JP2021528664A - ダイナミックレンジが拡大されたバルク音響波共振器 - Google Patents

ダイナミックレンジが拡大されたバルク音響波共振器 Download PDF

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Abstract

低認識成分が固定されている面を含む低感度バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーであって、低認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、低感度バルク音響波共振器センサー；高認識成分が固定されている面を含む高感度ＢＡＷ共振器センサーであって、高認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、高感度ＢＡＷ共振器センサー；増幅分子、増幅要素が連結された第二の認識成分、並びに所望に応じてタグ及び分析物分子の一方又は両方を収容している１又は複数の容器、を含む装置。
【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、その開示内容全体が参照により本明細書に援用される２０１８年７月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６９４５１１号明細書の利益を主張するものである。
医学、獣医学、環境、バイオハザード、バイオテロ、農業製品、及び食品安全性に関連する物質の診断試験のための装置並びに測定技術は、数多く存在する。診断試験では、従来、有意義なデータを得るために長い反応時間を必要とし、高価なリモートの又は大きく扱い難い試験設備が関与し、大きいサンプルサイズを必要とし、複数の試薬が用いられ、高度に訓練された使用者が必要であり、並びに多大な直接費及び間接費が関与し得る。例えば、ヒト及び動物の何れの診断市場でも、ほとんどの試験では、患者からサンプルを採取して、それを試験所へ送る必要があり、その場合、結果を数時間又は数日間で得ることはできない。その結果、医療従事者は、患者の治療を待たなければならない。
診断試験及び分析のためのポイントオブユーズ（又はヒト及び獣医学的医療を考える場合は、ポイントオブケア）のソリューションは、記載した欠点のほとんどを解決することができるものではあるが、依然としてある程度の制限がある。さらに、利用可能であるポイントオブユーズのソリューションの一部は、試験所での試験と比較して、感度及び再現性に制限がある。また、多くの場合、利用可能であるポイントオブユーズ試験の各々について、システムが別々であり得ることから、使用者にとって多大な直接費が掛かってしまう。
これらの、及び様々な他の特徴は、以下の詳細な記述及び関連する図面を見ることによって明らかとなるであろう。
サンプル中の分析物を検出するためのシステムが本明細書で開示され、このシステムは、低認識成分が固定されている面を備えた低感度バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーであって、低認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、低感度バルク音響波共振器センサー；高認識成分が固定されている面を備えた高感度ＢＡＷ共振器センサーであって、高認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、高感度ＢＡＷ共振器センサー；増幅分子、増幅要素が連結された第二の認識成分、並びに所望に応じてタグ及び分析物分子の一方又は両方を収容している１又は複数の容器；１又は複数の容器から低及び高認識成分が結合された低及び高ＢＡＷ共振器センサーの両方の面までの流体経路；低及び高ＢＡＷ共振器センサーの振動を駆動するように構成された作動回路；低及び高ＢＡＷ共振器センサーの両方と結合するように配置され、低及び高ＢＡＷ共振器センサーの振動の共振特性を表す１又は複数の共振器出力シグナルを測定するように構成された測定回路；並びに作動回路及び測定回路と操作可能に結合されたコントローラ、を備える。
サンプル中の分析物を検出するための装置と共に用いるための、システムを備えたキットも開示され、このシステムは：低認識成分が固定されている面を備えた低感度バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーであって、低認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、低感度バルク音響波共振器センサー；高認識成分が固定されている面を備えた高感度ＢＡＷ共振器センサーであって、高認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、高感度ＢＡＷ共振器センサー；並びに、増幅分子、増幅要素が連結された第二の認識成分、並びに所望に応じてタグ及び分析物分子の一方又は両方を収容している１又は複数の容器、を備える。
サンプル中の分析物を検出するための方法も開示され、この方法は、分析物又は分析物及びタグが連結された分析物分子と、低認識成分と、増幅要素が連結された第二の認識成分とを、低認識成分及び増幅要素が連結された第二の認識成分を含む複合体を生成させるために接触させることであって、低認識成分は、低ＢＡＷ共振器センサーの面に対して固定されており、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグの１つ以上を、又は第二の認識成分に結合されたこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されている、接触させること；分析物又は分析物及びタグが連結された分析物分子と、高認識成分と、増幅要素が連結された第二の認識成分とを、高認識成分及び増幅要素が連結された第二の認識成分を含む複合体を生成させるために接触させることであって、高認識成分は、高ＢＡＷ共振器センサーの面に対して固定されており、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグの１つ以上を、又は第二の認識成分に結合されたこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、増幅要素が連結された第二の認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は低及び高認識成分に結合したこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、低認識成分及び高認識成分は、分析物分子に対して異なる親和性を有する、接触させること；連結された増幅要素と、増幅前駆体とを、増幅前駆体をＢＡＷ共振器の面に質量を付与する分子に変換するための条件下で接触させること；並びにＢＡＷ共振器の面に付与された質量を測定すること、を含む。
