JP2022036976A - 阻害性キメラ抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

【課題】正のＴ細胞シグナルをもたらすＴ細胞のオフ標的活性化を予防するために適切な負のシグナルを生じさせるために用いられ得る負のまたは阻害性ＣＡＲを提供する。【解決手段】抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインが、免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｓｗｉｔｃｈ Ｍｏｔｉｆ）ＩＴＳＭを含み、前記ＩＴＳＭがアミノ酸配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、Ｘ１がアミノ酸であり、Ｘ２がアミノ酸であり、Ｘ３がアミノ酸であり、Ｘ４がＶまたはＩである、阻害性キメラ抗原受容体を提供する。【選択図】図５－１

Description

本発明は、負のＴ細胞シグナルを誘導するキメラ抗原受容体（Ｎ－ＣＡＲまたはＩＣＡＲ）、ならびにこのようなＮ－ＣＡＲおよび正のＴ細胞シグナルを誘導するＣＡＲ（Ｐ－ＣＡＲ）を含むＴ細胞、ならびに治療法におけるそれらの使用に関する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いる再指向Ｔ細胞標的化に基づくＴ細胞療法は、臨床において、特に腫瘍学において大きな将来性を示し始めている（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｌ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ２８；Ｌｅｅ ＤＷら、Ｌａｎｃｅｔ．２０１４ Ｏｃｔ １０．ｐｉｉ：Ｓ０１４０～６７３６（１４）６１４０３～３、またはＧｒｕｐｐ ＳＡら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１３ Ａｐｒ １８；３６８（１６）：１５０９～１８を参照されたい）。本分野が熱意を持たれてきていることを考慮して、ＣＡＲ Ｔ細胞療法のための適切な標的を同定するための多大なる努力がなされている。このような治療学の潜在力を考慮すると、このような治療法のための新規な標的を同定する本分野の能力は、オン標的オフ組織（つまり、オフ腫瘍）活性に対する懸念によって妨げられている。このようなイベントは、有効性を弱めるだけでなく、最近の臨床イベントによって実証されるように、安全性についての大きな課題ももたらす（Ｍｏｒｇａｎ ＲＡら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ａｐｒ；１８（４）：８４３～５１；Ｍｏｒｇａｎ ＲＡら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３ Ｆｅｂ；３６（２）：１３３～５１、またはＬｉｎｅｔｔｅ ＧＰら、Ｂｌｏｏｄ．２０１３ Ａｕｇ ８；１２２（６）：８６３～７１を参照されたい）。効果的でありながらもこれらの安全性の懸念を軽減するための臨床的アプローチもまた、注入型のＣＡＲ Ｔ細胞治療実体に直接的または間接的に作用する。
ＣＡＲ Ｔ細胞のオン標的オフ組織活性に付随するこれらの安全性の問題に対処するため、およびこの治療学様式を行いやすい標的空間を広げるために、Ｔ細胞シグナル伝達を調節するための論理ゲートを生み出すことが重要視されてきている（Ｆｅｄｅｒｏｖ ＶＤら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｄｅｃ １１；５（２１５）：２１５ｒａ１７２を参照されたい）。
１つのこのようなアプローチは、Ｔ細胞が２つ以上のＣＡＲをその細胞表面に発現するＮＯＴゲートの使用を伴う。正のＴ細胞シグナルをもたらすＣＡＲ（Ｐ－ＣＡＲ）は、腫瘍抗原に結合して、Ｔ細胞の活性化および／もしくは増殖、ならびに／またはサイトカインの分泌、ならびに／またはＣＤ３ゼータもしくは他の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するモチーフによって仲介される細胞傷害性を可能にするが、負のＴ細胞シグナルをもたらすＣＡＲ（Ｎ－ＣＡＲ）は、オフ組織抗原に結合し、正のシグナルを弱めるかまたは無効にする。
したがって、オン組織（オン腫瘍）シナリオの元では、Ｔ細胞はＰ－ＣＡＲシグナルのみを受け取り、その後、活性化および細胞傷害性を得るが、オフ組織（オフ腫瘍）シナリオでは、Ｔ細胞は、Ｐ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲシグナルの両方を受け取り、それによりＮ－ＣＡＲシグナルが下流シグナル伝達を弱めるかまたは終わらせ、その結果、活性化および細胞傷害性が損なわれるかまたはなくなる。
したがって、Ｐ－ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｐ－ＣＡＲを含むＴ細胞）のオフ標的活性化を予防するために適切な負のシグナルを生じさせるために用いられ得る負のまたは阻害性ＣＡＲ（Ｎ－ＣＡＲ）が必要である。このような負のシグナルが、短期間で、可逆的に、かつこのようなＮ－ＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞のオン標的オフ組織活性を弱めるかまたは予防するために十分であれば、さらに有利であろう。
通常技術
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を採用する。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献に十分に説明されている。
定義
以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解される。用語「単離された分子」は、その起源または由来源が理由で（１）天然では会合している（分子の天然状態で分子に付随している）成分と会合していない、（２）同一の由来源、例えば種、分子が発現される細胞、ライブラリーなどに由来する他の分子をほとんど含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）天然にはない、分子（ここで、分子は、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である）を指す。したがって、化学合成された、またはその天然の起源である細胞株と異なる細胞株において発現された分子は、その天然で会合している成分から「単離されている」ことになる。分子はまた、当技術分野において周知の精製技術を用いる単離によって、天然で会合している成分をほぼ含まないようにされ得る。分子の純度または均質性は、当技術分野において周知の多くの手段によってアッセイされ得る。例えば、ポリペプチド試料の純度は、当技術分野において周知の技術を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動およびポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を用いてアッセイされ得る。特定の目的では、ＨＰＬＣまたは当技術分野において周知の他の精製手段を用いることによって、より高い分解を得ることができる。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書において用いる場合、この用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、別段の特定がない限り、特異的結合について抗体と競合するそのあらゆる抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体配置も包含する。抗原結合部分には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメおよびラクダ抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、一本鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、およびｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ならびに、ポリペプチドへの特異的な抗原結合をもたらすために十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭなどのあらゆるクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、いかなる特定のクラスのものである必要もない。抗体重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンにはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
抗体の「可変領域」は、単独のまたは組み合わされた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野において知られているように、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からそれぞれなる重鎖および軽鎖の可変領域は、超可変領域としても知られており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。特に、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸残基における（例えばフレームワーク領域における）置換での、対象可変領域の変異体が望ましい場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは保存的なアミノ酸置換は、対象可変領域を対象可変領域と同じ標準的クラスにおけるＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６（４）：９０１～９１７、１９８７）。
特定の実施形態において、ＣＤＲの確定的な描写および抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を明らかにすることによって、および／または抗体－リガンド複合体の構造を明らかにすることによって行われる。特定の実施形態において、これは、Ｘ線結晶学などの当業者に知られている様々な技術のいずれかによって行うことができる。特定の実施形態において、様々な分析方法を、ＣＤＲ領域を同定または近似するために採用することができる。このような方法の例には、限定はしないが、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＡｂＭ定義、接触定義、および立体構造定義が含まれる。
Ｋａｂａｔの定義は抗体における残基の番号付けに標準的であり、ＣＤＲ領域を同定するために典型的に用いられる。例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：２１４～８を参照されたい。Ｃｈｏｔｈｉａの定義はＫａｂａｔの定義に類似しているが、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、特定の構造ループ領域の位置を考慮する。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１～１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７～８３を参照されたい。ＡｂＭ定義は、抗体の構造をモデリングする、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐによって生産された一連の組み込み型コンピュータプログラムを用いる。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、８６：９２６８～９２７２；「ＡｂＭ（商標），Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．を参照されたい。ＡｂＭ定義は、知識データベースと、Ｓａｍｕｄｒａｌａら、１９９９、「Ａｂ Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．、３：１９４～１９８によって記載されているものなどのａｂ ｉｎｉｔｉｏ方法との組み合わせを用いて、正の配列から抗体の三次構造をモデリングする。接触定義は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５：７３２～４５を参照されたい。ＣＤＲの「立体構造の定義」として本明細書において言及される別のアプローチにおいて、ＣＤＲの位置は、抗原の結合に対するエンタルピーの寄与をもたらす残基として同定され得る。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６～１１６６を参照されたい。さらに他のＣＤＲ結合の定義は、上記のアプローチの１つに厳密に従わないこともあるが、特定の残基または残基群が抗原の結合に大きく影響しないという予測または実験上の所見に照らしてそれらが短くなったり長くなったりし得るものの、それでもＫａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重複する。本明細書において用いる場合、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含む、当技術分野において知られているあらゆるアプローチによって定義されたＣＤＲを指し得る。本明細書において用いられる方法は、これらのアプローチのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得る。２つ以上のＣＤＲを含有するあらゆる所与の実施形態で、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、伸長定義、ＡｂＭ定義、接触定義、および／または立体構造定義のいずれかに従って定義され得る。
当技術分野において知られているように、抗体の「定常領域」は、単独のまたは組み合わされた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
本明細書において用いる場合、「モノクローナル抗体」は、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかに存在し得る考えられる天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、ほぼ均質な抗体集団から得られているという抗体の特徴を指しており、いずれかの特定の方法による抗体の生産を要すると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または、米国特許第４，８１６，５６７号において記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２～５５４において記載されている技術を用いて生成されるファージライブラリーから単離され得る。本明細書において用いる場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）である非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲの残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても取り込まれたＣＤＲにもフレームワーク配列にも見られないが抗体の性能をさらに洗練し最適化するために含まれている残基を含み得る。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または、本明細書において開示されているようなヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すものである。
用語「エピトープ」は、抗体の抗原結合領域の１つまたは複数で抗体によって認識および結合され得る、分子の部分を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの表面分子群からなることが多く、特異的な三次元構造上の特徴および特異的な電荷特徴を有する。一部の実施形態において、エピトープはタンパク質エピトープであり得る。タンパク質エピトープは、線状または立体構造であり得る。線状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用点の全ては、タンパク質の正のアミノ酸配列に沿って線状に生じる。「非線状エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原性タンパク質内の不連続なポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。用語「抗原性エピトープ」は、本明細書において用いる場合、当技術分野において周知のあらゆる方法によって、例えば、従来の免疫アッセイによって決定される、抗体が特異的に結合し得る抗原の一部として定義される。抗原上の望ましいエピトープが決定されると、本明細書において記載されている技術を例えば用いて、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。あるいは、発見プロセスの間に、抗体の生成および特徴付けによって、望ましいエピトープについての情報を解明することができる。この情報から、同一のエピトープへの結合について抗体を競合スクリーニングすることが可能となる。これを達成するためのアプローチは、抗原への結合について互いに競合または交差競合する抗体を見出すための競合研究および交差競合研究を行うことである。
用語「シグナル伝達ドメイン」は、第２のメッセンジャーを生成すること、またはこのようなメッセンジャーに対して応答してエフェクターとして機能することによる定義されたシグナル伝達経路を介して、細胞内の情報を伝達することによって作用して細胞活性を調節する、タンパク質の機能的部分を指す。
用語「オフ組織抗原」（またはオフ腫瘍抗原）は、非腫瘍組織上に存在し、目的の腫瘍（腫瘍抗原に対するＰ－ＣＡＲおよびオフ組織抗原に対するＮ－ＣＡＲを含む本発明の細胞によって治療される腫瘍）上に存在しない、または腫瘍抗原（すなわち、目的の腫瘍上に存在し、Ｐ－ＣＡＲによって標的化される抗原）のレベルと比較して格段に低いレベルで目的の腫瘍上に存在するだけの抗原を指す。
用語「抗腫瘍効果」は、限定はしないが、例えば腫瘍容積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、余命の延長、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、またはがん状態に伴う様々な生理学的症候の改善を含む、様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、第一に腫瘍発生の予防における本発明の細胞の能力によって現れ得る。
用語「自己移植の」は、その個体内にそれが後ほど再導入される同一の個体に由来する、あらゆる材料を指す。
用語「同種異系の」は、材料が導入される個体と同種の異なる動物に由来するあらゆる材料を指す。遺伝子が１つまたは複数の遺伝子座で同一でない場合に、２以上の個体が互いに同種異系であると言われる。一部の態様において、同一種の個体に由来する同種異系材料は、抗原的に相互作用するには遺伝的に十分に似ていない可能性がある。
用語「異種の」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
用語「がん」は、異常細胞の迅速かつ制御されていない成長を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して身体の他の部分に広がり得る。様々ながんの例が本明細書において記載され、これには、限定はしないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、肝臓がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんなどが含まれる。
用語「保存的な配列修飾」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特徴に顕著に影響しないまたは改変しない、アミノ酸修飾を指す。このような保存的な修飾には、アミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。修飾は、当技術分野において知られている標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異生成およびＰＣＲを用いる突然変異生成によって、本発明の抗体または抗体断片内に導入され得る。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝鎖状側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、本発明のＣＡＲ内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、改変されたＣＡＲは、本明細書において記載される機能アッセイを用いて試験することができる。
一部の実施形態において、アミノ酸配列の「断片」は、前記アミノ酸配列よりも短い。一部の実施形態において、アミノ酸配列の断片は、前記アミノ酸配列よりも少なくとも１％、５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％短い。一部の実施形態において、アミノ酸配列の断片は、前記アミノ酸配列と比較して少なくとも１、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００アミノ酸短い。
別段の特定がない限り、アミノ酸配列またはアミノ酸配列を表す式の左から右への方向付けは、従来の左から右への方向付けであるＮ末端からＣ末端の方向付けを用いて開示される。
ドメインのＮ末端隣接領域は、前記ドメインのＮ末端アミノ酸に直接隣接するアミノ酸配列を指す。ドメインのＣ末端隣接領域は、前記ドメインのＣ末端アミノ酸に直接隣接するアミノ酸配列を指す。例えば、配列ｓｅｑ１－ＩＴＩＭ－ｓｅｑ２において、ｓｅｑ１はＩＴＩＭ細胞内ドメインのＮ末端隣接領域であり、ｓｅｑ２はＩＴＩＭ細胞内ドメインのＣ末端隣接領域である。別の実施例において、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域は、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインのＩＴＩＭモチーフのＮ末端アミノ酸に直接隣接するアミノ酸配列である。別の実施例において、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域は、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインのＩＴＳＭモチーフのＣ末端アミノ酸に直接隣接するアミノ酸配列である。
別の実施例において、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域は、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインのＩＴＩＭのＮ末端アミノ酸に直接隣接するアミノ酸配列である。別の実施例において、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域は、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインのＩＴＩＭのＣ末端アミノ酸に直接隣接するアミノ酸配列である。
別の実施例において、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域は、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインのＩＴＳＭのＮ末端アミノ酸に直接隣接するアミノ酸配列である。別の実施例において、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域は、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインのＩＴＳＭのＣ末端アミノ酸に直接隣接するアミノ酸配列である。
用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合によって誘導され、それによってシグナル伝達イベント、例えば限定はしないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達を仲介する、正の応答を指す。刺激は、特定の分子の改変された発現、例えばＴＧＦ－βの下方調節および／または細胞骨格構造の再編成などを仲介し得る。
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合した外来抗原をその表面上に提示する、補助細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、これらの複合体を、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて認識し得る。ＡＰＣは抗原をプロセシングし、それらをＴ細胞に提示する。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、本明細書において用いる場合、分子の細胞内部分を指す。
用語「コードする」は、定義されたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれかおよびその結果生じる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によって細胞または他の生物学的系においてタンパク質が生産される場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に同一であり通常は配列表に示されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖との両方が、その遺伝子もしくはｃＤＮＡのタンパク質または他の生成物をコードすると言われ得る。
別段の特定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり同一のアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という表現には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型ではイントロンを含有し得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
用語「効果的な量」または「治療上効果的な量」は、本明細書において区別せずに用いられ、特定の生物学的結果を得るために効果的な、本明細書において記載されるような化合物、製剤、材料、または組成物の量を指す。
用語「内因性」は、生物、細胞、組織、または系の内部に由来する、または内部で生産されるあらゆる材料を指す。
用語「外因性の」は、生物、細胞、組織、または系の外部から導入される、または外部で生産されるあらゆる材料を指す。
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
用語「移入ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内側に送達するために用いられ得る、組成物を指す。多くのベクターが当技術分野において知られており、これには、限定はしないが、線状ポリヌクレオチド、イオン化合物または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが含まれる。したがって、用語「移入ベクター」には、自律複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどをさらに含むと解釈されるべきである。ウイルス移入ベクターの例には、限定はしないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが含まれる。
