JP2021519811A - 象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に関するもので、下記一般式１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。ＫＹ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８（一般式１）前記一般式１において、Ｒ１はアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）であり、Ｒ２はアルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）であり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）であり、Ｒ６はアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）であり、Ｒ７およびＲ８はリジン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）である。【選択図】図３

Description

本発明は、歯磨き剤組成物に関するもので、より具体的に、本発明は歯を構成する象牙質欠損部の生理的再石灰化を誘導して、知覚過敏症を防止または緩和するための歯磨き剤組成物に関するものである。

よく「しみる歯（知覚過敏）」と言われる象牙質知覚過敏症は、成人人口の８％〜５７％が経験する一般的な症状である。特に、韓国において最も多く発生する疾患である歯周病の場合、患者の７２．５％〜９８％が知覚過敏で苦しんでいる（出処：国家健康情報ポータル医学情報、http://health.cdc.go.kr/health/Main.do）。

象牙質知覚過敏症は、象牙細管が外部からのすべての刺激をそのまま歯髄内の神経に伝達して、同じ刺激に対してもいつもより敏感に反応するようにして誘発される痛症と定義され得る。象牙質自体には神経がないが、歯がしみると感じるのは、冷たい温度刺激が象牙細管を経て歯髄内部の神経まで伝わるからである。

歯の最も多くの部分を占める象牙質には、歯髄からエナメル質に至るまでの象牙細管が存在する。この管の内部は液体で詰まっており、歯髄側に行くほど直径が大きくなり密集する構造を有するが、このような構造的特徴のため、外部刺激が内部の歯髄神経に速やかに伝達され得る。外部と接した象牙質が損傷して象牙細管が外部と接する面積が広くなると、同じ刺激に対しても通常より敏感に反応するようになる原因となり得る。

現在、知覚過敏症を治療するためのアプローチ方法は、作用原理に応じて大きく２種類に分けられ、一つは痛みを伝達する神経の信号伝達を妨害することであり、他の一つは露出した象牙細管を塞いで、その症状を緩和させる方法である。

まず、痛症を伝達する神経の信号伝達を妨害するための方法に、リン酸水素二カリウム塩（Ｋ_２ＨＰＯ_４）成分がよく用いられている。しかし、リン酸水素二カリウム塩は、痛症ブロックの効果が低いだけでなく、持続的に繰り返し使用する必要があり、咀嚼過程における噛む感覚を制限するため、効率的な治療方法とは言い難い。

次に、象牙細管を封鎖するための方法のために、リン酸一水素カルシウム（ＣａＨＰＯ_４）、フッ素（fluorine）、シュウ酸（oxalate）、アミノ酸のアルギニン（arginine）と炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）などが用いられている。最近では、象牙質知覚過敏症に対して、歯科で治療を受ける手間を考慮して、象牙質知覚過敏症を治療、緩和または防止し得るリン酸カルシウム、歯科用シリカ、塩化ストロンチウム、炭酸カルシウムまたはリン酸三カルシウムを有効成分として含む知覚過敏症の防止用歯磨き剤が販売されているが、これもやはり生体本来の象牙質とは異なる物質を用いることとなるので、時間が経つにつれ周辺境界部位に隙間が生じたり、または封鎖部から離脱して再び神経が露出されたりして、歯がしみる症状が再発するなど、歯の知覚過敏症状を緩和させる効率が低いと言う問題を有している。

本発明は、象牙質の生理的再石灰化（remineralization）によって露出された象牙細管の欠損部を閉鎖することにより知覚過敏症を防止または緩和する、ペプチドを含む歯磨き剤組成物を提供することを目的とする。

本発明の目的は、以上で言及したものに制限されず、言及されていないまた他の目的は、以下の記載から本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者に明確に理解され得ることである。

前記の技術的課題を解決するための本発明の一様態による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物は、下記一般式１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物を提供する。

Ｋ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８・・・一般式（１）
前記一般式１において、
Ｒ１は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、またはグルタミン（Ｑ）であり、
Ｒ２は、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）であり、
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）であり、
Ｒ６は、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）であり、
Ｒ７およびＲ８は、リジン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）である。

ここで、前記ペプチドは、配列番号１〜９６のいずれかのアミノ酸配列からなるものであり得る。

また、前記組成物１００重量部に対して、前記ペプチド０．００１５重量部〜０．００２５重量部が含まれ得る。

また、前記組成物１００重量部に対して、リン酸三カルシウム３１．００重量部〜３３．００重量部が含まれ得る。

また、前記組成物１００重量部に対して、ヒドロキシアパタイト（Hydroxyapatite）０．０４５重量部〜０．０５５重量部が含まれ得る。

例示的な実施例において、歯磨き剤組成物は、前記組成物１００重量部に対して精製水２０重量部〜２２重量部、湿潤剤３３重量部〜３７重量部、粘度調整剤４．５重量部〜５．４重量部、界面活性剤１．１重量部〜１．３重量部、着香剤０．８重量部〜０．９重量部および賦形剤０．０４重量部〜０．０６重量部を含み得る。

