JP2021505196A - 自己免疫阻害剤及びその適用 - Google Patents
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Abstract
Description
喘息は、慢性の気道炎症疾患である。喘息を有する患者は、気道過敏症及び様々な程度の可逆性の気道閉塞を有し、長期間の再発性発作は、気道のリモデリング(コラーゲン線維び平滑筋を伴う)を引き起こし、それによって気道の肥厚化及び狭窄をもたらし、閉塞性肺気腫を引き起こす。重度喘息を有する患者の約50%が、Th2細胞媒介性II型炎症応答を有する。健常な人と比較すると、喘息患者は、血清又は気管支生検の両方において上昇したIL-4及びIL-13レベルを有する。アレルゲンによる刺激後、IL-4及びIL-13レベルはいずれも、喘息を有する患者の気管支肺胞洗浄液において増加することが見出されている。アレルギー性喘息を有する患者におけるIL-4の吸入は、気道過敏症及び喀痰中の好酸球性顆粒球の増加等の喘息の特徴的な症状を誘導しうる。研究者らは、アレルギー性喘息の発症が、Th1/Th2型細胞の比率の不均衡に密接に関連し、このように過剰なサイトカインIL-4を産生することを示している。IL-4は、Th1のTh2細胞への分化を決定し、B細胞によるIgEの合成を促進する唯一のサイトカインであるが、IL-13は、呼吸器過敏症、気道のリモデリング、及び過剰な粘液分泌を誘発する主要なパートナーである(Annu Rev Immunol, Wynnら 2003)。
1. 真核細胞におけるIL-4Rα細胞外領域のタンパク質の組換え発現
ヒトIL-4Rα細胞外領域(Uniprot P24394、26-232)を含有するプラスミド遺伝子AgH01-pUC57-Amp(SynbioTech社)を合成する。このプラスミドを鋳型として使用して、5'-ctgagaggtgccagatgtatgaaggtgctgcag-3'を上流のプライマーとして、及び5'-tccgcctccgccgctagcgtgctgctcgaaggg-3'を下流のプライマーとして、ヒトIL-4Rα細胞外断片をPCRによって増幅する。増幅された産物を、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB社、カタログ番号M0530L)を使用してライゲートし、施設内で構築した真核細胞発現プラスミド系(c末端の6×ヒスチジンタグを有する融合タンパク質)にクローニングする。同様に、カニクイザルIL-4Rα細胞外領域(Uniprot Q6JHZ9、24-231)をコードするDNA配列を、鋳型として合成プラスミドAgC01-pUC57-Ampを使用して真核細胞発現プラスミド系にクローニングする。ヒトIL-4(Uniprot P05112、25-153)をコードする遺伝子を、鋳型として合成プラスミドAg1104-PUC57-Ampを使用して真核細胞発現プラスミド系にクローニングする。ヒトIL13Rα1(Uniprot P78552、27-343)をコードする遺伝子を、購入したIL13Rα1 cDNAクローニングプラスミド(Sino Biological社、カタログ番号HG10943-M)を鋳型として使用して真核細胞発現プラスミド系にクローニングする。HEK293-6E細胞にこれらのプラスミドを7日間トランスフェクトした後、培養上清を収集し、ニッケル-キレートカラムによって精製し、ヒトIL-4Rα細胞外領域(hIL-4Rα)、カニクイザルIL-4Rα細胞外領域(cynoIL-4Rα)、ヒトIL-13Rα1細胞外領域(hIL-13Rα1)、及びヒトIL-4(hIL-4)の組換えタンパク質を得る。
完全長のhIL-4Rα配列を含有する発現プラスミドを、Opti-MEM培地中でPEIと1:3の比率で混合し、室温で20分間静置する。細胞を6ウェルプレートに接種した翌日に取り出し、細胞のコンフルエンスが顕微鏡下で約80%であることを観察する。DMEM培地(Gibco社)を吸引し、予め加温したOpti-MEM培地(Gibco社)4.5mlを添加する。次に、プラスミド-PEI混合物を細胞に滴下して加え、軽く振とうし、37℃の二酸化炭素インキュベータで培養した;24時間後、真核細胞スクリーニング物質であるピューロマイシン(Gibco社)を、1μg/mlの濃度でスクリーニング培養物に添加する。スクリーニング培地中で成長させた細胞を顕微鏡下で観察し、限界希釈を介したスクリーニングによってサブクローンを得る。単クローン性細胞がウェルにおいてコンフルエントになった後、FACS分析を実施する。
3.1 動物の免疫
hIL-4Rα組換えタンパク質を抗原として、等量の免疫学的アジュバント(Freund社のアジュバント)と混合し、6週齢の雌性Balb/cマウス5匹を、腹部領域での皮下注射によって免疫する。初回免疫後、追加免疫を2週間毎に実施する。4回免疫後、血液を尾から採取し、マウス5匹の血清の力価及びリガンドhIL-4に対する結合の阻害をそれぞれ、ELISAによって検出する。
