其中各結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原-結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用結合該抗原之抗體的VH或VL結構域分別篩選互補VL或VH結構域之文庫來進行分離。參見例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，術語「載體」係指能夠使與其連接之另一核酸增殖的核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構形式之載體以及併入已引入之宿主細胞之基因組的載體。某些載體能夠引導與其可操作地連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文關於層析所用之術語「依序」係指依次具有第一層析步驟及第二層析步驟。在一些實施例中，術語「依序」係在第一層析步驟之後有超過一個其他步驟之情形下使用。在一些實例中，如本文關於層析所用之術語「依序」係指按特定順序進行之層析步驟；例如第一層析步驟，隨後第二層析步驟，隨後第三層析步驟等。在依序進行之第一層析步驟及其他層析步驟之間可包括其他步驟，包括但不限於非層析步驟(例如pH值及/或電導率調節、過濾、濃縮)。
如本文關於層析所用之術語「連續」係指具有直接連接之第一層析材料及第二層析材料或允許兩種層析材料之間連續流動的另外一些機構。
「加載密度」係指質量量，例如與一定體積(例如公升)之層析材料接觸的組合物的公克數。在一些實例中，加載密度以g/L表示。
本文提及「約」一值或參數時包括(並且描述)關於該值或參數本身之變化型式。舉例而言，提及「約X」之描述包括對「X」之描述。
除非上下文另外明確指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一個(種)(a/an)」、「或」及「該」包括複數指示物。應瞭解，本文所描述之本發明態樣及變化型式包括「由態樣及變化型式組成」及/或「基本上由態樣及變化型式組成」。
II. 純化FkpA之方法
本文提供用於產生FkpA之超純製劑的方法。在一些實施例中，該等製劑包含超過約95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%中之任一者純的FkpA。在一些實施例中，99%純FkpA之製劑表明製劑中之物質中不超過1%為存在於在FkpA之製備期間所存在之細胞或細胞溶解產物(例如蛋白質、核酸、脂質等)中的物質。99%純FkpA製劑可含有用於純化或調配FkpA之緩衝液、鹽或其他賦形劑。
在一些態樣中，本發明提供用於產生FkpA之超純製劑的方法。在一些實施例中，FkpA係藉由使FkpA在細菌發酵培養物(諸如大腸桿菌培養物)中過表現來製備。在一些實施例中，諸如大腸桿菌培養物之細菌發酵培養物除內源性FkpA之外亦表現外源性FkpA。在一些實施例中，FkpA係藉由使外源性FkpA在細菌發酵培養物(諸如大腸桿菌培養物)中表現來製備。因此，在某些實施例中，該方法進一步包括在允許外源性FkpA表現之條件下培養大腸桿菌培養物的步驟。在發酵之後，收集細菌細胞並離心。將所得細胞糊狀物再懸浮於溶解緩衝液(例如25mM MES pH 6.0)中且溶解(例如藉由使用微流化器)。在一些實施例中，將細胞溶解產物用聚乙烯亞胺(PEI)調節。在一些實施例中，細胞溶解產物係以超過約0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1.0%中之任一者的最終濃度用PEI調節。在一些實施例中，細胞溶解產物係用PEI調節超過約15min、30min、45min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h、16h、20h或24h中之任一者。在一些實施例中，細胞溶解產物係在超過約0℃、4℃或21℃中之任一者下用PEI調節。在一些實施例中，細胞溶解產物係在周圍溫度下(約21℃)用PEI調節。在一些實施例中，經PEI調節之溶解產物經離心以移除粒子。在一些實施例中，經PEI調節之溶解產物在層析之前經過濾。在一些實施例中，經PEI調節之溶解產物在層析之前經22μm過濾器過濾。
在一些實施例中，該方法包括用於自包含FkpA多肽及雜質之細胞溶解產物中純化FkpA多肽的方法，該方法包括b)藉由離心使細胞溶解產物澄清，c)將經澄清之包含FkpA多肽之細胞溶解產物施加至陽離子交 換層析材料，d)使FkpA多肽自陽離子交換層析材料溶離，以產生包含FkpA多肽之陽離子交換洗出液，e)將包含FkpA多肽之陽離子交換洗出液施加至疏水相互作用層析(HIC)材料，f)使FkpA多肽自HIC材料溶離以產生HIC洗出液，g)將包含FkpA多肽之HIC洗出液施加至尺寸排阻層析，h)由尺寸排阻層析收集包含經純化FkpA多肽之級分。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換層析材料為固相，其含有帶負電荷之基團(「配位體」)且具有用於與在固相上或通過固相傳送之水溶液中之陽離子進行交換的游離陽離子。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換材料可為膜、整體柱或樹脂。在一實施例中，陽離子交換材料可為樹脂。在上文之一些實施例中，陽離子交換層析材料為陽離子交換層析管柱。在上文之一些實施例中，陽離子交換層析材料為陽離子交換層析膜。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換材料可利用習知層析材料或對流層析材料。習知層析材料包括例如灌注材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂)及擴散材料(例如交聯型瓊脂糖樹脂)。在一些實施例中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)樹脂可為POROS®樹脂。在一些實施例中，交聯型瓊脂糖樹脂可為磺丙基-Sepharose® Fast Flow(「SPSFF」)樹脂。對流層析材料可為膜(例如聚醚碸)或整體柱材料(例如交聯聚合物)。聚醚碸膜可為Mustang。交聯聚合物整體柱材料可為交聯聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-共-二甲基丙烯酸伸乙酯)。
在該等方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換材料包含羧酸官能基或磺酸官能基。在一些實施例中，官能基為磺丙基、磺乙基、磺異丁基或羧基。在一些實施例中，陽離子交換材料為膜、整體柱或樹脂粒子。在一些實施例中，陽離子交換材料為樹脂。在一些實施例中，陽離子交換材料為Mustang S、Sartobind S、SO3 Monolith、S Ceramic HyperD、POROS® HS50、POROS® HS20、磺丙基-Sepharose® Fast Flow(SPSFF)、SP-Sepharose® XL(SPXL)、CM Sepharose® Fast Flow、CaptoTM S、Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3或Fractogel COO。在一些實施例中，陽離子交換材料為POROS® HS50。陰離子交換材料之實例為此項技術中已知的且包括 但不限於POROS® HQ 50、POROS® PI 50、POROS® D、Mustang Q、Q Sepharose® FF(QSFF)及DEAE Sepharose®或其等效物。在一些實施例中，陰離子交換材料為弱陰離子交換材料；例如DEAE。在其他實施例中，陰離子交換材料為強陰離子交換材料；例如QSFF。在一些實施例中，用於純化FkpA之陰離子交換材料為弱陰離子交換材料。在一些實施例中，弱陰離子交換材料包含四級胺。在一些實施例中，四級胺鍵聯至交聯型瓊脂糖。在一些實施例中，用於純化FkpA之陰離子交換材料為DEAE Sepharose®。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，疏水相互作用層析(HIC)為根據疏水性分離生物分子之液相層析技術。HIC材料之實例包括但不限於Toyopearl®己基650、Toyopearl®丁基650、Toyopearl®苯基650、Toyopearl®醚650、Source、Resource、Sepharose® Hi-Trap、丁基sepharose®、辛基sepharose®、苯基sepharose®。在上文之一些實施例中，HIC材料為HIC管柱。在上文之一些實施例中，HIC材料為HIC膜。在一些實施例中，HIC材料包含丁基部分。在一些實施例中，丁基部分鍵聯至交聯型瓊脂糖。在一些實施例中，用於純化FkpA之HIC材料為丁基Sepharose®。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，尺寸排阻層析為根據尺寸及形狀分離生物分子之液相層析技術。尺寸排阻層析材料進入不同孔徑以有效分離具有特定重量範圍之分子。尺寸排阻層析材料之實例包括但不限於右旋糖酐、多孔瓊脂糖粒子、交聯型瓊脂糖、交聯型瓊脂糖及右旋糖酐及交聯丙烯醯胺。尺寸排阻層析材料之實例包括但不限於Sephadex、Superdex、Sephacryl、TSKgel及Bio-Gel。在一些實施例中，在FkpA之純化中使用Superdex 75尺寸排阻層析。
包含FkpA之組合物加載於層析材料上可經最佳化使FkpA產物與雜質分離。在一些實施例中，組合物加載至層析材料上經最佳化使雜質與層析材料結合。舉例而言，可在許多不同pH值下之加載緩衝液中將組合物加載至層析材料(例如層析管柱)上，而加載緩衝液之電導率為恆定的。或者，可在許多不同電導率下之加載緩衝液中將組合物加載至層析材料上，而加載緩衝液之pH值為恆定的。在將組合物加載於層析材料上完成 後，且在產物自層析材料溶離至彙集物級分中之後，彙集物級分中之雜質的量提供關於在給定pH值或電導率下產物與雜質之分離的資訊。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，以每毫升陽離子交換層析材料小於或等於約10mg、9mg、8mg、7mg、6mg、5mg、4mg、3mg、2mg或1mg中之任一者的多肽的加載密度將包含FkpA之組合物加載至陽離子交換層析材料上。可將組合物以每毫升陽離子交換層析材料約1mg與2mg、2mg與3mg、3mg與4mg、4mg與5mg、5mg與6mg、6mg與7mg、7mg與8mg、8mg與9mg或9mg與10mg中之任一者之間的多肽加載密度加載至陽離子層析材料上。在一些實施例中，陽離子交換層析材料為與磺丙基交聯之瓊脂糖；例如SP Sepharose®。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，以每毫升HIC材料小於或等於約10mg、9mg、8mg、7mg、6mg、5mg、4mg、3mg、2mg或1mg中之任一者的多肽的加載密度將包含FkpA之組合物加載至HIC材料上。可將組合物以每毫升HIC材料約1mg與2mg、2mg與3mg、3mg與4mg、4mg與5mg、5mg與6mg、6mg與7mg、7mg與8mg、8mg與9mg或9mg與10mg中之任一者之間的多肽的加載密度加載至HIC材料上。在一些實施例中，HIC材料為與丁基部分交聯之交聯型瓊脂糖；例如丁基Sepharose®。
FkpA自層析材料之溶離可經最佳化而以最少之雜質且以最小彙集物體積產生FkpA。舉例而言，可在加載緩衝液中將組合物加載至層析材料(例如層析管柱)上。在加載完成之後，最初將層析材料洗滌且然後用許多不同pH值下之緩衝液溶離，而溶離緩衝液之電導率為恆定的。或者，可使產物在許多不同電導率下之溶離緩衝液中自層析材料溶離，而溶離緩衝液之pH值為恆定的。在產物自層析材料溶離完成之後，彙集物級分中之雜質的量提供關於在給定pH值或電導率下產物與雜質之分離的資訊。產物在高數目之級分(例如八個管柱體積)中溶離指示溶離型態之「拖尾」。在本發明之一些實施例中，溶離之拖尾降至最低程度。
視例如所需緩衝液pH值、所需緩衝液電導率、所關注蛋白質之特徵及純化方法而定可採用各種緩衝液。在本文所描述之方法中之任 一者的一些實施例中，該等方法包括使用緩衝液。緩衝液可為加載緩衝液、平衡緩衝液或洗滌緩衝液。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中之一或多者為相同的。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液為不同的。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，緩衝液包含鹽。加載緩衝液可包含氯化鈉、乙酸鈉或其混合物。在一些實施例中，加載緩衝液為氯化鈉緩衝液。在一些實施例中，加載緩衝液為乙酸鈉緩衝液。
如本文所用之加載物為加載至層析材料上之組合物。加載緩衝液為用於將包含FkpA之組合物加載至層析材料上的緩衝液。層析材料可在加載所要純化之組合物之前用平衡緩衝液來平衡。在一些實例中，洗滌緩衝液係在將組合物加載至層析材料上之後且在所關注之多肽自固相溶離之前使用。
如本文所用之溶離為產物(例如FkpA)自層析材料中移出。溶離緩衝液為用於使所關注之多肽或其他產物自層析材料溶離的緩衝液。在許多情況下，溶離緩衝液具有與加載緩衝液不同之物理特徵。舉例而言，溶離緩衝液可具有與加載緩衝液不同之電導率或與加載緩衝液不同之pH值。在一些實施例中，溶離緩衝液具有比加載緩衝液低之電導率。在一些實施例中，溶離緩衝液具有比加載緩衝液高之電導率。在一些實施例中，溶離緩衝液具有比加載緩衝液低之pH值。在一些實施例中，溶離緩衝液具有比加載緩衝液高之pH值。在一些實施例中，溶離緩衝液具有與加載緩衝液不同之電導率及不同之pH值。溶離緩衝液可具有較高或較低電導率與較高或較低pH值之任何組合。
電導率係指水溶液在兩個電極之間傳導電流的能力。在溶液中，電流藉由離子遷移而流動。因此，隨著存在於水溶液中之離子之量增加，溶液將具有更高電導率。電導率之度量之基本單位為西門子(Siemen)(或姆歐(mho))、姆歐(mS/cm)，且可使用電導率計(諸如各種型號之Orion電導率計)來量測。由於電解電導率為溶液中之離子運載電流的能力，故可藉由改變其中之離子的濃度來改變溶液之電導率。舉例而言，可改變溶液中緩衝劑之濃度及/或鹽(例如氯化鈉、乙酸鈉或氯化鉀)之濃度以達成所需電導 率。較佳地，改變各種緩衝液之鹽濃度以達成所需電導率。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換加載緩衝液具有大於約4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm中之任一者的電導率。電導率可在約4mS/cm與17mS/cm、4mS/cm與10mS/cm、4mS/cm與7mS/cm、5mS/cm與17mS/cm、5mS/cm與10mS/cm或5mS/cm與7mS/cm中之任一者之間。在一些實施例中，電導率為約4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm中之任一者。在一個態樣中，電導率為加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液之電導率。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及洗滌緩衝液中之一或多者的電導率為相同的。在一些實施例中，加載緩衝液之電導率不同於洗滌緩衝液及/或平衡緩衝液之電導率。
在一些實施例中，陽離子交換溶離緩衝液具有大於加載緩衝液之電導率的電導率。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，溶離緩衝液具有大於約5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm、20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm或100mS/cm中之任一者的電導率。在一些實施例中，藉由改變溶離緩衝液之鹽濃度來改變溶離緩衝液之電導率。
在一些實施例中，HIC加載緩衝液具有大於溶離緩衝液之電導率的電導率。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，HIC加載緩衝液具有大於約5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm、20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm或100mS/cm中之任一者的電導率。在一些實施例中，藉由改變溶離緩衝液之鹽濃度來改變溶離緩衝液之電導率。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，HIC溶離 緩衝液具有小於約4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm中之任一者的電導率。
在以上實施例中之任一者的一些態樣中，藉由分步梯度或藉由線性梯度使溶離緩衝液之電導率相對於加載及/或洗滌緩衝液等度地變化。
在一些實施例中，FkpA係使用在9個管柱體積內自約0%至約60% 10mM MES及300mM NaCl之鹽梯度自陽離子交換層析材料溶離。
在一些實施例中，FkpA係使用純化水自HIC材料溶離，直至FkpA自HIC材料溶離為止。
基於蛋白質之胺基酸含量計算之FkpA等電點為約7.01。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換加載緩衝液具有小於約10、9、8、7、6或5中之任一者的pH值。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，加載緩衝液具有大於約4、5、6、7、8或9中之任一者的pH值。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中之一或多者的pH值為相同的。在一些實施例中，加載緩衝液之pH值不同於平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液之pH值。在一些實施例中，用於陽離子交換層析之加載緩衝液的pH值為約pH 6.0。
在一些實施例中，溶離緩衝液具有小於加載緩衝液之pH值的pH值。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，溶離緩衝液具有小於約8、7、6、5、4、3或2中之任一者的pH值。溶離緩衝液之pH值可在約4與9、4與8、4與7、4與6、4與5、5與9、5與8、5與7、5與6、6與9、6與8、6與7中之任一者之間。在一些實施例中，溶離緩衝液之pH值為約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0中之任一者。在一些實施例中，包含FkpA之組合物係在pH值為8之加載緩衝液中加載至陰離子交換材料上且在pH值為約7.0或7.1之溶離緩衝液中自陰離子交換材料溶離。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，HIC加載 緩衝液具有小於約6.0、7.0或8.0中之任一者的pH值。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，加載緩衝液具有大於約6.0、7.0或8.0中之任一者的pH值。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中之一或多者的pH值為相同的。在一些實施例中，加載緩衝液之pH值不同於平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液之pH值。
在一些實施例中，尺寸排阻層析係以流穿模式或以差別分配模式使用。在一些實施例中，用於尺寸排阻層析之緩衝液為PBS pH 7.5±0.4。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，流速小於約50CV/h、40CV/h或30CV/h中之任一者。流速可在約5CV/h與50CV/h、10CV/h與40CV/h或18CV/h與36CV/h中之任一者之間。在一些實施例中，流速為約9CV/h、18CV/h、25CV/h、30CV/h、36CV/h或40CV/h中之任一者。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，流速小於約200cm/h、150cm/h、100cm/h、75cm/h或50cm/h中之任一者。流速可在約25cm/h與200cm/h、25cm/h與175cm/h、25cm/h與150cm/h、25cm/h與100cm/h、50cm/h與100cm/h或65cm/h與85cm/h中之任一者之間。在一些實施例中，流速約為超過約0.1mL/min、0.25mL/min、0.5mL/min、0.75mL/min、1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min、5mL/min、6mL/min、7mL/min、8mL/min、9mL/min、10mL/min、11mL/min、12mL/min、13mL/min、14mL/min、15mL/min、20mL/min、25mL/min及50mL/min。在一些實施例中，流速在約0.1mL/min與1mL/min、1mL/min與5mL/min、1mL/min與10mL/min、5mL/min與10mL/min、10mL/min與15mL/min、10mL/min與25mL/min以及15mL/min與25mL/min之間。在一些實施例中，用於FkpA之陰離子交換層析的流速為約13.3ml/min。在一些實施例中，用於FkpA之疏水相互作用層析的流速為約13.2ml/min。在一些實施例中，用於FkpA之尺寸排阻層析的流速為約1ml/min。
床高度為所用層析材料之高度。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，床高度大於約3cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm或100cm中之任一者。床高度可在約3cm與50cm、5cm與35cm、3cm與35cm 或5cm與50cm中之任一者之間。在一些實施例中，床高度係基於加載物中之多肽或雜質的量來確定。
在一些實施例中，層析係在具有大於約1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、75mL、100mL或200mL之體積的管柱或容器中進行。
在本發明之一些實施例中，自層析收集級分。在一些實施例中，所收集之級分大於約0.01CV、0.02CV、0.03CV、0.04CV、0.05CV、0.06CV、0.07CV、0.08CV、0.09CV、0.1CV、0.2CV、0.3CV、0.4CV、0.5CV、0.6CV、0.7CV、0.8CV、0.9CV、1.0CV、2.0CV、3.0CV、4.0CV、5.0CV、6.0CV、7.0CV、8.0CV、9.0CV或10.0CV。在一些實施例中，彙集含有產物(例如多肽)之級分。在一些實施例中，自加載級分且自溶離級分彙集含有多肽之級分。級分中之多肽的量可由熟習此項技術者測定；例如級分中之多肽的量可藉由UV光譜學來測定。在一些實施例中，彙集含有可偵測多肽片段之級分。在一些實施例中，級分中FkpA之存在及純度係藉由尺寸排阻層析來測定。
示例性實施例
在一些實施例中，本發明提供以下用於製備FkpA之超純製劑的示例性但非限制性方法。FkpA係表現於大腸桿菌中。將細胞糊狀物懸浮於10體積25mM MES pH 6.0(溶解緩衝液)中且混合直至懸浮液為均質的。在房舍壓力下(6000-8000psi)使用微流化器HC-8000以4道執行細胞溶解作用。將懸浮液在RC6離心機中使用SS-34轉子在15,000rpm下離心30min。
在其他實施例中，將細胞糊狀物懸浮(每1L 50g細胞糊狀物)於50mM MES pH 6.0中且混合直至懸浮液為均質的。在房舍壓力(約7000psi)下使用微流化器110F以3道執行細胞溶解作用。使勻漿適應0.1% PEI(使用10% PEI儲備溶液)且在周圍溫度(約21℃)下混合30min。將懸浮液在Sorval RC-5B+離心機中使用「GSA」轉子在8500rpm下離心30min。收集離心分離液且經0.22um Durapore過濾器過濾。
(a)SP Sepharose® Fast Flow
以結合及溶離模式將經澄清之離心分離液(用1.5M Tris鹼調節至pH 8.0)加載至含有SP Sepharose® Fast Flow(GE Healthcare)之管柱。管柱具有以下特性：管柱為27.0cm(高度)×2.6cm(直徑)，體積145mL，蛋白質容量每毫升樹脂50mg。將管柱用3CV 250mM MES pH 6.0預平衡且用25mM MES(pH 6.0)平衡。在加載結束時，將管柱用3CV之平衡緩衝液洗滌。使用9CV梯度之0-30%緩衝液B(25mM MES，300mM NaCl)溶離FkpA。藉由SDS-PAGE分析級分。
(b)丁基-S Sepharose®
然後，以結合及溶離模式將所彙集之SP級分施加至丁基-S Sepharose®層析材料。管柱具有以下特性：管柱尺寸為9.4cm(高度)×2.6cm(直徑)，體積50mL，蛋白質容量每毫升樹脂20mg。將管柱用300mM硫酸鈉、50mM磷酸鈉，pH 7.0平衡。在加載於丁基-S Sepharose®管柱上之前藉由添加相等體積之50mM磷酸鹽、0.6M硫酸鈉，pH 7.0來調節SP彙集物。然後，將管柱用50mM磷酸鹽、300mM硫酸鈉，pH 7.0洗滌持續3CV。用純化水使FkpA自管柱溶離。收集級分且藉由管柱級分之SDS-PAGE分析進行分析。
(c)Superdex 200
然後，使用Superdex 200對所彙集之丁基Sepharose®級分進行尺寸排阻層析。此步驟用於移除任何殘餘高MW及低MW物質且用於調配FkpA。Superdex 200具有針對分子量在10與600kDal之間之分子的分級範圍且適合於像FkpA一般之蛋白質。管柱為Superdex 200且具有以下特性：管柱為60cm×2.6cm直徑，體積320mL，加載體積16mL。使用離心過濾器將HIC彙集物(級分7-11)濃縮至16mL(SEC CV之5%)之體積。使用艾本德臨床離心機(Eppendorf clinical centrifuge)將各單位在3000rpm下離心20min時間間隔直至達到目標體積。將Superdex 200尺寸排阻管柱用3CV PBS(pH 7.5±0.4)平衡。將丁基Sepharose®級分加載於管柱上且以1mL/min之流速用PBS(pH 7.5±0.4)溶離。
用於測定FkpA純度之方法
用於測定FkpA製劑之純度的方法為此項技術中已知的。在一些實施例中，製劑中之FkpA純度係藉由尺寸排阻層析(SEC)來測定。在一些實施例中，製劑中之FkpA純度係藉由高效液相層析尺寸排阻層析(HPLC SEC)來測定。在一些實施例中，製劑中之FkpA純度係藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來測定。在一些實施例中，SDS PAGE凝膠上之蛋白質係使用螢光蛋白成像來鑑別。在一些實施例中，SDS PAGE係使用Sypro®Ruby成像。在一些實施例中，SDS-PAGE上之蛋白質係使用Heukeshoven銀染色目視觀察。在其他實施例中，FkpA分子之身份係使用包括但不限於以下之表徵分析來證實：N端序列分析、肽質量指紋分析(PMF)、藉由CHIP TOF進行之完整/簡化Mass分析及西方墨點分析。
在一些實施例中，本發明提供FkpA之超純製劑。在一些實施例中，本發明提供一種FkpA製劑，其中FkpA構成製劑之至少約95%、96%、97%、98%、99%或99.5%中之任一者。在一些實施例中，FkpA為製劑之約95%、96%、97%、98%、99%及/或99.5%中之任一者。在一些實施例中，製劑包含低於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%或0.01%中之任一者的雜質。雜質可包括但不限於宿主細胞蛋白質，諸如大腸桿菌宿主細胞蛋白質；核酸；病毒；細胞培養物組分，諸如細胞培養基組分；以及FkpA之聚集物或FkpA之片段(例如FkpA之非功能性片段)。在一些實施例中，製劑包含低於約2%、1.5%或1%中之任一者的低分子量物質。在一些實施例中，製劑包含低於約1%、0.5%或0.1%之高分子量物質。在一些實施例中，高分子量物質為不可偵測的。在一些實施例中，FkpA、低分子量物質及/或高分子量物質之存在係藉由SEC來偵測。
在一些實施例中，本發明提供FkpA之超純製劑。在一些實施例中，本發明提供一種FkpA製劑，其中FkpA構成製劑之至少約95%、96%、97%、98%、99%或99.5%中之任一者。在一些實施例中，FkpA為製劑之約95%、96%、97%、98%、99%及/或99.5%中之任一者。在一些實施例中，製劑包含低於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02% 或0.01%中之任一者的雜質。雜質可包括但不限於宿主細胞蛋白質，諸如大腸桿菌宿主細胞蛋白質；核酸；病毒；細胞培養物組分，諸如細胞培養基組分；以及FkpA之聚集物或FkpA之片段(例如FkpA之非功能性片段)。在一些實施例中，製劑包含低於約1%、0.5%或0.1%中之任一者的低分子量物質。在一些實施例中，製劑包含低於約1%、0.5%或0.1%之高分子量物質。在一些實施例中，FkpA、低分子量物質及/或高分子量物質之存在係藉由SEC來偵測。
量測DNA(諸如宿主細胞DNA)之方法為此項技術中已知的且描述於實例部分中。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，DNA之量減少大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中之任一者。DNA之量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。DNA之量可減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之DNA的量與在純化步驟之前組合物中之DNA的量相比較來測定。
細胞培養基組分係指存在於細胞培養基中之組分。細胞培養基可為在收穫細胞時之細胞培養基。在一些實施例中，細胞培養基組分為慶大黴素(gentamicin)。慶大黴素之量可藉由ELISA來量測。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，細胞培養基組分之量減少大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中之任一者。細胞培養基組分之量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。在一些實施例中，細胞培養基組分之量減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之細胞培養基組分的量與在純化步驟之前組合物中之細胞培養基組分的量相比較來進行測定。
III. 多肽-FkpA
本發明提供用於產生FkpA之超純製劑的方法。術語「FkpA」 蛋白係指細菌FKBP型肽基-脯胺醯基順反異構酶。FkpA為周質蛋白二硫化物異構酶I，其展現順/反肽基-脯胺醯基異構酶(PPIase)及伴侶蛋白活性。FkpA在肽出現在細胞周質中時可幫助多肽摺疊。在一些實施例中，FkpA衍生自細菌。在一些實施例中，FkpA多肽為大腸桿菌FkpA多肽。在其他實施例中，FkpA多肽衍生自腸桿菌(Enterobacteria)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、巴克納氏菌屬(Buchnera)、黃單胞菌屬(Xanthmonas)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、志賀氏菌屬(Shigella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、耶爾森氏菌屬(Yersina)、歐文氏菌屬(Erwinia)及奈瑟氏菌屬(Neisseria)之任何物種。在一些實施例中，FkpA多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸序列。在一些實施例中，FkpA多肽包含與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%中之任一者的一致性的胺基酸序列。
要使用本文所描述之方法純化的FkpA多肽通常係使用重組技術製備。用於在細菌中製備重組多肽之方法為此項技術中已知的。當使用重組技術時，多肽可在細胞內、在周質間隙中產生或直接分泌至培養基中。在一些實施例中，將編碼FkpA之核酸引入用於過表現多肽之宿主細胞中。在某些實施例中，經工程改造以過表現FkpA之宿主細胞以大於由未基因工程改造情況下宿主細胞所產生之水準的水準表現FkpA。在一些實施例中，編碼FkpA之核酸係由表現載體(例如質粒)表現。在一些實施例中，編碼FkpA多肽之核酸包含SEQ ID NO：3之核酸序列。在一些實施例中，編碼FkpA之核酸包含與SEQ ID NO：3之核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%中之任一者的一致性的核酸序列。
多肽可自培養基或自宿主細胞溶解產物中回收。表現多肽時所採用之細胞可受到諸如以下之各種物理或化學手段之干擾：冷凍-解凍循環、超音處理、機械破壞或細胞溶解劑。若多肽係在細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾來移除粒子碎片(宿主細胞或溶解之片段)。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用於分離分泌至大腸桿菌之周質間隙中的多肽的程序。簡單來說，將細胞糊狀物在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下解凍超過約30min。細胞碎片可藉由 離心來移除。在多肽係分泌至培養基中之情況下，通常首先使用可商購獲得之多肽濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此類表現系統之上清液。在前述步驟中之任一者中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物之生長。