例示的な実施例において、歯磨き剤組成物は、前記組成物１００重量部に対してアミノカプロン酸０．１５重量部〜０．２５重量部、アラントイン１．９重量部〜２．１重量部を含み得る。

例示的な実施例では、湿潤剤はＤ−ソルビトール液、またはピロリドンカルボン酸ナトリウム（sodium PCA Solution、ＰＣＡ−Ｎａ）液、または濃グリセリンであり、粘度調整剤は含水ケイ酸、キサンタンガムまたはＣＭＣであり、界面活性剤はココイルメチルタウリン酸ナトリウムであり、着香剤は緑茶エキス、カモミール抽出物、ローズマリーエキス、ミルラチンキ（myrrh tincture）、ラタニアチンキ、カモミールチンキ、マスチックオイル４０ ＨＦ−６０６６２、プロポリス抽出液、グレープフルーツ種子抽出物、スピアミントＢ７１２２８またはペパーミントオイル８１６８９であり、賦形剤はヒドロキシアパタイトであり得る。

例示的な実施例において、湿潤剤は、Ｄ−ソルビトール液８０重量％〜８３重量％、ＰＣＡ−Ｎａ液７重量％〜８重量％、濃グリセリン１０重量％〜１２重量％を含み得る。

例示的な実施例において、粘度調整剤は、含水ケイ酸７９重量％〜８５重量％、キサンタンガム１１重量％〜１３重量％を含み得る。

本発明は、象牙質の生理的な再石灰化によって露出された象牙細管の欠損部を閉鎖することにより知覚過敏症を防止または緩和する、ペプチドを含む歯磨き剤組成物を提供し得る。

本発明の効果は以上で言及したものに制限されず、言及されていない他の効果は以下の記載から、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者に明確に理解され得る。

図１ａは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれているペプチドが、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ発現に及ぼす影響をグループ別に比較した結果を示すグラフである。 図１ｂは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれているペプチドが処理されたＭＤＰＣ−２３細胞において、象牙芽細胞分化マーカーであるＤＳＰＰ遺伝子の発現レベルを比較した結果を示すグラフである。 図１ｃは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれている、グループ１１および１２のペプチドが処理されたＭＤＰＣ−２３細胞において、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ、Ｄｍｐ１、およびＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルを比較した結果を示すグラフである。 図１ｄは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれているペプチドの歯髄組織細胞に対する細胞毒性を評価した結果を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれているペプチドの安定性を確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により分子量を測定した結果である。図２において、Ａは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれているペプチドそのものの分子量を示し、Ｂは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物状態に含まれているペプチドの分子量を示す。 図３は、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の象牙細管透過度を示したもので、蛍光染色試薬（ローダミンＢ）を混合して象牙細管が露出された歯に１分間処理した後、蛍光顕微鏡で観察した結果を示すものである。 図４は、比較例３−１および比較例３−２と本発明の実施例とによる象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の象牙細管封鎖能を比較した結果を図示すものである。Ａ〜Ｄは、精製水のみで処理した象牙質の象牙細管を示すもの（比較例３−１）で、Ｅ〜Ｈは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の構成のうち、ペプチド未含有の歯磨き剤組成物を用いてブラッシングした象牙細管を示すもの（比較例３−２）で、Ｉ〜Ｌは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物を用いてブラッシングした象牙細管を示すものである（サイズバー：Ａ、Ｄ、Ｇ、１００μｍ；Ｂ、Ｅ、Ｈ、２０μｍ；Ｃ、Ｆ、Ｉ、１０μｍ）。それぞれの場合、象牙細管が露出された象牙質試験片に１日、１回、１分間ブラッシングしてから蒸留水により３回洗浄後、人工唾液に保管しており、この過程を２週間繰り返した後、象牙細管封鎖能を走査型電子顕微鏡で観察した。

本発明の目的および効果、そしてそれらを達成するための技術的構成は、添付の図面と共に詳細に後述する実施例を参照すると明確になることである。本発明を説明するに当たり、公知の機能または構成に関する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曖昧にすると判断される場合は、その詳細な説明を省略し得る。そして、後述する用語は、本発明における説明を考慮して定義された用語であり、これはユーザーなどの意図または慣例などによって異なり得る。

しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で実現され得る。ただ、本実施例は、本発明の開示が完全となるようにし、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に発明の範疇をきちんと知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇により定義されるのみである。したがって、その定義は、本明細書全般に亘る内容に基づいてなされるべきである。