尾静脈負荷の3日後、上記の免疫マウス#3及び#4を断頭により屠殺し、マウスの脾臓及び末梢リンパ節を収集し、これをPBS緩衝液中で粉砕後、B細胞に富む浮遊液を取り、B細胞を遠心分離によって収集する。総RNAを、Trizol RNA抽出キットを使用してB細胞から抽出し、抗体重鎖cDNAライブラリを、逆転写キットSuperScript(商標)First-Strand Synthesis System、カタログ番号18080051)によって、重鎖特異的プライマーを使用して逆転写によって得る。cDNAを鋳型として使用して、抗体重鎖可変領域断片を、一組の重鎖可変領域プライマーを使用してPCRによって増幅し;NcoI及びNheIによる二重の消化後、増幅した抗体重鎖可変領域断片を、施設内で構築したファージミドpDS-mHCにクローニングする。同様に、軽鎖cDNAライブラリを、軽鎖特異的プライマーを使用して逆転写により得る。cDNAを鋳型として使用して、抗体軽鎖可変領域断片を、一組の軽鎖可変領域プライマーを使用してPCRによって増幅し;NcoI及びBsiw3.Iによる二重の消化後、抗体軽鎖可変領域断片を、施設内で構築したファージミドpDS-LCにクローニングする。次に、ライブラリ容量6×109個の繊維状ファージM13に基づくマウスFabファージディスプレイライブラリを構築する。
3.3. hIL-4Rαに結合する抗体のELISAスクリーニング
IL-4Rαに対して特異性を有するFab抗体を、一連の組換えヒトIL-4Rαタンパク質の通例のバイオパニングを使用してファージディスプレイライブラリから単離する。簡単に説明すると、1mg/ml IL-4Rα組換えタンパク質25μlを取り、PBS(ZSGB-BIO社、商品番号ZLI-9063)コーティング溶液5mlに添加し、上下させて混合し、5μg/ml抗原コーティング溶液を得る。0.05 Mカーボネートコーティング緩衝液(pH 9.5)中で製剤化したIL-4Rαを、イムノチューブ(Immunotube Maxisorp、Nunc社)に4℃で一晩コーティングする。イムノチューブをPBSで洗浄した後、5%BSAによって2時間ブロッキングする。BSAによって最終濃度1%となるように調製した精製Fabファージをイムノチューブに添加し、コーティングした抗原に1時間結合させる。複数回ラウンドの洗浄をPBS-Tween(0.5%体積/体積)によって実施し、非結合ファージを除去し、結合したファージ粒子を100mMトリエチルアミンによって溶出し;1M Tris-HCl(pH 7.4)によって中和後、溶出したファージ粒子を大腸菌(E. coli)TG1細菌に感染させ、次のラウンドの濃縮スクリーニングのために救出する。2ラウンドのバイオパニング後、単コロニーをIPTG誘導発現のために96ウェルU型プレートに採取し、上清をELISAスクリーニングのために取る。
hIL-4Rα抗原に結合した576個の陽性単コロニーを、IPTGによって再度誘導し、上清をELISAによるスクリーニングのために取る。7個の96ウェルELISAプレートプレート(Thermo Maxisorp)を取り、PBS(ZSGB-BIO社、商品番号ZLI-9063)100μlを各ウェルに添加し、室温で10分間インキュベートする。1mg/ml IL-4Rα組換えタンパク質35μlを取り、0.05Mカーボネートコーティング緩衝液(pH 9.5)35mlに添加し、上下させて混合し、1μg/ml抗原コーティング溶液を得る。プレートのウェル中のPBS溶液を捨て、抗原コーティング溶液100μlを各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートする。コーティングしたプレートのウェルからコーティング溶液を捨て、次にプレートをPBS-Tで3回洗浄し、2%ミルク/PBSの追加の200μlを各ウェルに添加した後、室温で2時間ブロッキングし、ブロッキング溶液を捨て、ウェルをPBSで3回洗浄する。抗体50μlを各ウェルからピペットで採取して、上清を誘導し、ELISAプレートに50μl/ウェルで添加し、室温で30分間インキュベートする。ブロッキングした5ml EPチューブを取り、ブロッキング溶液を捨て、0.5%BSA 3mlを添加し、ビオチン標識IL-4 1.1μlを、最終濃度625ng/mlとなるように更に添加する;その50μlを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。各ウェルを、PBS-T及びPBSでそれぞれ、3回洗浄し、遠心脱水する。