IV. 製備中可能使用FkpA之多肽.
在蛋白質摺疊及組裝可能受到FkpA(例如外源性FkpA)之表現的幫助的細菌(例如大腸桿菌)中可產生之多肽的實例包括但不限於免疫球蛋白、免疫黏附素、抗體、半抗體、抗體片段、酶、激素、融合蛋白、含Fc之蛋白質、免疫結合物、細胞因子及白介素。多肽之實例包括但不限於哺乳動物蛋白質，諸如腎素；激素；生長激素，包括人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降血鈣素；促黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子及溫韋伯氏因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，諸如蛋白質C；心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，諸如尿激酶或人類尿液或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；鈴蟾素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；腦啡肽酶；RANTES(通常在活化時調控表現及分泌之T細胞)；人類巨噬細胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；穆氏管-抑制物質(Muellerian-inhibiting substance)；鬆弛素A-鏈；鬆弛素B-鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺素相關肽；酶；微生物蛋白質，諸如β-內醯胺酶；脫氧核糖核酸酶；IgE；細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子之受體；蛋白質A或D；類風濕因子；神經營養因子，諸如骨骼衍生之神經營養因子(BDNF)、神經營養素-3、神經營養素-4、神經營養素-5或神經營養素-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或諸如NGF-b之神經生長因子；血小板衍生之生長因子(PDGF)；纖維母細胞生長因子，諸如aFGF及bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II(IGF-I及IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦 IGF-I)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)；細胞因子；CD蛋白質，諸如CD3、CD4、CD8、CD19及CD20；促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；融合多肽，亦即包含於兩個或更多個異源多肽或其片段上且由重組核酸編碼之多肽；含有Fc之多肽，例如包含融合至第二多肽之免疫球蛋白Fc區或其片段之融合蛋白；免疫結合物；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10、IL13、IL17；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如愛滋病包膜之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；整合素，諸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及VCAM；腫瘤相關抗原，諸如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受體；免疫黏附素；及以上所列蛋白質中之任一者的片段及/或變異體以及與包括例如以上所列蛋白質中之任一者的蛋白質結合的抗體，包括抗體片段。
在一些實施例中，用於本文所描述之分析方法中之任一者中的多肽製劑含有所關注之抗體，亦即由宿主細胞產生之重組多肽為抗體。
此類抗體之分子靶標包括CD蛋白質及其配位體，諸如但不限於：(i)CD3、CD4、CD13、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79α(CD79a)及CD79β(CD79b)；(ii)ErbB受體家族之成員，諸如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；(iii)細胞黏附分子，諸如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM及αv/β3整合素，包括其α或β亞基(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；(iv)生長因子，諸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白質C、BR3、c-met、組織因子、β7等；及(v)細胞表面及跨膜腫瘤相關抗原(TAA)，諸如描述於美國專利第7,521,541號中之彼等。
其他示例性抗體包括但不限於選自以下之彼等：抗雌激素受體抗體、抗孕激素受體抗體、抗p53抗體、抗HER-2/neu抗體、抗EGFR抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣黏蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗c-erbB-2抗體、抗P-醣蛋白抗體、抗CEA抗體、抗視網膜母細胞瘤蛋白抗體、抗ras癌蛋白抗體、抗Lewis X抗體、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/p24抗體、抗CD10抗體、抗CD11a抗體、抗CD11c抗體、抗CD13抗體、抗CD14抗體、抗CD15抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD23抗體、抗CD30抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗CD38抗體、抗CD41抗體、抗LCA/CD45抗體、抗CD45RO抗體、抗CD45RA抗體、抗CD39抗體、抗CD100抗體、抗CD95/Fas抗體、抗CD99抗體、抗CD106抗體、抗泛素抗體、抗CD71抗體、抗c-myc抗體、抗細胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、抗HPV蛋白抗體、抗κ輕鏈抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗S-100抗體、抗τ抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體及抗Tn-抗原抗體。
單株抗體
在一些實施例中，抗體為單株抗體。單株抗體係獲自實質上均質之抗體的群體，亦即除了在製備單株抗體期間出現之可能的變異體(此類變異體通常以少量存在)，包含該群體之個別抗體為相同的及/或結合相同之抗原決定基。因此，修飾語「單株」指示抗體不為離散或多株抗體之混合物的特性。
舉例而言，可使用首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述之雜交瘤方法，或可藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)來製得單株抗體。
在雜交瘤方法中，小鼠或其他適當之宿主動物係如本文所描述進行免疫，以引發淋巴細胞，該淋巴細胞產生或能夠產生將與用於免疫之多肽特異性結合的抗體。或者，可在活體外免疫淋巴細胞。然後，使用適合之融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103頁(Academic Press,1986))。
將因此製備之雜交瘤細胞接種且使其在適合之培養基中生長，該適合之培養基較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活之物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核 糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤之培養基典型地將包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶(HAT培養基)，該等物質阻止HGPRT-缺陷型細胞之生長。
在一些實施例中，骨髓瘤細胞為有效融合、支持由所選抗體產生細胞穩定高水準產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的彼等。在此等細胞之中，在一些實施例中，骨髓瘤細胞株為鼠骨髓瘤細胞株，諸如可自索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA)獲得之衍生自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之彼等，及可自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA)獲得之SP-2或X63-Ag8-653細胞。亦已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異骨髓瘤細胞株(Kozbor,J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
對生長雜交瘤細胞之培養基進行關於產生針對抗原之單株抗體的分析。在一些實施例中，由雜交瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性係藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析(諸如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA))來測定。
單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人，Anal.Biochem.107：220(1980)之斯卡查德分析(Scatchard analysis)來測定。
在雜交瘤細胞經鑑別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體之後，可藉由限制稀釋程序來對純系進行亞選殖且藉由標準方法使其生長(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice第59-103頁(Academic Press,1986))。適合用於此目的之培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，可使雜交瘤細胞在動物中在活體內作為腹水腫瘤生長。
由亞純系分泌之單株抗體係藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如多肽A-Sepharose®、羥磷灰石層析、凝膠電泳、滲析或親和層析)自培養基、腹水流體或血清適當地分離。
編碼單株抗體之DNA係使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼鼠抗體之重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)容易地分離及測序。在一些實施例中，雜交瘤細胞充當此類DNA之來源。一經分離，即可將DNA放入表現載體中，然後將該等表現載體轉染至不以其他方式產生免疫球蛋白多肽之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、人類胚胎腎(HEK)293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以獲得在重組宿主細胞中單株抗體之合成。關於編碼抗體之DNA在細菌中之重組表現的評述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)及Plückthun,Immunol.Revs.,130：151-188(1992)。
在另一實施例中，抗體或抗體片段可自使用描述於McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)中之技術產生的抗體噬菌體文庫分離。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠及人類抗體。後續出版物描述了藉由鏈改組來產生高親和力(nM範圍)人類抗體(Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992))以及作為用於構造極大噬菌體文庫之策略的組合感染及活體內重組(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266(1993))。因此，此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術的可行替代方案。
亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代同源鼠序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或藉由使全部或部分之非免疫球蛋白多肽之編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接來修飾DNA。
典型地，此類非免疫球蛋白多肽取代抗體之恆定域，或其取代抗體之一個抗原組合位點的可變域以產生嵌合二價抗體，該嵌合二價抗體包含一個對抗原具有特異性之抗原組合位點及對不同抗原具有特異性之另一抗原組合位點。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，抗體為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些實施例中，抗體為IgG單株抗體。
抗體片段
在一些實施例中，抗體為抗體片段。已研發用於產生抗體片段之各種技術。傳統上，此等片段係經由完整抗體之蛋白水解消化(參見例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)及Brennan等人，Science 229：81(1985))而得到。然而，此等片段現可由重組宿主細胞直接產生。舉例而言，抗體片段可分離自上文所論述之抗體噬菌體文庫。或者，Fab’-SH片段可直接自大腸桿菌中回收且經化學偶合以形成F(ab’)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根據另一途徑，F(ab’)2片段可直接分離自重組宿主細胞培養物。用於產生抗體之其他技術片段將為熟練從業者清楚的。在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及美國專利第5,587,458號。抗體片段亦可為例如如例如美國專利5,641,870中所描述之「線性抗體」。此類線性抗體片段可為單特異性或雙特異性的。
在一些實施例中，提供本文所描述之抗體的片段。在一些實施例中，抗體片段為抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合片段選自由以下組成之群：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv及雙功能抗體。
多肽變異體及修飾
在某些實施例中，涵蓋本文中之蛋白質的胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良蛋白質之結合親和力及/或其他生物特性。蛋白質之胺基酸序列變異體可藉由向編碼蛋白質之核苷酸序列中引入適當的修飾或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如蛋白質之胺基酸序列內的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可形成缺失、插入及取代之任何組合以得到最終構築體，前提條件為最終構築體具有所需特徵。
變異體多肽
「多肽變異體」意謂如本文所定義與多肽之全長天然序列、缺少信號肽之多肽序列、具有或不具有信號肽之多肽胞外結構域具有至少約80%胺基酸序列一致性的多肽，例如活性多肽。此類多肽變異體包括例如在全長天然胺基酸序列之N或C端添加或缺失一或多個胺基酸殘基的多 肽。通常，多肽變異體將與全長天然序列多肽序列、缺少信號肽之多肽序列、具有或不具有信號肽之多肽胞外結構域具有至少約80%胺基酸序列一致性，或者至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者的胺基酸序列一致性。視情況，變異體多肽將與天然多肽序列相比具有不超過一個保守胺基酸取代，或者與天然多肽序列相比具有不超過約2、3、4、5、6、7、8、9或10中之任一者的保守胺基酸取代。
變異體多肽例如當與全長天然多肽相比時可在N端或C端截短，或可缺少內部殘基。某些變異體多肽可缺少不為所需生物活性所必需之胺基酸殘基。此等多肽具有截短、缺失及插入之變異體可藉由許多習知技術中之任一者來製備。所需變異體多肽可為化學合成的。另一適合之技術涉及藉由聚合酶鏈反應(PCR)分離及擴增編碼所需變異體多肽之核酸片段。在PCR中在5’及3’引物中採用定義核酸片段之所需末端的寡核苷酸。較佳地，變異體多肽與本文所揭示之天然多肽共同擁有至少一種生物及/或免疫活性。
胺基酸序列插入包括長度自一個殘基變化至含有一百或更多個殘基之多肽的胺基未端及/或羧基未端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。未端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與細胞毒性多肽融合之抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括抗體之N端或C端與增加抗體之血清半衰期的酶或多肽融合。
舉例而言，可能需要改良多肽之結合親和力及/或其他生物特性。多肽之胺基酸序列變異體係藉由向抗體核酸中引入適當的核苷酸或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如多肽之胺基酸序列內的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可形成缺失、插入及取代之任何組合以得到最終構築體，前提條件為最終構築體具有所需特徵。胺基酸改變亦可改變多肽(例如抗體)之轉譯後加工，諸如改變糖基化位點之數目或位置。
將多肽之序列與同源已知多肽分子之序列相比較且使高同源性區域中形成之胺基酸序列改變之數目減到最少可發現在確定可插入、取代或缺失哪一胺基酸殘基而不會不利地影響所需活性時的指導。
適合用於鑑別為誘變之較佳位置的多肽(例如抗體)某些殘 基或之區域的方法稱為如Cunningham及Wells,Science 244：1081-1085(1989)所描述之「丙胺酸掃描誘變」。在此，鑑別殘基或目標殘基(例如帶電荷之殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)之群組且由中性或帶負電荷之胺基酸(最佳丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。然後，藉由在取代位點處或針對取代位點引入另外的或其他變異體來細化對取代展示功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此，雖然用於引入胺基酸序列變異之位點為預先確定的，但無需預先確定突變本身之性質。舉例而言，為分析給定位點處之突變的效能，在目標密碼子或區域處進行丙胺酸掃描或隨機誘變，並針對所需活性篩選所表現之抗體變異體。
另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中具有至少一個由不同殘基置換之胺基酸殘基。最受關注之用於取代誘變之位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。若此類取代使得生物活性改變，則可引入在表1中命名為「示例性取代」或如下文關於胺基酸類別進一步描述之更實質性改變，且篩選產物。
多肽之生物特性的實質性修飾係藉由選擇對維持以下各項之作用顯著不同的取代來實現：(a)取代區域內之多肽骨架之例如呈片層或螺旋構象的結構，(b)目標位點處之分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈之體積。胺基酸可根據側鏈特性之相似性進行分組(在A.L.Lehninger,Biochemistry第二版，第73-75頁，Worth Publishers,New York(1975)中)：
(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不帶電荷極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，可基於常見側鏈特性將天然存在之殘基分成數個組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將此等類別中之一者的成員換成另一類別。
通常亦可用絲胺酸取代不參與維持抗體之適當構象的任何半胱胺酸殘基，以改良分子之抗氧化性且防止異常交聯。相反地，可添加半胱胺酸鍵至多肽中以改良其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段的情況下)。
取代型變異體之一個實例涉及取代親本抗體(例如人類化抗 體)之一或多個高變區殘基。一般而言，經選擇用於進一步研發之所得變異體將相對於產生其之親本抗體具有改良之生物特性。適宜用於產生此類取代型變異體之方式涉及使用噬菌體展示之親和力成熟。簡單來說，使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以產生在各位點處所有可能的胺基取代。因此產生之抗體變異體係以與包封於各粒子內之M13的基因III產物之融合體形式以單價方式由絲狀噬菌體粒子展示。然後如本文所揭示篩檢噬菌體展示之變異體的生物活性(例如結合親和力)。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可執行丙胺酸掃描誘變以鑑別顯著促進抗原結合之高變區殘基。或者或另外，可能有益的是分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與目標之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基為根據本文詳細描述之技術取代的候選殘基。一旦產生了此類變異體，即可如本文所描述對該組變異體進行篩選且可選擇在一或多個相關分析中具有優良特性之抗體用於進一步研發。
多肽之另一類型之胺基酸變異體改變抗體之原始糖基化模式。多肽可包含非胺基酸部分。舉例而言，多肽可經糖基化。此類糖基化可在宿主細胞或宿主生物體中表現多肽期間天然地發生，或可為由人類干預產生之故意的修飾。改變意謂缺失存在於多肽中之一或多個碳水化合物部分，及/或添加不存在於多肽中之一或多個糖基化位點。
多肽之糖基化典型地為N-鍵聯或O-鍵聯的。N-鍵聯係指碳水化物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接之識別序列。因此，多肽中存在此等三肽序列中之任一者均產生潛在糖基化位點。O-鍵聯之糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸(最通常為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸)之連接。
添加糖基化位點至多肽宜藉由改變胺基酸序列以使得其含有上述三肽序列中之一或多者來實現(對於N-鍵聯糖基化位點)。亦可藉由向原始抗體之序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始抗體之序列來形成改變(對於O-鍵聯糖基化位點)。
移除存在於多肽上之碳水化合物部分可以化學方式或以酶促方式或藉由編碼充當糖基化目標之胺基酸殘基之密碼子的突變取代來實現。多肽上之碳水化合物部分的酶促裂解可藉由使用多種內切糖苷酶及外切糖苷酶來達成。
其他修飾包括麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別脫醯胺化為對應的麩胺醯基及天東胺醯基殘基；脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基的磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之γ-胺基的甲基化；N端胺之乙醯化；及任意C端羧基之醯胺化。
嵌合多肽
可以形成嵌合分子之方式修飾本文所描述之多肽，該等嵌合分子包含與另一異源多肽或胺基酸序列融合之多肽。在一些實施例中，嵌合分子包含多肽與標籤多肽之融合，該標籤多肽提供可與抗標籤抗體選擇性結合之抗原決定基。抗原決定基標籤通常放置於多肽之胺基末端或羧基末端。多肽之此類抗原決定基標記形式之存在可使用針對標籤多肽之抗體來偵測。另外，提供抗原決定基標籤使得能夠使用抗標籤抗體或與抗原決定基標籤結合之另一類型之親和基質藉由親和純化而容易地純化多肽。
多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在某些實施例中，多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，該等結合特異性中之一者係針對一種抗原而另一者係針對任何另一抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可與同一抗原之兩個不同抗原決定基結合。亦可使用雙特異性抗體來將細胞毒性試劑定位至表現特定抗原之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。在一些實施例中，多特異性抗體為雙特異性抗體，其中一條臂結合IL13，而另一條臂結合IL17。
用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於：具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及「杵入臼」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)，及此 外交換雙特異性抗體之一半的抗原結合片段(Fab)內的一或多個重鏈及輕鏈結構域(CrossMab，參見WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253及WO2009/080254)。亦可藉由以下方法製得多特異性抗體：工程改造用於製備抗體Fc-異二聚體分子之靜電導引作用(WO 2009/089004A1)；使兩種或更多種抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈來產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術來製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所描述製備三特異性抗體。如下文所論述，在一些實施例中，多特異性抗體係如下製備：在細胞(例如表現FkpA之大腸桿菌細胞)中產生半抗體，分離半抗體，且將半抗體組裝成雙特異性抗體。
本文中亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之經工程改造抗體(包括「章魚抗體」)(參見例如US 2006/0025576A1)。
本文中之抗體或片段亦包括包含與一種抗原以及另一不同抗原結合之抗原結合位點之「雙重作用Fab」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
用於製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知的。傳統上，雙特異性抗體之重組製備係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中該兩個重鏈具有不同特異性(Milstein及Cuello,Nature,305：537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配，此等雜交瘤(四體瘤)產生10種不同抗體分子之可能的混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結構。正確分子之純化(通常藉由親和層析步驟進行)非常繁瑣，且產物產率低。類似程序揭示於1993年5月13日公開之WO 93/08829及Traunecker,EMBO J.,10：3655(1991)等人中。
根據一種不同之途徑，具有所需結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。融合較佳係與包含至少一部分鉸鏈、CH2及CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定域進行。較佳具有存在 於融合中之至少一者中的含有為輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨之表現載體中，且共轉染至適合之宿主生物體中。當在構築中使用不相等比率之三個多肽鏈提供最佳產率時，此在實施例中為調節三個多肽片段之相互比例提供極大靈活性。然而，在表現相等比率之至少兩個多肽鏈產生高產率時，或在該等比率無特殊意義時，可能將兩個或全部三個多肽鏈之編碼序列插入一個表達載體中。
在此途徑之一個實施例中，雙特異性抗體由一條臂中之具有第一結合特異性之雜合免疫球蛋白重鏈及另一條臂中之雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。發現此不對稱結構促進所需雙特異性化合物與不希望之免疫球蛋白鏈組合之分離，因為免疫球蛋白輕鏈僅存在於雙特異性分子之一半中提供容易的分離方式。此途徑揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之其他細節，參見例如Suresh等人，Methods in Enzymology,121：210(1986)。
根據另一途徑，一對抗體分子之間的界面可經工程改造以使自重組細胞培養物中回收之異二聚體的百分比最大化。較佳界面包含抗體恆定域之CH3結構域的至少一部分。在此方法中，將第一抗體分子之界面的一或多個小的胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)(杵或突起)置換。藉由將較大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換在第二抗體分子之界面上產生具有與大側鏈相同或類似之尺寸的補充性「空腔」(臼)。此提供用於使異二聚體之產率增加超過諸如同二聚體之不希望之最終產物的機理。杵及臼進一步描述於本文中。
杵於臼中
使用杵入臼作為製備多特異性抗體及/或單臂抗體及/或免疫黏附素之方法為此項技術中熟知的。參見指定給Genentech之於1998年3月24日授權之美國專利第5,731,168號。描述用於產生多特異性抗體之方法的其他參考文獻包括於2009年7月16日公開且指定給Amgen之PCT公開案第WO2009089004號，及於2009年7月16日公開且指定給Novo Nordisk A/S之美國專利公開案第20090182127號。亦參見Marvin及Zhu, Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6)：649-658及Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26：1-9。在此提供簡要論述。
「突起」係指自第一多肽之界面伸出之至少一個胺基酸側鏈，且因此可安置於鄰近界面(亦即第二多肽之界面)中之互補空腔中，以穩定異多聚體，且藉此例如相對於形成同多聚體更偏向於形成異多聚體。突起可存在於原始界面中或可以合成方式(例如藉由改變編碼界面之核酸)引入。通常，改變編碼第一多肽之界面的核酸以編碼突起。為達成此目的，將編碼第一多肽之界面中的至少一個「原始」胺基酸殘基之核酸用編碼具有比原始胺基酸殘基大之側鏈體積的至少一個「輸入」胺基酸殘基之核酸置換。應瞭解，可能存在超過一個原始殘基及對應輸入殘基。經置換之原始殘基之數目的上限為第一多肽之界面中的殘基之總數目。各種胺基殘基之側鏈體積顯示於下表中。
a胺基酸分子量減去水之分子量。來自Handbook of Chemistry and Physics，第43版，Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961之值。
b來自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24：107-123,1972之值。
c來自C.Chothia,J.Mol.Biol.105：1-14,1975之值。可及表面積定義於此參考文獻之圖6-20中。
用於形成突起之較佳輸入殘基通常為天然存在之胺基酸殘基且較佳選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。最佳為色胺酸及酪胺酸。在一個實施例中，用於形成突起之原始殘基具有小側鏈體積，諸如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。在CH3結構域中用於形成突起之示例性胺基酸取代包括但不限於T366W取代。
「空腔」係指自第二多肽之界面凹入的至少一個胺基酸側鏈並且因此接納第一多肽之鄰近界面上的相應突起。空腔可存在於原始界面中或可以合成方式(例如藉由改變編碼界面之核酸)引入。通常，改變編碼第二多肽之界面的核酸以編碼空腔。為達成此目的，將編碼第二多肽之界面中的至少一個「原始」胺基酸殘基之核酸用編碼具有比原始胺基酸殘基小之側鏈體積的至少一個「輸入」胺基酸殘基之DNA置換。應瞭解，可能存在超過一個原始殘基及對應輸入殘基。經置換之原始殘基之數目的上限為第二多肽之界面中的殘基之總數目。各種胺基殘基之側鏈體積顯示於上表2中。用於形成空腔之較佳輸入殘基通常為天然存在之胺基酸殘基，且較佳選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。最佳為絲胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。在一個實施例中，用於形成空腔之原始殘基具有大側鏈體積，諸如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。在CH3結構域中用於產生空腔之示例性胺基酸取代包括但不限於T366S、L368A及Y407A取代。
「原始」胺基酸殘基為由可能具有比原始殘基小或大之側鏈體積的「輸入」殘基置換的胺基酸殘基。輸入胺基酸殘基可為天然存在或非天然存在之胺基酸殘基，但較佳為前者。「天然存在之」胺基酸殘基為由遺傳密碼編碼且列於上表2中之彼等殘基。「非天然存在之」胺基酸殘基意謂不由遺傳密碼編碼，但能夠共價結合多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基的殘基。非天然存在之胺基酸殘基的實例為正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高 絲胺酸及其他胺基酸殘基類似物，諸如描述於例如Ellman等人，Meth.Enzym.202：301-336(1991)中之彼等。為產生此類非天然存在之胺基酸殘基，可使用Noren等人，Science 244：182(1989)及Ellman等人(同上)之程序。簡言之，此程序涉及用非天然存在之胺基酸殘基化學活化抑制劑tRNA，隨後進行RNA之活體外轉錄及轉譯。本發明之方法涉及置換至少一個原始胺基酸殘基，但可置換超過一個原始殘基。通常，經置換之原始胺基酸殘基將不超過第一或第二多肽之界面中的全部殘基。典型地，用於置換之原始殘基為「隱藏」的。「隱藏的」意謂殘基基本上為溶劑不可及的。一般而言，輸入殘基不為半胱胺酸以防止可能的氧化或二硫鍵之錯配。
突起「可安置」於空腔中，此意謂分別在第一多肽及第二多肽之界面上的突起及空腔之空間位置，以及突起及空腔之尺寸使得突起可定位於空腔中，而不會顯著干擾第一及第二多肽在界面處之正常締合。由於諸如Tyr、Phe及Trp之突起典型地不垂直於界面之軸線而伸長，且具有較佳構象，故將突起與對應空腔對準依賴於根據三維結構(諸如藉由X-射線晶體照像術或核磁共振(NMR)而獲得之三維結構)而對突起/空腔對進行的塑造。此可使用此項技術中廣泛接受之技術來達成。
「原始或模板核酸」意謂編碼所關注之多肽的核酸，其可經「改變」(亦即基因工程改造或突變)以編碼突起或空腔。原始或起始核酸可為天然存在之核酸或可包含已經歷在先改變之核酸(例如人類化抗體片段)。「改變」核酸意謂藉由插入、缺失或置換編碼所關注之胺基酸殘基至少一個密碼子來使原始核酸突變。通常，編碼原始殘基之密碼子由編碼輸入殘基之密碼子置換。用於以此方式對DNA進行基因修飾之技術已評述於Mutagenesis：a Practical Approach,M.J.McPherson編，(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中，且包括例如定點誘變、盒誘變及聚合酶鏈反應(PCR)誘變。藉由使原始/模板核酸突變，由原始/模板核酸編碼之原始/模板多肽因此相應地改變。
藉由合成手段，例如藉由重組技術、活體外肽合成、先前所描述之用於引入非天然存在之胺基酸殘基之彼等技術、藉由肽之酶促偶合或化學偶合技術或此等技術之一些組合，可將突起或空腔「引入」第一或 第二多肽之界面中。因此，所「引入」之突起或空腔為「非天然存在之」或「非天然」的，此意謂其不存在於自然界或原始多肽(例如人類化單株抗體)中。
一般而言，用於形成突起之輸入胺基酸殘基具有相對較小數目之「旋轉異構體」(例如約3-6個)。「旋轉異構體」為胺基酸側鏈之在能量上有利之構象。各種胺基酸殘基之旋轉異構體的數目評述於Ponders及Richards,J.Mol.Biol.193：775-791(1987)中。
在一個實施例中，第一Fc多肽與第二Fc多肽在界面處相遇/相互作用。在第一與第二Fc多肽在界面處相遇之一些實施例中，第二Fc多肽(序列)之界面包含突起(亦稱為「杵」)，其可安置於第一Fc多肽(序列)之界面中的空腔(亦稱為「臼」)中。在一個實施例中，已相對於模板/原始多肽改變第一Fc多肽以編碼空腔，或已相對於模板/原始多肽改變第二Fc多肽以編碼突起，或兩者。在一個實施例中，已相對於模板/原始多肽改變第一Fc多肽以編碼空腔，且已相對於模板/原始多肽改變第二Fc多肽以編碼突起。在一個實施例中，第二Fc多肽之界面包含可安置於第一Fc多肽之界面中的空腔中的突起，其中空腔或突起或兩者已分別引入第一及第二Fc多肽之界面。在第一與第二Fc多肽在界面處相遇之一些實施例中，第一Fc多肽(序列)之界面包含突起，其可安置於第二Fc多肽(序列)之界面中的空腔中。在一個實施例中，已相對於模板/原始多肽改變第二Fc多肽以編碼空腔，或已相對於模板/原始多肽改變第一Fc多肽以編碼突起，或兩者。在一個實施例中，已相對於模板/原始多肽改變第二Fc多肽以編碼空腔，且已相對於模板/原始多肽改變第一Fc多肽以編碼突起。在一個實施例中，第一Fc多肽之界面包含可安置於第二Fc多肽之界面中的空腔中的突起，其中突起或空腔或兩者已分別引入第一及第二Fc多肽之界面。
在一個實施例中，突起及空腔各自包含天然存在之胺基酸殘基。在一個實施例中，包含突起之Fc多肽係藉由將模板/原始多肽之界面的原始殘基用具有比原始殘基大之側鏈體積的輸入殘基置換來產生。在一個實施例中，包含突起之Fc多肽係藉由包括一步驟之方法來產生，在該步驟中，將編碼該多肽之界面的原始殘基的聚核苷酸用編碼具有比原始殘基大 之側鏈體積的輸入殘基的聚核苷酸置換。在一個實施例中，原始殘基為蘇胺酸。在一個實施例中，原始殘基為T366。在一個實施例中，輸入殘基為精胺酸(R)。在一個實施例中，輸入殘基為苯丙胺酸(F)。在一個實施例中，輸入殘基為酪胺酸(Y)。在一個實施例中，輸入殘基為色胺酸(W)。在一個實施例中，輸入殘基為R、F、Y或W。在一個實施例中，突起係藉由置換模板/原始多肽中之兩個或更多個殘基來產生。在一個實施例中，包含突起之Fc多肽包含用色胺酸對位置366處之蘇胺酸的置換，胺基酸編號係根據Kabat等人之EU編號流程(Sequences of proteins of immunological interest，第5版，第1卷(1991；NIH,Bethesda,MD)中之第688-696頁)來進行。
在一些實施例中，包含空腔之Fc多肽係藉由將模板/原始多肽之界面的原始殘基用具有比原始殘基小之側鏈體積的輸入殘基置換來產生。舉例而言，包含空腔之Fc多肽係藉由包括一步驟之方法來產生，在該步驟中，將編碼該多肽之界面的原始殘基的聚核苷酸用編碼具有比原始殘基小之側鏈體積的輸入殘基的聚核苷酸置換。在一個實施例中，原始殘基為蘇胺酸。在一個實施例中，原始殘基為白胺酸。在一個實施例中，原始殘基為酪胺酸。在一個實施例中，輸入殘基不為半胱胺酸(C)。在一個實施例中，輸入殘基為丙胺酸(A)。在一個實施例中，輸入殘基為絲胺酸(S)。在一個實施例中，輸入殘基為蘇胺酸(T)。在一個實施例中，輸入殘基為纈胺酸(V)。空腔可藉由置換模板/原始多肽之一或多個原始殘基來產生。舉例而言，在一個實施例中，包含空腔之Fc多肽包含兩個或更多個選自由以下組成之群的原始胺基的置換：酸蘇胺酸、白胺酸及酪胺酸。在一個實施例中，包含空腔之Fc多肽包含兩個或更多個選自由以下組成之群的輸入殘基：丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及纈胺酸。在一些實施例中，包含空腔之Fc多肽包含兩個或更多個選自由以下組成之群的原始胺基酸的置換：蘇胺酸、白胺酸及酪胺酸，且其中該等原始胺基酸係經選自由以下組成之群的輸入殘基置換：丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及纈胺酸。在一些實施例中，經置換之原始胺基酸為T366、L368及/或Y407。在一個實施例中，包含空腔之Fc多肽包含用絲胺酸對位置366處之蘇胺酸的置換，胺基酸編號係根據Kabat等人(同上)之EU編號流程來進行。在一個實施例中，包含空腔之Fc多肽 包含用丙胺酸對位置368處之白胺酸的置換，胺基酸編號係根據Kabat等人(同上)之EU編號流程來進行。在一個實施例中，包含空腔之Fc多肽包含用纈胺酸對位置407處之酪胺酸的置換，胺基酸編號係根據Kabat等人(同上)之EU編號流程來進行。在一個實施例中，包含空腔之Fc多肽包含兩個或更多個選自由以下組成之群的胺基酸置換：T366S、L368A及Y407V，胺基酸編號係根據Kabat等人(同上)之EU編號流程來進行。在此等抗體片段之一些實施例中，包含突起之Fc多肽包含用色胺酸對位置366處之蘇胺酸的置換，胺基酸編號係根據Kabat等人(同上)之EU編號流程來進行。
在一個實施例中，抗體包含構成如WO2005/063816中所描述之「杵」及「臼」的Fc突變。舉例而言，臼突變可為Fc多肽中之T366S、L368A及/或Y407V中之一或多者，且杵突變可為T366W。
在本發明之一個態樣中，多特異性抗體經純化，其中抗體包含第一半抗體及第二半抗體，其中第一半抗體包含結合IL-17之第一VH/VL單元且第二半抗體包含結合IL-13之第二VH/VL單元。在一些實施例中，第一半抗體不結合IL-13，且其中第二半抗體不結合IL-17。
IL-17家族中存在六個成員：IL-17A、B、C、D、E及F。IL-17家族之成員形成同二聚體，且IL-17A及IL-17F進一步形成異二聚體。參見例如Gaffen,S.L.,2009,Nature Review 9：556-567；Hymowitz等人，2001,EMBO J.20：5332-41以及WO2005/010044。IL-17有時用在提及IL-17家族成員IL-17A之原型的場合中。在某些實施例中，本文所提供之多特異性抗體結合IL-13及IL-17AA且抑制其活性。
在某些特定實施例中，本文所提供之多特異性抗體與IL-17AA、IL-17AF及IL-17FF結合，抑制IL-17AA、IL-17AF及IL-17FF誘導之活性，且抑制IL-13誘導之活性。在某些實施例中，抗IL-13/IL-17雙特異性抗體係指抗IL-13/IL-17AA、FF及AF抗體。在某些此類實施例中，與單獨由IL-17A或IL-17F誘導之活性相反，抗IL-13/IL-17AA、AF及FF雙特異性抗體有利地阻斷由所有IL-17A及F細胞因子誘導之活性。在一些實施例中，本文所提供之多特異性抗體與IL-17AA、IL-17AF及IL-17FF結合。在一些實施例中，IL-17AA誘導之活性為IL-17AA誘導之基因表現及/ 或活體內或活體外細胞增殖。在一些實施例中，IL-17AF誘導之活性為IL-17AF誘導之基因表現及/或活體內或活體外細胞增殖。在一些此類實施例中，IL-17FF誘導之活性為IL-17FF誘導之基因表現及/或活體內或活體外細胞增殖。在一些實施例中，IL-13誘導之活性為IL-13誘導之基因表現及/或活體內或活體外細胞增殖。在一些實施例中，本文所提供之多特異性抗體不抑制IL-13與IL-13Rα1之結合。
