CN100574840C - 免疫球蛋白的纯化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由多孔颗粒组成的分离基质，所述颗粒上固定有抗体结合配体，其中所述配体密度为5.0-10mg/ml；对于大小为11kDa的葡聚糖，其表达为K_av的颗粒的凝胶相分布系数大于0.65，中值粒径为65-84um。所述碳水化合物材料优选为高度交联的琼脂糖。

Description

免疫球蛋白的纯化

技术领域

本发明涉及抗体制备领域，尤其是涉及对抗体进行离析和/或分离的分离基质。本发明还包括含有本发明的分离基质的色谱柱、采用所述分离基质分离抗体的方法、以及从原料中进行大规模纯化抗体的多步骤工艺。

背景

免疫系统由很多相互依赖的细胞类型组成，所述细胞共同保护机体免受细菌、寄生虫、真菌、病毒的感染，以及防止肿瘤细胞的生长。免疫系统的卫士为在宿主的血液中不断漫游的巨噬细胞。当受到感染或免疫激活时，巨噬系统通过吞噬标记有被称为抗原的外来分子的入侵者而产生响应。由T辅助细胞介导的该现象引发一连串复杂的应答，其导致B细胞的激活。而这些B细胞又产生称为抗体的蛋白，所述蛋白与外来入侵者结合。抗体和抗原之间的结合标志着通过吞噬作用或补体系统的活化导致外来入侵者被破环。存在有五种不同类型的抗体或免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们不仅生理作用不同而且它们的结构也不同。从结构角度而言，IgG抗体为被广泛研究的一类特殊的免疫球蛋白，其可能是由于它们在成熟免疫应答中起着显著作用。

目前在一系列不同的人和兽医诊断、卫生保健和治疗应用中对免疫球蛋白的生物活性进行了研究。事实上，在最近的几年中，单克隆抗体和重组抗体结构已经成为目前临床试验中研究的最大一类蛋白，并且FDA批准其用于治疗和诊断。作为对表达系统和生产策略的补充，设计纯化方案以简单、低成本的方式获得高纯度的抗体。

分离免疫球蛋白的传统方法基于对包括免疫球蛋白的蛋白组分的选择性可逆沉淀，同时将其它蛋白组分留在溶液中。典型的沉淀剂为乙醇、聚乙二醇、易溶的即抗无序的盐，例如硫酸铵和磷酸钾、以及辛酸。典型地，这些沉淀方法得到非常不纯的产物，同时耗时、耗力。而且，向原材料中加入沉淀剂使得很难将上清液用于其他目的，从而产生了处理的问题，就大规模纯化免疫球蛋白而言，该问题尤为重要。

离子交换色谱法是一种公知的蛋白分级方法，常用于分离免疫球蛋白。然而，由于带电的离子交换配体会与所有带有相反电荷的化合物反应，因此，离子交换色谱的选择性可能会低于其它的色谱分离。

疏水作用色谱法(HIC)是另一种用于分离免疫球蛋白的方法。但是，疏水基质要求向原材料中加入易溶盐，从而有效结合免疫球蛋白。以连续或逐步的梯度降低易溶盐的浓度，所结合的抗体从基质上释放。如果要求高纯度的产品，推荐采用该疏水作用色谱法并结合进一步的步骤。由此，该方法的一个缺点是需要向原材料中加入易溶盐，由此向大规模用户提出了一个问题而且增加了成本。对于除了细胞培养上清液之外的原材料，例如乳清、血浆和蛋黄，向原材料中加入易溶盐在很多情况下在大规模应用中是不允许的，其原因是，所述盐可能阻止了不含免疫球蛋白的原材料的任意经济上可行的应用。大规模应用的一个额外问题是几千升废物的处理。

嗜硫吸附色谱法是由J.Porath在1985年(J.Porath等；FEBSLetters，第185卷，第306页，1985)引入的一种新的用于分离免疫球蛋白的色谱吸附法。在该篇论文中，描述了在0.5M硫酸钾即易溶盐的存在下二乙烯砜活化的琼脂糖如何显示与免疫球蛋白的特异性结合，所述琼脂糖偶联有包括游离巯基的不同配体。尽管所描述的用于嗜硫吸附色谱法的基质通常显示了良好的性能，但是由于向原材料中加入易溶盐以确保免疫球蛋白的有效结合，会产生上文所述的缺点。

亲和色谱法在分离技术中具有独特、有效的作用，因为这是唯一一种能够基于生物功能或各自的化学结构从而对生物分子进行纯化的技术。高选择性和高效能使得该技术理想地适合于将特定物质从复杂的生物混合物中分离出来。在亲和色谱法中，待纯化的分子被共价连接至不溶支持物上的配体特异性地、可逆地结合，所述配体包括互补结合物质。在有利于其与所述固定配体特异性结合的条件下加入样品。未结合的物质被洗掉，通过将试验条件改变至有利于其解吸的情况下，可以回收感兴趣的物质。亲和色谱法具有浓缩的效果，其能够对大体积的样品进行非常便利的处理。蛋白A和蛋白G亲和色谱法是分离和纯化免疫球蛋白的常见而广泛采用的方法，尤其是分离单克隆抗体，其主要原因是使用方便以及获得的高纯度。