二次抗体SA-HRP(BD bioscience社、カタログ番号6222697)を、0.5%BSAによって1:8000の比率で希釈し、その100μlを各ウェルに添加し、室温で30分間インキュベートする。ウェルを、PBS-T及びPBSでそれぞれ、3回洗浄し、遠心脱水する。TMB基質溶液100μlを各ウェルに添加し、反応を37℃の暗所で行い、基質が中等度に着色すると、H2SO4 50μlを各ウェルに添加して、反応を終了させ、OD 450nmを、酵素結合検出器(BioTek社、Synergy HT)を使用して15分以内に測定し、データを収集して結果をGraph Pad Prism 5ソフトウェアを使用して計算する。3.2 ELISAで得られた陽性コロニーのうち、120個の単コロニーがhIL-4Rαに対するヒトIL-4の結合を阻害する。
ヒトhIL-4Rαに対するヒトIL-4の結合を阻害する上記で検出された120個の陽性単コロニーの上清を、FACS分析のために取る。HEK293細胞及び安定にトランスフェクトされたHEK293-hIL-4Rα細胞株を、細胞5*104個/ウェルで調製し、細胞染色のためのCell Tracker Green CMFDA(Invitrogen社、カタログ番号C2925)の量は、細胞1*106個あたりCell tracker green溶液100μlであり、インキュベーションを37℃のインキュベータにおいて30分間実施する;0.5%BSA/PBS 5mlを添加し、これを1000rpmで3分間遠心分離し、3回洗浄する。細胞各1*106個は、3%BSA/PBS溶液100μlに対応し、溶液を4℃で20分間ブロッキングする;調製した細胞を96ウェルU型プレートに100μl/ウェルの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨て、一次抗体溶液を添加し、氷中で1時間インキュベートする。精製Fab抗体を開始濃度500nM(12.5μg/ml)から一連の5つの濃度に作製し、1:5に従って連続希釈する。一次抗体溶液と共にインキュベーション後、追加の0.5%BSA/PBSを150μlの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;0.5%BSA/PBS 150μlを更に添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;二次抗体である抗ヒトIgG、Fab'2-AF647(Jackson社)を添加する前に、これを1%BSA/PBSによって1:300に希釈し、希釈した二次抗体溶液40μlを各ウェルに添加し、氷中で45分間インキュベートする。二次抗体溶液と共にインキュベーション後、追加の0.5%BSA/PBSを150μlの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;0.5%BSA/PBS 150μlを更に添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;PBS 20〜100μlを添加して、細胞を1*106個/mlに再浮遊させ、得られた浮遊液をフローサイトメーター(I-Que screener)にロードする。正しいプロセスに従って機器及びオペレーティングシステムを開き、正しいパラメータを設定後、細胞を試験プレートにロードし、蛍光シグナルを検出する;分析を、Graph Pad Prism 5ソフトウェアを使用して実施し、結果は図3Cに示す通りであり、プレELISAによってスクリーニングした抗体が、IL-4Rαを発現する安定にトランスフェクトしたHEK293細胞に特異的に結合することを示している。
hIL-4Rαに対して強い結合を有する、FACSで分析した最初の100個の陽性単コロニーの上清を、細胞表面上に発現された受容体の阻害実験のために取る。HEK293細胞及び安定にトランスフェクトしたHEK293-hIL-4Rα細胞を、細胞3*104個/ウェルで調製し、細胞染色のためのCell Tracker(商標)Green CMFDA(Invitrogen社、カタログ番号C2925)の量は、細胞1*106個あたりCell tracker green溶液100μlであり、インキュベーションを37℃のインキュベータにおいて30分間実施する;次に、0.5%BSA/PBSの追加の5mlを添加し、これを1000rpmで3分間遠心分離し、3回洗浄する。細胞各1*106個は、3%BSA/PBS溶液100μlに対応し、溶液を4℃で20分間ブロッキングする。調製した細胞を96ウェルU型プレートに100μl/ウェルの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;一次抗体溶液を添加し、氷中で1時間インキュベートする。精製Fab抗体を開始濃度100nMから一連の5つの濃度に作製し、1:5に従って連続希釈する。