在一些實施例中，抗IL13/IL17AA AF FF雙特異性抗體包含第一半抗體及第二半抗體，其中第一半抗體包含結合IL-17AA、AF及FF之第一VH/VL單元，且第二半抗體包含結合IL-13之第二VH/VL單元，其中第一VH/VL單元包含：包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3，且其中第二VH/VL單元包含：包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，第一半抗體不結合IL-13，且第二半抗體不結合IL-17。
在一些實施例中，第一VH/VL單元包含：與SEQ ID NO：18之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的VH序列及與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的VL序列，且其中第二VH/VL單元包含：與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的VH序列及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的VL序列。在一些實施例中，提供多特異性抗體，其中第一VH/VL單元包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的VH序列及具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的VL序列，且其中第二VH/VL單元包 含含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VH序列及具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列的VL序列。
在某些實施例中，第一半抗體結合包含重鏈及輕鏈的IL17AA AF及FF，該重鏈包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列，該輕鏈包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列，且第二半抗體結合包含重鏈及輕鏈的IL13，該重鏈包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列，該輕鏈包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在某些實施例中，第一半抗體結合包含重鏈及輕鏈的IL17AA AF及FF，該重鏈包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列，該輕鏈包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列，且第二半抗體結合包含重鏈及輕鏈的IL13，該重鏈包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列，該輕鏈包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。與抗IL13/抗IL17抗體有關之序列呈現於表3中。參見PCT/US2015/01716(WO2015/127405)，其以全文引用之方式併入本文中。
V. 載體、宿主細胞及重組方法
為使用FkpA重組製備異源多肽(例如多特異性抗體)，分離編碼多肽(例如多特異性抗體)之核酸且插入可複製載體供進一步選殖(DNA之擴增)或用於表現。編碼多肽(例如多特異性抗體)之DNA係使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼該抗體之重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)容易地分離及測序。許多載體為可用的。載體之選擇部分依賴於所要使用之宿主細胞。一般而言，較佳宿主細胞具有任一原核生物來源。應瞭解，為此目的可使用任何同型之恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此類恆定區可獲自任何人類或動物物種。
A. 使用原核宿主細胞產生抗體
i. 載體構築
編碼本發明之多特異性抗體之多肽組分的聚核苷酸序列可使用標準重組技術來獲得。可由諸如雜交瘤細胞之抗體產生細胞分離所需聚核苷酸序列並測序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術合成聚核苷酸。一經獲得，即將編碼多肽之序列插入能夠在原核宿主中複製並表現異源聚核苷酸的重組載體中。可獲得且此項技術中已知之許多載體均可用於本發明之目的。適當載體之選擇將主要取決於要插入載體中之核酸的尺寸及要用載體轉型之特定宿主細胞。各載體視其功能(異源聚核苷酸之擴增或 表現，或兩者)及其與其駐留於其中之特定宿主細胞之相容性而定含有各種組分。載體組分通常包括但不限於：複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。
一般而言，含有衍生自與宿主細胞相容之物種的複製子及控制序列之質粒載體與此等宿主結合使用。載體通常帶有複製位點，以及標誌序列，該等標誌序列能夠在轉型細胞中提供表型選擇。舉例而言，大腸桿菌係典型地使用pBR322(一種衍生自大腸桿菌物種之質粒)轉型。pBR322含有編碼安比西林(Amp)及四環素(Tet)抗性之基因且因此提供容易鑑別轉型細胞之手段。pBR322、其衍生物或其他微生物質粒或噬菌體亦可含有或經修飾以含有可由微生物生物體用於表現內源性蛋白質之啟動子。用於表現特定抗體之pBR322衍生物之實例詳細描述於Carter等人，美國專利第5,648,237號中。
此外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬菌體載體可用作與此等宿主有關之轉型載體。舉例而言，在製備可用於轉型諸如大腸桿菌LE392之易感宿主細胞的重組載體時可利用諸如GEMTM-11之噬菌體。
本發明之表現載體可包含兩個或更多個啟動子-順反子對，其編碼各個多肽組分。啟動子為未轉譯調控序列，其定位於調節其表現之順反子的上游(5’)。原核啟動子典型地屬於誘導型及組成型兩類。誘導型啟動子為響應於培養條件之改變(例如存在或不存在營養物或溫度變化)而引起受其控制之順反子的轉錄水準增加的啟動子。
由多種潛在宿主細胞識別之大量啟動子為熟知的。所選啟動子可藉由經由限制酶消化自源DNA移除啟動子且將經分離之啟動子序列插入本發明之載體中而與編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA可操作地連接。天然啟動子序列與許多異源啟動子均可用於引導目標基因之擴增及/或表現。在一些實施例中，利用異源啟動子，因為其與天然目標多肽啟動子相比通常允許所表現之目標基因的更大轉錄及更高產率。
適合用於原核宿主之啟動子包括PhoA啟動子、-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子諸如tac或trc啟 動子。然而，在細菌中具功能性之其他啟動子(諸如其他已知細菌或噬菌體啟動子)同樣為適合的。其核苷酸序列已公開，藉此使熟練工人能夠使用連接子或銜接子可操作地將其與編碼目標輕鏈及重鏈之順反子連結(Siebenlist等人，(1980)Cell 20：269)以供應任何所需限制位點。
轉譯起始區(TIR)為蛋白質之總轉譯水準之主要決定因素。TIR包括編碼信號序列之聚核苷酸，且自緊鄰夏因-達爾加諾序列(Shine-Delgarno sequence)之上游延伸至起始密碼子下游之約二十個核苷酸。一般而言，載體將包含TIR，TIR及變異體TIR為此項技術中已知的，且用於產生TIR之方法為此項技術中已知的。可產生具有一定範圍之轉譯強度的一系列核酸序列變異體，藉此提供用於調節此因素以獲得許多不同多肽之最佳分泌的適宜手段。與此等變異體融合之報告基因(PhoA)之使用提供一種用於定量不同轉譯起始區之相對轉譯強度的方法。變異體或突變體TIR可在質粒載體之背景下提供，藉此提供可將所關注之基因插入其中且量測其表現之一組質粒，以便建立最佳範圍之轉譯強度以獲得成熟多肽之最大表現。變異體TIR揭示USP 8,241,901中。
在本發明之一個態樣中，重組載體內之各順反子包含分泌信號序列組分，其指導所表現之多肽的跨膜易位。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中之目標多肽DNA之一部分。出於本發明之目的選擇的信號序列應為由宿主細胞識別及加工(亦即由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別及加工異源多肽之天然信號序列的原核宿主細胞，用選自例如本發明之信號序列的原核信號序列來取代信號序列。此外，載體可包含選自由以下組成之群的信號序列：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Lpp或熱穩定性腸毒素II(STII)前導子、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。
在一個態樣中，一或多種聚核苷酸(例如表現載體)共同編碼抗體。在一個實施例中，單一聚核苷酸編碼抗體之輕鏈且單獨的聚核苷酸編碼抗體之重鏈。在一個實施例中，單一聚核苷酸編碼抗體之輕鏈及重鏈。在一些實施例中，一或多種聚核苷酸(例如表現載體)共同編碼單臂抗體。在一個實施例中，單一聚核苷酸編碼(a)單臂抗體之輕鏈及重鏈，及(b)Fc多肽。在一個實施例中，單一聚核苷酸編碼單臂抗體之輕鏈及重鏈，且單獨 的聚核苷酸編碼Fc多肽。在一個實施例中，單獨的聚核苷酸分別編碼單臂抗體之輕鏈組分、單臂抗體之重鏈組分及Fc多肽。單臂抗體之製備描述於例如WO2005063816中。
適合用於表現本發明之抗體的原核宿主細胞包括古細菌及真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。適用細菌之實例包括埃希氏桿菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、芽孢桿菌屬(Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis))、腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種(例如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa))、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)或副球菌屬(Paracoccus)。在一個實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施例中，使用大腸桿菌細胞作為用於本發明中之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington,D.C.：American Society for Microbiology,1987)，第1190-1219頁；ATCC保藏號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110△fhuA(△tonA)ptr3 lac Iq lacL8 △ompT△(nmpc-fepE)degP41 kanR之菌株33D3(美國專利第5,639,635號)及菌株63C1及64B4。在一些實施例中，大腸桿菌菌株為名為62A7(△fhuA(△tonA)ptr3、lacIq、lacL8、經修復之ompT△(nmpc-fepE)△degP ilvG)的W3110衍生物。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ 1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308(ATCC 31,608)亦為適合的。此等實例為說明性而非限制性的。用於構築具有規定之基因型的上述細菌中之任一者之衍生物的方法為此項技術中已知的且描述於例如Bass等人，Proteins,8：309-314(1990)中。將細菌之細胞中的複製子之可複製性考慮在內來選擇適當的細菌通常為必需的。舉例而言，當使用諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410之熟知質粒來供應複製子時，可適當地使用大腸桿菌、沙雷氏菌屬或沙門氏菌屬物種作為宿主。典型地，宿主細胞應分泌最少量之蛋白水解酶，且可理想地將其他蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。
為改良細菌培養物中多肽之製備產率及品質，細菌細胞可經 修飾。舉例而言，為改良所分泌抗體多肽之適當組裝及摺疊，細菌宿主細胞可包含表現伴侶蛋白之其他載體，諸如FkpA及Dsb蛋白(DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)可用於共轉型宿主原核細胞。已證實伴侶蛋白有助於細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質的適當摺疊及溶解。
ii. 抗體製備
用上述表現載體轉型宿主細胞且在適當時經改良之習知培養基中培養，以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。
轉型意謂將DNA引入原核宿主中，使得DNA可作為染色體外元件或藉由染色體成分進行複製。視所用宿主細胞而定，使用適合於此類細胞之標準技術來進行轉型。對於含有實質細胞壁障壁之細菌細胞而言，通常使用採用氯化鈣之鈣處理。用於轉型之另一方法採用聚乙二醇/DMSO。所用之另一技術為電穿孔。
使用於製備本發明之多肽的原核細胞在此項技術中已知且適合用於培養所選宿主細胞之培養基生長中。合適培養基之實例包括路裏亞培養液(Luria broth，LB)加上必需的營養補充物。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構築進行選擇之選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，添加安比西林至培養基中以使表現安比西林抗性基因之細胞生長。
亦可以適當濃度包括除碳、氮及無機磷酸鹽來源之外的任何必需補充物，其係單獨地或以與另一補充物或培養基的混合物(諸如複合氮源)的形式引入。視情況，培養基可含有一或多種選自由以下組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、硫代乙醇酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇。
在合適溫度下培養原核宿主細胞。對於大腸桿菌生長而言，舉例而言，較佳溫度在約20℃至約39℃、更佳約25℃至約37℃範圍內，甚至更佳在約30℃下。培養基之pH值可為任何在約5至約9範圍內的pH值，此主要取決於宿主生物體。對於大腸桿菌，pH值較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。
若在本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適合用於 活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一個態樣中，使用PhoA啟動子來控制多肽之轉錄。因此，將轉型宿主細胞在磷酸鹽限制培養基中培養來進行誘導。較佳地，磷酸鹽限制培養基為C.R.A.P培養基(參見例如Simmons等人，J.Immunol.Methods(2002),263：133-147)或描述於WO2002/061090中之培養基。如此項技術中已知，可根據所採用之載體構築體使用多種其他誘導劑。
在一個實施例中，所表現之本發明之多肽分泌至宿主細胞之周質中且自宿主細胞之周質中回收。蛋白質回收典型地涉及通常藉由諸如滲透壓休克、超音處理或溶解之手段來使微生物破裂。一旦細胞破裂，即可藉由離心或過濾移除細胞碎片或全細胞。蛋白質可例如藉由親和樹脂層析進一步純化。或者，可將蛋白質運送至培養基中且在其中進行分離。可自培養物中移除細胞，且將培養物上清液過濾且濃縮，以便進一步純化所產生之蛋白質。可進一步分離所表現之多肽且使用通常已知之方法(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點分析)加以鑑別。
在本發明之一個態樣中，抗體製備係藉由發酵過程大批量進行。各種大規模分批饋料發酵程序均可用於製備重組多肽。大規模發酵具有至少1000公升之容量，較佳具有約1,000至100,000公升之容量。此等發酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧及營養物，尤其葡萄糖(較佳碳/能量來源)。小規模發酵通常涉及在體積容量不超過約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內之發酵罐中發酵。
在發酵過程中，典型地係在細胞已在合適條件下生長至所需密度(例如約180-220之OD550)之後引發對蛋白質表現之誘導，在此階段細胞處於靜止階段初期。如此項技術中已知及上文所描述，可根據所採用之載體構築體使用多種誘導劑。可在誘導之前使細胞生長更短之時間。通常將細胞誘導約12-50小時，不過可使用更長或更短之誘導時間。
為改良本發明之多肽的製備產率及品質，可修改各種發酵條件。舉例而言，為改良所分泌之抗體多肽的適當組裝及摺疊，表現伴侶蛋白之其他載體，諸如FkpA、DsbA及/或DsbC可用於共轉型宿主原核細胞。已證實伴侶蛋白有助於細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質的適當摺疊及 溶解。在一些實施例中，FkpA、DsbA及/或DsbC在細菌宿主細胞中表現。
為使所表現之異源蛋白質(尤其蛋白水解敏感之彼等)的蛋白水解降至最低程度，在本發明中可使用缺乏蛋白水解酶之某些宿主菌株。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾以在編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因中實現基因突變。一些大腸桿菌蛋白酶缺陷型菌株為可用的且描述於例如Joly等人，(1998)，同上；Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；Georgiou等人，美國專利第5,508,192號；Hara等人，Microbial Drug Resistance,2：63-72(1996)中。
在一個實施例中，使用缺乏蛋白水解酶且用表現一或多種伴侶蛋白之質粒轉型的大腸桿菌菌株作為本發明之表現系統中的宿主細胞。
B. 抗體純化
可採用此項技術中已知之標準蛋白質純化方法。以下程序為合適純化程序之示例：免疫親和或離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、矽石或陽離子交換樹脂(諸如SP)或陰離子交換樹脂(諸如DEAE)上之層析、層析聚焦(chromatofocusing)、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱及使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾。
在一個態樣中，使用固定在固相上之蛋白質A進行本發明之抗體產物的免疫親和純化。蛋白質A為來自金黃色葡萄球菌之41kD細胞壁蛋白質，其以高親和力與抗體之Fc區結合。Lindmark等人，(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13。固定蛋白質A之固相較佳為包含玻璃或矽石表面之管柱，更佳為可控孔度玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱已塗有諸如甘油之試劑，以求防止雜質之非特異性黏附。
作為純化之第一步，將衍生自如上文所描述之細胞培養物的製劑施加至固定了蛋白質A之固相上，以允許所關注之抗體與蛋白質A特異性結合。然後洗滌固相以移除未與固相特異性結合之雜質。最後，藉由溶離自固相中回收所關注之抗體。
在本發明之一些實施例中，分析衍生自純化步驟中之一或多者的級分的FkpA移除情況。在一些實施例中，FkpA之移除係藉由免疫分 析(例如藉由本文所描述之免疫分析)來測定。
本發明亦提供包含本文所描述之抗體中之任一者的免疫結合物(可互換地稱為「抗體-藥物結合物」或「ADC」)，該等抗體中之任一者結合於例如細胞毒性劑(諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物))。
以下描述本發明之雙特異性抗體之純化流程。
VI. FkpA之組合物
在一些態樣中，本發明提供包含超純FkpA之組合物。在一些實施例中，組合物包含FkpA，其中FkpA為超過約95.0%、96.0%、97.0%、98.0%、99.0%或99.5%中之任一者的FkpA。在一些實施例中，包含95% FkpA之組合物為如下組合物，其中製劑中低於5%之物質為存在於在FkpA之製備期間存在之細胞或細胞溶解產物中之其他物質(例如蛋白質、核酸、脂質等)。在一些實施例中，FkpA多肽之百分比係藉由尺寸排阻層析(例如HPLC-SEC)來量測。在一些實施例中，包含超純FkpA之組合物包含低於約5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%中之任一者的低分子量物質(例如如藉由SEC或SDS-PAGE所量測分子量小於FkpA之物質)。在一些實施例中，包含超純FkpA之組合物包含低於約2%之低分子量物質。在一些實施例中，包含超純FkpA之組合物包含低於約5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%中之任一者的高分子量物質(例如如藉由SEC或SDS-PAGE所量測分子量大於FkpA之物質)。在一些實施例中，包含超純FkpA之組合物包含低於約1%之高分子量物質。
在一些實施例中，調配包含高度純化之FkpA的組合物供使用。在一些實施例中，調配包含超純FkpA之組合物來用於免疫動物以產生針對FkpA之抗體；例如藉由添加佐劑以有助於產生免疫反應。在其他實施例中，調配包含超純FkpA之組合物以用於免疫分析中；例如作為陽性對照或作為標準曲線。
VII. 針對FkpA之抗體的產生
在某些態樣中，本發明提供超純FkpA來用作免疫原以產生 用於免疫分析中以便分析重組多肽樣品中FkpA之存在的抗體(例如多株抗體及/或單株抗體)。舉例而言，抗體可在免疫分析中用於偵測及/或定量重組多肽樣品中之FkpA，其中重組多肽(例如多特異性抗體)係在表現外源性FkpA之細菌細胞中產生。在一些實施例中，本發明提供特異性結合超純FkpA之多株抗體。在一些態樣中，多株抗體特異性結合FkpA之不同抗原決定基且因此提供偵測FkpA片段、變異體、錯誤摺疊之蛋白質等的功效。為使針對宿主細胞蛋白質雜質之兔抗體的產生(其可能導致在免疫分析中所量測之樣品中之FkpA含量的過度定量或過度評估)降至最低程度，將動物(例如兔)用超純FkpA免疫。
本發明提供特異性結合FkpA之抗體。在一些實施例中，抗體為多株抗體。較佳藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原及佐劑而在動物中產生多株抗體。可適用的是使用例如以下之雙官能或衍生劑來使相關抗原與在所要免疫之物種中具免疫原性之多肽(例如鑰孔戚血藍素、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)結合：順丁烯二醯亞胺苯甲醯基磺基丁二醯亞胺酯(通過半胱胺酸殘基結合)、N-羥基丁二醯亞胺(通過離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中R及R1為不同之烷基)。
藉由將例如100μg或5μg之多肽或結合物(分別用於兔或小鼠)與3體積之弗氏完全佐劑組合且在多個位點皮內注射溶液來使動物針對抗原、免疫原性結合物或衍生物免疫。一個月後藉由在多個位點皮下注射將動物用含1/5至1/10原始量之肽或結合物的弗氏完全佐劑進行加強免疫。在七至14天後，將動物放血且分析血清之抗體效價。對動物加強免疫直至效價平臺期。在一些實施例中，將動物用具有同一抗原但與不同多肽及/或通過不同交聯劑結合之結合物加強免疫。亦可在重組細胞培養物中以多肽融合物之形式製得結合物。另外，諸如明礬之聚集劑適合用於增強免疫反應。
在一些實施例中，用FkpA免疫之動物為山羊、綿羊、兔、小鼠、豚鼠、倉鼠、大鼠、驢或雞。
在一些實施例中，特異性結合FkpA之抗體為單株抗體。單 株抗體係獲自實質上均質之抗體的群體，亦即除了在製備單株抗體期間出現之可能的變異體(此類變異體通常以少量存在)，包含該群體之個別抗體為相同的及/或結合相同之抗原決定基。因此，修飾語「單株」指示抗體不為離散或多株抗體之混合物的特性。如上文所描述，可使用首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述之雜交瘤方法，或可藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)來製得單株抗體。
在一些態樣中，本發明提供用於純化特異性結合FkpA之抗體的方法，其包括使包含抗FkpA抗體之組合物與包含附接於支撐物材料之超純FkpA的層析材料接觸，洗滌層析材料以移除未結合之化合物，且溶離抗FkpA抗體。在一些實施例中，附接於支撐物材料之超純FkpA包含低於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者的雜質。在一些實施例中，超純FkpA係藉由本文所描述之方法來製備。在一些實施例中，本發明提供用於純化特異性結合FkpA之多株抗體的方法。在一些實施例中，低於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%中之任一者的多株抗體特異性結合非FkpA化合物。
在一些實施例中，抗FkpA抗體係藉由使抗體與固定於層析材料上之超純FkpA(例如固定於活化甘油基-可控孔度玻璃之超純FkpA)接觸來純化。在一些實施例中，抗體係例如在與經固定之FkpA接觸之前藉由硫酸銨沈澱來濃縮。在一些實施例中，抗體與經固定之FkpA結合且然後洗滌經固定FkpA-抗體複合物以移除未結合之雜質。在其他實施例中，抗體係藉由使用不同pH值下之緩衝液作為加載緩衝液來溶離而自經固定之FkpA溶離；例如抗體在中性pH值(例如pH 7.2)下與經固定之FkpA結合且在酸性pH值(例如pH 2.0)下溶離。在一些其他實施例中，抗FkpA抗體經受進一步層析；例如尺寸排阻層析。在一些實施例中，分別分析經純化之抗FkpA抗體(例如多株抗體)與超純FkpA之結合。
VIII. 使用針對FkpA之抗體進行的免疫分析
在一些實施例中，本發明提供用於分析重組多肽(例如多特異性抗體)樣品中FkpA之存在及/或量的方法，其包括使用免疫分析偵測樣 品中之FkpA及將在樣品中偵測到之FkpA的量與對一或多個濃度之超純FkpA參考標準物之偵測相比較。在一些實施例中，製劑包含低於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%或0.01%中之任一者的雜質。在一些實施例中，超純FkpA參考標準物係藉由本文所描述之方法來製備。在一些實施例中，免疫分析包含特異性結合超純FkpA之抗體。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體結合低於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%或0.01%中之任一者的非FkpA化合物。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體為多株抗體。在其他實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體為單株抗體。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體在免疫分析中用作捕獲抗體。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體係用作偵測抗體。在一些實施例中，偵測抗體與偵測劑(例如辣根過氧化物酶)結合。在一些實施例中，FkpA為大腸桿菌FkpA。在一些實施例中，重組多肽係在宿主細胞(例如大腸桿菌宿主細胞)中製備。在一些實施例中，宿主細胞過表現FkpA(例如過表現FkpA之大腸桿菌宿主細胞)。在一些實施例中，宿主細胞表現外源性FkpA(例如表現外源性FkpA之大腸桿菌宿主細胞)。在一些實施例中，樣品為細胞溶解產物或獲自重組多肽製劑且其中重組多肽製劑已經受一或多個層析純化步驟。在一些實施例中，重組多肽製劑為最終純化產物。在一些實施例中，特異性結合超純FkpA之抗體在免疫分析中能夠偵測小於約及/或約50ng/mL、25ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ug/mL、2.5ng/mL及/或1.5ng/mL中之任一者的FkpA。
在一些態樣中，本發明提供用於偵測及定量FkpA之免疫分析方法。此類方法可用於偵測及定量在宿主細胞中產生之重組多肽製劑中之FkpA，該等宿主細胞為例如大腸桿菌，其中FkpA得以表現以有助於多肽摺疊及組裝。在一些實施例中，免疫分析方法使用本文所描述之捕獲及偵測抗FkpA抗體。在一些實施例中，抗體用於此項技術中已知之任何免疫分析方法中，包括但不限於夾心分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、電化學分析(ECL)、磁性免疫分析。在某些實施例中，該方法包括使重組多肽製劑 之樣品在容許抗FkpA抗體與FkpA結合之條件下與如本文所描述之抗FkpA抗體接觸，及偵測在抗FkpA抗體與FkpA之間是否形成複合物。
在某些實施例中，提供經標記抗FkpA抗體。標記物包括但不限於直接偵測之標記物或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記物)，以及例如通過酶促反應或分子間相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配位體。示例性標記物包括但不限於放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團(諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物)、羅丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯、傘形酮、螢光素酶(例如螢光蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號))、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、與採用過氧化氫來氧化染料前驅體之酶(諸如HRP)偶合的雜環氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶或微過氧化物酶、生物素/親和素、自旋標記物、噬菌體標記物、穩定自由基及類似物。
在某些實施例中，捕獲抗FkpA抗體係固定於固相上。在一些實施例中，用於固定之固相為基本上不溶於水且適用於免疫計量分析之任何惰性支撐物或載體，包括呈例如表面、粒子、多孔基質、珠粒及類似物之形式的支撐物。常用支撐物之實例包括小薄片、SEPHADEX®、凝膠、聚氯乙烯、塑膠珠粒及用聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯及類似物製造之分析板或試管(包括96-孔微量滴定板)以及粒狀材料，諸如濾紙、瓊脂糖、交聯右旋糖酐及其他多醣。或者，諸如氰-溴化物-活化之碳水化合物的反應性水不溶性基質及描述於美國專利第3,969,287號；第3,691,016號；第4,195,128號；第4,247,642號；第4,229,537號及第4,330,440號中之反應性受質適合用於捕獲-試劑固定。在一些實施例中，將經固定之捕獲試劑塗佈於可用於一次分析若干樣品之微量滴定板上。示例性微量滴定板包括但不限於MICROTEST®、MAXISORP®、NUNC MAXISORB®及IMMULON®。固相塗有如上文所定義之捕獲試劑，其可按需要藉由非共價或共價相互作用或物理連接而連接。用於附接之技術包括描述於美國專利第4,376,110號及其中所引用之參考文獻中的彼等。若為共價，則將板或其他固相與交聯劑以 及捕獲試劑一起在此項技術中熟知之條件下孵育，諸如在室溫下持續一個小時。在一些實施例中，將板堆疊且在分析本身之前長久地塗佈，且然後以手動、半自動或自動(諸如藉由使用機器人)方式同時對若干樣品進行分析。
在一些實施例中，將塗佈過之板用與結合位點非特定異結合且使結合位點飽和之阻斷劑處理，以防止不希望的游離配位體與板之孔上的過量位點之結合。適合用於此目的之阻斷劑的實例包括但不限於例如明膠、牛血清白蛋白、卵白蛋白、酪蛋白及無脂奶。阻斷處理典型地在周圍溫度之條件下進行一段時間，典型地約1-4小時。
在一些實施例中，在塗佈及阻斷之後，將所要分析之樣品適當地稀釋，添加至經固定之相中。可用於出於此目的而進行稀釋之示例性緩衝液包括但不限於(a)含有0.5% BSA、0.05% TWEEN 20®清潔劑(P20)、0.05% PROCLIN® 300抗生素、5mM EDTA、0.25% 3-((3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基)-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)表面活性劑、0.2%β-γ球蛋白及0.35M NaCl之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)；(b)含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)、0.05% P20及0.05% PROCLIN® 300之PBS，pH 7；(c)含有0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLIN® 300、5mM EDTA及0.35M NaCl之PBS，pH 6.35；(d)含有0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLIN® 300、5mM EDTA、0.2%β-γ球蛋白及0.35M NaCl之PBS；及(e)含有0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLIN® 300、5mM EDTA、0.25% CHAPS及0.35M NaCl之PBS。
選擇用於孵育樣品及經固定之捕獲試劑的條件以最大化分析靈敏性且使解離減到最少，且確保存在於樣品中之任何所關注之分析物(諸如FkpA)與經固定之捕獲試劑結合。視情況，使樣品與經固定之捕獲試劑分離(例如藉由洗滌)以移除未捕獲之物質。用於洗滌之溶液通常為緩衝液(例如「洗滌緩衝液」)。若對所捕獲之所關注之物質可能在後續步驟中在某種程度上解離存在任何擔憂，則可在此階段亦添加交聯劑或其他合適試劑，以允許現在結合之所關注之物質(例如FkpA)共價附接於捕獲試劑。
使經固定之捕獲試劑加上存在之任何結合之所關注之物質與偵測抗FkpA抗體接觸。在一些實施例中，偵測抗體經生物素化。在一些 實施例中，用於生物素化標記物之偵測手段為親和素或鏈黴親和素-HRP。在一些實施例中，偵測手段之讀出為螢光的或比色的。
來自樣品之現在與捕獲試劑結合之任何所關注之游離物質(例如FkpA)的含量係使用用於偵測抗體之偵測手段來量測或定量。在一些實施例中，量測或定量包括將作為以上步驟之結果而發生反應與標準曲線相比較以測定與已知量相比所關注之物質(例如FkpA)的含量。
添加至經使固定捕獲試劑中之抗體將直接標記，或藉由在洗掉過量第一抗體之後添加莫耳過量之針對第一抗體之動物物種之IgG的第二經標記抗體而間接地偵測。在後者(間接分析)中，將針對第一抗體之經標記抗血清添加至樣品中以便原位產生經標記之抗體。
用於第一或第二抗體之標記為不妨礙所關注之游離物質(例如FkpA)與第一或第二抗體結合的任何可偵測官能基。合適標記物之實例包括已知用於免疫分析中之彼等，諸如上文列舉之彼等。
習知方法可用於使此等標記物與蛋白質或多肽共價結合。舉例而言，可使用諸如二醛、碳二醯亞胺、二順丁烯二醯亞胺、雙醯亞胺酯、雙重氮化聯苯胺及類似物之偶合劑來將抗體用上述螢光、化學發光及酶標記物進行標記。參見例如美國專利第3,940,475號(螢光測定法)及美國專利第3,645,090號(酶)；Hunter等人，Nature 144：945(1962)；David等人，Biochemistry,13：1014-1021(1974)；Pain等人，J.Immunol.Methods 40：219-230(1981)；及Nygren,J.Histochem.and Cytochem.,30：407-412(1982)。
IX. 獲得用於調配物及方法中之多特異性抗體
用於本文所描述之純化方法中之多特異性抗體可使用此項技術中熟知之包括重組方法之方法來獲得。以下部分提供關於此等方法之指導。
(A)聚核苷酸
編碼多肽之聚核苷酸可獲自任何來源，包括但不限於由鹹信具有多肽mRNA且以可偵測水準表現其之組織製備之cDNA文庫。因此，編碼多肽之聚核苷酸可適宜地由自人類組織製備之cDNA文庫獲得。多肽 編碼基因亦可自基因組文庫或藉由已知合成程序(例如自動化核酸合成)來獲得。
舉例而言，聚核苷酸可編碼整個免疫球蛋白分子鏈，諸如輕鏈或重鏈。完全重鏈不僅包括重鏈可變區(VH)，而且包括重鏈恆定區(CH)，其典型地將包含三個恆定域：CH1、CH2及CH3；及「鉸鏈」區。在一些情況下，恆定區之存在為所需的。
可由聚核苷酸編碼之其他多肽包括抗原結合抗體片段，諸如單域抗體(「dAb」)、Fv、scFv、Fab’及F(ab’)2及「微抗體」。微抗體為(典型地)二價抗體片段，其已切除CH1及CK或CL結構域。由於微抗體小於常規抗體，故其在臨床/診斷用途中會達成較佳組織穿透率，但為二價的，其會保留比單價抗體片段(諸如dAb)高之結合親和力。因此，除非上下文另外指示，否則如本文所用之術語「抗體」不僅涵蓋整個抗體分子，而且涵蓋上文所論述類型之抗原結合抗體片段。較佳地，存在於編碼之多肽中之各構架區將相對於對應人類受者構架包含至少一個胺基酸取代。因此，舉例而言，構架區可相對於受者構架區總計包含三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五個胺基酸取代。
適當地，本文所描述之聚核苷酸可經分離及/或純化。在一些實施例中，聚核苷酸為經分離之聚核苷酸。
術語「經分離之聚核苷酸」旨在表明分子自其正常或天然環境中移出或分離，或已以使得其不存在於其正常或天然環境中之方式製備。在一些實施例中，聚核苷酸為經純化之聚核苷酸。術語經純化旨在表明已移除至少一些污染分子或物質。
適當地，聚核苷酸為實質上純化的，使得相關聚核苷酸構成存在於組合物中之主導(亦即最豐富)聚核苷酸。
(B)聚核苷酸之表現
以下描述主要係關於藉由培養經含有多肽編碼聚核苷酸之載體轉型或轉染的細胞來製備多肽。當然，預期可採用此項技術中熟知之替代方法來製備多肽。舉例而言，可藉由使用固相技術進行直接肽合成來製備適當的胺基酸序列或其部分(參見例如Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis W.H.Freeman Co.,San Francisco,Calif.(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963))。活體外蛋白質合成可使用手動技術或藉由自動化來執行。自動化合成可例如使用應用生物系統肽合成器(Foster City,Calif)使用製造商之說明書來實現。可使用化學法或酶促法來產生所需多肽而分開地化學合成多肽之各個部分且將其組合。
將如本文所描述之聚核苷酸插入表現載體中以產生多肽。術語「控制序列」係指為在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所必需的DNA序列。控制序列包括但不限於啟動子(例如天然相關之啟動子或異源啟動子)、信號序列、增強子元件及轉錄終止序列。
聚核苷酸當與另一聚核苷酸序列一起置於一功能關係中時為「可操作地連接」。舉例而言，前序列或分泌前導子之核酸若表現為參與多肽之分泌的前蛋白，則為與該多肽之核酸可操作地連接；啟動子或增強子若影響編碼序列之轉錄，則為與該序列可操作地連接；或核糖體結合位點若經安置以便有助於轉譯，則為與編碼序列可操作地連接。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之核酸序列為連續的，且在分泌前導子之情況下為連續的及處於閱讀相中。然而，增強子不必為連續的。連接係藉由在適宜限制位點處進行連結來實現。若此類位點不存在，則根據習知作法使用合成寡核苷酸銜接子或連接子。
對於抗體，可在相同或不同之表現載體中選殖輕鏈及重鏈。編碼免疫球蛋白鏈之核酸區段與表現載體中之控制序列可操作地連接，從而確保免疫球蛋白多肽之表現。
可藉由熟知方法(其視細胞宿主之類型而變化)將含有聚核苷酸序列(例如可變重鏈及/或可變輕鏈編碼序列及視情況存在之表現控制序列)之載體轉移至宿主細胞中。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，然而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質體轉染、生物發射或基於病毒之轉染可用於其他細胞宿主(大體上參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，第2版，1989)。用於轉型哺乳動物細胞之其他方法包括使用聚凝胺、原生質體融合、脂質體、電穿孔及微量注射。為產生轉基因動物，可將轉基因微量注射至受精之母細胞中， 或可併入胚胎幹細胞之基因組，且將此類細胞之核轉移至去核之卵母細胞中。
載體
術語「載體」包括表現載體及轉型載體及穿梭載體。
術語「表現載體」意謂能夠活體內或活體外表現之構築體。
術語「轉型載體」意謂能夠自一個實體轉移至另一實體(其可屬於該物種或可屬於不同物種)之構築體。若構築體能夠自一個物種轉移至另一物種(諸如自大腸桿菌質粒至諸如屬於芽孢桿菌屬之細菌)，則轉型載體有時被稱為「穿梭載體」。其甚至可為能夠自大腸桿菌質粒轉移至土壤桿菌屬(Agrobacterium)到達植物之構築體。
載體可如下文所描述轉型至合適宿主細胞中以使多肽表現。各種載體為公眾可獲得的。載體可例如呈質粒、黏粒、病毒粒子或噬菌體之形式。可藉由多種程序將適當核酸序列插入載體中。一般而言，使用技術此項技術中已知之將DNA插入適當的限制性核酸內切酶位點中。含有此等組分中之一或多者的合適載體之構築採用熟練技工已知之標準連結技術。
載體可為例如質粒、病毒或噬菌體載體，其具備複製起點、視情況存在之用於表現該聚核苷酸之啟動子及視情況存在之啟動子的調控子。載體可含有此項技術中熟知之一或多個可選標記基因。
此等表現載體為典型地在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA之主要部分而可複製的。
宿主細胞
舉例而言，宿主細胞可為細菌、酵母或其他真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。
可使用已經基因操縱之轉基因多細胞宿主生物體來產生多肽。生物體可為例如轉基因哺乳動物生物體(例如轉基因山羊或小鼠家系)。
合適原核生物包括但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如大腸桿菌。各種大腸桿菌菌株為公眾可獲得的，諸如大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)；大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27,325)及K5 772(ATCC 53,635)。其他合適原核宿主細胞包括腸桿菌科(諸如埃希氏桿菌屬，例如大腸桿菌；腸桿菌屬(Enterobacter))、歐文氏菌屬、克雷伯氏桿菌屬、變形桿菌屬、沙門氏菌屬(例如鼠傷寒沙門氏菌)、沙雷氏菌屬(Serratia)(例如黏質沙雷氏菌)及志賀氏菌屬以及芽孢桿菌屬(諸如枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，例如地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(諸如銅綠假單胞菌)及鏈黴菌屬(Streptomyces)。此等實例為說明性而非限制性的。菌株W3110為一種尤其較佳宿主或親本宿主，因為其為用於重組聚核苷酸產物發酵之常見宿主菌株。較佳地，宿主細胞分泌最小量之蛋白水解酶。舉例而言，菌株W3110可經修飾以在編碼對宿主而言為內源性多肽的基因中實現基因突變，並且此類宿主之實例包括大腸桿菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大腸桿菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan’；大腸桿菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan’；大腸桿菌W3110菌株40B4，其為具有非卡那黴素(kanamycin)抗性degP缺失突變之菌株37D6；及具有突變周質蛋白酶之大腸桿菌菌株。或者，活體外選殖方法(例如PCR或其他核酸聚合酶反應)為合適的。在一些實施例中，原核宿主細胞(例如大腸桿菌宿主細胞)表現一或多種伴侶蛋白以有助於抗體之摺疊及組裝。在一些實施例中，伴侶蛋白為FkpA、DsbA或DsbC中之一或多者。在一些實施例中，伴侶蛋白由內源性伴侶蛋白基因表現。在一些實施例中，伴侶蛋白由外源性伴侶蛋白基因表現。在一些實施例中，伴侶蛋白基因為大腸桿菌伴侶蛋白基因(例如大腸桿菌FkpA基因、大腸桿菌DsbA基因及/或大腸桿菌DsbC基因)。
