BR112020009211A2 - Inibidor autoimune e aplicação do mesmo - Google Patents

Inibidor autoimune e aplicação do mesmo Download PDF

Info

Publication number
BR112020009211A2
BR112020009211A2 BR112020009211-8A BR112020009211A BR112020009211A2 BR 112020009211 A2 BR112020009211 A2 BR 112020009211A2 BR 112020009211 A BR112020009211 A BR 112020009211A BR 112020009211 A2 BR112020009211 A2 BR 112020009211A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
antibody
sequence seq
heavy chain
Prior art date
Application number
BR112020009211-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Gang Xu
Bo Chen
Juntao Yu
Original Assignee
Chengdu Conmed Biosciences Co., Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Conmed Biosciences Co., Ltd filed Critical Chengdu Conmed Biosciences Co., Ltd
Publication of BR112020009211A2 publication Critical patent/BR112020009211A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

a presente divulgação refere-se a um anticorpo inibidor duplo que tem como alvo a interleucina-4 e a interleucina-13 humanas, um método de fabricação e uso do mesmo.

Description

INIBIDOR AUTOIMUNE E APLICAÇÃO DO MESMO Campo Técnico
[001]A presente divulgação refere-se a um anticorpo inibidor duplo que tem como alvo a interleucina-4 e a interleucina-l13, um método de fabricação para o mesmo e uso do mesmo.
Antecedentes Da Técnica
[002] A interleucina-4 (ILH4) é um fator determinante principal nas respostas imunes mediadas por células auxiliares de Th2. Granulócitos eosinófilos, granulócitos basofílicos, mastócitos ou células linfoides inatas secretam IL-4 após serem ativadas por imunógenos, a IL-4 pode induzir células T ingênuas ativadas por antígeno a se diferenciarem em células Th2. As células Th2 expressam citocinas, tais como, IL-4, IL-5 e IL-13, e a IL4 atua nas próprias células Th2, que podem formar um efeito de amplificação e ativação do enovelamento.
[003] IL-4 e IL-13 exercem atividades biológicas ligando- se a receptores específicos na superfície da célula e transmitindo sinais para o interior da célula. Ao atuar nas células B, IL4 e IL-13 podem regular positivamente a expressão de antígenos de classe IT de MHC e intensificam a capacidade das células B de apresentar antígenos, o que faz com que o sistema imune produza uma resposta imune à estimulação de pequenas quantidades de antígenos, e induz uma troca de classe de anticorpos das células B, produzindo IgGl e IgE. A ligação da IL-4 e IgE aos mastócitos resulta em uma ativação dos mastócitos para liberar histaminas, serotoninas, etc. Os granulócitos eosinófilos podem ser recrutados e ativados por IL-4, IL-5 e IL-13 secretadas pelas células Th2. A IL-13 atua nas células epiteliais e nas células musculares lisas, levando à proliferação de células caliciformes epiteliais das vias aéreas e à contração do músculo liso.
[004] A IL-4R0 (Uniprot P24394), uma proteína transmembranar do tipo II com um peso molecular de aproximadamente 140 kDa (2,325x10-º?º kg), é um co-receptor de IL-4 e IL-13. A IL-4 se liga a IL-4Ra com alta afinidade e forma um complexo com yc na superfície da célula, complexo que transmite um sinal via yc, e é referido como um complexo receptor de tipo I IL-4Ra/IL-4Ryc; ao contrário da IL4, a IL-13 se liga à IL-13Ral com baixa afinidade e, em seguida, se liga à IL-4Ra para formar um receptor de alta afinidade, que transmite um sinal via IL-13R0l, e é referido como complexo receptor do tipo II IL-4Ra/IL-13Ral. A IL-4 pode funcionar através de receptores do tipo I e receptores do tipo II, enquanto a IL-13 pode funcionar apenas através dos receptores do tipo II. As diferenças na expressão nas células efetoras entre receptores do tipo I e receptores do tipo II resultam em IL-4 e IL-13 produzindo efeitos biológicos de sobreposição parciais e suas respectivas funções específicas.
[005]A interleucina (IL)-13 é considerada um mediador principal da inflamação das células T auxiliares tipo 2 (Th2), e o nível elevado de IL-13 é associado a uma variedade de doenças, incluindo, mas sem limitação a, asma, doença inflamatória intestinal, fibrose pulmonar idiopática (FPI), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e dermatite atópica e outras (Oh CK et al., Eur Respir Rev 19:46- 54(2010); Fahy JV et al., Nat Rev Immunol 15:57-65[2015]).
A IL-13 é produzida por vários tipos de células, incluindo células Th2, granulócitos basofílicos, granulócitos eosinófilos, mastócitos, células epiteliais das vias aéreas e células linfoides inatas do tipo 2. A IL-13 se liga a um receptor heterodimérico IL-4Ra/IL-13Ral, que também é um receptor para IL4, e ativa a via de sinalização STAT-6 (Hershey GK, J Allergy Clin Immunol 111(4):677-90[2003]). Em alguns casos, a IL-13 é associada a manifestações clínicas da asma, incluindo produção de muco, fibrose subepidérmica, produção de IgE, hiperplasia do músculo liso e recrutamento e ativação de células inflamatórias (Hershey GK, J Allergy Clin Immunol 111(4):677-90[2003]; Fahy JV et al., Nat Rev Immunol 15:57-65[2015]). Como a inflamação Th2 envolve a atividade de vários tipos de células diferentes das células Th2, incluindo células linfoides inatas do tipo 2 (ILC2s)
a “inflamação Th2” foi recentemente referida como “inflamação do tipo 2” na literatura científica.
Além das células Th2, as ILC2s também foram identificadas como uma fonte importante de citocinas, tais como IL-5 e IL-13. Portanto, citocinas, tais como IL-l13 e IL-5, que foram previamente identificadas como citocinas Th2, agora também são citadas como citocinas do tipo 2 na literatura científica.
De forma similar, os estados de doença associados a essas citocinas também são agora denominados doenças causadas pelo tipo 2 ou doenças relacionadas ao tipo 2. Ver, por exemplo, Noonan et al., J.
Allergy Clin Immunol., 132(3) :567-574(2013); Hanania et al., Thorax 70(8):748- 56(2015); e Cai et al., Bioanalysis 8(4):323-332(2016). Por exemplo, o termo “asma tipo 2” usado na literatura científica reflete o processo evolutivo de compreensão da asma, e é caracterizado por altos níveis de interleucinas (incluindo IL-5 e IL-13) no tecido pulmonar. Portanto, “Th2” e “tipo 2” são usados de forma intercambiável nesse documento.
[006]A asma é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas. Pacientes com asma têm hiperresponsividade das vias aéreas e graus variados de obstrução reversível das vias aéreas, e ataques recorrentes a longo prazo causam remodelação das vias aéreas (envolvendo fibras de colágeno e músculos lisos), resultando em espessamento e estenose das vias aéreas, e levando a enfisema obstrutivo. Cerca de 50% dos pacientes com asma grave têm uma resposta inflamatória tipo II mediada por células Th2. Em comparação com à pessoa normal, os pacientes com asma apresentam níveis elevados de IL-4 e IL-13 nas biópsias séricas ou brônquicas. Após a estimulação com alérgenos, os níveis de IL-4 e IL-13 aumentam o líquido de lavagem broncoalveolar em pacientes com asma. A inalação de IL4 em pacientes com asma alérgica pode induzir sintomas característicos da asma, como hiperresponsividade das vias aéreas e aumento de granulócitos eosinófilos no escarro. Pesquisas mostram que o aparecimento de asma alérgica está intimamente relacionado ao desequilíbrio da proporção de células do tipo Thl/Th2, produzindo citocina IL-4 excessiva. A IL-4 é a única citocina que determina a diferenciação de células Thl em Th2, e promove a síntese de IgE pelas células B, enquanto a IL-13 é o parceiro dominante que desencadeia a hiperresponsividade do trato respiratório, a remodelação das vias aéreas, e a secreção de muco excessiva (Annu Rev Immunol, Wynn et al., 2003).
[007] Granulócitos eosinófilos estão presentes no sangue periférico de pacientes com dermatite atópica, e moléculas associadas à ativação da via Th2 são detectadas na pele sem lesão de pacientes com dermatite atópica, mas não na pele normal de controles saudáveis. Além disso, o nível de timo e quimiocina regulada por ativação CCL17 é elevado no soro de pacientes com dermatite atópica, e CCL17 é uma quimiocina induzida por IL-4 e IL-13 que induz seletivamente a ativação de células T. As terapias de amplo espectro, tais como corticosteroides tópicos e ciclosporina A oral, podem induzir um rápido declínio nos níveis de TARC, o que está intimamente relacionado à gravidade da dermatite atópica, demonstrando que um potencial inflamatório tipo II impulsiona a dermatite atópica na doença. A dermatite atópica é geralmente complicada com outras doenças alérgicas, tais como, rinite alérgica e asma.
[008] Acredita-se que a patogênese da rinite atópica seja uma alergia mediada por Th2 a alérgenos comuns, tais como, pólen, mofo e ácaros da poeira doméstica. Em comparação com o grupo de controle, os grupos mais jovens com rinite atópica sazonal apresentam um nível elevado de IL-4 na lavagem nasal. Os níveis de IL-4 e IL-13 são regulados positivamente nos mastócitos nasais em pacientes com rinite atópica perene em comparação com mastócitos nasais em pacientes com rinite infecciosa crônica. A IL4 induz a regulação positiva do MRNA de FceRI e a expressão da proteína da superfície celular nos mastócitos nasais. A rinite atópica pode evoluir para sinusite crônica acompanhada de pólipos nasais, e os pólipos nasais também têm uma resposta do tipo Th2, que leva a níveis elevados de granulócitos eosinófilos, IL-5, IgE e quimiocinas de granulócitos eosinófilos nos tecidos. A mucosa de pacientes tendo sinusite crônica com pólipos nasais contém mais células ILC2 linfoides inatas do que a de pacientes tendo sinusite crônica sem pólipos nasais ou tendo mucosa normal, em que as células ILC2 linfoides inatas secretam altos níveis de IL-13 sob a estimulação de IL-33.
[009] A doença pulmonar obstrutiva crônica é uma doença pulmonar obstrutiva caracterizada por significativa inflamação pulmonar e sistêmica. Nos pacientes, a inflamação na maioria das vias aéreas dos pacientes leva à bronquite crônica e à inflamação nas pequenas vias aéreas, o que resulta em lúmen reduzido e maior resistência de fluxo de ar. Ao contrário da asma, a limitação do fluxo aéreo na doença pulmonar obstrutiva crônica é irreversível. Pesquisas demonstraram que os linfócitos obtidos da lavagem broncoalveolar em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica têm um fenótipo misto. Em comparação com pacientes com doença pulmonar obstrutiva não crônica ou de controle, os pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica têm uma proporção maior de células T de IL-4*CD4, IL-4'CD8 e IL- 13*CD8. 30% dos pacientes com exacerbação aguda de doença pulmonar obstrutiva crônica têm vírus respiratórios, 77% dos quais são rinovírus, e rinovírus é uma razão importante que causa O agravamento da doença pulmonar obstrutiva crônica. Pacientes com piora da doença pulmonar obstrutiva crônica têm respostas Thl e Th2 nos pulmões e no sangue periférico; O IFNy não é expressado onipresentemente nesses pacientes, o que não apresenta diferença significativa em comparação aos pacientes na fase estável e no grupo de controle; pelo contrário, a IL-4 é expressada onipresentemente nesses pacientes, que são regulados positivamente em comparação com os pacientes na fase estável e no grupo de controle. Pesquisas “demonstraram que o controle dos níveis de granulócitos eosinófilos pode trazer um benefício clínico muito significativo para pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica, reduzindo o agravamento em 62%. O uso de beralizumab em pacientes com granulócitos eosinófilos > 200 por microlitro pode efetivamente remover os granulócitos eosinófilos nos pacientes, reduzir os sintomas de exacerbação aguda da doença pulmonar obstrutiva crônica, e melhorar o FEV1 e os escores de sintomas (Brightling CE et al., Lancet Respir Med. 2014). A síndrome de sobreposição da doença pulmonar obstrutiva crônica/asma é agora reconhecida como uma doença com dois aspectos principais: asma e doença pulmonar obstrutiva crônica.
[0010] Tendo em vista o efeito e a função de IL-4Ra e IL- 13 em várias doenças relacionadas, permanece uma necessidade na técnica de desenvolver anticorpos específicos anti-IL-4Ra melhorados adequados para o tratamento de pacientes.
Sumário da Invenção
[0011] Através de extensa pesquisa aprofundada e triagem em massa, os inventores inesperadamente obtiveram um anticorpo anti-IL-4R%M tendo afinidade e especificidade extremamente excelentes, e um anticorpo humanizado obtido com base no anticorpo anti-IL-4Ra. O anticorpo da presente invenção é capaz de se ligar a antígenos de IL-4Ra com uma alta especificidade e alta afinidade, e inibe significativamente a ligação de IL-4Ra a IL-4 e IL-4RM a IL-
13. Além disso, o anticorpo da presente invenção não tem efeitos colaterais visíveis nos mamíferos. A presente invenção foi realizada com base no acima exposto.
[0012]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo que se liga especificamente a IL-4Ra.
[0013] Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, de acordo com o aspecto anterior, compreendendo uma CDR da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2-4, 12-14, 22-24, 32-34, 42-44, 52-54, 62-64, 72-74, 82-84, 92-94, 102-104, 112-114, 122-124, 1132-134, 142-144, 152-154, 162-164, 172-174, 1777-179, 182-184, 1872 189, 192-194, 197-199, 202-204 e 207-209 ou qualquer variante das mesmas, e/ou uma CDR da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7-9, 17-19, 27-29, 37-39, 47-49, 57-59, 67-69, 77-79, 87-89, 97-99, 107-109, 1117-119, 127-129, 137-139, 147-149, 1157-159, 167-169, 212- 214, 217-219, 222-224, 227-229 ou qualquer variante das mesmas.
[0014] O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, compreendendo uma CDR1 da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 177, 182, 187, 192, 197, 202, 207 ou qualquer variante das mesmas, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133 143, 153, 163, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208 ou qualquer variante das mesmas; e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 179, 184, 189, 194, 199, 204, 209 ou qualquer variante das mesmas; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 212, 217, 222, 227 ou qualquer variante das mesmas, uma CDR2 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 8, 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128 138, 148, 158, 168, 213, 218, 223, 228 ou qualquer variante das mesmas, e uma CDR3 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 9, 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 214, 219, 224, 229 ou qualquer variante das mesmas.
[0015]O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 206 ou qualquer variante das mesmas e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 211, 216, 221 226 ou qualquer variante das mesmas.