明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」または「備える」と言うとき、これは特に反する記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含み得ることを意味する。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
本発明を説明するに当たり、象牙芽細胞（または象牙質芽細胞）（odontoblast）とは、象牙質の基質を構成するタンパク質、多糖体を細胞内で合成、分泌する細胞のことを意味し得る。また、象牙前質（未石灰化の象牙質）に接して、歯髄の周辺部に一層の細胞層を構成する円柱状の細胞として、歯乳頭の細胞の中でエナメル基に面しているもの（外胚葉系の中間葉に由来する細胞となる）が分化した細胞であり、また、象牙質の石灰化にも関与する細胞のことを意味し得る。

本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれるペプチド（以下、「象牙芽細胞分化促進ペプチド」と言う）は、細胞毒性を示さずとも、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ、Ｄｍｐ１およびＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルを増加させることができ、歯髄組織細胞と一緒に生体内に移植する場合、前記歯髄組織細胞が象牙質／歯髄組織−類似組織を形成する特徴を示し得る。

象牙芽細胞分化促進ペプチドには、象牙質の再生促進または象牙質知覚過敏症の治療効果を示し得る限り、これを構成するアミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が異なる配列とを有するペプチド変異体も含まれる。

一般に、分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびポリペプチドにおけるアミノ酸の交換は、当該分野に公知である。最も一般的に起きる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。また、アミノ酸配列上の変異または修飾によってペプチドの熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加したペプチド、または象牙質または歯髄組織の再生促進能が増加したペプチドを含み得る。

例えば、本発明で提供する配列番号１のペプチドの３番目に位置する酸性アミノ酸であるグルタミンは、塩基性アミノ酸であるリジンまたはアルギニンに置換されても、本発明で提供するペプチドの効果をそのまま示すことができ；配列番号１のペプチドの４番目または５番目に位置する塩基性アミノ酸であるアルギニンは、酸性アミノ酸であるグルタミンまたは塩基性アミノ酸であるリジンに置換されても、本発明で提供するペプチドの効果をそのまま示すことができ；配列番号１のペプチドの６番目、７番目または９番目に位置する塩基性アミノ酸であるリジンは、塩基性アミノ酸であるアルギニンまたは芳香族アミノ酸であるチロシンに置換されても、本発明で提供するペプチドの効果をそのまま示すことができ；配列番号１のペプチドの８番目に位置する酸性アミノ酸であるアスパラギンは、中性アミノ酸であるセリンに置換されても、本発明で提供するペプチドの効果をそのまま示すことができ；配列番号１のペプチドの１０番目に位置する芳香族アミノ酸であるチロシンは、塩基性アミノ酸であるリジンに置換されても、本発明で提供するペプチドの効果をそのまま示し得る。

このように、象牙芽細胞分化促進ペプチドを構成する酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸または芳香族アミノ酸はそれぞれ、異なる酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸または芳香族アミノ酸に置換されてもそのまま効果を示し得るので、象牙芽細胞分化促進ペプチドを構成するアミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が異なる配列を有するペプチド変異体も、象牙芽細胞分化促進ペプチドの範疇に含まれることは自明である。

また、象牙芽細胞分化促進ペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に任意のアミノ酸が付加された形態を有しても、本発明で提供するペプチドの効果をそのまま示し得るので、本発明で提供するペプチドの範疇に含まれる。一例として、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端に１個〜３００個のアミノ酸が付加された形態となり得、他の例として、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端に１個〜１００個のアミノ酸が付加された形態となり得、また別の例として、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端に１個〜２４個のアミノ酸が付加された形態となり得る。

象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理していないＭＤＰＣ−２３細胞（対照群）から測定された象牙芽細胞の分化マーカーであるＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて、象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理したＭＤＰＣ−２３細胞において、前記ＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルがすべて１．３倍以上の値を示すことを確認した（表１３〜２４）。

これまで報告されたものによると、ＤＳＰＰのｍＲＮＡ発現レベルが増加すると、象牙芽細胞分化および象牙質の再生が促進されると知られているので、前記ＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを増加させる効果を示す象牙芽細胞分化促進ペプチドは、象牙芽細胞分化および象牙質再生を促進する効果を示すことが分かる（Taduru Sreenath et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 27, Issue of July 4, pp.24874-24880, 2003; William T. Butler et al、Connective Tissue Research, 44(Suppl. 1):171-178, 2003）。

本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれるペプチドは、ペプチド単独の形態でも使用され得、前記ペプチドが２回以上繰り返し結合されたポリペプチドの形態でも使用され得、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端に象牙芽細胞分化または象牙質の再生効果を示す薬物が結合された複合体の形態でも使用され得る。

（実施例１）
［象牙芽細胞分化促進のためのペプチドの合成］
ペプチド（配列番号１）をＦｍｏｃ（9-fluorenylmethyloxycarbonyl）法により合成し、前記合成されたペプチドのアミノ酸を置換して、各グループのペプチドを合成した（表１〜表１２）。

Ｎ−ＫＹＱＲＲＫＫＮＫＹ−Ｃ（配列番号１）
まず、グループ１のペプチドは、配列番号１のペプチドまたは前記配列番号１のペプチドの５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換して合成した（表１）。