在此等原核宿主中，可製得表現載體，該等表現載體將典型地含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。此外，將存在多種熟知啟動子中之許多，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子將典型地視情況使用操作子序列控制表現，且具有核糖體結合位點序列及類似物，以引 發及完成轉錄及轉譯。
可使用真核微生物來表現。真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為適合用於多肽編碼載體之選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為常用之低等真核宿主微生物。其他宿主包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬宿主，諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦爾提克魯維酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)以及馬克思克魯維酵母(K.marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)；假絲酵母屬(Candida)；裏氏木黴(Trichoderma reesia)；粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及絲狀真菌，諸如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)以及麯黴屬(Aspergillus)宿主，諸如構巢麯黴(A.nidulans)及黑麯黴(A.niger)。甲醇酵母在本文中為合適的且包括但不限於選自由組成之屬的能夠依靠甲醇生長之酵母：漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬、克勒克酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬、酵母屬(Saccharomyces)、球擬酵母屬(Torulopsis)以及紅酵母屬(Rhodotorula)。酵母屬為較佳酵母宿主，並且合適載體按需要具有表現控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列及類似序列。典型啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶及其他醣解酶。誘導型酵母啟動子尤其包括來自乙醇脫氫酶、異細胞色素C以及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶的啟動子。
除微生物之外，亦可使用哺乳動物組織細胞培養物來表現及製備如本文所描述之多肽，且在一些情況下為較佳的(參見Winnacker,From Genes to Clones VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987))。對於一些實施例，真核細胞可能為較佳的，因為此項技術中已研製出許多能夠分泌異源多肽(例如完整免疫球蛋白)之合適宿主細胞株，且其包括CHO細胞株、各種Cos細胞株、HeLa細胞，較佳骨髓瘤細胞株或轉型B細胞或雜交瘤。在一些實施 例中，哺乳動物宿主細胞為CHO細胞。
在一些實施例中，宿主細胞為脊椎動物宿主細胞。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為藉由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎細胞株(經亞選殖以在懸浮培養物中生長之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO或CHO-DP-12細胞株)；小鼠足細胞；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝細胞瘤細胞株(Hep G2)。
X. 半抗體之多特異性抗體組裝物的製備
在一些實施例中，本發明提供用於製備多特異性抗體之方法及試劑。在一些實施例中，多特異性抗體係藉由分開製備半抗體來製備，各半抗體包含結合特定抗原決定基之VH/VL單元。在一些實施例中，各半抗體係在宿主細胞中分開製備。在一些實施例中，各半抗體係在同一宿主細胞中一起製備。將半抗體混合且使其組裝成多特異性抗體。在一些實施例中，各半抗體係在同一宿主細胞中一起製備。在一些實施例中，宿主細胞表現伴侶蛋白，諸如FkpA、DsbA及/或DsbC，以有助於半抗體之摺疊。在一些實施例中，多特異性抗體係由結合IL13之半抗體及結合IL17之半抗體組裝。
各半抗體如美國專利第7,642,228號中所描述可具有工程改造至重鏈中之杵(突起)或臼(空腔)。簡單來說，可首先產生CH3杵突變體。然後可藉由使接近於配偶體CH3結構域上之杵的殘基366、368及407隨機化來產生CH3臼突變體之文庫。在某些實施例中，杵突變包含T366W，且具有突變之臼包含IgG1或IgG4骨架中之T366S、L368A及Y407V。其他免疫球蛋白同型中之等效突變可由熟習此項技術者得到。另外，熟練技工將容易瞭解，較佳的是用於雙特異性抗體之兩個半抗體為同一同型。
在一些實施例中，含有杵或臼突變之半抗體係在單獨培養物 中藉由在細菌宿主細胞(例如大腸桿菌)中表現重鏈及輕鏈構築體而產生。各半抗體可藉由蛋白質A親和層析分開地純化。來自杵及臼半抗體之經澄清之細胞提取物可藉由HiTrap® MaBSelectTM SuReTM管柱來純化。具有不同特異性之經蛋白質A純化之半抗體可經組裝以在還原劑存在下在活體外在氧化還原反應中形成雙特異性抗體。
在一些實施例中，含有杵或臼突變之半抗體係在同一培養物中藉由在同一細菌宿主細胞(例如大腸桿菌)中表現重鏈及輕鏈構築體而產生。半抗體可藉由蛋白質A親和層析來純化。來自杵及臼半抗體之澄清之細胞提取物可藉由HiTrap® MaBSelectTM SuReTM管柱來純化。具有不同特異性之經蛋白質A純化之半抗體可經組裝以在還原劑存在下在活體外在氧化還原反應中形成雙特異性抗體。
可使用任何合適方法來製備所需還原條件。舉例而言，可藉由添加還原劑(reductant/reducing agent)至反應物(諸如本發明之組裝混合物)中來製備所需還原條件。合適還原劑包括但不限於二硫蘇糖醇(DTT)、叁(2-羧乙基)膦(TCEP)、氫硫基乙酸、抗壞血酸、硫醇乙酸、麩胱甘肽(GSH)、β-巰基乙胺、半胱胺酸/胱胺酸、GSH/麩胱甘肽二硫化物(GSSG)、半胱胺/胱胺、甘胺醯基半胱胺酸及β-巰基乙醇，較佳GSH。在某些特定實施例中，還原劑為弱還原劑，包括但不限於GSH、β-巰基乙胺、半胱胺酸/胱胺酸、GSH/GSSG、半胱胺/胱胺、甘胺醯基半胱胺酸及β-巰基乙醇，較佳GSH。在某些較佳實施例中，還原劑為GSH。在某些實施例中，還原劑不為DTT。以合適濃度且在合適實驗條件下選擇合適還原劑以在反應中達成所需還原條件在一般熟習此項技術者之能力範圍內。舉例而言，在20℃下在具有10g/L之雙特異性抗體蛋白質濃度的溶液中10mM L-還原麩胱甘肽將產生約-400mV之起始氧化還原電位。舉例而言，添加麩胱甘肽至組裝混合物中產生有利於杵入臼雙特異性組裝之弱還原條件。類似類別中之其他還原劑(諸如BMEA(β-巰基乙胺))可具有類似作用。參見WO2013/055958，其以全文引用之方式併入本文中。反應之還原條件可使用此項技術中已知之任何合適方法來估計及量測。舉例而言，還原條件可使用刃天青指示物來量測(在還原條件下自藍色脫色至無色)。對於更精密量測，可使用氧化還原電位計 (諸如由BROADLEY JAMES®製備之ORP電極)。
在某些特定實施例中，還原條件為弱還原條件。如本文所用之術語「弱還原劑」或「虛弱還原條件」係指藉由在25℃下具有陰性氧化電位之還原劑製備的還原劑或還原條件。當pH值在7與9之間，且溫度在15℃與39℃之間時，還原劑之氧化電位較佳在-50至-600mV、-100至-600mV、-200至-600mV、-100至-500mV、-150至-300mV之間，更佳在約-300至-500mV之間，最佳為約-400mV。熟習此項技術者將能夠選擇適合用於製備所需還原條件之還原劑。熟練研究者將認識到，可以較低濃度使用強還原劑，亦即在相同的濃度、pH值及溫度下具有比以上所提及之還原劑更陰性之氧化電位的還原劑。在一較佳實施例中，蛋白質在還原劑存在下在上文敍述之條件下孵育時將能夠形成二硫鍵。弱還原劑之實例包括但不限於麩胱甘肽、β-巰基乙胺、胱胺酸/半胱胺酸、GSH/GSSG、半胱胺/胱胺、甘胺醯基半胱胺酸及β-巰基乙醇。在某些實施例中，可使用類似於200倍莫耳比之GSH：抗體的氧化電位作為弱還原條件之參考點，此時可預期使用其他還原劑之有效組裝。
麩胱甘肽濃度可以莫耳濃度或以相對於存在於組裝混合物中之半抗體的量的莫耳比或莫耳過量來表述。使用目標莫耳比之還原劑控制組裝混合物中之蛋白質濃度；此防止因可變蛋白質濃度而產生之過度還原或不足還原(under reducing)。在某些其他實施例中，相對於半抗體之總量以2-600倍、2-200倍、2-300倍、2-400倍、2-500倍、2-20倍、2-8倍、20-50倍、50-600倍、50-200倍或100-300倍莫耳過量，較佳50-400倍，更佳100-300倍且最佳200倍莫耳過量將還原劑添加至組裝混合物中。在某些實施例中，組裝混合物具有7與9之間的pH值，較佳pH 8.5。
XI. 包括多特異性抗體之多肽的純化
本文提供用於使用伴侶蛋白(例如FkpA、DsbA及/或DsbC)純化在大腸桿菌中產生之多肽(例如多特異性抗體)的方法。在一些態樣中，多特異性抗體之純化包括以下依序進行之步驟：親和層析、混合模式層析及疏水相互作用層析。在一些實施例中，多特異性抗體係在親和層析之前組裝。在其他態樣中，多特異性抗體係在親和層析之後組裝。在一些實施 例中，多特異性抗體為雙特異性抗體，其中抗體之一條臂(亦即一個VH/VL單元)結合IL13且抗體之另一條臂結合IL17。
在一些實施例中，多特異性抗體包含兩條或更多條抗體臂，其中不同抗體臂結合不同抗原決定基。在一些實施例中，抗體臂包含VH/VL單元。在一些實施例中，抗體臂包含半聚體，亦稱為半抗體。為有助於組裝，在一些實施例中，一條抗體臂之重鏈經修飾以包含「杵」且另一條抗體臂之重鏈包含「臼」，使得第一重鏈之杵配合至第二重鏈之臼中。
在一些實施例中，多特異性抗體之各臂係在單獨的細胞培養物中製備。在抗體臂在宿主細胞中表現之後，收集全部細胞培養液並均質化且提取抗體臂。在一些實施例中，在層析之前添加聚乙烯亞胺(PEI)至細胞溶解產物中。在一些實施例中，細胞溶解產物在層析之前經離心。然後，藉由親和層析純化多特異性抗體之各臂。在一些實施例中，親和層析為蛋白質A層析。此時，可分析經純化之抗體臂；例如藉由SDS-PAGE SEC層析、質譜法等。然後將經純化之多特異性抗體臂合併且允許其藉由本文所描述之方法進行組裝。
在其他實施例中，多特異性抗體之各臂係在單獨的細胞培養物中製備。在抗體臂在宿主細胞中表現之後，收集全部細胞培養液並均質化。然後將來自各培養物之細胞勻漿混合且提取經合併之抗體臂。在一些實施例中，在層析之前添加聚乙烯亞胺(PEI)至細胞溶解產物中。在一些實施例中，細胞溶解產物在層析之前經離心。然後藉由親和層析純化經合併之多特異性抗體臂。在一些實施例中，親和層析為蛋白質A層析。此時，可分析經純化之抗體臂；例如藉由SDS-PAGE SEC層析、質譜法等。然後將經純化之多特異性抗體臂合併且允許其藉由本文所描述之方法進行組裝。
在其他實施例中，多特異性抗體之各臂係在同一細胞培養物中製備。在抗體臂在宿主細胞中表現之後，收集全部細胞培養液並均質化且提取抗體臂。在一些實施例中，在層析之前添加聚乙烯亞胺(PEI)至細胞溶解產物中。在一些實施例中，細胞溶解產物在層析之前經離心。然後藉由親和層析純化多特異性抗體之臂。在一些實施例中，親和層析為蛋白質A 層析。此時，可分析經純化之抗體臂；例如藉由SDS-PAGE SEC層析、質譜法等。然後允許經純化之多特異性抗體臂藉由本文所描述之方法進行組裝。
在一些實施例中，細胞溶解產物中之PEI的最終濃度為至少約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%或5.0中之任一者。在一些實施例中，細胞溶解產物中之PEI的最終濃度在約0.1%與5%、0.1%與1%、0.1%與0.5%、0.5%與5%、0.5%與1%或1%與5%中之任一者之間。在一些實施例中，使包含PEI之細胞溶解產物保持超過約1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、14h、16h、18h、20h或24h中之任一者。在一些實施例中，使包含PEI之細胞溶解產物保持約1h至24h、1h至6h、6h至12h、12h至18h、18h至24h中之任一者。在一些實施例中，使包含PEI之細胞溶解產物保持約10h至14h中之任一者。在一些實施例中，使包含PEI之細胞溶解產物保持在約4℃與37℃之間。在一些實施例中，使包含PEI之細胞溶解產物保持在約周圍溫度下。
在一些實施例中，在層析之前藉由離心使細胞溶解產物澄清。在一些實施例中，細胞溶解產物在層析之前經過濾。在一些實施例中，細胞溶解產物在層析之前經0.22μm過濾器過濾。
親和層析之實例包括但不限於使用用蛋白質A或蛋白質G衍生之層析。親和層析材料之實例包括但不限於ProSep®-vA、ProSep® Ultra Plus、Protein A Sepharose® Fast Flow、Toyopearl® AF-rProtein A、MabSelectTM、MabSelect SuReTM及MabSelect SuReTM LX。在上文之一些實施例中，親和層析材料係在管柱中。在上文之一些實施例中，親和層析材料為膜。在一些實施例中，親和層析為蛋白質A層析。在一些實施例中，蛋白質A層析為MabSelect SuReTM層析。
在一些實施例中，隨後將來自親和層析步驟之洗出液施加至混合模式層析。在一些實施例中，混合模式材料包含能夠進行以下功能中之一或多者的官能基：陰離子交換、陽離子交換、氫鍵結及疏水相互作用。在一些實施例中，混合模式材料包含能夠進行陰離子交換及疏水相互作用 之官能基。在一些實施例中，混合模式材料包含能夠進行陽離子交換及疏水相互作用之官能基。混合模式材料可含有N-苯甲基-N-甲基乙醇胺、4-巰基-乙基-吡啶、己胺或苯基丙胺作為配位體或含有交聯聚烯丙基胺。混合模式材料之實例包括CaptoTM adhere樹脂、AccellTM Plus四級甲胺(QMA)樹脂、CaptoTM MMC樹脂、MEPHyperCelTM樹脂、HEAHyperCelTM樹脂、PPAHyperCelTM樹脂或ChromaSorbTM膜或Sartobind STIC®。在一些實施例中，混合模式材料為CaptoTM adhere樹脂。在一些實施例中，混合模式層析係以結合及溶離模式執行，其中多特異性抗體結合混合模式層析材料且然後自混合模式層析材料溶離。在上文之一些實施例中，混合模式材料係在管柱中。在上文之一些實施例中，混合模式材料係在膜中。
在一些實施例中，隨後將來自混合模式層析步驟之洗出液施加至疏水相互作用層析(HIC)。在一些實施例中，在疏水相互作用層析之前將來自混合模式層析步驟之洗出液施加至陰離子交換層析。疏水相互作用層析為根據疏水性分離生物分子之液相層析技術。HIC層析材料之實例包括但不限於Toyopearl®己基-650、Toyopearl®己基-650C、Toyopearl®丁基-650、Toyopearl®苯基-650、Toyopearl®醚-650、HiTrap®瓊脂糖、辛基Sepharose®、苯基Sepharose®或丁基Sepharose®。在一些實施例中，HIC層析材料包含苯基Sepharose®。在其他實施例中，HIC層析材料包含丁基Sepharose®。在一些實施例中，HIC層析係以流穿模式執行，其中多特異性抗體流穿HIC層析。在上文之一些實施例中，HIC層析材料係在管柱中。在上文之一些實施例中，HIC層析材料係在膜中。
在本發明之一些實施例中，在HIC層析之前將混合模式層析洗出液施加至陰離子交換層析。在一些實施例中，陰離子交換層析材料為固相，其帶正電荷且具有游離陰離子供與在固相上或固相中穿過之水溶液中之陰離子交換。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陰離子交換材料可為膜、整體柱或樹脂。在一實施例中，陰離子交換材料可為樹脂。在一些實施例中，陰離子交換材料可包含一級胺、二級胺、三級胺或四級銨離子官能基、聚胺官能基或二乙胺基乙基官能基。陰離子交換材料之實例為此項技術中已知的且包括但不限於POROS® HQ 50、POROS® PI 50、POROS® D、Mustang® Q、Q Sepharose® Fast Flow(QSFF)及DEAE-Sepharose®。在一些實施例中，陰離子交換層析材料為QSFF層析材料。在一些實施例中，陰離子交換層析係以結合及溶離模式執行。在上文之一些實施例中，陰離子交換層析材料係在管柱中。在上文之一些實施例中，陰離子交換層析材料在膜中。
在本發明之一些實施例中，將來自HIC層析之包含多特異性抗體的級分施加至陽離子交換層析。在一些實施例中，陽離子交換層析材料為固相，其帶正電荷且具有游離陽離子供與在固相上或固相中穿過之水溶液中之陽離子交換。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換材料可為膜、整體柱或樹脂。在一些實施例中，陽離子交換材料可為樹脂。陽離子交換材料可包含羧酸官能基或磺酸官能基，諸如但不限於磺酸鹽、羧酸、羧甲基磺酸、磺異丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺醯基、硫氧基乙基(sulphoxyethyl)或正磷酸鹽。在上文之一些實施例中，陽離子交換層析材料為陽離子交換層析管柱。在上文之一些實施例中，陽離子交換層析材料為陽離子交換層析膜。陽離子交換材料之實例為此項技術中已知的，包括但不限於Mustang® S、Sartobind® S、SO3 Monolith,CIM®、CIMmultus®及CIMac® SO3、S Ceramic HyperD®、POROS® XS、POROS® HS 50、POROS® HS 20、磺丙基-Sepharose® Fast Flow(SPSFF)、SP-Sepharose® XL(SPXL)、CM Sepharose® Fast Flow、CaptoTM S、Fractogel® EMD Se Hicap、Fractogel® EMD SO3 -或Fractogel® EMD COO-。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，陽離子交換材料為POROS® HS 50。在一些實施例中，陽離子交換層析係以結合及溶離模式執行。在上文之一些實施例中，陽離子交換層析材料係在管柱中。在上文之一些實施例中，陽離子交換層析材料係在膜中。
在本發明之一些實施例中，將來自陰離子交換層析之包含多肽(例如多特異性抗體)的級分施加至羥磷灰石層析。在一些實施例中，羥磷灰石包含(Ca5(PO4)3OH)2。在一些實施例中，羥磷灰石層析材料為固相層析。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，羥磷灰石材料可為膜、整體柱或樹脂。在一些實施例中，陽離子交換材料可為樹脂。在一些 實施例中，樹脂為陶瓷。在一些實施例中，羥磷灰石層析為陶瓷羥磷灰石層析。在一些實施例中，羥磷灰石層析為CHT陶瓷羥磷灰石層析。羥磷灰石材料之實例為此項技術中已知的，包括但不限於CHT陶瓷羥磷灰石I型及II型。在一些實施例中，羥磷灰石層析係以結合及溶離模式執行。在上文之一些實施例中，羥磷灰石層析材料係在管柱中。在上文之一些實施例中，羥磷灰石層析材料係在膜中。
包含多特異性抗體之溶液加載於本文所描述之層析材料中之任一者上可經最佳化以使多特異性抗體與雜質分離。在一些實施例中，將包含多特異性抗體之溶液加載至層析材料上經最佳化以當以結合及溶離模式(例如在本文所指定情況下之親和層析、混合模式層析及離子交換層析)使用時使多特異性抗體與層析材料結合。舉例而言，可在許多不同pH值下之加載緩衝液中將包含多特異性抗體之溶液加載至層析材料(例如層析管柱)上，而加載緩衝液之電導率為恆定的。或者，可在許多不同電導率下之加載緩衝液中將包含多特異性抗體之溶液加載至層析材料上，而加載緩衝液之pH值為恆定的。在將包含多特異性抗體之溶液加載於層析材料上及多特異性抗體自層析材料溶離至彙集物級分中完成之後，彙集物級分中之污染物的量提供關於在給定pH值或電導率下產物與污染物之分離的資訊。同樣地，對於多特異性抗體流穿層析材料(例如HIC)之層析，將加載緩衝液關於pH值及電導率最佳化，使得多特異性抗體流穿層析材料，而雜質由層析材料保留或以與多特異性抗體不同之速率流穿層析材料。
在一些實施例中，包含多特異性抗體或抗體臂之溶液的加載密度為每公升親和層析材料(例如蛋白質A層析材料)大於約10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g或150g中之任一者。在一些實施例中，包含多特異性抗體或抗體臂之溶液的加載密度在每公升親和層析材料(例如蛋白質A層析材料)約10g與20g、20g與30g、30g與40g、40g與50g、50g與60g、60g與70g、70g與80g、80g與90g、90g與100g中之任一者之間。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，將親和層析之洗出液以每公升混合模式層析材料(例如CaptoTM adhere層析材料)大於 約30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g或150g中之任一者之多肽的加載密度加載至混合模式層析材料上。在一些實施例中，親和層析洗出液之加載密度在每公升混合模式層析材料(例如CaptoTM adhere層析材料)約10g與20g、20g與30g、30g與40g、40g與50g、50g與60g、60g與70g、70g與80g、80g與90g、90g與100g中之任一者之間。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，將混合模式層析或陰離子交換層析之洗出液以每公升HIC層析材料(例如苯基Sepharose®或丁基Sepharose®層析材料)大於約30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g或150g中之任一者之多肽的加載密度加載至HIC層析材料上。在一些實施例中，混合模式層析或陰離子交換層析之洗出液的加載密度在每公升混合模式層析材料(例如苯基Sepharose®或丁基Sepharose®層析材料)約10g與20g、20g與30g、30g與40g、40g與50g、50g與60g、60g與70g、70g與80g、80g與90g、90g與100g中之任一者之間。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，將混合模式層析之洗出液以每公升陰離子交換層析材料(例如QSFF層析材料)大於約30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g或150g中之任一者之多肽的加載密度加載至陰離子交換層析材料上。在一些實施例中，混合模式層析之洗出液的加載密度在每公升陰離子交換層析材料(例如QSFF層析材料)約10g與20g、20g與30g、30g與40g、40g與50g、50g與60g、60g與70g、70g與80g、80g與90g、90g與100g中之任一者之間。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，將來自HIC層析之包含多特異性抗體的級分以每公升陽離子交換層析材料(例如POROS® HS 50層析材料)大於約30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g或150g中之任一者之多肽的加載密度加載至陽離子交換層析材料上。在一些實施例中，來自HIC層析之包含多特異性抗體之級分的加載密度在每公升陽離子交換層析材料(例如 POROS® HS 50層析材料)約10g與20g、20g與30g、30g與40g、40g與50g、50g與60g、60g與70g、70g與80g、80g與90g、90g與100g中之任一者之間。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，將來自陰離子交換層析之包含多特異性抗體的級分以每公升羥磷灰石層析材料(例如CHTI型陶瓷羥磷灰石層析材料)小於約5g、10g、15g、20g、25g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g或150g中之任一者之多肽的加載密度加載至羥磷灰石層析材料上。在一些實施例中，來自HIC層析之包含多特異性抗體之級分的加載密度在每公升羥磷灰石層析材料(例如CHTI型陶瓷羥磷灰石層析材料)約5g與10g、10g與15g、15g與20g、20g與25g、25g與30g、30g與50g、50g與100g及100g與150g中之任一者之間。
多特異性抗體自層析材料之溶離可經最佳化而以最少之污染物且以最小彙集物體積產生產物。舉例而言，可在加載緩衝液中將含有多特異性抗體或抗體臂之溶液加載至層析材料(例如層析管柱)上。在加載完成之後，用在許多不同pH值下之緩衝液溶離多特異性抗體或抗體臂，而溶離緩衝液之電導率為恆定的。或者，多特異性抗體或抗體臂可在許多不同電導率下之溶離緩衝液中自層析材料溶離，而溶離緩衝液之pH值為恆定的。在多特異性抗體或抗體臂自層析材料溶離完成之後，彙集物級分中之雜質的量提供關於在給定pH值或電導率下多特異性抗體或抗體臂與雜質之分離的資訊。多特異性抗體或抗體臂在高數目之級分(例如八個管柱體積)中溶離指示溶離型態之「拖尾」。在本發明之一些實施例中，溶離之拖尾降至最低程度。
視例如所需緩衝液pH值、所需緩衝液電導率、所關注蛋白質之特徵及純化方法而定可採用各種緩衝液。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，該等方法包括使用緩衝液。緩衝液可為加載緩衝液、平衡緩衝液或洗滌緩衝液。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中之一或多者為相同的。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液為不同的。在本文所描述之方法中之任一者的一 些實施例中，緩衝液包含鹽。加載緩衝液可包含氯化鈉、乙酸鈉或其混合物。在一些實施例中，加載緩衝液為氯化鈉緩衝液。在一些實施例中，加載緩衝液為乙酸鈉緩衝液。在一些實施例中，緩衝液包含Tris。在一些實施例中，緩衝液包含精胺酸。
如本文所用之加載物為加載至層析材料上之組合物。加載緩衝液為用於將包含多特異性抗體或抗體臂之溶液加載至層析材料上的緩衝液。層析材料可在加載所要純化之溶液之前用平衡緩衝液來平衡。在一些實例中，在將溶液加載至層析材料上之後且在多特異性抗體或抗體臂自固相溶離之前使用洗滌緩衝液。然而，可藉由洗滌緩衝液自層析材料中移出一些所關注之產物(例如多特異性抗體)(例如在HIC情況下之流穿模式)。
如本文所用之溶離為自層析材料中移出產物(例如多特異性抗體或抗體臂)。溶離緩衝液為用於使所關注之多特異性抗體或其他產物自層析材料溶離的緩衝液。在許多情況下，溶離緩衝液具有與加載緩衝液不同之物理特徵。舉例而言，溶離緩衝液可具有與加載緩衝液不同之電導率或與加載緩衝液不同之pH值。在一些實施例中，溶離緩衝液具有比加載緩衝液低之電導率。在一些實施例中，溶離緩衝液具有比加載緩衝液高之電導率。在一些實施例中，溶離緩衝液具有比加載緩衝液低之pH值。在一些實施例中，溶離緩衝液具有比加載緩衝液高之pH值。在一些實施例中，溶離緩衝液具有與加載緩衝液不同之電導率及不同之pH值。溶離緩衝液可具有較高或較低電導率與較高或較低pH值之任何組合。
電導率係指水溶液在兩個電極之間傳導電流的能力。在溶液中，電流藉由離子遷移而流動。因此，隨著存在於水溶液中之離子之量增加，溶液將具有更高電導率。電導率之度量之基本單位為西門子(或姆歐)、姆歐(mS/cm)，且可使用電導率計(諸如各種型號之Orion電導率計)來量測。由於電解電導率為溶液中之離子運載電流的能力，故可藉由改變其中之離子的濃度來改變溶液之電導率。舉例而言，可改變溶液中緩衝劑之濃度及/或鹽(例如氯化鈉、乙酸鈉或氯化鉀)之濃度以達成所需電導率。較佳地，改變各種緩衝液之鹽濃度以達成所需電導率。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，加載緩衝 液具有大於約1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm或20mS/cm中之任一者的電導率。電導率可在約1mS/cm與20mS/cm、4mS/cm與10mS/cm、4mS/cm與7mS/cm、5mS/cm與17mS/cm、5mS/cm與10mS/cm或5mS/cm與7mS/cm中之任一者之間。在一些實施例中，電導率為約1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm或20mS/cm中之任一者。在一個態樣中，電導率為加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液之電導率。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及洗滌緩衝液中之一或多者的電導率為相同的。在一些實施例中，加載緩衝液之電導率不同於洗滌緩衝液及/或平衡緩衝液之電導率。
在一些實施例中，溶離緩衝液具有小於加載緩衝液之電導率的電導率。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，溶離緩衝液具有小於約0.0mS/cm、0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm或7.0mS/cm中之任一者的電導率。電導率可在約0mS/cm與7mS/cm、1mS/cm與7mS/cm、2mS/cm與7mS/cm、3mS/cm與7mS/cm或4mS/cm與7mS/cm、0mS/cm與5.0mS/cm、1mS/cm與5mS/cm、2mS/cm與5mS/cm、3mS/cm與5mS/cm或4mS/cm及5mS/cm中之任一者之間。在一些實施例中，溶離緩衝液之電導率為約0.0mS/cm、0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm或7.0mS/cm中之任一者。
在一些實施例中，溶離緩衝液具有大於加載緩衝液之電導率的電導率。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，溶離緩衝液具有大於約5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、 8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm、20.0mS/cm、21.0mS/cm、22.0mS/cm、23.0mS/cm、24.0mS/cm、25.0mS/cm、26.0mS/cm、27.0mS/cm、28.0mS/cm、29.0mS/cm或30.0mS/cm中之任一者的電導率。電導率可在約5.5mS/cm與30mS/cm、6.0mS/cm與30mS/cm、7mS/cm與30mS/cm、8mS/cm與30mS/cm、9mS/cm與30mS/cm或10mS/cm與30mS/cm中之任一者之間。在一些實施例中，溶離緩衝液之電導率為約5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm 18.0mS/cm、19.0mS/cm、20.0mS/cm、21.0mS/cm、22.0mS/cm、23.0mS/cm、24.0mS/cm、25.0mS/cm、26.0mS/cm、27.0mS/cm、28.0mS/cm、29.0mS/cm或30.0mS/cm中之任一者。在以上實施例中之任一者的一些態樣中，藉由分步梯度或藉由線性梯度使溶離緩衝液之電導率相對於加載及/或洗滌緩衝液有所變化。
在本發明之一些實施例中，在電導率為約<6.5mS/cm之緩衝液中將包含多特異性抗體之溶液加載至混合模式層析材料上，且使多肽在電導率為約1.5mS/cm之溶離緩衝液中自層析材料溶離。在一些實施例中，加載緩衝液具有約6.5mS/cm之電導率且溶離緩衝液具有約3mS/cm之電導率。在一些實施例中，加載緩衝液具有約5.5mS/cm之電導率且溶離緩衝液具有約2mS/cm之電導率。在一些實施例中，加載緩衝液具有約5.5mS/cm之電導率且溶離緩衝液具有約1mS/cm之電導率。在以上實施例之其他實施例中，層析材料為CaptoTM adhere樹脂。
在以上實施例中之任一者的一些態樣中，藉由分步梯度或藉由線性梯度使溶離緩衝液之電導率相對於加載及/或洗滌緩衝液有所變化。在一些實施例中，在<6.5mS/cm下將包含多特異性抗體之組合物加載至混合模式層析(例如CaptoTM ahere層析)上，且藉由達至約1.5mS/cm之分步電導率梯度使多特異性抗體自混合模式層析溶離。在一些實施例中，在<2.5mS/cm下將包含多特異性抗體之組合物加載至陰離子交換層析(例如QSFF 層析)上，且藉由達至約8.6mS/cm之分步電導率梯度使多特異性抗體自陰離子交換層析溶離。在一些實施例中，在約5.0mS/cm下將包含多特異性抗體之組合物加載至陽離子交換層析(例如POROS® HS 50層析)上，且藉由分步電導率梯度達至約27.5mS/cm之使多特異性抗體自陽離子交換層析溶離。
在一些實施例中，將包含多特異性抗體之組合物加載至羥磷灰石層析(例如CHT I型陶瓷羥磷灰石層析)上，且藉由線性電導率梯度使多特異性抗體自羥磷灰石層析溶離。在一些實施例中，在包含約10mM磷酸鈉之羥磷灰石緩衝液A中將多特異性抗體加載至羥磷灰石層析上。在一些實施例中，藉由逐漸添加包含約10mM磷酸鈉、約1M氯化鈉之羥磷灰石緩衝液B來形成線性梯度。在一些實施例中，羥磷灰石緩衝液A及/或B為約pH 6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3中之任一者。在一些實施例中，羥磷灰石緩衝液A及/或B為約pH 6.8。在一些實施例中，在梯度上溶離緩衝液中之羥磷灰石緩衝液B含量增加。在一些實施例中，線性梯度以約0%羥磷灰石緩衝液B開始且以約100%羥磷灰石緩衝液B結束。在一些實施例中，在約10、15、20、25或30個管柱體積(CV)中之任一者上，線性梯度以約0%羥磷灰石緩衝液B開始且以約100%羥磷灰石緩衝液B結束。在一些實施例中，在約20管柱體積(CV)個，線性梯度以約0%羥磷灰石緩衝液B開始且以約100%羥磷灰石緩衝液B結束。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，加載緩衝液具有小於約10、9、8、7、6或5中之任一者的pH值。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，加載緩衝液具有大於約4、5、6、7、8或9中之任一者的pH值。加載緩衝液可具有在約4與9、4與8、4與7、5與9、5與8、5與7、5與6中之任一者之間的pH值。在一些實施例中，加載緩衝液之pH值為約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8中之任一者。pH值可為加載緩衝液、平衡緩衝液或洗滌緩衝液之pH值。在一些實施例中，加載緩衝液、平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中之一或多者的pH值為相同的。在一些實施例中，加載緩衝液之pH值不同於平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液之pH值。
在一些實施例中，溶離緩衝液具有小於加載緩衝液之pH值的pH值。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，溶離緩衝液具有小於約8、7、6、5、4、3或2中之任一者的pH值。溶離緩衝液之pH值可在約4與9、4與8、4與7、4與6、4與5、5與9、5與8、5與7、5與6、6與9、6與8、6與7中之任一者之間。在一些實施例中，溶離緩衝液之pH值為約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0中之任一者。
在一些實施例中，溶離緩衝液具有大於加載緩衝液之pH值的pH值。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，溶離緩衝液具有大於約5、6、7、8或9中之任一者的pH值。溶離緩衝液之pH值可在約4與9、5與9、6與9、7與9、8與9、4與8、5與8、6與8、7與8、4與7、5與7及6與7中之任一者之間。在一些實施例中，溶離緩衝液之pH值為約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7/0、7.5、8.0、8.5或9.0中之任一者。
在一些實施例中，在約pH 7.7下將包含多特異性抗體或抗體臂之溶液加載至親和層析(例如蛋白質A層析)上，且藉由達至約2.9之pH值的分步梯度使多特異性抗體或抗體臂自親和層析溶離。
在一些態樣中之中之任一者該以上實施例，藉由分步梯度或藉由線性梯度使溶離緩衝液之pH值相對於加載及/或洗滌緩衝液有所變化。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，流速小於約50CV/h、40CV/h或30CV/h中之任一者。流速可在約5CV/h與50CV/h、10CV/h與40CV/h或18CV/h與36CV/h中之任一者之間。在一些實施例中，流速為約9CV/h、18CV/h、25CV/h、30CV/h、36CV/h或40CV/h中之任一者。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，流速小於約100cm/h、75cm/h或50cm/h中之任一者。流速可在約25cm/h與150cm/h、25cm/h與100cm/h、50cm/h與100cm/h或65cm/h及85cm/h中之任一者之間。
床高度為所用層析材料之高度。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，床高度大於約5cm、10cm、15cm、20cm、25cm、 30cm、35cm、40cm、45cm或50cm中之任一者。在一些實施例中，床高度在約5cm與50cm之間。在一些實施例中，床高度係基於加載物中之多肽或污染物的量來確定。
在一些實施例中，層析係在具有大於約1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、75mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、25L、50L、100L、200L、300L、400L、500L、600L、700L、800L、900L或100L之體積的管柱中。
在本發明之一些實施例中，自層析收集級分。在一些實施例中，所收集之級分大於約0.01CV、0.02CV、0.03CV、0.04CV、0.05CV、0.06CV、0.07CV、0.08CV、0.09CV、0.1CV、0.2CV、0.3CV、0.4CV、0.5CV、0.6CV、0.7CV、0.8CV、0.9CV、1.0CV、2.0CV、3.0CV、4.0CV、5.0CV、6.0CV、7.0CV、8.0CV、9.0CV或10.0CV。在一些實施例中，彙集含有產物(例如多特異性抗體或抗體臂)之級分。級分中之多肽的量可由熟習此項技術者測定；例如級分中之多肽的量可藉由UV光譜學來測定。在一些實施例中，當OD280大於約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0中之任一者時收集級分。在一些實施例中，當OD280在約0.5與1.0、0.6與1.0、0.7與1.0、0.8與1.0或0.9與1.0中之任一者之間時收集級分。在一些實施例中，彙集含有可偵測多特異性抗體或抗體臂之級分。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，雜質為產物特異性雜質。產物特異性雜質之實例包括但不限於未配對半抗體、未配對抗體鏈、抗體片段、同二聚體、聚集物、高分子量物質、極高分子量物質、低分子量物質及抗體之電荷變異體，諸如酸性變異體及鹼性變異體。
在一些實施例中，方法使得未配對半抗體及/或同二聚體(例如包含相同結合域之配對半二聚體)減少或移除。量測未配對半抗體及同二聚體之存在之方法為此項技術中已知的；例如藉由疏水相互作用層析，包括疏水相互作用層析高效液相層析(HIC-HPLC)。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，半抗體及/或同二聚體之量減少大於約5%、10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。半抗體及/或同二聚體之量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之半抗體及/或同二聚體的量與在純化步驟之前組合物中之半抗體及/或同二聚體的量相比較來進行測定。
聚集之多肽(例如聚集之多特異性抗體或聚集之抗體臂)可為高分子量(HMW)蛋白質。在一些實施例中，聚集之多肽為所關注之多肽的多聚體。HMW蛋白質可為所關注之多肽的二聚體(達至8x單體)或更大。量測聚集蛋白質(例如HMW蛋白質)之方法為此項技術中已知的且描述於實例部分中。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，聚集蛋白質的量減少大於約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。聚集蛋白質的量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。聚集蛋白質的量可減少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之聚集蛋白質(例如HMW蛋白質)的量與在純化步驟之前組合物中之聚集蛋白質(例如HMW蛋白質)的量相比較來進行測定。
片段多肽可為低分子量(LMW)蛋白質。在一些實施例中，片段化多肽為所關注之多特異性抗體或抗體臂之片段。LMW蛋白質之實例包括但不限於Fab(抗原結合片段)、Fc(可結晶片段)區或兩者之組合或所關注之抗體的任何隨機片段化部分。量測片段化蛋白質(例如LMW蛋白質)之方法為此項技術中已知的且描述於實例部分中。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，LMW蛋白質之量減少大於約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。LMW蛋白質之量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。LMW蛋白質之量可減少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之 任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之片段化蛋白質(例如LMW蛋白質)的量與在純化步驟之前組合物中之片段化蛋白質(例如LMW蛋白質)的量相比較來進行測定。