サンプル中の分析物を検出するための方法がさらに開示され、この方法は、分析物又は分析物及びタグが連結された分析物分子と、低認識成分と、増幅要素が連結された第二の認識成分とを、低認識成分及び増幅要素が連結された第二の認識成分を含む複合体を生成させるために接触させることであって、低認識成分は、低ＢＡＷ共振器センサーの面に対して固定されており、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグの１つ以上を、又は第二の認識成分に結合されたこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、固定されている面上での濃度が低い、接触させること；分析物又は分析物及びタグが連結された分析物分子と、高認識成分と、増幅要素が連結された第二の認識成分とを、高認識成分及び増幅要素が連結された第二の認識成分を含む複合体を生成させるために接触させることであって、高認識成分は、高ＢＡＷ共振器センサーの面に対して固定されており、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグの１つ以上を、又は第二の認識成分に結合されたこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、固定されている面上での濃度が高く、増幅要素が連結された第二の認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は低及び高認識成分に結合したこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、第一の認識成分の低濃度は、第二の認識成分の高濃度よりも低い、接触させること；連結された増幅要素と、増幅前駆体とを、増幅前駆体をＢＡＷ共振器の面に質量を付与する分子に変換するための条件下で接触させること；並びにＢＡＷ共振器の面に付与された質量を測定すること、を含む。
図１Ａは、バルク音響波（ＢＡＷ）共振器検出装置の実施形態の動作原理を示す模式図である。 図１Ｂは、バルク音響波（ＢＡＷ）共振器検出装置の実施形態の動作原理を示す模式図である。 図１Ｃは、バルク音響波（ＢＡＷ）共振器検出装置の実施形態の動作原理を示す模式図である。
図２は、分析物を検出するためのＢＡＷ共振器システムの構成要素を示す模式図である。
図３Ａは、バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーの面上でのシグナル増幅の実施形態を示す模式図である。 図３Ｂは、バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーの面上でのシグナル増幅の実施形態を示す模式図である。 図３Ｃは、バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーの面上でのシグナル増幅の実施形態を示す模式図である。 図３Ｄは、バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーの面上でのシグナル増幅の実施形態を示す模式図である。
図４は、ヒトＴＳＨに対するＢＡＷ共振器センサーによるイムノアッセイの検量線である。
図５は、その開示内容が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１５／０３７７８３４（Ａ１）号明細書に概略記載の通りであるシステムを用いて高濃度で得た結果をプロットした曲線である。
模式図は、必ずしも正しい縮尺ではない。図面で用いられる同じ番号は、同じ構成要素、工程、及び同種のものを意味する。しかし、ある図面中の構成要素を意味するための番号の使用は、同じ番号で標識された別の図面中の構成要素を制限することを意図するものではないことは理解される。加えて、構成要素を意味するための異なる番号の使用は、異なる番号が付与された構成要素が同一又は類似であり得ないことを意図するものでもない。
以下の詳細な記述では、化合物、組成物、生成物、及び方法のいくつかの具体的な実施形態が開示される。他の実施形態も考慮され、本開示の範囲又は趣旨から逸脱することなく成され得ることは理解されたい。以下の詳細な記述は、したがって、限定する意味で解釈されるべきではない。
本明細書で用いられるすべての科学的及び技術的用語は、特に断りのない限り、本技術分野で一般的に用いられる意味を有する。本明細書で与えられる定義は、本明細書で頻繁に用いられるある特定の用語の理解を容易とするためのものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書及び添付の請求項で用いられる場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、内容からそれ以外が明らかに示されない限り、複数の指示対象を有する実施形態を包含する。
本明細書及び添付の請求項で用いられる場合、「又は」の用語は、内容からそれ以外が明らかに示されない限り、「及び／又は」を含む意味で一般的に用いられる。「及び／又は」の用語は、列挙された要素の１つ若しくはすべて、又は列挙された要素の何れか２つ以上の組み合わせを意味する。