次に、グループ２のペプチドは、配列番号１のペプチドの５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、８番目のアミノ酸をセリンに置換して合成した（表２）。

次に、グループ３のペプチドは、配列番号１のペプチドの５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、９番目のアミノ酸をチロシンに置換して合成した（表３）。

次に、グループ４のペプチドは、配列番号１のペプチドの５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、８番目のアミノ酸をセリンに置換し、９番目のアミノ酸をチロシンに置換し、１０番目のアミノ酸をリジンに置換して合成した（表４）。

次に、グループ５のペプチドは、配列番号１のペプチドの３番目のアミノ酸をアルギニンに置換し、４番目のアミノ酸をグルタミンに置換し、５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換して合成した（表５）。

次に、グループ６のペプチドは、配列番号１のペプチドの３番目のアミノ酸をアルギニンに置換し、４番目のアミノ酸をグルタミンに置換し、５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、８番目のアミノ酸をセリンに置換して合成した（表６）。

次に、グループ７のペプチドは、配列番号１のペプチドの３番目のアミノ酸をアルギニンに置換し、４番目のアミノ酸をグルタミンに置換し、５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、９番目のアミノ酸をチロシンに置換し、１０番目のアミノ酸をリジンに置換して合成した（表７）。

次に、グループ８のペプチドは、配列番号１のペプチドの３番目のアミノ酸をアルギニンに置換し、４番目のアミノ酸をグルタミンに置換し、５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、８番目のアミノ酸をセリンに置換し、９番目のアミノ酸をチロシンに置換し、１０番目のアミノ酸をリジンに置換して合成した（表８）。

次に、グループ９のペプチドは、配列番号１のペプチドの３番目のアミノ酸をリジン酸に置換し、４番目のアミノ酸をグルタミンに置換し、５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換して合成した（表９）。

次に、グループ１０のペプチドは、配列番号１のペプチドの３番目のアミノ酸をリジンに置換し、４番目のアミノ酸をグルタミンに置換し、５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、８番目のアミノ酸をセリンに置換して合成した（表１０）。

次に、グループ１１のペプチドは、配列番号１のペプチドの３番目のアミノ酸をリジンに置換し、４番目のアミノ酸をグルタミンに置換し、５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、９番目のアミノ酸をチロシンに置換し、１０番目のアミノ酸をリジンに置換して合成した（表１１）。

最後に、グループ１２のペプチドは、配列番号１のペプチドの３番目のアミノ酸をリジンに置換し、４番目のアミノ酸をグルタミンに置換し、５番目〜７番目のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、８番目のアミノ酸をセリンに置換し、９番目のアミノ酸をチロシンに置換し、１０番目のアミノ酸をリジンに置換して合成した（表１２）。

（実施例２）
［象牙芽細胞を利用した象牙質の再生促進効果検証］
＜実施例２−１：ＤＳＰＰ（dentin sialophosphoprotein）プロモーター活性に及ぼすペプチドの影響検証＞
まず、マウス由来象牙芽細胞であるＭＤＰＣ−２３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地において、５％のＣＯ_２および３７℃の条件で培養した。

次に、前記培養したＭＤＰＣ−２３細胞を、２４ウェルプレートに各ウェル当り５×１０^４の細胞数で分注して２４時間培養した後、リポフェクタミンＰｌｕｓ試薬を用いて、前記培養した細胞に、ｐＧＬ３ベクターにＤＳＰＰプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子が導入された組み換えベクターを導入して形質転換させた。前記形質転換されたＭＤＰＣ−２３細胞に、前記実施例１で合成されたグループ１〜１２のペプチドをそれぞれ処理して４８時間培養した後、前記各々の形質転換されたＭＤＰＣ−２３細胞からルシフェラーゼ活性を測定し、各グループ別に算出された平均レベルを比較した（図１ａ）。この際、対照群としては、象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理していない形質転換済みＭＤＰＣ−２３細胞を使用した。

図１ａは、本発明で提供する各ペプチドが、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ発現に及ぼす影響をグループ別に比較した結果を示すグラフである。図１ａに示すように、本発明で提供する各ペプチドは、全体として対照群から測定されたルシフェラーゼ（luciferase）活性レベルの約１．３倍以上の値を示したが、グループごとに差を示しており、グループ１２のペプチドが最も高いレベルのルシフェラーゼ活性を示し、次に高いレベルのルシフェラーゼ活性を示すペプチドはグループ１１のペプチドであることを確認した。

従って、本発明で提供するペプチドは、ＤＳＰＰプロモーターを活性化させる効果を示すことが分かった。

＜実施例２−２：象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ遺伝子の発現レベルに及ぼすペプチドの影響検証＞
前記実施例２−１で培養したＭＤＰＣ−２３細胞に、前記実施例１で合成された各グループのペプチドを処理して４８時間培養した後、前記ＭＤＰＣ−２３細胞にて発現される象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定し、前記測定された各ＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを、対照群から測定されたＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する相対的比率で換算した（表１３〜２４）。また、各グループのペプチドにより測定されたＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルの平均値を各グループ別に比較した（図１ｂ）。この際、対照群としては、象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理していないＭＤＰＣ−２３細胞を使用した。