抗體之酸性變異體為抗體之pI小於天然完整抗體之pI的變異體。抗體之鹼性變異體為抗體之pI大於天然完整抗體之pI的變異體。電荷變異體(例如酸性及鹼性變異體)可為自然過程(諸如氧化、脫醯胺化、離胺酸殘基之C端加工、N端焦麩胺酯形成及抗體之醣化)之結果。量測電荷變異體之方法為此項技術中已知的；例如成像毛細管等電聚焦(cIEF)。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，電荷變異體(酸性及/或鹼性變異體)之量減少大於約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。電荷變異體(酸性及/或鹼性變異體)之量可減少約10%與99%、30%與95%、30%與99%、50%與95%、50%與99%、75%與99%或85%與99%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之電荷變異體(酸性及/或鹼性變異體)的量與在純化步驟之前組合物中之電荷變異體的量相比較來進行測定。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，雜質為製程特異性雜質。舉例而言，該雜質可為宿主細胞物質；伴侶蛋白，諸如FkpA、DsbA及DSPC；浸出蛋白質A；核酸；另一多肽；內毒素；病毒污染物；細胞培養基組分、羧肽酶B、慶大黴素等中之任何一或多者。在一些實例中，污染物可為來自例如但不限於以下之宿主細胞蛋白質(HCP)：細菌細胞，諸如大腸桿菌細胞、昆蟲細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、真菌細胞。
宿主細胞蛋白質(HCP)為來自產生多肽之細胞的蛋白質。舉例而言，ECP為來自宿主細胞之蛋白質，亦即大腸桿菌蛋白質。CHOP之量可藉由酶聯免疫吸附分析(「ELISA」)來量測。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，HCP(例如ECP)之量減少大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。HCP之量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。在一些實施例中，HCP之量減少約10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之HCP的量與在純化步驟之前組合物中之HCP的量相比較來進行測定。
伴侶蛋白(例如FkpA、DsbA及/或DsbC)常常用於在細胞中製備抗體以有助於抗體之摺疊及組裝。伴侶蛋白可使用特異性結合FkpA、DsbA或DsbC之抗體藉由ELISA來偵測。舉例而言，可針對FkpA、DsbA或DsbC之超純組合物產生抗體。在一些實施例中，FkpA、DsbA及/或DsbC係藉由質譜法測定。
浸出蛋白質A為自與其結合之固相洗提或洗滌得到之蛋白質A。舉例而言，浸出蛋白質A可自蛋白質A層析管柱浸出。蛋白質A之量可例如藉由ELISA來量測。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，浸出蛋白質A之量減少大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中之任一者。浸出蛋白質A之量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。在一些實施例中，浸出蛋白質A之量減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之浸出蛋白質A的量與在純化步驟之前組合物中之浸出蛋白質A的量相比較來進行測定。
量測DNA(諸如宿主細胞DNA)之方法為此項技術中已知的且描述於實例部分中。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，DNA之量減少大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中之任一者。DNA之量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。DNA之量可減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之DNA的量與在純化步驟之前組合物中之DNA的量相比較來測定。
細胞培養基組分係指存在於細胞培養基中之組分。細胞培養基可為在收穫細胞時之細胞培養基。在一些實施例中，細胞培養基組分為 慶大黴素。慶大黴素之量可藉由ELISA來量測。在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，細胞培養基組分之量減少大於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%中之任一者。細胞培養基組分之量可減少約10%至99%、30%至95%、30%至99%、50%至95%、50%至99%、75%至99%或85%至99%中之任一者。在一些實施例中，細胞培養基組分之量減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%中之任一者。在一些實施例中，該減少係藉由將自純化步驟中回收之組合物中之細胞培養基組分的量與在純化步驟之前組合物中之細胞培養基組分的量相比較來進行測定。
在一些實施例中，多特異性抗體係藉由病毒過濾進一步純化。病毒過濾為移除多肽純化饋料流中之病毒污染物。病毒過濾之實例包括超濾及微濾。在一些實施例中，使用小病毒過濾器純化多肽。
在一些實施例中，在層析之後(例如在HIC層析之後或在陽離子交換層析之後)將多特異性抗體濃縮。濃縮方法之實例為此項技術中已知的且包括但不限於超濾及透濾。在一些實施例中，藉由第一超濾、透濾及第二超濾來濃縮多特異性抗體。在一些實施例中，超濾及/或透濾使用截止值小於約5kDal，10kDal、15kDal、20kDal或25kDal中之任一者的過濾器。在一些實施例中，將第一超濾之截留物透濾至醫藥調配物中。
在本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，該等方法進一步包括將純化方法之經純化多肽與醫藥學上可接受之載劑組合。在一些實施例中，藉由超濾/透濾將多特異性抗體調配至醫藥調配物中。
在一些實施例中，多肽(例如多特異性抗體)之濃度超過約10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL、200mg/mL或300mg/mL中之任一者。在一些實施例中，多特異性抗體之濃度在約10mg/mL與20mg/mL、20mg/mL與30mg/mL、30mg/mL與40mg/mL、40mg/mL與50mg/mL、50mg/mL與60mg/mL、60mg/mL與70mg/mL、70mg/mL與80mg/mL、80mg/mL與90mg/mL、90mg/mL與100 mg/mL、100mg/mL與110mg/mL、110mg/mL與120mg/mL、120mg/mL與130mg/mL、130mg/mL與140mg/mL、140mg/mL與150mg/mL、150mg/mL與160mg/mL、160mg/mL與170mg/mL、170mg/mL與180mg/mL、180mg/mL與190mg/mL、190mg/mL與200mg/mL200mg/mL與300mg/mL中之任一者之間。
XII. 調配物及製備調配物之方法
本文亦提供包含藉由本文所描述之方法純化之多特異性抗體的調配物及製備調配物之方法。舉例而言，經純化之多肽可與醫藥學上可接受之載劑組合。
在一些實施例中，可藉由將具有所需純度之多肽與視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑以凍乾調配物或水溶液形式進行混合來製備多肽調配物供儲存(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))。
如本文所用之「載體」包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所採用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物為無毒的。常常，生理學上可接受之載劑為水性pH緩衝溶液。
可接受之載劑、賦形劑及穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒，且包括緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八基二甲基苯甲基銨；氯化六甲銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，多肽調配物中之多肽維持功能活性。
要用於活體內投與之調配物必須為無菌的。此係藉由通過無菌過濾膜過濾而容易地實現。
本文中之調配物亦可如所治療之特定適應症所必需含有超過一種活性化合物，較佳為不具有不利地影響彼此之互補活性的彼等。舉例而言，除多肽之外，在一種調配物中可能需要包括另一多肽(例如抗體)。或者或另外，組合物可進一步包含化學治療劑、細胞毒性劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑及/或心臟保護劑。此類分子適當地以對預定目標而言有效之量以組合形式存在。
XIII. 在表現FkpA之細胞中製備之多肽的組合物
在一些態樣中，本發明提供包含在表現FkpA之宿主細胞中製備之重組多肽之組合物。在一些實施例中，組合物中之重組多肽已自包括FkpA之宿主細胞蛋白質中純化。在一些實施例中，組合物包含在表現FkpA之宿主細胞中製備之重組多肽及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含小於約或不超過約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.2ppm FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.1ppm FkpA。在一些實施例中，組合物包含濃度為至少約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中之任一者的重組多肽。在一些實施例中，組合物包含濃度為至少約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中之任一者的重組多肽；及小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.2ppm FkpA。在 一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.1ppm FkpA。在一些實施例中，組合物包含濃度在約5mg/ml與約100mg/ml、約50mg/ml與約150mg/ml、約100mg/ml與約200mg/ml、約150mg/ml與約250mg/ml、約200mg/ml與約300mg/ml之間的重組多肽；及小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.2ppm FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.1ppm FkpA。
在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含小於約或不超過約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的DsbA及/或DsbC。在一些實施例中，組合物包含濃度為至少約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中之任一者的重組多肽。在一些實施例中，組合物包含濃度為至少約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中之任一者的重組多肽；及小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的DsbA及/或DsbC。在一些實施例中，組合物包含濃度在約5mg/ml與約100mg/ml、約50mg/ml與約150mg/ml、約100mg/ml與約200mg/ml、約150mg/ml與約250mg/ml、約200mg/ml與約300mg/ml之間的重組多肽；及小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的DsbA及/或DsbC。用於偵測DsbA 及DsbC之試劑及方法由美國臨時申請案第62/129,701號提供，該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，重組多肽為抗體。在一些實施例中，重組多肽為多特異性抗體。在一些實施例中，重組多肽為雙特異性抗體。在一些實施例中，組合物包含在表現FkpA(例如表現外源性FkpA)之細胞中製備之多特異性抗體。在一些實施例中，組合物包含在表現FkpA之細胞中製備之多特異性抗體，其中組合物基本上不含FkpA。在一些實施例中，組合物包含在表現FkpA之細胞中製備之多特異性抗體，其中組合物包含小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm的FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.2ppm FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.1ppm FkpA。在一些實施例中，組合物包含濃度為至少約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中之任一者的多特異性抗體。在一些實施例中，組合物包含濃度為至少約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中之任一者的多特異性抗體；及小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.2ppm FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.1ppm FkpA。在一些實施例中，組合物包含濃度在約5mg/ml與約100mg/ml、約50mg/ml與約150mg/ml、約100mg/ml與約200mg/ml、約150mg/ml與約250mg/ml、約200mg/ml與約300mg/ml之間的多特異性抗體；及小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、 0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.2ppm FkpA。在一些實施例中，包含重組多肽之組合物包含約0.1ppm FkpA。
在一些實施例中，組合物包含在表現FkpA(例如表現外源性FkpA、DsbA及/或DsbC)之細胞中製備之多特異性抗體。在一些實施例中，組合物包含在表現FkpA之細胞中製備之多特異性抗體，其中組合物基本上不含FkpA。在一些實施例中，組合物包含在表現FkpA之細胞中製備的多特異性抗體，其中組合物包含小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm的DsbA及/或DsbC。在一些實施例中，組合物包含濃度為至少約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml約中之任一者的多特異性抗體。在一些實施例中，組合物包含濃度為至少約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中之任一者的多特異性抗體；及小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的DsbA及/或DsbC。在一些實施例中，組合物包含濃度在約5mg/ml與約100mg/ml、約50mg/ml與約150mg/ml、約100mg/ml與約200mg/ml、約150mg/ml與約250mg/ml、約200mg/ml與約300mg/ml之間的多特異性抗體；及小於約50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中之任一者的DsbA及/或DsbC。
在一些實施例中，組合物包含在表現FkpA之細胞中製備之雙特異性抗體，其中組合物基本上不含FkpA。在一些實施例中，雙特異性 抗體包含第一半抗體及第二半抗體，其中第一半抗體包含結合IL-17之第一VH/VL單元且第二半抗體包含結合IL-13之第二VH/VL單元。在一些實施例中，第一半抗體不結合IL-13，且其中第二半抗體不結合IL-17。在某些特定實施例中，本文所提供之多特異性抗體與IL-17AA、IL-17AF及IL-17FF結合，抑制IL-17AA、IL-17AF及IL-17FF誘導之活性，且抑制IL-13誘導之活性。在某些此類實施例中，與單獨由IL-17A或IL-17F誘導之活性相反，抗IL-13/IL-17AA、AF及FF雙特異性抗體有利地阻斷由所有IL-17A及F細胞因子誘導之活性。在一些實施例中，本文所提供之多特異性抗體與IL-17AA、IL-17AF及IL-17FF結合。在一些實施例中，IL-17AA誘導之活性為IL-17AA誘導之基因表現及/或活體內或活體外細胞增殖。在一些實施例中，IL-17AF誘導之活性為IL-17AF誘導之基因表現及/或活體內或活體外細胞增殖。在一些此類實施例中，IL-17FF誘導之活性為IL-17FF誘導之基因表現及/或活體內或活體外細胞增殖。在一些實施例中，IL-13誘導之活性為IL-13誘導之基因表現及/或活體內或活體外細胞增殖。在一些實施例中，本文所提供之多特異性抗體不抑制IL-13與IL-13Rα1之結合。
在一些實施例中，組合物中之抗IL13/IL17AA AF FF雙特異性抗體包含第一半抗體及第二半抗體，其中第一半抗體包含結合IL-17AA、AF及FF之第一VH/VL單元且第二半抗體包含結合IL-13之第二VH/VL單元，其中第一VH/VL單元包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3，且其中第二VH/VL單元包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，第一半抗體不結合IL-13，且第二半抗體不結合IL-17。
在一些實施例中，第一VH/VL單元包含與SEQ ID NO：21 之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的VH序列及與SEQ ID NO：22之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的VL序列，且其中第二VH/VL單元包含與SEQ ID NO：10之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的VH序列及與SEQ ID NO：11之胺基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的VL序列。在一些實施例中，提供多特異性抗體，其中第一VH/VL單元包含含有SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列的VL序列，且其中第二VH/VL單元包含含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。
在某些實施例中，第一半抗體結合包含重鏈及輕鏈之IL17AA AF及FF，該重鏈包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，該輕鏈包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且第二半抗體結合包含重鏈及輕鏈之IL13，該重鏈包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，該輕鏈包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。在某些實施例中，第一半抗體結合包含重鏈及輕鏈之IL17AA AF及FF，該重鏈包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列，該輕鏈包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，且第二半抗體結合包含重鏈及輕鏈之IL13，該重鏈包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，該輕鏈包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在一些實施例中，多特異性抗體係藉由組裝如本文所描述之半抗體來製備。半抗體係如下在原核宿主細胞中製備：藉由培養宿主細胞來表現半抗體之兩條鏈，藉此在表現後兩條鏈摺疊並組裝以在宿主細胞中形成生物學半抗體。在一些實施例中，宿主細胞為大腸桿菌宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含一或多個聚核苷酸，該一或多個聚核苷酸編碼：編碼多肽之第一鏈的第一轉譯單元、編碼多肽之第二鏈的第二轉譯單元；及編碼至少一個選自由肽基-脯胺醯基異構酶(例如FkpA)、蛋白質二硫化物氧化還原酶(例如DsbA及DsbC)組成之群的伴侶蛋白的轉譯單元。轉譯單元可在同一多肽分子或不同多肽分子上，或任何組合。舉例而言，第一及第二轉譯單元可在第一多肽分子上且編碼一或多個伴侶蛋白之轉譯單 元可在第二多肽分子上。宿主細胞係在培養基中在包含以下之條件下培養：生長期，包含生長溫度及生長攪拌速率；及製備期，包含製備溫度及製備攪拌速率。在一些實施例中，生長溫度為高於製備溫度2至10℃，且生長攪拌速率為高於製備攪拌速率50至250rpm。自細胞中回收半抗體且如上文所描述進行組裝。在一些實施例中，在組裝之前藉由蛋白質A層析純化半抗體。參見美國臨時申請案第62/075,792號，其以全文引用之方式併入本文中。
經組裝之多特異性抗體經進一步純化以移除雜質，包括例如FkpA。在一些實施例中，經組裝之多特異性抗體係藉由混合模式層析(例如陰離子交換混合模式層析)隨後疏水相互作用層析來純化。在一些實施例中，經組裝之多特異性抗體係藉由混合模式層析(例如陰離子交換混合模式層析)隨後陰離子交換層析隨後疏水相互作用層析來純化。在一些實施例中，經組裝之多特異性抗體係藉由混合模式層析(例如陰離子交換混合模式層析)隨後陰離子交換層析隨後疏水相互作用層析隨後陽離子交換層析來純化。在一些實施例中，使用本文所描述之分析來分析經純化之多特異性抗體的FkpA移除情況。
XIV. 製品及套組
藉由本文所描述之方法純化之多肽(例如多特異性抗體)及/或包含藉由本文所描述之方法純化之多肽的調配物可含在一製品內。在一些實施例中，該製品包含使用本文所描述之超純FkpA多肽產生的抗體。製品可包含含有多肽及/或多肽調配物之容器。較佳地，該製品包含：(a)容器，容器內包含含有本文所描述之多肽及/或多肽調配物的組合物；及(b)具有關於向個體投與調配物之說明的包裝插頁。
製品包含容器及在容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納或含有調配物且可具有無菌存取口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿之塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性劑為多肽。標籤或包裝插頁指示組合物在個體中之使用，且具有關於多肽及所提供之任何其他藥物之給藥量及時間間隔的具體指導。製品 可進一步包括由商業及用戶立場來看所需之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭及注射器。在一些實施例中，容器為注射器。在一些實施例中，注射器進一步含在注射裝置內。在一些實施例中，注射裝置為自動注射器。
「包裝插頁」用於指通常包括在治療產品之商業包裝中的說明書，其含有關於以下之資訊：適應症、用法、劑量、投與、禁忌、要與所包裝之產品組合的其他治療產品及/或關於此類治療產品之使用的警告。
在一些實施例中，本發明提供用於偵測包含由細菌細胞製備之重組多肽的醫藥組合物中之FkpA的套組，其中該套組包含如本文所描述之抗FkpA抗體。在其他實施例中，本發明提供用於偵測包含由細菌細胞製備之重組多肽的醫藥組合物中之FkpA的套組，其中該等套組包含如本文所描述之抗FkpA抗體。在一些實施例中，本發明提供用於偵測包含由細菌細胞製備之重組多肽的醫藥組合物中之FkpA的套組，其中細菌細胞(例如大腸桿菌細胞)表現FkpA。在一些實施例中，套組包括使用說明。在一些實施例中，套組進一步包含超純FkpA以在產生用於定量樣品中之FkpA的標準曲線時用作參考標準物。在一些實施例中，套組進一步包含超純FkpA以在用於偵測樣品中之FkpA的分析中用作陽性對照。
揭示於本說明書中之所有特徵可以任何組合形式進行組合。揭示於本說明書中之各特徵可由服務相同、等效或類似目的之替代特徵代替。因此，除非另外明確陳述，否則所揭示之各特徵僅為通用系列之等效物或類似特徵之實例。
本發明之其他細節係藉由以下非限制性實例來說明。本說明書中之所有參考文獻的揭示內容係明確地以引用之方式併入本文中。
實例
以下實例單純地旨在示例本發明且因此不應視為以任何方式限制本發明。以下實例及詳細描述係為了說明而非為了限制提供。
實例1. 關於大腸桿菌蛋白質之分析並不適當地量測FkpA。
FkpA為大腸桿菌中典型地不以高水準表現之伴侶蛋白，但過表現FkpA之大腸桿菌已用於改良包括抗體之異多聚體真核蛋白質的適 當組裝及摺疊(Zhang等人，2003,BioTechniques,35：1032-1042)。
為測定對大腸桿菌蛋白質(ECP)之分析是否可適當地偵測FkpA之存在並定量FkpA，將超純FkpA(參見實例2)之樣品以不同濃度添加至分析稀釋劑(0.15M NaCl/0.1M NaPO4/0.1%魚膠/0.05%聚山梨酸酯20/0.05% Proclin 300)中，且在ECP分析中測試(Zhu-Shimoni,J.等人，2014,Biotech and Bioeng.111：2367-2379)。使用牛血清白蛋白作為陰性對照，因為對大腸桿菌蛋白質之分析不會偵測此哺乳動物蛋白質。結果顯示於表4中。
LTR=小於範圍，ND=未偵測到
結果表明ECP分析未適當地偵測及定量FkpA。另外，用於偵測大腸桿菌殘餘物(例如大腸桿菌蛋白質及核酸)之商業分析作為對在大腸桿菌中製備之治療性蛋白質之釋放分析的一部分未特定地鑑別FkpA。因此，對產生對FkpA具高度特異性且對可能妨礙FkpA偵測分析之其他大腸桿菌蛋白質及/或核酸具最低反應性的多株抗體存在需要。此外，FkpA之超純製劑適用於產生用於準確偵測治療劑多肽製劑中之FkpA的FkpA標準物以及產生FkpA陽性對照以確保研究及商業多肽製備之分析品質。
實例2. 超純FkpA之製備
材料及方法
提取步驟
在大腸桿菌(名為66F8之W3110衍生物：△fhuA△phoA ilvG2096(Valr)△prc spr43H1△degP△manA lacIQ△ompT△menE)中表現FkpA。為此，如EP1356 052(參見例如實例9-10，尤其段落[0207])中所描 述，構築含有FkpA之ORF的相容質粒(pACYC，Novagen,Madison,WI)。將0.5mL冷凍儲備培養物(含有10-15% DMSO)解凍且用於接種含有補充有2mL卡那黴素溶液(5mg/mL)及2.5mL 1M磷酸鈉溶液的500mL大豆LB培養基的2L搖瓶。將培養擴大至大規模培養。在約200之OD下將50mL大劑量添加之200mM IPTG添加至發酵物中。IPTG用於誘導tacII啟動子，該tacII啟動子用於控制FkpA開放閱讀框(ORF)之表現。發酵操作持續時間為50小時。
除非另外指出，否則所有細胞溶解及離心步驟均在2-8℃下進行。
將自10L大腸桿菌發酵物中回收之細胞糊狀物的304g等分試樣解凍隔夜。將細胞糊狀物懸浮於10體積之25mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)(pH 6.0)(溶解緩衝液)中且混合60min以產生均勻懸浮液。使用配備有溫度控制單元(初始設定點5℃)之微流化器HC-8000均質器(Microfluidics Corporation)來進行細胞溶解。在引入細胞懸浮液之前將微流化器用1L之冰凍溶解緩衝液沖洗。將細胞懸浮液轉移至微流化器中，且在房舍壓力(6-8K psi)下進行總共四次。使用冰凍溶解緩衝液將殘餘懸浮液自微流化器中趕出。取溶解之細胞懸浮液的200mL等分試樣進行離心及後續純化。將剩餘約3.2L之勻漿儲存在-60℃下。
將200mL等分試樣分成六個相等體積且轉移至50mL離心管中。在20℃之溫度下，使用配備有SS-34轉子之RC6 Plus離心機(Thermo Corporation)以15,000rpm之速度將管子離心30min。將含有FkpA之上清液儲存在2-8℃之溫度下且棄去集結粒。
SP Sepharose® Flow陽離子交換層析之分析評估
經計算之FkpA等電點(pI)(基於成熟蛋白之胺基酸序列)為7.01。在pH 6.0下進行之陽離子交換層析將產生目標蛋白質之良好結合，而大部分大腸桿菌蛋白質(ECP)雜質(具有3-6之pI值)將流穿管柱。
此潛在第一層析步驟之分析評估係使用填充有強陽離子交換介質SP Sepharose® Fast Flow(GE Healthcare)之1mL重力流管柱來執行。
將管柱用3管柱體積(CV)之50mM MES、1.0M NaCl，pH 6.0(溶離緩衝液)預平衡且然後用3CV之50mM MES(pH 6.0)(平衡緩衝液)平衡。將1.0mL等分試樣之溶解產物上清液加載至管柱，隨後用平衡緩衝液進行5CV洗滌。使用自100mM增加至1000mM(藉由摻混該等平衡及溶離緩衝液來製備)之NaCl濃度使管柱分步溶離。
在不存在二硫鍵還原之情況下使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來測定管柱級分中FkpA之相對純度。結果表明，在此等條件下FkpA完全與陽離子交換介質結合(如由流穿及洗滌級分中缺乏FkpA所證實)(圖1，泳道2及3)。藉由100mM NaCl步驟FkpA完全自管柱溶離，表明FkpA與陽離子交換介質弱結合，且證實大部分ECP流穿管柱之假設。所得含FkpA彙集物非常潔淨，僅具有少量殘餘ECP(圖1，泳道4)。
SP Sepharose ® Flow陽離子交換層析之分步溶離評估
使用SP Sepharose® Fast Flow陽離子交換層析之FkpA純化的製備型評估係在ÄKTA Explorer 100(GE Healthcare)上進行。使用2.6cm(寬)×27.3cm(長)管柱(1CV=145mL)來進行此操作。所有步驟均在8.85mL/min(100cm/h)之流速下進行。將管柱用3CV之溶離緩衝液(25mM MES、1.0M NaCl，pH 6.0)預平衡且然後用3CV之平衡緩衝液(25mM MES，pH 6.0)平衡。將溶解產物上清液加載至管柱且用20mL之平衡緩衝液驅趕。將管柱用5CV之平衡緩衝液洗滌且然後用50mM MES、100mM NaCl，pH 6.0分步溶離。在分步溶離之後，將管柱用3CV之溶離緩衝液洗提。
層析圖顯示於圖2中。管柱級分之SDS-PAGE分析(圖3A及3B)表明FkpA與主要溶離峰有關，且主要存在於級分11-17中。級分18-23中亦存在少量FkpA。
SP Sepharose® Flow陽離子交換層析之梯度溶離評估
為進一步評估SP Sepharose® Fast Flow移除殘餘ECP之潛力，對來自第一製備型評估之級分11-18進行再層析。
彙集級分11-18且使用Sephadex® G-25緩衝液交換回到SP Sepharose® Fast Flow平衡緩衝液中。
遵循相同加載及洗滌參數，在與早期製備型操作中所用相同之SP Sepharose® Fast Flow管柱上對經緩衝液交換之級分進行再層析。使用0-30%梯度(0-300mM NaCl)經9CV進行溶離，此考慮了為FkpA之原始分步溶離所需的相對鹽量。
層析圖(圖4)顯示在相對低(5-11mS/cm)離子強度條件下溶離之大的主鋒。梯度型態顯示與分步溶離型態(圖2)之強相似性，並且不存在較小前峰(彼等級分不包括在經選擇用於再層析之彼等中)。
溶離型態之SDS-PAGE分析. 對相對於FkpA之ECP條帶的檢驗表明使用線性梯度僅達成此等雜質中之一些的部分解析(資料未顯示)。此可能表明此等ECP可能具有類似於FkpA之pI值，或另外一些模式之相互作用可能引起其共純化。
潛在第二純化步驟之分析評估：Q Sepharose® Fast Flow與苯基Sepharose®之比較
Q Sepharose ® Fast Flow
此潛在第二層析步驟之分析評估係使用填充有強陰離子交換介質Q Sepharose® Fast Flow(QSFF)(GE Healthcare)之1mL重力流管柱來執行。
將管柱用5mL之50mM Tris、1.0M NaCl，pH 8.0(QSFF溶離緩衝液)預平衡且然後用5mL之50mM Tris(pH 8.0)(QSFF平衡緩衝液)平衡。使用PD-10管柱(GE Healthcare)將來自上文所描述之SP Sepharose®之梯度評估的級分22-50之迷你彙集物的2.5mL等分試樣緩衝液交換至3.5mL之QSFF平衡緩衝液中且加載至管柱。將管柱用3.5mL QSFF平衡緩衝液洗滌，且隨後用3.0mL之QSFF溶離緩衝液溶離。
藉由SDS-PAGE分析來自QSFF及苯基Sepharose®(下文所描述)之評估的管柱級分(圖5)。Q Sepharose®管柱不結合FkpA，但能夠移除與管柱結合之較高分子量(MW)物質中之三者。然而，在管柱流穿物中仍可與FkpA一起偵測到在約35KDa、約40KDa及約26KDa下之條帶。回收資料概括於表5及6中。Q Sepharose® Fast Flow凝膠給出良好的總回收率(95%)。
FkpA(mg/mL)=(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
苯基Sepharose ®
此潛在第二層析步驟之分析評估係使用填充有疏水相互作用介質苯基Sepharose® Fast Flow(低取代)(GE Healthcare)之1mL重力流管柱來執行。
將管柱用5mL之50mM磷酸鹽(pH 7.0)(苯基溶離緩衝液)預平衡且然後用5mL之0.6M硫酸鈉、50mM磷酸鹽，pH 7.0(苯基平衡緩衝液)平衡。將2.5mL之1.2M硫酸鈉添加至來自上文所描述之SP Sepharose®之梯度評估的級分22-50之迷你彙集物的2.5mL等分試樣中。輕輕混合迷你彙集物且允許其在室溫下靜置30min且然後加載至管柱。將管柱用3.0mL苯基平衡緩衝液洗滌，且隨後用3.0mL體積之含逐漸減少之硫酸鈉(0.5M、0.4M、0.3M、0.2M、0.1M及0M)的苯基溶離緩衝液進行分步溶離。最後，使用3.0mL之純化水(PW)將管柱洗提。
苯基Sepharose®(低取代)凝膠顯示與Q Sepharose® Fast Flow相反之行為：與QSFF結合之雜質能夠流穿苯基Sepharose®(低取代)管柱。在QSFF上與FkpA共純化之約35KDa條帶同樣流穿苯基Sepharose®管柱。在逐漸減少之鹽型態中在0M硫酸鈉下以及在PW洗提物中FkpA溶離得非常晚，表明其疏水性極強。含FkpA級分似乎不含存在於SP Sepharose® Fast Flow彙集物中之ECP雜質。回收資料概括於表5及6中。苯基Sepharose® Fast Flow(低取代)凝膠僅能夠回收51%。剩餘蛋白質可能與管柱結合，表明苯基Sepharose®(低取代)凝膠亦緊密地結合FkpA。苯基Sepharose® Fast Flow(低取代)能夠成功移除殘餘ECP，但代價為回收率較低。
潛在第二純化步驟之分析評估：苯基Sepharose ® 、丁基Sepharose ® 及辛基Sepharose ® 之比較
已證實疏水相互作用層析(HIC)用於第二純化步驟之潛力；執行第二評估，比較具有不同疏水性之三種HIC介質：苯基Sepharose®(低取代)、辛基Sepharose® Fast Flow及丁基Sepharose® 4 Fast Flow(GE Healthcare)。
如上文關於苯基Sepharose®所描述加上另一步驟執行各管柱之層析，在該另一步驟中在使用3.0mL之純化水(PW)洗提管柱之後，使用3mL之2%氫氧化鈉使各管柱再生。
比較來自各管柱之管柱再生級分(表7及8)。不同管柱按照相對於FkpA疏水性增加之順序列於表7及8中。在三者之中，丁基Sepharose® 4 Fast Flow凝膠具有最低再生值(15%)，而辛基Sepharose® Fast Flow及苯基Sepharose® Fast Flow(低取代)分別顯示45%及56%回收率。因此，辛基Sepharose® Fast Flow及苯基Sepharose® Fast Flow(低取代)凝膠在用作第二層析步驟時亦為疏水性的。
FkpA(mg/mL)=(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
潛在第二純化步驟之分析評估：丁基-S Sepharose ® 6 Fast Flow
在比較具有不同疏水性之三種HIC介質之後；評估另一HIC凝膠：丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow(GE Healthcare)。此凝膠在所評估之HIC凝膠層析介質中具有最弱之HIC配位體。
用丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow(GE Healthcare)填充1mL重力流管柱。將管柱用5mL之50mM磷酸鹽(pH 7.0)(丁基-S溶離緩衝液)預平衡且然後用5mL之0.6M硫酸鈉、50mM磷酸鹽，pH 7.0(丁基-S平衡緩衝液)平衡。將2.5mL之1.2M硫酸鈉添加至來自上文所描述之SP Sepharose®之梯度評估的級分22-50之迷你彙集物的2.5mL等分試樣中。輕輕混合迷你彙集物且允許其在室溫下靜置30min且然後加載至管柱。將管柱用3.0mL丁基-S平衡緩衝液洗滌，且隨後用3.0mL體積之含逐漸減少之硫酸鈉(0.5M、0.4M、0.3M、0.2M、0.1M及0M)的丁基-S溶離緩衝液分步溶離。將管柱使用3.0mL之純化水(PW)洗提兩次且然後使用3mL之 2%氫氧化鈉再生。
藉由SDS-PAGE分析來自丁基-S之評估的管柱級分(圖6)。來自SP Sepharose® Fast Flow迷你彙集物之ECP在平衡條件(0.6M硫酸鈉)下不由管柱捕獲。此外，在NaOH再生級分中似乎存在極少的FkpA，表明此層析介質也許能夠自SP Sepharose® Fast Flow彙集物中移除殘餘ECP，同時不具有大的回收損失。
潛在第二純化步驟之分析評估：丁基Sepharose® 4 Fast Flow及丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow之比較
直接比較含有丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow或丁基Sepharose® 4 Fast Flow之1mL重力流管柱。程序如上文關於丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow所描述，除了使用6.0mL之PW而非2×3mL PW將管柱洗提一次。
對來自丁基Sepharose® 4 Fast Flow及丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow之管柱級分的SDS-PAGE分析分別顯示於圖7A及7B中。對於丁基Sepharose® 4 Fast Flow樣品，FkpA溶離得非常晚(50mM磷酸鹽，隨後PW)。再生級分中存在顯著量之FkpA及較低MW雜質。對於丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow樣品，FkpA在若干洗滌濃度之過程中溶離，並且大多數在PW洗提步驟之前溶離。再生級分仍含有一些較低MW雜質及少量FkpA。丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow實驗組之回收資料顯示於表9及10中。質量平衡為定量的，且在再生級分中僅發現總蛋白之6%。丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow凝膠提供殘餘ECP自SP Sepharose® Fast Flow彙集物中之優良清除，以及極高回收率。
FkpA(mg/mL)=(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
丁基-S Sepharose ® 6 Fast Flow最佳化
此實驗之目的為評估管柱之中間0.3M硫酸鈉洗滌將提供類似於潛在之逐漸降低之硫酸鈉梯度的純化(回收率及純度)。
用丁基-S Sepharose® 6 Fast Flow(GE Healthcare)填充1mL重力流管柱。將管柱用5mL之50mM磷酸鹽(pH 7.0)(丁基-S溶離緩衝液)預平衡且然後用5mL之0.6M硫酸鈉、50mM磷酸鹽，pH 7.0(丁基-S平衡緩衝液)平衡。將2.5mL之0.6M硫酸鈉添加至來自上文所描述之SP Sepharose®之梯度評估的級分22-50之迷你彙集物的2.5mL等分試樣中。輕輕混合迷你彙集物且允許其在室溫下靜置30min且然後加載至管柱。將管柱用5.0mL之0.3M硫酸鈉、50nm磷酸鹽，pH 7.0洗滌，且隨後用5.0mL純化水(PW)溶離，且然後使用3mL之2%氫氧化鈉再生。
藉由SDS-PAGE對管柱級分之分析(圖8)表明SP Sepharose® Fast Flow彙集物中之較高MW雜質在減少之硫酸鈉條件下流穿丁基-S Sepharose®管柱，留下非常潔淨之溶離彙集物。在加載泳道中少數較低MW條帶與管柱結合且經由再生移除(如早期凝膠中所示；圖3)。
回收資料顯示於表11及12中。F-T/洗滌彙集物中之回收率比先前實驗之回收值高約5%。PW溶離回收率稍低。其他PW溶離可具有增加之產率。再生步驟亦略高於分步溶離，此與再生之前可能需要更長溶離步驟相符。
FkpA(mg/mL)=(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
丁基-S Sepharose® HIC介質顯示ECP自SP Sepharose® Fast Flow彙集物之優良分離，並且具有極佳FkpA回收率。基於此等分析評估之資料，其將被按比例放大且在FkpA純化製程中用作第二回收步驟。
丁基S Sepharose ® Fast Flow步驟之按比例放大
將丁基-S Sepharose®層析步驟按比例放大以將回收率及純度與分析型丁基-S Sepharose®層析步驟相比較。進行一系列研發操作以將步驟最佳化。分析型HIC操作表明FkpA與丁基-S Sepharose®凝膠相對緊密地結合。評估經擴大之溶離步驟，看是否可獲得FkpA回收率之增加。
緩衝液及溶液
調節緩衝液：0.6M硫酸鈉、50mM磷酸鹽，pH 7.0
平衡緩衝液：0.3M硫酸鈉、50mM磷酸鹽，pH 7.0(A11)
溶離溶液：純化水(PW，A12)
再生溶液：2% NaOH
管柱製備
製備2.6cm×9.4cm(50mL)管柱來進行此評估。將管柱用3CV之平衡緩衝液平衡。
加載調節
將140mL之調節緩衝液逐漸添加至140mL之SP Sepharose® FF彙集物中，並且在添加期間輕輕混合。在添加所有調節緩衝液之後在室溫下繼續混合30分鐘。
層析
層析圖顯示於圖9中。觀測到少量穿透OD，此係基於分析評估進行預測。溶離峰具有明顯拖尾，且在約6CV溶離之後達到10mAUFS。收集彙集後物質作為分離級分。使用2%(0.5M)氫氧化鈉作為再生溶液進行管柱再生。UV-Vis分光光度分析管柱級分顯示於表13中。質量平衡高於分析操作，但數據類似於由先前分析操作產生之數據。按比例放大操作就FkpA之純度及回收率而言顯示類似管柱效能。第二管柱操作顯示類似管柱型態。
SDS-PAGE
藉由SDS-PAGE對管柱級分之分析(圖10A)表明純化步驟類似於分析評估，證實此HIC步驟之按比例放大能夠重現存在於SP Sepharose® Fast Flow彙集物中之宿主細胞蛋白質雜質的移除。較高MW雜 質流穿管柱且較低MW雜質與管柱緊密結合(如由早期凝膠所證實)。溶離彙集物非常潔淨，並且在彙集後物質中觀測到極少量之FkpA。使用SYPRO Ruby試劑(Bio-Rad Laboratoiies)使同一凝膠在染色溶液中隔夜孵育之後成像。SYPRO Ruby成像為用於含蛋白質樣品之分析的較靈敏之偵測方法。SYPRO Ruby成像(圖10B)表明純化FkpA之級分仍具有許多較低MW條帶，其可能為宿主細胞蛋白質雜質及/或FkpA之切短形式。
結論
由選自不同HIC介質之分析評估之參數來看，丁基-S Sepharose®層析步驟之按比例放大為線性的。丁基-S Sepharose®歸因於其具有在此第二純化步驟中所評估之HIC介質之最弱配位體而提供FkpA之最佳回收。基於SDS-PAGE分析，分子純度因此單元操作而極大地提高，其中主要雜質條帶存在於流穿物中或更高度地被截留。
HPLC-SEC分析評估
基於其一級序列，FkpA具有約26kDa之莫耳質量。先前公開之關於FkpA之資訊表明分子在較高MW下通過非共價結合操作。使用蛋白質參考物以及含有FkpA之丁基-S Sepharose®彙集物來進行分析評估，以測定在尺寸排阻層析管柱上FkpA遷移至何處。
材料及方法