[0016]O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 171 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[0017] O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 176 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[0018] O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 196 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[0019] O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 196 ou qualquer variante das mesmas, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[0020] O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, em que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.
[0021]O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, em que o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo inibe a interação de hIL-4 com hIL-4Ra; de preferência, o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo também inibe a ligação de hIL-4RM a um complexo hIL-13Ra/hIL-13.
[0022]O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, em que o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo é humanizado.
[0023] O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência para o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes.
[0024] UMa molécula de ácido nucleico que codifica oO anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, ou uma molécula de ácido nucleico tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a mesma.
[0025]UM vetor compreendendo o ácido nucleico de qualquer um dos aspectos precedentes.
[0026]UmMa célula compreendendo o vetor de qualquer um dos aspectos precedentes.
[0027] Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou o ácido nucleico que codifica o mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0028] UM método para tratamento de doenças alérgicas em um mamífero, compreendendo a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, ou da célula ou da composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos precedentes.
[0029] Um método para tratamento de câncer, compreendendo a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, ou da célula ou da composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos precedentes.
[0030] UM método para tratamento de asma em um mamífero, compreendendo a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou o vetor, ou a célula ou a composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos precedentes.
[0031] UM método para tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica em um mamífero, compreendendo a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, da célula ou da composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos precedentes.
[0032]UM método para tratar doenças associadas à produção anormal de IL4 e/ou IL-13 em um mamífero, compreendendo a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, ou da célula ou da composição farmacêutica como definido(a) em qualquer um dos aspectos precedentes.
[0033] Um método para inibir uma resposta mediada por TH- 2 em um mamífero, compreendendo a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, da célula ou da composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos precedentes.
[0034] Uso do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, ou da célula ou da composição farmacêutica como definido(a) em qualquer um dos aspectos precedentes na preparação de um fármaco para o tratamento de doenças alérgicas em um mamífero.
[0035] Uso do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, ou da célula ou da composição farmacêutica como definido(a) em qualquer um dos aspectos precedentes na preparação de um fármaco para o tratamento da asma em um mamífero.
[0036]Uso do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, ou da célula ou da composição farmacêutica em qualquer um dos aspectos precedentes na preparação de um fármaco para o tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica em um mamífero.
[0037] O uso do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, da célula ou da composição farmacêutica em qualquer um dos aspectos precedentes na preparação de um fármaco para o tratamento de doenças associadas à produção anormal de IL- 4 e/ou IL-13.
[0038] O uso do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, da célula ou da composição farmacêutica em qualquer um dos aspectos precedentes na preparação de um fármaco para o tratamento de uma resposta mediada por TH-2 em um mamífero.
Breve descrição dos Desenhos
[0039]A Figura 1A mostra que a proteína da região extracelular da IL-4R%A — humana tem um tamanho de aproximadamente 40 kDa (6,642x10 ?? kg); A Figura 1B mostra que a proteína da região extracelular do macaco cinomolgo IL-4Ra tem um tamanho de aproximadamente 40 kDa (6,642x10-?3 kg); A Figura 1C mostra que a proteína IL-4 humana tem um tamanho de aproximadamente 20 kDa (3,321x10-º?? kg); e A Figura 1D mostra que a proteína da região extracelular da IL-13Ral humana tem um tamanho de aproximadamente 55 kDa (9,133x10-23 kg).
[0040] A Figura 2 mostra as células monoclonais HEK293 que expressam estavelmente hIL-4Ra.
[0041] A Figura 3A mostra que os títulos de anticorpos no soro de 5 camundongos imunizados podem atingir 1:819200; a Figura 3B mostra que os anticorpos no soro dos camundongos imunizados t$3 e d4 podem inibir a ligação de receptores de IL4 e IL4 humanos; a Figura 3C mostra que todos os anticorpos previamente triados por ELISA se ligam especificamente a células HEK293 transfectadas de maneira estável que expressam IL-4Ra; a Figura 3D mostra que 15 anticorpos nas colônias positivas previamente triadas por ELISA podem inibir a ligação de células transfectadas de maneira estável que expressam hIL-4Ra à IL-4 humana.
[0042] A Figura 4A mostra que o hIL-4Ra pode se ligar ao complexo hIL-13Ra/hIL-13; a Figura 4B mostra que o anticorpo candidato pode inibir a ligação de hIL-4Ra ao complexo hIL- 13R0/hIL-13.
[0043] A Figura 5A mostra que os anticorpos candidatos humanizados podem se ligar especificamente a células HEK293 transfectadas de maneira estável que expressam IL-4R0; a Figura 5B mostra que o anticorpo candidato pode inibir a ligação da IL-4 humana a células que expressam hIL-4Ra.
[0044] A Figura 6A mostra que o hIL 4 pode estimular a proliferação de células TF-l1; a Figura 6B mostra que o hIL- 13 pode estimular a proliferação de células TF-l. A Figura 6Cc mostra que os anticorpos humanizados podem inibir a proliferação de células TF-1 estimuladas por hIL-4; A Figura 6D mostra que os anticorpos humanizados inibem a proliferação de células TF-l1 estimuladas por hIL-13; a Figura 6E mostra que os anticorpos humanizados podem inibir simultaneamente a proliferação de células TF-l estimuladas por hILH4 e estimuladas por hIL-13.
[0045] A Figura 7A mostra que os anticorpos candidatos humanizados se ligam à proteína IL-4Ra humana; a Figura 7B mostra os anticorpos candidatos humanizados que se ligam à proteína IL-4Ra do macaco cinomolgo; a Figura 7C mostra que os anticorpos humanizados candidatos não se ligam à proteína IL-4Ra de camundongo; a Figura 7D mostra que os anticorpos candidatos humanizados se ligam à proteína IL-4Ra de rato.
Descrição Detalhada das Modalidades
[0046] Na presente invenção, todos os termos científicos e técnicos aqui usados têm os significados comumente entendidos por um técnico no assunto, a menos que especificados de outra forma. Além disso, termos e etapas de operação de laboratório relacionados à química de proteínas e ácidos nucleicos, biologia molecular, cultura de células e tecidos, microbiologia e imunologia, como usados nesse documento, são termos e etapas convencionais que são amplamente usadas na técnica correspondente. Para entender melhor a presente invenção, são providas abaixo definições e explicações de termos relacionados.
[0047] “Interleucina-4” (IL-4) refere-se a uma proteína IL-4 de mamífero natural ou endógena ou a uma proteína tendo a mesma sequência de aminoácidos que a proteína IL-4 de mamífero natural ou endógena correspondente (por exemplo, uma proteína recombinante e proteína sintética (isto é, uma proteína preparada por um método químico de síntese orgânica)). Por conseguinte, como definido nesse documento,
o termo inclui a proteína IL-4 madura, variantes polimórficas ou alélicas, outras isoformas de IL-4 e formas modificadas ou não modificadas das anteriores (por exemplo, lipidadas ou glicosiladas). A IL-4 de ocorrência natural ou endógena inclui proteínas do tipo selvagem, tal como IL-4 madura, variantes polimórficas ou alélicas, e outras isoformas e formas mutantes que ocorrem naturalmente em mamíferos (por exemplo, humanos e primatas não humanos). Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas de, por exemplo, uma fonte que produz naturalmente IL-4. Estas proteínas e proteínas tendo a mesma sequência de aminoácidos que a IL-4 endógena ou de ocorrência natural correspondente são referidas pelo nome do mamífero correspondente. Por exemplo, onde o mamífero correspondente é humano, a proteína é designada como IL-4 humana. Existem várias proteínas IL-4 mutantes conhecidas na técnica, como divulgado em WO 03/038041.
[0048] “Interleucina-13” (IL-13) refere-se a uma proteína IL-13 de mamífero de ocorrência natural ou endógena ou à uma proteína tendo a mesma sequência de aminoácidos que a proteína IL-13 de mamífero de ocorrência natural ou endógena correspondente (por exemplo, uma proteína recombinante e proteína sintética (isto é, uma proteína preparada por um método químico de síntese orgânica)). A IL-13 é uma citocina secretada por muitos tipos de células, incluindo células T auxiliares tipo 2 (Th2). Por conseguinte, como definido nesse documento, o termo inclui a proteína IL-13 madura, variantes polimórficas ou alélicas, outras isoformas da IL-13 (por exemplo, aquelas produzidas por splicing alternativo Ou outros processos celulares), e formas modificadas ou não modificadas das anteriores (por exemplo, lipidadas Ou glicosiladas). A IL-13 de ocorrência natural ou endógena inclui proteínas do tipo selvagem, tal como IL-13 madura, variantes polimórficas ou alélicas, e outras isoformas e formas mutantes que ocorrem naturalmente em mamíferos (por exemplo, humanos e primatas não humanos). Por exemplo, a IL- 13, como usada nesse documento, inclui variantes de IL-13 humana nas quais Arg na posição 110 da IL-13 humana madura é substituída por Gin (a posição 110 da IL-13 madura corresponde à posição 130 da proteína precursora) e Gin é associado à asma (asma atópica e não atópica) e outras variantes da IL-13. (Heinzmann et al., Hum MoI Genet 9: 549- 559(2000)). Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas de, por exemplo, uma fonte que produz naturalmente IL-13. Estas proteínas e proteínas tendo a mesma sequência de aminoácidos que a IL-13 endógena ou de ocorrência natural correspondente são referidas pelo nome do mamífero correspondente. Por exemplo, onde o mamífero correspondente é humano, a proteína é designada como IL-13 humana. Existem várias proteínas IL-l13 mutantes conhecidas na técnica, como divulgado em WO 03/035847. A sequência de aminoácidos de uma IL-13 humana de exemplo pode ser encontrada, por exemplo, sob o Nº de Acesso UniProtKB P35225. A IL-13 se liga a um receptor de IL-13, em que o receptor de IL-13 pode incluir o receptor de IL-4 alfa (IL4Ra) complexado com a subunidade al do receptor de IL-13 (IL13RAl) ou com a subunidade a2 do receptor de IL-13 (ILI13RA2). Por exemplo, a IL-13 pode se ligar a um complexo do receptor de IL-4 alfa e subunidade alfa 1 do receptor de IL-13.
[0049] A expressão “substancialmente idêntica” em relação a uma sequência de polipeptídeos da cadeia de anticorpos pode ser interpretada como uma cadeia de anticorpos que exibe pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de polipeptídeos de referência. O termo em relação a uma sequência de ácidos nucleicos pode ser interpretado como uma sequência de nucleotídeos que exibe pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de referência.
[0050]Os termos “identidade” ou “homologia” podem significar a porcentagem de bases nucleotídicas ou resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticas ao resíduo de uma sequência correspondente à qual ela é comparada, depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade para toda a sequência, e não considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade da sequência. Nem extensões N-terminais ou C-terminais nem inserções devem ser interpretadas como redutoras de identidade ou homologia. Métodos e programas de computador para o alinhamento estão prontamente disponíveis e são bem conhecidos na técnica. A identidade da sequência pode ser medida usando o software de análise de sequência.
[0051] AS expressões e os termos “fragmento funcional, variante, derivado ou análogo” e similares, bem como várias formas dos mesmos, de um anticorpo ou antígeno são um composto ou uma molécula tendo atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo ou antígeno de comprimento total de interesse. Por exemplo, um fragmento funcional ou análogo de um anticorpo anti-IL-4 é aquele que pode se ligar a uma molécula de IL-4 ou que pode impedir ou reduzir substancialmente a capacidade de um ligando ou um anticorpo agonístico ou antagonista, de se ligar a IL-4.
[0052] Variantes “de substituição” são aquelas que têm pelo menos um resíduo de aminoácido em uma sequência nativa removida e substituída por um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição. As substituições podem ser únicas, onde apenas um aminoácido na molécula é substituído, ou podem ser múltiplas, onde dois ou mais aminoácidos são substituídos na mesma molécula. As substituições múltiplas podem estar em sítios consecutivos. Além disso, um aminoácido pode ser substituído por vários resíduos, caso em que essa variante compreende uma substituição e uma inserção. Variantes “de inserção” são aquelas com um ou mais de aminoácidos inseridos imediatamente adjacentes a um aminoácido em uma posição específica em uma sequência nativa. Imediatamente adjacente a um aminoácido significa ligado ao grupo funcional a-carboxil ou a-amino do aminoácido. As variantes “de exclusão” são aquelas com um ou mais de aminoácidos na sequência de aminoácidos nativos removida. Normalmente, as variantes de exclusão terão um ou dois de aminoácidos excluídos em uma região específica da molécula.
[0053] Como usado nesse documento, o termo “anticorpos” é usado no sentido mais amplo, e abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), fragmentos de anticorpos ou polipeptídeos sintéticos que transportam um(a) ou mais de sequências derivadas de CDR ou CDR, desde que os polipeptídeos exibam a atividade biológica desejada.
Anticorpos (Abs) e imunoglobulinas (Igs) são glicoproteínas tendo as mesmas características estruturais. “Anticorpos” também pode se referir a imunoglobulinas e fragmentos de imunoglobulina, se produzidos naturalmente ou parcialmente ou totalmente sinteticamente (por exemplo, recombinantemente), incluindo qualquer fragmento dos mesmos que compreenda pelo menos uma região variável parcial de uma molécula de imunoglobulina e retenha a especificidade de ligação de todo o comprimento da molécula de imunoglobulina.
Assim, os anticorpos incluem qualquer proteína tendo um domínio de ligação que seja homólogo ou substancialmente homólogo a um domínio de ligação antígeno da imunoglobulina (um sítio de ligação a anticorpo). Os anticorpos incluem fragmentos de anticorpo, tais como, fragmentos de anticorpo de células-tronco antitumorais.
Como usados nesse documento, o termo anticorpo inclui anticorpos sintéticos, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos não humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intracorpos e fragmentos de anticorpos, por exemplo, sem limitação, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fç(ar')2, fragmentos Fv, Fv ligado a dissulfeto (dsF.), fragmentos Fa, fragmentos Fa, Fv de cadeia única (scF.), Fab de cadeia única (scFar”), anticorpos biespecíficos, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), Ou fragmentos de ligação a antígeno de qualquer um dos anticorpos acima mencionados.
Os anticorpos providos nesse documento incluem qualquer classe de imunoglobulina (por exemplo, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) e membros de qualquer tipo (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgaA2) ou subtipo (por exemplo, IgG2a e IgG2b).
[0054]Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, etc.) ou subclasse (por exemplo, IgG:i, IgG2, IgG2a, IgG;, IgG., IgAi, IgA, etc.) ("tipo” e “classe”, assim como “subtipo” e “subclasse” são usados aqui de forma intercambiável). Anticorpos e imunoglobulinas nativo(a)s ou do tipo selvagem (ou seja, obtido(a)s de um membro de uma população não manipulada artificialmente) são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons (2,491x10-?? kg), que são compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na outra extremidade. Por “manipulado não artificialmente” entende-se não tratado para conter ou expressar uma molécula de ligação a antígeno estranha. O tipo selvagem pode se referir ao alelo ou a espécie mais prevalente encontrado(a) em uma população ou ao anticorpo obtido de um animal não manipulado, em comparação com um alelo ou polimorfismo, ou uma variante ou derivado obtido por uma forma de manipulação, tal como mutagênese, uso de métodos recombinantes e assim por diante para alterar um aminoácido da molécula de ligação a antígeno.