前記ＤＳＰＰ遺伝子の発現レベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction、ＲＴ−ＰＣＲ）およびリアルタイムＰＣＲ分析により測定した。具体的に、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて前記ＭＤＰＣ−２３細胞から全（total）ＲＮＡを分離した。２μｇの全ＲＮＡと逆転写酵素１ｕｌと０．５μｇのオリゴ（oligo；ｄＴ）とを用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に利用した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、下記各プライマーとSYBR GREEN PCR Master Mix（タカラ社、日本）を用いて、ABI PRISM 7500シーケンス検出システム（sequence detection system）（Applied Biosystems）にて行われた。リアルタイムＰＣＲは、９４℃、１分；９５℃、１５秒；６０℃、３４秒を４０サイクル（cycles）繰り返す条件で行った。結果の分析は、比較Ｃｔ（comparative cycle threshold）法を用いて評価した。この際、内部対照群としてＧａｐｄｈ遺伝子を使用し、測定値は３回繰り返し実験を行った後、その平均値および標準偏差値を使用した。

Ｄｓｐｐ_Ｆ：5’-ATTCCGGTTCCCCAGTTAGTA-3’（配列番号９７）
Ｄｓｐｐ_Ｒ：5’-CTGTTGCTAGTGGTGCTGTT-3’（配列番号９８）
Ｇａｐｄｈ_Ｆ：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’（配列番号９９）
Ｇａｐｄｈ_Ｒ：5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’（配列番号１００）

前記表１３〜２４に示すように、象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理していないＭＤＰＣ−２３細胞（対照群）から測定された象牙芽細胞分化マーカーであるＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて、象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理する場合、前記ＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルがすべて１．３倍以上の値を示すことを確認した。特に、グループ１１のペプチドはいずれもＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて３倍以上の値を示し、グループ１２のペプチドはいずれもＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて３．８倍以上の値を示すことを確認した。

さらに、図１ｂは、象牙芽細胞分化促進ペプチドが処理されたＭＤＰＣ−２３細胞において、象牙芽細胞分化マーカーであるＤＳＰＰ遺伝子の発現レベルを比較した結果を示すグラフである。図１ｂに示すように、象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理する場合、象牙芽細胞分化マーカーであるＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルが増加し、図１ａのものと同様に、対照群から測定されたＤＳＰＰ遺伝子ｍＲＮＡレベルの約１．３倍以上の値を示すことを確認した。

＜実施例２−３：象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ、Ｄｍｐ１およびＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルに及ぼすペプチドの影響検証＞
前記実施例２−２の結果から、象牙芽細胞分化促進ペプチドは、ＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを増加させることができ、特に、グループ１１および１２のペプチドは、ＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを少なくとも３倍以上増加させ得ることを確認した。

これにより、前記グループ１１および１２のペプチドが、他の象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｍｐ１およびＮｅｓｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡレベルも増加させ得るかを確認した。

概ね、下記の各プライマーを使用して、ペプチドとしてグループ１１および１２のペプチドを使用することを除いては、前記実施例２−２と同様の方法を行い、Ｄｍｐ１およびＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルに及ぼす象牙芽細胞分化促進ペプチドの効果を測定し、各グループ別に算出された平均レベルを比較した（図１ｃ）。この際、対照群としては、象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理していないＭＤＰＣ−２３細胞を使用し、比較群としてＤＳＰＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを使用した。

Ｄｍｐ１_Ｆ：5’-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3’（配列番号１０１）
Ｄｍｐ１_Ｒ：5’-TGTGGTCACTATTTGCCTGTG-3’（配列番号１０２）
Ｎｅｓｔｉｎ_Ｆ：5’-CCCTGAAGTCGAGGAGCTG-3’（配列番号１０３）
Ｎｅｓｔｉｎ_Ｒ：5’-CTGCTGCACCTCTAAGCGA-3’（配列番号１０４）

図１ｃは、グループ１１および１２のペプチドが処理されたＭＤＰＣ−２３細胞において、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ、Ｄｍｐ１およびＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルを比較した結果を示すグラフである。図１ｃに示すように、象牙芽細胞分化促進ペプチドを処理すると、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰ、Ｄｍｐ１およびＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルがすべて増加したが、遺伝子ごとに増加レベルの差を示し、グループ１１のペプチドよりもグループ１２のペプチドがさらに高いレベルで増加させることを確認した。

前記各分化マーカー遺伝子は、象牙芽細胞分化と象牙質の石灰化過程に関与する遺伝子として知られているので、本発明で提供するペプチドは、象牙質の再生を促進する効果を示すものと分析された。

