JP2021526798A - 核酸ライブラリを生成する方法ならびにそれを実施するための組成物およびキット - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、2018年6月6日に出願された米国仮特許出願第62/681,524号の利益を主張し、その出願はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
上に要約されるように、本開示は、核酸ライブラリを生成する方法を提供する。方法は、一本鎖核酸(ssNA)を一本鎖核酸結合タンパク質(SSB)と接触させて、SSB結合ssNAを生成することを含む。方法は、SSB結合ssNAと、第1のアダプターオリゴヌクレオチドと、SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第1のスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせることをさらに含む。組み合わせることは、SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域を介してSSB結合ssNAの末端領域にハイブリダイズされた第1のスプリントオリゴヌクレオチドと、第1のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第1のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたその第1のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体の形成をもたらし、これにより、第1のアダプターオリゴヌクレオチドの末端がSSB結合ssNAの第1の末端領域の末端に隣接する。いくつかの実施形態では、組み合わせることは、SSB結合ssNAと、第2のアダプターオリゴヌクレオチドと、SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む第2のスプリントオリゴヌクレオチドとを組み合わせることをさらに含み、形成された複合体は、第1のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた末端領域の反対側のSSB結合ssNAの末端領域に、SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた第2のスプリントオリゴヌクレオチドと、第2のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して第2のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたその第2のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、第2のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、第1のアダプターオリゴヌクレオチドに隣接する末端の反対側のSSB結合ssNAの末端に隣接する。
上に要約されるように、本開示はまた、組成物を提供する。組成物は、例えば、本開示の方法の部分において上に記載されるステップのうちのいずれかの1つ以上を実施することを含め、本開示の方法のうちのいずれかを実施することを含む、様々な用途において使用を見出す。したがって、組成物は、本開示の方法の部分において上に記載されるオリゴヌクレオチド(非均一オリゴヌクレオチドの複数/集合を含む)、ssNA、SSB、他の試薬などのうちのいずれかを、任意の組み合わせにおいて含み得る。
上記に要約したように、本開示は、キットを提供する。キットは、例えば、本開示の方法の部分において上に記載されるステップのうちのいずれかの1つ以上を実施することを含め、本開示の方法のうちのいずれかを実施することを含む、様々な用途において使用を見出す。したがって、キットは、本開示の方法の部分において上に記載されるオリゴヌクレオチド(非均一オリゴヌクレオチドの複数/集合を含む)、ssNA、SSB、他の試薬などのうちのいずれかを、任意の組み合わせにおいて含み得る。
実施例1
1つの反応における一本鎖DNAへの迅速で効率的で標的化されたアダプターのライゲーションのためのアプローチがここに開示される。以下の実施例では、Illumina P7またはP5アダプター配列を含む配列決定アダプターオリゴヌクレオチドが、P7スプリントについては一連の3プライムNおよびP5スプリントについては一連の5プライムNを含むスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。スプリントは、二本鎖ライゲーションのみ高効率で行うことができるリガーゼに、アダプターを標的一本鎖DNAにライゲーションさせるための機会を作り出す。ライゲーションに関与することが必要とされないすべてのオリゴヌクレオチドDNA末端は、ライゲーションを防止するオリゴヌクレオチド修飾(例えばアミノ修飾)によってブロックされる。
1.試料インプット(36uL)
a.剪断DNAおよびET SSB(カタログ番号M2401S)を36uLの体積に組み合わせる
i.1uLのET SSBは、試験したほとんどの試料タイプに対して阻害することなくライゲーションを促進する
ii.緩衝液EBT(10mMのトリス−HCl、pH8.0、および0.05%のTween 20)で残りの体積を充填する
2.試料変性
a.95℃に予熱した蓋を有するサーモサイクラー中で試料を3分間インキュベートする
b.直ちに変性試料を氷またはPCR冷却器上に30秒間置く。
3.2uLのプールされたアダプター混合物(等しい体積のP5およびP7アダプター)を添加する
a.アダプターインプットは、インプットのモル濃度に依存する。6〜10対1のモル比のアダプター対テンプレートが好ましい。
4.反応マスター混合物を添加し、ピペッティングにより十分に混合する
a.8uLのT4 DNAリガーゼ緩衝液(カタログ番号M0202M)
b.32uLの50%PEG 8000(カタログ番号B0216L)
c.1uLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ−10,000U/mL(カタログ番号M0201L)
d.1uLのT4 DNAリガーゼ−2,000,000U/mL(カタログ番号M0202M)
5.37℃で最大60分間インキュベートする
a.ほとんどのライゲーションは最初の15分で生じるが、プラトーは約45分まで達成されない。
6.反応物をクリーンアップする
a.カラムクリーンアップ(例えば、分解DNA用)またはSPRI(例えば、現代試料用)。
クリーンアップ後、予め増幅したライブラリの希釈物に対してqPCRを行い、ライゲーション効率を決定した。より低いCT値は、より高いCT値を有する同じ試験の別の試料と比較して、より高いライゲーション効率を示す。1の差は、ライブラリ効率の2倍の差にほぼ等しい。予め増幅したライブラリのアリコートを、インデックスPCR反応でも増幅した。インデックス化後、ライブラリをSPRIでクリーニングし、Agilent TapeStation 2200システム上で可視化して、各ライブラリ内のアダプタアーティファクトの割合を推定した。
NEBによって供給されるET SSBタンパク質などの一本鎖結合タンパク質(SSB)は、一本鎖ライゲーションのライゲーション効率を向上させることが観察された。インプットのモル濃度が等しいとすると、より高い平均断片長を有する試料は、ピークライゲーションを達成するためにSSBのより大きなインプットを必要とした。反応物中のDNAのモル濃度も、必要とされるSSBの量に影響する。ET SSBは過剰が膨大であればライゲーションを阻害する潜在能力を有する。