[0055] Como usado nesse documento, “anticorpo anti-IL-4” significa um anticorpo ou polipeptídeo derivado do mesmo (um derivado) que se liga especificamente a IL-4 como definido nesse documento, incluindo, mas não limitado a, moléculas que inibem ou reduzem substancialmente a ligação de IL-4 a seus ligantes ou inibem a atividade da IL-4.
[0056]0O termo “variável” no contexto de um domínio variável de anticorpos, refere-se a certas porções das moléculas pertinentes que diferem extensivamente na sequência entre e dentre os anticorpos e são usadas no reconhecimento e na ligação específicos de um anticorpo específico para seu alvo específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente através dos domínios variáveis dos anticorpos. A variabilidade é concentrada em três segmentos chamados regiões determinantes de complementaridade (CDRs; isto é, CDR1l, CDR2 e CDR3) ou regiões hipervariáveis, nos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões ou sequências estruturais (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem quatro regiões FR, adotando amplamente uma configuração de folha B, ligada por três CDRs, em que as CDRs formam enovelamentos conectando e, em alguns casos, formando parte da estrutura da folha à. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas frequentemente nas proximidades pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação alvo (epítopo ou determinante) dos anticorpos (ver Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Como usado nesse documento, a numeração de resíduos de aminoácidos de imunoglobulina é feita usando o sistema de numeração de resíduos de aminoácidos de imunoglobulina de Kabat et al., a menos que indicado de outra forma. Uma CDR pode ter a capacidade de se ligar especificamente a epítopo cognato.
[0057] O termo “dobradiça” ou “região de dobradiça”, como usado nesse documento, refere-se a um polipeptídeo flexível compreendendo aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo.
[0058] Conforme usado nesse documento, “fragmentos de anticorpo” ou “fragmentos de ligação a antígeno” de anticorpos referem-se a qualquer porção de um anticorpo de comprimento total que seja menor que o comprimento total mas compreende pelo menos uma porção da região variável do anticorpo que se liga a antígeno (por exemplo, um ou mais de CDRs e/ou um ou mais sítios de ligação a anticorpo) e, assim, retém a especificidade de ligação, bem como pelo menos a capacidade de ligação específica parcial do anticorpo de comprimento total. Assim, os fragmentos de ligação a antígeno se referem a fragmentos de anticorpo que compreendem uma porção de ligação a antígeno que se liga ao mesmo antígeno que o anticorpo do qual os fragmentos de anticorpo são derivados. Os fragmentos de anticorpo incluem derivados de anticorpo produzidos por tratamento enzimático de anticorpos de comprimento total e derivados produzidos pela síntese, tais como derivados produzidos de forma recombinante. Os anticorpos incluem fragmentos de anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não se limitam a, Fab, Fab", F(aw')2, Fv de cadeia única (scFvy), Fv, dsFv, anticorpos biespecíficos, fragmentos de Fa e Fa, e outros fragmentos, incluindo fragmentos modificados (ver, por exemplo, Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Capítulo 1; págs. 3-25, Kipriyanov). Os fragmentos podem compreender uma pluralidade de cadeias unidas, por exemplo, através de uma ligação dissulfeto e/ou via um ligante peptídico.
Os fragmentos de anticorpo usualmente compreendem pelo menos ou cerca de 50 aminoácidos, e tipicamente pelo menos ou cerca de 200 aminoácidos.
Os fragmentos de ligação a antígeno incluem quaisquer fragmentos de anticorpo, sobre os fragmentos de anticorpo são inseridos em uma estrutura de anticorpo (por exemplo, por substituição de uma região correspondente), um anticorpo que se liga imunoespecificamente (isto é, exibindo pelo menos ou pelo menos cerca de 107-10º M! de Ka) a antígenos é obtido. “Fragmentos funcionais” ou “análogos de anticorpos anti-IL- 4 e/ou IL-13” são fragmentos ou análogos que impedem ou reduzem substancialmente a capacidade dos receptores de se ligarem a ligantes ou iniciarem a transdução de sinal.
Como usado nesse documento, fragmentos funcionais geralmente têm o mesmo significado que “fragmentos de anticorpo” e, no caso de anticorpos, podem se referir a fragmentos que impedem ou reduzem substancialmente a capacidade dos receptores de se ligarem a ligantes ou iniciarem a transdução de sinal, tal como Fv, Fab e F(ar')2. Os fragmentos “F)Y” consistem em dímeros (dímeros VH-VL) formados por um domínio variável de uma cadeia pesada e um domínio variável de uma cadeia leve por ligação não covalente.
É nessa configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação alvo na superfície do dímero VH-VL, como é o caso de um anticorpo intacto.
Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo intacto.
No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas 3 CDRs específicas para um alvo) tem a capacidade de reconhecer e ligar alvos.
[0059] Os fragmentos de anticorpo “F, de cadeia única”, “sFyY” ou “crosta” compreendem domínios VH e VL de anticorpos, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo F, compreende adicionalmente um ligante polipeptídico entre VH e VL, que é tipicamente uma molécula flexível que permite ao sF, formar a estrutura desejada para ligação alvo.
[0060]O termo “anticorpo biespecífico” refere-se a fragmentos de anticorpo tendo dois sítios de ligação a antígeno; os fragmentos de anticorpo podem compreender um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica. Ao usar um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios variáveis na mesma cadeia, os domínios do anticorpo biespecífico são forçados para parear com os domínios de ligação de outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno.
[0061] Os fragmentos Fab compreendem os domínios variável e constante da cadeia leve, bem como o domínio variável e o primeiro domínio constante (Cm) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab! diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxil do domínio Cm para incluir uma ou mais de cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Os fragmentos Fab” podem ser produzidos por clivagem da ligação dissulfeto nas cisteínas da dobradiça do produto de digestão com pepsina de Fçraw)2. Tratamentos enzimáticos e químicos adicionais de anticorpos podem produzir outros fragmentos funcionais de interesse.
[0062]O0 termo “Fab linear” refere-se a um anticorpo tetravalente, como descrito por Miller et al. (Miller et al.
(2003), JImMuUnOl. 170: 4854-4861). O “Fab linear” é composto de um conjunto do mesmo domínio Cn:i-VH, pareado com a cadeia leve idêntica em cada posição de Cm-VH. Essas moléculas foram desenvolvidas de modo a aumentar a valência de um anticorpo para intensificar sua afinidade funcional através do efeito da avidez, mas são monoespecíficas.
[0063] Como usado nesse documento, o “anticorpo monoclonal” refere-se a uma população de anticorpos idênticos, isto é, cada molécula de anticorpo individual na população do anticorpo monoclonal é idêntica a outras moléculas de anticorpo. Esta propriedade contrasta com a propriedade de uma população policlonal de anticorpos, que compreende anticorpos tendo uma pluralidade de sequências diferentes. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por muitos métodos bem conhecidos (Smith et al. (2004) JU. Clin. Pathol. 57,912-917; e Nelson et al., J Clin Pathol (2000), 53,111-117). Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser preparados imortalizando células B, por exemplo, por fusão com células de mieloma para produzir uma linha celular de hibridoma ou infectando células B com um vírus tal como o EBV. As técnicas recombinantes também podem ser usadas para preparar anticorpos a partir de uma população clonal de células hospedeiras, transformando in vitro as células hospedeiras com um plasmídeo portando uma sequência artificial de um nucleotídeo que codifica os anticorpos.
[0064] Como usado nesse documento, o termo “hibridoma” ou “célula de hibridoma” refere-se a uma célula ou linha celular (tipicamente uma célula de mieloma ou linfoma) produzida pela fusão de linfócitos produtores de anticorpos e células cancerígenas produtoras de anticorpos. Como é do conhecimento dos técnicos no assunto, os hibridomas podem proliferar e continuar a fornecer para produzir anticorpos monoclonais específicos. Os métodos para produzir hibridomas são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow & Lane, 1988). O termo “hibridoma” ou “célula de hibridoma” quando referido também nesse documento inclui subclones e células descendentes do hibridoma.
[0065] Como usado nesse documento, “anticorpo convencional” refere-se a um anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas (que podem ser designadas H e H') e duas cadeias leves (que podem ser designadas L e L') e dois sítios de ligação a antígeno, em que cada cadeia pesada pode ser uma cadeia pesada de imunoglobulina de comprimento total ou qualquer região funcional que retenha a capacidade de ligação a antígeno (por exemplo, as cadeias pesadas incluem, mas não limitadas a, cadeias VH, cadeias VH-Cn, e cadeias VH-Cun1-Cnon Crx3) e cada cadeia leve pode ser uma cadeia leve de comprimento total ou qualquer região funcional (por exemplo, cadeias leves incluem, mas não são limitadas a, cadeias VL e cadeias VL-C1). Cada cadeia pesada (H e H') é pareada com uma cadeia leve (L e L'", respectivamente).
[0066]Como usado nesse documento, um anticorpo de comprimento total é um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas de comprimento total (por exemplo, VH-Crn1-Cn2-Cn3 OU VH-Cn1-Cn2-Cn3-Cuha) E duas cadeias leves de comprimento total (VL-C1L) e uma região de dobradiça, por exemplo, um anticorpo produzido naturalmente pela secreção do anticorpo por células B, e um anticorpo produzido sinteticamente com o mesmo domínio.
[0067] Como aqui usado, dsF, refere-se a um F, tendo uma ligação dissulfeto intermolecular manipulada que estabiliza o par VH-VL.
[0068] Como usado nesse documento, um fragmento Fab é um fragmento de anticorpo que resulta da digestão de uma imunoglobulina de comprimento total com papaína, ou um fragmento tendo a mesma estrutura, que é sintetizada ou produzida, por exemplo, por métodos recombinantes. O fragmento Fab compreende uma cadeia leve (compreendendo VL e Cri) e outra cadeia compreendendo um domínio variável (VH) da cadeia pesada e um domínio de região constante (Cm) da cadeia pesada.
[0069] Como usado nesse documento, um fragmento Fç(ap')2 É um fragmento de anticorpo que resulta da digestão de uma imunoglobulina com pepsina a pH 4,0-4,5, ou um fragmento tendo a mesma estrutura, que é sintetizada ou produzida, por exemplo, por métodos recombinantes. Um fragmento Fç(ab')2 compreende essencialmente dois fragmentos Far, em que cada porção da cadeia pesada compreende alguns aminoácidos adicionais, incluindo cisteínas que formam uma ligação dissulfeto que conecta os dois fragmentos.
[0070] Como usado nesse documento, um fragmento Fab! é um fragmento compreendendo metade de um fragmento Fçap')2 (compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve).
[0071] Como usado nesse documento, um fragmento scFvy refere-se a um fragmento de anticorpo compreendendo uma cadeia leve variável (VL) e uma cadeia pesada variável (VH) covalentemente ligada por um ligante polipeptídico em qualquer ordem. O ligante é de um comprimento de modo que os dois domínios variáveis sejam ligados em ponte sem interferência substancial. Ligantes de exemplo são resíduos
(Gly-Ser)n com alguns resíduos Glu ou Lys dispersados por toda a parte para aumentar a solubilidade.
[0072]0 termo “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo no qual a sequência de região variável é derivada de uma espécie e a sequência de região constante é derivada de outra espécie, por exemplo, no qual a sequência de região variável é derivada de um anticorpo de camundongo e a sequência de região constante é derivada de um anticorpo humano.
[0073] Anticorpo “humanizado” refere-se a uma forma de anticorpo não humano (por exemplo, camundongo) que é uma imunoglobulina quimérica, cadeia de imunoglobulina ou um fragmento da mesma (por exemplo, Fv, Far, Fab", Fç(ap')2 OU outras subsequentes de ligação a antígeno de anticorpos), e contém sequências mínimas derivadas de imunoglobulinas não humanas. De preferência, oO anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) na qual os resíduos da região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo receptor são substituídos por resíduos da CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tendo a especificidade, a afinidade e a capacidade desejadas, tal como camundongo, rato, coelho.
[0074] Além disso, também é possível no processo de humanização fazer mutação os resíduos de aminoácidos nas regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL, melhorando assim uma ou mais de propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo. As mutações podem ser introduzidas, por exemplo, por mediação por PCR, o efeito das mutações na ligação de anticorpo ou outras propriedades funcionais pode ser avaliado usando ensaios in vitro ou in vivo, como descrito nesse documento. Tipicamente, mutações conservadoras são introduzidas. Tais mutações podem ser substituições, adições ou exclusões de aminoácidos. Além disso, o número de mutações nas CDRs é usualmente uma ou no máximo duas. Assim, os anticorpos humanizados da presente invenção também abrangem anticorpos compreendendo uma ou duas mutações de aminoácidos dentro das CDRs.
[0075] Como usado nesse documento, o termo “epítopo” refere-se a qualquer determinante antigênico em um antígeno ao qual o paratopo de um anticorpo se liga. Os determinantes epitópicos usualmente compreendem agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como, aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e tipicamente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga.
[0076] Como usado nesse documento, um domínio variável ou uma região variável é um domínio Ig específico da cadeia pesada ou leve de um anticorpo, compreendendo uma sequência de aminoácidos que varia entre diferentes anticorpos. Cada cadeia leve e cada cadeia pesada tem um domínio de região variável VL e VH, respectivamente. O domínio variável provê especificidade ao antígeno e, portanto, é responsável pelo reconhecimento do antígeno. Cada região variável compreende uma CDR e uma região estrutural (FR), em que a CDR é uma parte de um domínio do sítio de ligação a antígeno.
[0077] Como usado nesse documento, “domínio de ligação a antígeno” e “sítio de ligação a antígeno” são usados como sinônimos para se referir a um domínio dentro de um anticorpo que reconhece e interage fisicamente com um antígeno cognato. As moléculas de anticorpo convencionais nativas de comprimento total têm dois sítios de ligação a antígeno convencionais, cada um compreendendo uma porção da região variável da cadeia pesada e uma porção da região variável da cadeia leve. Os sítios convencionais de ligação a antígeno compreendem um enovelamento conectando as fitas beta antiparalelas no domínio da região variável. O sítio de ligação a antígeno pode compreender outras porções do domínio da região variável. Cada sítio de ligação a antígeno convencional compreende 3 regiões hipervariáveis da cadeia pesada e 3 regiões hipervariáveis da cadeia leve. As regiões hipervariáveis também são referidas como regiões determinantes da complementaridade (CDRs).
