JP2022042964A

JP2022042964A - 疎水性相互作用クロマトグラフィー担体とタンパク質精製方法

Info

Publication number: JP2022042964A
Application number: JP2021127468A
Authority: JP
Inventors: 浩二朗曽田; Kojiro Sota; 吉裕松本; Yoshihiro Matsumoto
Original assignee: JNC Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2022-03-15
Also published as: US20220064211A1

Abstract

【課題】抗体単量体含有溶液から抗体２量体を除去できるクロマトグラフィー担体を提供する。【解決手段】多孔性粒子を含むベース担体と前記ベース担体に結合した疎水性配位子とを含むクロマトグラフィー担体であって、前記クロマトグラフィー担体は、グラジエント溶出試験で測定された電気伝導度が３４ｍＳ／ｃｍ以下であるクロマトグラフィー担体とする。好ましくは、多孔性粒子の平均粒径が６６～１５０μｍであり、疎水性配位子が、フェニル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチル、およびｎ－オクタデシルからなる群より選択される少なくとも１種を有する。【選択図】図１

Description

本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体およびそれを用いたタンパク質精製方法に関する。

クロマトグラフィーを用いてバイオ医薬品の精製を行うことは広く知られており、種々の分子間相互作用を利用して目的物と不純物の分離が行われる。例として、静電的相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用を利用した疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび抗体に対するアフィニティー相互作用を利用したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーなどがある。

その中で疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)はモノクローナル抗体の精製プロセスの最終精製工程で抗体凝集体や宿主細胞由来タンパク質やリークしたプロテインＡなど工程関連不純物を低減する目的で使用されている（非特許文献１，２）

ＨＩＣを用いる場合、通常、ＨＩＣ担体と目的物又は不純物との疎水性相互作用を促進するため高濃度のコスモトロピック塩が用いられる。一方、無塩条件下でフロースルー様式にて凝集体を除去できるＨＩＣ法も開発されている（特許文献１）。

しかし、タンパク質、特に抗体を回収できつつも、抗体の凝集体の中でも２量体の抗体の除去に優れたクロマトグラフィー担体は存在しなかった。

国際公開２０１４／１４５２０８号

ＳｈｕｋｌａａｎｄＴｈｏｍｍｅｓ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２８（５）：２５３－２６１，２０１０Ｓｈｕｋｌａｅｔａｌ．，ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ８４８：２８－３９，２００７

本発明の目的は、抗体の２量体の除去に優れたＨＩＣ担体、およびこの担体を用いて２量体が除去された抗体溶液を回収する方法を提供することである。

本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、多孔性粒子を含むベース担体に疎水基を付加し、得られたクロマトグラフィー担体が、優れた２量体除去特性を有していることを見出し、本発明に至った。すなわち本発明は、例えば以下の通りである。

［１］多孔性粒子を含むベース担体と前記ベース担体に結合した疎水性配位子とを含むクロマトグラフィー担体であって、
前記クロマトグラフィー担体は、グラジエント溶出試験で測定された電気伝導度が３４ｍＳ／ｃｍ以下であるクロマトグラフィー担体。

［２］前記多孔性粒子の平均粒径が６６～１５０μｍである、［１］に記載のクロマトグラフィー担体。

［３］前記疎水性配位子が、フェニル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチル、およびｎ－オクタデシルからなる群より選択される少なくとも１種を有する、［１］または［２］に記載のクロマトグラフィー担体。

［４］前記多孔性粒子が、架橋セルロース粒子である、［１］～［３］のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。

［５］［１］～［４］のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体を抗体溶液と接触させる工程と、抗体溶液を回収する工程とを含むことにより、２量体を除去された溶液が得られる、抗体の精製方法。
［６］抗体溶液と接触させる前記工程がクロマトグラフィー担体を含む容器に、フロースルー様式で抗体溶液を通過させる工程を含む、［５］に記載の抗体の精製方法。

［７］前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、［５］または［６］に記載の抗体の精製方法。

［８］前記抗体が、ヒト抗体、マウス抗体、またはキメラ抗体である、［７］に記載の抗体の精製方法。

本発明によると、２量体の抗体の除去に優れたクロマトグラフィー担体を提供することができる。

実施例１において、試験したクロマトグラフィー担体それぞれの直線状保持データである。実施例３および４におけるカラム配置の模式図である。実施例３および４におけるサイズ排除クロマトグラフィー分析のクロマトグラムである。

本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語が最初に定義される。さらなる定義は、詳細な説明全体にわたって記載される。

用語「分取クロマトグラフィー装置」とは、２種類のポンプを有し、少なくとも２種類の溶液をそれぞれ送液できる。また、検出器には少なくともＵＶ検出器と電気伝導度計の２種類があり、ＵＶ検出器、電気伝導度計の順に接続されている。

用語「グラジエント溶出試験」とは、カラム容積が１．０６ｍＬであるカラムに充填したクロマトグラフィー担体に分取クロマトグラフィー装置を用いてｐＨ７．０で１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流速０．２５カラム体積／分で５カラム体積流した後に、ｐＨ７．０の１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解している１ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液を流速０．２５カラム体積／分で１カラム体積流した後、ｐＨ７．０で１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流速０．２５カラム体積／分で２カラム体積流した後に、流速０．２５カラム体積／分で、１０カラム体積かけてｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流した後に、フローセルの容積が２μＬ以下の吸光度計で透過光２８０ｎｍで計測されたリゾチームの溶出ピークトップが現れた時の溶液を、吸光度計と容積２０μＬ以下のチューブで接続されたフローセルの容積が５０μＬ以下の電気伝導度計で測定する試験である。この試験により、クロマトグラフィー担体からリゾチームが溶出される緩衝液の電気伝導度、またはリゾチームが溶出されないことが観測される。