本明細書で用いられる場合、「有する」、「有している」、「含む」、「含んでいる」、「備える」、「備えている」、又は同種の語は、それらの非限定的意味で用いられ、一般的に、「含むが、限定されない」を意味する。「本質的に成っている」、「成っている」、及び同種の語は、「備えている」及び同種の語に包括されることは理解される。本明細書で用いられる場合、「本質的に成っている」は、組成物、生成物、方法、又は同種のものに関する場合、組成物、生成物、方法、又は同種のものの構成要素が、列挙された構成要素と、組成物、生成物、方法、又は同種のものの基本的で新規な特徴に実質的な影響を与えない他の何れかの構成要素とに限定されることを意味する。
「好ましい」及び「好ましくは」の語は、ある特定の状況下で、ある特定の有益性が得られ得る本発明の実施形態を意味する。しかし、他の実施形態も、同一又は他の状況下で好ましい場合がある。さらに、１又は複数の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを暗示するものではなく、請求項を含む本開示の範囲から他の実施形態を除外することを意図するものでもない。
また、本明細書において、終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包括されるすべての数値を含む（例：１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含み、又は１０以下は、１０、９．４、７．６、５、４．３、２．９、１．６２、０．３などを含む）。値の範囲が、特定の値「まで」である場合、その値は、その範囲の中に含まれる。
「上」、「下」、「左」、「右」、「上側」、「下側」、並びに他の方向及び配向などの本明細書で言及される何れの方向も、図面に関する明確性のために本明細書で記載されるものであり、実際の装置若しくはシステム、又は装置若しくはシステムの使用を限定するものではない。本明細書で述べる装置又はシステムは、数多くの方向及び配向で用いられ得る。
開示される装置は、有利には、高い感度と広いダイナミックレンジとを組み合わせるものである。開示される装置の感度は、数多くのプロトコルを通して高めることができる。そのうちの１つは、その開示内容が参照により本明細書に援用される、２０１９年２月２６日に出願され、米国特許出願公開第２０１９／０１８７０９８号明細書として公開された、「ＴＨＩＮ ＦＩＬＭ ＢＵＬＫ ＡＣＯＵＳＴＩＣ ＲＥＳＯＮＡＴＯＲ ＷＩＴＨ ＳＩＧＮＡＬ ＥＮＨＡＮＣＥＭＥＮＴ」と題する米国特許出願第１６／２８５３０４号明細書に開示されている。
センサー、装置、及びシステム
本明細書で開示されるセンサーは、バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーなどの少なくとも２つの薄膜共振子センサーを含む。開示される装置では、少なくとも２つのＢＡＷ共振器センサーは、目的の分析物に対して異なる感度を有する。一方のセンサーは、高感度センサーと称することができ、他方のセンサーは、低感度センサーと称することができる。この用語は、２つのセンサーの相対的な感度を示唆することを意図しているだけであり、外部の何れかのセンサー又は装置に対しての２つのセンサーの感度を示すものではないことには留意されたい。
ＢＡＷ共振器センサーは、圧電層、又は圧電基材、並びに入力及び出力変換器を含む。ＢＡＷ共振器センサーは、この技術を携帯型装置での使用に適するものとする小型のセンサーである。したがって、本明細書で述べるセンサーを備えた標的分析物を検出するための携帯型装置が考慮される。
ここで、図１Ａ及び１Ｂに関する図面を参照すると、分析物を検出するためのセンサーとして用いられるバルク弾性波圧電共振子２０の実施形態の一般的動作原理が示される。共振子２０は、典型的には、共振子の電極を形成する２つの金属層の各々が両側に結合された圧電材料の平面層を含む。共振子の２つの面は、共振子が、共振子の共振帯域内のシグナルによって駆動されると、自由に振動を起こす。共振子がセンサーとして用いられる場合、その面のうちの少なくとも１つは、検出される物質に対する結合部位を提供するように構成されている。共振子の面上に物質が結合すると、共振子の共振特性が変化し、共振特性の変化が検出、解釈されて、検出される物質に関する定量的情報が得られる。
例えば、そのような定量的情報は、共振子の面上での検出される物質の結合によって引き起こされる共振子の挿入又は反射係数位相シフトの変化を検出することによって得られ得る。そのようなセンサーは、共振子を振動子として作動させ、振動周波数の変化をモニタリングするセンサーとは異なる。そうではなく、そのようなセンサーは、予め選択された周波数のシグナルの経路に共振子を挿入し、共振子面上での検出される物質の結合によって引き起こされる挿入又は反射係数位相シフトの変動をモニタリングする。当然、振動周波数をモニタリングするセンサーも、本明細書で述べるシグナル増幅に応じて用いられてよい。
より詳細には、図１Ａは、検出される物質がその面２６に結合する前の共振子２０を示す。図示した共振子２０は、共振子の共振帯域内の周波数ｆを有する入力電気シグナル２１を提供するシグナル源２２と電気的に結合されている。入力電気シグナルは、共振子２０と結合されて、共振子を通して伝送されて、出力電気シグナル２３を提供する。図示した実施形態では、出力電気シグナル２３は、入力シグナル２１と同じ周波数であるが、位相シフトΔΦ１によって入力シグナルとは位相が異なっており、それは、共振子の圧電特性及び物理的寸法に依存する。出力シグナル２３は、挿入位相シフトに関連する位相シグナルを提供する位相検出器２４と結合されている。
図１Ｂは、検出される物質がその面２６に結合した検出共振子２０を示す。同じ入力シグナルが、共振子２０と結合される。共振子の共振特性が、摂動としての物質の結合によって変化することから、出力シグナル２５の挿入位相シフトは、ΔΦ２に変化する。物質の結合によって引き起こされる挿入位相シフトの変化は、位相検出器２４によって検出される。測定された位相シフト変化は、共振子の面上に結合した物質の量と関連している。
図１Ｃは、共振子の挿入位相測定に対する別の選択肢を示す。方向性結合器２７が、シグナル源２２と共振子２０との間に追加され、共振子２０の反対側の電極は接地されている。位相検出器２８は、共振子面に物質が結合した結果としての反射係数の位相シフトを測定するように構成されている。