[0078] Como usado nesse documento, “região hipervariável”, “HV”, “região determinante de complementaridade” e “CDR” e “CDR de anticorpo” são usados de forma intercambiável para se referirem a uma dentre uma pluralidade de porções dentro de cada região variável que juntas formam um sítio de ligação a antígeno do anticorpo. Cada domínio de região variável contém 3 CDRs, designadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Por exemplo, o domínio da região variável da cadeia leve compreende 3 CDRs, designadas como CDR1 VL, CDR2 VL e CDR3 VL; o domínio da região variável da cadeia pesada compreende 3 CDRs, designadas como CDR1 VH, CDR2 VH e CDR3 VH. 3 CDRs na região variável são descontínuas ao longo da sequência linear de aminoácidos, mas estão muito próximas no polipeptídeo dobrado. As CDRs estão localizadas dentro do enovelamento que conecta a fita paralela da folha beta dos domínios variáveis. Como descrito nesse documento, um técnico no assunto está ciente e pode identificar CDRs com base na numeração de Kabat ou Chothia (ver, por exemplo,
Kabat, E.A. et al. (1991) sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health e Human Services, NIH Publication Nº 91-3242; e Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917).
[0079] Como usado nesse documento, uma região estrutural (FR) é um domínio em um domínio de região variável de anticorpo em uma folha beta; em termos de sequência de aminoácidos, a região FR é relativamente mais conservada do que a região hipervariável.
[0080] Como usado nesse documento, um domínio “região constante” é um domínio em uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos que é relativamente mais conservada do que a sequência de aminoácidos do domínio da região variável. Em uma molécula de anticorpo convencional de comprimento total, cada cadeia leve tem um único domínio da região constante da cadeia leve (CL), e cada cadeia pesada compreende um ou mais domínios da região constante da cadeia pesada (Cn), incluindo Cn, Cro, Crx3 e Cm. Os isotipos IgA, IgD e IgG de comprimento total compreendem Cn1, Chun, Crn3 E a região de dobradiça, enquanto IgE e IgM compreendem Cuni, Crn2, Cn3 E Cha. Os domínios Cm e Cz estendem o braço Fab da molécula de anticorpo, facilitando assim a interação com o antígeno e a rotação do braço do anticorpo. A região constante de um anticorpo pode desempenhar uma função efetora, por exemplo, mas não se limitando a, depuração de antígenos, patógenos e toxinas às quais o anticorpo se liga especificamente, tal como por interação com várias células, biomoléculas e tecidos.
[0081] Como usado nesse documento, uma região funcional de um anticorpo é uma porção de anticorpo compreendendo pelo menos VH, VL, Cr (por exemplo, Cn, Cmn2 Ou Cr3), Cr Ou um domínio da região de dobradiça ou pelo menos uma região funcional do mesmo do anticorpo.
[0082] Como usado nesse documento, uma região funcional de um domínio VH é pelo menos uma porção de um domínio VH intacto que retém pelo menos parte da especificidade de ligação de todo o domínio VH (por exemplo, retendo uma ou mais CDRs de todo o domínio VH), de modo que a região funcional do domínio VH se ligue ao antígeno sozinho ou em combinação com outro domínio de anticorpo (por exemplo, um domínio VL) ou uma região do mesmo. A região funcional de um domínio VH de exemplo é uma região compreendendo CDR1, CDR2 e/ou CDR3 do domínio VH.
[0083] Como usado nesse documento, uma região funcional de um domínio VL é pelo menos uma porção de um domínio VL intacto que retém pelo menos parte da especificidade de ligação de todo o domínio VL (por exemplo, retendo uma ou mais de CDRs de todo o domínio VL), de modo que a região funcional do domínio VL se ligue ao antígeno sozinho ou em combinação com outro domínio de anticorpo (por exemplo, um domínio VH) ou uma região do mesmo. A região funcional de um domínio VL de exemplo é uma região compreendendo CDR1, CDR2 e/ou CDR3 do domínio VL.
[0084] Como usado nesse documento, “ligar-se especificamente” ou “ligação imunoespecífica” com relação a um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é usado nesse documento de forma intercambiável e refere-se à capacidade de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno para formar uma ou mais ligações não covalentes com um aloantígeno através de interações não covalentes entre o anticorpo e o sítio de ligação a anticorpo do antígeno. O antígeno pode ser um antígeno isolado ou presente em uma célula tumoral. Tipicamente, um anticorpo que se liga imunoespecificamente (ou se liga especificamente) a um antígeno se liga ao antígeno com uma constante de afinidade Ka de cerca de 1 x 107 M! ou 1 x 10º M! ou mais (ou com uma constante de dissociação (Kd) de 1 x 107 M ou 1 x 10º M ou menos). As constantes de afinidade podem ser determinadas por métodos cinéticos padrão de respostas de anticorpos, por exemplo, imunoensaios, ressonância de plasmon de superfície (SPR) (Rich e Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599), calorimetria de titulação isotérmica (ITC) ou outros ensaios de interação cinética conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Paul, ed., Fundamental Immunology, 2º ed., Raven Press, Nova Iorque, páginas 332-336(1989); ver também Patente U.S. Nº 7.229.619, que descreve métodos de exemplo de SPR e ITC para calcular a afinidade de ligação de anticorpos). Instrumentos e métodos para detectar e monitorar a taxa de ligação em tempo real são conhecidos e estão disponíveis comercialmente (ver BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Suécia e GE Healthcare Life Sciences; Malmavist (2000) Biochem.Soc.Trans. 27:335).
[0085] Como usado nesse documento, o termo “competindo” com relação a um anticorpo significa que um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a um epítopo de uma maneira suficientemente semelhante a um segundo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e, portanto, o resultado da ligação do primeiro anticorpo ao epítopo do mesmo associado é detectavelmente reduzido na presença do segundo anticorpo em comparação àquele em ausência do segundo anticorpo; alternativamente, a ligação do segundo anticorpo ao epítopo associado do mesmo pode ser, mas não necessariamente, reduzida de forma detectável na presença do primeiro anticorpo em comparação àquele em ausência do primeiro anticorpo. Isto é, o primeiro anticorpo pode inibir a ligação do segundo anticorpo ao epítopo do mesmo, no entanto, o segundo anticorpo não é necessariamente para inibir a ligação do primeiro anticorpo ao seu epítopo correspondente. No entanto, no caso em que cada anticorpo pode inibir de maneira detectável a ligação de outro anticorpo ao epítopo ou ligando associado do mesmo, seja em um grau idêntico, superior ou inferior, os anticorpos são referidos como ligação “competitivamente cruzada” ao epítopo correspondente dos mesmos. os anticorpos concorrentes e cruzadamente concorrentes são abrangidos pela presente invenção. Independentemente do mecanismo de tal concorrência ou concorrência cruzada (por exemplo, impedimento estérico, alteração conformacional ou ligação a um epítopo comum ou um fragmento do mesmo), um técnico no assunto reconhecerá que, com base nos ensinamentos providos na presente invenção, que tais anticorpos concorrentes e/ou concorrentes cruzados são abrangidos pela presente invenção e podem ser usados nos métodos divulgados nesse documento.
[0086] Como usado nesse documento, “polipeptídeo” refere- se a dois ou mais de aminoácidos que são ligados covalentemente. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados nesse documento de forma intercambiável.
[0087] “Proteína isolada”, “polipeptídeo isolado” ou “anticorpo isolado” refere-se a uma proteína, um polipeptídeo ou um anticorpo: (1) que não é associada(o) a componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo; (2) é livre de outras proteínas da mesma espécie; (3) é expressada(o) por uma célula de uma espécie diferente; Ou (4) não ocorre na natureza. Assim, um polipeptídeo que é sintetizado ou quimicamente sintetizado em um sistema celular diferente da célula da qual se origina naturalmente será “isolado” de seus componentes naturalmente associados. Uma proteína também pode ser tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados por isolamento, isto é, usando a técnica de purificação de proteínas bem conhecida na técnica.
[0088] Substituições de aminoácidos conservativas adequadas em peptídeos ou proteínas são conhecidas por um técnico no assunto e geralmente podem ser realizadas sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Tipicamente, um técnico no assunto reconhecerá que uma única substituição de aminoácidos em uma região não essencial de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4º Edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub.co., p.224).
[0089] Como usado nesse documento, os termos “polinucleotídeo” e “molécula de ácido nucleico” referem-se a um oligômero ou polímero compreendendo pelo menos dois nucleotídeos ou derivados de nucleotídeos ligados, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA), que geralmente são ligados por uma ligação fosfodiéster.
[0090] Como usado nesse documento, uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico que é isolada de outras moléculas de ácido nucleico presentes na fonte natural da molécula de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico “isolada” de, por exemplo, uma molécula de CDNA, pode ser substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando preparada por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros componentes químicos durante a síntese química. Moléculas de ácido nucleico isoladas de exemplo providas nesse documento incluem moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno providos.
[0091] “Idêntico” ou “identidade” em relação à uma sequência tem um significado bem reconhecido na técnica, e a porcentagem de identidade de sequência entre duas moléculas ou regiões de ácido nucleico ou polipeptídeo pode ser calculada usando as técnicas divulgadas. A identidade da sequência pode ser medida ao longo de todo o comprimento de um polinucleotídeo ou polipeptídeo ou ao longo de uma região da molécula. (Ver, por exemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nova Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991). Embora existam muitos métodos para medir a identidade entre dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, o termo “identidade” é bem conhecido por um técnico no assunto (Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48:1073(1988)).
[0092] Como usado neste documento, “operacionalmente ligado” em relação a uma sequência de ácidos nucleicos, uma região, um elemento ou um domínio significa que as regiões de ácido nucleico estão funcionalmente relacionadas entre si. Por exemplo, um promotor pode ser operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que permite ao promotor regular ou mediar a transcrição do ácido nucleico.
[0093] Como usado nesse documento, “expressão” refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido por transcrição e tradução de um polinucleotídeo. O nível de expressão de um polipeptídeo pode ser avaliado usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, métodos para determinar a quantidade de polipeptídeos produzidos de uma célula hospedeira. Tais métodos podem incluir, mas não se limitam à, quantificação de polipeptídeos em lisados celulares por ELISA, coloração com azul de Coomassie após eletroforese em gel, ensaios de proteína Lowry e ensaios de proteína Bradford.
[0094] Como usado nesse documento, uma “célula hospedeira” refere-se a uma célula usada para receber, manter, replicar e amplificar um vetor. As células hospedeiras também podem ser usadas para expressar o polipeptídeo codificado pelo vetor. O ácido nucleico contido no vetor se replica quando a célula hospedeira se divide, amplificando o ácido nucleico. As células hospedeiras podem ser células eucarióticas ou procarióticas. As células hospedeiras adequadas incluem, mas não se limitam a, células CHO, várias células COS, células HeLa, células HEK, tais como células HEK 293.
[0095] “Otimização de códon” refere-se a um método para modificar uma sequência de ácidos nucleicos para expressão intensificada em uma célula hospedeira de interesse, substituindo pelo menos um códon (por exemplo, cerca de ou mais que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 ou mais códons) da sequência nativa com códons que são usados com mais frequentemente ou com mais frequência nos genes da célula hospedeira enquanto mantém a sequência de aminoácidos nativa. Várias espécies exibem viés particular para certos códons de um aminoácido particular. A preferência por códons (uma diferença no uso de códons entre organismos) usualmente se correlaciona com a eficiência da tradução do RNA mensageiro (mMRNA), que por sua vez acredita-se ser dependente das “propriedades dos códons sendo “traduzidos e da disponibilidade de moléculas de RNA de transferência específica (tRNA). A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados com mais frequência na síntese de peptídeos. Por conseguinte, os genes podem ser adaptados para a expressão ideal de genes em um determinado organismo com base na otimização de códons. As tabelas de uso de códons estão prontamente disponíveis, por exemplo, no Banco de Dados do Uso de Códons disponível em www.kazusa.orjp/codon/, e essas tabelas podem ser adaptadas de diferentes maneiras. Ver Nakamura Y. et al., “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.” Nucl.Acids Res., 28:292(2000).
[0096] Como usado nesse documento, um “vetor” é um ácido nucleico replicável e quando um vetor é transformado em uma célula hospedeira adequada, uma ou mais proteínas heterólogas podem ser expressadas a partir do vetor. O vetor como usado nesse documento inclui o vetor no qual um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou um fragmento do mesmo pode ser introduzido, tipicamente, por digestão e ligação por restrição. O vetor como usado nesse documento também inclui o vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. O vetor é usado para introduzir um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo em uma célula hospedeira, para amplificar o ácido nucleico, ou para expressar/exibir um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico. O vetor tipicamente permanece livre, mas pode ser projetado para integrar o gene ou uma parte do mesmo no cromossomo do genoma. Os vetores de cromossomos artificiais, tais como vetores artificiais de levedura e cromossomos artificiais de mamíferos, também são levados em consideração. A seleção e o uso de tais veículos são bem conhecidos de um técnico no assunto.
[0097] Como usado nesse documento, os vetores também incluem “vetores virais” ou “vetores de vírus". O vetor do vírus é um vírus manipulado, que pode ser operacionalmente ligado a um gene exógeno para transferir (como um veículo ou transporte) o gene exógeno para uma célula.
[0098] Como usado nesse documento, um “vetor de expressão” inclui um vetor capaz de expressar DNA, que pode ser operacionalmente ligado a uma sequência reguladora, tal como uma região promotora, que é capaz de afetar a expressão de tais fragmentos de DNA. Tais fragmentos adicionais podem incluir sequências de promotores e terminadores e, opcionalmente, podem incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um intensificador, um sinal de poliadenilação, etc. Os vetores de expressão geralmente são derivados de plasmídeo ou DNA viral, ou podem conter elementos de ambos. Assim, um vetor de expressão refere-se a um construto de DNA ou RNA recombinante, tal como, um plasmídeo, fago, vírus recombinante ou outro vetor que, quando introduzido em uma célula hospedeira adequada, resulta na expressão do DNA clonado. Os vetores de expressão adequados são bem conhecidos de um técnico no assunto e incluem vetores de expressão que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas, e vetores de expressão que retêm vetores livres ou de expressão que são integrados no genoma de uma célula hospedeira.
[0099] Como usado nesse documento, “tratar” um indivíduo tendo uma doença ou condição significa que os sintomas do indivíduo são parcialmente ou totalmente aliviados ou inalterados após o tratamento. Assim, o tratamento inclui prevenir, tratar e/ou curar. Prevenir refere-se à prevenção de doenças subjacentes e/ou prevenção de agravamento dos sintomas ou progressão da doença. O tratamento também inclui qualquer uso farmacêutico de qualquer um dos anticorpos providos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos e as composições providas nesse documento.