使用TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC管柱(7.8mm×30cm；Tosoh Bioscience)進行評估。移動相為0.25M KCl、0.2M磷酸鉀，pH 6.2。管柱流速為0.5mL/min。將FkpA與以下蛋白質標準物相比較：抗體(約150kDa)、牛血清白蛋白(約66.5kDa)及Nutropin®(約22kDa)。
層析
HPLC-SEC結果顯示於圖11中。FkpA具有在抗體與BSA之間的滯留時間，證實早期參考文獻：FkpA具有比由其一級序列將預測到的大得多的溶液莫耳質量(表14)。
Superdex 200尺寸排阻層析
選擇Superdex 200尺寸排阻層析(SEC)來分離FkpA與殘餘較高MW物質及較低MW物質，以及調配蛋白質。
操作1：中試方法使用1.6cm×60cm Superdex 200管柱
初始Superdex 200操作係在120mL管柱上執行。在將Superdex 200 SEC步驟按比例放大以產生最終調配原液之前表徵管柱級分之純度。
材料及方法
使用1.6cm×60cm(1CV=120mL)Superdex 200管柱(GE Healthcare)進行此中試操作。用1CV之0.1M NaOH清潔管柱且然後用3CV之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，pH 7.5)(平衡緩衝液)平衡。
樣品製備
使用一對Amicon Ultra 10kDa單元(Millipore Corporation)濃縮30mL之丁基-S Sepharose®彙集物。使用20min循環將Amicon單元在艾本德5810R離心機中在3000rpm下離心直至截留物體積6mL(1CV之5%)。
層析
Superdex 200層析步驟之層析圖顯示於圖12中。型態似乎不實質上不同於使用TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC管柱之HPLC-SEC型態，除了TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC管柱產生較高MW物質之較佳解析。
SDS-PAGE
藉由SDS-PAGE分析管柱級分32-42。藉由在室溫下(無加熱)與SDS樣品緩衝液一起孵育1h來製備用於電泳之樣品。對普通樣品製備進行此修改來看加熱樣品是否引起較低MW物質之存在。
無染色圖像(圖13A)及同一凝膠之SYPRO Ruby成像(圖13B)顯示存在與完整蛋白質共遷移之較低MW條帶。可推斷出在85℃下加熱5min之習知樣品製備不引起較低MW條帶之存在，因為其存在於未加熱之樣品中。
西方墨點分析
進行西方墨點分析以確定物質之純度是否足以用於免疫兔子或是否需要進行額外的純化工作。對於此分析，使用來自Superdex 200管柱之級分37(峰值級分；圖12)。
凝膠及西方墨點法結果顯示於圖14中。用於西方墨點法之抗體為抗ECP。將蛋白質轉移至PVDF薄片上且將各PVDF薄片與山羊抗ECP一起孵育。隨後使用與辣根過氧化物酶結合之兔抗山羊抗體進行第二次孵育。然後將PVDF薄片與藉由與辣根過氧化物酶反應而發冷光之增強型化學發光受質一起孵育。分子量標記物在StrepTactin及辣根過氧化物酶結合物系統之情況下亦發冷光。與抗ECP一起孵育之免疫墨點在樣品中顯示ECP。凝膠結果證實先前所產生之SYPRO Ruby成像結果(圖13B)。西方墨點法顯示在37kDa與50kDa之間的模糊條帶，此條帶在Sypro Ruby成像情況下未見到。
質譜分析
用胰蛋白酶消化蛋白質且藉由UPLC-MS/MS進行分析，以確定1)存在於物質中之FkpA肽序列，及2)無其他蛋白質雜質存在於樣品中。該分析由來自0-40%乙腈之45分鐘UPLC梯度組成，乙腈係直接噴入高解析率四級桿飛行時間質譜儀中，該高解析率四極桿飛行時間質譜儀收集MS探測掃描，隨後為在層析分離期間各連續MS掃描之前20種最豐富之前驅離子的MS/MS。針對Uniprot大腸桿菌權威及同種型資料庫檢索LC-MS/MS原始資料文件，從而鑑別356FkpA肽(歸因於高MS/MS採樣率許多為同一肽之多個實例)。亦發現2β-半乳糖苷酶肽，其來源於用於校正質譜儀之內標，且因此不含於FkpA樣品中。使用質譜法來進一步表徵FkpA且使用β-半乳糖苷酶作為內對照。
結果顯示於表15中。質譜分析顯示FkpA序列與信號序列 之約91%覆蓋率，表示正如所料，9%不存在於FkpA肽覆蓋範圍中。未觀測到來自其他蛋白質之其他肽，從而得出以下結論：藉由SDS-PAGE及蛋白質印跡分析觀測到之較低MW條帶為FkpA相關的。若有其他雜質存在，則其含量低於質譜儀之偵測極限及/或其組合物不存在於與結果相比較之資料庫中。
Superdex 200操作2-4
在初始中試操作之後，在320mL管柱上執行後續操作2-4以產生最終調配原液。
管柱製備
用1CV之0.1M NaOH清潔2.6cm×60cm管柱(320mL床體積)且然後用3CV之PBS(pH 7.5)(平衡緩衝液)平衡。
樣品製備
使用60mg-95mg之等分試樣來進行操作2-4。使用與操作1所用相同之程序來製備SEC之等分試樣。目標最終體積為16.0mL(床體積之5%)。圖15顯示在操作2期間獲得之層析圖。彙集級分37-44且使用TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC管柱再次分析。圖16顯示操作2級分37-44之TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC層析圖。可見到約2%聚集物。此聚集量為所需的，以便針對聚集物產生抗體。操作3及4之結果類似。
SDS-PAGE
藉由SDS-PAGE分析來自操作1之管柱級分35-40及來自操作2-4之管柱級分37-44。參見圖17(分別泳道2-5)。操作1之物質似乎已降解，且不用於後續實驗。
超濾及過濾
使用Amicon Ultra 10kDa單元將Superdex 200彙集物濃縮至2.0mg/ml之目標蛋白質濃度。僅操作2-4之物質包括於最終原液中，此係歸因於未預料到及未知之操作1物質降解之原因。
使用兩個Amicon Ultra 10kDa單元。將來自操作2-4之13mL組合級分(來自各操作之級分37-44)轉移至各單元中。如先前所描述將樣品離心。倒掉濾液且將UF截留物與來自組合級分之其他物質混合(以使單元中之較高蛋白質濃度降至最低)。重複此製程直至蛋白質濃度略微高於2.0mg/mL之目標。將經濃縮之樣品經0.2μ過濾器過濾且用5mL之UF濾液驅趕。如表16中所示，在目標蛋白質濃度下FkpA之回收率為實際上定量的。
超純FkpA之冷凍-解凍穩定性
冷凍-解凍穩定性測試後之目的為確保試劑穩定多達三次冷凍-解凍，而不損失活性或改變電泳或SEC型態。
材料及方法
使用超純FkpA之75μL等分試樣來進行研究。一個等分試樣保持在冷藏室中且剩餘三個放置在-80℃冷凍器中。在一個小時之後，將三個冷凍等分試樣解凍且輕輕混合。一個等分試樣(「一次冷凍-解凍」)放置在冷藏室中且另外兩個放回冷凍器中。對剩餘兩個樣品重複該製程，其中第二冷凍-解凍樣品轉移至冷藏室，且第三冷凍-解凍樣品保持在-80℃冷凍器中隔夜。在次日將第三樣品解凍。
SDS-PAGE
藉由SDS-PAGE分析各個冷凍-解凍樣品之10μg等分試樣。凝膠結果(圖18)顯示四個樣品各自之間的可比性。
HPLC-SEC
藉由HPLC-SEC分析各個冷凍-解凍樣品之100μg等分試樣。尺寸分級結果(圖19A及19B及表17)顯示四個樣品之間的可比性。較高MW物質及單體方面之非常小的差異可能係歸因於對峰之手工整合。來自Superdex 200操作2-4之超純FkpA原液對三次冷凍-解凍而言為穩定的，並且在蛋白質方面沒有明顯改變。該試劑被認為適合用作用於在兔中產生抗體之免疫原，以及充當ELISA分析之參考且作為用於構造親和管柱以純化來自兔抗血清之抗FkpA的配位體。
藉由SDS-PAGE(圖14)、HPLC-SEC(表17)、N端序列分析及肽質量指紋分析(表15)來表徵最終產物。如使用FkpA之消光係數以分光光度法所測定，濃度為2.02mg/mL，且稀釋至100μg/mL。將經稀釋之溶液指定為標準儲備液I且儲存在-70℃或更低之溫度下。
實例3. 抗FkpA抗體之產生及純化
針對超純FkpA產生多株抗體，以用於用以量測治療多肽之製劑中FkpA之移除情況的分析中。以下實例描述用於產生多株FkpA抗體之純化方法。此等試劑以及FkpA免疫原為研製特異性FkpA ELISA所需的。
用超純FkpA免疫三隻兔子。在第42天，自個別兔子抽取血液且使用FkpA抗血清來純化抗FkpA抗體。藉由直接結合ELISA分析來自兔A、B及C之抗血清及免疫前血清。將超純FkpA在碳酸鹽緩衝液(pH 9.6) 中稀釋至4μg/mL且直接塗佈於Costar 96孔板(目錄號9018)上且在2-8℃下孵育12至72小時。使用板洗滌器用約400μL之洗滌緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及0.05%聚山梨酸酯20)將各孔洗滌並吸出3次且充分地形成墨點。不藉由將板顛倒在廢物儲集器上方來自孔中移除溶液。添加約200μL之分析稀釋劑至各孔中且在周圍溫度下在攪拌下孵育1至2小時。重複洗滌步驟。在分析稀釋劑(0.15M NaCl、0.1M NaPO4 pH 7.2、0.05%聚山梨酸酯20、0.1%魚膠；0.05% proclin 300)中1：500稀釋樣品且然後連續四倍稀釋多達12次且添加至對應孔中。將板在室溫下在攪拌下孵育兩小時。將板用ELISA洗滌緩衝液洗滌且將在分析稀釋劑中稀釋之山羊抗兔-HRP添加至各孔中且在室溫下在攪拌下孵育兩小時。將板用ELISA洗滌緩衝液洗滌且將SureBlue ReserveTM TMB微孔過氧化物酶受質(Kirkegaard & Perry Labs[KPL]，目錄號53-00-00)(受質溶液)添加至板中且允許在室溫下顯色約20分鐘。用0.6N硫酸使反應停止。在450nm之波長下讀取OD且使用Softmax Pro數據簡化軟體來分析數據。來自兔A、B及C之抗血清針對FkpA的免疫反應性為類似的(圖20)，因此將樣品彙集在一起。
FkpA抗體之純化
對彙集之抗血清執行60%硫酸銨沈澱(ASP)步驟。將52.7mL硫酸銨溶液(3.8M硫酸銨、50mM磷酸鹽，pH 7.0)緩慢添加至73.0mL抗FkpA兔抗血清中，且在整個添加過程中輕輕攪拌。一旦添加完全，即將溶液轉移至冷藏室且輕輕混合隔夜。
然後使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來測定ASP抗FkpA抗體之相對純度並且確認蛋白質之莫耳質量。將AS懸浮液之2×10μL等分試樣轉移至單獨之艾本德管中。添加90μL之PBS(pH 7.2)至各樣品中且輕輕混合以溶解懸浮液。將100μL樣品轉移至艾本德管中。將樣品以最高速度微量離心5min。排出上清液且轉移至單獨之艾本德管中。將剩餘球粒在100μL之PBS(pH 7.2)中複水。將上清液之2×10μL等分試樣轉移至單獨之艾本德管中。添加90μL之PBS(pH 7.2)至各上清液樣品中且輕輕混合。
藉由SDS-PAGE分析來自各條件之10μL樣品。在存在及 不存在二硫鍵還原的情況下執行電泳以評估抗體之共價聚集。使用Bio-Rad CriterionTM 4-20% TGX(Tris-Glycine eXtended)Stain FreeTM凝膠執行SDS-PAGE且使用Bio-Rad Criterion Stain FreeTM成像器(Bio-Rad Laboratories)成像。凝膠結果顯示於圖21中。如藉由上清液中不存在抗體(如藉由箭頭所標記)所證實，60%分級步驟成功地耗盡抗血清中之所有兔抗體。
在藉由SDS-PAGE分析之後，將剩餘硫酸銨懸浮液在2-8℃之溫度下在Sorvall RC 6 Plus離心機中在11,000rpm下離心30分鐘。移除上清液且將球粒儲存在-80℃下。
然後將球粒溶解於磷酸鹽緩衝液中。ASP抗FkpA抗體之濃度經UV分光光度法測定為6.69mg/mL。
藉由如上文所描述之直接結合ELISA分析ASP抗FkpA抗體。將超純FkpA在碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中稀釋至4μg/mL且直接塗佈於Costar 96孔板(目錄號9018)上。在分析稀釋劑中1：500稀釋樣品且然後連續兩倍稀釋多達12次。使用山羊抗兔HRP來偵測結合。ASP抗FkpA抗體在1：256,000稀釋時開始對超純FkpA顯示線性劑量反應(圖22)。此等結果促進實行ELISA夾心分析。
ASP抗FkpA抗體情況下之ELISA夾心分析的開展
使用皮爾斯套組(Pierce Kit)EZ-Link過氧化物酶(目錄號31489)根據製造商之說明書使1mg之ASP抗FkpA抗體與HRP結合。將HRP結合之ASP抗FkpA抗體在分析稀釋劑中進一步1/20稀釋且指定為ASP HRP結合物儲備液I。將ASP抗FkpA抗體製成等分試樣且指定為ASP包被來源。然後將ASP包被來源在PBS中稀釋至1mg/mL且指定為ASP包被儲備液I。
將ASP包被儲備液I在碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中稀釋至4μg/mL且直接塗佈於Costar 96孔板(目錄號9018)上。將FkpA稀釋至0.78-100ng/mL範圍內之各種濃度且添加至各對應孔中。將ASP HRP結合物儲備液I稀釋至1：60、1：80、1：100及1：110且添加至各對應孔中。將100μL之經稀釋ASP包被儲備液I吸移至微量滴定板之各孔中且在2-8℃下孵育12至72小時。使用板洗滌器用約400μL之洗滌緩衝液將各孔洗滌並吸 出3次，且充分形成墨點。不藉由將板顛倒在廢物儲集器上方來自孔中移除溶液。添加約200μL之分析稀釋劑至各孔中且在周圍溫度下在攪拌下孵育1至2小時。重複洗滌步驟。將每孔100μL之經稀釋標準物(一式兩份)、對照(一式兩份)及樣品吸移至適當的孔中。將板在周圍溫度下在攪拌下孵育2小時±10分鐘。將孔如上文進行洗滌，使板旋轉，且重複洗滌步驟。將ASP HRP-結合物儲備液I用分析稀釋劑稀釋，得到在最高與最低標準之間的顯著OD範圍，目標為1.5-2.0 OD之最大OD值。向各孔中吸移100μL之經稀釋HRP-結合物儲備液I且在周圍溫度下在攪拌下孵育2小時±10分鐘。將孔如上文進行洗滌，使板旋轉，且重複洗滌步驟。向孔中吸移每孔100μL之受質溶液且在黑暗中在周圍溫度下孵育充足的時間以允許最佳標準曲線顯色。將100μL之0.6N硫酸吸移至各孔中。使用讀板器使用兩個過濾器讀取OD：450nm用於偵測吸光度，而620-630nm用於參考吸光度(參考波長為視情況存在的)。藉由使用數據處理軟體使用最小4參數羅吉斯曲線擬合程式(minimum 4-parameter logistic curve-fitting program)來測定樣品濃度。結果顯示於圖23中。標準曲線在約25ng/mL下似乎進入平臺期。工作範圍經測定為約0.156-20ng/mL且如藉由約1.7之預期最大OD所確定最佳ASP HRP結合物儲備液I稀釋度為1：90。
ASP抗FkpA抗體情況下之ELISA夾心分析的用途
執行ELISA夾心分析以分析如實例6中所描述而產生之抗IL13/IL17雙特異性抗體樣品中之FkpA的量。ASP HRP結合物儲備液I經1：90稀釋。結果顯示非線性(表18)；因此表明其他抗體純化可能為較佳的。
*=數據未包括在計算中，N/A=不適用，GTR=大於範圍，LTR=小於範圍
FkpA抗體之親和純化
為改良ELISA夾心分析之線性，將ASP抗FkpA抗體之等分試樣藉由親和(AF)純化及尺寸排阻層析(SEC)進一步純化。使用共價偶合至活化甘油基CPG之超純FkpA來構築親和管柱，以將目標抗FkpA抗體與非FkpA抗體分離。
用於偶合至甘油基可控孔度玻璃之超純FkpA的製備
將具有2.02mg/mL超純FkpA之20 x 1mL小瓶在2-8℃下解凍隔夜且彙集內容物。使用125mL Sephadex G-25管柱(GE Healthcare)將FkpA緩衝液交換至偶合緩衝液(0.1M碳酸氫鈉、0.5M氯化鈉，pH 8.3)中。用1CV之0.1M NaOH清潔管柱且然後用3CV之偶合緩衝液平衡。
偶合程序
甘油基-CPG(Millipore Corporation)因其高流速特徵及其在溶離階段期間承受低pH值條件之能力而被選擇作為用於構築親和管柱之支撐物。支撐物之甘油基部分具有乙醇官能基，其在胺基化學偶合之前氧化成醛。所有偶合步驟均在室溫下進行。
在通風櫥中添加無水甘油基-CPG至適當量之純化水中(1公克之甘油基-CPG將產生約3mL之水合凝膠)。甘油基-CPG與水輕輕混合以使凝膠完全水合。允許水合凝膠沈降15-30分鐘。體積為10-12mL之沈降體積為水合凝膠的目標。
移除液體層(含有細粒)且添加純化水至經沈降之凝膠中。輕輕混合凝膠且然後沈降15-30分鐘。移除液體層且按需要重複該步驟，直至在液體層中未觀測到細粒。
選擇偏過碘酸鈉(NaIO4)來將甘油基-CPG凝膠上之羥基氧化成醛。添加相等體積之新製備之1%(m/v)偏過碘酸鈉至水合甘油基-CPG中，且然後轉移至適當大小之容器中。將容器緊固至軌道旋轉器上且輕輕混合30分鐘。在氧化步驟結束時，自旋轉器移去容器且允許凝膠沈降。
移除液體，且添加3-4體積之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，pH 7.2)至凝膠中。輕輕地使凝膠懸浮且然後允許沈降15分鐘。移除液體且將PBS再重複3次以移除殘餘偏高磺酸鈉，然後添加所要偶合之蛋白質。最後，將3-4體積之0.1M碳酸氫鈉、0.5M NaCl，pH 8.3(偶合緩衝液)添加至經沈降之凝膠中，輕輕混合，且允許其沈降15分鐘。在偶合步驟之前移除液體。
將經緩衝液交換之FkpA(來自Sephadex G-25步驟)添加至經氧化之甘油基-CPG中。使用氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)來還原中間物席夫鹼(Schiff base)且在FkpA與支撐物之間形成穩定共價鍵。以每毫升經沈降之甘油基-CPG約1mg之氰基硼氫化鈉將NaBH3CN添加至反應混合物中。將反應混合物轉移至密封容器中，緊固至軌道旋轉器上，且在室溫下輕輕混合隔夜。
自旋轉器上移去偶合凝膠且允許其沈降15-30分鐘。在沈降之後，移出上清液之2mL等分試樣且轉移至一對1mL艾本德管中。以最高速度將管子微量離心2分鐘以移除任何殘餘固體。量測上清液中之殘餘蛋白質以測定偶合效率。FkpA與經氧化甘油基-CPG之結合應為定量的，從而耗盡上清液中之蛋白質。上清液中之蛋白質濃度顯示無殘餘FkpA的跡象，表明偶合效率為100%(數據未顯示)。
如上文關於移除NaIO4所描述來洗滌FkpA-CPG凝膠以移除殘餘NaBH3CN。
添加相等體積之1.0M Tris(pH 8.0)至FkpA-CPG凝膠中。使用FkpA之偶合來引入其他胺基以在使用凝膠作為親和支撐物之前阻斷任何剩餘反應性位點。
再次如上文所描述洗滌FkpA-CGP。
親和管柱製備
將親和凝膠裝在1.6cm×K管柱(GE Healthcare)中。最終尺寸為1.6cm×6.3cm(CV=12.6mL)。將管柱用5CV之PBS、0.02%疊氮化鈉，pH 7.2洗滌且然後儲存於冷藏室中直至使用。
FkpA-CPG親和層析
操作1：FkpA-CPG親和凝膠之初始評估
親和管柱效能之初始評估係使用25%之60%硫酸銨集結粒來進行。將集結粒自-60℃儲存溫度解凍且升溫至室溫。將120mL之3.8M硫酸銨、50mM磷酸鈉，pH 7.0添加至集結粒中且輕輕混合集結粒以使其懸浮。將懸浮液分配在四個SS-34離心管之間且在Sorvall RC 6 Plus離心機中在15K rpm下離心30min。棄去上清液且將四個離心管中之三個轉移回-60℃冷凍器中以便日後純化。
將30mL之50mM磷酸鈉(pH 7.0)添加至剩餘離心管中。將管子緊固至實驗室旋轉器上且在室溫下輕輕混合1h以使集結粒中之蛋白質完全溶解。
將樣品在15K rpm下離心15min且然後經0.2μ過濾器過濾。將經過濾之樣品用30mL之PBS、0.02%疊氮化鈉，pH 7.5(用於親和管柱之平衡緩衝液)驅趕，以產生要加載至親和管柱之原料。
將樣品加載至管柱且用20mL之平衡緩衝液驅趕。在洗滌之後，將溶離彙集物收集至含有17mL之1.0M Tris(pH 8.0)的燒杯中，並且在收集彙集物之整個過程中輕輕混合。層析圖顯示於圖24中。
將經pH調節之彙集物使用0.2μ過濾器過濾且用5.0mL之平衡緩衝液驅趕，然後量測彙集物中之蛋白質濃度及回收率。濃度經 UV-VIS分光光度法測定為0.058mg/mL。將經pH調節之彙集物儲存在2-8℃下。
Superdex 200層析
使用Superdex 200管柱(GE)執行SEC以移除聚集物及調配經pH調節之親和彙集物。
將1.6cm×60cm(1CV=120mL)Superdex 200管柱(GE Healthcare)用1CV之0.1M NaOH清潔且然後用3CV之PBS(pH 7.5)(平衡緩衝液)平衡。
操作1：FkpA-CPG之層析操作1
使用兩個Amicon Ultra 10kDa單元將來自FkpA-CPG操作1之83mL經pH調節之彙集物濃縮至體積6.0mL(1CV之5%)。將13mL之經pH調節之彙集物轉移至各單元中。使濃縮器在艾本德離心機中在3K rpm下旋轉30min。移除濾液且補充經pH調節之彙集物。重複該製程直至達成目標UF截留物體積(UF截留物體積=3.8mL)。
將UF截留物加載至管柱且用PBS(pH 7.5)驅趕。層析圖(圖25)顯示與目標單聚物質分離之許多較高MW物質。
藉由HPLC-SEC分析含有較高MW物質之級分(級分41-63)及包含主峰之彼等(級分64-86)。分析結果(圖26A及26B)表明主峰含有約96%單聚物質，藉由使用尺寸排阻層析步驟其極大地提高。
彙集Superdex 200級分且使用Amicon Ultra濃縮單元(Millipore)濃縮。濃度經UV分光光度法測定為3.1mg/mL。
使用皮爾斯套組EZ-Link過氧化物酶(目錄號31489)根據製造商之說明書使1mg之經親和純化之抗FkpA抗體與HRP結合。將HRP結合之經親和純化之抗FkpA抗體在分析稀釋劑中進一步1/20稀釋且指定為AF HRP結合物儲備液I。將經親和純化之抗FkpA抗體製成等分試樣且指定為AF包被來源。將AF包被來源在PBS中稀釋至1mg/mL且指定為AF包被儲備液I。
將AF包被儲備液I在碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中稀釋至4μg/mL且直接塗佈於Costar 96孔板(目錄號9018)上。將FkpA稀釋至 0.78-100ng/mL範圍內之各種濃度且添加至各對應孔中。將AF HRP結合物儲備液I稀釋至1：2000、1：4000、1：6000及1：8000且添加至各對應孔中。如上文所描述執行分析。結果顯示於圖27中。工作範圍經測定為0.78-100ng/mL且最佳AF HRP結合物儲備液I稀釋度為1：6000，因為最大OD為約1.7。
ASP及經親和純化之抗FkpA抗體的比較
執行ELISA夾心分析以比較ASP及經親和純化之抗FkpA抗體分析如實例6中所描述製備之含有5.31mg/mL抗IL13/IL17之抗IL13/IL17雙特異性抗體樣品中之FkpA的量的能力。分析參數顯示於表19中。針對ASP及AF抗FkpA抗體之所得標準曲線顯示於圖28A及28B中。如圖28A、28B及表19及20中所示，經親和純化之抗體具有0.78ng/mL-100ng/mL之動態範圍，具有改良之線性，且需要較少HRP偵測抗體。
剩餘ASP抗體之親和純化
基於上文所描述之並排比較，使用親和層析繼之以尺寸排阻層析來純化剩餘ASP抗體。級分33-46含有約98%單體(圖29)。濃度經UV分光光度法測定為0.386mg/mL。將Superdex 200操作2級分33-46組合且如先前所描述使用單一Amicon Ultra 10kDa單元濃縮。濃度經UV分光光度法測定為1.2mg/mL。且將樣品指定為AF包被儲備液II。
AF抗體之冷凍解凍穩定性
冷凍-解凍穩定性測試後之目的為確保試劑穩定多達三次冷凍-解凍，而不損失活性或改變電泳或SEC型態。使用AF包被儲備液II之100μL等分試樣來進行此實驗。一個等分試樣保持在冷藏室中且剩餘三個放置在-60℃冷凍器中。在一個小時之後，將三個冷凍等分試樣解凍且輕輕混合。一個等分試樣(「一次冷凍-解凍」)放置在冷藏室中且另外兩個放回冷凍器中。對剩餘兩個樣品重複該製程，其中第二冷凍-解凍樣品轉移至冷藏室，且第三冷凍-解凍樣品保持在-60℃冷凍器中隔夜。在次日將第三樣品解凍。
藉由SDS-PAGE分析各個冷凍-解凍樣品之10μg等分試樣。凝膠結果顯示於圖30中。在凝膠之兩側冷凍-解凍樣品在冷凍-解凍之間似乎類似。還原側顯示各個樣品中之一些極高MW條帶。此等條帶可能為與還原步驟相關之凝膠假像。
藉由HPLC-SEC分析四個冷凍-解凍樣品。各個樣品使用50μg等分試樣。分析結果在圖31A及31B及表21中。型態相當類似，但顯示隨冷凍-解凍增加較高MW物質略微傾向於增加。此等樣品之功能測試顯示較高MW物質增加對試劑之使用幾乎無影響(圖32)。基於SDS-PAGE及HPLC-SEC分析，在多達3次冷凍-解凍中蛋白質純度及/或組成不存在顯著差異。
將AF包被儲備液II製成等分試樣且歷經多個冷凍/解凍事件來評估AF抗FkpA抗體之穩定性。
AF包被儲備液I及II之夾心ELISA比較
將AF包被儲備液I及II在碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中稀釋至3μg/mL且直接塗佈於Costar 96孔板(目錄號9018)上且在2-8℃下孵育隔夜。將板用ELISA洗滌緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)/0.05%聚山梨酸酯20)洗滌，在室溫下在攪拌下用分析稀釋劑(0.15M氯化鈉[NaCl]/0.1M磷酸鈉[NaPO4]/0.1%魚膠/0.05%聚山梨酸酯20/0.05% Proclin 300)阻斷1-2小時且然後再次用ELISA洗滌緩衝液洗滌。添加標準曲線(100-1.56ng/mL)及空白至板中且在室溫下在攪拌下孵育兩小時。將板用ELISA洗滌緩衝液洗滌且按用分析稀釋劑1：6000稀釋將AF HRP結合物儲備液I添加至板中且在室溫下在攪拌下孵育兩小時。將板用ELISA洗滌緩衝液洗滌且將SureBlue ReserveTM TMB微孔過氧化物酶受質(Kirkegaard & Perry Labs[KPL]，目錄號53-00-00)添加至板中且允許在室溫下顯色約20分鐘。用0.6N硫酸使反應停止。在450nm之波長下讀取OD且使用Softmax Pro數據簡化軟體來分析數據。由AF包被儲備液I及II產生之標準曲線幾乎為可重疊的。塗佈濃度、測抗體稀釋度及孵育時間經篩選及最佳化。3ug/mL之塗佈濃度及1/6000之AF HRP結合物稀釋度經測定為準確且穩健的。包被孵育時間為穩健長達3天。
來自後續血液之抗體的純化及分析
基於是否發生紅血細胞之溶血彙集兔A、B及C之後續血液，且分開純化溶解及未溶解物質。藉由60% ASP純化兩種彙集物，隨後進行如先前所描述之親和層析及SEC。基於SEC-HPLC數據，在溶解彙集物(指定為批次B)與未溶解彙集物(指定為批次C)之間不存在顯著差異。級分35-38最緊密類似於AF包被儲備液II(指定為批次A)物質，因此將批號B級分35-38彙集在一起(表22)。
批次A、B及C係在夾心ELISA中作為包被抗體進行比較。將包被抗體稀釋至3μg/mL。AF HRP結合物儲備液I係在1：6000之稀釋度下用作偵測抗體。三種抗體之結果為類似的(圖33)。批次B之濃度經UV分光光度法測定為2.13mg/mL。
使用皮爾斯套組EZ-Link過氧化物酶(目錄號31489)根據製造商之說明書使1mg之批次B抗體與HRP結合。將批次B HRP結合之抗體進一步1/10稀釋且指定為批次B HRP結合物儲備液I。將批次B製成亞等分試樣且指定為批次B包被儲備液I。
分析物穩健性
執行實驗設計以篩選分析條件且證實穩健性。改變分析參數，諸如塗佈濃度、結合型稀釋度及TMB受質孵育時間。此等參數之微小 變化不影響分析結果。最優條件顯示於表23中。
實例4. 超純FkpA之穩定性
儲存在-70℃下之超純FkpA之穩定性
為測試作為分析對照之超純FkpA之穩定性，將實例2中所描述之標準儲備液I在分析稀釋劑中稀釋至3(低)、15(中)、75(高)ng/mL，製成等分試樣且儲存在-70℃下。在冷凍之前使用標準曲線藉由ELISA量測一個低、中及高等分試樣之濃度。藉由解凍等分試樣且測定FkpA之濃度監測低、中及高超純FkpA對照之穩定性總共18天。低對照當儲存在-70℃下時為不穩定的。中對照顯示類似不穩定性，然而，高對照當儲存在-70℃下時似乎為穩定的。
與-70℃相比儲存在2-8℃下之超純FkpA的穩定性
對一半儲存在-70℃下而另一半儲存在2-8℃下總共8天之一組新的低及中對照執行第二測試。在冷凍之前不量測濃度。如先前的實驗中，冷凍對照之濃度在第1天由所計算之目標濃度開始降低30%。儲存在2-8℃下之對照的濃度以比儲存在-70℃下之對照慢的速率降低，但該降低仍被認為在可接受範圍之外(圖34)。
在變化量之聚山梨醇酯中製備之超純FkpA的穩定性
將標準儲備液I在變化量之聚山梨醇酯中在用於分析對照中的分析稀釋劑中稀釋至3(低)、15(中)或75(高)ng/mL。分析稀釋劑含有0.05%聚山梨醇酯，因此測試0.1、0.25、0.5及1%之聚山梨醇酯濃度來看其是否改良在-70℃下冷凍之對照的穩定性。在冷凍之前(T=0)測試FkpA之各種溶液且如上文所描述監測總共15天。對於稀釋至3ng/mL之所有樣品，僅含有0.5%聚山梨醇酯之樣品當與T=0相比時似乎在全部15天內具有低於20%之濃度降低。在其他3ng/mL條件下觀測到更大可變性(表24)。 對於15ng/mL溶液，沒有條件具有低於目標濃度大於30%的濃度。含有0.5%或0.25%聚山梨醇酯之濃度在全部15天內保持在目標之20%以內(表24)。0.5%聚山梨醇酯產生所測試之所有對照的最佳回收率。相對於目標濃度與第0天兩者之差異百分比(差異%)在1-13%之間且%CV為1-10%。在0.10%聚山梨醇酯中稀釋之對照具有低於20%之差異%，但具有20%之%CV的低對照存在更大可變性。總地來說，增加量之聚山梨醇酯不被認為足以防止超純FkpA不穩定性。
在魚膠、ApoMab及緩衝液C中製備之超純FkpA的穩定性
測定當在0.2%魚膠，1mg/mL ApoMab(Ashkenazi,A,2008,Nature Reviews Drug Discovery,7：1001-1012)或緩衝液C(20mM組胺酸乙酸酯、240mM蔗糖、0.02%聚山梨酸酯20，pH 5.5)中稀釋至3(低)、15(中)或75(高)ng/mL時在-70℃下之超純FkpA的穩定性。(圖35A及35B)。結 果顯示FkpA在若干不同組合物中之穩定性及當儲存在緩衝液C中時在所有情況下在-70℃下對照保持穩定。作為實例，藉由重複此分析16次來證實在緩衝液C中對照回收之穩健性(表25)。可變性在可接受範圍內。
實例5. 超純FkpA與商業FkpA試劑之比較
測定了實例3中所描述之夾心ELISA分析用於偵測不同FkpA標準物之能力。各種標準物包括標準儲備液I(實例2中所描述)、BioSource FkpA標準物目錄號MBS1037402及BioSource FkpA標準物目錄號MBS1182120。所用之標準物為1.56至100ng/mL。BioSource FkpA標準物目錄號MBS1037402及MBS1182120產生具有比標準儲備液I低之信號的標準曲線(圖36)。
實例6. 抗IL13/抗IL17 IgG4雙特異性抗體之產生
用於使用大腸桿菌中之兩條不同的輕鏈來產生人類IgG1雙特異性抗體的技術(Yu等人，2011,Sci Transl Med 3,84ra44)。該方法使用杵入臼技術(Ridgway等人，1996,Protein Eng.9,617-621；Atwell等人，1997,J Mol Biol 270,26-35)來促進免疫球蛋白重鏈之異二聚化。為使得能夠使用兩條不同的輕鏈而不存在輕鏈錯配，將各臂作為半聚體或半抗體在單獨的大腸桿菌細胞中培養。使用此途徑藉由將抗IL17及抗IL13親本抗體亞選殖至載體中從而允許作為人類IgG4臼之抗IL17臂及作為人類IgG4杵之抗IL13臂表現來產生抗IL13/抗IL17雙特異性抗體。IgG4杵重鏈恆定區之序列顯示於SEQ ID NO：15或16中且IgG4臼重鏈恆定區之序列顯示於SEQ ID NO：26或27中。
對於初始抗體表現，使用大腸桿菌菌株64B4，其僅表現內源性FkpA。在初始評估期間，吾人發現在高於7之pH值下抗IL-17半抗體形成沈澱。捕獲半抗體且然後在低pH值下自蛋白質A管柱溶離且將洗 出液調節至pH 8.5以在氧化還原反應中執行雙特異性抗體之組裝。在pH調節之後，約20%之抗IL-17半抗體洗出液因沈澱而損失。用於與抗IL-13半抗體配對之可用抗IL-17半抗體之減少導致兩個半抗體之比率之間的不平衡且降低抗IL-13/IL-17雙特異性抗體之產率。隨後，在過表現外源性FkpA、DsbA及DsbC之不同大腸桿菌菌株中產生半抗體。將大腸桿菌菌株67A6(基因型：W3110△fhuA△phoA ilvG2096(IlvG+；Valr)△prc spr43H1△manA lacIQ△ompT△menE742 degPS210A)用編碼抗IL13或抗IL17半Ab及伴侶FkpA、DsbA及DsbC之LC及HC的TIR(轉譯起始區域)2,2單一質粒轉型。在兩個質粒上，FkpA之表現受phoA啟動子之控制而DsbA及DsbC之表現以多順反子方式受tacII啟動子之控制。LC與HC均受獨立phoA啟動子之控制。使用質粒來轉型67A6。經表現之FkpA含有其天然信號肽。
使半抗體抗IL13.杵及抗IL17.臼各自在上文所描述之67A6大腸桿菌細胞之培養物中生長。將抗IL13.杵之大規模培養物維持在pH 6.7±0.2下且將抗IL17.臼之大規模培養物維持在pH 7.0±0.2下。使培養物在34℃下在220rpm下生長直至培養物之OD達到150。然後將培養轉變成25℃ 160rpm。總發酵為72小時。
將各半抗體之全部培養液經由微流體分開地均質化。然後將各勻漿彙集物用水稀釋並用PEI調節且在室溫下孵育。隨後將此經調節勻漿彙集物離心以分離固體，隨後經一系列過濾器過濾含有半抗體之離心分離液。
各半抗體之效價比由大腸桿菌菌株64B4在不存在FkpA、DsbA及DsbC之外源性表現的情況下產生之效價高約10至20倍(數據未顯示)。因此，FkpA、DsbA及DsbC之外源性表現為製備抗IL13/IL17抗體所接受的。
然後使用MabSelect SuReTM樹脂(GE Healthcare Life Sciences)在親和層析管柱上分開地捕獲各半抗體。在管柱平衡之後，將離心分離液加載至管柱上且用平衡緩衝液及第二洗滌緩衝液洗滌。使半抗體在酸性條件(pH 2.8)下自管柱溶離。
抗IL13/抗IL17抗體之組裝
將經親和純化之抗IL13及抗IL17半抗體以1：1質量比組合，隨後滴定至pH 8.5。將相對於由組裝過程預測之雙特異性抗體之理論最大量100倍過量莫耳比之還原型L-麩胱甘肽(GSH)添加至混合物中且將溫度由室溫調節至35℃。在活體外以氧化還原反應組裝兩個半抗體以形成抗IL13/抗IL17雙特異性抗體。氧化還原反應在35℃下持續12-24h。藉由將pH調節至6.5來中止組裝反應且將彙集物用水稀釋，然後進行以下描述之純化製程。
在初始MabSelect SuReTM純化及組裝之後，執行若干依序進行之雙特異性抗體純化步驟。首先，使用CAPTOTM ADHERE樹脂(GE Healthcare Life Sciences)以結合及溶離模式操作之混合模式陰離子交換層析步驟純化經組裝之抗體。在管柱平衡(50mM乙酸鹽，pH 6.5)之後，將經調節之組裝彙集物加載至管柱上，用平衡緩衝液洗滌，且然後用第二洗滌緩衝液(200mM乙酸鹽，pH 6.5)洗滌。藉由降低緩衝液(25mM乙酸鹽，pH 5.2)之pH值來使雙特異性抗體溶離。
在CAPTOTM ADHERE層析之後，如藉由SEC-HPLC所量測，雙特異性抗體產物之濃度自約80-85%增加至92%，且高分子量物質濃度自約12-15%降低至約4%。此外，製劑中之ECP降低約2個對數級數，DsbA降低約1個對數級數且FkpA降低0.75個對數級數。
歷經使用Q SEPHAROSE® Fast Flow樹脂(GE Healthcare Life Sciences)以結合及溶離模式操作之陰離子交換層析步驟進一步純化彙集物。將調節至pH 8.5之CaptoTM adhere洗出液彙集物加載至經平衡之Q Sepharose® Fast Flow管柱上且用平衡緩衝液(50mM Tris，pH 8.5)洗滌。藉由增加緩衝液(50mM Tris、100mM乙酸鈉，pH 8.5)之電導率來使雙特異性抗體自管柱溶離。
在QSFF層析之後，如藉由SEC-HPLC所量測，雙特異性抗體產物之濃度自約92%增加至94%，且高分子量物質濃度自4%降低至約2.5%，且未能偵測到極高分子量物質之量。此外，製劑中之DsbC降低約4倍且FkpA降低4-5倍。
將QSFF洗出液彙集物調節至pH 5.5且在使用PHENYL SEPHAROSE® 6 Fast Flow(高取代)樹脂(GE Healthcare Life Sciences)且以流穿模式操作之疏水相互作用層析管柱上進一步純化。將管柱平衡(170mM乙酸鹽，pH 5.5)且將經調節之QSFF彙集物加載至管柱上。抗IL13/抗IL17雙特異性抗體流穿且隨後將管柱用平衡緩衝液洗滌。開始產物彙集物收集且基於隨著彙集進行在0.5至1 OD之間的OD280或最大10CV之管柱洗滌體積而終止。然後將彙集物濃縮且使用超濾/透濾(UF/DF)進行緩衝液交換。
執行第二操作，並且得到類似結果。
實例7. 抗IL13/抗IL17抗體之製劑中之雜質的偵測
分析兩批抗IL13/抗IL17雙特異性抗體中包括以下之雜質的存在：未配對半抗體、均二聚體、低分子量物質(LMWS)、高分子量物質(HMWS)、極高分子量物質(vHMWS)、酸性變異體、鹼性變異體、FkpA、DsbA、DsbC、ECP、浸出蛋白質A、大腸桿菌DNA及內毒素。產物品質呈現於表26中。
經純化之抗IL13/抗IL17雙特異性抗體中之FkpA的偵測
藉由ELISA使用針對超純FkpA之抗體以及用於標準物及對照之超純FkpA測定FkpA之濃度。在抗IL13/抗IL17雙特異性抗體之各製備階段之後亦藉由LC-MS/MS(液相層析-串聯質譜法)來分析樣品中FkpA之存在。
以下描述藉由ELISA及LC-MS/MS偵測FkpA。結果顯示於表27中。
藉由ELISA偵測FkpA
將針對超純FkpA之多株血清在碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中稀釋至3μg/mL且直接塗佈於Costar 96孔板(目錄號9018)上且在2-8℃下孵育隔夜。將板用ELISA洗滌緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)/0.05%聚山梨酸酯20)洗滌，在室溫下在攪拌下用分析稀釋劑(0.15M氯化鈉/0.1M磷酸鈉/0.1%魚膠/0.05%聚山梨酸酯20/0.05% Proclin 300)阻斷1-2小時且然後再次用ELISA洗滌緩衝液洗滌。添加標準曲線之超純FkpA(100-1.56ng/mL)及空 白至板中且在室溫下在攪拌下孵育兩小時。將板用ELISA洗滌緩衝液洗滌且按用分析稀釋劑1：6000稀釋將經親和純化之抗FkpA HRP結合物儲備液添加至板中且在室溫下在攪拌下孵育兩小時。將板用ELISA洗滌緩衝液洗滌且將SureBlue ReserveTM TMB微孔過氧化物酶受質(Kirkegaard & Perry Labs，目錄號53-00-00)添加至板中且允許在室溫下顯色約20分鐘。用0.6N硫酸使反應停止。在450nm之波長下讀取OD且使用Softmax Pro數據簡化軟體來分析數據。
藉由LC-MS/MS偵測FkpA
1、5、10、25及50ppm FkpA於0.5mg Apomab中之FkpA標準物。將0.5mg之各抗體樣品及標準物用純化水稀釋至5mg/mL之最終濃度。將400μL變性緩衝液(7.2M鹽酸胍、0.3M乙酸鈉，pH 5.0)及10μL 0.5M拆鍵劑叁(2-羧乙基)膦(TCEP)(中性pH，Pierce)添加至100μL之經稀釋樣品中，且將樣品在37℃下孵育15分鐘。
將NAP-5脫鹽管柱用約10mL之脫鹽緩衝液(1mM乙酸鈉、0.5mM TCEP，pH 5.0)平衡。加載樣品且用800μL之脫鹽緩衝液溶離。添加100μL之0.5M MOPS(3-(N-嗎啉基)丙磺酸、4-嗎啉丙烷-磺酸)至各樣品中。
添加20μL之0.5mg/mL胰蛋白酶至各樣品中且將樣品在37℃下孵育60min。藉由添加30μL之10%三氟乙酸(TFA)將胰蛋白酶滅活。
注射100μL之各經消化樣品來藉由多反應監測(MRM)進行LC-MS/MS分析。在具有2.1mm×150mm，1.7μm Waters CSH C18 UPLC管柱之Waters Acquity H-Class Bio UPLC上執行LC。管柱溫度為60℃，流速0.3mL/min，且使用緩衝液A(含0.1%甲酸之水)及緩衝液B(含0.1%甲酸之乙腈)作為0-40% B之梯度持續45min。
使用Sciex 6500Qtrap質譜儀執行MS/MS。MRM監測FkpA肽SAYALGASLGR(SEQ ID NO：45)肽之+2前驅離子向y6碎片離子之轉變。碰撞能量為28.1V，去簇電位=70V，且停留時間為100ms。Q1質量=533.3，針對前驅體，Q3質量=560.3，針對y6碎片離子。使用FkpA標準曲線來測定抗IL13/抗IL17樣品中之FkpA濃度。
實例8. 抗IL13/抗IL17雙特異性抗體之5-管柱純化
為進一步降低抗IL13/抗IL17抗體中之FkpA的濃度，向上文所描述之4-管柱程序中添加另一純化步驟。評估POROS® 50HS陽離子交換層析。將調節至pH 5.0之苯基SEPHAROSE® 6Fast Flow(高取代)洗出液彙集物的樣品施加至POROS® HS 50(Applied BiosystemsTM)陽離子交換管柱且以結合及溶離模式進行純化。使用線性鹽梯度(在22CV內0至500mM乙酸鹽，pH 5.8)溶離雙特異性抗體。然後分析樣品中雜質之移除情況。結果呈現於表28中。
n.t.：未測出
BsAb=雙特異性抗體
基於此等結果，將POROS® HS 50管柱併入抗IL13/抗IL17之純化流程中。藉由蛋白質A親和層析在MabSelect SuReTM管柱上純化半抗體且如實例6中所描述進行組裝。藉由如實例6中所描述之CAPTOTM ADHERE、Q SEPHAROSE® Fast Flow及苯基SEPHAROSE® 6 Fast Flow(高 取代)層析步驟進一步純化經組裝之抗IL13/抗IL17抗體。
在UF/DF步驟之前，將來自苯基SEPHAROSE® 6 Fast Flow管柱之抗IL13/抗IL17雙特異性抗體彙集物在以結合及溶離模式操作之POROS® HS 50管柱上純化。將管柱平衡(50mM乙酸鹽，pH 5.5)且將經稀釋之PHENYL SEPHAROSE® 6 Fast Flow(高取代)流穿彙集物加載至管柱上。將管柱依次用平衡緩衝液及第二洗滌緩衝液(50mM乙酸鹽，pH 5.8)洗滌。使用在22CV內10-100%B(A：水，B：500mM乙酸鹽，pH 5.8)之線性鹽梯度使雙特異性抗體自管柱溶離。開始洗出液收集且基於隨著彙集進行在0.5至1之間的OD280而終止。
隨後，使用超濾/透濾(UF/DF)執行POROS® HS 50彙集物之濃縮及緩衝液交換。
在存在αIL13及αIL17之四次不同發酵的情況下重複該製程。
分析最終產物之樣品以及不同純化製程步驟之後的樣品的產物特異性雜質。樣品中高分子量物質(HMWS)之分析的結果呈現於表29中。簡單來說，經組裝雙特異性抗體起始物質含有約91-94%產物及約6.0-7.5% HMWS。在CaptoTM adhere混合模式層析之後，樣品含有約95-98%產物及約2.2% HMWS，表明樣品中HMWS雜質之量減少。在陰離子交換、HIC及陽離子交換之後，樣品含有98-99.6%產物及0.2-1.5% HMWS。
藉由使用呈現於實例4中之ELISA使用針對超純FkpA之抗體來分析5-管柱製程彙集物之樣品中FkpA之存在。如表30及31中所示，5-管柱製程在自雙特異性抗體調配物中移除FkpA的方面為有效的。
因此，在由過表現外源性FkpA之大腸桿菌細胞產生的半抗體組裝的示例性雙特異性抗體(亦即抗IL13/抗IL17雙特異性抗體)之樣品中，如藉由ELISA分析所分析，本文所描述之純化製程實質上移除FkpA或使其含量降低至不超過6ppm。作為比較，在由僅表現內源性FkpA之大腸桿菌細胞(諸如不具有表現外源性FkpA或其他伴侶蛋白之質粒的菌株64B4)產生且藉由ProPacTM HIC-10管柱純化(數據未顯示)的抗IL13/抗IL17雙特異性抗體之樣品中，如藉由相同ELISA分析所測定，FkpA之含量保持在7ppm。
實例9. 用於純化在外源地表現FkpA之大腸桿菌中產生之多肽的混合模式陰離子交換層析的評估
高通量篩檢指示與傳統陰離子交換層析(例如QSFF層析)相比在混合模式陰離子交換層析上產物相關雜質之拆分率提高(圖37)。藉由QSFF層析極少或沒有分離到抗IL17單體，但在混合模式層析情況下觀測到改良之抗IL13單體及抗IL17二聚體物質分離。
評估了混合模式層析在雙特異性抗體之純化中的用途。在評估之一個實驗組中，在細菌培養物中分開製備結合IL13或IL17之半抗體。然後使用蛋白質A層析(MabSelect SuReTM層析)對結合IL13或IL17之半抗體進行親和層析。然後如上文所描述組裝部分純化之抗體以形成結合IL13及IL17之雙特異性抗體。對經組裝之雙特異性抗體依次進行QSFF陰離子交換層析及CaptoTM Adhere混合模式陰離子交換層析(順序1)或依次進行CaptoTM Adhere混合模式陰離子交換層析及QSFF陰離子交換層析(順序2)。結果呈現於表32中。