用語「ｐＨ７．０で１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液」とは、溶液１Ｌあたり１３２．１４ｇの硫酸アンモニウムと２．４０ｇのリン酸２水素ナトリウムが溶解されており、水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した水溶液を指す。

用語「ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液」とは、溶液１Ｌあたり２．４０ｇのリン酸２水素ナトリウムが溶解されており、水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した水溶液を指す。

用語「トリス」とはトリスヒドロキシメチルアミノメタンを指す。

用語「ｐＨ６．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋５０ｍＭ・ＮａＣｌ緩衝液」とは、溶液１Ｌあたり１．２０ｇの酢酸と２．９２ｇの塩化ナトリウムを含み、トリスによりｐＨ６．０に調整した水溶液を指す。

用語「ｐＨ６．７の２００ｍＭリン酸ナトリウム＋１００ｍＭ硫酸ナトリウム緩衝液」とは溶液１Ｌあたり２４．０ｇのリン酸２水素ナトリウムと１４．２ｇの硫酸ナトリウムが溶解されており、水酸化ナトリウムでｐＨ６．７に調整した水溶液を指す。

用語「ｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液」とは、溶液１Ｌあたり１．２０ｇの酢酸を含み、トリスによりｐＨ７．０に調整した水溶液に５Ｍ－ＮａＣｌ溶液を１０ｍＳ／ｃｍになるまで添加した溶液を指す。

用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原識別部によって、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質またはポリペプチドなどの標的と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、抗体は、そのままの（例えば全長）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなど）、単一鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二特異性抗体、線状抗体、単一鎖抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ならびに抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体及び共有結合修飾抗体を含む、必要とされる特異性の抗原識別部を含む免疫グロブリン分子の他の修飾配置を包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体が何らかの特定のクラスのものである必要はない。免疫グロブリンは、重鎖の不変領域の抗体アミノ酸配列に応じて異なるクラスに帰属させてもよい。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、サブクラス（イソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２にさらに分けられてもよい。

用語「２量体」とは、抗体が２分子結合しているものを指す。

用語「凝集体」とは、抗体が３分子以上結合しているものを指す。

用語「除去」とは、単量体を含む抗体溶液から単量体以外を取り除くことを指す。例えば、２量体の除去された状態とは、２量体を含む抗体溶液をクロマトグラフィー担体に接触させたとき、クロマトグラフィー担体が２量体を保持することで、回収された溶液中の２量体の質量が、ロードした溶液中の２量体の質量よりも減少した状態を指す。

用語「ロードする」とは、カラムに充填されたクロマトグラフィー担体に、抗体を含む溶液をカラムの一方の口より通液させ、クロマトグラフィー担体と抗体を含む溶液を接触させ、もう一方の口より抗体を含む溶液を取り出す操作を指す。

用語「フロースルー様式」とは、産物の調製の分離技術を指し、ここで、調製物中に含まれる少なくとも１つの産物がクロマトグラフィー担体を通って流れることが意図され、一方、少なくとも１つの可能性ある混入物または不純物はそのクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合する。

以下、本発明のクロマトグラフィー担体の構成要素について、順に説明する。
１．ベース担体
クロマトグラフィー担体は、一般的に、ベース担体にリガンドが結合した構成を有する。本発明におけるベース担体は多孔性粒子を含み、多孔性粒子は、リガンドとしての疎水性配位子を導入するための官能基（例えば、水酸基、カルバモイル基など）で修飾されている。そのような官能基で修飾され得る限り、使用される多孔性粒子は限定されないが、例えば、アガロース、デキストラン、でんぷん、セルロース、プルラン、キチン、キトサン、三酢酸セルロース、二酢酸セルロースなどの多糖類およびその誘導体；ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアルキルビニルエーテル、ポリビニルアルコールなどの有機重合体などが好ましく挙げられる。多孔性粒子は、架橋構造を形成していることが、機械的強度を確保できる点から好ましい。これらの中でも、架橋反応によってセルロース粒子の骨格が補強された架橋セルロース粒子を用いることがより好ましい。

架橋セルロース粒子としては、クロマトグラフィー担体のベース担体として使用され得るものであれば特に制限されない。原料となるセルロースは、結晶セルロースであっても非結晶セルロースであってもよいが、強度が高いことから結晶セルロースが好ましい。