[00100] Conforme usado nesse documento, “efeito terapêutico” refere-se a um efeito causado pelo tratamento em um indivíduo que altera, geralmente melhora ou aprimora os sintomas de doenças ou condições, ou cura doenças ou condições.
[00101] Como usado nesse documento, “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “dose terapeuticamente eficaz”
refere-se a uma quantidade de uma substância, um composto, um material ou uma composição compreendendo o composto que é pelo menos suficiente para produzir um efeito terapêutico quando administrado a um indivíduo. Assim, é uma quantidade essencial para prevenir, curar, melhorar, bloquear ou bloquear parcialmente os sintomas de uma doença ou condição.
[00102] Como usado nesse documento, “quantidade profilaticamente eficaz” ou “dose profilaticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de uma substância, um composto, um material ou uma composição compreendendo o composto que exerce o efeito profilático desejado quando administrado a um indivíduo, por exemplo, para impedir ou retardar o início ou a recorrência de uma doença ou um sintoma, reduzir a probabilidade de ocorrência ou recorrência de uma doença ou um sintoma. A dose eficaz completa dos profiláticos não ocorre necessariamente pela administração de uma dose e pode ocorrer após a administração de uma série de doses. Assim, uma quantidade profilaticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais de administrações.
[00103] Como usado aqui, o termo “paciente” refere-se a um mamífero, como humano.
[00104] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDR da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2-4, 12-14, 22-24, 32-34, 42-44, 52- 54, 62-64, 72-74, 82-84, 92-94, 102-104, 112-114, 122-124, 132-134, 142-144, 152-154, 162-164, 172-174, 177-179, 1827 184, 187-189, 192-194, 197-199, 202-204, 207-209 ou qualquer variante das mesmas, e/ou uma CDR da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 7-9, 17-19, 27-29,
37-39, 47-49, 57-59, 67-69, 77-79, 87-89, 97-99, 107-109, 117-119, 127-129, 137-139, 147-149, 157-159, 167-169, 212- 214, 217-219, 222-224, 227-229 ou qualquer variante das mesmas.
[00105] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDR1l da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 177, 182, 187, 192, 197, 202, 207 ou qualquer variante das mesmas, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208 ou qualquer variante das mesmas, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 179, 184, 189, 194, 199, 204, 209 ou qualquer variante das mesmas; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 212, 217, 222, 227 ou qualquer variante das mesmas, uma CDR2 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 8, 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138, 148, 158, 168, 213, 218, 223, 228 ou qualquer variante das mesmas, e uma CDR3 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 9, 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 214, 219, 224, 229 ou qualquer variante das mesmas.
[00106]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 206 ou qualquer variante das mesmas e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 211, 216, 221, 226 ou qualquer variante das mesmas.
[00107] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9.
[00108]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 18, e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 19.
[00109] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDR1I da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 22, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 23, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 24; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 27, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 28, e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 29.
[00110]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 32, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 33, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 34; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 37, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 38, e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 39.
[00111] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlIl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 42, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 43, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 44; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 47, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 48, e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 49.
[00112]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 52, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 53, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 54; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 57, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 58 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 59.
[00113] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 62, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 63, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 64; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 67, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 68 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 69.
[00114] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 72, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 73, e uma
CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 74; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 77, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 78 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 79.
[00115]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 82, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 83, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 84; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 87, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 88 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 89.
[00116]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 92, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 93, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9; e/ou uma CDRl da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 97, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 98 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 99.
[00117] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 102, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 103, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 104; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 107, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 108 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 109.
[00118]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 112, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 113, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 114; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 117, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 118 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 119.
[00119]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 122, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 123, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 124; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 127, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 128 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 129.
[00120] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 132, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 133, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 134; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 137, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 138 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 139.
[00121]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 142, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 143, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 144; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 147, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 148 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 149.
[00122]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 152, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 153, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 154; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 157, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 158 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 159.
[00123] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 162, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 163, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 164; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 167, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 168 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 169.
[00124]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 172, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 173, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 174; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 212, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 213 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 214.
[00125]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlIl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 182, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 183, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 184; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 212, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 213 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 214.
[00126]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 187, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 188, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 189; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 212, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 213 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 214.
[00127] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 192, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 193, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 194; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 212, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 213 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 214.
[00128]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 197, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 198, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 212, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 213 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 214.
[00129] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 202, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 203, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 204; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 212, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 213 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 214.
[00130] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 207, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 208, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 209; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 212, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos
SEQ ID NO: 213 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 214.
[00131] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 172, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 173, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 174; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 217, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 218 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 219.
[00132] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 177, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 178, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 179; e/ou uma CDRl da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 217, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 218 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 219.
[00133] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 182, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 183, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 184; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 217, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 218 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 219.
[00134] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 187, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 188, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 189; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 217, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 218 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 219.
[00135]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 192, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 193, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 194; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 217, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 218 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 219.
[00136]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 197, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 198, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 217, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 218 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 219.
[00137] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 202, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 203, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 204; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 217, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 218 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 219.
[00138]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 207, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 208, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 209; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 217, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 218 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 219.
[00139]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDR1I da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 172, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 173, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 174; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 222, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 223 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 224.
[00140] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 177, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 178, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 179; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 222, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 223 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 224.
[00141] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlIl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 182, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 183, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 184; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 222, uma
CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 223 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 224.
[00142] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 187, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 188, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 189; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 222, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 223 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 224.
[00143] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 192, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 193, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 194; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 222, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 223 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 224.
[00144] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 197, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 198, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 222, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 223 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 224.
[00145]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRlI da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 202, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 203, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 204; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 222, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 223 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 224.
[00146]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 207, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 208, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 209; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 222, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 223 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 224.
[00147] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 172, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 173, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 174; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 227, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 228 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229.
[00148]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 177, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 178, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 179; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 227, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 228 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229.
[00149]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 182, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 183, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 184; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 227, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 228 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229.
[00150]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 187, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 188, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 189; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 227, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 228 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229.
[00151]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 192, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 193, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 194; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 227, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 228 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229.
[00152] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 197, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 198, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 227, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 228 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229.
[00153]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 202, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 203, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 204; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 227, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 228 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229.
[00154]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma CDRl da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 207, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 208, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 209; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 227, uma CDR2 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 228 e uma CDR3 da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229.
[00155]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou qualquer variante da mesma,
e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6 ou qualquer variante da mesma.
[00156]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16 ou qualquer variante da mesma.
[00157] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 21 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 26 ou qualquer variante da mesma.
[00158]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 31 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 36 ou qualquer variante da mesma.
[00159]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 41 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 46 ou qualquer variante da mesma.
[00160]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 51 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 56 ou qualquer variante da mesma.
[00161]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 61 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 66 ou qualquer variante da mesma.
[00162]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 71 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 76 ou qualquer variante da mesma.
[00163] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 81 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 86 ou qualquer variante da mesma.
[00164]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 91 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 96 ou qualquer variante da mesma.
[00165]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 101 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 106 ou qualquer variante da mesma.
[00166]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 111 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 116 ou qualquer variante da mesma.
[00167] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 111 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 116 ou qualquer variante da mesma.
[00168]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 121 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 126 ou qualquer variante da mesma.
[00169]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 131 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 136 ou qualquer variante da mesma.
[00170] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 141 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 146 ou qualquer variante da mesma.
[00171] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 151 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 156 ou qualquer variante da mesma.
[00172]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 161 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 166 ou qualquer variante da mesma.
[00173] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 171 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[00174]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 176 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[00175]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 181 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[00176]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 186 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[00177]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 191 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[00178]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 196 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[00179] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 201 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[00180] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 206 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
[00181] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 171 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[00182] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 176 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[00183] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 181 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[00184]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 186 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[00185]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 191 ou qualquer variante da mesma,
e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[00186]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 196 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[00187] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 201 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[00188]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 206 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
[00189]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 171 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[00190] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 176 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[00191] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 181 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[00192]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 186 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[00193] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 191 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[00194]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 196 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[00195]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 201 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[00196]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 206 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
[00197] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 171 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 226 ou qualquer variante da mesma.
[00198]EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 176 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 226 ou qualquer variante da mesma.
[00199] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 181 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 226 ou qualquer variante da mesma.
[00200] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 186 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 226 ou qualquer variante da mesma.
[00201] EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 191 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 226 ou qualquer variante da mesma.
[00202]EM um aspecto, a divulgação refere-se à um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 196 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 226 ou qualquer variante da mesma.
[00203] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 201 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 226 ou qualquer variante da mesma.
[00204] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 206 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 226 ou qualquer variante da mesma.
[00205] EM um aspecto, a divulgação refere-se a um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 206 ou qualquer variante das mesmas e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 211, 216, 221, 226 ou qualquer variante das mesmas.
[00206]EM um aspecto, a divulgação refere-se a uma sequência isolada de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento funcional ou variante da mesma, como divulgado nesse documento, um construto de vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou uma porção de ligação a IL-4 e/ou IL-13 do fragmento funcional do anticorpo da presente invenção, uma célula hospedeira contendo o vetor e uma tecnologia recombinante para a produção de polipeptídeos.
[00207] Em um aspecto, a divulgação inclui adicionalmente kits, por exemplo, os kits compreendem os anticorpos e fragmentos, homólogos e derivados dos mesmos, etc. da divulgação, tais como, conjugados rotulados ou citotóxicos, e instruções para uso do anticorpo, conjugados que matam certos tipos de células, etc. As instruções podem compreender orientações para o uso in vitro, in vivo ou ex vivo dos anticorpos e dos conjugados, etc. O anticorpo pode estar na forma líquida ou na forma sólida, tipicamente em uma forma liofilizada. O kit pode conter outros agentes adequados como tampões, soluções de reconstituição e outros ingredientes essenciais para o uso pretendido. A combinação acondicionada com quantidades predeterminadas de agentes e instruções para uso é contemplada, em que o uso é, por exemplo, para uso terapêutico ou para a realização de ensaios de diagnóstico. Onde o anticorpo é rotulado, por exemplo, rotulado com uma enzima, o kit pode compreender um substrato e um cofator necessário para a enzima (por exemplo, um precursor de substrato que provê um cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, outros aditivos, tais como estabilizadores e tampões (por exemplo, tampões de bloqueio ou tampões de lise) também podem ser compreendidos. As quantidades relativas dos vários agentes podem ser variadas para prover um concentrado da solução do agente, que provê flexibilidade ao usuário, economia de espaço, economia de agentes etc. Esses agentes também podem ser providos na forma de pó seco, tipicamente na forma liofilizada, incluindo excipientes que, quando dissolvidos, provêm uma solução de agente com uma concentração apropriada.
[00208] Os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento de mamíferos. Em uma modalidade, por exemplo, um anticorpo de interesse ou equivalente é administrado a um mamífero não humano com a finalidade de obter dados pré- clínicos. Mamíferos não humanos de exemplo a serem tratados incluem primatas não humanos, cães, gatos, roedores e outros mamíferos, nos quais são realizados estudos pré-clínicos. Tais mamíferos podem ser usados para estabelecer modelos animais para uma doença a ser tratada com o anticorpo ou podem ser usados para estudar a toxicidade do anticorpo de interesse. Em cada uma dessas modalidades, os estudos de escalonamento de dose podem ser realizados no mamífero.
[00209] O anticorpo, com ou sem um segundo componente (tal como um componente de agente terapêutico conjugado ao mesmo), pode ser usado como um agente terapêutico, sozinho ou em combinação com um fator citotóxico. A presente invenção refere-se a terapias baseadas em anticorpos que compreendem administrar os anticorpos da presente invenção a um animal, mamífero ou humano para tratar uma doença, um distúrbio ou uma condição mediada(o) por IL-4 e/ou IL-13.
[00210] O termo “tratando/tratamento/tratar”, como usado na presente invenção, refere-se a tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Refere-se à prevenção, cura, reversão, atenuação, melhoria, minimização, inibição ou interrupção dos efeitos nocivos do estado da doença, da progressão da doença, dos fatores causadores de doenças (por exemplo, bactérias ou vírus) ou outras condições anormais.
[00211] Por conseguinte, a presente invenção também abrange anticorpos multivalentes, incluindo anticorpos biespecíficos anti-IL-4/IL-13 que têm moléculas efetoras, átomos ou outras substâncias com funções diagnósticas Ou terapêuticas anexadas. Por exemplo, um anticorpo pode ter uma etiqueta radiodiagnóstica ou um átomo citotóxico radioativo ou uma substância de metal ou citotóxica, tal como uma cadeia da ricina, que são anexados ao anticorpo para diagnóstico in vivo ou tratamento de câncer.
[00212] Além disso, os anticorpos da presente invenção também podem ser usados em imunoensaios, métodos de purificação e outros “métodos nos quais são usadas imunoglobulinas ou fragmentos dos mesmos. Tais usos são bem conhecidos na técnica.
[00213] Por conseguinte, a presente invenção também provê composições compreendendo o anticorpo anti-IL-13 e/ou anti- IL-4 ou um fragmento do mesmo da presente invenção, em que o anticorpo é convenientemente combinado com carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, que são um meio comum na técnica.
[00214]O0 termo “composição farmacêutica”, como usado nesse documento, refere-se a formulações de várias preparações. As formulações contendo quantidades terapeuticamente eficazes de anticorpos multivalentes são soluções líquidas estéreis, suspensões líquidas ou formas liofilizadas e, opcionalmente, contêm estabilizadores ou excipientes.
[00215] Como usado nesse documento, o termo “distúrbio” refere-se a qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com o anticorpo da presente invenção. Isso inclui distúrbios ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem um mamífero, especialmente um humano, ao distúrbio. Exemplos de distúrbios não limitativos a serem tratados nesse documento incluem câncer, inflamação, doenças autoimunes, infecções doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, doenças neurológicas e doenças metabólicas.
[00216]Os anticorpos da presente invenção podem ser usados para tratar, inibir ou prevenir doenças, tais como, doenças alérgicas, doenças mediadas por Th2, doenças mediadas por IL-13, doenças mediadas por IL-4 e/ou doenças mediadas por IL-4/IL-13. Exemplos de tais doenças incluem doença de Hodgkin, asma, asma alérgica, dermatite atópica, alergia atópica, colite ulcerativa, esclerodermia, rinite alérgica, fibrose pulmonar idiopática da DPOC3, rejeição crônica de transplante, fibrose pulmonar induzida por bleomicina, fibrose pulmonar induzida por radiação, granuloma pulmonar, esclerose sistêmica progressiva, esquistossomose, fibrose do fígado, câncer de rim, linfoma de Burkitt, doença de Hodgkin, doença não-Hodgkin, síndrome de Sézary, asma, artrite séptica, dermatite semelhante a herpes, urticária idiopática crônica, colite ulcerativa, esclerodermia, cicatriz hipertrófica, doença de Whipple, hiperplasia prostática benigna, um distúrbio pulmonar no qual o receptor de IL-4 atua, uma condição na qual o receptor de IL-4 medeia a ruptura da barreira epitelial, um distúrbio do sistema digestivo no qual o receptor de IL-4 atua, respostas alérgicas a fármacos, Doença de Kawasaki, doença das células falciformes, síndrome de Churg-Strauss, doença de Grave, pré-eclâmpsia, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativa autoimune, anemia hemolítica autoimune, esôfago de Barrett, uveíte autoimune, tuberculose, fibrose cística, doença fúngica broncopulmonar alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença e fibrose do pulmão induzida por bleomicina, proteinose alveolar pulmonar, síndrome da angústia respiratória do adulto, sarcaidose, síndrome de hiper IgE, síndrome hipereosinofílica idiopática, doença vesical autoimune, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso, miastenia gravis, síndrome de fadiga crônica e doença renal.