用語「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に機能可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含む。発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において提供され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソーム内に含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野において知られている全ての発現ベクターが含まれる。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルスファミリーの一属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという点で、レトロウイルスの間で特有である。これらは大量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡ内に送達し得、そのため、これらは、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶが、レンチウイルスの全ての例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３～１４６４（２００９）において提供されているような自己不活化レンチウイルスベクターを特に含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。診療所において使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、限定はしないが、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが含まれる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に知られていよう。
用語「相同」または「同一性」は、２つのポリマー分子の間、例えば２つの核酸分子、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子の間、または２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置に同一の単量体サブユニットがある場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置にアデニンがある場合、これらはその位置で相同または同一である。２つの配列の間の相同性は、適合するまたは相同な位置の数の直接的な関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５つの位置）が相同であれば、２つの配列は５０％相同である。位置の９０％（例えば、１０のうち９）が適合しているかまたは相同であれば、２つの配列は９０％相同である。
用語「機能可能に連結している」または「転写制御」は、異種核酸配列の発現をもたらす、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と機能可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコード配列に機能可能に連結している。機能可能に連結しているＤＮＡ配列は互いに連続的であり得、例えば２つのタンパク質コード領域を繋ぐ必要がある場合には、同一のリーディングフレーム内にある。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において、あらゆる長さのアミノ酸鎖を指すために区別せずに用いられる。鎖は線状または分枝鎖状であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、かつ／または非アミノ酸によって中断され得る。この用語はまた、天然に、または介入によって、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくはあらゆる他の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸鎖を包含する。この定義にさらに含まれるものは、例えば、アミノ酸（例えば非天然アミノ酸などを含む）の１つまたは複数の類似体および当技術分野において知られている他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは一本鎖または会合した鎖として生じ得ることが理解される。
当技術分野において知られているように、本明細書において区別せずに用いられる「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、あらゆる長さのヌクレオチド鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖に組み込まれ得るあらゆる基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖の組み立ての前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによって、ポリマー化の後にさらに修飾され得る。他のタイプの修飾には、例えば、「キャップ」、類似体での１つまたは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）での、および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）でのヌクレオチド間修飾、懸垂部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）を含有するヌクレオチド間修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）でのヌクレオチド間修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含有するヌクレオチド間修飾、修飾された連結（例えば、アルファアノマー核酸など）でのヌクレオチド間修飾、およびポリヌクレオチドの未修飾形態が含まれる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えばホスホン酸基、リン酸基によって置き換えられ得るか、標準的な保護基によって保護され得るか、またはさらなるヌクレオチドに対するさらなる連結を準備するために活性化され得るか、または固体担体にコンジュゲートされ得る。５’および３’末端のＯＨはリン酸化され得るか、またはアミンでもしくは１から２０の炭素原子からなる有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｏ－アリル、２’－フルオロ－、または２’－アジド－リボースを含む当技術分野において一般的に知られている類似体形態のリボースまたはデオキシリボース糖、炭素環糖類似体、アルファ－またはベータ－アノマー糖、アラビノース、キシロース、またはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含有し得る。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、別の連結基によって置き換えられ得る。これらの別の連結基には、限定はしないが、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は独立してＨであるか、または、置換されたもしくは置換されていない、エーテル（－Ｏ－）連結を含有していてもよいアルキル（１～２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルである）によって置き換えられている実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド内の全ての連結が同一である必要はない。先の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書において区別せずに用いられる）抗体は、当技術分野においてよく理解されている用語であり、このような特異的または優先的な結合を判定するための方法もまた、当技術分野において周知である。分子は、別の細胞または物質とよりも、特定の細胞または物質とより頻繁に、より迅速に、より長い期間、および／またはより強い親和性で反応するかまたは会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質に結合するよりも強い親和性、親和力で、より容易に、および／またはより長い期間結合する場合、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートの組み込みのためのベクターのレシピエントであり得るかまたはレシピエントである、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、元の親細胞に必ずしも完全に同一（形態学上またはゲノムＤＮＡの相補性において）である必要はない。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書において用いる場合、第１の抗体またはその抗原結合部分が第２の抗体またはその抗原結合部分の結合に十分に類似した様式でエピトープに結合して、第１の抗体とその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の存在下で、第２の抗体の不存在下での第１の抗体の結合と比較して、検出可能に減少することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合もまた第１の抗体の存在下で検出可能に減少するという別の場合もあり得るが、必ずしも当てはまるわけではない。すなわち、第２の抗体が第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第１の抗体は第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害し得る。しかし、各抗体が他の抗体とその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同程度に、より大きい程度で、またはより小さい程度で検出可能に阻害する場合、抗体はそれらのそれぞれのエピトープの結合について互いに「交差競合する」と言われる。競合抗体および交差競合抗体の両方が、本発明に包含される。このような競合または交差競合が生じるメカニズム（例えば、立体障害、立体構造の変化、または共通のエピトープもしくはその部分への結合）に関わらず、当業者には、本明細書において提供される教示に基づいて、このような競合および／または交差競合抗体が本明細書において開示される方法に包含され、このような方法に有用であり得ることが理解されよう。
本明細書において用いる場合、「治療」は、有利なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。
本明細書において用いる場合、薬剤、化合物、または医薬組成物の「効果的な投与量」または「効果的な量」は、あらゆる１つまたは複数の有利なまたは所望の結果を得るために十分な量である。予防的使用では、有利なまたは所望の結果には、リスクの排除もしくは低減、重症度の軽減、または、疾患の生化学的、組織学的、および／もしくは行動的症候、その合併症、および疾患の発症の間に見られる中間の病理学的表現型を含む疾患の発生の遅延が含まれる。治療的使用では、有利なまたは所望の結果には、発生の低減、または様々な疾患もしくは状態（例えば、限定はしないが、腎細胞がん、胃がん、頭頚部がん、肺がん、卵巣がん、および膵臓がんなど）の１つもしくは複数の症候の改善、疾患を治療するために必要な他の投薬の用量の減少、別の投薬の効果の増強、および／または疾患の進行の遅延などの臨床結果が含まれる。効果的な投与量は、１回または複数回の投与で投与され得る。本発明の目的では、薬剤、化合物、または医薬組成物の効果的な投与量は、直接的または間接的な予防的または治療的治療の達成に十分な量である。臨床的背景において理解されているように、薬剤、化合物、または医薬組成物の効果的な投与量は、別の薬剤、化合物、または医薬組成物と組み合わせて達成されてもされなくてもよい。したがって、「効果的な投与量」は１つまたは複数の治療物質を投与する背景において考慮され得、１つまたは複数の他の作用物質と組み合わせて所望の結果が得られ得るかまたは得られる場合、単一の作用物質は効果的な量で投与されているとみなされ得る。
「個体」または「対象」は、哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物にはまた、限定はしないが、家畜、スポーツ用の動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが含まれる。
本明細書において用いる場合、「ベクター」は、宿主細胞において目的の１つまたは複数の遺伝子または配列を送達し得る、好ましくは発現し得る構築物を意味する。ベクターの例には、限定はしないが、ウイルスベクター、裸ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内にカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が含まれる。
本明細書において用いる場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に機能可能に連結している。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に機能可能に連結している遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の場合において、この配列はコアプロモーター配列であり得、他の場合において、この配列は、エンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能可能に連結している場合に細胞のほとんどのまたは全ての生理学的条件下で細胞内で遺伝子産物を生産させる、ヌクレオチド配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、ヌクレオチド配列であって、それが遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能可能に連結している場合に、プロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にほぼ限り細胞内で遺伝子産物を生産させる、ヌクレオチド配列を指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、ヌクレオチド配列であって、それが遺伝子によってコードまたは特定されているポリヌクレオチドと機能可能に連結している場合に、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にほぼ限り細胞内で遺伝子産物を生産させる、ヌクレオチド配列を指す。
ｓｃＦｖの背景において用いられる用語「フレキシブルポリペプチドリンカー」または「リンカー」は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を共に連結するために単独でまたは組み合わせて用いられる、グリシンおよび／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、フレキシブルポリペプチドリンカーはグリシン／セリンリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎまたは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、およびｎ＝１０である）を含む。一実施形態において、フレキシブルポリペプチドリンカーには、限定はしないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が含まれる。別の実施形態において、リンカーには、（ＧｌｙＸＳｅｒ）ｎ（式中、ｘ＝１、２、３、４、または５であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９。または１０である）の複数の反復、例えば、（ＧｌｙＳｅｒ）、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、または（Ｇｌｙ５Ｓｅｒ）の複数の反復が含まれる。また、本発明の範囲内には、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１３８４７５において記載されているリンカーも含まれる。
本明細書において用いる場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７－メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写開始の直後に真核細胞メッセンジャーＲＮＡの「前部」または５’末端に付加されている、修飾されたグアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結した末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップの付加は転写に組み合わされ、同時転写的に生じ、その結果、それぞれが他方に影響する。転写開始の直後に、合成されるｍＲＮＡの５’末端には、ＲＮＡポリメラーゼと会合したキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学的反応として進む。キャップ部分は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率などの機能性を調節するように修飾され得る。
本明細書において用いる場合、「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。通常、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するために用いられる鋳型を含む。
本明細書において用いる場合、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付加された一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態において、ポリＡは、５０から５０００までの間、好ましくは６４超、より好ましくは１００超、最も好ましくは３００または４００超である。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節するように化学的にまたは酵素的に修飾され得る。
本明細書において用いる場合、「ポリアデニル化」は、ポリアデニル部分またはその修飾された変異体の、メッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合を指す。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素であるポリアデニル化ポリメラーゼの作用を介してｍＲＮＡ前駆体に付加されたアデニンヌクレオチドの長い配列（数百であることが多い）である。高等真核生物において、ポリ（Ａ）尾部は、特異的配列であるポリアデニル化シグナルを含有する転写産物に付加される。ポリ（Ａ）尾部およびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護することに役立つ。ポリアデニル化はまた、転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出、および翻訳に重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写の直後に核内で起きるが、さらにその後に細胞質内でも起きる。転写が終了した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は通常、切断部位付近の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位で遊離３’末端に付加される。
本明細書において用いる場合、「一過性」は、数時間、数日、または数週間にわたる、組み込まれていない導入遺伝子の発現を指し、ここで、発現の期間は、宿主細胞内のゲノム内に組み込まれたかまたは安定なプラスミドレプリコンに含有された場合の遺伝子の発現の期間よりも短い。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞の１つの部分から細胞の別の部分へのシグナル伝達において役割を有する様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。表現「細胞表面受容体」には、細胞膜を介してシグナルおよび伝達シグナルを受け取り得る分子および分子複合体が含まれる。
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及には、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態が含まれる（および記載される）。例えば、「約Ｘ」という記載には「Ｘ」という記載が含まれる。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。
実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて本明細書において記載される場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という表現で記載される他の類似の実施形態もまた提供されると理解される。
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の代替的な群分類の表現で記載されている場合、本発明は、列挙された群全てを全体として包含するのみではなく、群の各メンバーを個別に、また主たる群の全ての考えられる下位群も包含し、また、群メンバーの１つまたは複数が含まれない主たる群もまた包含される。本発明はまた、特許請求の範囲に記載された発明における群メンバーのいずれかの１つまたは複数を明確に排除することも想定する。
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。一致しない場合には、定義を含む本明細書が優先される。本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変型は、言及された整数または整数群を含めることを意味するがいかなる他の整数または整数群も排除するものではないことが理解されよう。文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」に続くいかなる例も、網羅的または限定的であることを意図するものではない。
典型的な方法および材料が本明細書において記載されるが、本明細書において記載されるものと類似または同等の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において用いることができる。材料、方法、および実施例は例示的なものにすぎず、限定することを意図したものではない。
形質導入されたＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ１および様々なＮ－ＣＡＲの二重の細胞表面発現を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ発現は、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＦｃγとを用いて検出され（ｘ軸で示される）、Ｎ－ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出された（ｙ軸）。 形質導入されたＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ１および様々なＮ－ＣＡＲの二重の細胞表面発現を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ発現は、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＦｃγとを用いて検出され（ｘ軸で示される）、Ｎ－ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出された（ｙ軸）。 形質導入されたＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ１および様々なＮ－ＣＡＲの二重の細胞表面発現を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ発現は、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＦｃγとを用いて検出され（ｘ軸で示される）、Ｎ－ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出された（ｙ軸）。 形質導入されたＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ１および様々なＮ－ＣＡＲの二重の細胞表面発現を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ発現は、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＦｃγとを用いて検出され（ｘ軸で示される）、Ｎ－ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出された（ｙ軸）。 Ｐ－ＣＡＲ１誘導型のＴ細胞活性化に対する様々なＮ－ＣＡＲの阻害的効果を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ１を発現する、対照ΔＰＤ１または試験対象Ｎ－ＣＡＲを形質導入されたルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＤ１９発現ＡＡＰＣまたは二重ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ発現ＡＡＰＣとインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を１６時間後に評価した。データは、ＣＤ１９ ＡＡＰＣとの共培養から得られた平均ＲＬＵに対する、ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ ＡＡＰＣとの共培養から得られた平均ＲＬＵの比率として表す。試料当たりｎ＝６複製。示されるデータは、平均＋／－９５％ＣＩである。図５Ａ／５Ｃおよび５Ｂは、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターおよびＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を用いた結果をそれぞれ示す。 形質導入されたＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ２および表１０に列挙されたＮ－ＣＡＲの二重細胞表面発現を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ発現は、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＦｃγとを用いて検出され（ｘ軸で示される）、Ｎ－ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出された（ｙ軸）。 形質導入されたＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ２および表１０に列挙されたＮ－ＣＡＲの二重細胞表面発現を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ発現は、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＦｃγとを用いて検出され（ｘ軸で示される）、Ｎ－ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後にＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出された（ｙ軸）。 形質導入されたＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ２および表１０に列挙されたＮ－ＣＡＲの二重細胞表面発現を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ発現は、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＦｃγとを用いて検出され（ｘ軸で示される）、Ｎ－ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出された（ｙ軸）。 形質導入されたＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ２および表１０に列挙されたＮ－ＣＡＲの二重細胞表面発現を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ発現は、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＦｃγとを用いて検出され（ｘ軸で示される）、Ｎ－ＣＡＲ発現は、ビオチン化組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後のＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出された（ｙ軸）。 Ｐ－ＣＡＲ２誘導型のＴ細胞活性化に対する様々なＮ－ＣＡＲの阻害的効果を示す図である。Ｐ－ＣＡＲ２を発現する、対照ΔＰＤ１または試験対象Ｎ－ＣＡＲを形質導入されたルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＤ１９発現ＡＡＰＣまたは二重ＰＳＭＡ／ＣＤ１９発現ＡＡＰＣとインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を１６時間後に評価した。データは、ＣＤ１９ ＡＡＰＣとの共培養から得られた平均ＲＬＵに対する、ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ ＡＡＰＣとの共培養から得られた平均ＲＬＵの比率として表す。試料当たりｎ＝６複製。示されるデータは、平均＋／－９５％ＣＩである。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターおよびＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を用いた結果をそれぞれ示す。