本発明において好適に使用できる架橋セルロース粒子としては、例えば、特開２００９－２４２７７０号公報に開示されている多孔性セルロースゲルが挙げられる。同公報に開示されている多孔性セルロースゲルは、未架橋セルロース粒子の懸濁液に、セルロースモノマーのモル数の６～２０倍量の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩およびホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩の存在下、セルロースモノマーのモル数の４～１２倍量の架橋剤と、架橋剤のモル数の０．１～１．５倍量のアルカリとを３時間以上かけて連続滴下または分割添加する工程を含む方法で得られる。このようにして得られた架橋セルロース粒子は、機械的強度が高く、流速の速いクロマトグラフィー条件下での使用が可能であり、生産性の高いＨＩＣ担体を得ることができる。ここで、「セルロースモノマー」とは、セルロースの構成単位であるグルコースユニットを意味する。また、セルロースモノマーのモル数（すなわち、重合度）は、グルコース１ユニットから水分を引いた量（すなわちセルロースの乾燥重量）に基づいて計算する（分子量１６２を１モルとする）。

多孔性粒子の形状は特に制限されないが、機械的強度が高く、ゲル沈降性に優れ、均一な充填床を作製できることから、球状のものが好ましい。この場合、多孔性粒子の真球度は０．８～１．０であることが好ましい。ここで「真球度」とは、多孔性粒子の短径／長径を意味する。

球状セルロース粒子は、例えば、結晶セルロースまたは結晶領域と非結晶領域とからなるセルロースを溶解し再生することで容易に得ることができる。球状セルロース粒子の製造方法としては、例えば、特公昭５５－３９５６５号公報、特公昭５５－４０６１８号公報などに記載される酢酸エステルを経由する方法；特公昭６３－６２２５２号公報などに記載されるチオシアン酸カルシウム塩を含む溶液から製造する方法；特開昭５９－３８２０３号公報などに記載されるパラホルムアルデヒドおよびジメチルスルホキシドを含む溶液から製造する方法；特許第３６６３６６６号公報に記載される、セルロースを塩化リチウム含有アミドに溶解させたセルロース溶液から製造する方法などが挙げられる。また、球状の架橋セルロース粒子は、球状セルロース粒子を架橋することで得ることができる。

本発明に用いる多孔性粒子の粒子径は、１０～５００μｍが好ましく、５０～１５０μｍが特に好ましい。また、平均粒子径は、６６～１５０μｍが好ましい。ここで、「粒子径」とは、各多孔性粒子の粒子径の実測値を意味し、「平均粒子径」とは、上記粒子径に基づいて算出される平均値を意味する。

本明細書において、多孔性粒子の粒子径および平均粒子径は、例えば、レーザー回折／散乱式の粒子径分布測定装置を用いて測定することができる。この装置では、粒子群にレーザー光を照射し、そこから発せられる回折／散乱光の強度分布パターンから粒度分布を求め、それに基づいて粒子径および平均粒子径を算出する。具体的な測定装置としては、レーザー回折／散乱式の粒子径分布測定装置ＬＡ－９５０（株式会社堀場製作所製）などを用いることができる。

あるいは、光学顕微鏡で撮影した画像を使用して粒子径を測定することもできる。具体的には、ノギスなどを用いて画像上の粒子径を計測し、撮影倍率から元の粒子径を求める。そして、光学顕微鏡画像から求めたそれぞれの粒子径の値から、下記の式によって平均粒子径を算出する。
体積平均粒子径（ＭＶ）＝Σ（ｎｄ^４）／Σ（ｎｄ^３）
［式中、ｄは光学顕微鏡画像から求めた各粒子の粒子径の値を表し、ｎは測定した粒子の個数を表す。］

多孔性粒子の多孔性は、細孔サイズ特性をもって特徴づけることができる。細孔サイズ特性を示す指標の一つとして、ゲル分配係数Ｋａｖがある。細孔サイズは、粒子の物理的強度や精製対象となる目的物質の多孔性粒子内での拡散性に影響を及ぼす。従って、細孔サイズによって、多孔性粒子中を通過する液体の流速や多孔性粒子の動的吸着容量に違いが生じる。そのため、目的に応じた細孔サイズとなるような多孔性粒子の設計が必要となる。特に動的吸着容量の観点から、多孔性粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、重量平均分子量１．５×１０^５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドをサンプルとして使用し、純水を移動相として使用した場合に、０．１５～０．６の範囲であるものが好ましく、より好ましくは０．２～０．５５であり、特に好ましくは０．３～０．５である。

本発明においては、上記範囲のゲル分配係数を得られるような細孔サイズを有する多孔性粒子を使用することが、吸着特性の観点から好ましい。多孔性粒子として架橋セルロース粒子を使用する場合、そのゲル分配係数Ｋａｖは、例えば、粒子形成時のセルロースの溶解濃度を制御することにより調整することができる。

ゲル分配係数Ｋａｖは、特定の分子量を有する標準物質（例えば、ポリエチレンオキシド）をサンプルとして使用した場合の保持容量とカラム体積との関係から、次式により求めることができる。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／（Ｖｔ－Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）を表し、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）を表し、Ｖ０はブルーデキストランの保持容量（ｍＬ）を表す。］

ゲル分配係数Ｋａｖの具体的な測定方法は、例えば、Ｌ．Ｆｉｓｃｈｅｒ著生物化学実験法２「ゲルクロマトグラフィー」第１版（東京化学同人）などに記載されている。

２．リガンド
本発明のクロマトグラフィー担体は、リガンドとして疎水性配位子を含む。本発明において使用される疎水性配位子は、ベース担体上の官能基と結合し得るものであれば、特に限定されない。具体的には、フェニル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチル、ｎ－オクタデシル等を有する疎水性配位子が挙げられ、中でもフェニルであることが好ましい。好ましい疎水性配位子の構造として、以下の式（１）の構造が挙げられる。