1982年，Colbert等描述了一种蛋白A类材料的基因编码。在US5151350中，第一次描述了对所述基因的成功克隆和表达。该基因的克隆及其核苷酸序列的表征使得本领域技术人员获得一定量的蛋白A类材料核苷酸序列，从而在不同宿主-病媒系统中进行克隆。所述重组生产的蛋白A类材料及其亚片段具有蛋白A结合IgG的Fc区域以及激活多克隆抗体合成的特性。因此，这些物质以与蛋白A相同的方式用于色谱法中。在制药工业中，重组蛋白A色谱法的一个明显优势是消除了分离基质中含有哺乳动物残余物的风险，以及由此的药物产品中含有哺乳动物残余物的风险。

US6399750公开了一种结合IgG的介质，尤其是具有基本基质和基质结合基团的分离介质，所述基团为含有半胱氨酸的重组蛋白A(rProtein A)。该基团的公式为：-B-X-rProtein A，其中B为连接基本基质的桥，X包括来自rProtein A的杂原子N或S。在一优选实施方式中，X为构成硫来源的硫醚，C端残基为rProtein A的半胱氨酸。

市场上具有各种蛋白A色谱产品。例如，Millipore(Billerca，Mass.，USA)提供了用来自金黄色葡萄球菌的蛋白A制成的天然Prosep-A High Capacity，以及采用在大肠杆菌Escherichiacoli中表达的重组蛋白A制成的PROSEP-rPA High Capacity。PROSEP基质由具有互连小孔的玻璃颗粒构成。

McCue等(Journal of Chromatography A，989(2003)139-153：“Evaluation of protein A chromatography media”)研究了两种具有不同孔径大小的蛋白A介质，每种均具有多孔玻璃骨架。较小孔径的材料发现具有较大的静态容量，其提示其原因是具有更大的比表面积以及伴随的更高配体浓度。较小孔径的材料还发现具有更大的动态结合能力。

MabSelect^TM为Amersham Biosciences(Uppsala，瑞典)的蛋白A的色谱产品，尤其适用于从大体积的原料中捕获单克隆抗体。所述配体包括通过C末端半胱氨酸偶联至交联琼脂糖支持物上的重组蛋白A。MabSelect^TM的颗粒中位数直径为85um。

WO2004/074211(Amershanm Biosciences AB)涉及一种制备无机颗粒的方法，所述颗粒具有分级的孔结构。因此，该方法不生产有机颗粒，例如碳水化合物颗粒。

US5672276(BioSepra Inc)涉及改进的多孔固体支撑物以及该支撑物的制备方法和应用。尤其是，公开了钝化的多孔聚合物支撑物，其特征在于可逆的高吸收能力，而且基本没有生物分子的非特异性吸附或者相互作用。种类繁多的非钝化多孔固体基质可以如US5672276中所述进行钝化。这些多孔基质包括(i)无机氧化物支撑物，(ii)“稳定化的”无机氧化物支撑物，通过在表面涂覆疏水聚合物的薄保护层从而防止化学侵析，以及(iii)由有机/聚合物材料单独构成的多孔基质，尤其是疏水聚合物。US5672276中描述了由多糖衍生物例如琼脂糖、葡聚糖和纤维素等衍生物制成的有机离子交换剂具有很多的不足。例如，多糖衍生的离子交换剂在机械强度上不是很稳定，不能抗强酸。因此，根据该参考文献的经钝化的多孔介质被描述与多糖例如碳水化合物材料不同。

最后，Meyer等在“Templating of porous polymeric beads toform porous silica and titania spheres”(Adv.Mater 2002(14)，第23期，第1768-72页)中描述了无机颗粒。因此，在该参考文献中没有公开其上偶联有结合抗体的蛋白配体的碳水化合物颗粒。

然而，不管现有技术如何，仍然需要另一种分离基质以分离抗体或抗体结构，其符合纯度、安全性、效能和成本效益的要求。

附图的简要描述

附图1为一示意图，其中显示动态结合能力(DBC)为根据本发明的分离介质的保留时间的函数。为了比较，同时显示了一个现有技术产品的动态结合能力。

本发明的简要描述

本发明的一方面是一种分离多克隆或单克隆抗体的新的分离基质。其可以通过权利要求所述实现。

本发明的另一方面为允许对抗体进行比现有技术更快速、更有效的纯化的分离基质。其可以通过所附权利要求限定的新的分离基质来实现，当其用于色谱法中时，其结合能力显著提高。