本発明は、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
細胞内ドメイン
を含み、
細胞内ドメインが、免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフＩＴＳＭを含み、前記ＩＴＳＭがアミノ酸配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１がアミノ酸であり、
Ｘ２がアミノ酸であり、
Ｘ３がアミノ酸であり、
Ｘ４がＶまたはＩである、
負シグナル（または阻害性）キメラ抗原受容体（Ｎ－ＣＡＲ）に関する。
一部の実施形態において、用語アミノ酸は、天然アミノ酸を指す。一部の実施形態において、用語アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンから選択されるアミノ酸を指す。
一部の実施形態において、細胞外ドメインがＰＳＭＡに対するｓｃＦｖである場合、細胞内ドメインはヒトＰＤ－１の細胞内ドメインではない。
一部の実施形態において、細胞内ドメインはヒトＰＤ－１の細胞内ドメインではない。
一部の実施形態において、細胞内ドメインはヒトＢＴＬＡの細胞内ドメインではない。
一部の実施形態において、細胞内ドメインはヒトＣＤ２４４の細胞内ドメインではない。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列番号２０００、配列番号２００１、または配列番号２００２ではない。
一部の実施形態において、細胞外ドメインはＰＳＭＡに結合しない。
一部の実施形態において、細胞内ドメインはＰＤ－１の全細胞内ドメインを含まない。
一部の実施形態において、ＩＴＳＭはＴＥＹＡＴＩではない。
Ｎ－ＣＡＲの細胞内ドメインまたは領域には、阻害性細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。阻害性細胞内シグナル伝達ドメインは、通常、Ｎ－ＣＡＲが導入されている同一の免疫細胞上のＰ－ＣＡＲの正の細胞内シグナル伝達ドメインからのシグナルの不活化を起こし、それにより、免疫細胞の正常なエフェクター機能の活性化をブロックする。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
Ｎ－ＣＡＲの細胞内ドメイン
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
またはその変異体を含み、式中、
ｎは０、１、または２以上の整数であり、
ｍは１、または２以上の整数であり
ｐは１、または２以上の整数であり、
Ｌ１は不在であるか、または
（ａ）ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、例えば、以下の表３に示される配列のいずれかもしくはその断片、
（ｂ）ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、例えば以下の表１に示される配列のいずれかもしくはその断片、
（ｃ）上記（ｂ）内の配列にＮ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、例えば表２に示される配列のいずれか、もしくはその断片、および
（ｄ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含み、
Ｌ２およびＬ３のそれぞれは、不在であるか、または
（ｅ）ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、例えば以下の表４に示される配列のいずれか、もしくはその断片、
（ｆ）ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、例えば以下の表６に示される配列のいずれか、もしくはその断片、
（ｇ）ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメイン、例えば以下の表５に示される配列のいずれか、もしくはその断片、
（ｈ）上記（ｆ）もしくは（ｇ）内の配列にＮ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、例えば表２に示される配列のいずれか、もしくはその断片、および
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含み、
Ｌ４は不在であるか、または
（ｊ）ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、例えば、以下の表７に示される配列のいずれかもしくはその断片、
（ｋ）ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、例えば以下の表８に示される配列のいずれか、もしくはその断片、
（ｌ）上記（ｊ）もしくは（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、例えば表２に示される配列のいずれか、もしくはその断片、および
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含み、
ＩＴＩＭは配列Ｘ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９であり、式中、
Ｘ５はＳ、Ｖ、Ｉ、またはＬであり、
Ｘ６はアミノ酸であり、
Ｘ７はアミノ酸であり、
Ｘ８はアミノ酸であり、
Ｘ９はＶ、Ｉ、またはＬであり、
ＩＴＳＭは配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１はアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸であり、
Ｘ４はＶまたはＩである。
一部の実施形態において、既知の阻害性受容体は、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、いかなるＩＴＩＭもＩＴＳＭも含まず、かつＴ細胞内のＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって提供される活性化シグナルを低減させ得る負のシグナルを提供する細胞内ドメインとを含む、阻害性受容体を指す。
一部の実施形態において、既知の阻害性受容体は、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、Ｔ細胞内のＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって提供される活性化シグナルを低減させ得る負のシグナルを提供する細胞内ドメインとを含む、阻害性受容体を指す。
一部の実施形態において、既知の阻害性受容体は、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３ ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＬＩＬＲＢ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ５、ＣＤ９６、ＣＤ２２、およびＬＡＩＲ１から選択される。好ましい実施形態において、既知の阻害性受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ２である。
ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインは、１つのＩＴＩＭおよび１つのＩＴＳＭを含むドメインを指す。
ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインは、１つのＩＴＳＭを含みＩＴＩＭを含まないドメインを指す。
ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインは、１つのＩＴＩＭを含みＩＴＳＭを含まないドメインを指す。
ｎ、ｍ、またはｐの１つまたは複数が１超である場合、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、ＩＴＩＭ、およびＩＴＳＭは各出現毎に他のものから独立して選択される。例えば、Ｎ－ＣＡＲの細胞内ドメインは、異なる配列を有するいくつかのＩＴＳＭを含み得る。
一部の実施形態において、Ｌ１は不在であるか、または、
（ａ）以下から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、
Figure 2022036976000002
 （ｂ）以下から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、
Figure 2022036976000003
 （ｃ）上記（ｂ）内の配列にＮ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、および
（ｄ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含む。
一部の実施形態において、Ｌ２およびＬ３のそれぞれは不在であるか、または、
（ｅ）以下から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、
Figure 2022036976000004
 （ｆ）以下から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、
Figure 2022036976000005
 （ｇ）以下から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメイン、
Figure 2022036976000006
 （ｈ）上記（ｆ）もしくは（ｇ）内の配列にＮ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、および
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含む。
一部の実施形態において、Ｌ４は不在であるか、または、
（ｊ）以下から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、
Figure 2022036976000007
 （ｋ）以下から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、
Figure 2022036976000008
 （ｌ）上記（ｊ）もしくは（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、および
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含む。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ（すなわち、ｎは０であり、ｐは１である）を含む。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４（すなわち、ｎは０であり、ｍは１であり、ｐは１である）を含む。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４－Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４（すなわち、ｎは０であり、ｍは２であり、ｐは１である）を含む。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
またはその変異体を含み、式中、
ｎは０であり、
ｍは１であり、
ｐは１であり、
Ｌ３は、
（ｆ）ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、例えば以下の表６に示される配列のいずれか、もしくはその断片、または
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
から選択される１つの配列を含み、
Ｌ４は、
（ｋ）ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、例えば以下の表８に示される配列のいずれか、またはその断片、
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、例えば表２に示される配列のいずれか、またはその断片、および
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは１つまたは２つの配列を含み、
ＩＴＳＭは配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１はアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸であり、
Ｘ４はＶまたはＩである。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
またはその変異体を含み、式中、
ｎは０であり、
ｍは１であり、
ｐは１であり、
Ｌ３は、
Figure 2022036976000009
 から選択され、
Ｌ４は、
（ｋ）
Figure 2022036976000010
 および場合によって
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、例えば表２に示される配列のいずれか、またはその断片
からなる群から選択される１つの配列を含み、
ＩＴＳＭは配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１はアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸であり、
Ｘ４はＶまたはＩである。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
またはその変異体を含み、式中、
ｎは０であり、
ｍは１であり、
ｐは１であり、
Ｌ３は、
Figure 2022036976000011
 から選択され、
Ｌ４は、
（ｋ）
Figure 2022036976000012
 および場合によって
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、またはその断片
からなる群から選択される１つの配列を含み、
ＩＴＳＭは配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１はアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸であり、
Ｘ４はＶまたはＩである。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
またはその変異体を含み、式中、
ｎは０であり、
ｍは１であり、
ｐは１であり、
Ｌ３は、
Figure 2022036976000013
 から選択され、
Ｌ４は、
（ｋ）
Figure 2022036976000014
 および
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、またはその断片
を含み、
ＩＴＳＭは配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１はアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸であり、
Ｘ４はＶまたはＩである。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
またはその変異体を含み、式中、
ｎは０であり、
ｍは１であり、
ｐは１であり、
Ｌ３は、
Figure 2022036976000015
 から選択され、
Ｌ４は、
（ｋ）
Figure 2022036976000016
 および場合によって
（ｌ）上記（ｋ）の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、またはその断片
を含み、
ＩＴＳＭは配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１はアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸であり、
Ｘ４はＶまたはＩである。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
を含み、式中、
ｎは０であり、
ｍは１であり、
ｐは１または２であり、
Ｌ３は、
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
から選択される１つの配列を含み、
Ｌ４は、
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
から選択される１つまたは複数の、好ましくは１つまたは２つの配列を含み、
ＩＴＳＭは配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１はアミノ酸であり、
Ｘ２はアミノ酸であり、
Ｘ３はアミノ酸であり、
Ｘ４はＶまたはＩである。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２－Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｐを含み、式中、
ｐは１、２、３、４、または５であり、
Ｌ１は、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域またはその断片、例えば、以下の表３に示される配列のいずれかまたはその断片であり、
Ｌ２は不在であり、
Ｌ３は、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメインまたはその断片、例えば、以下の表５に示される配列のいずれかまたはその断片であり、
Ｌ４は、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、例えば、以下の表７に示される配列のいずれかもしくはその断片、または、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、例えば、以下の表８に示される配列のいずれかもしくはその断片である。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、配列
（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２－Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）p
またはその変異体を含み、式中、
ｐは１、２、３、４、または５であり、
Ｌ１は、以下の配列
Figure 2022036976000017
 から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域であり、
Ｌ２は不在であり、
Ｌ３は、以下の配列
Figure 2022036976000018
 から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメインであり、
Ｌ４は、以下の配列
Figure 2022036976000019
 から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、または
以下の配列
Figure 2022036976000020
 から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域である。
一部の実施形態において、（ｄ）、（ｉ）、および（ｍ）の非天然の配列は、１から５００までの間の、好ましくは、１から４００、１から３００、１から２００、１から１００、１０から１００、１０から８０、１０から６０、１０から４０、１００から２００、１００から３００、または１００から４００のアミノ酸を含む。
一部の実施形態において、（ｄ）または（ｉ）の非天然の配列はグリシン／セリンリンカー（ＧｌｙＸＳｅｒ）ｎであり、式中、ｘ＝１、２、３、４、または５であり、ｎは１から１００である。好ましくは、グリシン／セリンリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎまたは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含み、式中、ｎは１以上の、好ましくは１から１００の間、１から８０の間、１から５０の間、１から２０の間、または１から１０の間の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、およびｎ＝１０である。一実施形態において、グリシン／セリンリンカーには、限定はしないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が含まれる。
一部の実施形態において、Ｘ１はＥ、Ｖ、またはＩである。
一部の実施形態において、Ｘ１はＥである。
一部の実施形態において、Ｘ２はＳまたはＡである。
一部の実施形態において、Ｘ２はＡである。
一部の実施形態において、Ｘ３はＥ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＶである。
一部の実施形態において、Ｘ３はＥである。
一部の実施形態において、Ｘ３はＴである。
一部の実施形態において、Ｘ２はＩである。
一部の実施形態において、Ｘ５はＬ、Ｖ、またはＩである。
一部の実施形態において、Ｘ５はＬである。
一部の実施形態において、Ｘ５はＶである。
一部の実施形態において、Ｘ５はＩである。
一部の実施形態において、Ｘ６はＡ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｖ、Ｌ、またはＥである。
一部の実施形態において、Ｘ６はＨである。
一部の実施形態において、Ｘ６はＤである。
一部の実施形態において、Ｘ７はＡ、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ｖ、またはＥである。
一部の実施形態において、Ｘ７はＡである。
一部の実施形態において、Ｘ７はＧである。
一部の実施形態において、Ｘ８はＶ、Ｓ、Ｄ、またはＥである。
一部の実施形態において、Ｘ８はＳまたはＥである。
一部の実施形態において、Ｘ８はＥである。
一部の実施形態において、Ｘ９はＬまたはＶである。
一部の実施形態において、Ｘ９はＬである。
一部の実施形態において、Ｘ５はＬまたはＶであり、Ｘ８はＥであり、Ｘ９はＬである。
一部の実施形態において、ＩＴＳＭは、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つは、配列番号９２６から配列番号１０１５から選択される（以下の表を参照されたい）。
Figure 2022036976000021
一部の実施形態において、ＩＴＳＭは、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つは、ＴＥＹＡＳＩである。
一部の実施形態において、ＩＴＳＭは、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つは、ＴＥＹＳＥＩである。
一部の実施形態において、ＩＴＳＭは、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つは、ＴＶＹＳＥＶである。
一部の実施形態において、ＩＴＳＭは、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つは、ＴＥＹＳＴＩである。
一部の実施形態において、ＩＴＩＭは、または、いくつかのＩＴＩＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＩＭの少なくとも１つは、配列番号１０１６から配列番号１９９８から選択される（以下の表を参照されたい）。
Figure 2022036976000022
Figure 2022036976000023
Figure 2022036976000024
Figure 2022036976000025
Figure 2022036976000026
Figure 2022036976000027
Figure 2022036976000028
Figure 2022036976000029
Figure 2022036976000030
Figure 2022036976000031
一部の実施形態において、ＩＴＩＭは、または、いくつかのＩＴＩＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＩＭの少なくとも１つは、ＬＳＹＲＳＬ、ＬＰＹＹＤＬ、ＬＬＹＳＲＬ、ＬＩＹＴＬＬ、ＬＬＹＡＤＬ、ＩＳＹＴＴＬ、ＶＴＹＳＡＬ、ＩＨＹＳＥＬ、ＶＤＹＶＩＬ、ＬＨＹＡＳＬ、ＬＤＹＤＹＬ、ＶＤＹＤＦＬ、ＶＴＹＳＴＬ、ＩＩＹＳＥＶ、ＬＥＹＬＣＬ、ＶＬＹＧＱＬ、ＶＰＹＴＰＬ、ＩＳＹＰＭＬ、ＶＳＹＴＮＬ、ＬＬＹＥＭＶ、ＶＤＹＮＬＶ、ＩＴＹＦＡＬ、ＶＨＹＱＳＶ、ＶＰＹＶＭＶ、ＩＰＹＲＴＶ、ＩＡＹＳＬＬ、ＶＣＹＧＲＬ、ＬＫＹＬＹＬ、ＬＬＹＥＨＶ、ＩＴＹＳＬＬ、ＶＬＹＳＥＬ、ＩＷＹＮＩＬ、ＩＳＹＫＧＬ、ＩＤＹＹＮＬ、ＬＥＹＬＱＬ、ＬＫＹＲＧＬ、ＶＬＹＡＳＶ、ＬＱＹＬＳＬ、ＬＦＹＲＨＬ、ＶＱＹＫＡＶ、ＬＳＹＳＳＬ、ＬＳＹＴＫＶ、ＶＱＹＳＴＶ、ＶＫＹＮＰＶ、ＶＶＹＳＥＶ、ＬＥＹＶＳＶ、ＬＡＹＨＴＶ、ＶＱＹＬＲＬ、ＶＴＹＴＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＩＶＹＡＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＬＹＴＥＬ、ＩＴＹＡＡＶ、ＶＩＹＩＤＶ、ＶＴＹＡＥＶ、ＶＴＹＡＰＶ、ＶＴＹＡＫＶ、ＶＴＹＡＲＬ、ＩＬＹＨＴＶ、ＶＬＹＡＭＬ、ＶＩＹＡＱＬ、ＬＶＹＥＮＬ、ＬＣＹＡＤＬ、ＩＳＹＡＳＬ、ＬＴＹＶＬＬ、ＶＴＹＶＮＬ、ＶＲＹＳＩＶ、ＶＦＹＲＱＶ、ＬＫＹＭＥＶ、ＶＤＹＧＥＬ、ＬＳＹＭＤＬ、ＶＬＹＴＡＶ、ＶＱＹＴＥＶ、ＩＶＹＡＳＬ、ＶＥＹＬＥＶ、ＬＥＹＶＤＬ、ＩＴＹＡＤＬ、ＬＴＹＡＤＬ、ＶＩＹＥＮＶ、ＬＡＹＹＴＶ、ＶＳＹＳＡＶ、ＬＶＹＤＫＬ、ＬＮＹＭＶＬ、ＬＮＹＡＣＬ、ＬＤＹＩＮＶ、ＬＨＹＡＴＬ、ＬＨＹＡＶＬ、ＩＱＹＡＰＬ、ＩＱＹＡＳＬ、ＬＬＹＬＬＬ、ＶＶＹＳＱＶ、ＶＩＹＳＳＶ、ＶＶＹＹＲＶ、ＶＰＹＶＥＬ、ＬＤＹＤＫＬ、ＬＳＹＰＶＬ、ＶＡＹＳＱＶ、ＬＦＹＷＤＶ、ＬＩＹＳＱＶ、またはＬＤＹＥＦＬから選択される。
一部の実施形態において、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。一部の実施形態において、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一部の実施形態において、ｐは、１、２、３、４、または５である。一部の実施形態において、ｐは１である。一部の実施形態において、ｐは２である。一部の実施形態において、ｐは３である。一部の実施形態において、ｐは４である。一部の実施形態において、ｐは５である。
一部の実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一部の実施形態において、ｎは、１、２、３、４、または５である。一部の実施形態において、ｎは０である。一部の実施形態において、ｎは１である。一部の実施形態において、ｎは２である。一部の実施形態において、ｎは３である。