［＊はリガンドにおけるベース担体との結合部位である］

ベース担体への疎水性配位子の付加方法は、特に限定されず、公知の方法で行うことができる。例えば、疎水性配位子が結合し得る官能基（例えば、エポキシ基など）で修飾されており、多孔性粒子と疎水性配位子原料とを含む溶液を、所定の条件下で攪拌することにより行うことができる。好ましい疎水性配位子原料として、以下の式（２）の構造が挙げられる。

以下、本発明のクロマトグラフィー担体のグラジエント溶出試験とタンパク質の精製方法について説明する。

本発明の例示の実施形態において、クロマトグラフィー担体はカラムに充填される。具体的なカラムはＳｕｐｅｒＥｄｇｅＥｍｐｔｙＭｉｎｉＣｏｌｕｍｎｓＫｉｔ（ＪＮＣ株式会社製)を用いることができるがこれに限定されない。

本発明は、カラム容積が１．０６ｍＬであるカラムに充填した前記クロマトグラフィー担体に分取クロマトグラフィー装置を用いてｐＨ７．０で１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流速０．２５カラム体積／分で５カラム体積流した後に、ｐＨ７．０の１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解している１ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液を流速０．２５カラム体積／分で１カラム体積流した後、ｐＨ７．０で１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流速０．２５カラム体積／分で２カラム体積流した後に、流速０．２５カラム体積／分で、１０カラム体積かけてｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流した後に、フローセルの容積が２μＬ以下の吸光度計により透過光２８０ｎｍで計測されたリゾチームの溶出ピークトップが現れた時の溶液が、吸光度計と容積２０μＬ以下のチューブで接続されたフローセルの容積が５０μＬ以下の電気伝導度計で測定された時の電気伝導度が３４ｍＳ／ｃｍ以下であるクロマトグラフィー担体を用いることで、既存のＨＩＣ担体よりも優れる２量体の除去性を示す驚くべきデータの認識に基づく。

本発明の例示の実施形態において、抗体溶液は、ＣＨＯ細胞上清を清澄化し、プロテインＡ担体により精製したものを用いてもよい。

本明細書において提供される方法は、抗体を精製するのに特に有用である。本発明の例示の実施形態において、本開示の抗体はＩｇＧ１抗体である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する、重鎖不変領域は、それぞれアルファ、デルタ及びイプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置はよく知られている。

本明細書において提供されるＨＩＣ法を使用して精製されてもよい抗体は、モノクローンでもポリクローンでもよい。「モノクローナル抗体」は均一抗体集団を指し、「ポリクローナル抗体」は不均一抗体集団を指す。

本発明の例示の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖であるヒト以外の抗体、またはヒトの免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むその抗原結合性フラグメントの形態を指してもよい。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基と置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であってもよい。

本明細書において提供されるクロマトグラフィー担体を使用して精製されてもよい抗体の例は、以下を含むがこれらに限定されない。アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴル、ＡＬＤ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブペンテテート、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマクソマブ、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、コンシズマブ、クレネズマブ、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、ヅリゴツマブ、ヅピルマブ、ヅシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エルデルマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴル、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマクソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、ホントリズマブ、ホラルマブ、ホラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、グセルクマブ、エミシズマブ、イバリズマブ、イブリツモマブ、チウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ラムパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ－ＣＤ、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オヅリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、キリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレヅマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バンチクツマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマホドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、およびゾリモマブアリトクスである。

本発明の例示の実施形態において、抗体溶液の濃度測定には吸光度計を使用する。
本発明の例示の実施形態において、抗体溶液はクロマトグラフィーカラムにロードされ、次いで、装填したタンパク質は、移動相緩衝液の添加によって押し出される。実施形態において、タンパク質は、カラムに装填する前に移動相緩衝液中でまず平衡させてもよい。精製したタンパク質を、例えば、素通り画分として収集されてもよい。

本発明の例示の実施形態において、フロースルー様式のＨＩＣを使用する。フロースルー様式のＨＩＣは、２量体を除去するためにしばしば使用される。２量体は、単量体と非常に類似した化学的性質を有するが、一般に単量体より疎水性である。本明細書において提供されるような条件下で、２量体はカラムのクロマトグラフィー担体に結合し、単量体のフロースルーを可能にする。それにより、フロースルーは、本明細書において使用される場合、本明細書において提供される担体含有カラムを通り抜けた画分中で収集される移動相緩衝剤中のタンパク質を指す。

本発明の例示の実施形態において、フロースルーに含まれる２量体量の測定にサイズ排除クロマトグラフィーを使用する。サイズ排除クロマトグラフィーを用いることで生体分子を溶液中での分子サイズに基づいて分離することができる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。

＜実施例１＞
〔６％球状セルロース粒子（含水）の製造〕
６％球状セルロース粒子を、以下の手順に従って製造した。ここで、以下の（１）の工程で結晶性セルロースの濃度が６重量％である場合に、製造されるセルロース粒子を「６％球状セルロース粒子」と呼ぶ。

（１）１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に、６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名：セオラスＰＨ１０１）を加え、１１０～１２０℃に加熱して溶解した。