本明細書で述べるシグナル増幅の態様で用いられ得る他のＢＡＷ共振器位相シフトセンサーとしては、例えば、米国特許第８４０９８７５号明細書に記載のものが挙げられ、この特許は、本明細書に提示される開示内容と矛盾しない限り、その全内容が参照により本明細書に援用される。例えば、センサー装置は、（ｉ）分析物の結合部位を備えた検出共振子；（ｉｉ）検出共振子の振動を駆動するように構成された作動回路；（ｉｉｉ）検出共振子と結合するように配置され、検出共振子の振動の共振特性を表す１又は複数の共振器出力シグナルを測定するように構成された測定回路；並びに（ｉｖ）作動回路及び測定回路と操作可能に結合されたコントローラ、を含み得る。コントローラは、実行されると、作動回路が検出共振子を駆動する周波数をコントローラに調節させて、検出共振子の共振点を維持する命令を含有するデータ記憶装置とインターフェース接続され得る。したがって、検出は、ＢＡＷ共振器を振動へと作動させること；ＢＡＷ共振器の振動の共振特性を表す１又は複数の共振器出力シグナルを測定すること；及び検出共振子の作動周波数を調節して、ＢＡＷ共振器の共振点を維持すること、によって達成することができる。実施形態では、作動回路が検出共振子を駆動する周波数は、最大群遅延の周波数である。
そのような位相検出の手法は、有利には、異なる共振周波数の圧電共振子と共に用いることができる。
様々な実施形態では、本明細書で述べる方法、装置、及びシステムで使用するためのＢＡＷ共振器は、約７００ＭＨｚ以上、約９００ＭＨｚ以上、約１ＭＨｚ以上、１．５ＧＨｚ以上、約１．８ＧＨ以上、約２ＧＨｚ以上、２．２ＧＨｚ以上、２．５ＧＨｚ以上、約３ＧＨＺ以上、又は約５ＧＨＺ以上などの約５００ＭＨｚ以上の共振周波数を有し、以下でより詳細に述べる増幅要素を介した質量増加と共に用いられた場合、高められた感度を提供することができる。実施形態では、ＢＡＷ共振器は、約９００ＭＨｚ〜約３ＧＨｚ又は約１．５ＧＨｚ〜約２．５ＧＨｚなどの約５００ＭＨｚ〜約５ＧＨｚの共振周波数を有する。そのような周波数の一部は、これまでに報告された圧電共振子の周波数よりも実質的に高い。
本明細書で述べる検出共振子は、薄膜共振子（ＴＦＲ）である。薄膜共振子は、例えばＡＴ−カット水晶を用いるのではなく、基材上に堆積された圧電材料の薄層を備える。圧電膜は、典型的には、約２マイクロメートル未満などの約５マイクロメートル未満の厚さを有し、約１００ナノメートル未満の厚さを有する場合もある。薄膜共振子は、一般的に、その高い共振周波数及び理論的により高い感度のために好ましい。用途に応じて、検出素子として用いられる薄膜共振子は、縦又はせん断バルク弾性波共振モードの何れかをサポートするように形成され得る。好ましくは、検出素子は、せん断バルク弾性波共振モードをサポートするように形成され、なぜなら、その方が、液体サンプルでの使用により適しているからである。
ＴＦＲを用い得るセンサー装置及びシステムに関するさらなる詳細内容は、例えば、Ｄｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．に対して１９９９年８月３日に発行された米国特許第５９３２９５３号明細書に記載されており、この特許は、本明細書に提示される開示内容と矛盾しない限り、その全内容が参照により本明細書に援用される。
ＴＦＲセンサーは、適切ないかなる方法で、適切ないかなる材料から作製されてもよい。例えば、共振子は、シリコンウェハ又はサファイアなどの基材、ブラッグミラー層又は他の適切な遮音手段、下部電極、圧電材料、及び上部電極を含み得る。
ＴＦＲには、適切ないかなる圧電材料が用いられてもよい。適切な圧電基材の例としては、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ３）、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ３）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、窒化アルミニウム（ＡｌＮ）、チタン酸、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）、及び同種のものが挙げられる。
電極は、アルミニウム、タングステン、金、チタン、モリブデン、又は同種のものなど、適切ないかなる材料から形成されてもよい。電極は、蒸着によって堆積されてよく、又は他の適切ないかなるプロセスによって形成されてもよい。
本明細書で述べる薄膜共振子及び増幅は、適切ないかなる装置又はシステムで用いられてもよい。例えば、図２を参照すると、分析物を検出するためのシステムは、容器１０（又は２つ以上の容器）、薄膜共振子２０、作動回路２２、測定回路２９、及び制御電子機器３０を含み得る。流体経路が、１又は複数の容器１０を共振子２０と結合している。制御電子機器３０は、作動回路及び測定回路と操作可能に結合されている。実施形態では、制御電子機器３０は、測定回路２９からの入力に基づいて、作動回路２２が共振子２０を振動させる周波数を改変するように構成されている。
さらに図２を参照すると、容器１０（又は２つ以上の容器）は、増幅分子、増幅要素が連結された第二の認識成分若しくはその成分、並びに所望に応じて１又は複数のタグ、分析物分子、及び第一の認識成分を収容し得る。これらの試薬の各々は、以下でより詳細に記載される。制御電子機器３０は、容器１０から共振子２０へのそのような試薬の流れを、例えばポンプ、吸引、又は同種のものを介して、制御し得る。
適切ないかなる制御電子機器３０が用いられてもよい。例えば、制御電子機器は、プロセッサ、コントローラ、メモリ、又は同種のものを含み得る。メモリは、プロセッサ又はコントローラによって実行されると、装置及び制御電子機器に、本明細書で述べる装置及び制御電子機器に属する様々な機能を行わせるコンピュータ読み取り用の命令を含み得る。メモリは、いかなる揮発性、非揮発性、磁気、光学、又は電気媒体を含んでもよく、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、非揮発性ＲＡＭ（ＮＶＲＡＭ）、電気的に消去可能なプログラマブルＲＯＭ（ＥＥＰＲＯＭ）、フラッシュメモリ、又は他の何れかのデジタル媒体などである。制御電子機器３０は、マイクロプロセッサ、コントローラ、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、又は同等のディスクリート若しくは集積論理回路のうちの何れか１又は複数を含み得る。いくつかの例では、制御電子機器３０は、１若しくは複数のマイクロプロセッサ、１若しくは複数のコントローラ、１若しくは複数のＤＳＰ、１若しくは複数ＡＳＩＣ、又は１若しくは複数のＦＰＧＡ、さらには他のディスクリート若しくは集積論理回路の何れかの組み合わせなどの複数の構成要素を含み得る。本明細書における制御電子機器に属する機能は、ソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、又はこれらの何れかの組み合わせとして具体化され得る。