[00217]0 termo “doença alérgica” refere-se a uma condição patológica na qual um paciente é hipersensível e tem uma resposta imune a uma substância que normalmente não é imunogênica. Uma característica geral das doenças alérgicas é que a IgE ativa os mastócitos e causa respostas inflamatórias (por exemplo, respostas locais, respostas sistêmicas), nas quais essas respostas podem levar a sintomas benignos, tal como coriza, e também podem levar a choque anafilático com risco de vida e morte. Exemplos de doenças alérgicas incluem, mas não se limitam a, rinite alérgica (por exemplo, polinose), asma (por exemplo, asma alérgica), dermatite alérgica (por exemplo, eczema), dermatite de contato, alergia alimentar e urticária (colmeia).
[00218] Conforme usado nesse documento, “doença mediada por Th2” refere-se a uma doença cuja patologia é (total ou parcialmente) causada por uma resposta imune (resposta imune do tipo Th2) regulada por células linfoides Th2T CD4+, e que é caracterizada por a formação de IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. As respostas imunes do tipo Th2 estão associadas à produção de certas citocinas (por exemplo, IL-4, IL-13) e certas classes de anticorpos (por exemplo, IgE) e imunidade humoral. As doenças mediadas por Th2 são caracterizadas pela presença de níveis elevados de citocinas Th2 (por exemplo, IL-4, IL- 13) e/ou certas classes de anticorpos (por exemplo, IgE) e incluem, por exemplo, doenças alérgicas (por exemplo, rinite alérgica, dermatite idiopática, asma (tal como asma idiopática), doença alérgica das vias aéreas (ÀD), choque anafilático e conjuntivite), distúrbios autoimunes associados a níveis elevados de IL-4 e/ou IL-13 (por exemplo, artrite reumatoide, doença do enxerto contra hospedeiro, doença do rim (por exemplo, síndrome nefrótica, nefrite por lúpus)) e infecções associadas a níveis elevados de IL-4 e/ou IL-13 (por exemplo, vírus, parasitas, fungos (tal como infecção por (C. albicans)). Alguns cânceres são associados a níveis elevados de IL-4 e/ou IL-, ou à proliferação de células cancerígenas induzida por IL-4 e/ou IL-13 (por exemplo, linfoma de células B, linfoma de células T, mieloma múltiplo, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama e câncer de ovário). Estes cânceres podem ser tratados, inibidos ou prevenidos com o gaud Ii da presente invenção.
[00219]O termo “câncer”, usado na presente invenção, refere-se ou descreve a condição fisiológica de um mamífero, especialmente humano, que é tipicamente caracterizado pelo crescimento descontrolado e não regulado de células. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia.
[00220]O termo “doença(s) autoimune(s)”, como usado nesse documento, refere-se a uma doença ou um distúrbio não maligna(o) decorrente e direcionado contra os tecidos de um indivíduo. Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas não se limitam a, respostas inflamatórias, tal como dermatose inflamatória, incluindo psoríase e dermatite; condições alérgicas, tal como eczema e asma; outros sintomas envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose, diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus tipo I ou diabetes mellitus dependente de insulina); esclerose múltipla e distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central.
[00221] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados como composições para administração isolada ou podem ser usados em combinação com outros agentes ativos. Os anticorpos podem ser usados em uma terapia combinada com as terapias existentes com IL-13 (por exemplo, agentes ativos existentes de IL-13, tal como anti-IL-13Ral, IL-4/13Trap, anti-IL-13) mais anticorpos anti-IL-4, bem como agentes ativos de IL-4 existentes (por exemplo, proteína mutante anti-IL-4R, IL-4, IL-4/13Trap) mais anticorpo anti-IL-13 e anticorpo IL-4 (por exemplo, WO 05/0076990 (CAT), WO 03/092610 (Regeneron), WO 00/64944 (Genetic Inst.) e WO 2005/062967 (Tanox)).
[00222]UM ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00223]UM vetor compreendendo o ácido nucleico de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00224] Uma célula que compreende o vetor de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00225]UMa composição farmacêutica compreendendo O anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou o ácido nucleico que codifica o mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00226] UM método para tratamento de doenças alérgicas em um mamífero, compreendendo a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou o ácido nucleico que codifica o mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00227] Um método para tratamento de doenças alérgicas em um mamífero, compreendendo a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou o ácido nucleico que codifica o mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00228] Um método para tratamento de câncer, compreendendo a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou do ácido nucleico que codifica o mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00229]UM método para tratar a asma em um mamífero, compreendendo a etapa de administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou do ácido nucleico que codifica o mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00230]UM método para tratar doenças associadas à produção anormal de IL4 e/ou IL-13 em um mamífero, compreendendo a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou do ácido nucleico que codifica o mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00231] UM método para inibir uma resposta mediada por TH-2 em um mamífero, compreendendo a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento funcional do mesmo, ou do ácido nucleico que codifica o mesmo de qualquer um dos aspectos precedentes.
[00232] Como usado nesse documento, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” pretende incluir todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento isotônicos e de absorção, etc., que sejam compatíveis com a administração farmacêutica. Carreadores adequados são descritos na edição mais recente da Remington's Pharmaceutical Sciences, um texto de referência padrão no campo, que é incorporado nesse documento por referência. Exemplos preferidos de tais veículos ou diluentes incluem, mas não se limitam a, água, solução salina, soluções de Ringer, solução de dextrose e albumina sérica humana a 5%. Também podem ser usados lipossomas e carreadores não aquosos, como óleos fixados. O uso de tais meios e agentes com substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o anticorpo, é contemplado o uso do mesmo nas composições.
[00233] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
[00234] As composições farmacêuticas das modalidades são formuladas para serem compatíveis com a via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração parentérica, tais como administrações intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (isto é, tópica), transmucosa e retal. As soluções ou suspensões usadas para administração parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: diluentes estéreis para injeção, tais como, água, solução salina, óleo fixo, polietilenoglicóis glicerol, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como, álcool benzílico Ou metil parabenos; antioxidantes, tais como, ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ; tampões, tais como, acetatos, citratos e fosfatos; e agentes para o ajuste da pressão osmótica, tal como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com um ácido ou uma base, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A formulação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos para doses múltiplas de vidro ou plástico.
[00235] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (solúveis em água nesse documento) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intravenosa, carreadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL" (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista facilidade de escoabilidade na seringa. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido, etc.) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, etc. Em muitos casos, pode ser preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como, manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00236] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o anticorpo ou os anticorpos na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o anticorpo ou os anticorpos em um carreador estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dentre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são secagem a vácuo e liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução filtrada estéril dos ingredientes acima.
[00237] Para administração por inalação, o composto é dispensado na forma de um spray de aerossol a partir de um recipiente pressurizado ou dispensador ou nebulizador, que contém um propelente adequado, tal como dióxido de carbono.
[00238] Administração sistêmica também pode ser realizada por meios transmucosais ou transdérmicos. Para administração transmucosal ou transdérmica, são usados na formulação penetrantes apropriados para a permeação na barreira. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, administração transmucosa, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusídico. A administração transmucosal pode ser realizada através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, um ou mais dos anticorpos podem ser formulados em pomadas, bálsamos, géis ou cremes, tais como geralmente conhecidos na técnica.
[00239] Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositórios convencionais, como manteiga de cacau e outros glicerídeos ou enemas de retenção para dispensação retal.
[00240] EM uma modalidade, os anticorpos podem ser preparados com carreadores que protegerão os anticorpos contra a rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação prolongada/liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de dispensação microencapsulados. Podem ser usados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como etileno-acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para uma pessoa habilitada na técnica.
[00241] Por exemplo, esses ingredientes ativos podem ser encapsulados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por métodos de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli (metilmetacrilato), respectivamente em sistemas de dispensação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões.
[00242] Uma formulação de liberação prolongada pode ser preparada. Exemplos de formulações adequadas de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo os anticorpos, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2- hidroxietilmetilpropionato) ou poli (álcool vinílico)), polilactida (Patente US Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido lático degradável-ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT'Y (microesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros, tais como, etileno-acetato de vinila e ácido lático-ácido glicólico permitem a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos mais curtos.
[00243] As suspensões lipossomais (incluindo lipossomas direcionados para células infectadas com anticorpos monoclonais contra antígenos virais) também podem ser usadas como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, métodos descritos na Pat. US Nº 4.522.811.
[00244] É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem como usada nesse documento refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de um ou mais dos anticorpos calculados para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com os carreadores farmacêuticos necessários. As especificações para as formas de unidade de dosagem das modalidades são ditadas e diretamente dependentes: das características únicas dos anticorpos e do efeito terapêutico específico a ser alcançado; e as limitações inerentes à técnica de formulação de tais anticorpos para os indivíduos em tratamento.
[00245] A composição farmacêutica pode ser colocada em um recipiente, uma embalagem ou um dispensador juntamente com instruções para administração.
[00246] A formulação contida nesse documento também pode conter mais de um anticorpo, como necessário para a indicação particular a ser tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente. Alternativamente, ou além disso, a composição pode compreender um agente que intensifica sua função, tal como, um agente citotóxico, citocina, agente quimioterapêutico ou agente inibidor de crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.
[00247] EM uma modalidade, um ou mais dos anticorpos pode (m) ser administrado(s) em uma terapia combinada, isto é, em combinação com outros agentes, tais como, agentes terapêuticos (que podem ser usados para tratar condições ou distúrbios patológicos, tais como, várias formas de câncer, distúrbios autoimunes e distúrbios inflamatórios). O termo “em combinação com”, como usado nesse documento, refere-se a agentes administrativos substancialmente simultaneamente, simultaneamente ou sequencialmente. se administrado sequencialmente, o primeiro composto de dois compostos é ainda preferencialmente detectado a uma concentração eficaz no local de tratamento após o início da administração do segundo composto.
[00248] Por exemplo, uma terapia de combinação pode compreender um ou mais de anticorpos descritos nesse documento que são coformulados e/ou coadministrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (por exemplo, uma ou mais citocinas e inibidores de fator de crescimento, imunossupressores, agentes anti-inflamatórios, inibidores metabólicos, inibidores de enzimas e/ou citotoxina Ou agentes citostáticos, como descrito em mais detalhes abaixo). Tais terapias de combinação podem utilizar vantajosamente dosagens mais baixas dos agentes terapêuticos administrados, evitando assim possíveis toxicidades Ou complicações associadas às várias monoterapias.
[00249] Os agentes terapêuticos preferidos para uso em combinação com os anticorpos descritos nesse documento são aqueles que interferem nos diferentes estágios da resposta inflamatória. Em uma modalidade, um ou mais de anticorpos descritos nesse documento pode(m) ser coformulado(s) e/ou coadministrado(s) com um ou mais de agentes adicionais, tais como, outras citocinas ou antagonistas do fator de crescimento (por exemplo, receptores solúveis, inibidores de peptídeos, moléculas pequenas, fusões de ligantes); ou anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a outras citocinas ou fatores de crescimento, receptores dos mesmos ou outras moléculas da superfície celular); e citocinas anti- inflamatórias ou agonistas das mesmas.
[00250] Em outras modalidades, os anticorpos descritos nesse documento são usados como adjuvantes de vacina para distúrbios autoimunes, doenças inflamatórias, etc. Combinações de adjuvantes para tratar esses tipos de distúrbios são adequadas para uso em combinação com vários antígenos, em que os antígenos são derivados dos autoantígenos direcionados, isto é, autoantígenos envolvidos na autoimunidade, tal como proteína básica de mielina; autoantígenos inflamatórios, tal como proteína peptídica amiloide; ou antígenos de transplante, tais como aloantígenos. Os antígenos podem incluir peptídeos Ou polipeptídeos derivados de proteínas e fragmentos de qualquer um dos seguintes: açúcares, proteínas, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos, autoantígenos, proteínas peptídicas amiloides, antígenos de transplante, alérgenos ou outros componentes macromoleculares. Em alguns exemplos, mais de um antígeno é compreendido de uma composição antigênica.
[00251] Para fins de clareza e descrição concisas, os recursos são descritos nesse documento como parte das mesmas ou de modalidades separadas, no entanto, deve ser entendido que o escopo da presente invenção pode incluir algumas modalidades tendo combinações de todos ou alguns dos recursos descritos.
Modalidades
1. Expressão recombinante da proteína da região extracelular de IL-4RM em células eucarióticas
[00252] É sintetizado um gene de plasmídeo AgHO1-pUC57- Amp (SynbioTech) contendo uma região extracelular de IL-4Ra humana (Uniprot P24394, 26-232). Usando este plasmídeo como molde, 5" -ctgagaggtgccagatgtatgâggtgctgcag-3" como o iniciador a montante e 5" -tceegectecegecgetagegtgetgetegàâggg- 3'” como o iniciador a jusante, o fragmento extracelular de IL-4Ra humano é amplificado por PCR. Os produtos amplificados são ligados usando o Master Mix NEBuilder HiFi DNA Assembly (NEB, Cat: MOS530L) e clonados em um sistema de plasmídeo de expressão eucariótica construído internamente (uma proteína de fusão com uma etiqueta his c-terminal 6 x). De forma similar, a sequência de DNA que codifica uma região extracelular de IL-4Ra de cinomolgo (Uniprot Q6JHZ9, 24-231) é clonada no sistema de plasmídeo de expressão eucariótica usando um plasmídeo sintético AgCcCO01-pUC57-Amp como um molde. O gene que codifica a IL-4 humana (Uniprot PO5112, 25-153) é clonado no sistema do plasmídeo de expressão eucariótica usando um plasmídeo sintético Agll04-PUC5S7-Amp como um molde. O gene que codifica IL13Ral humano (Uniprot P78552, 27-343) é clonado no sistema de plasmídeo de expressão eucariótica usando um plasmídeo de clonagem de cDNA da IL13Ral adquirido (Sino Biological, Cat: HG10943-M) como um molde. Após a transfecção das células HEK293-6E com esses plasmídeos por 7 dias, o sobrenadante da cultura é coletado e purificado por uma coluna de níquel-quelato para obter proteínas recombinantes da região extracelular humana da IL- 4RM (hIL-4RM), região extracelular do cinomolgo IL-4Ra (cynoIL-4RMa), região extracelular de IL-13Ral humana (hIL- 13Ral) e IL-4 humana (hIL-4).