（２）この溶液に、界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加した。それを、１３０～１４０℃に予め加熱したｏ－ジクロロベンゼン４８０ｍＬ中に滴下し、２００～３００ｒｐｍにて撹拌して分散液を得た。

（３）次いで、上記分散液を４０℃まで冷却した。それをメタノール１９０ｍＬ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。

（４）得られた懸濁液を濾過分別して粒子を回収し、その粒子をメタノール１９０ｍＬで洗浄した。この洗浄操作を数回行った。

（５）さらに大量の水で粒子を洗浄し、６％球状セルロース粒子を得た。

（６）次いで、この球状セルロース粒子をＪＩＳ標準ふるい規格５３～１２５μｍのふるいにかけて、所望の粒子径（粒子径：５０～１５０μｍ、平均粒子径：約１００μｍ）を有する６％球状セルロース粒子（含水、セルロース溶解濃度：６重量％）を得た。

なお、ここでの平均粒子径は、光学顕微鏡で撮影した画像を使用して測定した。具体的には、ノギスを用いて画像上の粒子径を計測し、撮影倍率から元の粒子径を求めた。そして、光学顕微鏡画像から求めたそれぞれの粒子径の値から、下記の式によって平均粒子径を算出した。
体積平均粒子径（ＭＶ）＝Σ（ｎｄ^４）／Σ（ｎｄ^３）
［式中、ｄは光学顕微鏡画像から求めた各粒子の粒子径の値を表し、ｎは測定した粒子の個数を表す。］

〔架橋６％セルロース粒子の製造〕
上記で製造した６％球状セルロース粒子を架橋反応させ、架橋６％セルロース粒子を製造した。その手順は以下の通りである。

（１）上記で得られた６％球状セルロース粒子（含水）１００ｇに１２１ｇの純水を加え、撹拌しながら加温した。３０℃に到達したところで、４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．３ｇおよびＮａＢＨ４０．５ｇを加え、さらに加温および撹拌した。ここでの初期アルカリ濃度は、０．６９％（ｗ／ｗ）であった。

（２）３０分後、４５℃に加温された反応液に６０ｇのＮａ２ＳＯ４を加え、溶解させた。混合物の温度が５０℃に到達した時点から、温度を５０℃に維持しながらさらに２時間撹拌を継続した。

（３）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分おきにおよそ６時間かけて添加した。

（４）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。

（５）反応混合物を４０℃に冷却した後、酢酸２．６ｇを加えて中和した。

（６）反応混合物を濾過してセルロース粒子を回収し、セルロース粒子を純水で濾過洗浄
して架橋６％セルロース粒子を得た。得られた架橋６％セルロース粒子の平均粒子径およびＫａｖ値を、以下の通り測定した。

（平均粒子径の測定）
レーザー回折／散乱式の粒子径分布測定装置ＬＡ－９５０（ＨＩＣによる精製での２量体の減少率）を用いて平均粒子径を測定したところ、８５μｍであった。

（Ｋａｖ値の測定）
ゲル分配係数Ｋａｖは、重量平均分子量１．５×１０^５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドをサンプルとして用い、その保持容量とカラム体積との関係から、次式により算出した。なお、移動相としては純水を使用した。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／（Ｖｔ－Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）を表し、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）を表し、Ｖ０はブルーデキストランの保持容量（ｍＬ）を表す。］
上記で得られた架橋６％セルロース粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、０．３７であった。

〔疎水性による修飾〕
上記で得られた架橋６％セルロース粒子１５ｇを、５０ｍＬ遠沈管に入れ、そこに純水２４ｍＬを加えてスラリーとした。その後、温度２８℃に昇温し、ゲルが流動するように攪拌した。硫酸ナトリウム９．９ｇを加え、その後４８．６重量％のＮａＯＨ水溶液を２．１ｇ加え１時間攪拌した。グリシジルフェニルエーテル（東京化成工業株式会社）１．６ｇを加え、５０℃±２℃にし、攪拌しながら１６時間反応させた。その後５０℃の純水１００ｍＬで５回、１００ｍＬのメタノールで１５回、１００ｍＬの純水で５回洗浄して、疎水基で修飾されたセルロース粒子を得た。

〔グラジエント溶出試験〕
特許文献１に最も疎水性が高いクロマトグラフィー担体と記載されており、親水性ビニルポリマーを基材にヘキシル基が導入されたＨＩＣ担体である親水性ビニルポリマーを基材としたＨＷ－６５（たんぱく質排除限界分子量５×１０^６）にヘキシル基を導入したトヨパールヘキシルー６５０Ｃ（東ソー株式会社製）と、本発明のクロマトグラフィー担体をそれぞれ１．０６ｍＬのカラム体積のカラムに充填し、分取クロマトグラフィー装置を用いてｐＨ７．０で１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流速０．２５カラム体積／分で５カラム体積流した後に、ｐＨ７．０の１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解している１ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液を流速０．２５カラム体積／分で１カラム体積流した後、ｐＨ７．０で１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流速０．２５カラム体積／分で２カラム体積流した後に、流速０．２５カラム体積／分で、１０カラム体積かけてｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流した後に、フローセルの容積が２μＬ以下の吸光度計で、透過光２８０ｎｍで計測されたリゾチームの溶出ピークトップが現れた時の溶液が、吸光度計と容積２０μＬ以下のチューブで接続されたフローセルの容積が５０μＬ以下の電気伝導度計で測定された時の電気伝導度を比較した。リゾチームはロシュ製のものを用いた。図１は、試験したクロマトグラフィー担体それぞれの直線状保持データを示す。示す通り、本発明のクロマトグラフィー担体はトヨパールヘキシルー６５０Ｃよりも低い電気伝導度で溶出された。本発明のクロマトグラフィー担体で溶出された電気伝導度は３４ｍＳ／ｃｍであり、トヨパールヘキシル６５０Ｃで溶出された電気伝導度は６４ｍＳ／ｃｍであった。