在陰離子交換層析之前對經組裝之雙特異性抗體進行混合模式陰離子層析通常使得產物變異體移除率提高。
製程相關雜質之清除率呈現於表33中。
如藉由在使用順序2純化之物質中較低量之雜質所示，當混合模式在陰離子交換層析之前時觀測到改良之雜質清除率。
結合及溶離QSFF陰離子交換條件如下：將管柱用50mM Tris(pH 8.5)平衡。將調節至pH 8.5及1.8mS/cm之組裝彙集物(順序1)或CaptoTM Adhere溶離彙集物(順序2)加載至管柱上，達到每公升填充樹脂20g蛋白質之加載密度，用平衡緩衝液洗滌，且然後用第二洗滌緩衝液(50mM Tris加5mM乙酸鈉，pH 8.5)洗滌。藉由增加緩衝液(50mM Tris加139mM乙酸鈉，pH 8.5)之電導率來使雙特異性抗體溶離。開始彙集且基於在280nm下之吸光度而終止。
結合及溶離CaptoTM Adhere混合模式陰離子交換條件如 下：將管柱用50mM乙酸鹽(pH 6.5)平衡。將調節至pH 6.5及7.0mS/cm之QSFF溶離彙集物(順序1)或組裝彙集物(順序2)加載至管柱上，達到每公升填充樹脂24g蛋白質之加載密度，用平衡緩衝液洗滌，且然後用第二洗滌緩衝液(200mM乙酸鹽，pH 6.5)洗滌。藉由降低緩衝液(25mM乙酸鹽，pH 5.2)之pH值來使雙特異性抗體溶離。開始彙集且基於在280nm下之吸光度而終止。
實例10. 篩選用於減少FkpA之HIC樹脂
針對多肽產物(諸如雙特異性抗體產物)中之FkpA的減少對許多HIC樹脂進行篩選。樹脂包括BakerbondTM WP Hi-丙基、CaptoTM辛基、CaptoTM丁基、Toyopearl®己基-650C、Toyopearl® PPG-600M、Toyopearl®苯基-650M、Toyopearl®丁基-650M及Toyopearl®醚-650M。己基650C在流穿模式中產生最低FkpA含量，隨後為Capto®丁基(圖38及39)。執行機器人高通量篩選以評估在變化之鹽類型及濃度及pH值條件下產物及FkpA與此等樹脂之批量結合。檢驗三種不同親液鹽(kosmotropic salt)以確定鹽類型對選擇性之影響。測試之鹽及濃度範圍如下：100-800mM乙酸鈉，100-400mM硫酸鈉，500-2000mM氯化鈉。此外，評估5.0-7.0之pH值範圍。將96孔膜底板用各孔中約50mL之樹脂進行填充且對於各實驗在適當結合條件(鹽類型、鹽濃度、pH值)下平衡。將調節至對應結合條件之含有FkpA之部分純化產物彙集物(亦即起始加載物質/原料)施加於各孔中，達到每微升樹脂50μg產物之加載密度的目標。在混合及孵育以達成平衡之後，收集上清液且分析相對產物及FkpA含量，以評估所獲得之產物相對於起始加載物質/原料的富集情況。己基650C在流穿模式中產生最低FkpA含量，隨後為CaptoTM丁基。
實例11. 方法型式
評估了許多方法型式。在方法之第一實例中，在大腸桿菌中產生半抗體。參見圖40A。將各半抗體之大腸桿菌全細胞培養液經由微流體均質化。將各勻漿彙集物用水稀釋並用PEI調節且在室溫下孵育。隨後將經調節勻漿彙集物離心以分離固體，隨後經一系列過濾器過濾含有半抗體之離心分離液。然後，使用蛋白質A層析管柱(MabSelect SuReTM)對半抗 體進行親和純化。然後，如上文所描述藉由將經親和純化之半抗體組合來組裝雙特異性抗體。對於此第一方法(方法1)，以結合及溶離模式對經組裝之雙特異性抗體進行混合模式陰離子交換層析(CaptoTM Adhere)，然後以結合及溶離模式進行陰離子交換層析(Q Sepharose® Fast Flow)。然後以流穿模式對回收級分進行HIC(苯基Sepharose® 6 Fast Flow，高取代)。最後，對雙特異性抗體進行超濾及透濾以調配雙特異性抗體。在方法之另一實例方法2(圖40B)中，如上文所描述製備經組裝之雙特異性抗體，進行混合模式陰離子交換層析(CaptoTM Adhere)，然後以結合及溶離模式進行陰離子交換層析(Q Sepharose®Fast Flow)。然後以流穿模式對回收級分進行HIC(苯基Sepharose® 6 Fast Flow，高取代)且以結合及溶離模式進行陽離子交換層析(POROS® 50 HS)。最後，對雙特異性抗體進行超濾及透濾以調配雙特異性抗體。
在第三方法(方法3，圖40C)中，如上文所描述組裝雙特異性抗體且然後進行混合模式陰離子交換層析(CaptoTM Adhere)，然後以結合及溶離模式進行陰離子交換層析(Q Sepharose® Fast Flow)，且以流穿模式進行HIC(己基650C)。最後，對雙特異性抗體進行超濾及透濾以調配雙特異性抗體。
在第四方法(方法4，圖40D)中，如上文所描述組裝雙特異性抗體且然後以結合及溶離模式進行混合模式陰離子交換層析(CaptoTM Adhere)，然後以結合及溶離模式進行陰離子交換層析(Q Sepharose® Fast Flow)，且以結合及溶離模式進行陶瓷羥磷灰石層析(CHT I型，80μm)。
最後，對於方法1-3，對雙特異性抗體進行超濾及透濾以調配雙特異性抗體。
然後使用MabSelect SuReTM樹脂(GE Healthcare Life Sciences)在親和層析管柱上分開地捕獲各半抗體。在管柱平衡之後，將離心分離液加載至管柱上且用平衡緩衝液及第二洗滌緩衝液洗滌。使半抗體在酸性條件(pH 2.8)下自管柱溶離。
CaptoTM Adhere製程：
結合及溶離CaptoTM Adhere混合模式陰離子交換條件如 下：將管柱用50mM乙酸鹽(pH 6.5)平衡。將調節至pH 6.5及6.5mS/cm之組裝彙集物加載至管柱上，達到每公升填充樹脂20g蛋白質之加載密度，用平衡緩衝液洗滌，且然後用第二洗滌緩衝液(200mM乙酸鹽，pH 6.5)洗滌。藉由降低緩衝液(25mM乙酸鹽，pH 5.2)之pH值來使雙特異性抗體溶離。開始彙集且基於在280nm下之吸光度而終止。
Q Sepharose® FF製程：
結合及溶離QSFF陰離子交換條件如下：將管柱用50mM Tris(pH 8.5)平衡。調節至pH 8.5之CaptoTM Adhere溶離彙集物加載至管柱上，達到每公升填充樹脂50g蛋白質之加載密度且用平衡緩衝液洗滌。藉由增加緩衝液(50mM Tris加100mM乙酸鈉，pH 8.5)之電導率來使雙特異性抗體溶離。開始彙集且基於在280nm下之吸光度而終止。
苯基Sepharose®製程：
流穿型苯基Sepharose® 6 Fast Flow(高取代)HIC條件如下：將管柱用170mM乙酸鹽(pH 5.5)平衡。將在pH 5.5下之經調節QSFF溶離彙集物加載至管柱上。抗IL13/抗IL17雙特異性抗體流穿且隨後將管柱用平衡緩衝液洗滌。開始產物彙集物收集且基於在280nm下之吸光度而終止。
POROS® HS 50製程：
結合及溶離POROS® HS 50陽離子交換條件如下：將管柱用50mM乙酸鹽(pH 5.5)平衡。調節至5.0mS/cm之苯基Sepharose®流穿彙集物加載至管柱上，達到每公升填充樹脂20g蛋白質之加載密度，用平衡緩衝液洗滌，且然後用第二洗滌緩衝液(50mM乙酸鹽，pH 5.8)洗滌。藉由以在22個管柱體積(CV)內10-100%B(A：WFI，B：500mM乙酸鹽，pH 5.8)之線性梯度增加電導率來使雙特異性抗體溶離。開始彙集且基於在280nm下之吸光度而終止。
己基-650C製程：
流穿己基-650C HIC條件如下：將管柱用在pH 7.0下之50mM MOPS加125mM乙酸鈉平衡。將在pH 7.0下之經調節QSFF溶離彙集物加載至管柱上。抗IL13/抗IL17雙特異性抗體流穿且隨後將管柱用平 衡緩衝液洗滌。開始產物彙集物收集且基於在280nm下之吸光度而終止。
CHT I型製程：
結合及溶離CHT I型陶瓷羥磷灰石層析條件如下：將管柱用10mM磷酸鈉(pH 6.8)平衡。將經調節以含有10mM磷酸鈉(pH 6.8)之QSFF溶離彙集物加載至管柱上，達到每公升填充樹脂25g蛋白質之加載密度且用平衡緩衝液洗滌。藉由以在20個管柱體積(CV)內0-100%B(A：平衡緩衝液，B：在pH 6.8下之含有1M氯化鈉之10mM磷酸鈉)線性梯度增加電導率來使雙特異性抗體溶離。開始彙集且基於在280nm下之吸光度而終止。
此等示例性方法(方法1-4)各自之最終管柱彙集物的總產率及產物品質數據顯示於下表34中：
*：分析了N=1個操作
n.a.：數據不適用
實例12. αA/αB之純化
組裝並純化結合兩種抗原A及B之雙特異性抗體。如上文關於抗IL13/抗IL17雙特異性抗體所描述(參見實例6)在過表現FkpA、DsbA及DsbC之大腸桿菌中製備抗A及抗B半抗體。抗A半抗體在Fc區中包括「杵」胺基酸取代，而抗B半抗體包括「臼」胺基酸取代。
將各半抗體之全部培養液經由微流體分開地均質化。然後將各勻漿彙集物用水稀釋並用PEI調節且在室溫下孵育。隨後將此經調節勻漿彙集物離心以分離固體，隨後經一系列過濾器過濾含有半抗體之離心分離液。
然後使用MabSelect SuReTM樹脂(GE Healthcare Life Sciences)在親和層析管柱上分開地捕獲各半抗體。在管柱平衡之後，將離心分離液加載至管柱上且用平衡緩衝液及第二洗滌緩衝液洗滌。使半抗體在酸性條件(pH 2.8<3)下自管柱溶離。
藉由將相等質量之各半抗體組合來組裝雙特異性抗體。將樣品滴定至pH 8.4。將相對於由組裝過程預測之雙特異性抗體之理論最大量100倍過量莫耳比之還原型L-麩胱甘肽(GSH)添加至混合物中且將溫度由室溫調節至35℃。在活體外以氧化還原反應形式組裝兩個半抗體，以形成雙特異性抗體。氧化還原反應在35℃下持續20h。藉由將pH調節至6.5來中止組裝反應且將彙集物用水稀釋，然後進行以下描述之純化製程。
然後對經組裝之雙特異性抗體進行CaptoTM Adhere混合模 式陰離子交換層析。結合及溶離CaptoTM Adhere混合模式陰離子交換條件如下：將管柱用含有50mM乙酸鈉之2mM MES(pH 6.5)平衡。將調節至pH 6.5及6.5mS/cm之組裝彙集物加載至管柱上，達到每公升填充樹脂20g蛋白質之加載密度，用平衡緩衝液洗滌，且然後用第二洗滌緩衝液(含有150mM乙酸鹽之6mM MES，pH 6.5)洗滌。藉由降低緩衝液(25mM乙酸鹽，pH 5.0)之pH值來使雙特異性抗體溶離。開始彙集且基於在280nm下之吸光度而終止。
將彙集之CaptoTM Adhere洗出液調節至pH 8.5且以結合及溶離模式在QSFF陰離子交換層析管柱上純化。結合及溶離QSFF陰離子交換條件如下：將管柱用50mM Tris(pH 8.5)平衡。將經調節之CaptoTM Adhere溶離彙集物加載至管柱上，達到每公升填充樹脂41g蛋白質之加載密度且用平衡緩衝液洗滌。藉由增加緩衝液(50mM Tris加100mM乙酸鈉，pH 8.5)之電導率來使雙特異性抗體溶離。開始彙集且基於在280nm下之吸光度而終止。
然後以流穿模式對調節至pH 5.5之QSFF洗出液進行苯基Sepharose® HS層析。流穿型苯基Sepharose® 6 Fast Flow(高取代)HIC條件如下：將管柱用170mM乙酸鹽(pH 5.5)平衡。將經調節之QSFF溶離彙集物加載至管柱上。雙特異性抗體流穿且隨後將管柱用平衡緩衝液洗滌。開始產物彙集物收集且基於在280nm下之吸光度而終止。然後將苯基Sepharose®彙集物濃縮且使用超濾/透濾(UF/DF)進行緩衝液交換。分析抗A/抗B雙特異性抗體中包括以下之雜質的存在：未配對半抗體、均二聚體、低分子量物質(LMWS)、高分子量物質(HMWS)、極高分子量物質(vHMWS)、酸性變異體、鹼性變異體、FkpA、DsbA、DsbC、ECP、浸出蛋白質A、大腸桿菌DNA及內毒素。產物品質及方法效能(如藉由產率%所示)詳述於表35中。
序列
除非另外指明，否則胺基酸序列係自N端至C端呈現且核酸序列係自5’至3’呈現。
大腸桿菌FkpA
胺基酸序列-無前導序列
(SEQ ID NO：1)
胺基酸序列-完全序列
(SEQ ID NO：2)
核酸序列
(SEQ ID NO：3)
<110> 美商建南德克公司
<120> FkpA之純化及其用於製備重組多肽之用途
<130> P32953-WO
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Claims (396)

  1. 一種用於自包含FkpA多肽之細胞溶解產物中純化該FkpA多肽的方法，該方法包括a)藉由離心使該細胞溶解產物澄清，b)將包含該FkpA多肽之經澄清之細胞溶解產物施加至陽離子交換層析材料，c)使該FkpA多肽自該陽離子交換層析材料溶離以產生包含該FkpA多肽之陽離子交換洗出液，d)將包含該FkpA多肽之該陽離子交換洗出液施加至疏水相互作用層析(HIC)材料，e)使該FkpA多肽自該HIC材料溶離以產生HIC洗出液，f)將包含該FkpA多肽之該HIC洗出液應用於尺寸排阻層析，g)使該FkpA多肽自該尺寸排阻層析溶離。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中包含該FkpA多肽之該溶解產物在約pH 6.0下。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該陽離子交換層析材料為強陽離子交換劑。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該強陽離子交換劑包含磺丙基。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該磺丙基鍵聯至交聯型瓊脂糖。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中該陽離子交換材料係在溶離之前在25mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)中洗滌。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該FkpA係使用鹽梯度自該陽離子層析材料溶離。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該鹽梯度為線性梯度。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該鹽梯度為在9個管柱體積內自約25mM MES、300mM NaCl至25mM MES 300mm NaCl之0-30%梯度。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之方法，其中該陽離子交換洗出液係收集於級分中。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該等級分係在疏水相互作用層析 之前藉由尺寸排阻層析進行分析。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中包含至少約25% FkpA之級分經選擇用於進一步純化。
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之方法，其中該HIC材料包含丁基部分。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該丁基部分鍵聯至交聯型瓊脂糖。
  15. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之方法，其中該陽離子交換洗出液在HIC之前經調節以含有約0.6M硫酸鈉及約50mM PO4，約pH 7。
  16. 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之方法，其中該FkpA-結合型HIC材料係在溶離之前用40mM磷酸鹽、300mM硫酸鈉，pH 7.0洗滌。
  17. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之方法，其中該FkpA係使用水自該HIC材料溶離。
  18. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之方法，其中該HIC洗出液係收集於級分中。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中將包含FkpA之級分彙集。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中將包含至少約25% FkpA之級分彙集。
  21. 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之方法，其中該尺寸排阻層析材料包含交聯型瓊脂糖及右旋糖酐之球形複合物。
  22. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之方法，其中尺寸排阻流穿物係收集於級分中。
  23. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之方法，其中該HIC洗出液在尺寸排阻層析之前經濃縮。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該HIC洗出液在尺寸排阻層析之前係濃縮約6倍至約10倍。
  25. 如申請專利範圍第22項至第24項中任一項之方法，其中將該等包含FkpA之尺寸排阻級分彙集。
  26. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之方法，其中該FkpA多肽為大腸桿菌FkpA多肽。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該FkpA多肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
  28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該FkpA多肽之胺基酸序列與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少約80%一致性。
  29. 如申請專利範圍第1項至第28項中任一項之方法，其中該FkpA表現於細胞中。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該細胞為原核細胞。
  31. 如申請專利範圍第29項或第30項之方法，其中該細胞為大腸桿菌細胞。
  32. 如申請專利範圍第29項至第31項中任一項之方法，其中該細胞經工程改造以按大於FkpA之內源性表現的水準表現FkpA。
  33. 如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之方法，其中該細胞係使用微流化器溶解。
  34. 一種組合物，其包含藉由如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法純化之FkpA多肽。
  35. 一種包含經純化FkpA多肽之組合物，其中該組合物包含至少約98%之單聚FkpA多肽。
  36. 如申請專利範圍第35項之組合物，其中該組合物包含低於約2%之低分子量物質。
  37. 如申請專利範圍第35項或第36項之組合物，其中該組合物包含不超過約5%之高分子量物質。
  38. 如申請專利範圍第35項至第37項中任一項之組合物，其中單聚FkpA多肽之百分比係藉由尺寸排阻層析來偵測。
  39. 如申請專利範圍第38項之組合物，其中該組合物包含低於約5%、約4%、約3%、約2%或約1%之雜質。
  40. 如申請專利範圍第39項之組合物，其中該等雜質為相對於FkpA之高分子量及/或低分子量多肽物質。
  41. 如申請專利範圍第39項或第40項之組合物，其中該等雜質為以下中 之一或多者：大腸桿菌蛋白質(ECP)、FkpA之聚集物、FkpA之片段、核酸或細胞培養基組分。
  42. 如申請專利範圍第34項至第41項中任一項之組合物，其中該FkpA對一或多個冷凍-解凍循環而言為穩定的。
  43. 如申請專利範圍第42項之組合物，其中該FkpA對三個冷凍-解凍循環而言為穩定的。
  44. 如申請專利範圍第34項至第43項中任一項之組合物，其中該組合物中之該FkpA多肽的純度係藉由層析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳或西方墨點分析中之一或多者來量測。
  45. 如申請專利範圍第34項至第44項中任一項之組合物，其中該組合物中之該FkpA多肽的純度係藉由高效液相層析(HPLC)來量測。
  46. 如申請專利範圍第34項至第45項中任一項之組合物，其中該組合物中之該FkpA多肽的純度係藉由尺寸排阻層析(SEC)來量測。
  47. 如申請專利範圍第34項至第44項中任一項之組合物，其中該組合物中之該FkpA多肽的純度係藉由SDS凝膠電泳使用螢光成像或銀染色來量測。
  48. 如申請專利範圍第47項之組合物，其中該組合物中之非FkpA多肽的存在係藉由由凝膠電泳鑑別到存在如藉由西方墨點分析所示與抗FkpA抗體不具免疫反應性之物質來進行鑑別。
  49. 如申請專利範圍第48項之組合物，其中該組合物中之該FkpA多肽之聚集物的存在係藉由根據西方墨點分析存在分子量大於天然FkpA之物質來進行鑑別。
  50. 一種用於產生特異性結合FkpA之抗體的方法，其包括將動物暴露於包含藉由如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法純化之FkpA的組合物或對其進行免疫。
  51. 一種用於產生特異性結合FkpA之抗體的方法，其包括將動物暴露於如申請專利範圍第34項至第49項中任一項之組合物或對其進行免疫。
  52. 如申請專利範圍第50項或第51項之方法，其進一步包括收集該動物之血清，其中該血清包含特異性結合FkpA之抗體。
  53. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該血清包含特異性結合FkpA之 多株抗體。
  54. 如申請專利範圍第52項或第53項之方法，其中一或多種單株抗體係分離自該血清。
  55. 如申請專利範圍第50項至第54項中任一項之方法，其中該動物為山羊、兔、小鼠、豚鼠、倉鼠、大鼠、驢或雞。
  56. 一種包含特異性結合FkpA之多株抗體的組合物，其中該等多株抗體係藉由將動物對包含藉由如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法純化之FkpA的組合物進行免疫而產生。
  57. 一種包含特異性結合FkpA之多株抗體的組合物，其中該等多株抗體係藉由將動物對如申請專利範圍第34項至第49項中任一項之組合物進行免疫而產生。
  58. 如申請專利範圍第56項或第57項之組合物，其中該等多株抗體係收集自該動物之血清。
  59. 一種包含特異性結合FkpA之單株抗體的組合物，其中該等單株抗體係藉由將動物對包含藉由如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法純化之FkpA的組合物進行免疫而產生。
  60. 一種包含特異性結合FkpA之單株抗體的組合物，其中該等單株抗體係藉由將動物對如申請專利範圍第34項至第49項中任一項之組合物進行免疫而產生。
  61. 如申請專利範圍第56項至第60項中任一項之組合物，其中該動物為山羊、兔、小鼠、豚鼠、倉鼠、大鼠、驢或雞。
  62. 一種純化特異性結合FkpA之抗體之方法，其包括使包含抗FkpA抗體之如申請專利範圍第56項至第61項中任一項之組合物與硫酸銨接觸，達至約60%之硫酸銨最終濃度，將溶液離心，移除上清液及將集結粒溶解於磷酸鹽緩衝液中。
  63. 如申請專利範圍第62項之方法，其中該磷酸鹽緩衝液包含約50mM磷酸鈉，約pH 7.0。
  64. 一種純化特異性結合FkpA之抗體之方法，其包括a)使包含抗FkpA抗體之如申請專利範圍第56項至第61項中任一項之組合物與硫酸銨接觸，達至約60%之硫酸銨最終濃度，將溶液離心， 移除上清液且將集結粒溶解於磷酸鹽緩衝液中，以產生抗FkpA抗體溶液；b)將該抗FkpA抗體溶液施加至親和層析材料，c)使該等抗體自該親和材料溶離，以產生包含該等抗FkpA抗體之親和洗出液；及d)對該硫酸銨上清液進行尺寸排阻層析，及e)收集來自該尺寸排阻層析之包含經純化之抗體的級分。
  65. 如申請專利範圍第64項之方法，其中該磷酸鹽緩衝液包含約50mM磷酸鈉，約pH 7.0。
  66. 如申請專利範圍第64項或第65項之方法，其中該親和層析材料包含鍵聯至層析介質之FkpA。
  67. 如申請專利範圍第66項之方法，其中該層析介質為交聯右旋糖酐。
  68. 如申請專利範圍第66項或第67項之方法，其中該FkpA係藉由如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法純化。
  69. 如申請專利範圍第66項或第67項之方法，其中該FkpA係衍生自如申請專利範圍第34項至第49項中任一項之組合物。
  70. 如申請專利範圍第66項至第69項中任一項之方法，其中該FkpA係共價鍵聯至該層析介質。
  71. 如申請專利範圍第66項至第70項中任一項之方法，其中該FkpA係鍵聯至使用甘油基-可控孔度玻璃(甘油基-CPG)之該層析介質。
  72. 如申請專利範圍第64項至第71項中任一項之方法，其中該等抗FkpA抗體係自親和管柱溶離。
  73. 如申請專利範圍第64項至第72項中任一項之方法，其中該尺寸排阻層析材料包含交聯型瓊脂糖及右旋糖酐之球形複合物。
  74. 如申請專利範圍第73項之方法，其中交聯型瓊脂糖及右旋糖酐之該球形複合物具有針對分子量在10,000道爾頓與600,000道爾頓之間的分子的分離範圍。
  75. 如申請專利範圍第64項至第74項中任一項之方法，其中尺寸排阻流穿物係收集於級分中。
  76. 如申請專利範圍第75項之方法，其中將該等包含抗FkpA抗體之尺寸 排阻級分彙集。
  77. 如申請專利範圍第64項至第76項中任一項之方法，其中該等抗體為多株抗體。
  78. 如申請專利範圍第64項至第77項中任一項之方法，其中該等抗體係根據如申請專利範圍第50項至第55項中任一項之方法來製備。
  79. 如申請專利範圍第64項至第78項中任一項之方法，其中低於約1%之該等抗體特異性結合非FkpA化合物。
  80. 一種經分離之抗FkpA抗體，其係藉由如申請專利範圍第62項至第79項中任一項之方法來純化。
  81. 一種用於定量樣品中之FkpA的方法，其包括使用偵測系統偵測該樣品中之FkpA及將在該樣品中偵測到之FkpA的量與對一或多種濃度之超純FkpA參考標準物之偵測相比較。
  82. 如申請專利範圍第81項之方法，其中該超純FkpA參考標準物包含至少約95%、約96%、約97%或約98%之單聚FkpA多肽。
  83. 如申請專利範圍第81項或第82項之方法，其中該超純FkpA參考標準物係藉由如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法來製備或包含如申請專利範圍第34項至第49項中任一項之FkpA組合物。
  84. 如申請專利範圍第81項至第83項中任一項之方法，其中該偵測系統為免疫分析。
  85. 如申請專利範圍第84項之方法，其中該免疫分析包含特異性結合該超純FkpA參考標準物之抗體。
  86. 一種用於分析重組多肽樣品中FkpA之存在及/或量的方法，其包括使用免疫分析偵測該樣品中之FkpA及將在該樣品中偵測到之FkpA的量與對一或多種濃度之超純FkpA參考標準物之偵測相比較。
  87. 如申請專利範圍第86項之方法，其中該超純FkpA參考標準物包含至少約98%之單聚FkpA多肽。
  88. 如申請專利範圍第86項或第87項之方法，其中該超純FkpA參考標準物係藉由如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法來製備。
  89. 如申請專利範圍第84項至第88項中任一項之方法，其中該免疫分析包含特異性結合超純FkpA之抗體。
  90. 如申請專利範圍第89項之方法，其中特異性結合該超純FkpA之該等抗體為多株抗體。
  91. 如申請專利範圍第89項或第90項之方法，其中特異性結合該超純FkpA之該等抗體在該免疫分析中用作捕獲抗體。
  92. 如申請專利範圍第89項至第91項中任一項之方法，其中該等特異性結合超純FkpA之抗體係用作偵測抗體。
  93. 如申請專利範圍第92項之方法，其中該等偵測抗體與偵測劑結合。
  94. 如申請專利範圍第89項至第93項中任一項之方法，其中偵測劑為辣根過氧化物酶。
  95. 如申請專利範圍第89項至第94項中任一項之方法，其中該等特異性結合FkpA之抗體係包含於如申請專利範圍第56項至第61項中任一項之組合物中，或根據如申請專利範圍第50項至第55項中任一項之方法來製備。
  96. 如申請專利範圍第81項至第95項中任一項之方法，其中該FkpA為大腸桿菌FkpA。
  97. 如申請專利範圍第81項至第96項中任一項之方法，其中該樣品包含在宿主細胞中製備之重組多肽。
  98. 如申請專利範圍第97項之方法，其中該宿主細胞為大腸桿菌細胞。
  99. 如申請專利範圍第97項或第98項之方法，其中該宿主細胞過表現FkpA。
  100. 如申請專利範圍第81項至第99項中任一項之方法，其中該樣品為細胞溶解產物。
  101. 如申請專利範圍第81項至第100項中任一項之方法，其中該樣品係獲自重組多肽製劑，且其中該重組多肽製劑已經受一或多個層析純化步驟。
  102. 如申請專利範圍第101項之方法，其中該重組多肽製劑為最終純化產物。
  103. 如申請專利範圍第81項至第102項中任一項之方法，其中含於該重組多肽樣品中之該重組多肽為抗體或免疫黏附素。
  104. 如申請專利範圍第103項之方法，其中該抗體為多特異性抗體、雙特 異性抗體、半抗體或抗體片段。
  105. 如申請專利範圍第103項或第104項之方法，其中該重組多肽為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  106. 一種用於偵測樣品中之FkpA的免疫分析方法，其中該樣品係獲自來自宿主細胞株之重組多肽製劑，該方法包括：(a)使結合FkpA之捕獲抗體與該樣品接觸，藉此產生樣品-捕獲抗體組合物質；(b)使結合FkpA之偵測抗體與該樣品-捕獲抗體組合物質接觸；及(c)偵測與該樣品-捕獲抗體組合物質結合之該抗體。
  107. 如申請專利範圍第106項之方法，其進一步包括使用標準滴定曲線定量所結合之該偵測抗體的含量。
  108. 如申請專利範圍第107項之方法，其進一步包括基於所結合之該偵測抗體的含量計算存在於該樣品中之FkpA的量。
  109. 如申請專利範圍第108項之方法，其中存在於該樣品中之FkpA的量係藉由將該標準滴定曲線與用超純FkpA組合物產生之標準滴定曲線相比較來進行測定。
  110. 如申請專利範圍第109項之方法，其中該超純FkpA組合物包含至少約98%之單聚FkpA多肽。
  111. 如申請專利範圍第109項或第110項之方法，其中該組合物中之該超純FkpA係藉由如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法來製備。
  112. 如申請專利範圍第106項至第111項中任一項之方法，其中該捕獲抗體特異性結合該超純FkpA。
  113. 如申請專利範圍第106項至第112項中任一項之方法，其中該偵測抗體特異性結合該超純FkpA。
  114. 如申請專利範圍第112項或第113項之方法，其中特異性結合該超純FkpA之該抗體為多株抗體。
  115. 如申請專利範圍第106項至第114項中任一項之方法，其中結合FkpA之第二偵測抗體與辣根過氧化物酶結合。
  116. 如申請專利範圍第106項至第115項中任一項之方法，其中該多株抗 體係根據如申請專利範圍第50項至第55項中任一項之方法而產生。
  117. 如申請專利範圍第106項至第116項中任一項之方法，其中該免疫分析為夾心分析。
  118. 如申請專利範圍第117項之方法，其中該夾心分析為酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
  119. 如申請專利範圍第106項至第118項中任一項之方法，其中該FkpA為大腸桿菌FkpA。
  120. 如申請專利範圍第106項至第119項中任一項之方法，其中來自該宿主細胞株之該重組多肽製劑係獲自大腸桿菌。
  121. 如申請專利範圍第120項之方法，其中該宿主細胞株表現外源性FkpA。
  122. 如申請專利範圍第106項至第121項中任一項之方法，其中該樣品為細胞溶解產物。
  123. 如申請專利範圍第106項至第122項中任一項之方法，其中該樣品係獲自該重組多肽製劑，且其中該重組多肽製劑已經受一或多個層析純化步驟。
  124. 如申請專利範圍第123項之方法，其中該重組多肽製劑為最終純化產物。
  125. 如申請專利範圍第106項至第124項中任一項之方法，其中含於該重組多肽製劑中之該重組多肽為抗體或免疫黏附素。
  126. 如申請專利範圍第125項之方法，其中該抗體為多特異性抗體、雙特異性抗體、半抗體或抗體片段。
  127. 如申請專利範圍第125項或第126項之方法，其中該重組多肽為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  128. 如申請專利範圍第125項之方法，其中該重組多肽為雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合IL13之第一結合域及結合IL17之第二結合域。
  129. 如申請專利範圍第128項之方法，其中該IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
  130. 如申請專利範圍第128項或第129項之方法，其中該雙特異性抗體之 該第一結合域包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。
  131. 如申請專利範圍第128項至第130項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。
  132. 如申請專利範圍第128項至第131項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈。
  133. 如申請專利範圍第128項至第132項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈。
  134. 如申請專利範圍第128項至第133項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈。
  135. 如申請專利範圍第128項至第134項中任一項之方法，其中該IL17為人類IL17。
  136. 如申請專利範圍第128項至第135項中任一項之方法，其中第二結合域結合人類IL17AA、IL17FF及IL17AF。
  137. 如申請專利範圍第128項至第136項中任一項之方法，其中該IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之胺基酸序列且該IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
  138. 如申請專利範圍第128項至第137項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3。
  139. 如申請專利範圍第128項至第138項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的VL序列。
  140. 如申請專利範圍第128項至第139項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈。
  141. 如申請專利範圍第128項至第140項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈。
  142. 如申請專利範圍第128項至第141項中任一項之方法，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈。
  143. 一種用於包含由細菌細胞製備之重組多肽的醫藥組合物之品質分析，該品質分析包括對該醫藥組合物之樣品進行如申請專利範圍第106項至第142項中任一項之免疫分析方法，以偵測該醫藥組合物中FkpA之存在或量。
  144. 如申請專利範圍第143項之品質分析，其中該醫藥組合物中之FkpA的量不超過約30ppm、約25ppm、約20ppm、約15ppm、約14ppm、約13ppm、約12ppm、約11ppm、約10ppm、約9ppm、約8ppm、約7ppm、約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm。
  145. 如申請專利範圍第143項或第144項中任一項之品質分析，其中該細菌細胞為大腸桿菌細胞。
  146. 如申請專利範圍第143項至第145項中任一項之品質分析，其中該細菌細胞表現外源性FkpA。
  147. 如申請專利範圍第143項至第146項中任一項之品質分析，其中該樣品為細胞溶解產物。
  148. 如申請專利範圍第143項至第147項中任一項之品質分析，其中該樣品係獲自該重組多肽製劑，且其中該重組多肽製劑已經受一或多個層 析純化步驟。
  149. 如申請專利範圍第148項之品質分析，其中該重組多肽製劑為最終純化產物。
  150. 如申請專利範圍第143項至第149項中任一項之品質分析，其中該重組多肽為抗體或免疫黏附素。
  151. 如申請專利範圍第150項之品質分析，其中該抗體為多特異性抗體、雙特異性抗體、半抗體或抗體片段。
  152. 如申請專利範圍第151項之品質分析，其中該重組多肽為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  153. 如申請專利範圍第151項之品質分析，其中該重組多肽為雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合IL13之第一結合域及結合IL17之第二結合域。
  154. 如申請專利範圍第153項之品質分析，其中該IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
  155. 如申請專利範圍第153項或第154項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。
  156. 如申請專利範圍第153項至第155項中任一項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。
  157. 如申請專利範圍第153項至第156項中任一項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈。
  158. 如申請專利範圍第153項至第157項中任一項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈。
  159. 如申請專利範圍第153項至第158項中任一項之品質分析，其中該雙 特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈。
  160. 如申請專利範圍第153項至第159項中任一項之品質分析，其中該IL17為人類IL17。
  161. 如申請專利範圍第153項至第159項中任一項之品質分析，其中第二結合域結合人類IL17AA、IL17FF及IL17AF。
  162. 如申請專利範圍第153項至第161項中任一項之品質分析，其中該IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之胺基酸序列且該IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
  163. 如申請專利範圍第153項至第162項中任一項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3。
  164. 如申請專利範圍第153項至第163項中任一項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的VL序列。
  165. 如申請專利範圍第153項至第164項中任一項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈。
  166. 如申請專利範圍第153項至第165項中任一項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈。
  167. 如申請專利範圍第153項至第166項中任一項之品質分析，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈。
  168. 如申請專利範圍第153項至第167項中任一項之品質分析，其進一步包括偵測該醫藥組合物中之DsbA及/或DsbC的量的步驟。
  169. 如申請專利範圍第168項之品質分析，其中DsbA之量不超過約5 ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm。
  170. 如申請專利範圍第168項或第170項之品質分析，其中DsbA之量不超過約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm。
  171. 如申請專利範圍第168項至第170項中任一項之品質分析，其中DsbA及/或DsbC之量係藉由免疫分析來量測。
  172. 一種用於偵測包含由細菌細胞製備之重組多肽之醫藥組合物中的FkpA的套組，該套組包含藉由如申請專利範圍第50項至第55項中任一項之方法製備之抗FkpA抗體或如申請專利範圍第56項至第61項中任一項之抗FkpA抗體的組合物。
  173. 如申請專利範圍第172項之套組，其中該套組進一步包含在產生用於定量樣品中之FkpA的標準曲線時用作參考標準物及/或用作陽性對照之超純FkpA。
  174. 如申請專利範圍第172項之套組，其中該超純FkpA係根據如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法來製備。
  175. 一種包含重組多肽之組合物，其中該重組多肽係在表現內源性FkpA之宿主細胞中製備，其中該組合物包含濃度不超過約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm之FkpA。
  176. 如申請專利範圍第175項之組合物，其中該組合物中之FkpA的量係藉由免疫分析來測定。
  177. 如申請專利範圍第175項之組合物，其中該組合物中之FkpA的量係藉由如申請專利範圍第106項至第124項中任一項之免疫分析來測定。
  178. 一種包含重組多肽之組合物，其中該重組多肽係在經工程改造以表現外源性FkpA之宿主細胞中製備，其中該組合物包含濃度不超過約15ppm、約14ppm、約13ppm、約12ppm、約11ppm、約10ppm、約 9ppm、約8ppm、約7ppm、約6ppm、約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm之FkpA。
  179. 如申請專利範圍第175項至第178項中任一項之組合物，其中該重組多肽為抗體。
  180. 如申請專利範圍第179項之組合物，其中該抗體為雙特異性抗體。
  181. 如申請專利範圍第175項至第180項中任一項之組合物，其中該組合物包含至少約0.2ppm之FkpA。
  182. 如申請專利範圍第175項至第181項中任一項之組合物，其中該宿主細胞表現外源性FkpA，其中該組合物包含不超過約13ppm。
  183. 如申請專利範圍第175項至第182項中任一項之組合物，其中該宿主細胞表現外源性FkpA，其中該組合物包含不超過約0.7ppm。
  184. 如申請專利範圍第175項至第183項中任一項之組合物，其中該宿主細胞表現外源性FkpA，其中該組合物包含不超過約6ppm。
  185. 如申請專利範圍第175項至第184項中任一項之組合物，其中該重組多肽為雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含結合IL13之第一結合域及結合IL17之第二結合域。
  186. 如申請專利範圍第185項之組合物，其中該IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
  187. 如申請專利範圍第185項或第186項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。
  188. 如申請專利範圍第185項至第187項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。
  189. 如申請專利範圍第185項至第188項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重 鏈。