本发明的另一方面为如上所述的分离基质，其适于大规模的操作。更加特殊的方面是所述分离基质，其对原料具有显著提高的结合能力。

本发明的另一方面是装有或填充有根据本发明的分离基质的色谱柱。

另一方面是试剂盒，其包括根据本发明的色谱柱、适于抗体纯化的缓冲液和书面说明。

另一方面是采用根据本发明的分离基质将抗体从液体中分离出来的方法。该分离基质可以位于根据本发明的分离柱中。根据本发明的该方法可以用于获得基本纯的特定抗体物质，或者获得已经将其中的一种或多种不希望的抗体除去的液体。

通过所附权利要求和以下描述，本发明的进一步的实施方式和优点将是显而易见的。

定义

本文中，术语“抗体”或“免疫球蛋白”互换使用。

本文中，术语“配体”是指能够与靶化合物例如抗体交互作用的分子或化合物。

本文中，术语“间隔臂”或“桥”是指将配体与分离基质的支撑物间隔开的元件。分离基质的支撑物还叫作“基本基质”。术语“分离基质”本文中还称为分离介质。

本文中，术语“抗体结合蛋白”是指不论结合机制能够结合抗体的蛋白。

术语“Fc-结合蛋白”是指能够结合抗体的可结晶部分(Fc)的蛋白，包括例如蛋白A和蛋白G，或其任何保持所述结合特性的片段或遗传衍生物或融合蛋白。

术语“洗脱液”为该领域的常规含义，即具有适当PH和/或离子强度、将一种或多种化学物从分离基质上分离出来的缓冲液。

术语“K_av”是指凝胶相分布系数，其是根据以下公式从对于给定大小的分子的洗脱或保留体积V_R(也为V_e)、以及柱的间隙空位体积V₀和柱的几何体积(V_c)计算出的柱的自变量：

K_av＝(V_R-V₀)/(V_c-V₀)

(参见例如“Handbook of process chromatography，A Guide toOptimization，Scale-Up and Validation”(1997)Academic Press，San Siego.Gail Sofer&Lars Hagel编辑，ISBN0-12-654266-X，368页)

本发明的详细描述

第一方面，本发明涉及由多孔颗粒组成的分离基质，该多孔颗粒上固定有抗体结合蛋白配体，其中对于大小为110kDa的葡聚糖，其表示为K_av的基本基质的凝胶相分布系数大于0.65，中值粒径为65至84um。在一个实施方式中，本发明涉及包括多孔颗粒的分离基质，该多孔颗粒上固定有抗体结合蛋白配体，其中配体密度为5.0-10，中值粒径为65至84um。在另一实施方式中，本发明涉及由多孔颗粒组成的分离基质，该多孔颗粒上固定有抗体结合蛋白配体，其中配体密度为5.0-10mg/ml；对于大小为110kDa的葡聚糖，其表示为K_av的基本基质的凝胶相分布系数大于0.65，中值粒径为65至84um。

在一个实施方式中，本发明分离基质的配体包括结合抗体的蛋白，例如蛋白A，G和/或L。在一个实施方式中，所述配体包括Fc结合蛋白。在最有利的实施方式中，所述Fc结合蛋白为蛋白A。在最佳实施方式中，所述配体包括非哺乳动物来源的重组蛋白A。在该文中，术语“包括”蛋白A应解释为包括蛋白A或其功能等同物，其保留了蛋白A结合IgG的特性。所述重组蛋白A配体可以通过单个或多个连接物偶联至颗粒，优选通过半胱氨酸。在一替换实施方式中，所述配体包括κ-结合蛋白，例如蛋白L。

在一特定实施方式中，本发明分离基质的配体包括蛋白A功能结构域的单体、二聚体或多聚体。由此，所述配体可以包括一个或多个域A，B，C，D和E，优选域B和/或域C。在一特定实施方式中，所述二聚体或多聚体包括蛋白Z，其为域B的突变形式，参见例如US5143844(Abrahamsen等)。在一有利的实施方式中，其在保持根据本发明所获得的良好结合能力的同时，有利于定置洗净(CIP)，所述配体包括一个或多个碱稳定的蛋白A功能结构域。由此，在该实施方式中，所述配体包括突变的蛋白，其中一个或多个所述蛋白A结构功能域发生突变，参见例如WO03/080655(Amersham Biosciences)，该专利通过引用的方式结合至本文。在一替换实施方式中，配体包括一个或多个蛋白A的域C。该包括碱稳定的单聚或多聚配体的分离基质很容易由本领域的技术人员制备得到，例如WO03/080655(AmershamBiosciences)中所述。

在一个替换实施方式中，所述配体为抗体结合肽。因此，根据该实施方式的分离基质包含固定有抗体结合蛋白配体的多孔颗粒，其中对于大小为110kDa的葡聚糖，其表示为K_av的基本基质的凝胶相分布系数大于0.65，中值粒径为65至84um。