〔抗体溶液の準備〕
ｍＡｂを含有するＣＨＯ細胞の培養上清１ＬをプロテインＡ担体セルファインＳＰＡ－ＨＣ（ＪＮＣ株式会社製）にて精製し、１８０ｍＬの溶液を得た。次にこの溶液に１Ｍ酢酸を添加し、ｐＨ３．４にし、２５℃で１時間静置し、ウイルス不活化を行った。ウイルス不活化後の溶液に１Ｍトリスを添加し、ｐＨ６．０に調整した。上記溶液の抗体濃度は１３ｍｇ／ｍＬであり、これをｐＨ６．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋５０ｍＭ・ＮａＣｌ緩衝液で希釈し、５．７ｍｇ／ｍＬにし、これをロードサンプルとした。ロードサンプルの抗体濃度は吸光度計で２８０ｎｍの波長の吸光度を測定し、測定された吸光度を１．４で除して算出した。ロードサンプルの抗体量はロードサンプル体積に抗体濃度を乗じて算出した。ロードサンプルの電気伝導度はＥＳ－７１（株式会社堀場製作所製）と３５５２－１０Ｄ（株式会社堀場製作所製）を用いて測定し、７．７ｍＳ／ｃｍであった。

〔ＨＩＣによる精製〕
対照としてトヨパールヘキシルー６５０Ｃ（東ソー株式会社製）と、本発明のクロマトグラフィー担体をそれぞれ１．０６ｍＬのカラム体積のカラムに充填し、分取クロマトグラフィー装置を用いてｐＨ６．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋５０ｍＭ・ＮａＣｌ緩衝液を流速０．２５カラム体積／分で５カラム体積流した後に、ロードサンプルを流速０．２５カラム体積／分で１８．６ｍＬ流し、ｐＨ６．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋５０ｍＭ・ＮａＣｌ緩衝液を流速０．２５カラム体積／分で１０カラム体積流した。ロードサンプルを流し始めてから１８．６ｍＬ分と、ロードサンプルロード後に流したｐＨ６．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液１０カラム体積分を合わせて回収し、フロースループール（ＦＴプール）とした。抗体の回収量はＦＴプールの体積に、回収した溶液の抗体濃度を乗じて算出した。

〔２量体含有量の分析〕
ロードサンプルおよびＦＴプールをサイズ排除クロマトグラフィーで分析し２量体の含有率を測定した。カラムにはＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＳＷｍＡｂＨＲ（東ソー株式会社製）を、ガードカラムにはＴＳＫｇｅｌｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎＳｕｐｅｒＳＷｍＡｂ（東ソー株式会社製）を用いて、移動相にはｐＨ６．７の２００ｍＭリン酸ナトリウム＋１００ｍＭ硫酸ナトリウム緩衝液を用いた。精製溶液は移動相で希釈し、抗体濃度を１ｍｇ／ｍＬにし、これを注入量５０μＬ、カラム温度２５℃、流速０．７ｍＬ／分で分析した。保持時間１２．５分のピークを単量体、１０．５分のピークを２量体、２量体ピークより前の７．８分から９．８分のピークを凝集体とした。単量体、２量体および凝集体ピークの面積の合計を全抗体量とし、単量体、２量体および凝集体のピーク面積からそれぞれの割合を算出した。抗体量に各割合を乗じて、単量体量、２量体量および凝集体量を算出した。単量体回収率はＦＴプールの単量体量をロードサンプルの単量体量で除して算出した。２量体の減少率はロードサンプルの２量体量をＦＴプールの２量体量で除して算出した。

試験したクロマトグラフィー担体それぞれの２量体含有量と回収率を表１に示す。対照の２量体減少率が２．８であったのに対し、本発明のクロマトグラフィー担体では６．７であり対照（トヨパールヘキシルー６５０Ｃ）の２倍以上の減少率を示した。単量体回収率９０％以上を保ちながらフロースルー様式でこれほどの２量体の減少率を示すクロマトグラフィー担体は従来なく、驚くべき結果であった。