  190. 如申請專利範圍第185項至第189項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈。
  191. 如申請專利範圍第185項至第190項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕鏈。
  192. 如申請專利範圍第185項至第191項中任一項之組合物，其中該IL17為人類IL17。
  193. 如申請專利範圍第185項至第192項中任一項之組合物，其中該第二結合域結合人類IL17AA、IL17FF及IL17AF。
  194. 如申請專利範圍第193項之組合物，其中該IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之胺基酸序列且該IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
  195. 如申請專利範圍第185項至第194項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3。
  196. 如申請專利範圍第185項至第195項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的VL序列。
  197. 如申請專利範圍第185項至第196項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈。
  198. 如申請專利範圍第185項至第196項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈。
  199. 如申請專利範圍第185項至第198項中任一項之組合物，其中該雙特 異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈。
  200. 如申請專利範圍第185項至第199項中任一項之組合物，其中該組合物包含濃度不超過約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm之DsbA。
  201. 如申請專利範圍第200項之組合物，其中該組合物中之DsbA的濃度係藉由免疫分析來量測。
  202. 如申請專利範圍第185項至第201項中任一項之組合物，其中該組合物包含濃度不超過約5ppm、約4ppm、約3ppm、約2ppm、約1ppm、約0.9ppm、約0.8ppm、約0.7ppm、約0.6ppm、約0.5ppm、約0.4ppm、約0.3ppm、約0.2ppm或約0.1ppm之DsbC。
  203. 如申請專利範圍第202項之組合物，其中該組合物中之DsbC的濃度係藉由免疫分析來量測。
  204. 一種包含雙特異性抗體之組合物，其中該重組多肽係藉由包括以下步驟之方法來製備：a)向宿主細胞中引入i)編碼第一重鏈及第一輕鏈之核酸，其中該第一重鏈及該第一輕鏈形成第一抗原結合域；ii)編碼第二重鏈及第二輕鏈之核酸，其中該第二重鏈及該第二輕鏈形成第一抗原結合域；iii)編碼FkpA多肽之核酸；其中該第一重鏈及該第二重鏈形成Fc結構域；及b)純化該抗體，其中該組合物包含小於約5ppm之FkpA。
  205. 如申請專利範圍第204項之組合物，其中該組合物包含小於約1ppm之FkpA。
  206. 如申請專利範圍第175項至第205項中任一項之組合物，其中該宿主細胞為原核宿主細胞。
  207. 如申請專利範圍第206項之組合物，其中該宿主細胞為革蘭氏陰性細 菌。
  208. 如申請專利範圍第207項之組合物，其中該革蘭氏陰性細菌為大腸桿菌。
  209. 如申請專利範圍第175項至第208項中任一項之組合物，其中該FkpA為大腸桿菌FkpA。
  210. 如申請專利範圍第175項至第209項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體經純化。
  211. 如申請專利範圍第175項至第210項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體包含結合IL13之第一結合域。
  212. 如申請專利範圍第175項至第211項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體包含結合IL17之第二結合域。
  213. 如申請專利範圍第211項或第212項之組合物，其中該IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
  214. 如申請專利範圍第211項至第213項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含：包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L3。
  215. 如申請專利範圍第211項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VL序列。
  216. 如申請專利範圍第211項至第215項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈。
  217. 如申請專利範圍第211項至第215項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈。
  218. 如申請專利範圍第211項至第217項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第一結合域包含含有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的輕 鏈。
  219. 如申請專利範圍第211項至第218項中任一項之組合物，其中該IL17為人類IL17。
  220. 如申請專利範圍第211項至第219項中任一項之組合物，其中該第二結合域結合人類IL17AA、IL17FF及IL17AF。
  221. 如申請專利範圍第220項之組合物，其中該IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7之胺基酸序列且該IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
  222. 如申請專利範圍第219項至第221項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含：包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-L3。
  223. 如申請專利範圍第219項至第222項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的VL序列。
  224. 如申請專利範圍第219項至第223項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的重鏈。
  225. 如申請專利範圍第219項至第223項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的重鏈。
  226. 如申請專利範圍第219項至第225項中任一項之組合物，其中該雙特異性抗體之該第二結合域包含含有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈。
  227. 如申請專利範圍第175項至第226項中任一項之組合物，其中該組合物包含不超過約15ppm之DsbA。
  228. 如申請專利範圍第175項至第227項中任一項之組合物，其中該組合物包含不超過約5ppm之DsbA。
  229. 如申請專利範圍第175項至第228項中任一項之組合物，其中該組合物包含不超過約15ppm之DsbC。
  230. 如申請專利範圍第175項至第229項中任一項之組合物，其中該組合物包含不超過約5ppm之DsbC。
  231. 一種用於自包含多肽及一或多種雜質之組合物中純化該多肽的方法，a)對該組合物進行親和層析以產生親和洗出液，b)對該親和洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對該混合模式洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含該多肽之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  232. 一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化該多特異性抗體的方法，其中該多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對該組合物進行蛋白質A層析以產生蛋白質A洗出液，b)對該蛋白質A洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對該混合模式洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含該多特異性抗體之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  233. 如申請專利範圍第231項或第232項之方法，其中該混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。
  234. 如申請專利範圍第231項之方法，其中該親和層析係以結合及溶離模式進行。
  235. 如申請專利範圍第232項或第233項之方法，其中該蛋白質A層析係以結合及溶離模式進行。
  236. 如申請專利範圍第231項至第235項中任一項之方法，其中該混合模式層析係以結合及溶離模式進行。
  237. 如申請專利範圍第231項至第236項中任一項之方法，其中該HIC係以流穿模式進行。
  238. 一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化該多特異性抗體的方法，其中該多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL 單元，其中該多特異性抗體之各臂係分開產生，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對該多特異性抗體之各臂進行蛋白質A層析，以產生該多特異性抗體之各臂的蛋白質A洗出液，b)在足以產生包含該多特異性抗體之組合物的條件下，形成包含該多特異性抗體之各臂之蛋白質A洗出液的混合物，c)對包含該多特異性抗體之該組合物進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及d)對該混合模式洗出液進行疏水相互作用層析(HIC)且收集包含該多特異性抗體之級分其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  239. 如申請專利範圍第238項之方法，其中該混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。
  240. 如申請專利範圍第238項或第239項之方法，其中該蛋白質A層析係以結合及溶離模式進行。
  241. 如申請專利範圍第238項至第240項中任一項之方法，其中該混合模式層析係以結合及溶離模式進行。
  242. 如申請專利範圍第238項至第241項中任一項之方法，其中該疏水相互作用層析係以流穿模式進行。
  243. 如申請專利範圍第231項至第242項中任一項之方法，其中該混合模式洗出液在疏水相互作用層析之前經受陰離子交換層析。
  244. 如申請專利範圍第243項之方法，其中該陰離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
  245. 如申請專利範圍第231項至第244項中任一項之方法，其進一步包括對包含該多肽或多特異性抗體之該疏水相互作用層析級分進行陽離子交換層析且收集包含該多肽或多特異性抗體之級分的步驟。
  246. 如申請專利範圍第245項之方法，其中該陽離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
  247. 一種用於自包含多肽及一或多種雜質之組合物中純化該多肽的方法，a)對該組合物進行親和層析以產生親和洗出液， b)對該親和洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對該陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含該多肽之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  248. 一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化該多特異性抗體的方法，其中該多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對該組合物進行蛋白質A層析以產生蛋白質A洗出液，b)對該蛋白質A洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對該陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含該多特異性抗體之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  249. 一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化該多特異性抗體的方法，其中該多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，其中該多特異性抗體之各臂係分開產生，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對該多特異性抗體之各臂進行蛋白質A層析，以產生該多特異性抗體之各臂的蛋白質A洗出液，b)在足以產生包含該多特異性抗體之組合物的條件下，形成包含該多特異性抗體之各臂之蛋白質A洗出液的混合物c)對包含該多特異性抗體之該組合物進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及d)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，e)對該陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含該多特異性抗體之級分且收集包含該多特異性抗體之級分， 其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  250. 如申請專利範圍第247項至第249項中任一項之方法，其中該混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。
  251. 如申請專利範圍第247項之方法，其中該親和層析係以結合及溶離模式進行。
  252. 如申請專利範圍第248項至第250項中任一項之方法，其中該蛋白質A層析係以結合及溶離模式進行。
  253. 如申請專利範圍第247項至第252項中任一項之方法，其中該混合模式層析係以結合及溶離模式進行。
  254. 如申請專利範圍第247項至第253項中任一項之方法，其中該陰離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
  255. 如申請專利範圍第247項至第254項中任一項之方法，其中該疏水相互作用層析係以流穿模式進行。
  256. 如申請專利範圍第247項至第255項中任一項之方法，其進一步包括對包含該多肽或多特異性抗體之該疏水相互作用層析級分進行陽離子交換層析的步驟。
  257. 如申請專利範圍第247項至第256項中任一項之方法，其中該陽離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
  258. 一種用於自包含多肽及一或多種雜質之組合物中純化該多肽的方法，a)對該組合物進行親和層析以產生親和洗出液，b)對該親和洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對該陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含該多肽之級分，e)對該疏水相互作用洗出液進行陽離子交換層析且收集包含該多肽之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  259. 一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化該多特異性抗體的方法，其中該多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL 單元，該方法包括以下依序進行之步驟；a)對該組合物進行蛋白質A層析以產生蛋白質A洗出液，b)對該蛋白質A洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對該陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含該多特異性抗體之級分，e)對該疏水相互作用洗出液進行陽離子交換層析且收集包含該多肽之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  260. 一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化該多特異性抗體的方法，其中該多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，其中該多特異性抗體之各臂係分開產生，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對該多特異性抗體之各臂進行蛋白質A層析，以產生該多特異性抗體之各臂的蛋白質A洗出液，b)在足以產生包含該多特異性抗體之組合物的條件下，形成包含該多特異性抗體之各臂之蛋白質A洗出液的混合物c)對包含該多特異性抗體之該組合物進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及d)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，e)對該陰離子交換洗出液進行疏水相互作用層析且收集包含該多特異性抗體之級分且收集包含該多特異性抗體之級分，f)對該疏水相互作用洗出液進行陽離子交換層析且收集包含該多肽之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  261. 如申請專利範圍第258項至第260項中任一項之方法，其中該混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。
  262. 如申請專利範圍第258項之方法，其中該親和層析係以結合及溶離模 式進行。
  263. 如申請專利範圍第259項至第261項中任一項之方法，其中該蛋白質A層析係以結合及溶離模式進行。
  264. 如申請專利範圍第258項至第263項中任一項之方法，其中該混合模式層析係以結合及溶離模式進行。
  265. 如申請專利範圍第258項至第264項中任一項之方法，其中該陰離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
  266. 如申請專利範圍第258項至第265項中任一項之方法，其中該疏水相互作用層析係以流穿模式進行。
  267. 如申請專利範圍第258項至第266項中任一項之方法，其中該陽離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
  268. 一種用於自包含多肽及一或多種雜質之組合物中純化該多肽的方法，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對該組合物進行親和層析以產生親和洗出液，b)對該親和洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對該陰離子交換洗出液進行羥磷灰石層析且收集包含該多肽之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  269. 一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化該多特異性抗體的方法，其中該多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對該組合物進行蛋白質A層析以產生蛋白質A洗出液，b)對該蛋白質A洗出液進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及c)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，d)對該陰離子交換洗出液進行羥磷灰石層析且收集包含該多特異性抗體之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  270. 一種用於自包含多特異性抗體及一或多種雜質之組合物中純化該多特異性抗體的方法，其中該多特異性抗體包含多條臂，各臂包含VH/VL單元，其中該多特異性抗體之各臂係分開產生，該方法包括以下依序進行之步驟：a)對該多特異性抗體之各臂進行蛋白質A層析，以產生該多特異性抗體之各臂的蛋白質A洗出液，b)在足以產生包含該多特異性抗體之組合物的條件下，形成包含該多特異性抗體之各臂之蛋白質A洗出液的混合物c)對包含該多特異性抗體之該組合物進行混合模式層析以產生混合模式洗出液，及d)對該混合模式洗出液進行陰離子交換層析以產生陰離子交換洗出液，e)對該陰離子交換洗出液進行羥磷灰石層析，且收集包含該多特異性抗體之級分且收集包含該多特異性抗體之級分，其中該方法使該組合物中之產物特異性雜質的量減少。
  271. 如申請專利範圍第268項至第270項中任一項之方法，其中該混合模式層析為混合模式陰離子交換層析。
  272. 如申請專利範圍第271項之方法，其中該親和層析係以結合及溶離模式進行。
  273. 如申請專利範圍第269項至第272項中任一項之方法，其中該蛋白質A層析係以結合及溶離模式進行。
  274. 如申請專利範圍第268項至第273項中任一項之方法，其中該混合模式層析係以結合及溶離模式進行。
  275. 如申請專利範圍第268項至第274項中任一項之方法，其中該陰離子交換層析係以結合及溶離模式進行。
  276. 如申請專利範圍第268項至第275項中任一項之方法，其中該羥磷灰石層析係以流穿模式進行。
  277. 如申請專利範圍第231項至第245項或第256項至第267項中任一項之方法，其進一步包括對包含該多肽或多特異性抗體之該羥磷灰石相互作用層析級分進行超濾的步驟。
  278. 如申請專利範圍第245項至第246項或第256項至第267項之方法，其進一步包括對包含該多肽或多特異性抗體之該陽離子交換級分進行超濾的步驟。
  279. 如申請專利範圍第267項至第276項之方法，其進一步包括對包含該多肽或多特異性抗體之該羥磷灰石層析級分進行超濾的步驟。
  280. 如申請專利範圍第277項至第279項中任一項之方法，其中該超濾依序包括第一超濾、透濾及第二超濾。
  281. 如申請專利範圍第232項至第233項、第235項至第246項、第248項至第250項、第252項至第257項、第259項至第261項、第263項至第270項或第269項至第276項中任一項之方法，其中該蛋白質A層析包含鍵聯至瓊脂糖之蛋白質A。
  282. 如申請專利範圍第281項之方法，其中該蛋白質A層析為MAbSelectTM、MAbSelectTM SuRe及MAbSelectTM SuRe LX、Prosep-VA、Prosep-VA Ultra Plus、蛋白質A Sepharose® fast flow或Tyopearl蛋白質A層析。
  283. 如申請專利範圍第281項或第282項之方法，其中該蛋白質A層析使用以下中之一或多者：蛋白質A平衡緩衝液、蛋白質A加載緩衝液或蛋白質A洗滌緩衝液，其中該平衡緩衝液、加載緩衝液及/或洗滌緩衝液在約pH 7與約pH 8之間。
  284. 如申請專利範圍第283項之方法，其中該蛋白質A平衡緩衝液為約pH 7.7。
  285. 如申請專利範圍第283項或第284項之方法，其中該蛋白質A平衡緩衝液包含約25mM Tris及約25mM NaCl。
  286. 如申請專利範圍第283項至第285項中任一項之方法，其中該蛋白質A層析係在加載之後用平衡緩衝液洗滌。
  287. 如申請專利範圍第286項之方法，其進一步包括第二次洗滌及第三次洗滌，其中該第二次洗滌為1M精胺酸且該第三次洗滌為平衡緩衝液。
  288. 如申請專利範圍第283項至第287項中任一項之方法，其中該多特異性抗體係藉由pH梯度自該蛋白質A層析溶離。
  289. 如申請專利範圍第283項至第288項中任一項之方法，其中該多特異 性抗體係藉由施加具有低pH值之蛋白質A溶離緩衝液至該蛋白質A層析而自該蛋白質A溶離。
  290. 如申請專利範圍第289項之方法，其中該蛋白質A溶離緩衝液包含約150mM乙酸，約pH 2.8或約pH 2.9。
  291. 如申請專利範圍第283項至第290項中任一項之方法，其中該蛋白質A洗出液係在該洗出液之OD280大於約0.5之情況下彙集。
  292. 如申請專利範圍第231項至第291項中任一項之方法，其中該混合模式層析包含四級胺及疏水部分。
  293. 如申請專利範圍第231項至第292項中任一項之方法，其中該混合模式層析包含鍵聯至高度交聯型瓊脂糖之四級胺及疏水部分。
  294. 如申請專利範圍第231項至第293項中任一項之方法，其中該混合模式層析包含N-苯甲基-n-甲基乙醇胺。
  295. 如申請專利範圍第294項之方法，其中該混合模式層析為CaptoTM adhere層析。
  296. 如申請專利範圍第231項至第295項中任一項之方法，其中該混合模式層析使用以下中之一或多者：混合模式預平衡緩衝液、混合模式平衡緩衝液、混合模式加載緩衝液或混合模式洗滌緩衝液，其中該混合模式預平衡緩衝液、該混合模式平衡緩衝液及/或混合模式洗滌緩衝液在約pH 6與約pH 7之間。
  297. 如申請專利範圍第296項之方法，其中該混合模式預平衡緩衝液、該混合模式平衡緩衝液及/或混合模式洗滌緩衝液為約pH 6.5。
  298. 如申請專利範圍第296項或第297項之方法，其中該混合模式預平衡緩衝液包含約200mM乙酸鹽或約500mM乙酸鹽。
  299. 如申請專利範圍第296項至第298項中任一項之方法，其中該混合模式平衡緩衝液包含約50mM乙酸鹽。
  300. 如申請專利範圍第296項至第299項中任一項之方法，其中該混合模式層析係在加載之後用洗滌緩衝液洗滌。
  301. 如申請專利範圍第300項之方法，其中該洗滌緩衝液為約50mM乙酸鹽且約pH 6.5或約200mM乙酸鹽且約pH 6.5。
  302. 如申請專利範圍第231項至第301項中任一項之方法，其中該多肽或 多特異性抗體係藉由pH梯度自該混合模式層析溶離。
  303. 如申請專利範圍第231項至第302項中任一項之方法，其中該多肽或多特異性抗體係藉由施加具有低pH值之混合模式溶離緩衝液至該混合模式陰離子交換層析而自該混合模式層析溶離。
  304. 如申請專利範圍第303項之方法，其中該混合模式溶離緩衝液包含約25mM乙酸鹽且約pH 5.2或約pH 5.0。
  305. 如申請專利範圍第231項至第304項中任一項之方法，其中該混合模式洗出液係在該洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
  306. 如申請專利範圍第231項至第267項中任一項之方法，其中該疏水相互作用層析(HIC)包含疏水部分。
  307. 如申請專利範圍第306項之方法，其中該疏水相互作用層析包含苯基部分。
  308. 如申請專利範圍第306項或第307項之方法，其中該疏水相互作用層析包含鍵聯至交聯型瓊脂糖之疏水部分。
  309. 如申請專利範圍第306項至第308項中任一項之方法，其中該疏水相互作用層析包含鍵聯至交聯型瓊脂糖之苯基部分或丁基部分。
  310. 如申請專利範圍第309項之方法，其中該疏水相互作用層析為苯基Sepharose®層析或丁基Sepharose®層析。
  311. 如申請專利範圍第306項至第310項中任一項之方法，其中該疏水相互作用交換層析使用以下中之一或多者：HIC平衡緩衝液、HIC加載緩衝液或HIC洗滌緩衝液，其中該HIC平衡緩衝液、該HIC加載緩衝液及/或該HIC洗滌緩衝液在約pH 5與約pH 6之間。
  312. 如申請專利範圍第311項之方法，其中該HIC平衡緩衝液、該加載緩衝液及/或該洗滌緩衝液為約pH 5.5。
  313. 如申請專利範圍第311項或第312項之方法，其中該HIC平衡緩衝液及該洗滌緩衝液包含約170mM乙酸鹽。
  314. 如申請專利範圍第311項至第313項中任一項之方法，其中該HIC加載緩衝液為50mM Tris、100mM乙酸鈉，pH約5.5。
  315. 如申請專利範圍第311項至第314項中任一項之方法，其中該疏水相互作用層析係在加載之後用HIC洗滌緩衝液洗滌。
  316. 如申請專利範圍第306項至第315項中任一項之方法，其中該疏水相互作用層析包含己基部分。
  317. 如申請專利範圍第306項之方法，其中該疏水相互作用層析包含鍵聯至羥基化甲基丙烯酸系聚合物之疏水部分。
  318. 如申請專利範圍第316項或第317項之方法，其中該疏水相互作用層析包含鍵聯至羥基化甲基丙烯酸系聚合物之己基部分。
  319. 如申請專利範圍第318項之方法，其中該疏水相互作用層析為TOYOPEARL®己基650C。
  320. 如申請專利範圍第316項至第319項中任一項之方法，其中該疏水相互作用交換層析使用以下中之一或多者：HIC平衡緩衝液、HIC加載緩衝液或HIC洗滌緩衝液，其中該HIC平衡緩衝液、該HIC加載緩衝液及/或該HIC洗滌緩衝液在約pH 6與約pH 8之間。
  321. 如申請專利範圍第320項之方法，其中該HIC平衡緩衝液、該加載緩衝液及/或該洗滌緩衝液為約pH 7.0。
  322. 如申請專利範圍第320項或第321項之方法，其中該HIC平衡緩衝液及該洗滌緩衝液包含約50mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)及125mM乙酸鹽。
  323. 如申請專利範圍第316項至第322項中任一項之方法，其中該疏水相互作用層析係在加載之後用HIC洗滌緩衝液洗滌。
  324. 如申請專利範圍第306項至第323項中任一項之方法，其中該疏水相互作用洗出液係在該洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
  325. 如申請專利範圍第243項、第244項或第247項至第324項中任一項之方法，其中陰離子交換層析包含四級胺。
  326. 如申請專利範圍第325項之方法，其中該陰離子交換層析包含鍵聯至交聯型瓊脂糖之四級胺。
  327. 如申請專利範圍第326項之方法，其中該混合模式陰離子交換層析為QSFF層析。
  328. 如申請專利範圍第325項至第327項中任一項之方法，其中該陰離子交換層析使用以下中之一或多者：陰離子交換預平衡緩衝液、陰離子交換平衡緩衝液或陰離子交換加載緩衝液，其中該陰離子交換預平衡 緩衝液、該陰離子交換平衡緩衝液及/或該陰離子交換加載緩衝液在約pH 8與約pH 9之間。
  329. 如申請專利範圍第328項之方法，其中該陰離子交換預平衡緩衝液、該陰離子交換平衡緩衝液及/或該陰離子交換加載緩衝液為約pH 8.5。
  330. 如申請專利範圍第328項或第329項之方法，其中該陰離子交換預平衡緩衝液包含約50mM Tris及約500mM乙酸鈉或約100mM乙酸鈉。
  331. 如申請專利範圍第328項至第330項中任一項之方法，其中該陰離子交換平衡緩衝液包含約50mM Tris。
  332. 如申請專利範圍第328項至第331項中任一項之方法，其中該陰離子交換層析係在加載之後用陰離子交換平衡緩衝液洗滌。
  333. 如申請專利範圍第328項至第332項中任一項之方法，其中該多肽或多特異性抗體係藉由鹽梯度自該陰離子交換層析溶離。
  334. 如申請專利範圍第328項至第333項中任一項之方法，其中該多肽或多特異性抗體係藉由施加具有增加之鹽濃度的陰離子交換溶離緩衝液至該陰離子交換層析而自該陰離子交換層析溶離。
  335. 如申請專利範圍第334項之方法，其中該陰離子交換溶離緩衝液包含約50mM Tris及約100mM乙酸鈉，約pH 8.5。
  336. 如申請專利範圍第328項至第335項中任一項之方法，其中該陰離子交換洗出液係在該洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
  337. 如申請專利範圍第267項至第280項中任一項之方法，其中該羥磷灰石層析為陶瓷羥磷灰石層析。
  338. 如申請專利範圍第337項之方法，其中該羥磷灰石層析為CHT I型陶瓷羥磷灰石層析。
  339. 如申請專利範圍第337項或第338項之方法，其中該羥磷灰石層析使用羥磷灰石緩衝液A或羥磷灰石緩衝液B中之一或多者，其中該羥磷灰石緩衝液B與羥磷灰石緩衝液A相比具有較高電導率。
  340. 如申請專利範圍第339項之方法，其中該羥磷灰石緩衝液A為平衡緩衝液，其包含約10mM磷酸鈉，約pH 6.8。
  341. 如申請專利範圍第339項或第340項之方法，其中該羥磷灰石緩衝液B包含約10mM磷酸鈉及約1M氯化鈉，約pH 6.8。
  342. 如申請專利範圍第339項至第341項中任一項之方法，其中該多肽或多特異性抗體係使用羥磷灰石緩衝液B/羥磷灰石緩衝液A之梯度自該羥磷灰石層析溶離。
  343. 如申請專利範圍第342項之方法，其中該梯度為線性梯度。
  344. 如申請專利範圍第342項或第343項之方法，其中該梯度自0%羥磷灰石緩衝液B增加至100%羥磷灰石緩衝液B。
  345. 如申請專利範圍第342項至第344項中任一項之方法，其中該梯度在約20個管柱體積中自0%羥磷灰石緩衝液B增加至100%羥磷灰石緩衝液B。
  346. 如申請專利範圍第337項至第345項中任一項之方法，其中該羥磷灰石洗出液係在該洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
  347. 如申請專利範圍第245項至第246項或第256項至第326項之方法，其中陽離子交換層析包含羧酸部分或磺酸部分。
  348. 如申請專利範圍第347項之方法，其中該羧酸部分或該磺酸部分為磺丙基、磺乙基、磺異丁基或羧基部分。
  349. 如申請專利範圍第347項或第348項之方法，其中該陽離子交換層析包含鍵聯至交聯型瓊脂糖之羧酸部分或磺酸部分。
  350. 如申請專利範圍第348項或第349項之方法，其中該陽離子交換材料為POROS® HS50、POROS® HS20、SO3 Monolith、S Ceramic HyperD、磺丙基-Sepharose® Fast Flow(SPSFF)、SP-Sepharose® XL(SPXL)、CM Sepharose® Fast Flow、CaptoTM S、Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3或Fractogel COO。
  351. 如申請專利範圍第347項至第350項中任一項之方法，其中該陽離子交換加載密度小於約20g/L。
  352. 如申請專利範圍第347項至第351項中任一項之方法，其中該陽離子交換層析使用以下中之一或多者：陽離子交換預平衡緩衝液、陽離子交換平衡緩衝液、陽離子交換加載緩衝液或陽離子交換洗滌緩衝液，其中該陽離子交換預平衡緩衝液、該陽離子交換平衡緩衝液、該陽離子交換加載緩衝液及/或陽離子交換洗滌緩衝液在約pH 5.0與約pH 6.0之間。
  353. 如申請專利範圍第352項之方法，其中該陽離子交換陽離子交換該平衡緩衝液、該陽離子交換加載緩衝液及/或陽離子交換洗滌緩衝液為約pH 5.5或約pH 5.8。
  354. 如申請專利範圍第352項或第353項之方法，其中該陽離子交換平衡緩衝液包含50mM乙酸鈉。
  355. 如申請專利範圍第352項至第354項中任一項之方法，其中該陽離子交換洗滌緩衝液包含50mM乙酸鈉。
  356. 如申請專利範圍第352項至第355項中任一項之方法，其中該陽離子交換層析係在加載之後用平衡緩衝液洗滌。
  357. 如申請專利範圍第352項至第356項中任一項之方法，其中該多肽或多特異性抗體係藉由鹽梯度自該陽離子交換層析溶離。
  358. 如申請專利範圍第352項至第357項中任一項之方法，其中該多肽或多特異性抗體係藉由施加具有增加之鹽濃度的陽離子交換溶離緩衝液至該陽離子交換層析而自該陽離子交換層析溶離。
  359. 如申請專利範圍第358項之方法，其中該陽離子交換溶離緩衝液包含500mM乙酸鈉，pH 5.8。
  360. 如申請專利範圍第359項之方法，其中該溶離為10%至100%陽離子交換溶離緩衝液之梯度溶離。
  361. 如申請專利範圍第352項至第360項中任一項之方法，其中該陽離子交換洗出液係在該洗出液之OD280大於約0.5至約1.0之情況下彙集。
  362. 如申請專利範圍第251項至第361項中任一項之方法，其中該多肽或該多特異性抗體係在細胞中製備。
  363. 如申請專利範圍第361項之方法，其中該等多特異性抗體之臂係在細胞中製備。
  364. 如申請專利範圍第362項或第363項之方法，其中該細胞為原核細胞。
  365. 如申請專利範圍第364項之方法，其中該原核細胞係在大腸桿菌細胞中。
  366. 如申請專利範圍第364項或第365項之方法，其中該細胞經工程改造以表現一或多種伴侶蛋白。
  367. 如申請專利範圍第366項之方法，其中該伴侶蛋白為以下中之一或多 者：FkpA、DsbA或DsbC。
  368. 如申請專利範圍第366項或第367項之方法，其中該伴侶蛋白為大腸桿菌伴侶蛋白。
  369. 如申請專利範圍第362項至第368項中任一項之方法，其中該等細胞經溶解以產生包含該多肽或該多特異性抗體之細胞溶解產物。
  370. 如申請專利範圍第369項之方法，其中在蛋白質A層析之前該等細胞經溶解以產生包含該多特異性抗體或該多特異性抗體之臂的細胞溶解產物。
  371. 如任何申請專利範圍第369項或第370項之方法，其中該等細胞係使用微流化器溶解。
  372. 如申請專利範圍第369項至第371項中任一項之方法，其中聚乙烯亞胺(PEI)係在層析之前添加至該細胞溶解產物中。
  373. 如申請專利範圍第372項之方法，其中該PEI係添加至該溶解產物中達至約0.4%之最終濃度。
  374. 如申請專利範圍第369項至第373項中任一項之方法，其中該細胞溶解產物係藉由離心而加以澄清。
  375. 如申請專利範圍第251項至第373項中任一項之方法，其中該產物特異性雜質為以下中之一或多者：未配對抗體臂、抗體同二聚體、聚集物、高分子量物質(HMW)、低分子量物質(LMW)、酸性變異體或鹼性變異體。
  376. 如申請專利範圍第251項至第375項中任一項之方法，其中該方法使該組合物中之以下中之任一者的量減少：大腸桿菌蛋白質(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出蛋白質A、核酸、細胞培養基組分或病毒雜質。
  377. 如申請專利範圍第232項至第245項、第247項至第257項、第259項至第267項或第269項至第376項中任一項之方法，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體。
  378. 如申請專利範圍第377項之方法，其中該多特異性抗體之第一條臂結合IL13。
  379. 如申請專利範圍第378項之方法，其中該IL13為人類IL13。
  380. 如申請專利範圍第378項或第379項之方法，其中該IL13包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
  381. 如申請專利範圍第378項至第380項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第一條臂包含：包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L3。
  382. 如申請專利範圍第378項至第381項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第一條臂包含：包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的VH序列及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的VL序列。
  383. 如申請專利範圍第378項至第382項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第一條臂包含含有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈。
  384. 如申請專利範圍第378項至第383項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第一條臂包含含有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈。
  385. 如申請專利範圍第378項至第384項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第一條臂包含含有SEQ ID NO：17之胺基酸序列的輕鏈。
  386. 如申請專利範圍第378項至第385項中任一項之方法，其中該抗體之第二條臂結合IL17。
  387. 如申請專利範圍第386項之方法，其中該IL17為人類IL17。
  388. 如申請專利範圍第386項或第387項之方法，其中該IL17包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
  389. 如申請專利範圍第386項至第388項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之第二條臂包含：包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-L2及包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L3。
  390. 如申請專利範圍第386項至第389項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第二條臂包含：包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VH 序列及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VL序列。
  391. 如申請專利範圍第386項至第390項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第二條臂包含含有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈。
  392. 如申請專利範圍第386項至第391項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第二條臂包含含有SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈。
  393. 如申請專利範圍第386項至第393項中任一項之方法，其中該多特異性抗體之該第二條臂包含含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列的輕鏈。
  394. 一種組合物，其包含藉由如申請專利範圍第231項至第393項中任一項之方法純化之多肽或多特異性抗體，其中該組合物包含不超過約5%、4%、3%、2%或1%之產物特異性雜質。
  395. 如申請專利範圍第394項之組合物，其中該產物特異性雜質為以下中之一或多者：未配對抗體臂、抗體同二聚體、聚集物、高分子量物質(HMW)、低分子量物質(LMW)、酸性變異體或鹼性變異體。
  396. 如申請專利範圍第394項或第395項之組合物，其中該組合物包含小於約組合物包含不超過約5%、4%、3%、2%或1%之在該組合物中之以下中之任一者：大腸桿菌蛋白質(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出蛋白質A、核酸、細胞培養基組分或病毒雜質。
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