一部の実施形態において、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。一部の実施形態において、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一部の実施形態において、ｍは、１、２、３、４、または５である。一部の実施形態において、ｍは１である。一部の実施形態において、ｍは２である。一部の実施形態において、ｍは３である。一部の実施形態において、ｍは４である。一部の実施形態において、ｍは５である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは１から１０である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは１であり、ｐは１から２０である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは１から６であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは１であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは２であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは３であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは４であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは５であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは６であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは１から６であり、ｐは１であり、ＩＴＳＭはＴＥＹＡＴＩである。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは１から６であり、ｐは１であり、ＩＴＳＭはＴＥＹＳＥＩである。
一部の実施形態において、ｎは０であり、ｍは１から６であり、ｐは１であり、ＩＴＳＭはＴＶＹＳＥＶである。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは１から５である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは１である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは２である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは３である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは４である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは５である。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは１から５であり、ＩＴＩＭはＶＤＹＧＥＬであり、ＩＴＳＭはＴＥＹＡＴＩである。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは１から５であり、ＩＴＩＭはＬＸ６ＹＡＸ８Ｌ（式中、Ｘ６はＨまたはＱから選択され、Ｘ８はＶまたはＳである）であり、ＩＴＳＭはＴＥＹＳＥＩである。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは１から５であり、ＩＴＩＭはＬＸ６ＹＡＸ８Ｌ（式中、Ｘ６はＨまたはＱから選択され、Ｘ８はＶまたはＳから選択される）であり、ＩＴＳＭはＴＥＹＡＳＩである。
一部の実施形態において、ｎは１であり、ｍは１であり、ｐは１から５であり、ＩＴＩＭはＬＸ６ＹＡＸ８Ｌ（式中、Ｘ６はＨまたはＱから選択され、Ｘ８はＶまたはＳである）であり、ＩＴＳＭはＴＶＹＳＥＶである。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、同一のアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＳＭを含む。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、異なるアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＳＭを含む。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、同一のアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＩＭを含む。
一部の実施形態において、細胞内ドメインは、異なるアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＩＭを含む。
一部の実施形態において、ＮＣＡＲの細胞内ドメインは、配列番号２０００、配列番号２００１、配列番号２００２、配列番号２００３、配列番号２００４、配列番号２００５、配列番号２００６、配列番号２００７、配列番号２００８、配列番号２００９、配列番号２０１０、配列番号２０１１、配列番号２０１２、配列番号２０１３、配列番号２０１４、配列番号２０１５、配列番号２０１６および配列番号２０１７から選択される。
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一部の実施形態において、配列（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐの変異体は、前記配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
一部の実施形態において、配列（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐの変異体は、前記配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
一部の実施形態において、配列（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐの変異体は、前記配列と少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
一部の実施形態において、配列（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐの変異体は、非変異体配列とほぼ同一の活性を有する。一部の実施形態において、ほぼ同一の活性は、非変異体配列の活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％を指す。
一部の実施形態において、ほぼ同一の活性は、非変異体配列の活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％を指し、これは、例えば以下の実施例３で開示されるように、Ｐ－ＣＡＲと試験対象の細胞内ドメインを含むＮ－ＣＡＲとを含み誘導性のＮＦＡＴ調節型またはＮＦκＢ調節型のルシフェラーゼの発現を組み込んだレポーター細胞におけるルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによって測定される。
Ｎ－ＣＡＲの膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態において、Ｎ－ＣＡＲは、Ｎ－ＣＡＲの細胞外ドメインに付加された膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１つまたは複数のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通ドメインの由来元であるタンパク質の細胞外領域に付随する１つもしくは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５のアミノ酸）、および／または膜貫通タンパク質の由来元であるタンパク質の細胞内領域に付随する１つもしくは複数のさらなるアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５のアミノ酸）を含み得る。一態様において、膜貫通ドメインは、Ｎ－ＣＡＲの他のドメインの１つと会合しているドメインである。一部の場合において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが同一のまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避けるように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小にするように、選択され得るか、またはアミノ酸置換によって修飾され得る。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ Ｔ細胞表面上の別のＣＡＲとホモ二量体化し得る。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同一のＣＡＲ Ｔ細胞内に存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小にするように、修飾または置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然のまたは組換えの由来源に由来し得る。由来源が天然である場合、ドメインは、あらゆる膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。一態様において、Ｎ－ＣＡＲが標的に結合している場合は常に、膜貫通ドメインは細胞内ドメインにシグナル伝達し得る。本発明において特定の使用をされる膜貫通ドメインは、例えばＴ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ４、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰＡ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。
一部の実施形態において、Ｎ－ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＰＤ－１またはＣＤ２８アルファの少なくとも膜貫通領域を含む。
一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質のヒンジを介して、Ｎ－ＣＡＲの細胞外ドメインに付加され得る。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えば、ＰＤ－１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＤ８アルファヒンジであり得る。
一部の実施形態において、膜貫通ドメインは組換え体であり得、この場合、膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。一態様において、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットを、組換え膜貫通ドメインの各末端で見ることができる。
２から１０までの間のアミノ酸長の短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、Ｎ－ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域との間の連結を形成してもよい。グリシン－セリンのダブレットは特に適切なリンカーとなる。例えば、一態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。一部の実施形態において、リンカーは、ヌクレオチド配列ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣによってコードされる。
Ｎ－ＣＡＲの細胞外ドメイン
抗原結合ドメインは、限定はしないが、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および機能的なその断片（限定はしないが、ラクダ科動物由来のナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）などの一本鎖ドメイン抗体を含む）を含むオフ組織抗原に、ならびに、組換えフィブロネクチンドメインなどの抗原結合ドメインとして機能することが当技術分野において知られている代替的な足場に結合する、あらゆるドメインであり得る。一部の場合において、抗原結合ドメインは、Ｎ－ＣＡＲが最終的にその中で用いられる種と同一の種に由来することが有利である。例えば、ヒトにおける使用では、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが抗体または抗体断片の抗原結合ドメインにヒト残基またはヒト化残基を含むことが有利であり得る。
ヒト化抗体は、限定はしないが、ＣＤＲ移植（例えば、それぞれが参照により全体が本明細書に組み込まれる、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７、ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，５３０，１０１号，および米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）、ベニアリングまたはリサーフェシング（例えば、それぞれが参照により全体が本明細書に組み込まれる、欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号および欧州特許第ＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８（４／５）：４８９～４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（６）：８０５～８１４；ならびにＲｏｇｕｓｋａら、１９９４、ＰＮＡＳ、９１：９６９～９７３を参照されたい）、鎖シャッフリング（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）、ならびに、例えば、それぞれが参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３１７１０５、Ｔａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９：１１１９～２５（２００２）；Ｃａｌｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１３（５）：３５３～６０（２０００）；Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０（３）：２６７～７９（２０００）；Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（１６）：１０６７８～８４（１９９７）；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９（１０）：８９５～９０４（１９９６）；Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（２３追補）：５９７３～５９７７（１９９５）；Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（８）：１７１７～２２（１９９５）；Ｓａｎｄｈｕ Ｊ Ｓ、Ｇｅｎｅ、１５０（２）：４０９～１０（１９９４）；およびＰｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３５（３）：９５９～７３（１９９４）において開示されている技術を含む、当技術分野において知られている様々な技術を用いて生産され得る。多くは、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変、例えば向上させるために、ＣＤＲドナー抗体の対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３を参照されたい）。
一部の態様において、抗体断片を含むＮ－ＣＡＲの部分は、標的抗原への高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながらヒト化される。本発明の一態様によると、ヒト化抗体および抗体断片は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列および様々な概念的ヒト化産物を分析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に馴染みがある。選択される候補免疫グロブリン配列の考えられる三次元立体構造を説明および提示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの提示を検査することによって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割を分析すること、例えば、標的抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基を分析することが可能になる。このやり方で、ＦＲ残基がレシピエント配列および移入配列から選択され、組み合わされ、その結果、抗体または抗体断片の所望の特徴、例えば、標的抗原に対する高い親和性が得られる。通常、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的にかつ最も実質的に関与する。
一部の実施形態において、抗体結合ドメインは、断片、例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態において、抗体結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能的（例えば二重特異的）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７、１０５（１９８７））である。一部の実施形態において、本発明のＮ－ＣＡＲの抗原結合ドメインは、野生型のまたは増強した親和性でオフ組織抗原を結合する。
一部の場合において、ｓｃＦｖは、当技術分野において知られている方法に従って調製され得る（例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３を参照されたい）。ＳｃＦｖ分子は、柔軟なポリペプチドリンカーを用いてＶＨ領域とＶＬ領域とを共に連結することによって生産され得る。ｓｃＦｖ分子は、長さおよび／またはアミノ酸組成が最適化されたリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域のフォールディングおよび相互作用の程度に大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカーが採用されると（例えば、５から１０までの間のアミノ酸）、鎖内のフォールディングが予防される。鎖間のフォールディングもまた、２つの可変領域を一緒にして機能的なエピトープ結合部位を形成することが必要である。リンカーの方向およびサイズの例については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４～６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、米国特許出願公開第２００５／０１７５６０６号、米国特許出願公開第２００７／００１４７９４号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０２０２５８およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２４７１５を参照されたく、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。
ｓｃＦｖは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれを超えるアミノ酸残基からなるリンカーを、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然アミノ酸を含み得る。一部の実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１以上の正の整数である）などのグリシンおよびセリンの反復のセットを含む。一実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３であり得る。リンカーの長さの変動は、活性を保持し得るかまたは増強し得、活性研究において優れた有効性を生じさせる。
好ましい実施形態において、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。
Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインによって認識されるオフ組織抗原は、好ましくは、Ｐ－ＣＡＲによって標的化される腫瘍細胞上に存在しないかまたは低レベルで存在する抗原である。
以下の表は、Ｎ－ＣＡＲ抗原とＰ－ＣＡＲ抗原との組み合わせの例を示す。
Figure 2022036976000104
Ｎ－ＣＡＲ抗原にはまた、Ｐ－ＣＡＲが標的化する抗原と無関係であり目的の腫瘍において下方調節されるが、重要な全ての正常組織に存在する抗原も含まれ得る。膵管腺癌についてのこのような抗原の例は、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＣＹＰ１７Ａ１、およびＡＴＰ４Ｂであり、腎臓明細胞癌についてのこのような抗原の例は、ＧＰ２、ＭＵＣ２１、ＣＬＣＡ４、およびＳＬＣ２７Ａ６である。
本発明は、上記に定義したＮ－ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡ構築物を包含し、ここで、Ｎ－ＣＡＲは、オフ腫瘍抗原に特異的に結合する抗体断片などの細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインの配列は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをコードする核酸配列と連続しており、かつ、前記核酸配列と同じリーディングフレーム内にある。一部の実施形態において、典型的なＮ－ＣＡＲ構築物は、最適なリーダー配列、細胞外オフ組織抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、および細胞内阻害性シグナル伝達ドメインを含む。
本発明には、細胞に直接的に形質導入され得るＮ－ＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物が含まれる。
本発明にはまた、細胞内に直接的にトランスフェクトされ得るＲＮＡ構築物が含まれる。トランスフェクションにおいて用いるためのｍＲＮＡを生成する方法は、特異的に設計されたプライマーで鋳型をインビトロ転写（ＩＶＴ）し、その後ポリＡ付加して、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップおよび／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、発現される核酸，ならびに典型的には５０～２０００塩基長のポリＡ尾部を含有する構築物を生産することを伴う。そのように生産されたＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクトし得る。一実施形態において、鋳型は、Ｎ－ＣＡＲのための配列を含む。一実施形態において、ＲＮＡ Ｎ－ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入される。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書において定義されるＮ－ＣＡＲを含む単離された免疫細胞に関する。一部の実施形態において、本発明はさらに、本明細書において定義されるＮ－ＣＡＲおよびＰ－ＣＡＲを含む免疫細胞に関する。一部の実施形態において、前記免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態において、前記Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。
用語「正にシグナル伝達するキメラ抗原受容体」あるいは「Ｐ－ＣＡＲ」は、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および以下に定義する刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン（本明細書において「細胞質シグナル伝達ドメイン」または「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を少なくとも含む組換えポリペプチド構築物を指す。一部の実施形態において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合したゼータ鎖である。一部の実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインはさらに、以下に定義する少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つまたは複数の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８から選択される。一部の実施形態において、Ｐ－ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、Ｐ－ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、Ｐ－ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、Ｐ－ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する１つの機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、Ｐ－ＣＡＲは、Ｐ－ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意のリーダー配列を含む。一部の実施形態において、Ｐ－ＣＡＲはさらに、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、細胞のプロセシングおよび細胞膜へのＰ－ＣＡＲの局在化の間に抗原認識ドメイン（例えばｓｃＦｖ）から切断されてもよい。
抗体またはその抗体断片を含むＰ－ＣＡＲの細胞外部分は、抗原結合ドメインが例えば単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、およびヒト化抗体を含む連続的ポリペプチド鎖の一部として発現する、様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９、Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６）。
用語「刺激分子」は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様のための刺激手段においてＴＣＲ複合体の正の活性化を調節する正の細胞質シグナル伝達配列を提供する、Ｔ細胞によって発現される分子を指す。一部の実施形態において、正のシグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドをロードされたＭＨＣ分子との結合によって開始され、限定はしないが増殖、活性化、分化などを含むＴ細胞応答の仲介をもたらす。刺激性の様式で作用する正の細胞質シグナル伝達配列（「正のシグナル伝達ドメイン」または正の細胞内シグナル伝達ドメインとも呼ばれる）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。ＩＴＡＭを含有する正の細胞質シグナル伝達配列の例には、限定はしないが、ＴＣＲゼータ（またはＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても知られている）、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。
一部の態様において、Ｐ－ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、正の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。正の細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｐ－ＣＡＲ含有細胞、例えばＰ－ＣＡＲ Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばＰ－ＣＡＲ Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例には、細胞溶解活性、およびサイトカインの分泌を含むヘルパー活性が含まれる。