所述基本基质可以包括由凝胶相分布系数位于指定值以内的任意材料构成的多孔颗粒，其动态结合能力(DBC)如本文所述显著提高。在本发明的另一有利的实施方式中，颗粒即分离基质的支撑物由交联的碳水化合物材料制成，例如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、konjac、角叉菜多糖、gellan、藻酸盐等，其很容易通过标准方法制备得到，例如反悬浮凝胶化(S Hjerten：Biochim Biophys Acta79(2)，393-398(1964))。在一个实施方式中，所述碳水化合物材料为高度交联的琼脂糖，例如Sepharose^TM(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)。

在本发明的最佳实施方式中，所述支撑物为多孔交联的琼脂糖材料，其显示良好的机械性能，由此允许高速流动而不会产生太高的压力。在该实施方式中，在凝胶化以前，所述琼脂糖聚合物已经被烯丙基化。可以根据US6602990(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)、SE0402322(PCS/SE2005/001408)(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)或SE0501610(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)制备所述琼脂糖颗粒。在一个有利的实施方式中，颗粒的制备如US6602990中所述，该专利通过引用的方式结合至本文。简言之，在形成凝胶之前，将具有一个活化位点和一个非活化位点的双功能交联剂引入琼脂糖溶液中，并允许其与琼脂糖的羟基反应，由此其化学结合于琼脂糖上。在该方法的第一步中，形成所述多糖的溶液或分散液。然后通过将其水溶液乳化于有机溶剂中形成多糖凝胶，之后激活所述交联剂的非活化位点，并与多糖的羟基反应。在所述初始交联之后，可以通过常规方法进行进一步的交联。

本发明的分离基质的颗粒为多分散的，可以通过范围为30-140um的粒径限定，优选43-128um，更优选70-84um。本领域另一常用的限定粒径的方式是累积体积分布的中值粒径(d_50v)，对于该分离介质而言，其范围为65-84um，例如大约75um。在另一实施方式中，所述颗粒为单分散的，被限定为粒径74-76um，例如75um。如本领域所公知的，在过程中很容易控制颗粒大小，从乳液中抽提样品，在显微镜下估计颗粒直径，接下来调整搅拌以减小颗粒大小。

根据本发明，可以采用任意公知的方法例如环氧偶合将配体固定至颗粒。在一特定实施方式中，配体密度为5-10mg/ml。本领域的技术人员很容易控制密度，即固定配体的浓度，参见例如Hermanson，GregT.，Mallia，A.Krishna，Smith，Paul K.Immobilized AffinityLigand Techniques，第118页，Academic Press.ISBN 0-12-342330-9.在该文献中还描述了蛋白A例如重组蛋白A的固定的特定方法。

因此，在本发明分离基质的一个实施方式中，对于大小为110kDa的葡聚糖，其表示为K_av的颗粒的凝胶相分布系数大于0.60，优选大于0.65。因此，在一个实施方式中，对于大小为110kDa的葡聚糖，其表示为K_av的颗粒的凝胶相分布系数为0.60-0.90，优选0.65-0.85，更优选0.65-0.75。本领域的技术人员通过调整固体含量很容易控制所述支撑物的凝胶相分布系数。采用K_av值而不采用孔径的准确值等的原因是，对于水溶胶样的琼脂糖，在湿态下准确测量孔径非常难，在水溶胶干燥后估计的孔大小不能真实地反映所述湿的状态。

分离基质的动态结合能力是对分离介质是否适合大规模操作的良好指示，结合力的增加大大改善了工艺的经济节约。在一个实施方式中，本发明为一种分离基质，在2.4分钟的保留时间下，其动态结合能力高于40mg抗体/ml分离基质。在一特定实施方式中，所述分离基质提供了高于35mg/ml分离基质的动态结合能力，例如在35-50范围内，如大约39-40mg/ml分离基质。

因此，如果该分离基质与现有技术例如上述的MabSelect^TM产品相比，本发明的凝胶相分布系数增加，而颗粒大小降低。即使不是直接相关，凝胶相分布系数的增加，即可利用的颗粒体积的增加，通常将伴随着孔径的增加。然而，如上所述，McCue等(Journal ofChromatography A，989(2003)139-153：“Evaluation of protein Achromatography media”)提出，在所报道的研究中，孔径的减小增加了动态结合能力。因此，本发明分离基质的动态结合能力的大幅增加与现有技术的教导相反，因此是非常出人意料的。