表１ＨＩＣによる精製での２量体の減少率

＜実施例２＞
〔抗体溶液の準備〕
ｍＡｂを含有するＣＨＯ細胞の培養上清１ＬをプロテインＡ担体セルファインＳＰＡ－ＨＣ（ＪＮＣ株式会社製）にて精製し、１８０ｍＬの溶液を得た。次にこの溶液に１Ｍ酢酸を添加し、ｐＨ３．４にし、２５℃で１時間静置し、ウイルス不活化を行った。ウイルス不活化後の溶液に１Ｍトリスを添加し、ｐＨ７．０に調整した。その後、ｐＨ７．０の溶液に１Ｍ・ＮａＣｌ溶液を添加し、電気伝導度を１０ｍＳ／ｃｍに調整した。上記溶液の抗体濃度は１０ｍｇ／ｍＬであった。１．０６ｍＬカラム体積に充填されたＣｅｌｌｕｆｉｎｅＭＡＸＩＢ（ＪＮＣ株式会社製）をｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液で平衡化したものに、１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度の溶液を２００ｇ／Ｌ－ｒｅｓｉｎロードし、その後ｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液を１５．９ｍＬロードした。抗体溶液のロードのフロースルーと、１５．９ｍＬロードしたフロースルーを合わせて回収し、ロードサンプルとした。ロードサンプルの抗体濃度は３．３８ｍｇ／ｍＬであり、ｐＨは７．０、電気伝導度は１０ｍＳ／ｃｍであった。抗体濃度は吸光度計で２８０ｎｍの波長の吸光度を測定し、測定された吸光度を１．４で除して算出した。ロードサンプルの抗体量はロードサンプル体積に抗体濃度を乗じて算出した。ロードサンプルの電気伝導度はＥＳ－７１（株式会社堀場製作所製）と３５５２－１０Ｄ（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。

〔ＨＩＣによる精製〕
実施例１の本発明のクロマトグラフィー担体を１．０６ｍＬのカラム体積のカラムに充填し、分取クロマトグラフィー装置を用いてｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液を流速０．２５カラム体積／分で５カラム体積流した後に、ロードサンプルを流速０．２５カラム体積／分で４３．９ｍＬ流し、ｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液を流速０．２５カラム体積／分で１５カラム体積流した。ロードサンプルを流し始めてから４３．９ｍＬ分と、ロードサンプルを流した後のｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液１５カラム体積分を合わせて回収し、フロースループール（ＦＴプール）とした。抗体の回収量はＦＴプールの体積に、回収した溶液の抗体濃度を乗じて算出した。

〔２量体含有量の分析〕
ロードサンプルおよびＦＴプールをサイズ排除クロマトグラフィーで分析し２量体の含有率を測定した。カラムにはＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＳＷｍＡｂＨＲ（東ソー株式会社製）を、ガードカラムにはＴＳＫｇｅｌｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎＳｕｐｅｒＳＷｍＡｂ（東ソー株式会社製）を用いて、移動相にはｐＨ６．７の２００ｍＭリン酸ナトリウム＋１００ｍＭ硫酸ナトリウム緩衝液を用いた。精製溶液は移動相で希釈し、抗体濃度を１ｍｇ／ｍＬにし、これを注入量５０μＬ、カラム温度２５℃、流速０．７ｍＬ／ｍｉｎで分析した。保持時間１２．５分のピークを単量体、１０．５分のピークを２量体、２量体ピークより前の７．８分から９．８分のピークを凝集体とした。単量体、２量体および凝集体ピークの面積の合計を全抗体量とし、単量体、２量体および凝集体のピーク面積からそれぞれの割合を算出した。抗体量に各割合を乗じて、単量体量、２量体量および凝集体量を算出した。単量体回収率はＦＴプールの単量体量をロードサンプルの単量体量で除して算出した。２量体の減少率はロードサンプルの２量体量をＦＴプールの２量体量で除して算出した。

本発明のクロマトグラフィー担体では２量体減少率が６．６であり１４０ｇ／Ｌ－ｒｅｓｉｎの付加においても２量体の減少率が６．６を示した（表２）。

表２１４０ｇ／Ｌ－ｒｅｓｉｎ負荷時のＨＩＣによる精製での２量体の減少率

〔ＨＩＣとＭｉｘｅｄ－Ｍｏｄｅを組み合わせた精製〕
Ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅクロマトグラフィー担体は目的物又は不純物と静電的相互作用や疎水性相互作用、水素結合相互作用など複数の相互作用をする担体で、単一の原理の相互作用をする担体と比較し、広い範囲の条件で目的物と不純物の分離が可能なことが知られている。以下の実施例では抗体精製において不純物であるホストセルタンパク質（ＨＣＰ）やリークしたプロテインAを低減させることに優れたＭｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ担体と、本発明の２量体低減に優れたＨＩＣ担体を組み合わせて抗体精製を実施した。

＜実施例３＞
〔抗体溶液の準備〕
ｍＡｂを含有するＣＨＯ細胞の培養上清１．６ＬをプロテインＡ担体セルファインＳＰＡ－ＨＣ（ＪＮＣ株式会社製）にて精製し、６７ｍＬの溶液を得た。次にこの溶液に１Ｍ酢酸を添加し、ｐＨ３．４にし、２５℃で１時間静置し、ウイルス不活化を行った。ウイルス不活化後の溶液に１Ｍトリスを添加し、ｐＨ５．０に調整した。さらにその溶液に超純水、１Ｍトリスおよび５ＭＮａＣｌを加えてｐＨ７．０、電気伝導度を１０ｍＳ／ｃｍに調製し、最後に０．２μｍのフィルターでろ過した。上記溶液の抗体濃度は１０．５ｍｇ／ｍＬであった。