[00253] Os resultados são mostrados nas Figuras 1A, 1B, 1C e 1D, mostrando que o tamanho das proteínas das regiões extracelulares de IL-4Ra humana e de cinomolgo é de cerca de 40 kDa; o tamanho da proteína da região extracelular de IL- 13Ral humana é de cerca de 55 kDa; e o tamanho da proteína da IL-4 humana é de cerca de 20 kDa.
2. Obtenção da linha celular estavelmente transfectada de HEK293-hIL-4R0
[00254]0 plasmídeo de expressão contendo a sequência completa de hIL-4Ra é misturado com PEI na razão de 1:3 em meio Opti-MEM, e deixado repousar em temperatura ambiente por 20 minutos. As células inoculadas em uma placa de 6 cavidades no dia anterior são retiradas, e a confluência celular é observada ao microscópio em cerca de 80%. O meio DMEM (Gibco) é aspirado e 4,5 ml de meio Opti-MEM pré- aquecido (Gibco) são adicionados. A mistura plasmídeo-PEI foi então adicionada em gotas às células, agitada suavemente e cultivada em uma incubadora de dióxido de carbono a 37ºC; 24 horas depois, uma substância de triagem eucariótica puromicina (Gibco) a uma concentração de 1 ug/ml é adicionada para triagem da cultura. As células cultivadas no meio de triagem são observadas sob um microscópio, e os subclones são obtidos por triagem por diluição limitada. A análise
FACS é realizada após células “monoclonais estarem confluentes nas cavidades.
[00255]O meio é aspirado, as células são lavadas com tampão PBS, 200 ul de tripsina são adicionados para digestão por um curto período de tempo, e 700 ul de meio completo são adicionados para finalizar a digestão. 300 pl da suspensão de células são tomados para coloração, e as células restantes são colocadas em uma incubadora a 37ºC para continuar a cultura. 500 pl de BSA/PBS a 0,5% são adicionados às células usadas para coloração em cada tubo, e as mesmas são centrifugadas a 200*g por 3 minutos, e lavadas duas vezes. 2 u1ul de um anticorpo de controle (Sino Biological, Cat: 10402-R209) são adicionados como anticorpo primário a 800 ul de solução de BSA/PBS a 1% até uma concentração final de 10 uvg/ml; são adicionados 100 ul do mesmo a cada tubo e incubados em gelo e no escuro por 1 hora. De modo similar, 500 ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionados a cada tubo, centrifugados a 200*g por 3 minutos, e lavados duas vezes. Um anticorpo secundário IgG anti-coelho de cabra conjugado com FITC (BD Biosciences, Cat: 554020) é adicionado a uma diluição de 1:200, 100 ul do mesmo são adicionados a cada tubo, e incubados em gelo por 1 hora no escuro. Da mesma forma, 500 ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionados a cada tubo, centrifugados a 200*g por 3 minutos, e lavados três vezes. As células são recolocadas em suspensão com a adição de 300 pl de solução de PBS e detectadas em um citômetro de fluxo. Os resultados são como mostrados na Figura 2, mostrando que são obtidas células monoclonais HEK293 que expressam estavelmente hIL-4Roa.
3. Preparação do anticorpo anti-hIL-4R0
3.1 Imunização animal
[00256] A proteína recombinante hIL-4Ra é misturada como um antígeno com uma quantidade igual de adjuvante imunológico (adjuvante de Freund) e cinco camundongos fêmeas Balb/c de 6 semanas de idade são imunizados por injeção subcutânea na região abdominal. Após a imunização inicial, uma imunização de reforço é realizada a cada duas semanas. Após quatro imunizações, O sangue é retirado da cauda e o título do soro e a inibição da ligação ao ligando hIL-4 de 5 camundongos são detectados por ELISA, respectivamente.
[00257] Uma placa ELISA de 96 cavidades (Thermo Maxisorp) é retirada, e 100 ul de PBS (ZSGB-BIO, item Nº ZLI-9063) são adicionados a cada cavidade, e incubados em temperatura ambiente por 10 min. São retirados 5 ul de 1 mg/ml de proteína recombinante IL-4RM, adicionados a 5 ml de tampão de revestimento de carbonato 0,05 M (pH 9,5), e misturados de cabeça para baixo para obter 1 ug/ml de solução de revestimento de antígeno. A solução de PBS nas cavidades da placa é descartada, e 100 ul da solução de revestimento de antígeno são adicionados a cada cavidade e incubados a 4 ºC durante a noite. A solução de revestimento é descartada das cavidades revestidas da placa, que é então lavada 3 vezes com PBS-T, e 200 ul adicionais de 2% de leite/PBS são adicionados a cada cavidade e depois bloqueados em temperatura ambiente por 2 horas; e a solução de bloqueio é descartada, e as cavidades são lavadas três vezes com PBS para uso. Para experimentos de titulação sérica, as amostras de soro dos 5 camundongos são diluídas de acordo com as séries 1:200, 1:800, 1:3200, 1:12800, 1:51200, 1:204800 e 1:81200, e 100 ul de cada diluente são adicionados às cavidades da placa e incubados a 37ºC por 1,5 horas.
As cavidades são lavadas três vezes com PBS-T e PES, respectivamente, e secos por centrifugação.
O anticorpo secundário Fc-HRP anti-mIgG (Jackson, Cat: 115035071) é diluído a 1:4000 com BSA a 0,5%, e 100 ul do mesmo são adicionados a cada cavidade e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente.
Para o experimento de bloqueio de soro, as amostras de soro dos 5 camundongos são diluídas a 1:20, 1:200 e 1:2000, e 50 ul do mesmo são adicionados a cada cavidade e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente.
É tomado um tubo de EP de 5 ml bloqueado, a solução de bloqueio é descartada, são adicionados 3 ml de BSA a 0,5% e 1,1 ul de IL-4 humana rotulada com biotina são adicionados adicionalmente a uma concentração final de 625 ng/ml; são adicionados 50 ul do mesmo a cada cavidade e incubados a 37ºC durante 1 hora.
As cavidades são lavadas três vezes com PBS-T e PBS, respectivamente, e secos por centrifugação.
O anticorpo secundário SA-HRP (BD bioscience, Cat: 6222697) é diluído a 1:8000 com BSA a 0,5%, e 100 ul do mesmo são adicionados a cada cavidade, e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente.
As cavidades são lavadas três vezes com PBS-T e PBS, respectivamente, e secos por centrifugação. 100 ul de solução de substrato TMB (Sigma, Cat: T2885) são adicionados a cada cavidade e a reação é realizada a 37ºC no escuro; o substrato é moderadamente colorido, 50 ul de H2SOas são então adicionados a cada cavidade para finalizar a reação e a OD 450 nm é medida usando um leitor de microplacas (BioTek, Synergy HT) em 15 minutos; e os dados são coletados e os resultados são calculados usando o software Graph Pad Prism 5. Os resultados são mostrados na Figura 3A, mostrando que o título de anticorpo no soro dos 5 camundongos imunizados pode atingir 1:819200. Os resultados são mostrados na Figura 3B, mostrando anticorpos no soro dos camundongos imunizados t+3 e d4 podem inibir a ligação da IL- 4 humana ao receptor de IL-4.
3.2 Preparação da biblioteca de exibição de fagos de anticorpos
[00258] Três dias após o desafio da veia da cauda, os camundongos imunizados *3 e 4, como declarados acima, são sacrificados por deslocamento cervical, e o baço e os linfonodos periféricos dos camundongos são coletados; após moagem igual em tampão PBS, é tomada uma suspensão rica em células B e as células B são coletadas por centrifugação. O RNA total é extraído das células B usando um kit de extração de RNA Trizol, e uma biblioteca de cDNA da cadeia pesada de anticorpo é obtida por transcrição reversa usando um iniciador específico de cadeia pesada com um kit de transcrição reversa (SuperScript"" First-Strand Synthesis System, Cat: 18080051). Usando o cDNA como molde, um fragmento de região variável da cadeia pesada de anticorpo é amplificado por PCR usando um conjunto de iniciadores da região variável da cadeia pesada; após digestão dupla com NcoI e Nhel, o fragmento da região variável da cadeia pesada de anticorpo amplificado é clonado em um fagomídeo pDS-mHC construído internamente. De modo similar, é obtida uma biblioteca de cDNA da cadeia leve por transcrição reversa usando um iniciador específico da cadeia leve. Usando o cDNA como um molde, um fragmento de região variável da cadeia leve de anticorpo é amplificado por PCR usando um conjunto de iniciadores da região variável da cadeia leve; após digestão dupla com NcoIl e Bsiw3.I, o fragmento da região variável da cadeia leve do anticorpo é clonado em um fagomídeo pDS-LC construído internamente. Uma biblioteca de exibição de fagos Fab de camundongo baseada no fago filamentoso M13 é então construída com uma capacidade de biblioteca de 6 x 10º.
3.3 Triagem ELISA para anticorpos que se ligam a hIL-4RO
[00259] Um anticorpo Fab com especificidade contra IL-4Ra é isolado da biblioteca de exibição de fagos usando um biopanning de rotina de uma série de proteínas de IL-4Ra humana recombinantes. Resumidamente, são retirados 25 ul de 1 mg/ml de proteína recombinante de IL-4Ra, adicionados a 5 ml de solução de revestimento de PBS (ZSGB-BIO, Item Nº ZLI- 9063), e misturados de cabeça para baixo para obter 5 ug/ml de solução de revestimento de antígeno. A IL-4Ra formulada em tampão de revestimento de carbonato 0,05 M (pH 9,5) é revestida sobre um imunotubo (Immunotube Maxisorp, Nunc) a 4ºC durante a noite. O imunotubo é lavado com PBS e depois bloqueado com BSA a 5% por 2 horas. Fago Fan purificado preparado com BSA a uma concentração final de 1% é adicionado ao imunotubo e deixado se ligar ao antígeno revestido por 1 hora. São realizadas várias rodadas de lavagem com PBS-Tween (0,5% v/v) e PBS para remover o fago não ligado, e as partículas do fago ligadas são eluídas com trietilamina 100 mM; depois de neutralizadas com Tris-HCl 1 M (pH 7,4), as partículas do fago eluídas são infectadas pelas bactérias TG1 de E. coli e resgatadas para a próxima rodada de triagem de enriquecimento. Após as duas rodadas de biopanning, colônias únicas são colhidas em placas do tipo U de 96 cavidades para expressão induzida por IPTG, e o sobrenadante é retirado para triagem por ELISA.
[00260] São retirados 10 ul da solução de 1 mg/ml de hIL- 4RM, adicionados a 10 ml de tampão de revestimento de carbonato 0,05 M (pH 9,5), e misturados de cabeça para baixo para obter 1 ug/ml de solução de revestimento de antígeno. A solução de revestimento de antígeno preparada é adicionada a uma placa ELISA de 96 cavidades (Thermo Maxisorp) com 100 ul por cavidade. A placa ELISA de 96 cavidades é envolvida com uma membrana de vedação e incubada durante a noite a 4ºC. No dia seguinte, a placa ELISA é retirada, colocada em uma lavadora de placas (BioTek, Synergy HT), e lavada três vezes com PBS; solução de PBS contendo BSA a 2% é adicionada com 200 ul por cavidade, e bloqueada em temperatura ambiente por 2 horas. A solução de bloqueio é então descartada e a placa é lavada três vezes com PBS. O sobrenadante induzido é adicionado sequencialmente às cavidades correspondentes com 50 ul por cavidade, as cavidades são incubadas por 1 hora em temperatura ambiente, o sobrenadante é descartado, e as cavidades são lavadas 3 vezes com PBS-T e PBS, respectivamente. A solução de TMB (Sigma, Cat No: T2885) é adicionada à placa ELISA de 96 cavidades, fila por fila, com 100 ul por cavidade. Depois de repousar a 37ºC durante 5 minutos, a reação é imediatamente terminada adicionando 50 ul de solução de ácido sulfúrico concentrado 2 M à placa ELISA de 96 cavidades. A placa ELISA de 96 cavidades é colocada em um leitor de microplacas (BioTek, Synergy HT), o valor OD450 é lido, e os dados são coletados e os resultados foram calculados usando o software GraphPad Prism 5. Um total de 3100 colônias únicas são colhidas para indução de IPTG e 576 delas são detectadas por ELISA para se ligarem a antígeno hIL-4Ra.
3.3 Triagem por ELISA para anticorpos que inibem a interação entre IL-4 humana e hIL-4R0
[00261]As 576 colônias únicas positivas ligadas a antígeno hIL-4Ra são reinduzidas por IPTG, e o sobrenadante é levado para triagem por ELISA. São tomadas sete placas ELISA de 96 cavidades (Thermo Maxisorp), e 100 ul de PBS (ZSGB-BIO, item Nº ZLI-9063) são adicionados a cada cavidade, e incubados em temperatura ambiente por 10 min. São retirados ul de proteína recombinante de IL-4Ra a 1 mg/ml, adicionados a 35 ml de tampão de revestimento de carbonato 0,05 M (pH 9,5), e misturados de cabeça para baixo para obter 1 ug/ml de solução de revestimento de antígeno. A solução de PBS nas cavidades da placa é descartada, e 100 ul da solução de revestimento de antígeno são adicionados a cada cavidade, e incubados a 4ºC durante a noite. A solução de revestimento é descartada das cavidades revestidos da placa, que é então lavada três vezes com PBS-T, e 200 ul adicionais de 2% de leite/PBS são adicionados a cada cavidade e depois bloqueados em temperatura ambiente por 2 horas; e a solução de bloqueio é descartada, e as cavidades são lavadas três vezes com PBS. Pipetam-se 50 ul de anticorpo de cada cavidade para induzir o sobrenadante, adicionam-se à placa ELISA com 50 ul por cavidade e incubam-se em temperatura ambiente durante 30 minutos. Um tubo de EP bloqueado de 5 ml é retirado, a solução de bloqueio é descartada, são adicionados 3 ml de BSA a 0,5%, e 1,l ul de IL4 rotulada com biotina são adicionados adicionalmente a uma concentração final de 625 ng/ml; são adicionados 50 ul do mesmo a cada cavidade e incubados a 37ºC durante 1 hora. As cavidades são lavadas três vezes com PBS-T e PBS, respectivamente, e secos por centrifugação. O anticorpo secundário SA-HRP (BD bioscience, Cat: 6222697) é diluído na razão de 1:8000 com BSA a 0,5%, e 100 ul do mesmo são adicionados a cada cavidade, e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente. As cavidades são lavadas três vezes com PBS-T e PES, respectivamente, e secos por centrifugação. 100 ul de solução de substrato TMB são adicionados a cada cavidade, e a reação é realizada a 37ºC no escuro, o substrato é moderadamente colorido, 50 ul de H;SOs são então adicionados a cada cavidade para terminar a reação, e o OD 450 nm é medido usando um detector ligado a enzima (BioTek, Synergy HT) em 15 minutos, e os dados são coletados e os resultados são calculados usando o software Graph Pad Prism 5. Entre as colônias positivas obtidas em 3,2 ELISA, 120 colônias isoladas inibem a ligação da IL-4 humana a hIL-4Ra.