即使本发明分离基质的最优选形式是颗粒，但是本发明也包括其它形式，例如整料、滤片或膜；芯片、表面、毛细管等。

第二方面，本发明涉及一包括上述分离基质的色谱柱。该柱中含有根据常规填充方法填充的基质，或装有以扩展床形式操作的基质。对于扩展方式的操作，所述颗粒优选提供高密度的填料，如本领域所公知的。在一个有利的实施方式中，所述柱由任意常规材料例如生物相容塑料构成，例如聚丙烯、不锈钢或玻璃。所述柱可以具有适合于实验室或大规模纯化和/或抗体探测的大小。在一特定实施方式中，根据本发明的柱具有luer接头、管连接件和圆顶螺母。

本发明还包括用于纯化抗体的试剂盒，所述试剂盒包括位于不同腔室中的填充有上述分离基质的色谱柱、一个或多个缓冲液和从原料进行大规模捕获抗体的书面说明。在一特定实施方式中，该试剂盒还包括luer接头、管连接件和圆顶螺母。

第三方面，本发明涉及通过亲和色谱法纯化抗体的方法，该工艺包括将工艺原料与根据本发明的分离基质接触以吸收抗体，对吸附至分离基质上的抗体进行洗涤的选择性步骤，加入洗脱液从而将抗体从分离介质上释放出来，从洗脱液中回收抗体。采用本方法，可以得到大于35mg抗体/ml分离基质，例如大于40mg抗体/ml分离基质的动态结合能力。由此，当实施本方法时，动态结合能力可以为35-50mg抗体/ml分离基质，例如39-40mg抗体/ml分离基质。

本方法可用于从培养液体中和上清液中分离抗体。在一有利的实施方式中，工艺原料包括发酵液。在该实施方式中，从宿主细胞蛋白、DNA、病毒、内毒素、营养素、细胞培养基组分例如抗发泡剂和抗生素、以及与产物相关的杂质例如misfolded样品和聚合物中纯化抗体。在一特定实施方式中，所述原料在与分离基质接触之前，经过机械过滤，因此，流动相为澄清的细胞培养液。吸附的适宜条件是本领域技术人员公知的。

本方法可以用于纯化任何种类的单克隆或多克隆抗体，例如来源于哺乳动物宿主的抗体，例如鼠、啮齿类动物、灵长类动物和人类，或者来源于培养细胞的抗体，例如杂交瘤。在一个实施方式中，回收的抗体为人或人源化抗体。在另一实施方式中，所述抗体选自来自小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、牛、绵羊、山羊、猪和鸡的抗体。所述抗体可以为任何类型，即选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在一个实施方式中，回收的抗体为免疫球蛋白G(IgG)。在一个特殊实施方式中，所述IgG选自人IgG1、人IgG2、人IgG4、人IgGA、人IgGD、人IgGE、人IgGM、小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、兔Ig、仓鼠Ig、豚鼠Ig、牛Ig和猪Ig，优选人IgG1、人IgG2、人IgG4、小鼠IgG2a、兔Ig和豚鼠Ig。因此，在一个实施方式中，抗体为单克隆抗体。众所周知，单克隆抗体技术涉及具有不断复制能力的永生细胞与哺乳动物细胞的融合以产生抗体。所产生的细胞融合或“杂交瘤”接下来将产生位于细胞培养物中的单克隆抗体。在此情况下，应当理解，术语“抗体”还包括抗体片段和包括抗体或抗体片段的任何融合蛋白。因此，本方法可用于分离免疫球蛋白类分子，其具有蛋白A和/或蛋白G和/或蛋白L结合免疫球蛋白的性能。

本方法可以作为常规液相色谱法，其中流动相通过重力和/或泵的作用流经分离基质。因此，在一个实施方式中，分离基质存在于色谱柱中，所述工艺原料和洗脱液流经色谱柱。

在一个替换实施方式中，本发明的该方面涉及通过亲和色谱将一个或多个抗体除去以纯化液体的方法，该工艺包括将液体与根据本发明的分离基质接触以吸附抗体并回收经纯化的液体。该实施方式例如可用于液体为血液或血浆的情况，希望从血液或血浆中除去一种或多种抗体从而获得安全的血液制品。在一个实施方式中，通过加入洗脱液将抗体从分离基质上释放出来，从而制备再次使用的分离基质。

根据本发明的抗体的吸附和洗脱很容易通过标准条件释放，例如类似商业产品所推荐的，参见例如MabSelect^TM操作说明书(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)。因此，通过加入改变分离基质的PH的洗脱液可以进行洗脱例如梯度洗脱。

最后一方面，本发明涉及对抗体进行纯化的多步骤工艺，该工艺包括如上所述的捕获步骤，之后有一个或多个步骤以对抗体进行中间纯化和/或精炼。在一个实施方式中，捕获步骤之后为疏水交互作用和/或离子交换色谱。在一替换的步骤中，捕获步骤之后为多种阴离子或阳离子交换色谱。在本工艺的最佳实施方式中，捕获步骤在MabSelect^TMXtra(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)上进行。