用語「共刺激分子」は、共刺激性リガンドと特異的に結合して、限定はしないが増殖などのＴ細胞による共刺激性応答を仲介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、抗原受容体以外の細胞表面分子、または効率的な免疫応答に必要なそれらのリガンドである。共刺激分子には、限定はしないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、および４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれる。
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリーで表され得る：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン，シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ＮＫ細胞受容体。このような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。
Ｐ－ＣＡＲおよびそれらを含む免疫細胞は広く開示されており、既知の方法に従って当業者が調製することができる。例えば、Ｐ－ＣＡＲおよびこのようなＰ－ＣＡＲを含む細胞を調製するための方法は、ＵＳ７４４６１９０、ＷＯ２００８／１２１４２０、ＵＳ８２５２５９２、ＵＳ２０１４００２４８０９、ＷＯ２０１２／０７９０００、ＷＯ２０１４１５３２７０、ＷＯ２０１２／０９９９７３、ＷＯ２０１４／０１１９８８、ＷＯ２０１４／０１１９８７、ＷＯ２０１３／０６７４９２、ＷＯ２０１３／０７０４６８、ＷＯ２０１３／０４０５５７、ＷＯ２０１３／１２６７１２、ＷＯ２０１３／１２６７２９、ＷＯ２０１３／１２６７２６、ＷＯ２０１３／１２６７３３、ＵＳ８３９９６４５、ＵＳ２０１３０２６６５５１、ＵＳ２０１４００２３６７４、ＷＯ２０１４０３９５２３、ＵＳ７５１４５３７、ＵＳ８３２４３５３、ＷＯ２０１０／０２５１７７、ＵＳ７４４６１７９、ＷＯ２０１０／０２５１７７、ＷＯ２０１２／０３１７４４、ＷＯ２０１２／１３６２３１Ａ１、ＷＯ２０１２／０５０３７４Ａ２、ＷＯ２０１３０７４９１６、ＷＯ２００９／０９１８２６Ａ３、ＷＯ２０１３／１７６９１５、またはＷＯ／２０１３／０５９５９３において開示されており、これらは全て、参照により全体が本明細書に組み込まれる。Ｐ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲを含む免疫細胞は、上記の参考文献において開示されている方法に従って当業者が調製することができる。好ましい実施形態において、Ｐ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲを含む免疫細胞は、ＷＯ２０１３／１７６９１５において開示されている方法に従って当業者が調製することができる。
一部の実施形態において、本発明のＴ細胞を操作する方法は、
（ａ）少なくとも
－免疫抑制物質の標的を発現する第１の遺伝子、および
－Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分をコードする第２の遺伝子
を不活化することによって、Ｔ細胞を修飾すること、
（ｂ）前記細胞を場合によって前記免疫抑制物質の存在下で増殖させること
を含み得る。
免疫抑制物質は、いくつかの作用メカニズムの１つによって免疫機能を抑制する作用物質である。言い換えると、免疫抑制物質は、免疫応答の程度および／または行き過ぎを弱める能力によって示される、化合物の役割である。非限定的な例として、免疫抑制物質は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インタロイキン－２ｕ鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、コルチコステロイド、または免疫抑制性代謝拮抗物質であり得る。
特定の実施形態において、本方法の遺伝子修飾ステップは、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲアルファ、およびＴＣＲベータからなる群から選択される１つの遺伝子の不活化に依る。別の実施形態において、本方法の遺伝子修飾ステップは、ＣＤ５２およびＧＲ、ＣＤ５２およびＴＣＲアルファ、ＣＤＲ５２およびＴＣＲベータ、ＧＲおよびＴＣＲアルファ、ＧＲおよびＴＣＲベータ、ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータからなる群から選択される２つの遺伝子の不活化に依る。別の実施形態において、本方法の遺伝子修飾ステップは、３つ以上の遺伝子の不活化に依る。遺伝子修飾は、好ましくはエクスビボで行われる。
一部の実施形態において、本発明のＴ細胞を操作する方法は、
（ａ）Ｔ細胞を好ましくは細胞培養物または血液試料から提供すること、
（ｂ）免疫抑制物質の標的を発現する前記Ｔ細胞において遺伝子を選択すること、
（ｃ）前記Ｔ細胞を、ＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖の破壊によって、
前記免疫抑制物質の標的をコードする前記遺伝子、および
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分をコードする少なくとも１つの遺伝子
のそれぞれを選択的に不活化し得るレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸で、形質転換すること、
（ｄ）前記レアカットエンドヌクレアーゼを前記Ｔ細胞内で発現させること、
（ｅ）ＴＣＲをその細胞表面上に発現しない形質転換されたＴ細胞を選別すること、
（ｆ）前記細胞を場合によって前記免疫抑制物質の存在下で増殖させること
を含み得る。
一部の実施形態において、本発明の細胞を操作する方法はさらに、１つまたは複数のさらなる遺伝子修飾ステップを含む。さらなる遺伝子修飾ステップとは、目的の１つまたは複数のタンパク質を操作するための細胞への導入を意味し得る。前記目的のタンパク質は、Ｐ－ＣＡＲおよび／またはＮ－ＣＡＲであり得る。
一部の実施形態において、Ｐ－ＣＡＲは、操作されたＴ細胞の生産および増殖に特に適合している多鎖キメラ抗原受容体であり、多鎖ＣＡＲは、以下の成分：
ａ）ＦｃｓＲＩアルファ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメインを含む１つのポリペプチド、
ｂ）Ｎ末端およびＣ末端細胞質尾部の一部とＦｃｃＲＩベータ鎖の膜貫通ドメインとを含む１つのポリペプチド、ならびに／または
ｃ）細胞質内尾部の一部およびＦｃｃＲＩガンマ鎖の膜貫通ドメインをそれぞれが含む２つのポリペプチドであって、それにより、個々のポリペプチドが自然発生的に共に多量体化して、二量体、三量体、または四量体ＣＡＲを形成する２つのポリペプチド
のうちの少なくとも２つを含む。
四量体Ｐ－ＣＡＲの例はＷＯ２０１３１７６９１５の図３に記載されており、異なる型の多鎖Ｐ－ＣＡＲはＷＯ２０１３１７６９１５の図４に示されている。このようなＰ－ＣＡＲは、上記で開示された方法と本発明に従ったＴ細胞を得るための本開示に従ったＮ－ＣＡＲとを共に用いて得られたＴ細胞において発現され得る。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書において定義するＮ－ＣＡＲと、ＵＳ７４４６１９０、ＷＯ２００８／１２１４２０、ＵＳ８２５２５９２、ＵＳ２０１４００２４８０９、ＷＯ２０１２／０７９０００、ＷＯ２０１４１５３２７０、ＷＯ２０１２／０９９９７３、ＷＯ２０１４／０１１９８８、ＷＯ２０１４／０１１９８７、ＷＯ２０１３／０６７４９２、ＷＯ２０１３／０７０４６８、ＷＯ２０１３／０４０５５７、ＷＯ２０１３／１２６７１２、ＷＯ２０１３／１２６７２９、ＷＯ２０１３／１２６７２６、ＷＯ２０１３／１２６７３３、ＵＳ８３９９６４５、ＵＳ２０１３０２６６５５１、ＵＳ２０１４００２３６７４、ＷＯ２０１４０３９５２３、ＵＳ７５１４５３７、ＵＳ８３２４３５３、ＷＯ２０１０／０２５１７７、ＵＳ７４４６１７９、ＷＯ２０１０／０２５１７７、ＷＯ２０１２／０３１７４４、ＷＯ２０１２／１３６２３１Ａ１、ＷＯ２０１２／０５０３７４Ａ２、ＷＯ２０１３０７４９１６、ＷＯ／２００９／０９１８２６Ａ３、ＷＯ２０１３／１７６９１５、またはＷＯ／２０１３／０５９５９３のいずれかにおいて定義されるＰ－ＣＡＲとを含む免疫細胞に関する。
一部の実施形態において、免疫細胞は、本明細書において定義されるＮ－ＣＡＲとＷＯ２０１４／０３９５２３において定義される多鎖Ｐ－ＣＡＲとを含む。
一部の実施形態において、本発明の免疫細胞は、Ｐ－ＣＡＲ抗原結合ドメインがその抗原に結合すると活性化される。一部の実施形態において、このような活性化は、Ｎ－ＣＡＲ抗原結合ドメインがその抗原に結合すると低減する。一部の実施形態において、活性化のこのような低減は、本発明に従ったＮ－ＣＡＲを含む免疫細胞において、ＰＤ－１の全細胞内ドメインを含むＮ－ＣＡＲを含む同一の免疫細胞と比較して、好ましくは少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または３０％増大する。一部の実施形態において、活性化のこのような低減は、本発明に従ったＮ－ＣＡＲを含む免疫細胞において、ＣＴＬＡ－４の全細胞内ドメインを含むＮ－ＣＡＲを含む同一の免疫細胞と比較して、好ましくは少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または３０％増大する。
一部の実施形態において、活性化は、Ｎ－ＣＡＲ抗原結合ドメインおよびＰ－ＣＡＲ抗原結合ドメインの両方がそれらのそれぞれの抗原に結合する場合、Ｐ－ＣＡＲ抗原結合ドメインのみがその抗原に結合する場合と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％低減する。
一部の実施形態において、免疫細胞の活性化のレベルは、サイトカイン生産を判定することによって測定される。一部の実施形態において、免疫細胞の活性化のレベルは、ＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳおよび／またはルミネックスアッセイによってＩＦＮガンマ生産をモニタリングすることによって測定される。一部の実施形態において、免疫細胞の活性化のレベルは、ＥＬＩＳＡおよび／またはルミネックスアッセイによってＴＮＦアルファ生産をモニタリングすることによって測定される。
一部の実施形態において、免疫細胞の活性化のレベルは、脱顆粒をモニタリングすることによって、例えば、ＦＡＣＳによってＣＤ１０７ａのレベルを測定することによって、測定される。
一部の実施形態において、免疫細胞の活性化のレベルは、標的細胞を死滅させる免疫細胞の能力をモニタリングすることによって測定される。
一部の実施形態において、免疫細胞の活性化のレベルは、例えば以下の実施例３に開示されるように、誘導性ＮＦＡＴ調節型またはＮＦκＢ調節型のルシフェラーゼ発現を組み込んだレポーター細胞におけるルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによって測定される。
一部の実施形態において、Ｎ－ＣＡＲの負のシグナルは短期間かつ可逆的であり、そのため、Ｐ－ＣＡＲおよび本発明に従ったＮ－ＣＡＲを含む免疫細胞は、Ｐ－ＣＡＲ抗原およびＮ－ＣＡＲ抗原の両方を有するオフ組織の状況で事前に不活化されても、Ｐ－ＣＡＲ抗原にのみ遭遇すれば確実に活性化され得る。
（実施例１）
Ｎ－ＣＡＲにおいて用いられる阻害性ドメインの同定
いくつかの受容体、すなわち、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３は、Ｔ細胞シグナル伝達を弱めるかまたは無効にするための負のシグナルを提供することが知られている。ＰＤ－１の細胞内シグナル伝達成分が、その活性に関与し得るモチーフを同定するために研究された。ＰＤ－１は、免疫受容体チロシン阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）の両方を含有し、データは、ＩＴＳＭドメインが、ＣＤ３ゼータ（Ｒｉｌｅｙ ＪＬ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００９ Ｍａｙ；２２９（１）：１１４～２５；またはＹｏｋｏｓｕｋａ Ｔら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１２ Ｊｕｎ ４；２０９（６）：１２０１～１７を参照されたい）のように、上流シグナル伝達成分の不活化を可能にするホスファターゼ（すなわちＳＨＰ２）を動員する重要な役割を有することを示唆する。ＩＴＳＭを有する他の受容体および分子が、Ｐ－ＣＡＲの結合によって生じるＴ細胞の活性化を弱めるかまたは無効にする負のシグナルの提供においてこの配列モチーフを利用することを目的として、この配列モチーフの機能的役割の理解を助けるために、同定および分析された。細胞質性であると注釈がつけられた配列に限定してタンパク質配列をｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースからダウンロードした。これらの細胞質配列のそれぞれを、目的のパターンについて検索した（ＩＴＩＭモチーフ、ＩＴＳＭモチーフ、またはＩＴＩＭおよびＩＴＳＭモチーフ）。
（実施例２）
Ｎ－ＣＡＲの設計
少なくとも１つのＩＴＳＭを単独で、または１つもしくは複数のＩＴＩＭもしくは他の阻害性ドメイン、例えばＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、もしくはＣＴＬＡ４の阻害的ドメインと組み合わせて含むＮ－ＣＡＲを、効果的なＮＯＴゲートを生成するために調製する。
具体的には、以下のＮ－ＣＡＲが調製される：
－複数のタンデムＰＤ－１ ＩＴＩＭ－ＩＴＳＭを含むＮ－ＣＡＲ、
－複数のタンデムＰＤ－１ ＩＴＳＭを含むＮ－ＣＡＲ、
－単一または複数の非ＰＤ１の天然のＩＴＳＭまたはＩＴＩＭ－ＩＴＳＭを含むＮ－ＣＡＲ、
－合成ＩＴＳＭまたはＩＴＩＭ－ＩＴＳＭを含むＮ－ＣＡＲ、
－少なくとも１つのＩＴＳＭおよびＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、またはＣＴＬＡ４などの他の阻害性受容体のシグナル伝達ドメインを含むＮ－ＣＡＲ。
（実施例３）
不死化されたヒトＴ細胞におけるＰ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲを含むＴ細胞の活性
実験モデルを用いて、実施例２に従って設計されたＮ－ＣＡＲを試験する。モデルは、Ｎ末端から、シグナル伝達ドメインまたは分泌シグナルドメイン（例えばＣＤ８分泌シグナル配列）、抗ＣＤ－１９一本鎖抗体、ヒンジ（例えばＣＤ８アルファ）、膜貫通（例えばＣＤ８アルファ）、および正の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ）を含有する、正のシグナル伝達ＣＡＲ（Ｐ－ＣＡＲ）構築物からなる。Ｐ－ＣＡＲの後ろまたは前には、Ｐ２ＡまたはＩＲＥＳのいずれかによってＰ－ＣＡＲから隔てられた蛍光マーカー（例えばＥＧＦＰ）または抗生物質耐性遺伝子が存在する（例えば表９を参照されたい）。
この構築物は、標準的な分子生物学的方法を用いて構築され、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）陰性の、またはＮＦＡＴ調節型もしくはＮＦκＢ調節型のルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞株に形質導入される。これらの細胞は、蛍光マーカーを用いるバルクＦＡＣＳ選別を用いて、または適切な抗生物質における選択によって精製され、その後、フローサイトメトリーによって表面のＣＡＲ発現が確認され、差次的に発現するＣＤ１９細胞株に対する活性について試験されて、活性化、増殖、およびサイトカイン放出、および脱顆粒／細胞傷害性の閾値が確立される。適切なＰ－ＣＡＲ細胞株が同定されると、これらの細胞は、Ｎ末端から、シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ８分泌シグナル配列）、抗ＰＳＭＡ一本鎖抗体、ヒンジ（例えば、トランケートされたＰＤ－１細胞外ドメイン）、膜貫通（例えばＰＤ－１）、および評価対象の負の細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＴＩＭまたは他の阻害性シグナル伝達ドメインと組み合わされていてもよい、非変性のまたは修飾されたＩＴＳＭ）を含有する負のシグナル伝達ＣＡＲ（Ｎ－ＣＡＲ）構築物を含有し、その後または前に、Ｐ２ＡまたはＩＲＥＳのいずれかによってＮ－ＣＡＲから隔てられた蛍光マーカー（例えばｍＣｈｅｒｒｙ）または抗生物質耐性遺伝子を有する、プラスミドを形質導入される。複数の型のこれらのＮ－ＣＡＲ構築物が、標準的な部位特異的突然変異生成およびカセット突然変異生成を用いて構築される。Ｐ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲを含むＴ細胞（Ｐ－ＣＡＲ＋／Ｎ－ＣＡＲ＋Ｔ細胞またはＮＯＴ ＧＡＴＥ ＣＡＲ Ｔ細胞とも呼ばれる）は、両蛍光マーカー（例えば、ＥＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ）でのバルクＦＡＣＳ選別によって、または適切な抗生物質における連続的な選択によって精製され、その後、デュアルカラーフローサイトメトリーによって両ＣＡＲの表面発現が検出され、そしてＣＤ１９発現細胞上でのＰ－ＣＡＲ活性の保持についてまず試験され、次いで、ＣＤ１９およびＰＳＭＡの両方を発現する細胞に対する負のシグナルの能力が試験される。Ｎ－ＣＡＲ候補は、ＮＦＡＴ調節型またはＮＦκＢ調節型のルシフェラーゼレポーター活性、サイトカイン生産（ＥＬＩＳＡ／ＦＡＣＳによるＩＦＮガンマ）、脱顆粒（ＣＤ１０７ａのレベル）、および標的細胞の死滅（ＦＡＣＳによる）をモニタリングすることによる、様々なレベルのＰ－ＣＡＲ抗原およびＮ－ＣＡＲ抗原の両方に対するＰ－ＣＡＲの正のシグナルを弱める能力を特徴とする。Ｎ－ＣＡＲシグナルの可逆性および可逆性の動態を、Ｐ－ＣＡＲ＋／Ｎ－ＣＡＲ＋Ｔ細胞とＣＤ１９およびＰＳＭＡの両方を発現する細胞とで第１のインキュベーションを行い、それらを精製し、その後、ＣＤ１９細胞とインキュベーションすることによって試験する。これらの細胞のサイトカイン生産および細胞傷害性を、ＣＤ１９細胞と直接的にインキュベートされた細胞と比較する。
実験および結果
Ｊｕｒｋａｔ細胞（クローンＥ６－１ ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ－１５２）を、１０％ウシ胎児血清（ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×ｇｌｕｔａＭＡＸ、１×非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｌｅｓ）内で０．４～２×１０６細胞／ｍＬの密度で維持した。２９３Ｔ細胞（クローンＨＥＫ－２９３Ｔ／１７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）を、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×ｇｌｕｔａＭＡＸ、１×非必須アミノ酸、および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＤＭＥＭ内でサブコンフルエントに維持した。
レンチウイルス粒子（ＬＶ）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、目的のＣＡＲまたはタンパク質をコードする移入ベクター（ｐＬＶＸ）、ＨＩＶ－１ ｇａｇ ｐｏｌパッケージングプラスミド（ｐｓＰＡＸ２）、およびＶＳＶ－Ｇ発現プラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）を４：３：１の比率で有する６ウェルプレート内での、サブコンフルエントな２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生産した。後日、培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後にＬＶを採取し、０．４５ｕｍのＭｉｌｌｅｘ－ＨＶシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。新鮮なＬＶ上清をすぐに用いて、等容積の細胞培養培地内にＬＶ上清を希釈することによってサブコンフルエントなＪｕｒｋａｔまたは２９３Ｔ細胞に形質導入を行った。
人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）を、２９３Ｔ細胞の連続的なＬＶ形質導入によって調製した。サブコンフルエントな２９３Ｔ細胞に、コドン最適化された完全長ヒトＣＤ１９（ＮＰ＿００１１７１５６９）、完全長ヒトＰＳＭＡ（ＮＰ＿００４４６７）、または空のベクターをコードするｐＬＶＸ発現構築物をトランスフェクトした。ｐＬＶＸベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子と、その後にＰ２Ａ配列および標的抗原を含んでいた。形質導入された２９３Ｔは、その後、ピューロマイシン含有培地において選択され、発現クローンのプールとして維持された。表面抗原発現を、ＡＰＣコンジュゲート型ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＰＳＭＡ（クローンＬＮ１－１７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号３４２５０４）またはＢＶ４２１コンジュゲート型マウス抗ヒトＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５６２４４０）を用いて、フローサイトメトリーによって判定した。細胞をＦＡＣＳによって、ＣＤ１９低発現または高発現クローン、ＰＳＭＡ低発現または高発現クローン、および二重ＣＤ１９低／ＰＳＭＡ高発現細胞または二重ＣＤ１９高／ＰＳＭＡ高発現細胞の集団に分類した。
Ｔ細胞活性化を判定するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイをＪｕｒｋａｔ細胞において確立した。Ｊｕｒｋａｔ細胞には、最小（ｍ）ＣＭＶプロモーターおよびＮＦκＢまたはＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）［Ｑｉａｇｅｎ Ｃｉｇｎａｌ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ］のタンデム反復の制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するように形質導入を行った。これらのＴＲＥを認識する転写因子は、Ｔ細胞シグナル伝達経路において重要な役割を有し、サイトカイン遺伝子および免疫応答に重要な他の遺伝子の転写調節に不可欠である。Ｔ細胞受容体が活性化すると、ルシフェラーゼレポーター活性が調節され、定量的ルミノメトリーによって測定され得る。
レポーターＪｕｒｋａｔ細胞（ＮＦＡＴ－ＬｕｃまたはＮＦκＢ－Ｌｕｃ）にはその後、Ｐ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲの異なる組み合わせを安定的に発現するように形質導入を行った。ｐＬＶＸ－ＣＡＲをコードする構築物は、抗生物質耐性遺伝子（Ｐ－ＣＡＲではピューロマイシン耐性、Ｎ－ＣＡＲではブラストサイジン耐性）と、その後にＰ２Ａ配列およびＰ－ＣＡＲまたはＮ－ＣＡＲを含んでいた。
特に、Ｐ－ＣＡＲ１またはＰ－ＣＡＲ２および表１０で列挙される配列から選択される細胞内ドメインを含むＮ－ＣＡＲを発現するＮ－ＦＡＴ－ＬｕｃおよびＮＦκＢ－Ｌｕｃ Ｊｕｒｋａｔ細胞を調製した。
Ｐ－ＣＡＲ１は、抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３のＳｃＦｖ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、（１９９７）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１１５７～１１６５を参照されたい）、ＣＤ８アルファヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
Ｐ－ＣＡＲ２は、抗ＣＤ１９抗体ＳＪ２５Ｃ１のＳｃＦｖ（ＵＳ２０１３０６３０９７を参照されたい）、ＣＤ２８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
Ｐ－ＣＡＲ１およびＰ－ＣＡＲ２の特異的配列を表９に列挙する。
Figure 2022036976000105
試験対象のＮ－ＣＡＲは、配列番号１９９９のアミノ酸配列（抗ＰＳＭＡ抗体Ｊ５９１のＳｃＦｖ（ＷＯ２００４／０９８５３５を参照されたい）、ＰＤ１ヒンジおよび膜貫通ドメイン）、ならびに表１０で列挙される配列から選択される細胞内ドメインを含む。配列番号１９９９のみを含むＣＡＲ（阻害性細胞内ドメインなし）を対照として用いた（ΔＰＤ１）。
Figure 2022036976000106
Figure 2022036976000107
Figure 2022036976000108
形質導入の３日後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を抗生物質選択培地に置いて、安定なＣＡＲ発現クローンのプールを選択した。
形質導入されたＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞における、マルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ１（表９）および表１０で列挙されるＮ－ＣＡＲの二重細胞表面発現を、図１および２に示す。形質導入されたＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞における、マルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ１（表９）および表１０で列挙されるＮ－ＣＡＲの二重細胞表面発現を、図３および４に示す。形質導入されたＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞における、マルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ２（表９）および表１０で列挙されるＮ－ＣＡＲの二重細胞表面発現を、図６および７に示す。形質導入されたＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞における、マルチカラーフローサイトメトリーによって評価されたＰ－ＣＡＲ２および表１０で列挙されるＮ－ＣＡＲの二重細胞表面発現を、図８および９に示す。
細胞にＰ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲレンチウイルスを連続的に形質導入し、各形質導入の後に抗生物質耐性クローンを選択した。様々なＮ－ＣＡＲの細胞内ドメインが、上部の各ドットプロットで示されている。Ｐ－ＣＡＲの発現を、組換えヒトＣＤ１９－マウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質と、その後、ＡＰＣコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗－マウスＦｃγとを用いて検出し（ｘ軸で示す）、Ｎ－ＣＡＲの発現を、ビオチン化された組換えヒトＰＳＭＡ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質と、その後、ＰＥコンジュゲート型ストレプトアビジンとで検出した（ｙ軸）。
インビトロでのＴ細胞活性化アッセイ
共培養アッセイのために、異なる組み合わせのＰ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲを発現するエフェクターＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＤ１９を発現する（オン標的）、ＣＤ１９およびＰＳＭＡの両方を発現する（オフ標的）、またはいずれの抗原も発現しない（空ベクターを形質導入された）ＡＡＰＣと共培養した。ＡＡＰＣ標的細胞を、組織培養物で処理した平底の白い９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣＯＳＴＡＲ）内で、ウェル当たり２００００細胞の密度で播種した。プレートを３７℃で、５％ＣＯ２内で２４時間インキュベートし、その後、培地を除去し、Ｐ－ＣＡＲ１またはＰ－ＣＡＲ２を発現する１０万の対照ΔＰＤ１または試験対象Ｎ－ＣＡＲを形質導入されたルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を１００ｕＬの容積で各ウェルに添加した。３７℃で１６時間のインキュベーションの後、１００ｕＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルごとに添加し、プレートを２分振とうし、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒで定量した。各Ｊｕｒｋａｔ細胞株を６回試験し、結果を、標的ＡＡＰＣとの共培養物の平均ＲＬＵに対する、オフ標的ＡＡＰＣとの共培養物の平均ＲＬＵ値の比率として表した。