分子認識及びシグナル増幅
著しいバックグラウンドシグナルを含むサンプルの分子認識は、シグナルの増幅によって促進され得る。本明細書で述べるセンサー、システム、及び方法は、連結された酵素などの増幅要素を含む第二の認識成分を用いる。ＢＡＷ共振器センサーは、本明細書で述べる高められた周波数範囲において、酵素によって開裂された基質の析出に起因するセンサー面の質量増加に対して非常に効率的に反応した。
ここで図３Ａ〜３Ｄを参照すると、ＢＡＷ共振器上の酵素増幅の模式図が示される。図３Ａに示されるように、分析物と結合するように構成された分子認識成分１００は、共振子２０の面２６上に固定されている。固定された分子認識成分１００を有する共振子２０は、分子認識成分１００と結合し得る分析物１１０を含む組成物と接触され得る（図３Ｂ参照）。固定された分子認識成分１００に分析物１１０が結合した共振子２０は、酵素などの増幅要素１３０に連結された第二の分子認識成分１２０を含む組成物と接触され得る。第二の分子認識成分１２０は、第二の分子認識成分１２０及び連結されている増幅要素１３０が面２６に対して固定されるように、分析物１１０と結合するように構成されている（図３Ｃ参照）。示した実施形態では、可溶性基質１４０が、増幅要素１３０によって不溶性生成物１５０に変換され得るものであり、それがセンサー２０の面２６上に析出、及び蓄積し、それによって、結合された分析物１１０の量又は濃度の関数として質量シグナルが増幅される（図３Ｄ参照）。
図３Ａ〜３Ｄに示される一連のイベントは、説明の目的で示されていること、及び他の適切な何れかの連続するイベントが用いられてもよいことは理解される。例えば、分析物１１０は、先に第二の分子認識成分１２０（及び結合した増幅要素１３０）と接触され、その後、分析物（第二の分子認識成分が結合している）が、分子認識成分１００が固定されている共振子２０の面２６と接触されてもよい。基質１４０は、第二の分子認識成分１２０−増幅要素１３０が添加される時点で存在していてよく、又は後から添加されてもよい。何れの場合であっても、増幅の前に洗浄が行われ得る。
標的分析物の限定されない例としては、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、炭水化物、化学化合物、又は細菌、真菌、原虫、ウィルス、及び同種のものなどの感染性種が挙げられる。ある特定の用途では、標的分析物は、２つ以上の分子認識成分と結合することができる。
共振子の面には、適切ないかなる分子認識成分（例：図３の１００）が結合されていてもよい。分子認識成分は、好ましくは、目的の分析物と選択的に結合する。例えば、分子認識成分は、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ＰＮＡ及びＬＮＡ分子などの核酸類似体、タンパク質、ペプチド、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥを含む抗体、レクチン、酵素、酵素補助因子、酵素基質、酵素阻害剤、受容体、リガンド、キナーゼ、プロテインＡ、ポリＵ、ポリＡ、ポリリジン、トリアジン染料、ボロン酸、チオール、ヘパリン、ポリサッカリド、クーマシーブルー、アズールＡ、金属結合ペプチド、糖、炭水化物、キレート化剤、原核細胞、及び真核細胞から成る群より選択され得る。
分子認識成分をＢＡＷ共振器の面上に固定するために、適切ないかなる方法が用いられてもよい。例えば、エポキシシランの均一コーティングが、蒸着プロセスを用いてセンサー面上に堆積され得る。次に、抗体などの試験用及びレファレンス用の分子認識成分が、例えば圧電ベースのナノ分散技術を用いて、試験及びレファレンス共振子上に堆積され得る。抗体にある一級アミンが、エポキシド基と反応して、センサー面に抗体を結合させる。さらなる例として、存在する場合は分子認識成分のチオール基が、ＢＡＷ共振器の面と結合する。ＢＡＷ共振器の面は、適宜又は必要に応じて、分子認識成分の結合を可能とするように修飾されてもよい。
上記で述べたものなどの適切ないかなる分子認識成分が、第二の分子認識成分（例：図３の１２０）として用いられてもよい。第二の分子認識成分は、酵素などの適切ないかなる増幅要素と連結されていてもよい。好ましくは、第二の分子認識成分は、抗体であり、増幅要素は、酵素である。
適切ないかなる増幅要素が、第二の分子認識成分に連結されていてもよい。実施形態では、増幅要素は、光開始剤、化学開始剤、又は熱開始剤などの活性化可能な重合開始剤である。重合開始剤は、１又は複数のモノマーの存在下で活性化されて、第二の分子認識成分からポリマーをグラフト化させ得る。実施形態では、増幅要素は、酵素である。実施形態では、酵素は、アッセイ環境中で可溶性である基質を、センサーの面上に析出する不溶性生成物に変換することができる。適切な酵素の例としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータガラクトシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。