附图的详细描述

附图1的示意图中，对于根据本发明的分离基质(上部的线)和对于现有技术产品(下部的点线)，Y轴为动态结合能力(DBC)(mg抗体/ml分离基质)，其为X轴上的保留时间(分钟)的函数。其清楚地显示，根据本发明的分离基质如何提供高得多的动态结合能力，实际上，高大约30％。

实验部分

这些例子仅仅出于阐述的目的，不应当理解为对本发明的由所附权利要求所限定的范围的限制。下文以及本说明书其他地方给出的全部参考文献通过引用的方式结合在本文。

实施例1：分离基质

通过US6602990(Amersham Biosciences)公开的悬浮凝胶法制备琼脂糖颗粒。尤其是，通过本领域公知的原理适当调整固体含量，制备K_av为0.69的颗粒。进一步，通过调整搅拌的速度和时间，将中值粒径控制为80um。

对上述颗粒进行环氧活化，根据公知的方法，例如Hermanson，GregT.，Mallia，A.Krishna，Smith，Paul K.Immobilizied AffinityLigand Techniques，第118页，Academic Press.ISBN 0-12-342330-9中所述，通过C端将重组蛋白A(rProtein A)偶联至颗粒上。rProteinA配体偶联的配体密度为7.3mg/ml。

用于比较的分离基质为Amersham Biosciences的MabSelect^TM，根据产品说明，其累计体积分布的中值粒径为85um。

实施例2：动态结合能力

根据以下测量如实施例1所述制备的分离基质的动态结合能力(DBC)：在装有所述产品的两个柱中装入中性PH的1.0mg/ml人多克隆IgG。在10％漏过点确定所述能力，结果如附图1所示。

装置

柱的填充

柱(2)    XK16/20                 Amersham Biosciences

填充池   XK16/20                 Amersham Biosciences

泵       25ml/分钟，例如P-900    Amersham Biosciences

安全阀   0.3MPa                  Amersham Biosciences

压力计

色谱

AKTA^TM Explorer 10或AKT FPLC^TM(Amersham Biosciences)分光光度计，双光束

化学试剂

乙醇            99.5％分光光度

氯化钠          p a

磷酸二氢钠p a   Baker    M＝137.99g/mol

氢氧化钠        p a      Prolabo         M＝40.00g/mol

柠檬酸钠        p a      Merck           M＝75.07g/mol

盐酸            p a

Gammanorm       165mg/ml Octapharma

溶液

缓冲液

填充液1：含有0.25M NaCl的20％(v/v)乙醇

填充液2：20％乙醇

吸附缓冲液：含有0.15M NaCl的0.020M NaH₂PO₄，用浓氢氧化钠溶液将PH调整至7.4±0.05

解吸液：用盐酸将PH调整至3.0±0.05的0.1M柠檬酸钠。

IgG样品溶液

用吸附缓冲液稀释Gammanorm制备1.00±0.01mg/ml的样品溶液。应当在280nm处通过分光光度法测量吸光度，检查样品溶液(1+1稀释后)的浓度。采用1.38ml/mg*cm作为吸光度系数计算正确的浓度。

柱的填充

凝胶预处理

对位于玻璃过滤漏斗上的50ml凝胶用填充液1清洗5分钟。采用真空吸干5分钟。小心混合，称取两份14.3g放于两个烧杯中。加入～25ml填充液1。

填充

将填充池通过连接件安装至柱上。测量并标记所需的床高度。定量转移凝胶，并装入填充液1。用填充液2以25ml/分钟填充5分钟，向下流动的最大压力为0.3MPa。在流动过程中标记床的高度。除去填充池，在凝胶上安装顶部接头，以10ml/分钟的流速流动5分钟以上。如果需要，将床高度调整或重填至10.0±0.3cm。

程序

装柱的控制

通过注入丙酮溶液通过柱检查柱的填充，计算所得到的峰的对称性。制备100mg丙酮/ml吸附缓冲液的溶液。向柱中以5ml/分钟注入50ul丙酮溶液。采用AKTA系统，或根据以下描述评价或计算峰不对称因子：

峰不对称因子计算为B/A的绝对值，其中A和B为最大峰高度的保留体积减去10％峰高度的保留体积。如果对称性在0.80-1.60之间，则所述柱被认可。

确定漏过能力

所述分析应当基于在控制的室温下的两个柱，23±1℃。以流动相速率为250cm/小时确定漏过能力。根据6.3部分检查流速。将吸附缓冲液通过旁路位置，直至达到稳定的基线。自动调零，加入35ml IgG溶液通过旁路，以得到稳定的100％的信号。重要的是，在整个分析过程中流速是一致的。当吸附缓冲液再次到达旁路位置的稳定基线之后，用5个柱体积的吸附缓冲液平衡所述柱。自动调零，以流动相速率250cm/h(8.38ml/分钟)向柱中加入100个柱体积的IgG溶液。