＜実施例２−４：歯髄組織細胞に対する象牙質または歯髄組織の再生促進および象牙質知覚過敏症治療用ペプチドの細胞毒性評価＞
まず、ヒト歯髄幹細胞は、ソウル大学歯科病院にて成人１０人（１８〜２２歳）の親知らずから歯髄組織細胞を分離した。具体的に、すべての実験は、臨床研究審査委員会（hospital’s Institutional Review Board）から承認を受けた後、患者の同意を得て実験を行い、Jung HS et al(J Mol Histol.(2011))の方法に基づいて親知らずを切断し、歯髄を露出させて鉗子で歯髄組織を分離した。前記分離された歯髄組織を両面刀で細かく細切して６０ｍｍシャーレに入れ、カバースリップで覆った後、ＤＭＥＭ培地で培養して、培養された歯髄組織細胞を得た。

次いで、前記得られた歯髄組織細胞を９６ウェルプレートに、各ウェル当り約３×１０^３細胞数になるよう分注して２４時間培養した後、グループ１１または１２のペプチドを１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ濃度で処理して、さらに１日、３日または５日間培養した。前記培養が終了した後、培養された細胞をＰＢＳで洗浄し、２０μｌのＭＴＴ溶液を加えて、その後約３７℃にて４時間反応させた。反応終了後、ＭＴＴ溶液を除去し、１００μｌのＤＭＳＯを加えて、５４０ｎｍ波長にて吸光度を測定した（図１ｄ）。この際、対照群としては、前記ペプチドを処理せずに培養した歯髄組織細胞を使用した。

図１ｄは、歯髄組織細胞に対する象牙芽細胞分化促進ペプチドの細胞毒性を評価した結果を示すグラフである。図１ｄに示すように、象牙芽細胞分化促進ペプチドを加えても、歯髄組織細胞の生存率は対照群と同じレベルを示すことを確認した。

（実施例３）
［象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の調製］
−段階１：精製水とＤ−ソルビトール液を混合する。

−段階２：リン酸三カルシウム、アミノカプロン酸、アラントイン、含水ケイ酸、ＰＣＡ−Ｎａ液、ヒドロキシアパタイト、ペプチド（配列番号９６）、酵素処理ステビア、キシリトールを添加して撹拌機で約４０分間撹拌する（撹拌条件：ＰＡＤＤＬＥ １０ｒｐｍ〜３０ｒｐｍ、ＤＩＳＰＥＲＳＥ ５００ｒｐｍ〜６００ｒｐｍ、ＨＯＭＯ ２４００ｒｐｍ〜３２００ｒｐｍ）。

−段階３：（濃）グリセリン、キサンタンガムを添加して約４０分間撹拌する（撹拌条件：ＰＡＤＤＬＥ １０ｒｐｍ〜３０ｒｐｍ、ＤＩＳＰＥＲＳＥ ５００ｒｐｍ、ＨＯＭＯ ２４００ｒｐｍ〜３２００ｒｐｍ）。

−段階４：（濃）グリセリン、カルボキシメチルセルロースナトリウム（Carboxymethyl Cellulose Sodium Salt、ＣＭＣ）を添加して約４０分間撹拌する（撹拌条件：ＰＡＤＤＬＥ １０ｒｐｍ〜３０ｒｐｍ、ＤＩＳＰＥＲＳＥ ５００ｒｐｍ〜６００ｒｐｍ、ＨＯＭＯ ２４００ｒｐｍ〜３２００ｒｐｍ）。

−段階５：ココイルメチルタウリン酸ナトリウムを添加して約２０分間撹拌する（撹拌条件：ＰＡＤＤＬＥ １０ｒｐｍ〜３０ｒｐｍ、ＤＩＳＰＥＲＳＥ ４５０ｒｐｍ〜６５０ｒｐｍ）。

−段階６：緑茶エキス、カモミール抽出物、ローズマリーエキス、ミルラチンキ、ラタニアチンキ、カモミールチンキ、マスチックオイル４０、プロポリス抽出液、グレープフルーツ種子抽出物、スピアミント、ペパーミントオイルを添加して、約１５分間撹拌する（撹拌条件：ＰＡＤＤＬＥ １０ｒｐｍ〜３０ｒｐｍ、ＤＩＳＰＥＲＳＥ ４５０ｒｐｍ〜６５０ｒｐｍ）。
各段階は、減圧条件（‐７６０ｍｍＨｇ）下で撹拌を実施した。

本発明の実施例３による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の組成を下記表２５にまとめる。

［比較例に用いるための組成物の準備］
＜比較例３−１＞
実施例３と同じ体積の精製水を準備した。

＜比較例３−２＞
実施例３の成分のうち精製水以外に、象牙芽細胞分化促進ペプチド（配列番号９６）が含まれないようにしたこと以外の成分は、すべて同様に含有されるように準備した。

＜実験例１：実施例３による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析＞
イ．実施例３により提供された歯磨き剤組成物の試料約０．５ｇを蒸留水約１ｍｌに溶かして歯磨き剤組成物溶液を製造する。