ＢＡＷ共振器の面上に蓄積可能である不溶性生成物を生成することができる酵素／基質系の例としては、アルカリホスファターゼ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロ−ブルーテトラゾリウムクロリド（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）が挙げられる。ＢＣＩＰの酵素触媒加水分解によって、不溶性二量体が生成され、これは、センサーの面上に析出し得る。ホスフェート部分がガラクトース、グルコース、脂肪酸、脂肪酸エステル、及びアミノ酸などの加水分解開裂性の官能基で置き換えられた他の類似体基質が、それらの補助酵素と共に用いられてもよい。他の酵素／基質系としては、ペルオキシダーゼ酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はミエロペルオキシダーゼと、ベンジデン、ベンジデンジヒドロクロリド、ジアミノベンジデン、ｏ−トリデン、ｏ−ジアニシジン及びテトラメチルベンジデン、カルバゾール、特に３−アミノ−９−エチルカルバゾール、及びすべてがペルオキシダーゼとの反応で析出物を形成することが報告されている様々なフェノール系化合物のうちの１つと、が挙げられる。また、アルファヒドロキシ酸オキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、及びキサンチンオキシダーゼなどのオキシダーゼも、フェナジンメトサルフェート−ニトロブルーテトラゾリウム混合物などの酸化性基質系と共に用いられ得る。
いかなる種類の競合アッセイが用いられてもよいことは理解される。分析物が、ストレプトアビジンタグ；ビオチンタグ；キチン結合タンパク質タグ；マルトース結合タンパク質タグ；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ；ポリ（Ｈｉｓ）タグ；Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、若しくはＶ５タグなどのエピトープタグ；又は同種のものなど、第一又は第二の認識複合体によって認識可能なタグを含むように修飾されてよいこともさらに理解される。タグが連結された分析物は、分析物の変異体又は誘導体を含み得ることはさらに理解される。変異体又は誘導体は、分析物を認識するように構成された第一又は第二の分子認識成分によって選択的に認識可能である変異体又は誘導体である。いくつかの状況では、変異又は誘導分析物は、タグが連結されていない分析物の親和性とは異なる第一又は第二の分子認識成分に対する親和性を有することが望ましい場合がある。分析物の変異体又は誘導体は、タグが連結された分析物の製造を容易とすることができる変異体又は誘導体であり得る。例えば、タグが連結された分析物は、組換えポリペプチドを含み得る、などである。
タグが連結された分析物分子を用いる競合アッセイが行われる場合、タグが連結された分析物分子は、分析物の代わりに、又は分析物に加えて、共振子の面上に固定された第一の分子認識成分と結合し得る。
開示される装置では、少なくとも２つのＢＡＷ共振器センサーは、目的の分析物に対して異なる感度を有しており：高感度センサーと低感度センサーである。低感度センサーの感度は、高感度センサーに存在するよりも低い親和性の分子認識成分を、低い能力の分子認識成分を、又はこれらの組み合わせを低感度センサーに固定することによって、高感度センサーに対して調節することができる。このことは、当然高感度センサーに関しても説明することができ、低感度センサーに存在するよりも高い親和性の分子認識成分を、高い能力の分子認識成分を、又はこれらの組み合わせを、高感度センサーに固定することになる。分子認識成分の親和性、能力、又は両方は、同じ分子認識成分のコーティング（量、濃度など）を改変することによって、異なる分子認識成分を用いることによって、又はこれらの組み合わせによって調節することができる。
いくつかの実施形態では、コーティングが改変される場合、様々なパラメータが、相対感度に影響を与えるために用いられてよく、例えばコーティング中の分子認識成分の濃度が例として挙げられる。いくつかの実施形態では、非特異的成分とも称され得るフィラー分子が、分子認識成分と共にコーティング組成物中に混合され得る。次に、非特異的成分と分子認識成分との相対量が、低感度センサーの感度レベルを決定するために選択され得る。
いくつかの実施形態では、異なる分子認識成分が、相対感度に影響を与えるために用いられ得る。例えば、目的の分析物に対して異なる感度を有する分子認識成分が、２つのセンサー上に含められ得る。例えば、高感度センサーの場合よりも目的の分析物に対する親和性の低い分子認識成分が、低感度センサー上にコーティングされてよく、低感度センサーの場合よりも親和性の高い分子認識成分が、高感度センサー上にコーティングされてよい。
本明細書で述べる装置、システム、及び方法は、サンプル中の標的分析物を検出するために用いられ得る。装置は、数多くの化学、環境、食品安全、又は医学の用途で有用であり得る。例えば、試験されるべきサンプルは、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、尿、及び同種のものであってよく、又はこれらから誘導されたものであってもよい。流体組成物ではない他の試験組成物は、分析用の適切な溶液又は溶媒中に溶解又は懸濁され得る。
標的分析物の限定されない例としては、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、炭水化物、化学化合物、又は細菌、真菌、原虫、ウィルス、殺虫剤、及び同種のものなどの感染性種が挙げられる。ある特定の用途では、標的分析物は、２つ以上の分子認識成分と結合することができる。
本開示は、以下の例によって説明される。特定の例、仮定、モデル、及び手順が、本明細書で示される本開示の範囲及び趣旨に従って広く解釈されるべきであることは理解されたい。
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を検出するための装置
表１は、現在利用可能であるいくつかのセントラルラボベースのヒトＴＳＨ試験のダイナミックレンジを示す。小児及び成人に対する正常範囲は、０．２７〜４．２ｕＩＵ／ｍｌ（９５パーセンタイル）であることが示されている（Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ ＴＳＨ Ｆａｃｔｓｈｅｅｔ）。
表１：いくつかのセントラルラボＴＳＨ試験の測定範囲。Ａｃｃｅｓｓ ＴＳＨ（３ｒｄ ＩＳ）だけは、第三ＷＨＯ標準（3rd WHO reference）のＴＳＨ製剤に基づいている。他はすべて、第二ＷＨＯ標準のＴＳＨ製剤に基づいている。６．８ＩＵ／ｎｇでの換算は、ＢＡＷセンサーアッセイ測定を行うために用いたスクリプスのＴＳＨ抗原に基づいている。