一次抗体溶液と共にインキュベーション後、追加の0.5%BSA/PBSを150μlの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;0.5%BSA/PBS 150μlを更に添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;ビオチン標識ヒトIL-4-mIgG2a Fcを最終濃度0.15μg/mlとなるように添加し、氷中で45分間インキュベートする。二次抗体SA-PEを1%BSA/PBSによって1:300に希釈する;二次抗体溶液40μlを、各ウェルに添加し、氷中で45分間インキュベートする。二次抗体溶液と共にインキュベーション後、追加の0.5%BSA/PBSを150μlの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;0.5%BSA/PBS 150μlを更に添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;PBS 20〜100μlを添加して細胞を1*106個/mlに再浮遊させ、得られた浮遊液をフローサイトメーター(I-Que screener)にロードする。正しいプロセスに従って機器及びオペレーティングシステムを開き、正しいパラメータを設定後、細胞を試験プレートにロードし、蛍光シグナルを検出する;分析を、Graph Pad Prism 5ソフトウェアを使用して実施する。結果は図3Dに示す通りであり、プレELISAによってスクリーニングした陽性単コロニー中15個の抗体が、ヒトIL-4に対する、IL-4Rαを発現する安定にトランスフェクトしたHEK293細胞の結合を阻害できることを示している。
4.1 複合体hIL-13Rα/hIL-13に対するhIL-4Rαの結合の検出
hIL-13Rα(濃度400ng/ml)1ml、及びhIL-13(Sino Biological社、商品番号10369-HNAC、濃度400ng/ml)1mlを取り、1:1の比率で混合して200ng/mlの希釈標準濃度を得て、これを室温で2時間静置し、インキュベートし、結合させる。hIL-13Rα/hIL-13複合体は、初回濃度200ng/mlを有し、これを1:1に従って連続希釈する;一連の3つの濃度:200ng/ml、100ng/ml、及び50ng/mlを96ウェルプレートにおいて100μl/ウェルで設定し、ブランク対照群を設定する。最初に、ビオチン標識hIL-4RαをSAプローブ(10ng/mlの希釈標準濃度で)に固定化して結合させ、その100μlを各ウェルに添加し、hIL-13Rα/hIL-13に対する結合をFortebioによって検出する;実験方法を実行するよう編集し、実験結果をFortebioソフトウェアによって分析する。結果は、図4Aに示す通りであり、hIL-4Rαが複合体hIL-13Rα/hIL-13に結合できることを示している。
上記の実験は、hIL-4Rαが、複合体hIL-13Rα/hIL-13に結合できることを証明し、これに基づいて、複合体hIL-13Rα/hIL-13に対するhIL-4Rαの結合を阻害するFab抗体を更にスクリーニングし、以前の期間でスクリーニングされた候補Fab抗体の阻害効果を比較し、希釈標準緩衝液を陰性対照群として設定する。ビオチン標識hIL-4Rαをプローブ(濃度10ng/mlで)によって固定化し、候補Fab抗体の希釈標準濃度を100μg/mlに調整し、複合体hIL-13Rα/hIL-13の濃度は200ng/mlである;最初に、ビオチン標識hIL-4RαをSAプローブ(10ng/mlの希釈標準濃度で)によって固定化し、その100μlを各ウェルに添加し、hIL-4Rα及び複合体hIL-13Rα/hIL-13に対する候補Fab抗体の阻害効果を、Fortebioによって検出する;実験方法を実行するように編集し、実験結果をFortebioソフトウェアによって分析する。結果は、図4Bに示す通りであり、候補抗体が、複合体hIL-13Rα/hIL-13に対するhIL-4Rαの結合を阻害できることを示している。
陽性単クローン性プラスミドを抽出し、シークエンシングして、候補陽性コロニーの重鎖及び軽鎖可変領域の配列を得る:
クローン1A6:
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
重鎖