図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、Ｐ－ＣＡＲ１誘導型のＴ細胞活性化に対する様々なＮ－ＣＡＲの阻害的効果を示す。Ｐ－ＣＡＲ１を発現する、対照ΔＰＤ１または試験対象Ｎ－ＣＡＲを形質導入されたルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＤ１９発現ＡＡＰＣまたは二重ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ発現ＡＡＰＣとインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を１６時間後に評価した。データは、ＣＤ１９ ＡＡＰＣとの共培養から得られた平均ＲＬＵに対する、ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ ＡＡＰＣとの共培養から得られた平均ＲＬＵの比率として表す。試料当たりｎ＝６複製。示されるデータは、平均±ＳＥＭである。図５Ａ／５Ｃおよび５Ｂは、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターおよびＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を用いた結果をそれぞれ示す。
図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｐ－ＣＡＲ２誘導型のＴ細胞活性化に対する様々なＮ－ＣＡＲの阻害的効果を示す。Ｐ－ＣＡＲ２を発現する、対照ΔＰＤ１または試験対象Ｎ－ＣＡＲを形質導入されたルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＤ１９発現ＡＡＰＣまたは二重ＰＳＭＡ／ＣＤ１９発現ＡＡＰＣとインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を１６時間後に評価した。データは、ＣＤ１９ ＡＡＰＣとの共培養から得られた平均ＲＬＵに対する、ＣＤ１９＋ＰＳＭＡ ＡＡＰＣとの共培養から得られた平均ＲＬＵの比率として表す。試料当たりｎ＝６複製。示されるデータは、平均±ＳＥＭである。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターおよびＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞を用いた結果をそれぞれ示す。
（実施例４）
－一次ヒトＴ細胞におけるＰ－ＣＡＲ＋／Ｎ－ＣＡＲ＋Ｔ細胞の活性
実施例２に従って設計されたＮ－ＣＡＲを一次ヒトＴ細胞においても試験してよく、それは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞で得られた実施例３の結果が一次細胞にも当てはまることを確実にするためである。これは、当業者に知られている方法に従って得られた一次ヒトＴ細胞にＮ－ＣＡＲ構築物をまず導入し、Ｎ－ＣＡＲ抗原の不存在下および存在下での抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によるＴ細胞活性化の減少をモニタリングすることによって行うことができる。さらに、実施例３において開示されるＰ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲ構築物もまた、一次ヒトＴ細胞に形質導入し、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、およびＣＤ１９／ＰＳＭＡ細胞で試験することができる。
（実施例５）
異種移植片研究におけるＰ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲを含むＴ細胞の活性
実施例３において開示されるＰ－ＣＡＲ構築物およびＮ－ＣＡＲ構築物は、一次ヒトＴ細胞に形質導入し、ＣＤ１９のみまたはＣＤ１９およびＰＳＭＡの両方を発現する腫瘍を移植されたＮＳＧ動物における異種移植片研究における有効性について試験することができる。ＮＳＧマウスに、ＣＤ１９またはＣＤ１９およびＰＳＭＡを発現するルシフェラーゼ標識された１０５～１０６細胞を移植する。移植の数日後、これらの動物に１０４～１０６のＰ－ＣＡＲ＋／Ｎ－ＣＡＲ＋Ｔ細胞を静脈内注入する。動物にルシフェリンを投与し、その後、ＩＶＩＳ画像化システムで通常通り画像化して、腫瘍量をモニタリングする。
本発明は、以下の実施形態によってさらに説明される。
１．抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
細胞内ドメイン、
を含み、かつ、
細胞内ドメインが、免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフＩＴＳＭを含み、前記ＩＴＳＭがアミノ酸配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、
Ｘ１がアミノ酸であり、
Ｘ２がアミノ酸であり、
Ｘ３がアミノ酸であり、
Ｘ４がＶまたはＩである、
阻害性キメラ抗原受容体（Ｎ－ＣＡＲ）。
２．細胞外ドメインがＰＳＭＡに対するｓｃＦｖである場合、細胞内ドメインがヒトＰＤ－１の細胞内ドメインではない、実施形態１に記載のＮ－ＣＡＲ。
３．細胞外ドメインがＰＭＳＡに結合しない、実施形態１または２に記載のＮ－ＣＡＲ。
４．細胞内ドメインがＰＤ－１の全細胞内ドメインを含まない、実施形態１から３のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５．ＩＴＳＭモチーフがＴＥＹＡＴＩではない、実施形態１から４のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５．１ 細胞内ドメインがヒトＰＤ１の細胞内ドメインではない、実施形態１から５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５．２ 細胞内ドメインがヒトＢＴＬＡの細胞内ドメインではない、実施形態１から５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５．３ 細胞内ドメインがヒトＣＤ２４４の細胞内ドメインではない、実施形態１から５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５．４ 細胞内ドメインが配列番号２０００、配列番号２００１、または配列番号２００２ではない、実施形態１から５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６．細胞内ドメインが、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
またはその変異体を含み、式中、
ｎが０、１、または２以上の整数であり、
ｍが１、または２以上の整数であり
ｐが１、または２以上の整数であり、
Ｌ１が不在であるか、または
（ａ）ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｂ）ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｃ）上記（b）内の配列にＮ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
（ｄ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含み、
Ｌ２およびＬ３のそれぞれが不在であるか、または
（ｅ）ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｆ）ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｇ）ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、
（ｈ）上記（ｆ）もしくは（ｇ）内の配列にＮ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含み、
Ｌ４が不在であるか、または
（ｊ）ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｋ）ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｌ）上記（ｊ）もしくは（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含み、
ＩＴＩＭが配列Ｘ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９であり、式中、
Ｘ５がＳ、Ｖ、Ｉ、またはＬであり、
Ｘ６がアミノ酸であり、
Ｘ７がアミノ酸であり、
Ｘ８がアミノ酸であり、
Ｘ９がＶ、Ｉ、またはＬであり、
ＩＴＳＭが配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
Ｘ１がアミノ酸であり、
Ｘ２がアミノ酸であり、
Ｘ３がアミノ酸であり、
Ｘ４がＶまたはＩである、
実施形態１から５．４のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７．Ｌ１が不在であるか、または
（ａ）表３に示される配列から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｂ）表１に示される配列から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｃ）上記（ｂ）内の配列もしくはその断片にＮ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
（ｄ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含み、
Ｌ２およびＬ３のそれぞれが不在であるか、または、
（ｅ）表４に示される配列から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｆ）表６に示される配列から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｇ）表５に示される配列から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、
（ｈ）上記（ｆ）もしくは（ｇ）内の配列もしくはその断片にＮ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含み、
Ｌ４が不在であるか、または
（ｊ）表７に示される配列から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｋ）表８に示される配列から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
（ｌ）上記（ｊ）もしくは（ｋ）内の配列もしくはその断片にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含む、
実施形態６に記載のＮ－ＣＡＲ。
８．細胞内ドメインが、配列（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２－Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｐを含み、式中、
ｐが１、２、３、４、または５であり、
Ｌ１が、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域またはその断片、例えば、表３に示される配列のいずれかまたはその断片であり、
Ｌ２が不在であり、
Ｌ３が、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメインまたはその断片、例えば、表５に示される配列のいずれかまたはその断片であり、
Ｌ４が、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、例えば、表７に示される配列のいずれかもしくはその断片、または、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、例えば表８に示される配列のいずれか、もしくはその断片である、
実施形態６または７に記載のＮ－ＣＡＲ。
９．Ｌ１が不在であるか、または、
（ａ）以下から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、
Figure 2022036976000109
 （ｂ）以下から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、
Figure 2022036976000110
 （ｃ）上記（ｂ）内の配列にＮ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、および
（ｄ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含む、実施形態６から８のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
１０．Ｌ２およびＬ３のそれぞれが不在であるか、または、
（ｅ）以下から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、
Figure 2022036976000111
 （ｆ）以下から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、
Figure 2022036976000112
 （ｇ）以下から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメイン、
Figure 2022036976000113
 （ｈ）上記（ｆ）もしくは（ｇ）内の配列にＮ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、および
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含む、実施形態６から９のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
１１．Ｌ４が不在であるか、または、
（ｊ）以下から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、
Figure 2022036976000114
 （ｋ）以下から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、
Figure 2022036976000115
 （ｌ）上記（ｊ）もしくは（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、および
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
からなる群から選択される１つもしくは複数の、好ましくは１つの配列を含む、実施形態６から１０のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
１１．１．細胞内ドメインが、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
を含み、式中、
ｎが０であり、
ｍが１であり、
ｐが１であり、
Ｌ３が、
（ｆ）ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域、例えば以下の表６に示される配列のいずれか、もしくはその断片、または
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
から選択される１つの配列を含み、
Ｌ４が、
（ｋ）ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、例えば以下の表８に示される配列のいずれか、またはその断片、
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、例えば表２に示される配列のいずれか、またはその断片、および
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
からなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは１つまたは２つの配列を含む、
実施形態６に記載のＮ－ＣＡＲ。
１１．２．細胞内ドメインが、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
を含み、式中、
ｎが０であり、
ｍが１であり、
ｐが１であり、
Ｌ３が、
Figure 2022036976000116
 から選択され、
Ｌ４が、
（ｋ）
Figure 2022036976000117
 および場合によって
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、例えば表２に示される配列のいずれか、またはその断片
からなる群から選択される１つの配列を含む、
実施形態６に記載のＮ－ＣＡＲ。
１１．３．細胞内ドメインが、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
を含み、式中、
ｎが０であり、
ｍが１であり、
ｐが１であり、
Ｌ３が、
Figure 2022036976000118
 から選択され、
Ｌ４が、
（ｋ）
Figure 2022036976000119
 および場合によって
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、好ましくはＫＩＲ２ＤＬ２、またはその断片
からなる群から選択される１つの配列を含む、
実施形態６に記載のＮ－ＣＡＲ。
１１．４．細胞内ドメインが、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
を含み、式中、
ｎが０であり、
ｍが１であり、
ｐが１であり、
Ｌ３が、
Figure 2022036976000120
 から選択され、
Ｌ４が、
（ｋ）
Figure 2022036976000121
 および
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、好ましくはＫＩＲ２ＤＬ２、またはその断片
を含む、
実施形態６に記載のＮ－ＣＡＲ。
１１．５．細胞内ドメインが、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
を含み、式中、
ｎが０であり、
ｍが１であり、
ｐが１であり、
Ｌ３が、
Figure 2022036976000122
 から選択され、
Ｌ４が、
（ｋ）
Figure 2022036976000123
 および場合によって
（ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメイン、またはその断片
から選択される配列を含む、
実施形態６に記載のＮ－ＣＡＲ。
１１．６．細胞内ドメインが、配列
（（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
を含み、式中、
ｎが０であり、
ｍが１であり、
ｐが１または２であり、
Ｌ３が、
（ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
から選択される１つの配列を含み、
Ｌ４が、
（ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
から選択される１つまたは複数の、好ましくは１つまたは２つの配列を含む、
実施形態６に記載のＮ－ＣＡＲ。
１１．７．細胞内ドメインが、配列番号２０００、配列番号２００１、配列番号２００２、配列番号２００３、配列番号２００４、配列番号２００５、配列番号２００６、配列番号２００７、配列番号２００８、配列番号２００９、配列番号２０１０、配列番号２０１１、配列番号２０１２、配列番号２０１３、配列番号２０１４、配列番号２０１５、配列番号２０１６および配列番号２０１７から選択される、実施形態６に記載のＮ－ＣＡＲ。
１２．（ｄ）、（ｉ）、および（ｍ）の非天然の配列が、１から４００までの間、１から３００までの間、１から２００までの間、１から１００までの間、１０から１００までの間、１０から８０までの間、１０から６０までの間、１０から４０までの間、１００から２００までの間、１００から３００までの間、または１００から４００までの間のアミノ酸を含む、実施形態６から１１．７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
１３．（ｄ）または（ｉ）の非天然の配列がグリシン／セリンリンカー（ＧｌｙＸＳｅｒ）ｎであり、式中、ｘ＝１、２、３、４、または５であり、ｎが１から１００である、実施形態６から１１．７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
１４．（ｄ）または（ｉ）の非天然の配列が、グリシン／セリンリンカー（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎまたは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎであり、式中、ｎが１から１００、１から８０、１から５０、１から２０、または１から１０である、実施形態１３に記載のＮ－ＣＡＲ。
１５．（ｄ）または（ｉ）の非天然の配列が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である、実施形態１４に記載のＮ－ＣＡＲ。
１６．細胞内ドメインが、配列（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２－Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｐを含み、式中、
ｐが１、２、３、４、または５であり、
Ｌ１が、以下の配列
Figure 2022036976000124
 から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域であり、
Ｌ２が不在であり、
Ｌ３が、以下の配列
Figure 2022036976000125
 から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメインであり、
Ｌ４が、以下の配列
Figure 2022036976000126
 から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域、または
以下の配列
Figure 2022036976000127
 から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域である、
実施形態６から１５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
１７．用語アミノ酸が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンを指す、実施形態１から１６のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
１８．Ｘ１がＥ、Ｖ、またはＩである、実施形態１から１７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
１９．Ｘ１がＥである、実施形態１から１８のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２０．Ｘ２がＳまたはＡである、実施形態１から１９のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２１．Ｘ２がＡである、実施形態１から２０のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２２．Ｘ３がＥ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、またはＶである、実施形態１から２１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２３．Ｘ３がＥである、実施形態１から２２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２４．Ｘ３がＴである、実施形態１から２３のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２５．Ｘ２がＩである、実施形態１から２４のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２６．Ｘ５がＬ、Ｖ、またはＩである、実施形態７から２５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２７．Ｘ５がＬである、実施形態７から２６のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２８．Ｘ５がＶである、実施形態７から２６のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
２９．Ｘ５がＩである、実施形態７から２６のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３０．Ｘ６がＡ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｖ、Ｌ、またはＥである、実施形態７から２９のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３１．Ｘ６がＨである、実施形態７から３０のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３２．Ｘ６がＤである、実施形態７から３０のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３３．Ｘ７がＡ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、またはＥである、実施形態７から３２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３４．Ｘ７がＡである、実施形態７から３３のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３５．Ｘ７がＧである、実施形態７から３３のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３６．Ｘ８がＶ、Ｓ、Ｄ、またはＥである、実施形態７から３５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３７．Ｘ８がＳまたはＥである、実施形態７から３６のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３８．Ｘ８がＥである、実施形態７から３７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