〔Ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ担体カラムとＨＩＣカラムを直接連結した状態で精製〕
Ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ担体ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＭＡＸＩＢ（ＪＮＣ株式会社製）および本発明の実施例１と同様の方法で製造したＨＩＣ担体ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＰｈｅｎｙｌＦＴ（ＪＮＣ株式会社製）をそれぞれ内径 5 ｍｍのガラスカラムに１．５ｃｍの高さに充填した。次に２本のカラムを、ＰＥＥＫチューブを用いて図２（a）のように接続した。連結したカラムを分取クロマトグラフィー装置に接続しｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液を流速０．０７５ｍＬ／分で通液し平衡化した。次に抗体溶液を流速０．０７５ｍL／分で６．５ｍＬ流し、その後ｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液を流速０．０７５ｍＬ／分で４．５ｍL流した。抗体溶液６．５ｍLおよびその後のｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液４．５ｍLのカラム通過液を合わせて回収し、フロースループール（ＦＴプール）とした。抗体の回収量はＦＴプールの体積に、回収した溶液の抗体濃度を乗じて算出した。

＜実施例４＞
〔Ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ担体とＨＩＣ担体を混合し１本のカラムに充填し精製〕
Ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ担体ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＭＡＸＩＢ（ＪＮＣ株式会社製）および本発明の実施例１の方法で製造したＨＩＣ担体ＣｅｌｌｕｆｉｎｅＰｈｅｎｙｌＦＴ（ＪＮＣ株式会社製）を体積換算で１：１の割合で混ぜ混合スラリーを調整した。調整したスラリーを内径 5 ｍｍのガラスカラムに加え３ｃｍの高さに充填した。（図２（ｂ））充填したカラムを分取クロマトグラフィー装置に接続しｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液を流速０．０７５ｍＬ／分で通液し平衡化した。次に実施例３と同様に調整した抗体溶液を流速０．０７５ｍL／分で６．５ｍＬ流し、その後ｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液を流速０．０７５ｍＬ／分で４．５ｍL流した。抗体溶液６．５ｍLおよびその後のｐＨ７．０の２０ｍＭ酢酸－トリス＋１０ｍＳ／ｃｍ・ＮａＣｌ溶液４．５ｍLのカラム通過液を合わせて回収し、フロースループール（ＦＴプール）とした。抗体の回収量はＦＴプールの体積に、回収した溶液の抗体濃度を乗じて算出した。

〔ＨＣＰ量の分析〕
負荷した抗体溶液およびＦＴプールのＨＣＰ量を、Ｅｌｉｓａｋｉｔ（Ｃｙｇｎｕｓ，Ｆ５５０）を使用して測定した。得られたＨＣＰの重量および測定波長２８０ｎｍでの吸光度から算出した抗体量を用いて、式｛ＦＴプール中のＨＣＰの重量（ｎｇ）／ＦＴプール中の抗体量（ｍｇ）｝から、ＨＣＰ量を濃度（ｐｐｍ）で表した。

〔リークプロテインＡ量の分析〕
負荷した抗体溶液およびＦＴプールのリークプロテインＡ量を、Ｅｌｉｓａｋｉｔ（Ｃｙｇｎｕｓ，Ｆ９１０）を使用して測定した。得られたリークプロテインＡの重量および測定波長２８０ｎｍでの吸光度から算出した抗体量を用いて、式｛ＦＴプール中のリークプロテインＡの重量（ｎｇ）／ＦＴプール中の抗体量（ｍｇ）｝から、リークプロテインＡ量を濃度（ｐｐｍ）で表した。

実施例３および４で得られたＦＴプールの分析結果を表３に、サイズ排除クロマトグラフィー分析のクロマトグラムを図３に示した。本発明のＨＩＣ担体をＭｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ担体と連結または混合した場合、同じ条件の抗体溶液を異なる担体に通液しているにも関わらず、高度に不純物が低減された。通常は異なるクロマト担体はそれぞれの適した条件が異なることから、カラム間で溶液条件の調整が必要となるが本発明のＨＩＣ担体を用いるとその操作が不要となり、より簡便に抗体精製が可能なことが示された。

表３抗体溶液およびカラム精製後のＦＴプールの分析結果

本発明により、２量体の抗体の除去に適したクロマトグラフィー担体と、それを利用したタンパク質の精製方法を提供することができる。

Claims

多孔性粒子を含むベース担体と前記ベース担体に結合した疎水性配位子とを含むクロマトグラフィー担体であって、
前記クロマトグラフィー担体は、グラジエント溶出試験で測定された電気伝導度が３４ｍＳ／ｃｍ以下であるクロマトグラフィー担体。
前記多孔性粒子の平均粒子径が６６～１５０μｍである、請求項１に記載のクロマトグラフィー担体。
前記疎水性配位子が、フェニル、ｎ－ブチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチル、およびｎ－オクタデシルからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１または２に記載のクロマトグラフィー担体。
前記多孔性粒子が、架橋セルロース粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
請求項１～４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体を抗体溶液と接触させる工程と、抗体溶液を回収する工程とを含むことにより、２量体を除去された溶液が得られる、抗体の精製方法。
抗体溶液と接触させる前記工程が、クロマトグラフィー担体を含む容器に、フロースルー様式で抗体溶液を通過させる工程を含む、請求項５に記載の抗体の精製方法。
前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項５または６に記載の抗体の精製方法。
前記抗体が、ヒト抗体、マウス抗体、またはキメラ抗体である、請求項７に記載の抗体の精製方法。