校准

必须相对于体积分配量对所述色谱系统进行仔细地校准。定期根据仪器手册进行校准，并在每次分析前对用于加样的泵检查流速。

评价

在10％漏过点q_10％评价动态结合能力。在280nm处检测UV吸光度。确定并记录100％UV信号(A_100％)，以及对应于没有结合的IgG亚类(从加样起60ml处确定)的UV信号(A_sub)。柱体积(V_c)和样品原料的浓度(C_o)(两位小数)也用于计算。

动态结合能力计算为：直至柱流出物中的IgG浓度为原料中IgG浓度的10％时向柱中装入的IgG量。所装入的量对10％漏出之前通过柱的IgG量进行校准。

$q_{10\%}=\frac{C_0}{V_C}[V_{\mathrm{app}}-V_{\mathrm{sys}}-\underset{V_{\mathrm{sys}}}{\overset{V_{\mathrm{app}}}{\∫}}\frac{A\left(V\right)-A_{\mathrm{sub}}}{A_{100\%}-A_{\mathrm{sub}}}*\mathrm{dv}]$

其中C₀为原料浓度，V_c为柱体积，V_app为直至10％漏过时加入的体积，V_sys为系统的死体积(不包括柱的死体积)，所述积分为从柱中流出的洗脱液中IgG的总量直至发生10％漏出，A(V)为给定的加入体积的吸光度值，A_sub为非结合的IgG亚类的吸光度贡献。单个柱之间的动态结合能力的差别不应当超过1.2mg/ml填充凝胶。

精确度

所述能力的相对标准偏差为2％。

参考文献

Handbook of Process Chromatography，A Guide toOptimization，Scale-up and validation(1997)，Academic Press，San Diego.Gail Sofer& Lars Hagel编辑，ISBN 0-12-654266-性，308-310页。

实施例3：计算凝胶相分布系数

原理

通过凝胶过滤确定根据实施例1的颗粒的凝胶相分布系数。将具有不同尺寸的两个葡聚糖通过填充的HR16/30柱。检测每个葡聚糖的保留体积，并用来计算K_av，该值用于描述对于特定分子量可用的颗粒体积部分。从K_av值报道了Mp110000的K_av值。

装置

填充：

柱        HR16/30

填充管    HR16/30

泵        AKTA^TM P-900泵*

选择性测试

AKTA explorer 10系统*

对照        UNICORN^TM

样品注入    Autosampler A-900

进样环路    200ul

泵          P-900

检测器      Shimadzu RI-检测器

*或等同物

化学试剂

填充的流动相为蒸馏水，选择性测试的流动相为0.20M的位于蒸馏水中的NaCl。

在流动相为蒸馏水的柱中注入2％丙酮，对柱填充进行检测。

在选择性测试中采用的葡聚糖为：

天然葡聚糖    5mg/ml     Amersham Biosciences

Mp＝196300    10mg/ml    Pharmacosmos

Mp＝66700     8mg/ml     Pharmacosmos

所有的葡聚糖用0.20M NaCl稀释，除了Mp＝196300用0.25M NaCl稀释，其用作柱的总体积的标记物。

安全指示

不需要采取特别的安全预防措施。

样品预处理

用0.20M NaCl对位于玻璃过滤器上的凝胶进行清洗，并干燥，直至凝胶发生开裂。然后将60ml干凝胶溶解于60ml 0.20M NaCl中，形成凝胶浆。

校准

根据各自的手册对使用过的仪器进行对照和校准。

程序

一个分析包括填充被测试两次的一个柱子，即每个葡聚糖注入两次。

装柱

根据以下方法对HR16/30柱(Amersham Biosciences)进行装柱：采用填充连接器，将该柱通过底部接头连接至填充管。将柱放在柱支架上，填充管位于底部。将填充管接头与泵连接，并一点一点填充0.5cm水。转移入凝胶浆，填充0.2M NaCl，将过滤器和底部接头放于柱上。

施加22ml/分钟的流速，将柱子右旋(turn the column right)，连续泵送10分钟。用Pasteur吸液管除去多余的凝胶。将过滤器放于顶部，打开顶部接头，调整床表面。施加10ml/分钟的流速，直至床稳定，再次调整接头，然后再次施加流速以检查床的稳定性。如果没有观察到床的进一步压缩，则认为其稳定了。

通过注入2％丙酮溶液(在蒸馏水中)检测装柱质量。在注入之前不需要达到平衡，其原因是，流动相没有改变。在1.2CV期间以150cm/h(5ml/min)洗脱丙酮。从所得到的峰计算板数和不对称因子。接受标准：板数＞2400N/m，不对称性0.7-1.3。

板数的计算：N/L

N          ＝5.54*(t_R/W_h)²

t_R         ＝保留时间

W_h         ＝半高时的峰宽

L          ＝柱高(m)