上記の重鎖及び軽鎖の可変領域配列断片をPCR増幅し、重鎖可変領域を、ヒト重鎖定常領域及び調節エレメントを含有するベクターにクローニングして、哺乳動物細胞において完全なIgG重鎖を発現させる。同様に、軽鎖可変領域を、ヒト軽鎖定常領域及び調節エレメントを含有するベクターにクローニングして、哺乳動物細胞において完全なIgG軽鎖を発現させる。正しいシークエンシングの後、ベクターをHEK293-6E哺乳動物細胞にトランスフェクトし、IgGを発現によって培養培地に分泌させ、上清をプールして収集し、濾過によって精製する。IgGをプロテインAクロマトグラフィーによって精製し、培養上清を適当なサイズを有するプロテインAカラムにロードし、50mM Tris-HCl(pH 8.0)及び250mM NaClによって洗浄し、結合したIgGを、0.1M グリシン-HCl(pH 3.0)によって溶出させる。タンパク質を、濃縮チューブ(Millipore)を使用して限界濾過によって濃縮し、OD280を検出し、IgGの濃度を分光光度計によって決定する。精製IgGの凝集又は分解をSDS-PAGEによって分析する。
PBSを96ウェルプレートのいずれかのカラムに100μl/ウェルで添加し、96ウェルプレートをプローブホルダーカセットに置く。プローブを取る際に、プローブがホルダーに触れないようにホルダーに完全に引っかけるように注意すること。固定化したビオチン標識hIL-4RαをPBSによって5μg/mlに希釈する;新規96ウェルプレートを取り、希釈した固定化材料をカラム毎に添加し、抗体100μl/ウェルをPBSによって50μg/mlに希釈し、次に1:1に希釈して、一連の6つの濃度:50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、0μg/mを100μl/ウェルで調製し、この量は特異的検体の結合能に応じて適切に調整することができる。新しい96ウェルプレートを取り、PBSをカラム1及び2に100μl/ウェル(ベースライン及び解離の両方に関して同じ緩衝液)で添加し;希釈した固定化材料をカラム3に添加し;連続希釈した検体をカラム4に添加し;10mM HCl(pH 1.9)をカラム11に添加し;PBSをカラム12に添加する。SAプローブは、固定化したビオチン材料に非常に強く結合する。再生すると、固定化材料はなおもプローブに結合したままであり、単に一度固定化するだけで再利用することができる。次に、Fortebioソフトウェアにおいて実験方法を設定した後、実験プログラムを検出のために実行する。抗体親和性の検出結果は以下のTable 1(表1)に示す通りである。
選択されたモノクローナル抗体可変領域配列を、CDR移植に関して高い相同性を有する配列を発見するためにヒト抗体の生殖系列配列と整列させる;次に、コンピューターを使用して相同性モデリングを実施し、CDR領域及びその周囲のフレームワークのアミノ酸配列を分析し、その空間的立体映像的組合せを調べる。静電気力、ファンデルワールス力、疎水性、及びエントロピーを計算することによって、IL-4Rαと相互作用し、陽性モノクローナル抗体の遺伝子配列において空間的フレームワークを維持しうる重要な個々のアミノ酸を分析し、復帰変異部位をこれに基づいて設計する。HLA-DR親和性を分析して調べ、低い免疫原性を有するヒト胚フレームワーク配列を選択する。
VH1021:
VL1011:
9.1 安定にトランスフェクトしたHEK293-IL-4Rα細胞株に対する候補ヒト化抗体の結合のFACS分析
IL-4Rαに対する候補ヒト化抗体の結合をFACSによって更に確認するために、HEK293細胞及び安定にトランスフェクトした293-hIL-4Rα細胞を、細胞5*104個/ウェルで調製する;0.5% BSA/PBS 5mlを添加し、1000rpmで3分間遠心分離した後、3回洗浄する。細胞各1*106個は、3%BSA/PBS溶液100μlに対応し、溶液を4℃で20分間ブロッキングする。調製した細胞を96ウェルU型プレートに100μl/ウェルの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;一次抗体溶液を添加し、氷中で1時間インキュベートする。精製Fab抗体を開始濃度500nM(12.5μg/ml)から一連の5つの濃度に作製し、1:5に従って連続希釈する。一次抗体溶液と共にインキュベーション後、追加の0.5%BSA/PBSを150μlの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる。0.5%BSA/PBS 150μlを更に添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;二次抗体である抗ヒトIgG、Fab'2-AF647を添加する前に、これを1%BSA/PBSによって1:300に希釈する;二次抗体溶液40μlを、各ウェルに添加し、氷中で45分間インキュベートする。二次抗体溶液と共にインキュベーション後、追加の0.5%BSA/PBSを150μlの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;0.5%BSA/PBS 150μlを更に添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;PBS 20〜100μlを添加して細胞を1*106個/mlに再浮遊させ、得られた浮遊液をフローサイトメーター(I-Que screener)にロードする。正しいプロセスに従って機器及びオペレーティングシステムを開き、正しいパラメータを設定後、細胞を試験プレートにロードし、蛍光シグナルを検出する;分析は、Graph Pad Prism 5ソフトウェアを使用して実施する。結果は図5Aに示す通りであり、ヒト化候補抗体が、IL-4Rαを発現する安定にトランスフェクトしたHEK293細胞に特異的に結合することを示す。