３９．Ｘ９がＬまたはＶである、実施形態７から３８のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４０．Ｘ９がＬである、実施形態７から３８のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４１．Ｘ５がＬまたはＶであり、Ｘ８がＥであり、Ｘ９がＬである、実施形態７から４０のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４２．ＩＴＳＭが、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つが、ＴＡＹＥＬＶ、ＴＡＹＧＬＩ、ＴＡＹＮＡＶ、ＴＣＹＧＬＶ、ＴＣＹＰＤＩ、ＴＤＹＡＳＩ、ＴＤＹＤＬＶ、ＴＤＹＬＳＩ、ＴＤＹＱＱＶ、ＴＤＹＹＲＶ、ＴＥＹＡＳＩ、ＴＥＹＡＴＩ、ＴＥＹＤＴＩ、ＴＥＹＰＬＶ、ＴＥＹＳＥＩ、ＴＥＹＳＥＶ、ＴＥＹＳＴＩ、ＴＥＹＴＫＶ、ＴＦＹＨＶＶ、ＴＦＹＬＬＩ、ＴＦＹＮＫＩ、ＴＦＹＰＤＩ、ＴＧＹＥＤＶ、ＴＧＹＬＳＩ、ＴＨＹＫＥＩ、ＴＩＹＡＱＶ、ＴＩＹＡＶＶ、ＴＩＹＣＳＩ、ＴＩＹＥＤＶ、ＴＩＹＥＲＩ、ＴＩＹＥＶＩ、ＴＩＹＨＶＩ、ＴＩＹＩＧＶ、ＴＩＹＬＫＶ、ＴＩＹＳＭＩ、ＴＩＹＳＴＩ、ＴＩＹＴＹＩ、ＴＫＹＦＨＩ、ＴＫＹＭＥＩ、ＴＫＹＱＳＶ、ＴＫＹＳＮＩ、ＴＫＹＳＴＶ、ＴＬＹＡＳＶ、ＴＬＹＡＶＶ、ＴＬＹＦＷＶ、ＴＬＹＨＬＶ、ＴＬＹＰＭＶ、ＴＬＹＰＰＩ、ＴＬＹＲＤＩ、ＴＬＹＲＤＶ、ＴＬＹＳＫＩ、ＴＬＹＳＬＩ、ＴＬＹＳＰＶ、ＴＭＹＡＱＶ、ＴＭＹＣＱＶ、ＴＮＹＫＡＶ、ＴＮＹＮＬＶ、ＴＰＹＡＧＩ、ＴＰＹＰＧＶ、ＴＰＹＶＤＩ、ＴＱＹＧＲＶ、ＴＱＹＮＱＶ、ＴＲＹＡＹＶ、ＴＲＹＧＥＶ、ＴＲＹＨＳＶ、ＴＲＹＫＴＩ、ＴＲＹＬＡＩ、ＴＲＹＭＡＩ、ＴＲＹＱＫＩ、ＴＲＹＱＱＩ、ＴＲＹＳＮＩ、ＴＲＹＳＰＩ、ＴＳＹＧＴＶ、ＴＳＹＭＥＶ、ＴＳＹＱＧＶ、ＴＳＹＴＴＩ、ＴＴＹＲＳＩ、ＴＴＹＳＤＶ、ＴＴＹＶＴＩ、ＴＶＹＡＱＩ、ＴＶＹＡＳＶ、ＴＶＹＥＶＩ、ＴＶＹＧＤＶ、ＴＶＹＫＧＩ、ＴＶＹＱＲＶ、ＴＶＹＳＥＶ、ＴＶＹＳＴＶ、ＴＹＹＨＳＩ、ＴＹＹＬＱＩ、またはＴＹＹＹＳＶから選択される、実施形態１から４１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４３．ＩＴＳＭが、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つがＴＥＹＡＳＩである、実施形態１から４２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４４．ＩＴＳＭが、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つがＴＥＹＳＥＩである、実施形態１から４３のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４４．１ ＩＴＳＭが、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つがＴＥＹＳＴＩである、実施形態１から４４のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４５．ＩＴＳＭが、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つがＴＶＹＳＥＶである、実施形態１から４４．１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４６．ＩＴＩＭが、または、いくつかのＩＴＩＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＩＭの少なくとも１つが、ＬＳＹＲＳＬ、ＬＰＹＹＤＬ、ＬＰＹＹＤＬ、ＬＬＹＳＲＬ、ＬＬＹＳＲＬ、ＬＩＹＴＬＬ、ＬＬＹＡＤＬ、ＩＳＹＴＴＬ、ＶＴＹＳＡＬ、ＩＨＹＳＥＬ、ＶＤＹＶＩＬ、ＬＨＹＡＳＬ、ＬＤＹＤＹＬ、ＶＤＹＤＦＬ、ＶＴＹＳＴＬ、ＩＩＹＳＥＶ、ＬＥＹＬＣＬ、ＶＬＹＧＱＬ、ＶＰＹＴＰＬ、ＩＳＹＰＭＬ、ＩＳＹＰＭＬ、ＩＳＹＰＭＬ、ＶＳＹＴＮＬ、ＬＬＹＥＭＶ、ＶＤＹＮＬＶ、ＩＴＹＦＡＬ、ＶＨＹＱＳＶ、ＶＰＹＶＭＶ、ＩＰＹＲＴＶ、ＩＡＹＳＬＬ、ＶＣＹＧＲＬ、ＬＫＹＬＹＬ、ＬＬＹＥＨＶ、ＩＴＹＳＬＬ、ＶＬＹＳＥＬ、ＩＷＹＮＩＬ、ＩＳＹＫＧＬ、ＩＤＹＹＮＬ、ＬＥＹＬＱＬ、ＬＫＹＲＧＬ、ＶＬＹＡＳＶ、ＬＱＹＬＳＬ、ＬＦＹＲＨＬ、ＶＱＹＫＡＶ、ＬＳＹＳＳＬ、ＬＳＹＴＫＶ、ＶＱＹＳＴＶ、ＶＫＹＮＰＶ、ＶＶＹＳＥＶ、ＶＶＹＳＥＶ、ＩＩＹＳＥＶ、ＬＥＹＶＳＶ、ＬＡＹＨＴＶ、ＶＱＹＬＲＬ、ＶＴＹＴＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＴＱＬ、ＩＶＹＡＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＶＹＴＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＬＹＴＥＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＴＹＡＡＶ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＴＹＡＡＶ、ＶＩＹＩＤＶ、ＶＴＹＡＥＶ、ＶＴＹＡＱＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＶＴＹＡＰＶ、ＶＴＹＡＱＬ、ＶＴＹＡＫＶ、ＶＴＹＡＲＬ、ＶＴＹＡＱＬ、ＩＬＹＨＴＶ、ＬＬＹＳＲＬ、ＶＬＹＡＭＬ、ＶＩＹＡＱＬ、ＬＶＹＥＮＬ、ＬＣＹＡＤＬ、ＩＳＹＡＳＬ、ＬＴＹＶＬＬ、ＶＴＹＶＮＬ、ＶＲＹＳＩＶ、ＶＦＹＲＱＶ、ＶＦＹＲＱＶ、ＬＫＹＭＥＶ、ＬＫＹＭＥＶ、ＶＤＹＧＥＬ、ＬＳＹＭＤＬ、ＶＬＹＴＡＶ、ＶＱＹＴＥＶ、ＩＶＹＡＳＬ、ＶＥＹＬＥＶ、ＬＥＹＶＤＬ、ＩＴＹＡＤＬ、ＬＴＹＡＤＬ、ＩＴＹＡＤＬ、ＬＴＹＡＤＬ、ＶＩＹＥＮＶ、ＶＩＹＥＮＶ、ＶＩＹＥＮＶ、ＶＩＹＥＮＶ、ＬＡＹＹＴＶ、ＶＳＹＳＡＶ、ＬＶＹＤＫＬ、ＬＮＹＭＶＬ、ＬＮＹＡＣＬ、ＬＤＹＩＮＶ、ＬＨＹＡＴＬ、ＬＨＹＡＳＬ、ＬＨＹＡＳＬ、ＬＨＹＡＶＬ、ＩＱＹＡＰＬ、ＩＱＹＡＳＬ、ＩＱＹＡＳＬ、ＬＬＹＬＬＬ、ＶＶＹＳＱＶ、ＶＩＹＳＳＶ、ＶＶＹＳＱＶ、ＶＩＹＳＳＶ、ＶＶＹＹＲＶ、ＶＰＹＶＥＬ、ＬＤＹＤＫＬ、ＬＰＹＹＤＬ、ＬＳＹＰＶＬ、ＶＡＹＳＱＶ、ＬＦＹＷＤＶ、ＬＦＹＷＤＶ、ＬＩＹＳＱＶ、またはＬＤＹＥＦＬから選択される、実施形態７から４５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４７．ＩＴＩＭが、または、いくつかのＩＴＩＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＩＭの少なくとも１つが、ＩＡＹＧＤＩ、ＩＡＹＲＤＬ、ＩＡＹＳＬＬ、ＩＡＹＳＲＬ、ＩＣＹＡＬＬ、ＩＣＹＤＡＬ、ＩＣＹＰＬＬ、ＩＣＹＱＬＩ、ＩＤＹＩＬＶ、ＩＤＹＫＴＬ、ＩＤＹＴＱＬ、ＩＤＹＹＮＬ、ＩＥＹＣＫＬ、ＩＥＹＤＱＩ、ＩＥＹＧＰＬ、ＩＥＹＩＲＶ、ＩＥＹＫＳＬ、ＩＥＹＫＴＬ、ＩＥＹＳＶＬ、ＩＥＹＷＧＩ、ＩＦＹＧＮＶ、ＩＦＹＨＮＬ、ＩＦＹＫＤＩ、ＩＦＹＱＮＶ、ＩＦＹＲＬＩ、ＩＧＹＤＩＬ、ＩＧＹＤＶＬ、ＩＧＹＩＣＬ、ＩＧＹＫＡＩ、ＩＧＹＬＥＬ、ＩＧＹＬＰＬ、ＩＧＹＬＲＬ、ＩＧＹＰＦＬ、ＩＧＹＳＤＬ、ＩＨＹＲＱＩ、ＩＨＹＳＥＬ、ＩＩＹＡＦＬ、ＩＩＹＨＶＩ、ＩＩＹＭＦＬ、ＩＩＹＮＬＬ、ＩＩＹＮＮＬ、ＩＩＹＳＥＶ、ＩＫＹＣＬＶ、ＩＫＹＫＥＬ、ＩＫＹＬＡＬ、ＩＫＹＴＣＩ、ＩＬＹＡＤＩ、ＩＬＹＡＦＬ、ＩＬＹＣＳＶ、ＩＬＹＥＧＬ、ＩＬＹＥＬＬ、ＩＬＹＦＱＩ、ＩＬＹＨＴＶ、ＩＬＹＬＱＶ、ＩＬＹＳＩＬ、ＩＬＹＳＶＬ、ＩＬＹＴＥＬ、ＩＬＹＴＩＬ、ＩＭＹＴＬＶ、ＩＮＹＣＳＶ、ＩＮＹＫＤＩ、ＩＮＹＴＴＶ、ＩＮＹＶＬＬ、ＩＰＹＤＶＬ、ＩＰＹＬＬＶ、ＩＰＹＲＴＶ、ＩＰＹＳＱＬ、ＩＰＹＳＲＩ、ＩＰＹＴＱＩ、ＩＱＹＡＰＬ、ＩＱＹＡＳＬ、ＩＱＹＥＲＬ、ＩＱＹＧＩＩ、ＩＱＹＧＮＶ、ＩＱＹＧＲＶ、ＩＱＹＮＶＶ、ＩＱＹＲＳＩ、ＩＱＹＴＥＬ、ＩＱＹＷＧＩ、ＩＲＹＡＮＬ、ＩＲＹＬＤＬ、ＩＲＹＰＬＬ、ＩＲＹＲＬＬ、ＩＲＹＲＴＩ、ＩＳＹＡＳＬ、ＩＳＹＣＧＶ、ＩＳＹＥＰＩ、ＩＳＹＦＱＩ、ＩＳＹＧＬＩ、ＩＳＹＫＫＬ、ＩＳＹＬＰＬ、ＩＳＹＰＭＬ、ＩＳＹＴＴＬ、ＩＴＹＡＡＶ、ＩＴＹＡＤＬ、ＩＴＹＡＥＬ、ＩＴＹＡＥＶ、ＩＴＹＡＳＶ、ＩＴＹＤＬＩ、ＩＴＹＥＮＶ、ＩＴＹＱＬＬ、ＩＴＹＳＬＬ、ＩＶＹＡＥＬ、ＩＶＹＡＬＶ、ＩＶＹＡＳＬ、ＩＶＹＥＩＬ、ＩＶＹＦＩＬ、ＩＶＹＨＭＬ、ＩＶＹＬＣＩ、ＩＶＹＲＬＬ、ＩＶＹＳＡＬ、ＩＶＹＳＷＶ、ＩＶＹＴＥＬ、ＩＶＹＹＩＬ、ＩＷＹＥＮＬ、ＩＷＹＦＶＶ、ＩＷＹＮＩＬ、ＩＹＹＬＧＶ、ＬＡＹＡＬＬ、ＬＡＹＡＲＩ、ＬＡＹＤＳＶ、ＬＡＹＦＧＶ、ＬＡＹＨＲＬ、ＬＡＹＫＤＬ、ＬＡＹＫＲＩ、ＬＡＹＰＰＬ、ＬＡＹＱＴＬ、ＬＡＹＲＥＶ、ＬＡＹＲＩＩ、ＬＡＹＲＬＬ、ＬＡＹＳＱＬ、ＬＡＹＳＳＶ、ＬＡＹＴＬＬ、ＬＡＹＷＧＩ、ＬＡＹＹＴＶ、ＬＣＹＡＤＬ、ＬＣＹＡＩＬ、ＬＣＹＦＨＬ、ＬＣＹＨＰＩ、ＬＣＹＫＥＩ、ＬＣＹＫＦＬ、ＬＣＹＭＩＩ、ＬＣＹＲＫＩ、ＬＣＹＲＶＬ、ＬＣＹＳＴＶ、ＬＣＹＴＬＶ、ＬＤＹＡＳＩ、ＬＤＹＣＥＬ、ＬＤＹＤＫＩ、ＬＤＹＤＫＬ、ＬＤＹＤＹＬ、ＬＤＹＤＹＶ、ＬＤＹＥＦＬ、ＬＤＹＩＮＶ、ＬＤＹＮＮＬ、ＬＤＹＰＨＶ、ＬＤＹＳＰＶ、ＬＤＹＶＥＩ、ＬＤＹＷＧＩ、ＬＥＹＡＰＶ、ＬＥＹＩＰＬ、ＬＥＹＫＴＩ、ＬＥＹＬＣＬ、ＬＥＹＬＫＬ、ＬＥＹＬＱＩ、ＬＥＹＬＱＬ、ＬＥＹＱＲＬ、ＬＥＹＶＤＬ、ＬＥＹＶＳＶ、ＬＥＹＹＱＩ、ＬＦＹＡＱＬ、ＬＦＹＣＳＶ、ＬＦＹＥＲＶ、ＬＦＹＧＦＬ、ＬＦＹＫＹＶ、ＬＦＹＬＬＬ、ＬＦＹＮＫＶ、ＬＦＹＲＨＬ、ＬＦＹＴＬＬ、ＬＦＹＷＤＶ、ＬＦＹＷＫＬ、ＬＧＹＧＮＶ、ＬＧＹＫＥＬ、ＬＧＹＬＱＬ、ＬＧＹＰＬＩ、ＬＧＹＰＷＶ、ＬＧＹＳＡＬ、ＬＧＹＳＤＬ、ＬＧＹＶＴＬ、ＬＨＹＡＫＩ、ＬＨＹＡＬＶ、ＬＨＹＡＮＬ、ＬＨＹＡＲＬ、ＬＨＹＡＳＩ、ＬＨＹＡＳＬ、ＬＨＹＡＳＶ、ＬＨＹＡＴＩ、ＬＨＹＡＴＬ、ＬＨＹＡＶＬ、ＬＨＹＤＶＶ、ＬＨＹＥＧＬ、ＬＨＹＥＴＩ、ＬＨＹＦＥＩ、ＬＨＹＦＶＶ、ＬＨＹＧＡＩ、ＬＨＹＩＬＩ、ＬＨＹＩＮＬ、ＬＨＹＫＲＩ、ＬＨＹＬＤＬ、ＬＨＹＬＮＩ、ＬＨＹＬＴＩ、ＬＨＹＬＶＩ、ＬＨＹＭＡＩ、ＬＨＹＭＩＩ、ＬＨＹＭＮＩ、ＬＨＹＭＴＩ、ＬＨＹＭＴＬ、ＬＨＹＭＴＶ、ＬＨＹＭＶＩ、ＬＨＹＮＭＬ、ＬＨＹＰＡＬ、ＬＨＹＰＤＬ、ＬＨＹＰＩＩ、ＬＨＹＰＩＬ、ＬＨＹＰＬＬ、ＬＨＹＰＭＬ、ＬＨＹＰＮＶ、ＬＨＹＰＳＩ、ＬＨＹＰＴＩ、ＬＨＹＰＴＬ、ＬＨＹＰＴＶ、ＬＨＹＰＶＩ、ＬＨＹＰＶＬ、ＬＨＹＲＩＩ、ＬＨＹＲＴＩ、ＬＨＹＳＩＩ、ＬＨＹＳＳＩ、ＬＨＹＳＴＩ、ＬＨＹＳＴＬ、ＬＨＹＳＶＩ、ＬＨＹＴＡＩ、ＬＨＹＴＡＬ、ＬＨＹＴＩＩ、ＬＨＹＴＫＶ、ＬＨＹＴＬＩ、ＬＨＹＴＳＩ、ＬＨＹＴＴＩ、ＬＨＹＴＴＶ、ＬＨＹＴＶＩ、ＬＨＹＴＶＬ、ＬＨＹＴＶＶ、ＬＨＹＶＳＩ、ＬＨＹＶＴＩ、ＬＨＹＶＶＩ、ＬＩＹＥＫＬ、ＬＩＹＥＮＶ、ＬＩＹＫＤＬ、ＬＩＹＮＳＬ、ＬＩＹＳＧＬ、ＬＩＹＴＬＬ、ＬＩＹＴＶＬ、ＬＩＹＷＥＩ、ＬＫＹＣＥＬ、ＬＫＹＤＫＬ、ＬＫＹＥＳＬ、ＬＫＹＦＴＩ、ＬＫＹＨＴＶ、ＬＫＹＩＬＬ、ＬＫＹＩＰＩ、ＬＫＹＫＨＶ、ＬＫＹＬＹＬ、ＬＫＹＭＥＶ、ＬＫＹＭＴＬ、ＬＫＹＰＡＩ、ＬＫＹＰＤＶ、ＬＫＹＰＥＬ、ＬＫＹＱＰＩ、ＬＫＹＲＧＬ、ＬＫＹＲＬＬ、ＬＬＹＡＤＬ、ＬＬＹＡＰＬ、ＬＬＹＡＶＶ、ＬＬＹＣＡＩ、ＬＬＹＥＨＶ、ＬＬＹＥＬＬ、ＬＬＹＥＱＬ、ＬＬＹＧＱＩ、ＬＬＹＩＲＬ、ＬＬＹＫＡＬ、ＬＬＹＫＦＬ、ＬＬＹＫＬＬ、ＬＬＹＫＴＶ、ＬＬＹＭＶＶ、ＬＬＹＮＡＩ、ＬＬＹＮＩＶ、ＬＬＹＮＶＩ、ＬＬＹＰＡＩ、ＬＬＹＰＬＩ、ＬＬＹＰＮＩ、ＬＬＹＰＳＬ、ＬＬＹＰＴＩ、ＬＬＹＰＶＩ、ＬＬＹＰＶＶ、ＬＬＹＱＩＬ、ＬＬＹＱＮＩ、ＬＬＹＲＬＬ、ＬＬＹＲＶＩ、ＬＬＹＳＩＩ、ＬＬＹＳＬＩ、ＬＬＹＳＰＶ、ＬＬＹＳＲＬ、ＬＬＹＳＴＩ、ＬＬＹＳＶＩ、ＬＬＹＳＶＶ、ＬＬＹＴＴＩ、ＬＬＹＴＶＩ、ＬＬＹＴＶＶ、ＬＬＹＶＩＩ、ＬＬＹＶＩＬ、ＬＬＹＶＴＩ、ＬＬＹＷＧＩ、ＬＬＹＹＬＬ、ＬＬＹＹＶＩ、ＬＭＹＤＮＶ、ＬＭＹＭＶＶ、ＬＭＹＱＥＬ、ＬＭＹＲＧＩ、ＬＮＹＡＣＬ、ＬＮＹＡＴＩ、ＬＮＹＥＶＩ、ＬＮＹＧＤＬ、ＬＮＹＨＫＬ、ＬＮＹＭＶＬ、ＬＮＹＮＩＶ、ＬＮＹＰＶＩ、ＬＮＹＱＭＩ、ＬＮＹＳＧＶ、ＬＮＹＳＶＩ、ＬＮＹＴＩＬ、ＬＮＹＴＴＩ、ＬＮＹＶＰＩ、ＬＰＹＡＤＬ、ＬＰＹＡＬＬ、ＬＰＹＦＮＩ、ＬＰＹＦＮＶ、ＬＰＹＨＤＬ、ＬＰＹＫＬＩ、ＬＰＹＫＴＬ、ＬＰＹＬＧＶ、ＬＰＹＬＫＶ、ＬＰＹＰＡＬ、ＬＰＹＱＶＶ、ＬＰＹＲＴＶ、ＬＰＹＶＥＩ、ＬＰＹＹＤＬ、ＬＱＹＡＳＬ、ＬＱＹＥＲＩ、ＬＱＹＦＡＶ、ＬＱＹＦＳＩ、ＬＱＹＨＮＩ、ＬＱＹＩＧＬ、ＬＱＹＩＫＩ、ＬＱＹＬＳＬ、ＬＱＹＭＩＶ、ＬＱＹＰＡＩ、ＬＱＹＰＬＬ、ＬＱＹＰＬＶ、ＬＱＹＰＳＩ、ＬＱＹＰＴＬ、ＬＱＹＰＶＬ、ＬＱＹＲＡＶ、ＬＱＹＳＡＩ、ＬＱＹＳＳＩ、ＬＱＹＳＶＩ、ＬＱＹＴＩＬ、ＬＱＹＴＬＩ、ＬＱＹＴＭＩ、ＬＱＹＹＱＶ、ＬＲＹＡＡＶ、ＬＲＹＡＧＬ、ＬＲＹＡＰＬ、ＬＲＹＡＳＩ、ＬＲＹＡＴＩ、ＬＲＹＡＴＶ、ＬＲＹＡＶＬ、ＬＲＹＣＧＩ、ＬＲＹＥＬＬ、ＬＲＹＥＴＬ、ＬＲＹＧＡＬ、ＬＲＹＧＰＩ、ＬＲＹＧＴＬ、ＬＲＹＨＨＩ、ＬＲＹＨＳＩ、ＬＲＹＨＶＬ、ＬＲＹＩＡＩ、ＬＲＹＩＦＶ、ＬＲＹＩＴＶ、ＬＲＹＫＥＶ、ＬＲＹＫＫＬ、ＬＲＹＫＭＶ、ＬＲＹＫＳＬ、ＬＲＹＫＶＩ、ＬＲＹＬＡＩ、ＬＲＹＬＤＬ、ＬＲＹＬＴＩ、ＬＲＹＬＴＶ、ＬＲＹＭＳＩ、ＬＲＹＭＶＩ、ＬＲＹＮＣＩ、ＬＲＹＮＧＬ、ＬＲＹＮＩＩ、ＬＲＹＮＩＬ、ＬＲＹＮＫＩ、ＬＲＹＮＳＬ、ＬＲＹＮＶＩ、ＬＲＹＮＶＬ、ＬＲＹＰＦＬ、ＬＲＹＰＩＩ、ＬＲＹＰＩＬ、ＬＲＹＰＬＬ、ＬＲＹＰＮＩ、ＬＲＹＰＳＩ、ＬＲＹＰＴＩ、ＬＲＹＰＴＬ、ＬＲＹＰＶＩ、ＬＲＹＰＶＬ、ＬＲＹＱＫＬ、ＬＲＹＱＭＩ、ＬＲＹＱＮＬ、ＬＲＹＲＬＩ、ＬＲＹＲＶＩ、ＬＲＹＳＡＩ、ＬＲＹＳＤＬ、ＬＲＹＳＩＩ、ＬＲＹＳＭＩ、ＬＲＹＳＳＩ、ＬＲＹＳＴＩ、ＬＲＹＳＴＬ、ＬＲＹＳＶＩ、ＬＲＹＳＶＬ、ＬＲＹＳＶＶ、ＬＲＹＴＡＩ、ＬＲＹＴＩＬ、ＬＲＹＴＬＩ、ＬＲＹＴＭＩ、ＬＲＹＴＮＬ、ＬＲＹＴＰＶ、ＬＲＹＴＳＩ、ＬＲＹＴＳＶ、ＬＲＹＴＴＩ、ＬＲＹＴＴＶ、ＬＲＹＴＶＩ、ＬＲＹＶＥＶ、ＬＲＹＶＴＩ、ＬＲＹＶＴＶ、ＬＳＹＤＳＬ、ＬＳＹＥＤＶ、ＬＳＹＦＧＶ、ＬＳＹＩＬＩ、ＬＳＹＩＳＶ、ＬＳＹＫＱＶ、ＬＳＹＫＲＬ、ＬＳＹＬＤＶ、ＬＳＹＭＤＬ、ＬＳＹＮＡＬ、ＬＳＹＮＤＬ、ＬＳＹＮＫＬ、ＬＳＹＮＱＬ、ＬＳＹＰＶＬ、ＬＳＹＱＥＶ、ＬＳＹＱＰＶ、ＬＳＹＱＴＩ、ＬＳＹＲＳＬ、ＬＳＹＲＳＶ、ＬＳＹＳＩＩ、ＬＳＹＳＳＬ、ＬＳＹＳＴＬ、ＬＳＹＴＫＶ、ＬＳＹＴＳＩ、ＬＳＹＴＴＩ、ＬＳＹＶＬＩ、ＬＴＹＡＤＬ、ＬＴＹＡＥＬ、ＬＴＹＡＱＶ、ＬＴＹＡＲＬ、ＬＴＹＣＤＬ、ＬＴＹＣＧＬ、ＬＴＹＣＶＬ、ＬＴＹＥＥＬ、ＬＴＹＥＦＬ、ＬＴＹＧＥＶ、ＬＴＹＧＲＬ、ＬＴＹＫＡＬ、ＬＴＹＬＲＬ、ＬＴＹＭＴＬ、ＬＴＹＮＴＬ、ＬＴＹＰＧＩ、ＬＴＹＱＳＶ、ＬＴＹＳＳＶ、ＬＴＹＴＴＶ、ＬＶＹＤＡＩ、ＬＶＹＤＫＬ、ＬＶＹＤＬＶ、ＬＶＹＥＮＬ、ＬＶＹＧＱＬ、ＬＶＹＨＫＬ、ＬＶＹＱＥＶ、ＬＶＹＲＫＶ、ＬＶＹＲＮＬ、ＬＶＹＳＥＩ、ＬＶＹＴＮＶ、ＬＶＹＷＥＩ、ＬＶＹＷＫＬ、ＬＶＹＷＲＬ、ＬＷＹＥＧＬ、ＬＷＹＫＹＩ、ＬＷＹＮＨＩ、ＬＷＹＴＭＩ、ＬＹＹＣＱＬ、ＬＹＹＧＤＬ、ＬＹＹＫＫＶ、ＬＹＹＬＬＩ、ＬＹＹＰＫＶ、ＬＹＹＲＲＶ、ＬＹＹＳＴＩ、ＬＹＹＶＲＩ、ＬＹＹＶＶＩ、ＳＡＹＡＴＬ、ＳＡＹＣＰＬ、ＳＡＹＰＡＬ、ＳＡＹＱＡＬ、ＳＡＹＱＴＩ、ＳＡＹＲＳＶ、ＳＡＹＴＡＬ、ＳＡＹＴＰＬ、ＳＡＹＶＶＬ、ＳＣＹＡＡＶ、ＳＣＹＣＩＩ、ＳＣＹＣＬＬ、ＳＣＹＤＦＬ、ＳＣＹＥＥＬ、ＳＣＹＥＫＩ、ＳＣＹＨＩＬ、ＳＣＹＰＹＩ、ＳＣＹＲＩＬ、ＳＣＹＲＴＬ、ＳＤＹＣＮＬ、ＳＤＹＥＤＬ、ＳＤＹＥＮＶ、ＳＤＹＥＳＶ、ＳＤＹＦＩＶ、ＳＤＹＨＴＬ、ＳＤＹＬＡＩ、ＳＤＹＬＤＩ、ＳＤＹＬＥＬ、ＳＤＹＱＤＬ、ＳＤＹＱＲＬ、ＳＤＹＳＶＩ、ＳＤＹＴＨＬ、ＳＥＹＡＳＶ、ＳＥＹＥＥＬ、ＳＥＹＦＥＬ、ＳＥＹＧＥＬ、ＳＥＹＩＴＬ、ＳＥＹＫＡＬ、ＳＥＹＫＥＬ、ＳＥＹＫＧＩ、ＳＥＹＬＡＩ、ＳＥＹＬＥＩ、ＳＥＹＭＶＩ、ＳＥＹＱＳＩ、ＳＥＹＲＰＩ、ＳＥＹＳＥＩ、ＳＥＹＳＳＩ、ＳＥＹＴＰＩ、ＳＥＹＴＹＶ、ＳＦＹＡＡＬ、ＳＦＹＤＳＬ、ＳＦＹＫＧＬ、ＳＦＹＬＹＶ、ＳＦＹＮＡＶ、ＳＦＹＰＳＶ、ＳＦＹＱＱＩ、ＳＦＹＱＱＬ、ＳＦＹＳＡＬ、ＳＦＹＳＤＩ、ＳＦＹＳＫＬ、ＳＦＹＳＲＶ、ＳＦＹＷＮＶ、ＳＦＹＹＬＩ、ＳＧＹＡＱＬ、ＳＧＹＡＴＬ、ＳＧＹＥＫＬ、ＳＧＹＱＬＶ、ＳＧＹＱＲＩ、ＳＧＹＲＲＬ、ＳＧＹＳＨＬ、ＳＧＹＳＱＬ、ＳＧＹＴＬＩ、ＳＧＹＴＲＩ、ＳＧＹＹＲＶ、ＳＨＹＡＤＶ、ＳＨＹＦＰＬ、ＳＨＹＩＤＩ、ＳＨＹＫＲＬ、ＳＨＹＱＶＶ、ＳＩＹＡＰＬ、ＳＩＹＡＴＬ、ＳＩＹＥＥＬ、ＳＩＹＥＥＶ、ＳＩＹＥＬＬ、ＳＩＹＥＶＬ、ＳＩＹＧＤＬ、ＳＩＹＫＫＬ、ＳＩＹＬＮＩ、ＳＩＹＬＶＩ、ＳＩＹＲＹＩ、ＳＩＹＳＷＩ、ＳＫＹＫＥＩ、ＳＫＹＫＩＬ、ＳＫＹＫＳＬ、ＳＫＹＬＡＶ、ＳＫＹＬＧＶ、ＳＫＹＮＩＬ、ＳＫＹＱＡＶ、ＳＫＹＳＤＩ、ＳＫＹＳＳＬ、ＳＫＹＶＧＬ、ＳＫＹＶＳＬ、ＳＬＹＡＮＩ、ＳＬＹＡＱＶ、ＳＬＹＡＹＩ、ＳＬＹＤＤＬ、ＳＬＹＤＦＬ、ＳＬＹＤＮＬ、ＳＬＹＤＳＩ、ＳＬＹＤＹＬ、ＳＬＹＥＧＬ、ＳＬＹＥＨＩ、ＳＬＹＥＬＬ、ＳＬＹＨＣＬ、ＳＬＹＨＫＬ、ＳＬＹＩＧＩ、ＳＬＹＫＫＬ、ＳＬＹＫＮＬ、ＳＬＹＬＡＩ、ＳＬＹＬＧＩ、ＳＬＹＮＡＬ、ＳＬＹＮＬＬ、ＳＬＹＲＮＩ、ＳＬＹＳＤＶ、ＳＬＹＴＣＶ、ＳＬＹＴＴＬ、ＳＬＹＶＡＩ、ＳＬＹＶＤＶ、ＳＬＹＶＳＩ、ＳＬＹＹＡＬ、ＳＬＹＹＮＩ、ＳＬＹＹＰＩ、ＳＭＹＤＧＬ、ＳＭＹＥＤＩ、ＳＭＹＮＥＩ、ＳＭＹＱＳＶ、ＳＭＹＴＷＬ、ＳＭＹＶＳＩ、ＳＮＹＥＮＬ、ＳＮＹＧＳＬ、ＳＮＹＧＴＩ、ＳＮＹＬＶＬ、ＳＮＹＱＥＩ、ＳＮＹＲＬＬ、ＳＮＹＲＴＬ、ＳＮＹＳＤＩ、ＳＮＹＳＬＬ、ＳＰＹＡＥＩ、ＳＰＹＡＴＬ、ＳＰＹＥＫＶ、ＳＰＹＧＤＩ、ＳＰＹＧＧＬ、ＳＰＹＮＴＬ、ＳＰＹＰＧＩ、ＳＰＹＰＧＶ、ＳＰＹＱＥＬ、ＳＰＹＲＳＶ、ＳＰＹＳＲＬ、ＳＰＹＴＤＶ、ＳＰＹＴＳＶ、ＳＰＹＶＶＩ、ＳＱＹＣＶＬ、ＳＱＹＥＡＬ、ＳＱＹＫＲＬ、ＳＱＹＬＡＬ、ＳＱＹＬＲＬ、ＳＱＹＭＨＶ、ＳＱＹＳＡＶ、ＳＱＹＴＳＩ、ＳＱＹＷＲＬ、ＳＲＹＡＥＬ、ＳＲＹＡＴＬ、ＳＲＹＥＳＬ、ＳＲＹＧＬＬ、ＳＲＹＬＳＬ、ＳＲＹＭＥＬ、ＳＲＹＭＲＩ、ＳＲＹＰＰＶ、ＳＲＹＱＡＬ、ＳＲＹＱＱＬ、ＳＲＹＲＦＩ、ＳＲＹＲＦＶ、ＳＲＹＳＡＬ、ＳＲＹＳＤＬ、ＳＲＹＴＧＬ、ＳＲＹＶＲＬ、ＳＳＹＤＥＬ、ＳＳＹＥＡＬ、ＳＳＹＥＩＶ、ＳＳＹＥＰＬ、ＳＳＹＧＲＬ、ＳＳＹＧＳＩ、ＳＳＹＧＳＬ、ＳＳＹＨＩＩ、ＳＳＹＨＩＬ、ＳＳＹＨＫＬ、ＳＳＹＨＮ
Ｉ、ＳＳＹＩＫＶ、ＳＳＹＮＳＶ、ＳＳＹＱＥＩ、ＳＳＹＲＫＶ、ＳＳＹＲＲＶ、ＳＳＹＳＤＩ、ＳＳＹＴＰＬ、ＳＳＹＴＲＬ、ＳＳＹＴＳＶ、ＳＳＹＴＴＩ、ＳＳＹＶＫＬ、ＳＴＹＡＥＶ、ＳＴＹＡＧＩ、ＳＴＹＡＨＬ、ＳＴＹＡＬＶ、ＳＴＹＡＰＩ、ＳＴＹＤＨＶ、ＳＴＹＤＫＶ、ＳＴＹＤＱＶ、ＳＴＹＤＲＩ、ＳＴＹＥＥＬ、ＳＴＹＥＹＬ、ＳＴＹＩＬＶ、ＳＴＹＬＰＬ、ＳＴＹＭＡＶ、ＳＴＹＱＴＬ、ＳＴＹＲＫＬ、ＳＴＹＳＱＬ、ＳＴＹＴＳＩ、ＳＴＹＹＱＶ、ＳＶＹＡＴＬ、ＳＶＹＣＦＬ、ＳＶＹＣＮＬ、ＳＶＹＤＳＶ、ＳＶＹＤＴＩ、ＳＶＹＥＫＶ、ＳＶＹＥＭＬ、ＳＶＹＧＳＶ、ＳＶＹＰＩＩ、ＳＶＹＱＰＩ、ＳＶＹＲＫＶ、ＳＶＹＳＨＬ、ＳＶＹＳＲＶ、ＳＶＹＴＡＬ、ＳＶＹＴＥＬ、ＳＶＹＷＫＶ、ＳＷＹＤＳＩ、ＳＷＹＦＴＶ、ＳＹＹＫＡＩ、ＳＹＹＬＫＬ、ＳＹＹＳＦＶ、ＳＹＹＶＴＩ、ＶＡＹＡＤＬ、ＶＡＹＡＲＩ、ＶＡＹＡＲＶ、ＶＡＹＤＱＬ、ＶＡＹＧＨＶ、ＶＡＹＫＱＶ、ＶＡＹＫＲＬ、ＶＡＹＮＬＬ、ＶＡＹＱＲＶ、ＶＡＹＳＧＶ、ＶＡＹＳＱＶ、ＶＣＹＣＩＶ、ＶＣＹＧＬＶ、ＶＣＹＧＲＬ、ＶＣＹＩＶＶ、ＶＣＹＬＬＶ、ＶＤＹＤＣＩ、ＶＤＹＤＦＬ、ＶＤＹＦＴＩ、ＶＤＹＦＶＬ、ＶＤＹＧＥＬ、ＶＤＹＩＬＶ、ＶＤＹＩＱＶ、ＶＤＹＫＮＩ、ＶＤＹＭＳＩ、ＶＤＹＮＬＶ、ＶＤＹＰＤＶ、ＶＤＹＳＤＬ、ＶＤＹＳＳＶ、ＶＤＹＴＴＬ、ＶＤＹＶＤＶ、ＶＤＹＶＧＶ、ＶＤＹＶＩＬ、ＶＤＹＶＱＶ、ＶＥＹＡＰＬ、ＶＥＹＤＰＬ、ＶＥＹＧＴＩ、ＶＥＹＨＲＬ、ＶＥＹＬＥＶ、ＶＥＹＱＬＬ、ＶＥＹＲＰＬ、ＶＥＹＳＳＩ、ＶＥＹＳＴＶ、ＶＦＹＡＥＩ、ＶＦＹＬＡＶ、ＶＦＹＲＱＶ、ＶＦＹＶＧＶ、ＶＦＹＹＶＩ、ＶＦＹＹＶＬ、ＶＧＹＥＴＩ、ＶＨＹＡＬＬ、ＶＨＹＡＲＬ、ＶＨＹＥＴＬ、ＶＨＹＧＧＶ、ＶＨＹＨＳＬ、ＶＨＹＩＰＶ、ＶＨＹＫＥＩ、ＶＨＹＬＱＶ、ＶＨＹＮＳＬ、ＶＨＹＱＳＶ、ＶＨＹＲＳＬ、ＶＩＹＡＱＬ、ＶＩＹＤＲＬ、ＶＩＹＥＮＶ、ＶＩＹＥＰＬ、ＶＩＹＥＲＬ、ＶＩＹＩＤＶ、ＶＩＹＫＫＩ、ＶＩＹＫＲＩ、ＶＩＹＰＦＬ、ＶＩＹＰＮＩ、ＶＩＹＳＤＬ、ＶＩＹＳＭＬ、ＶＩＹＳＳＶ、ＶＩＹＳＷＩ、ＶＫＹＡＤＩ、ＶＫＹＡＲＬ、ＶＫＹＡＴＬ、ＶＫＹＥＧＬ、ＶＫＹＧＤＬ、ＶＫＹＧＳＶ、ＶＫＹＬＬＶ、ＶＫＹＮＰＶ、ＶＫＹＰＰＩ、ＶＫＹＱＲＬ、ＶＫＹＱＶＩ、ＶＫＹＳＥＶ、ＶＫＹＳＮＶ、ＶＫＹＳＲＬ、ＶＫＹＳＴＬ、ＶＫＹＶＤＬ、ＶＬＹＡＤＩ、ＶＬＹＡＭＬ、ＶＬＹＡＳＶ、ＶＬＹＣＬＬ、ＶＬＹＣＬＶ、ＶＬＹＣＶＬ、ＶＬＹＤＣＬ、ＶＬＹＦＨＩ、ＶＬＹＦＴＶ、ＶＬＹＧＤＬ、ＶＬＹＧＱＬ、ＶＬＹＰＭＶ、ＶＬＹＰＲＬ、ＶＬＹＰＲＶ、ＶＬＹＳＥＬ、ＶＬＹＳＲＶ、ＶＬＹＴＡＶ、ＶＬＹＴＩＬ、ＶＭＹＤＡＶ、ＶＮＹＥＳＩ、ＶＮＹＳＡＬ、ＶＮＹＳＫＩ、ＶＮＹＳＳＩ、ＶＰＹＡＬＬ、ＶＰＹＤＴＬ、ＶＰＹＥＤＶ、ＶＰＹＥＥＬ、ＶＰＹＫＴＩ、ＶＰＹＬＲＶ、ＶＰＹＮＤＬ、ＶＰＹＰＡＬ、ＶＰＹＱＥＬ、ＶＰＹＲＬＬ、ＶＰＹＳＥＬ、ＶＰＹＴＬＬ、ＶＰＹＴＰＬ、ＶＰＹＴＴＬ、ＶＰＹＶＥＬ、ＶＰＹＶＭＶ、ＶＰＹＶＳＬ、ＶＱＹＫＡＶ、ＶＱＹＫＥＩ、ＶＱＹＮＩＶ、ＶＱＹＲＰＶ、ＶＱＹＳＱＩ、ＶＱＹＳＴＶ、ＶＱＹＴＥＶ、ＶＱＹＹＮＩ、ＶＲＹＡＲＬ、ＶＲＹＤＮＬ、ＶＲＹＧＲＩ、ＶＲＹＫＫＬ、ＶＲＹＫＲＶ、ＶＲＹＬＤＶ、ＶＲＹＲＴＩ、ＶＲＹＳＤＩ、ＶＲＹＴＱＬ、ＶＲＹＶＣＬ、ＶＳＹＡＥＬ、ＶＳＹＡＳＶ、ＶＳＹＥＰＩ、ＶＳＹＧＤＩ、ＶＳＹＩＧＬ、ＶＳＹＩＬＶ、ＶＳＹＭＭＬ、ＶＳＹＮＮＩ、ＶＳＹＮＮＬ、ＶＳＹＱＥＩ、ＶＳＹＱＰＩ、ＶＳＹＳＡＶ、ＶＳＹＳＦＬ、ＶＳＹＳＬＶ、ＶＳＹＳＰＶ、ＶＳＹＴＭＬ、ＶＳＹＴＮＬ、ＶＳＹＴＰＬ、ＶＳＹＶＫＩ、ＶＳＹＶＬＬ、ＶＴＹＡＤＬ、ＶＴＹＡＥＬ、ＶＴＹＡＥＶ、ＶＴＹＡＫＶ、ＶＴＹＡＰＶ、ＶＴＹＡＱＬ、ＶＴＹＡＴＬ、ＶＴＹＡＴＶ、ＶＴＹＧＮＩ、ＶＴＹＩＴＩ、ＶＴＹＱＩＩ、ＶＴＹＱＩＬ、ＶＴＹＱＬＬ、ＶＴＹＳＡＬ、ＶＴＹＳＴＬ、ＶＴＹＴＬＬ、ＶＴＹＴＱＬ、ＶＴＹＶＮＬ、ＶＶＹＡＤＩ、ＶＶＹＥＤＶ、ＶＶＹＦＣＬ、ＶＶＹＫＴＬ、ＶＶＹＱＫＬ、ＶＶＹＳＥＶ、ＶＶＹＳＱＶ、ＶＶＹＳＶＶ、ＶＶＹＴＶＬ、ＶＶＹＹＲＩ、ＶＹＹＨＷＬまたはＶＹＹＬＰＬから選択される、実施形態７から４５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４８．細胞内ドメインが、同一のアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＳＭを含む、実施形態１から４７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
４９．細胞内ドメインが、異なるアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＳＭを含む、実施形態１から４８のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５０．細胞内ドメインが、同一のアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＩＭを含む、実施形態１から４９のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５１．細胞内ドメインが、異なるアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＩＭを含む、実施形態１から５０のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５２．ｐが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５３．ｐが１である、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５４．ｐが２である、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５５．ｐが３である、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５６．ｐが４である、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５７．ｐが５である、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５８．ｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、実施形態７から５７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
５９．ｎが０である、実施形態７から５７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６０．ｎが１である、実施形態７から５７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６１．ｎが２である、実施形態７から５７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６２．ｎが３である、実施形態７から５７のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６３．ｍが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である、実施形態７から６２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６４．ｍが１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、実施形態７から６２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６５．ｍが１、２、３、４、または５である、実施形態７から６２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６６．ｍが１である、実施形態７から６２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６７．ｍが２である、実施形態７から６２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６８．ｍが３である、実施形態７から６２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
６９．ｍが４である、実施形態７から６２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７０．ｍが５である、実施形態７から６２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７１．ｎが０であり、ｍが１から６であり、ｐが１であり、ＩＴＳＭがＴＥＹＡＴＩである、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７２．ｎが０であり、ｍが１から６であり、ｐが１であり、ＩＴＳＭがＴＥＹＳＥＩである、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７３．ｎが０であり、ｍが１から６であり、ｐが１であり、ＩＴＳＭがＴＥＹＡＳＩである、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７４．ｎが１であり、ｍが１であり、ｐが１から５であり、ＩＴＩＭがＶＤＹＧＥＬであり、ＩＴＳＭがＴＥＹＡＴＩである、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７５．ｎが１であり、ｍが１であり、ｐが１から５であり、ＩＴＩＭがＬＸ６ＹＡＸ８Ｌであり、式中、Ｘ６がＨまたはＱから選択され、Ｘ８がＶまたはＳであり、ＩＴＳＭがＴＥＹＳＥＩである、実施形態７から５１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７６．細胞内ドメインが、同一のアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＳＭを含む、実施形態１から７５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７７．細胞内ドメインが、異なるアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＳＭを含む、実施形態１から７５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７８．細胞内ドメインが、同一のアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＩＭを含む、実施形態１から７５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
７９．細胞内ドメインが、異なるアミノ酸配列を有するいくつかのＩＴＩＭを含む、実施形態１から７５のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８０．抗原結合ドメインが一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１から７９のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８１．抗原結合ドメインが、Ｆｖ、Ｆａｂ、または（Ｆａｂ’）２である、実施形態１から７９のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８２．抗原結合ドメインが、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１Ｅ、ＣＤ３４、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１２３、またはＣＤ１４１に結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８３．抗原結合ドメインが、ＺＰ２、ＧＡＢＲＡ６、ＣＲＴＡＭ、またはＧＲＭ４、またはＭＤＧＡ１に結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８４．抗原結合ドメインが、ＳＦＴＰＣ、ＲＯＳ１、ＳＬＣ６Ａ４、またはＡＧＴＲ２に結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８５．抗原結合ドメインが、ＬＲＲＣ２６、ＨＴＲ３Ａ、ＴＭＥＭ２１１、またはＭＲＧＰＲＸ３に結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８６．抗原結合ドメインが、ＭＥＰ１Ｂ、ＴＭＩＧＤ１、ＣＥＡＣＡＭ２０、またはＡＬＰＩに結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８７．抗原結合ドメインが、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＣＹＰ１７Ａ１、またはＡＴＰ４Ｂに結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８８．抗原結合ドメインが、ＧＰ２、ＭＵＣ２１、ＣＬＣＡ４、およびＳＬＣ２７Ａ６に結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