Figure 2021528664
図４は、ヒトＴＳＨに対するＢＡＷセンサーによるイムノアッセイの検量線を示す。上限の１０００ｐｇ／ｍｌでは、周波数のシフトは、３５０ｋＨｚ／秒以上である。より高い濃度では、ＢＡＷセンサーの速いシフトを追跡することが困難となり、析出物が共振子を大きく減衰させる。Ａｃｃｅｓｓ ＴＳＨ（３ｒｄ ＩＳ）のダイナミックレンジと比較するためには、ダイナミックレンジを７倍増加させることが必要である。電子機器及びソフトウェアアルゴリズムの改善によってある程度の改善が成され得るが、それは、僅かに２倍の増加までとなり得る。
図５は、高い濃度では、追跡アルゴリズムが、米国特許出願公開第２０１５／０３７７８３４（Ａ１）号明細書に概略記載の通りであるシステムを用いては、高いレベルの周波数シフトを追跡できないことを示している。周波数追跡は、約１２秒で失われている。最初の１０秒間がフィットしているとしても、大きいシグナル及び共振子の極度の減衰に起因する大きい変動量が部分的に見られる。
２つの共振子を組み込むことによって、ＢＡＷによるイムノアッセイのダイナミックレンジが拡大され得る。第一の共振子は、図４に示される応答に類似の応答を発生させることができる高感度共振子である。第二の共振子は、測定システムを飽和させることなくより高い濃度レベルでの測定を行うことができる低感度共振子である。第二の共振子は、特異的捕捉リガンドと非特異的フィラー分子との混合物を、１：４（又は他の適切な何れかの比率）などの決まった比率で固定することによって感度が下げられている。これは、酵素で強化されたＢＡＷシステムにおいて、ダイナミックレンジの限界が、イムノアッセイ自体ではなく、素早くシフトする共振子を追跡するシステムの能力であることから、効果的である。多くの場合において、イムノアッセイでの結合は、面全体の能力の１０％よりも非常に低い。したがって、特異的対非特異的捕捉分子の１：４混合物を固定すると、共振子から発生して得られるシグナルは、混合比によって調整されるはずであり、したがって、同じ比率でダイナミックレンジが拡大する。濃度が高感度共振子のダイナミックレンジを超えた場合、装置は、低感度共振子を用いて濃度値を報告する。中間の濃度の場合は、結果の精度を高めるために、両方の共振子が用いられ得る。
混合する代わりとして、低感度共振子は、低親和性抗体を用いて製造されてもよい。これは、抗体親和性の比によって感度を効果的に低下させ、それによって、同様にダイナミックレンジを拡大させることになる。
したがって、ダイナミックレンジが拡大されたバルク音響波共振器の実施形態が開示される。上記で述べた実施及び他の実施は、以下の請求項の範囲内である。当業者であれば、本開示を、開示された実施形態以外の実施形態で実践することができることは理解されるであろう。開示された実施形態は、説明の目的で提示されるものであって、限定するものではない。

Claims (18)

  1. サンプル中の分析物を検出するためのシステムであって：
    低認識成分が固定された面を備えた低感度バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーであって、
    前記低認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、
    低感度バルク音響波共振器センサーと；
    高認識成分が固定された面を備えた高感度ＢＡＷ共振器センサーであって、
    前記高認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、
    高感度ＢＡＷ共振器センサーと；
    増幅分子、前記増幅要素が連結された第二の認識成分、並びに所望に応じて前記タグ及び前記分析物分子の一方又は両方を収容している１又は複数の容器と；
    前記１又は複数の容器から前記低及び高認識成分が結合された前記低及び高ＢＡＷ共振器センサーの両方の前記面までの流体経路と；
    前記低及び高ＢＡＷ共振器センサーの振動を駆動するように構成された作動回路と；
    前記低及び高ＢＡＷ共振器センサーの両方と結合するように配置され、前記低及び高ＢＡＷ共振器センサーの前記振動の共振特性を表す１又は複数の共振器出力シグナルを測定するように構成された測定回路と；
    前記作動回路及び前記測定回路と操作可能に結合されたコントローラと、
    を備えた、システム。
  2. 前記低及び高認識成分が、異なっている、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記低認識成分が、前記高認識成分の場合よりも、前記分析物分子に対して低い親和性を有する、請求項２に記載のシステム。
  4. 前記低及び高認識成分が、同じであり、前記低及び高認識成分が固定されている前記面上での前記低及び高認識成分の濃度が異なっている、請求項１に記載のシステム。
  5. 前記低ＢＡＷ共振器センサーの前記面上の前記低認識成分の濃度が、前記高ＢＡＷ共振器センサーの前記面上の前記高認識成分の濃度よりも低い、請求項４に記載のシステム。
  6. 少なくとも前記低ＢＡＷ共振器センサーの前記面上に、非特異的成分も固定されている、請求項４に記載のシステム。
  7. 前記コントローラが、前記低ＢＡＷ共振器センサーからの、前記高ＢＡＷ共振器センサーからの、又は両方からの前記出力シグナルを用いる、請求項１に記載のシステム。
  8. 前記コントローラが、前記低ＢＡＷ共振器センサーから、又は前記高ＢＡＷ共振器センサーからであるが、両方からではない、前記出力シグナルを用いる、請求項１に記載のシステム。
  9. 前記コントローラが、前記低ＢＡＷ共振器センサー及び前記高ＢＡＷ共振器センサーの両方からの前記出力シグナルを用いる、請求項１に記載のシステム。
  10. サンプル中の分析物を検出するための装置と共に用いるための、システムを備えたキットであって：
    前記システムは：
    低認識成分が固定された面を備えた低感度バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーであって、