HEK293細胞及び安定にトランスフェクトした293-hIL-4Rα細胞を、細胞3*104個/ウェルで調製する;0.5% BSA/PBS 5mlを添加し、1000rpmで3分間遠心分離し、3回洗浄する。細胞各1*106個は、3%BSA/PBS溶液100μlに対応し、溶液を4℃で20分間ブロッキングする。調製した細胞を96ウェルU型プレートに100μl/ウェルの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;一次抗体溶液を添加し、氷中で1時間インキュベートする。精製候補抗体を開始濃度100nMから一連の5つの濃度に作製し、1:5に従って連続希釈する。一次抗体溶液と共にインキュベーション後、追加の0.5%BSA/PBSを150μlの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;0.5%BSA/PBS 150μlを更に添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;ビオチン標識IL-4を最終濃度0.15μg/mlで添加し、氷中で45分間インキュベートする。二次抗体SA-PEを1%BSA/PBSによって1:300に希釈する;二次抗体溶液40μlを、各ウェルに添加し、氷中で45分間インキュベートする。二次抗体溶液と共にインキュベーション後、追加の0.5%BSA/PBSを150μlの体積で添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;0.5%BSA/PBS 150μlを更に添加し、1100rpmで3分間遠心分離し、上清を捨てる;PBS 20〜100μlを添加して細胞を1*106個/mlに再浮遊させ、得られた浮遊液をフローサイトメーター(I-Que screener)にロードする。正しいプロセスに従って機器及びオペレーティングシステムを開き、正しいパラメータを設定後、細胞を試験プレートにロードし、蛍光シグナルを検出し、Graph Pad Prism 5ソフトウェアを使用して分析を実施する。結果は図5Bに示す通りであり、候補抗体が、IL-4Rαを発現する細胞に対するヒトIL-4の結合を阻害できることを示す。
10.1 hIL-4又はhIL-13によるTF-1細胞増殖の刺激の実験
凍結保存したTF-1細胞(ATCC:CRL-2003(商標))を液体窒素タンクから取り出し、37℃の水浴中で軽く振とうさせながら速やかに溶解させる。溶解した細胞浮遊液を、予め加温した1640培地(Gibco社、カタログ番号C11875500BT)10mlを含有する50ml遠心チューブに移し、1000rpmで3分間遠心分離する;上清を捨て、GM-CSFを含有する1640完全培地を添加し、T75細胞培養フラスコに移し、静置培養のために37℃の5%二酸化炭素細胞インキュベータに入れる。細胞浮遊液を2〜3日毎に取り、800rpmで3分間遠心分離し、1640完全培地15mlを添加して再浮遊させ、細胞1*106個を取り、1640完全培地10mlを含有するT75培養フラスコに入れて2〜3回連続して継代培養する。細胞が単細胞の浮遊状態で明白でわずかに不規則な形態であり、細胞生存率が90%より高い場合、細胞活性検出実験を実施する。
TF-1細胞を、5.1に記載されるように培養し、細胞浮遊液(細胞3×105個/ml)100μlを実験設計に従って96ウェルプレートに添加し、如何なるサイトカインも含まない条件下で24時間培養し、端部の穴をPBSによって密封する。抗体を濃度1mMに希釈し、hIL-4を3ng/mlに希釈し、hIL-13を30ng/mlに希釈する。抗体を連続2倍希釈し、細胞に10μl/ウェルで添加し、均一に混合し、37℃及び5%CO2の条件下で1時間インキュベートする。1640培地10μlをブランク群に添加し、均一に混合し、37℃及び5%CO2の条件下で1時間インキュベートする。実験設計に従って、hIL-4及びhIL-13を細胞に10μl/ウェルで添加し、均一に混合し、37℃及び5%CO2の条件下で72時間培養する。1640培地10μlをブランク群に添加し、均一に混合し、37℃及び5%CO2の条件下で72時間培養する。均一に混合した細胞浮遊液を、96ウェル黒色ELISAプレートに80μl/ウェルで接種する;Cell Titer-Glo 80μlを各ウェルに添加し、次に、マイクロウェルプレートを軽く振とうさせ、シェーカー上で2分間均一に混合し、室温で10分間インキュベートして、安定な発光シグナルを産生させる。発光をELISAリーダーによって検出し、検出時間を1秒間に設定する。結果は、図6C、図6D、及び図6Eに示す通りであり、ヒト化抗体がhIL-4刺激TF-1細胞増殖を阻害できること、ヒト化抗体が、hIL-13刺激TF-1細胞増殖を阻害できること、ヒト化抗体がhIL-4刺激及びhIL-13刺激TF-1細胞増殖をそれぞれ、阻害できることを示している。