８９．抗原結合ドメインが、正常組織内に存在するが腫瘍上に存在しないかまたは低レベルで存在する細胞－表面タンパク質に結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
９０．抗原結合ドメインが、オフ組織抗原に結合する、実施形態１から８１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
９１．膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ４、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰＡ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４の膜貫通領域を含む、実施形態１から９０のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
９２．膜貫通ドメインがＰＤ－１の膜貫通領域を含む、実施形態１から９１のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
９３．膜貫通ドメインがＣＤ８アルファの膜貫通領域を含む、実施形態１から９２のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
９４．膜貫通ドメインが、ヒンジを介してＮ－ＣＡＲの細胞外ドメインに付加されている、実施形態１から９３のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ。
９５．ヒンジがヒト免疫グロブリンヒンジである、実施形態９４に記載のＮ－ＣＡＲ。
９６．ヒンジがＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８アルファヒンジ、またはＰＤ－１ヒンジである、実施形態９４に記載のＮ－ＣＡＲ。
９６．１．ヒンジがＰＤ－１ヒンジある、実施形態９４に記載のＮ－ＣＡＲ。
９７．抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
細胞内ドメイン、
を含むＰ－ＣＡＲ
および実施形態１から９６のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲ
を含む、単離された免疫細胞。
９８．Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＣＤ３３であり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＩＴＧＡＸ、ＣＤ１Ｅ、ＣＤ３４、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１２３、またはＣＤ１４１である、実施形態９７に記載の免疫細胞。
９９．Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＦＬＴ３であり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＺＰ２、ＧＡＢＲＡ６、ＣＲＴＡＭ、ＧＲＭ４、またはＭＤＧＡ１である、実施形態９７に記載の免疫細胞。
１００．Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＭＳＬＮであり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＳＦＴＰＣ、ＲＯＳ１、ＳＬＣ６Ａ４、またはＡＧＴＲ２である、実施形態９７に記載の免疫細胞。
１０１．Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＭＵＣ１６であり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＬＲＲＣ２６、ＨＴＲ３Ａ、ＴＭＥＭ２１１、またはＭＲＧＰＲＸ３である、実施形態９７に記載の免疫細胞。
１０２．Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＭＵＣ１７であり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＭＥＰ１Ｂ、ＴＭＩＧＤ１、ＣＥＡＣＡＭ２０、またはＡＬＰＩである、実施形態９７に記載の免疫細胞。
１０３．Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原が膵管腺癌の腫瘍細胞内に存在し、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＣＹＰ１７Ａ１、またはＡＴＰ４Ｂである、実施形態９７に記載の免疫細胞。
１０４．Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原が腎臓明細胞癌の腫瘍細胞内に存在し、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＧＰ２、ＭＵＣ２１、ＣＬＣＡ４、およびＳＬＣ２７Ａ６である、実施形態９７に記載の免疫細胞。
１０５．免疫細胞がＴ細胞である、実施形態９７から１０４のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１０６．Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、実施形態１０５に記載の免疫細胞。
１０７．薬物として用いるための、実施形態９７から１０６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１０８．がんの治療に用いるための、実施形態９７から１０６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１０９．炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、実施形態９７から１０６のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１１０．（ａ）免疫細胞を提供すること、（ｂ）Ｎ－ＣＡＲおよびＰ－ＣＡＲを前記細胞の表面で発現させることを含む、実施形態９７から１０９のいずれか１つに記載の免疫細胞を操作する方法。
１１１．（ａ）免疫細胞を提供すること、（ｂ）前記細胞内に、Ｎ－ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドおよびＰ－ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入すること、（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞内に発現させることを含む、実施形態１１０に記載の免疫細胞を操作する方法。
１１２．ａ）実施形態９７から１０９のいずれか１つに記載の免疫細胞を提供すること、およびｂ）前記Ｔ細胞を患者に投与することを含む、治療が必要な患者を治療するための方法。
１１３．前記免疫細胞がドナーから回収される、実施形態１１２に記載の患者を治療するための方法。
１１４．前記免疫細胞が患者から回収される、実施形態１１３に記載の患者を治療するための方法。
１１５．免疫細胞の活性化の低減が、Ｐ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲの両方がそれらのそれぞれの抗原に結合する場合、ＰＤ－１の全細胞内ドメインを含むＮ－ＣＡＲを含む同一の免疫細胞と比較して、好ましくは少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または３０％増大する、実施形態９７から１０９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１１６．免疫細胞の活性化の低減が、Ｐ－ＣＡＲおよびＮ－ＣＡＲの両方がそれらのそれぞれの抗原に結合する場合、ＣＴＬＡ－４の全細胞内ドメインを含むＮ－ＣＡＲを含む同一の免疫細胞と比較して、好ましくは少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または３０％増大する、実施形態９７から１０９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１１７．免疫細胞の活性化が、Ｎ－ＣＡＲ抗原結合ドメインおよびＰ－ＣＡＲ抗原結合ドメインの両方がそれらのそれぞれの抗原に結合する場合、Ｐ－ＣＡＲ抗原結合ドメインのみがその抗原に結合する場合と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％低減する、実施形態９７から１０９のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１１８．免疫細胞の活性化のレベルがサイトカイン生産の測定によって判定される、実施形態１１５から１１７のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１１９．サイトカインがＩＦＮガンマまたはＴＮＦアルファである、実施形態１１８に記載の免疫細胞。
１２０．サイトカイン生産がＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳおよび／またはルミネックスによって測定される、実施形態１１８または１１９に記載の免疫細胞。
１２１．免疫細胞の活性化のレベルが、脱顆粒のレベルによって判定される、実施形態１１５から１１７のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１２２．脱顆粒が、ＦＡＣＳによってＣＤ１０７ａの発現を測定することによって測定される、実施形態１２１に記載の免疫細胞。
１２３．免疫細胞の活性化のレベルが、標的細胞を死滅させる免疫細胞の能力をモニタリングすることによって測定される、実施形態１１５から１１７に記載の免疫細胞。
１２４．免疫細胞の活性化のレベルが、誘導性ＮＦＡＴ調節型またはＮＦκＢ調節型のルシフェラーゼ発現を組み込んだレポーター細胞におけるルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによって判定される、実施形態１１５から１１７のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１２５．免疫細胞の活性化のレベルが、実施例３に開示されるように、誘導性ＮＦＡＴ調節型またはＮＦκＢ調節型のルシフェラーゼ発現を組み込んだレポーター細胞におけるルシフェラーゼ活性をモニタリングすることによって判定される、実施形態１１５から１１７のいずれか１つに記載の免疫細胞。
１２６．実施形態１から９６のいずれか１つに記載のＮ－ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
１２７．実施形態１２４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

Claims (25)

  1. 抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
    膜貫通ドメイン、
    細胞内ドメイン、
    を含み、
    細胞内ドメインが、免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフＩＴＳＭを含み、前記ＩＴＳＭがアミノ酸配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、
    Ｘ１がアミノ酸であり、
    Ｘ２がアミノ酸であり、
    Ｘ３がアミノ酸であり、
    Ｘ４がＶまたはＩである、
    阻害性キメラ抗原受容体（Ｎ－ＣＡＲ）。
  2. 細胞内ドメインがヒトＰＤ－１、ヒトＣＤ２４４、またはヒトＢＴＬＡの細胞内ドメインではない、請求項１に記載のＮ－ＣＡＲ。
  3. 細胞内ドメインが、配列
    （（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
    またはその変異体を含み、式中、
    ｎが０、１、または２以上の整数であり、
    ｍが１、または２以上の整数であり
    ｐが１、または２以上の整数であり、
    Ｌ１が不在であるか、または
    （ａ）表３に示される配列から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
    （ｂ）表１に示される配列から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
    （ｃ）上記（ｂ）内の配列もしくはその断片にＮ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
    （ｄ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
    からなる群から選択される１つもしくは複数の配列を含み、
    Ｌ２およびＬ３のそれぞれが不在であるか、または
    （ｅ）表４に示される配列から選択される、ＩＴＩＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
    （ｆ）表６に示される配列から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、
    （ｇ）表５に示される配列から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭモチーフを有するタンパク質のＩＴＩＭとＩＴＳＭとの間の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、
    （ｈ）上記（ｆ）もしくは（ｇ）内の配列もしくはその断片にＮ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
    （ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
    からなる群から選択される１つもしくは複数の配列を含み、
    Ｌ４が不在であるか、または
    （ｊ）表７に示される配列から選択される、ＩＴＩＭ．＊ＩＴＳＭ細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
    （ｋ）表８に示される配列から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域もしくはその断片、
    （ｌ）上記（ｊ）もしくは（ｋ）内の配列もしくはその断片にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインもしくはその断片、および
    （ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
    からなる群から選択される１つもしくは複数の配列を含み、
    ＩＴＩＭが配列Ｘ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９であり、式中、
    Ｘ５がＳ、Ｖ、Ｉ、またはＬであり、
    Ｘ６がアミノ酸であり、
    Ｘ７がアミノ酸であり、
    Ｘ８がアミノ酸であり、
    Ｘ９がＶ、Ｉ、またはＬであり、
    ＩＴＳＭが配列ＴＸ１ＹＸ２Ｘ３Ｘ４であり、式中、
    Ｘ１がアミノ酸であり、
    Ｘ２がアミノ酸であり、
    Ｘ３がアミノ酸であり、
    Ｘ４がＶまたはＩである、
    請求項１または２に記載のＮ－ＣＡＲ。
  4. 細胞内ドメインが、配列
    （（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
    を含み、式中、
    ｎが０であり、
    ｍが１であり、
    ｐが１であり、
    Ｌ３が、
    （ｆ）以下の表６に示される配列から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＮ末端隣接領域もしくはその断片、または
    （ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
    から選択される１つの配列を含み、
    Ｌ４が、
    （ｋ）以下の表８に示される配列から選択される、ＩＴＳＭのみの細胞内ドメインの天然のＣ末端隣接領域またはその断片、
    （ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインまたはその断片、および
    （ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列、
    からなる群から選択される１つまたは複数の、好ましくは１つまたは２つの配列を含む、
    請求項３に記載のＮ－ＣＡＲ。
  5. Ｌ３が、
    Figure 2022036976000128
     から選択され、
    Ｌ４が、
    （ｋ）
    Figure 2022036976000129
     および場合によって
    （ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインまたはその断片
    からなる群から選択される１つの配列を含む、
    請求項４に記載のＮ－ＣＡＲ。
  6. Ｌ３が、
    Figure 2022036976000130
     から選択され、
    Ｌ４が、
    （ｋ）
    Figure 2022036976000131
     および
    （ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインまたはその断片
    を含む、
    請求項４に記載のＮ－ＣＡＲ。
  7. Ｌ３が、
    Figure 2022036976000132
     であり、
    Ｌ４が、
    （ｋ）
    Figure 2022036976000133
     および場合によって
    （ｌ）上記（ｋ）内の配列にＣ末端で隣接している、表２に示される配列から選択される、既知の阻害性受容体の天然の細胞内ドメインまたはその断片
    から選択される１つの配列を含む、
    請求項４に記載のＮ－ＣＡＲ。
  8. 細胞内ドメインが、配列
    （（Ｌ１－ＩＴＩＭ－Ｌ２）ｎ－（Ｌ３－ＩＴＳＭ－Ｌ４）ｍ）ｐ
    を含み、式中、
    ｎが０であり、
    ｍが１であり、
    ｐが１または２であり、
    Ｌ３が、
    （ｉ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
    から選択される１つの配列を含み、
    Ｌ４が、
    （ｍ）１から５００までの間のアミノ酸を含む非天然の配列
    からなる群から選択される１つの配列を含む、
    請求項４に記載のＮ－ＣＡＲ。
  9. ＩＴＳＭが、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つが、ＴＡＹＥＬＶ、ＴＡＹＧＬＩ、ＴＡＹＮＡＶ、ＴＣＹＧＬＶ、ＴＣＹＰＤＩ、ＴＤＹＡＳＩ、ＴＤＹＤＬＶ、ＴＤＹＬＳＩ、ＴＤＹＱＱＶ、ＴＤＹＹＲＶ、ＴＥＹＡＳＩ、ＴＥＹＡＴＩ、ＴＥＹＤＴＩ、ＴＥＹＰＬＶ、ＴＥＹＳＥＩ、ＴＥＹＳＥＶ、ＴＥＹＳＴＩ、ＴＥＹＴＫＶ、ＴＦＹＨＶＶ、ＴＦＹＬＬＩ、ＴＦＹＮＫＩ、ＴＦＹＰＤＩ、ＴＧＹＥＤＶ、ＴＧＹＬＳＩ、ＴＨＹＫＥＩ、ＴＩＹＡＱＶ、ＴＩＹＡＶＶ、ＴＩＹＣＳＩ、ＴＩＹＥＤＶ、ＴＩＹＥＲＩ、ＴＩＹＥＶＩ、ＴＩＹＨＶＩ、ＴＩＹＩＧＶ、ＴＩＹＬＫＶ、ＴＩＹＳＭＩ、ＴＩＹＳＴＩ、ＴＩＹＴＹＩ、ＴＫＹＦＨＩ、ＴＫＹＭＥＩ、ＴＫＹＱＳＶ、ＴＫＹＳＮＩ、ＴＫＹＳＴＶ、ＴＬＹＡＳＶ、ＴＬＹＡＶＶ、ＴＬＹＦＷＶ、ＴＬＹＨＬＶ、ＴＬＹＰＭＶ、ＴＬＹＰＰＩ、ＴＬＹＲＤＩ、ＴＬＹＲＤＶ、ＴＬＹＳＫＩ、ＴＬＹＳＬＩ、ＴＬＹＳＰＶ、ＴＭＹＡＱＶ、ＴＭＹＣＱＶ、ＴＮＹＫＡＶ、ＴＮＹＮＬＶ、ＴＰＹＡＧＩ、ＴＰＹＰＧＶ、ＴＰＹＶＤＩ、ＴＱＹＧＲＶ、ＴＱＹＮＱＶ、ＴＲＹＡＹＶ、ＴＲＹＧＥＶ、ＴＲＹＨＳＶ、ＴＲＹＫＴＩ、ＴＲＹＬＡＩ、ＴＲＹＭＡＩ、ＴＲＹＱＫＩ、ＴＲＹＱＱＩ、ＴＲＹＳＮＩ、ＴＲＹＳＰＩ、ＴＳＹＧＴＶ、ＴＳＹＭＥＶ、ＴＳＹＱＧＶ、ＴＳＹＴＴＩ、ＴＴＹＲＳＩ、ＴＴＹＳＤＶ、ＴＴＹＶＴＩ、ＴＶＹＡＱＩ、ＴＶＹＡＳＶ、ＴＶＹＥＶＩ、ＴＶＹＧＤＶ、ＴＶＹＫＧＩ、ＴＶＹＱＲＶ、ＴＶＹＳＥＶ、ＴＶＹＳＴＶ、ＴＹＹＨＳＩ、ＴＹＹＬＱＩ、またはＴＹＹＹＳＶから選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲ。
  10. ＩＴＳＭが、または、いくつかのＩＴＳＭが細胞内ドメイン内に存在する場合にはＩＴＳＭの少なくとも１つが、ＴＥＹＡＳＩ、ＴＥＹＳＥＩ、ＴＥＹＳＴＩ、またはＴＶＹＳＥＶから選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲ。
  11. 抗原結合ドメインが一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲ。
  12. 細胞内ドメインが、配列番号２０００、配列番号２００１、配列番号２００２、配列番号２００３、配列番号２００４、配列番号２００５、配列番号２００６、配列番号２００７、配列番号２００８、配列番号２００９、配列番号２０１０、配列番号２０１１、配列番号２０１２、配列番号２０１３、配列番号２０１４、配列番号２０１５、配列番号２０１６および配列番号２０１７またはその変異体から選択される、請求項１に記載のＮ－ＣＡＲ。
  13. 抗原結合ドメインが、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１Ｅ、ＣＤ３４、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１２３またはＣＤ１４１、ＺＰ２、ＧＡＢＲＡ６、ＣＲＴＡＭ、ＧＲＭ４、ＭＤＧＡ１、ＺＰ２、ＧＡＢＲＡ６、ＣＲＴＡＭ、ＧＲＭ４、ＭＤＧＡ１、ＳＦＴＰＣ、ＲＯＳ１、ＳＬＣ６Ａ４、ＡＧＴＲ２、ＬＲＲＣ２６、ＨＴＲ３Ａ、ＴＭＥＭ２１１、ＭＲＧＰＲＸ３、ＭＥＰ１Ｂ、ＴＭＩＧＤ１、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＡＬＰＩ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＣＹＰ１７Ａ１、ＡＴＰ４Ｂ、ＧＰ２、ＭＵＣ２１、ＣＬＣＡ４またはＳＬＣ２７Ａ６に結合する、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲ。
  14. 膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＰＤ－１、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ４、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰＡ、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４の膜貫通領域を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲ。
  15. 膜貫通ドメインがＰＤ－１またはＣＤ８アルファの膜貫通領域を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲ。
  16. 膜貫通ドメインが、ヒンジを介してＮ－ＣＡＲの細胞外ドメインに付加されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲ。
  17. ヒンジがＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８アルファヒンジ、またはＰＤ－１ヒンジである、請求項１６に記載のＮ－ＣＡＲ。
  18. 抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
    膜貫通ドメイン、
    細胞内ドメイン、
    を含むＰ－ＣＡＲ
    および請求項１から１７のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲ
    を含む、単離された免疫細胞。
  19. － Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＣＤ３３であり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＩＴＧＡＸ、ＣＤ１Ｅ、ＣＤ３４、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ１２３、もしくはＣＤ１４１である、または
    － Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＦＬＴ３であり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＺＰ２、ＧＡＢＲＡ６、ＣＲＴＡＭ、ＧＲＭ４、もしくはＭＤＧＡ１である、または
    － Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＭＳＬＮであり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＳＦＴＰＣ、ＲＯＳ１、ＳＬＣ６Ａ４、もしくはＡＧＴＲ２である、または
    － Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＭＵＣ１６であり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＬＲＲＣ２６、ＨＴＲ３Ａ、ＴＭＥＭ２１１、もしくはＭＲＧＰＲＸ３である、または
    － Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＭＵＣ１７であり、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＭＥＰ１Ｂ、ＴＭＩＧＤ１、ＣＥＡＣＡＭ２０、もしくはＡＬＰＩである、または
    － Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原が膵管腺癌の腫瘍細胞内に存在し、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＣＹＰ１７Ａ１、もしくはＡＴＰ４Ｂである、または
    － Ｐ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原が腎臓明細胞癌の腫瘍細胞内に存在し、Ｎ－ＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する抗原がＧＰ２、ＭＵＣ２１、ＣＬＣＡ４、およびＳＬＣ２７Ａ６である、
    請求項１８に記載の免疫細胞。
  20. 免疫細胞がヒトＴ細胞である、請求項１８または１９に記載の免疫細胞。
  21. がんの治療に用いるための、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
  22. （ａ）免疫細胞を提供すること、（ｂ）Ｎ－ＣＡＲおよびＰ－ＣＡＲを前記細胞の表面で発現させることを含む、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の免疫細胞を操作する方法。
  23. ａ）請求項１８から２１のいずれか一項に記載の免疫細胞を提供すること、およびｂ）前記Ｔ細胞を患者に投与することを含む、治療が必要な患者を治療するための方法。
  24. 請求項１から１７のいずれか一項に記載のＮ－ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
  25. 請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
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