ロ．イ．の溶液を約１５０００ｒｐｍで約１０分間遠心分離を行い、上澄み液を取る。

ハ．ロ．において得られた上澄み液２μｌを気質溶液(１０ｍｇ／ｍＬのα-シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、０．１％のＴＦＡ／ＡＣＮ（１：１，ｖ／ｖ）)２μｌと混合して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を行う（UltraflexIII TOF/TOF(Bruker Daltonics)）（図２、Ｂ）。

＜実験例２：実施例３による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の象牙細管透過度観察＞
イ．象牙細管が露出するように歯を切断
抜歯した人の歯の歯冠部をダイヤモンドソーにより横に切断して象牙細管を露出した後、リン酸塩緩衝溶液により約５分間２回洗浄。

ロ．切断された歯を洗浄
先に切断した歯を、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid、ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）溶液に約５分間反応させた後、リン酸塩緩衝溶液により約５分間２回洗浄。

ハ．実施例３による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に蛍光染色試薬添加
象牙芽細胞分化促進ペプチド（配列番号９６）が含有された象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に、蛍光染色試薬が０．１％含まれるように添加してよく混合した後、象牙細管が露出された切断歯を約１分間ブラッシングする。

ニ．象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の浸透度の観察
反応させた切断歯を蒸留水により３回洗浄した後、ダイヤモンドソーにより切断歯の象牙細管が長く見えるよう縦に約０．５ｍｍ厚さで切った後、蛍光顕微鏡で浸透程度を観察（図３を参照）。

＜実験例３：実施例３による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の象牙細管封鎖能の観察＞
イ．人工唾液の調製
人工唾液の組成は下記表２６の通りである。
※精製水に下記表２の各成分の最終濃度になるように添加して混合しており、リン酸カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）は最後に添加した。
※人工唾液のｐＨは人の唾液に近い７．２付近で測定される。

ロ．象牙細管試験片の作製
抜歯した人の歯をダイヤモンドソーにより横に切断して、１ｍｍ厚さの象牙細管が露出された象牙質試験片を作製した。
※象牙質試験片は、象牙細管を完全に露出させるために、約３２％リン酸（phosphoric acid）溶液に約５分間反応させた後、精製水により約５分間３回洗浄した。その後、象牙質試験片は、超音波洗浄機で約５分間６回洗浄して、象牙細管を完全に露出されるようにした。
その後、リン酸塩緩衝溶液により３回洗浄して保管する。

ハ．象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の象牙細管封鎖能観察
実施例３による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物を用いて、象牙細管試験片に約１分間ブラッシングして蒸留水により３回洗浄した後、人工唾液に約２４時間反応させる。

この過程を２週間繰り返した後、蒸留水により３回洗浄した後、乾燥して、走査型電子顕微鏡（Ｓ−４７００、HITACHI社、Tokyo、Japan)で象牙細管封鎖程度を観察する（図４、Ｉ〜Ｌ）。

＜比較実験例３−１＞
比較例３−１で用意された精製水を用いて象牙細管試験片に約１分間ブラッシングして蒸留水により３回洗浄した後、人工唾液に約２４時間反応させる。

この過程を２週間繰り返した後、蒸留水により３回洗浄した後、乾燥して、走査型電子顕微鏡で象牙細管封鎖程度を観察する（図４、Ａ〜Ｄ）。

＜比較実験例３−２＞
比較例３−２で用意された歯磨き剤組成物を用いて象牙細管試験片に約１分間ブラッシングして蒸留水により３回洗浄した後、人工唾液に約２４時間反応させる。

この過程を２週間繰り返した後、蒸留水により３回洗浄した後、乾燥して、走査型電子顕微鏡で象牙細管封鎖程度を観察する（図４、Ｅ〜Ｈ）。

前記実験例１により、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれているペプチドの安定性を確認し得る。図２は、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれているペプチドの安定性を確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により分子量を測定した結果である。図２において、Ａは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に含まれているペプチドそのものの分子量を示し、Ｂは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物状態に含まれているペプチドの分子量を示す。

図２を参照すると、実施例３による歯磨き剤組成物に含まれているペプチドそのものに対する分子量の測定値と同じピーク（分子量約１３８４Ｄａ）を持つことが観察され、これにより、象牙質分化促進ペプチドが歯磨き剤組成物内に安定して混合されていることが分かる（図３、Ａ参照）。

前記実験例２によると、実施例３による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の象牙細管透過度を蛍光顕微鏡で観察した結果、図３に示すように、象牙芽細胞分化促進ペプチドが含有された歯磨き剤組成物が処理された歯の場合、象牙質表面にて蛍光が強く観察された。さらに、露出した象牙細管の下方に沿って蛍光染色試薬の浸透が観察された。