    前記低認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、
    低感度バルク音響波共振器センサーと；
    高認識成分が固定された面を備えた高感度ＢＡＷ共振器センサーであって、
    前記高認識成分は、分析物、タグが連結された分析物分子、若しくはタグ、又は増幅要素が連結された第二の認識成分が結合されたこれらの分子の何れか１つを選択的に結合するように構成されている、
    高感度ＢＡＷ共振器センサーと；
    増幅分子、前記増幅要素が連結された第二の認識成分、並びに所望に応じて前記タグ及び前記分析物分子の一方又は両方を収容している１又は複数の容器と、
    を備える、キット。
  11. 前記増幅要素が、酵素であり、増幅前駆体が、基質であり、前記酵素は、前記基質を析出物に変換するように構成されている、請求項１０に記載のキット。
  12. サンプル中の分析物を検出するための方法であって：
    分析物又は分析物及びタグが連結された分析物分子と、低認識成分と、増幅要素が連結された第二の認識成分とを、前記低認識成分及び前記増幅要素が連結された第二の認識成分を含む複合体を生成させるために接触させることであって、
    前記低認識成分は、低バルク音響波（ＢＡＷ）共振器センサーの面に対して固定されており、前記分析物、前記タグが連結された前記分析物分子、若しくは前記タグの１つ以上を、又は前記第二の認識成分に結合されたこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されている、
    接触させること；
    分析物又は分析物及びタグが連結された分析物分子と、高認識成分と、増幅要素が連結された第二の認識成分とを、前記高認識成分及び前記増幅要素が連結された第二の認識成分を含む複合体を生成させるために接触させることであって、
    前記高認識成分は、高ＢＡＷ共振器の面に対して固定されており、前記分析物、前記タグが連結された前記分析物分子、若しくは前記タグの１つ以上を、又は前記第二の認識成分に結合されたこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、
    前記増幅要素が連結された第二の認識成分は、前記分析物、前記タグが連結された前記分析物分子、若しくは前記タグ、又は前記低及び高認識成分に結合したこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、
    前記低認識成分及び前記高認識成分は、前記分析物分子に対して異なる親和性を有する、
    接触させること；
    前記連結された増幅要素と、増幅前駆体とを、前記増幅前駆体を前記ＢＡＷ共振器センサーの面に質量を付与する分子に変換するための条件下で接触させること；並びに、
    前記ＢＡＷ共振器の前記面に付与された質量を測定すること、
    を含む、方法。
  13. 前記分析物又は前記分析物及び前記タグが連結された分析物と、前記増幅要素が連結された第二の認識成分との接触を、前記低及び高ＢＡＷ共振器の前記面に対してそれぞれ固定された前記低及び高認識成分の両方との接触の前に行う、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記分析物又は前記分析物及び前記タグが連結された分析物と、前記低及び高認識成分との接触を、前記増幅要素が連結された第二の認識成分との接触の前に行う、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記分析物又は前記タグが連結された分析物と、前記低認識成分と、前記高認識成分と、前記増幅要素が連結された第二の認識成分とを同時に接触させる、請求項１３に記載の方法。
  16. サンプル中の分析物を検出するための方法であって：
    分析物又は分析物及びタグが連結された分析物分子と、低認識成分と、増幅要素が連結された第二の認識成分とを、前記低認識成分及び前記増幅要素が連結された第二の認識成分を含む複合体を生成させるために接触させることであって、
    前記低認識成分は、低バルク音響波（ＢＡＷ）共振器の面に対して固定されており、前記分析物、前記タグが連結された前記分析物分子、若しくは前記タグの１つ以上を、又は前記第二の認識成分に結合されたこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、固定されている前記面上での濃度が低い、
    接触させること；
    分析物又は分析物及びタグが連結された分析物分子と、高認識成分と、増幅要素が連結された第二の認識成分とを、前記高認識成分及び前記増幅要素が連結された第二の認識成分を含む複合体を生成させるために接触させることであって、
    前記高認識成分は、高ＢＡＷ共振器の面に対して固定されており、前記分析物、前記タグが連結された前記分析物分子、若しくは前記タグの１つ以上を、又は前記第二の認識成分に結合されたこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、固定されている前記面上での濃度が高く、
    前記増幅要素が連結された第二の認識成分は、前記分析物、前記タグが連結された前記分析物分子、若しくは前記タグ、又は前記低及び高認識成分に結合したこれらの分子の何れか１つ以上を選択的に結合するように構成されており、
    前記第一の認識成分の前記低濃度は、前記第二の認識成分の前記高濃度よりも低い、
    接触させること；
    前記連結された増幅要素と、増幅前駆体とを、前記増幅前駆体を前記ＢＡＷ共振器の面に質量を付与する分子に変換するための条件下で接触させること；並びに、
    前記ＢＡＷ共振器の前記面に付与された質量を測定すること、
    を含む、方法。
  17. 前記低ＢＡＷ共振器の前記面上に、非特異的成分も固定されている、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記低及び高認識成分が、同じである、請求項１６に記載の方法。
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