在10％峰高处测量不对称因子。

选择性测试

在接受装柱标准之后，可以运行选择性测试方法，其包括以下步骤：

1.柱平衡，至少1.5CV 0.20M NaCl

2.用A-900自动加样仪注入200ul葡聚糖

3.用1.3CV的流动相进行洗脱。

对于每个葡聚糖或葡聚糖混合物*重复步骤2和3。

*可以根据以下方法混合葡聚糖，但是也可以一次注射一个。

混合1：天然葡聚糖+Mp66700

混合2：0.25M NaCl中的Mp196300

误差源

泵中存在的空气可以给出错误的流速，因此在运行过程中进行控制以使压力稳定是非常重要的。

评价

从所得到的色谱图的RI曲线得到每个葡聚糖的保留体积，其中峰定义为所述葡聚糖的RI最大值。然后从以下公式计算葡聚糖的K_av：

K_av＝(V_R-V₀)/(V_C-V₀)

其中：

V_R＝对于额外柱体积而调整的经洗脱的葡聚糖的保留体积，ml

V₀＝对于额外柱体积而调整的间隙体积(天然葡聚糖的保留体积)(ml)

V_C＝柱的几何体积(床高，cm·柱的表面积，cm²)

然后对葡聚糖进行logMp对K_av值作图。每个葡聚糖具有两个值导致在每个示意图上有四个值。对两个葡聚糖进行线性内插得到对应于所报道的110000分子质量(Mp值)的K_av值。

Claims (26)

1.一种由多孔碳水化合物颗粒组成的分离基质，所述颗粒上固定有抗体结合蛋白配体，其中所述配体密度为5.0-10mg/ml；以及中值粒径为6 5-84μm。

2.如权利要求1所述的分离基质，其中对于大小为11kDa的葡聚糖，其表达为K_av的凝胶相分布系数大于0.65。

3.如权利要求1或2所述的分离基质，其中对于大小为11kDa的葡聚糖，其表达为K_av的凝胶相分布系数为0.65-0.85。

4.如权利要求1或2所述的分离基质，其中所述配体密度为5.5-9.0mg/ml。

5.如权利要求1或2所述的分离基质，其中所述中值粒径为75μm。

6.如权利要求1或2所述的分离基质，其中所述颗粒包括交联多糖材料。

7.如权利要求6所述的分离基质，其中所述交联多糖材料为交联琼脂糖。

8.如权利要求7所述的分离基质，其中所述琼脂糖聚合物在凝胶化之前已经烯丙基化。

9.如权利要求1或2所述的分离基质，其提供了保留时间为2.4分钟时大于40mg抗体/ml分离基质的动态结合能力。

10.如权利要求1或2所述的分离基质，其中所述配体包括Fc结合蛋白。

11.如权利要求10所述的分离基质，其中所述Fc结合蛋白为蛋白A。

12.如权利要求11所述的分离基质，其中所述Fc结合蛋白为非哺乳动物来源所产生的重组蛋白A。

13.如权利要求1或2所述的分离基质，其中所述配体包括蛋白A功能结构域的单体、二聚体或多聚体。

14.如权利要求13所述的分离基质，其中一个或多个所述蛋白A功能结构域发生突变。

15.一种包括如权利要求1-14任意一项所述的分离基质的色谱柱。

16.一种从原料中大规模捕获抗体的试剂盒，所述试剂盒包括，位于不同腔室的填充有如权利要求1-14任意一项所述的分离基质的色谱柱，一个或多个缓冲液和其使用的书面说明书。

17.通过亲和色谱纯化抗体的方法，该工艺包括将工艺原料与如权利要求1-14任意一项所述的分离基质接触、任选的对吸附至分离基质上的抗体进行洗涤的步骤、加入将抗体从分离基质上释放出来的洗脱液、以及从洗脱液中回收抗体。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述工艺原料包括发酵液。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述原料在与分离基质接触之前经过机械过滤。

20.如权利要求17或18所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。

21.如权利要求17或18所述的方法，其中所述分离基质存在于色谱柱中，所述工艺原料和洗脱液通过所述色谱柱。

22.一种通过亲和色谱从液体纯化一种或多种抗体的方法，该工艺包括将所述液体与如权利要求1-14任意一项所述的分离基质接触，以吸收抗体，并回收经纯化的液体。

23.如权利要求21所述的方法，其中通过加入洗脱液将所述抗体从分离基质中释放出来，从而制备用于再次使用的分离基质。

24.一种对抗体进行纯化的多步骤工艺，该工艺包括如权利要求18所述的步骤，之后为对抗体进行中间纯化和/或精炼的一个或多个步骤。

25.如权利要求24所述的工艺，其中所述捕获步骤之后为疏水交互作用和/或离子交换色谱。

26.如权利要求20所述的工艺，其中所述捕获步骤之后为多种形式的阴离子或阳离子交换色谱。

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