次に、前記実験例３と比較実験例３−１および３−２とを比較した結果は、図４に示す通りである。図４は、比較例３−１および比較例３−２と本発明の実施例とによる象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の象牙細管封鎖能を比較した結果を示すものであり、より詳細には、Ａ〜Ｄは精製水のみで処理した象牙質の象牙細管を示すもの（比較例３−１）であり、Ｅ〜Ｈは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物の構成のうち、ペプチド未含有の歯磨き剤組成物と反応した象牙細管を示すもの（比較例３−２）であり、Ｉ〜Ｌは、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物と反応した象牙細管を示すものである（サイズバー：Ａ、Ｄ、Ｇ、１００μｍ；Ｂ、Ｅ、Ｈ、２０μｍ；Ｃ、Ｆ、Ｉ、１０μｍ）。

図４から分かるように、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物に反応させた象牙質の象牙細管に再石灰化が起こり、象牙細管が封鎖されていることが観察できた。

前術のように、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物は、象牙質に薄い膜を形成するとともに、リン酸三カルシウムから遊離されたリン酸−カルシウムイオンと強く結合して、露出された象牙細管および象牙質表面に再石灰化を誘導して、象牙細管を効果的に封鎖することとなる。すなわち、本発明の実施例による象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物は、露出した象牙細管の表面のみならず、象牙細管の内部で再石灰化を誘導して、知覚過敏症状を緩和および／または防止できる効果を示し得る。

本明細書と図面には、本発明の好適な実施例について開示しており、たとえ特定の用語が使用されているものの、これは単に本発明の技術内容を分かりやすく説明して発明の理解を助けるための一般的な意味で使用されたものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。ここに開示されている実施例の他にも、本発明の技術的思想に基づいた他の変形例が実施可能であると言うことは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に自明である。

「本研究は、韓国における２０１７年度中小ベンチャー企業部の技術開発事業支援による研究である［Ｓ２４６２６９６］。」

Claims (8)

1. 下記一般式１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物において、
   ＫＹ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８（一般式１）
   前記一般式１において、
   Ｒ１は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）であり、
   Ｒ２は、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）であり、
   Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）であり、
   Ｒ６は、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）であり、
   Ｒ７およびＲ８は、リジン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）であり、
   前記歯磨き剤組成物１００重量部に対して、前記ペプチド０．００１５重量部〜０．００２５重量部、リン酸三カルシウム３１．００重量部〜３３．００重量部、ヒドロキシアパタイト０．０４５重量部〜０．０５５重量部および精製水２０重量部〜２２重量部を含み、
   前記歯磨き剤組成物は、象牙質表面に薄い膜を形成し、前記リン酸三カルシウムから遊離されたリン酸−カルシウムイオンと結合して、象牙細管および象牙質表面に再石灰化を誘導することを特徴とする、象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物。
2. 前記ペプチドは、配列番号１〜９６のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物。
3. 前記組成物１００重量部に対して、湿潤剤３３重量部〜３７重量部、粘度調整剤４．４重量部〜５．４重量部、界面活性剤１．１重量部〜１．３重量部、および着香剤０．８重量部〜０．９重量部をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物。
4. 前記組成物１００重量部に対してアミノカプロン酸０．１５重量部〜０．２５重量部、アラントイン１．９重量部〜２．１重量部を含むことを特徴とする、請求項１に記載の象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物。
5. 前記湿潤剤は、Ｄ−ソルビトール液、ピロリドンカルボン酸ナトリウム（sodium PCA Solution、ＰＣＡ−Ｎａ）液、濃グリセリン、またはこれらの混合物であり、
   前記粘度調整剤は、含水ケイ酸、キサンタンガム、ＣＭＣ、またはこれらの混合物であり、
   前記界面活性剤は、ココイルメチルタウリン酸ナトリウムであり、
   前記着香剤は、緑茶エキス、カモミール抽出物、ローズマリーエキス、ミルラチンキ、ラタニアチンキ、カモミールチンキ、マスチックオイル４０ ＨＦ−６０６６２、プロポリス抽出液、グレープフルーツ種子抽出物、スピアミントＢ７１２２８、ペパーミントオイル８１６８９、またはこれらの混合物であることを特徴とする、請求項３に記載の象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物。
6. 前記湿潤剤は、前記Ｄ−ソルビトール液８０重量％〜８３重量％、前記ＰＣＡ−Ｎａ液７重量％〜８重量％、前記濃グリセリン１０重量％〜１２重量％を含むことを特徴とする、請求項５に記載の象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物。
7. 前記粘度調整剤は、前記含水ケイ酸７９重量％〜８５重量％、前記キサンタンガム４重量％〜８重量％、前記ＣＭＣ１１重量％〜１３重量％を含むことを特徴とする、請求項５に記載の象牙質知覚過敏症緩和のための歯磨き剤組成物。
8. 請求項１に記載の歯磨き剤組成物を、これを必要とする個体の口腔に処理する段階を含む、象牙質知覚過敏症緩和方法。
   
   

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