本プロトコルの効率を、NEB Ultra 2キット(dsDNA)、SS2.0(Gansauge et al.(2017)Nucleic Acids Research 45(10):e79)、ならびにCaroe et al.(2017)Methods in Ecology and Evolution 9(2):410−419およびMak et al.(2017)GigaScience 6:1−13に記載されている平滑末端単一チューブ(BEST)法と比較した。平均断片長が約350bpの現代ヒトDNAと、平均断片長が約35〜40bpで分解が激しい古代バイソン試料とを使用して比較結果を得た。
標準的なプロテイナーゼK処理を使用して、高温で毛髪からDNAを収集した。ライブラリを作製するためのテンプレートとして6ナノグラムのDNAを使用した。上に記載されるようにプロトコルに従った。アダプターライゲーション生成物から2つの配列決定ライブラリを生成した。1つは、50μLの全ライゲーション生成物のうちの1μLを使用した(SRL3)。もう1つはこの生成物を2.5μL使用した(SRL4)。両方のライブラリをIllumina MiSeq配列決定プラットフォーム上で配列決定して、ライブラリの特徴および複雑度(固有のライブラリ分子の数)を評価した。
古代バイソン骨から抽出したDNAを用いて、テンプレートDNA分子から配列決定ライブラリへの変換効率を比較した。上に記載されるプロトコルを含む4つの異なるプロトコルを用いて、同じ抽出物からの同じ量のDNAからライブラリを生成した。
Claims (53)
- 核酸ライブラリを生成する方法であって、
一本鎖核酸(ssNA)を一本鎖核酸結合タンパク質(SSB)と接触させて、SSB結合ssNAを生成することと、
前記SSB結合ssNA、
第1のアダプターオリゴヌクレオチド、ならびに
SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第1のスプリントオリゴヌクレオチド
を組み合わせることと、
を含み、
前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域を介して前記SSB結合ssNAの末端領域にハイブリダイズされた前記第1のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第1のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第1のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第1のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体を形成し、これにより、前記第1のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が前記SSB結合ssNAの前記末端領域の末端に隣接する、方法。 - 前記第1のアダプターオリゴヌクレオチドおよびSSB結合ssNAの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記接触、組み合わせること、および共有結合のステップの合計持続時間が、3時間以下である、請求項2に記載の方法。
- 前記複合体が、前記SSBと接触された前記ssNAの80%以上から形成される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAが、分解された核酸試料からのものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAが、古代核酸試料からのものである、請求項5に記載の方法。
- 前記ssNAが、法医学核酸試料からのものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAが、一本鎖DNA(ssDNA)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssDNAは二本鎖DNA(dsDNA)に由来するものである、請求項8に記載の方法。
- 前記ssDNAをSSBと接触させる前に、前記dsDNAを変性させることによって前記ssDNAを生成することをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記複合体の形成後、前記ssDNAを再ハイブリダイズさせて、dsDNAを生成することをさらに含む、請求項9または請求項10に記載の方法。
- 前記生成されたdsDNAを配列決定することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記生成されたdsDNAのサブサンプルが配列決定される、請求項12に記載の方法。
- 前記ssNAが、一本鎖RNA(ssRNA)である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組み合わせることが、
前記第1のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第1のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第1のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記SSB結合ssNAと
を組み合わせることを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 前記組み合わせることが、
前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域を介して前記SSB結合ssNAにハイブリダイズされた前記第1のスプリントオリゴヌクレオチドを含む複合体と、
前記第1のアダプターオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 前記組み合わせることが、
前記SSB結合ssNAと、
第2のアダプターオリゴヌクレオチドと、
SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第2のスプリントオリゴヌクレオチドと
を組み合わせることをさらに含み、
前記形成された複合体が、前記SSB結合ssNAのうち前記第1のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記末端領域とは反対側の末端領域に、前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域を介してハイブリダイズされた前記第2のスプリントオリゴヌクレオチドと、前記第2のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を介して前記第2のアダプターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた前記第2のスプリントオリゴヌクレオチドをさらに含み、これにより、前記第2のアダプターオリゴヌクレオチドの末端が、前記SSB結合ssNAのうち前記第1のアダプターオリゴヌクレオチドに隣接する前記末端とは反対側の末端に隣接する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第2のアダプターオリゴヌクレオチドおよびSSB結合ssNAの前記隣接する末端を共有結合させることをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記共有結合させることが、前記隣接する末端をライゲーションすることを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーションが、酵素ライゲーションによって行われる、請求項19に記載の方法。
- アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記SSB結合ssNAに隣接しない側の末端が、ブロッキング修飾を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、請求項21に記載の方法。
- 前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記SSB結合ssNAに隣接しない側の末端における3’OHの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記SSB結合ssNAに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な3’OHからなる群から選択される、請求項21または請求項22に記載の方法。
- 前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記SSB結合ssNAに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な3’OHであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および3’ホスフェートからなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域の長さが、10ヌクレオチド以下である、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプターオリゴヌクレオチドが、PCR増幅のためのアダプターまたはその相補体を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプターオリゴヌクレオチドが、部分的もしくは完全な配列決定アダプターまたはその相補体を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAの少なくとも一部分またはその誘導体を配列決定することをさらに含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸(SSB結合ssNA)と、
第1のアダプターオリゴヌクレオチドと、
SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第1のスプリントオリゴヌクレオチドと
を含む、組成物。 - 第2のアダプターオリゴヌクレオチドと、
SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第2のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含む、請求項31に記載の組成物。 - 前記ssNAが、分解された核酸試料からのものである、請求項31または請求項32に記載の組成物。
- 前記ssNAが、古代核酸試料からのものである、請求項33に記載の組成物。
- 前記ssNAが、法医学核酸試料からのものである、請求項31〜33のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ssNAが、一本鎖DNA(ssDNA)である、請求項31〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ssDNAが二本鎖DNA(dsDNA)に由来するものである、請求項36に記載の組成物。
- 前記ssNAが、一本鎖RNA(ssRNA)である、請求項31〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- アダプターオリゴヌクレオチド末端を、前記SSB結合ssNAの末端に共有結合させるための試薬をさらに含む、請求項31〜38のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記試薬が、リガーゼである、請求項39に記載の組成物。
- 一本鎖核酸結合タンパク質(SSB)と、
第1のアダプターオリゴヌクレオチドと、
SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第1のスプリントオリゴヌクレオチドと、
前記SSB、第1のアダプターオリゴヌクレオチド、および第1のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するための指示と
を含む、キット。 - 第2のアダプターオリゴヌクレオチドと、
SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のアダプターオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含む、第2のスプリントオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、
前記指示が、前記SSB、第1のアダプターオリゴヌクレオチド、第1のスプリントオリゴヌクレオチド、第2のアダプターオリゴヌクレオチド、および第2のスプリントオリゴヌクレオチドを使用して核酸ライブラリを生成するためのものである、請求項41に記載のキット。 - 前記SSBが、一本鎖DNA結合タンパク質である、請求項41または42に記載のキット。
- 前記SSBが、一本鎖RNA結合タンパク質である、請求項41または42に記載のキット。
- アダプターオリゴヌクレオチドの末端を、一本鎖核酸結合タンパク質に結合した一本鎖核酸(SSB結合ssNA)の末端に連結するための試薬をさらに含む、請求項41〜44のいずれか一項に記載のキット。
- 前記試薬が、リガーゼである、請求項45に記載のキット。
- アダプターオリゴヌクレオチドの末端が、ブロッキング修飾を含む、請求項41〜46のいずれか一項に記載のキット。
- 前記ブロッキング修飾が、ライゲーションをブロックする修飾である、請求項47に記載のキット。
- 前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記SSB結合ssNAに隣接しない側の末端における3’OHの不在、および、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記SSB結合ssNAに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な3’OHからなる群から選択される、請求項47または請求項48に記載のキット。
- 前記ブロッキング修飾が、前記アダプターオリゴヌクレオチドのうち前記SSB結合ssNAに隣接しない側の末端におけるアクセス不可能な3’OHであり、前記ブロッキング修飾が、アミノ修飾因子、スペーサー、ジデオキシ塩基、反転ジデオキシ塩基、および3’ホスフェートからなる群から選択される、請求項47または請求項48に記載のキット。
- 前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項41〜50に記載のキット。
- 前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域が、ユニバーサル塩基を含む、請求項41〜51に記載のキット。
- 前記SSB結合ssNAハイブリダイゼーション領域の長さが、10ヌクレオチド以下である、請求項41〜52に記載のキット。
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