1μg/ml ヒトhIL-4Rα、10μg/ml カニクイザルcynoIL-4Rα、1μg/mlマウスmIL-4Rα(Sino Biological社、カタログ番号80198-R08H)、及び1μg/mlラット由来ratIL-4Rα(Sino Biological社、カタログ番号51180-M08H)を、0.05Mカーボネートコーティング緩衝液(pH 9.5)中で、4℃で一晩希釈する。ウェル中の溶液を翌日に捨て、ウェルをPBS洗浄緩衝液によって3回洗浄する。2%BSAを含有するPBS溶液をブロッキングのために2時間添加する。PBS洗浄緩衝液によって3回洗浄後、様々な希釈濃度のヒト化候補抗体100μlを添加し、室温で1時間インキュベートした後、PBS洗浄緩衝液によって3回洗浄する;HRP架橋抗体(Jackson Immuno Research社)をPBS洗浄緩衝液によって1:10000に希釈し、室温で1時間インキュベートする。PBS洗浄緩衝液によって3回洗浄後、TMB基質溶液100μlを添加して発色させ、室温で10分間反応後、0.5M濃硫酸溶液50μlを添加することによって反応を停止させ、450nmでの吸光度を読み取る。結果は以下の通りである:図7Aは、ヒト化候補抗体がヒトIL-4Rαタンパク質に結合することを示し;図7Bは、ヒト化候補抗体がカニクイザルIL-4Rαのタンパク質に結合することを示し;図7Cは、候補ヒト化抗体がマウスIL-4Rαタンパク質に結合しないことを示し;図7Dは、ヒト化候補抗体がラットIL-4Rαタンパク質に結合することを示す;ヒト化抗体が、ヒト又はカニクイザル又はラットIL-4Rαタンパク質に対して類似の親和性で結合することができるが、マウスIL-4Rαタンパク質とは相互作用しないことが認められうる。
Claims (10)
- 配列番号2〜4、12〜14、22〜24、32〜34、42〜44、52〜54、62〜64、72〜74、82〜84、92〜94、102〜104、112〜114、122〜124、132〜134、142〜144、152〜154、162〜164、172〜174、177〜179、182〜184、187〜189、192〜194、197〜199、202〜204、207〜209のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖CDR、及び/又は配列番号7〜9、17〜19、27〜29、37〜39、47〜49、57〜59、67〜69、77〜79、87〜89、97〜99、107〜109、117〜119、127〜129、137〜139、147〜149、157〜159、167〜169、212〜214、217〜219、222〜224、227〜229のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖CDRを含む、IL-4Rαに特異的に結合する抗体又はその機能的断片。
- 配列番号2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、177、182、187、192、197、202、207のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖CDR1、配列番号3、13、23、33、43、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、163、173、178、183、188、193、198、203、208のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖CDR2、及び配列番号4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、179、184、189、194、199、204、209のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖CDR3;並びに/又は配列番号7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、212、217、222、227のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖CDR1、配列番号8、18、28、38、48、58、68、78、88、98、108、118、128、138、148、158、168、213、218、223、228のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖CDR2、及び配列番号9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、214、219、224、229のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖CDR3を含む、IL-4Rαに特異的に結合する抗体又はその機能的断片。
- 配列番号1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、176、181、186、191、196、201、206のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖可変領域、及び/又は配列番号6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、211、216、221、226のアミノ酸配列、若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖可変領域を含む、IL-4Rαに特異的に結合する抗体又はその機能的断片。
- hIL-4とhIL-4Rαとの相互作用を阻害し、好ましくは複合体hIL-13Rα/hIL-13に対するhIL-4Rαの結合も阻害し、任意選択でヒト化されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
- 配列番号171のアミノ酸配列若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖可変領域、及び/又は配列番号221のアミノ酸配列若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖可変領域を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
- 配列番号176のアミノ酸配列若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖可変領域、及び/又は配列番号221のアミノ酸配列若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖可変領域を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
- 配列番号196のアミノ酸配列若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖可変領域、及び/又は配列番号211のアミノ酸配列若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖可変領域を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
- 配列番号196のアミノ酸配列若しくはその任意のバリアントから選択される重鎖可変領域、及び/又は配列番号216のアミノ酸配列若しくはその任意のバリアントから選択される軽鎖可変領域を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体又はその機能的断片。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能的断片をコードする核酸分子、及び/又は前述の態様のいずれか1つに記載の、前記核酸を含むベクター、及び/又は前述の態様のいずれか1つに記載の、前記ベクターを含む細胞、並びに/又は請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能的断片、又は請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能的断片をコードする核酸分子、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 哺乳動物におけるアレルギー疾患、又は喘息、又は慢性閉塞性肺疾患の処置のための薬物の調製における、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能的断片、又は核酸分子、又はベクター、又は細胞、又は医薬組成物の使用。
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