3.4 Análise por FACS para anticorpos que se ligam a hIL-4RO expressada na superfície das membranas celulares
[00262] O sobrenadante das 120 colônias únicas positivas detectadas acima, que inibem a ligação da IL-4 humana à hIL- 4Ra humana, é tomado para análise por FACS. As células HEK293 e a linha celular estavelmente transfectada de HEK293-hIL- 4Ra são preparadas com 5*10º células por cavidade, e a quantidade de Cell Tracker Green CMFDA (Invitrogen, Cat: C2925) para a coloração de células é de 100 1ul de solução verde rastreadora de células por 1*10º células, e a incubação é realizada por 30 minutos em uma incubadora a 37ºC; são adicionados 5 ml de BSA/PBS a 0,5%, e os mesmos são centrifugados a 1000 rpm por 3 minutos e lavados 3 vezes. Cada 1*10º células corresponde a 100 ul de solução de BSA/PBS a 3%, e a solução é bloqueada a 4ºC por 20 minutos; as células preparadas são adicionadas a uma placa do tipo U de 96 cavidades a um volume de 100 pl/cavidade, e centrifugadas a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; e a solução primária de anticorpo é adicionada e incubada por 1 hora em gelo.
Os anticorpos Fab purificados são preparados em 5 séries de concentrações com uma concentração inicial de 500 nM (12,5 pg/ml) e diluídos de acordo com uma série de 1:5. Após incubação com a solução primária de anticorpo, BSA/PBS a 0,5% é adicionado adicionalmente a um volume de 150 ul, centrifugado a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 150 ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionados, centrifugados a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; antes de adicionar um anticorpo IgG anti-humano secundário, Fab'2-AF647 (Jackson), o mesmo é diluído a 1:300 com BSA/PBS a 1%; 40 pl da solução diluída de anticorpo secundário são adicionados a cada cavidade e incubados em gelo por 45 minutos.
Após a incubação com a solução secundária de anticorpo, BSA/PBS a 0,5% adicional é adicionado a um volume de 150 ul, centrifugado a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 150 ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionados, centrifugados a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 20-100 pl de PBS são adicionados para recolocar em suspensão as células para 1*10º células por ml, e a suspensão obtida é carregada em um citômetro de fluxo (peneira I-Que). Depois de abrir o instrumento e o sistema operacional de acordo com o processo correto e definir os parâmetros corretos, as células são carregadas na placa de teste, e o sinal fluorescente é detectado; a análise é realizada usando o software Graph Pad
Prism 5, e os resultados são mostrados na Figura 3C, mostrando que os anticorpos rastreados pelo pré-ELISA estão especificamente ligados às células HEK293 transfectadas de maneira estável que expressam IL-4Ra.
3.5 Análise por FACS para anticorpos que inibem a interação entre IL-4 humana e hIL-4R0
[00263] O sobrenadante do FACS analisado primeiras 100 colônias únicas positivas com forte ligação a hIL-4Ra é tomado para inibir experimentos de receptores expressados na superfície celular. As células HEK293 e as células transfectadas de forma estável HEK293-hIL-4Ra são preparadas com 3*10º células por cavidade, e a quantidade de Cell Tracker" Green CMFDA (Invitrogen, Cat: C2925) para a coloração de células é de 100 ul de solução verde rastreadora de células por 1*10º células, e a incubação é realizada por minutos em uma incubadora a 37ºC; 5 ml adicionais de BSA/PBS a 0,5% são então adicionados e os mesmos são centrifugados a 1000 rpm por 3 minutos, e lavados 3 vezes. Cada 1*10º células corresponde a 100 mL de solução de BSA/PBS a 3%, e a solução é bloqueada a 4ºC por 20 minutos. As células preparadas são adicionadas a uma placa do tipo U de 96 cavidades a um volume de 100 pl/cavidade, e centrifugadas a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; e a solução primária de anticorpo é adicionada e incubada por 1 hora em gelo. Os anticorpos Fab purificados são preparados em 5 séries de concentrações com uma concentração inicial de 100 nM, e diluídos de acordo com uma série de 1:5. Após a incubação com a solução primária de anticorpo, BSA/PBS a 0,5% adicional é adicionado a um volume de 150 ul, centrifugado a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 150 u7ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionados, centrifugados a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; é adicionado Fc IL-4-mIgG2a humano rotulado com biotina a uma concentração final de 0,15 pg/ml e incubado em gelo durante 45 minutos. O anticorpo secundário SA-PE é diluído a 1:300 com BSA/PBS a 1%; 40 ul da solução secundária de anticorpo são adicionados a cada cavidade e incubados em gelo por 45 minutos. Após a incubação com a solução secundária de anticorpo, BSA/PBS a 0,5% adicional é adicionado a um volume de 150 ul, centrifugado a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 150 ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionados, centrifugados a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 20-100 pl de PBS são adicionados para recolocar em suspensão as células para 1*10º células por ml, e a suspensão obtida é carregada em um citômetro de fluxo (peneira I-Que). Depois de abrir o instrumento e o sistema operacional de acordo com o processo correto, e definir os parâmetros corretos, as células são carregadas na placa de teste, e o sinal fluorescente é detectado; a análise é realizada usando o software Graph Pad Prism 5. Os resultados são mostrados na Figura 3D, mostrando que 15 anticorpos das colônias únicas positivas rastreadas pelo pré-ELISA podem inibir a ligação de células estavelmente transfectadas que expressam hIL-4Ra para IL-4 humana.
4. Triagem de anticorpos Fab que inibem a ligação de hIL- 4RM ao complexo hIL-13RM/hIL-13 por Fortebio 4,1 Detecção da ligação de hIL-4RM ao complexo hIL-13RM/hIL- 13
[00264] São tirados 1 ml de hIL-13Ra (a uma concentração de 400 ng/ml) e 1 ml de hIL-13 (Sino Biological, Item No.
10369-HNAC, a uma concentração de 400 ng/ml), e misturados a razão de 1:1 para uma concentração de trabalho de 200 ng/ml, e é permitido repousar, incubar e ligar em temperatura ambiente por 2 horas. O complexo hIL-13Ra/hIL-13 tem uma concentração inicial de 200 ng/ml e é diluído de acordo com uma série de 1:1; três séries de concentração são definidas: 200 ng/ml, 100 ng/ml e 50 ng/ml, com 100 ul por cavidade na placa de 96 cavidades, e grupos de controle em branco são definidos. Em primeiro lugar, o hIL-4Ra rotulado com biotina é imobilizado pela, e ligado à, sonda SA (a uma concentração de trabalho de 10 ng/ml), 100 ul do mesmo são adicionados a cada cavidade, e a ligação a hIL-13Ra/hIL-13 é detectada por Fortebio; um método experimental é editado para execução, e os resultados experimentais são analisados no software Fortebio. Os resultados são mostrados na Figura 4A, mostrando que o hIL-4Ra pode se ligar ao complexo hIL-13Ra/hIL-13.
4.2 Detecção de anticorpos que inibem a ligação de hIL-4RM ao complexo hIL-13RM/hIL-13
[00265] Os experimentos acima demonstram que o hIL-4Ra pode se ligar ao complexo hIL-13Ra/hIL-13 e, com base nisso, os anticorpos Fab que inibem a ligação de hIL-4Ra ao complexo hIL-13Ra/hIL-13 são rastreados adicionalmente, o efeito inibidor dos anticorpos Fab candidatos triados no período anterior é comparado, e o tampão de trabalho é definido como o grupo de controle negativo. O hIL-4Ra rotulado com biotina é imobilizado por uma sonda (a uma concentração de 10 ng/ml), e as concentrações de trabalho dos anticorpos Fab candidatos são ajustadas para 100 ug/ml, e a concentração do complexo hIL-13Ra/hIL-13 é 200 ng/ml; em primeiro lugar, o hIL-4Ra rotulado com biotina é imobilizado pela sonda SA (a uma concentração de trabalho de 10 ng/ml), 100 ul são adicionados a cada cavidade, e o efeito inibidor dos anticorpos Fab candidatos sobre hIL-4Ra e complexo hIL-13Ra/hIL-13 é detectado por Fortebio; um método experimental é editado para execução, e os resultados experimentais são analisados no software Fortebio. Os resultados são como mostrados na Figura 4B, mostrando que os anticorpos candidatos podem inibir a ligação de hIL-4Ra ao complexo hIL-13Ra/hIL-13.
5. Sequência da região variável do anticorpo monoclonal positivo candidato
[00266] Os plasmídeos monoclonais positivos são extraídos e sequenciados para obter as sequências das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve das colônias positivas candidatas: Clone 1A6: Cadeia pesada <-==—=———===—==FRl] ===========-> CDRl<----FR2-----> CDR2 <-——
QVOLOOSGTELVKPGASVKMSCKASVNTFTGYNMHWIKOT PGQOGLEWIGGLHPGNGDSSYNQKFKGRATLT me======FR3===============> CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMQOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFPYNGQGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGACTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACACATTTACCGGTTACAATATGCACTGGATAAAACAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATTCTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAGGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGGECCTEGGTTTCCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-—————— . Rl -=------> CDRI <--———-FR2-----> CDR2 <--=-=----------
DIQMTOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3-------—————--> CDR3 <---FR3--->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
Clone 1D8: Cadeia pesada <-—————-.=====FRl==--=-=---=--> CDRl<----FR2-----> CDR2 <-——
QVOLOQOSGAELVKPGASVKMSCTATGNIFTGYNMHWIKOTPGQOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKGRATLT Teme=====FR3===============> CDR3 <----FR3---->
ADKSSSSAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYNWGOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CACGGCTACAGGCAATATATTTACCGGTTATAATATGCACTGGATAAAGCAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAGGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCTCAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCEGECCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-———... . wa e —-—. CDRI <--——-—FR2-----> CDR2 <---—--———————-
DIQMTOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FPRI-------=————— CDR3 <--FR3--->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLHTFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAMACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGACTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA Clone 1H9: Cadeia pesada <-————. PRl=--——c——----> CDRI<----FR2-----> CDR2 <a
QVOLQQSGAELVKPGASVKMSCKASVNTFAGYNMHWVKQT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKGKATLT mem=====FR3===============> —CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYWGOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTÇGAAGCCTGEGECCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACACATTTGCCGGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGEGECCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-—————— FR] ===--=---> CDRI <-----FR2-----> CDR2Q <--=======-----
DIQMIQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FRI-----————————> CDR$ <--FR$--->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGATTCAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAA Clone 2H1: Cadeia pesada Comme PR e > CDRI<=———FRQ2=n———> CDR2 <——-.
QVELOQSGTELVKPGASVKMSCKASVNT FTGYNMHWIKQOT PGOGLEWIGGLHPGNGDSSYNQKFKGRATLT pe—==== "FR3==============-> CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFPYWGQOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGACTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACACATTTACCGGTTACAATATGCACTGGATAAAACAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATTCTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAGGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGECCGGECCTGGTTTCCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-————— FR] =====-=-> CDRI <-----FR2-----> CDR2 <-=======-----
DIQMIQOSTSSLSASLGDRVT ISCRASQDISNYLNWYQOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFRGSGSGTDY FRI-============> CDR3 <--FR3--->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGATTCAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGAGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Clone 2F8: Cadeia pesada <-=—=—— . . RR] ===========-> CDRl<----FR2-----> CDR2 <--—--
QVOLOQOSGTELVKPGASVKMSCKASVNTFTGYNMHWIKOTPGOGLEWIGGLHPGNGDSSYNQKFKGRATLT memee====FR3===============> CDR3 <--—-FR3---->
ADKSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFPYNGOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGACTGAGCTGGTGAAGCCTGGEGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACACATTTACCGGTTACAATATGCACTGGATAAAACAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATTCTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAGGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGEGCCGEGCCTGGTTTCCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-———-——FRl = =---—> CDRI <-----FR2-----> CDR2 <-=----———----
DIQMTOSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQOQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3----——————— . > . CDR3 <---FR3--->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWIT FGGGTKLEIKR
Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGACCCAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA Clone 9B4: Cadeia pesada <rmmmeememem==FRI====mmmmmn==> CDRI<----FR2--=---> CDR2 <-——---
QVOLQOOSGAELVKPGASVKMSCTASGNIFSGYNMHWIKQOTPGQOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKGKATLT memee===FRIoe=eneeee======> CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMQOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYNGQOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGECCTCAGTGAAGATGTCCTG CACGGCTTCAGGCAATATATTTAGTGGTTATAATATGCACTGGATAAAGCAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCEGECCTEGGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-=————————FRl ===-----> CDRI <---——-FR2-----> CDR2 <r====nnnnnnn
DIQMTOTTSSLSASLGDRVT ISCRASQDISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3-----——------> CDR3 <---FR3-->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWIFGGGTKLELK Sequência de ácidos nucleicos
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAGCTGAAA Clone 9E7: Cadeia pesada <rmmeeeeeeee==FR]I=====em=nn===> CDRI<----FR2--=---> CDR2 <----
EVOLOOSGAELVKPGASVKMSCKASVNI FTGYNMHWVKOT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKDKATLT messeme= == FR3====mnnmmnmn=> CDR3 <----FR3---->
ADRSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYNWGOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
GAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGECCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACATATTTACCGGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GACAAGGCCACATTGACTGCAGACAGATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTTAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGEGCCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-m=m=e=e===FRI========> —CDRI <----—-FR2-=-=---> CDR2 <rmm=2=2=====-
DIQMTOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3---=2=n=nn=n==> CDR3 <---FR3-->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK
Sequência de ácidos nucleicos
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Clone 24G10: Cadeia pesada <-———— PR = e==——.-.--> CDRI<----FR2-----> CDR2 <---
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYAMSWVROT PEKRLENWNVATISSGGSYTNYSDSVKGRFTIS -=————— FR3===-===========-> . CDR3 <----FR3---->
RDNVKNTLYLQMSSLKSEDSAMYYCARATARATEFAYWGQOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTTTCCTG TGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGGTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGA GGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTATACCAACTATTCAGACAGTGTGAAG GGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGTCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGTCTGAA GTCTGAGGACTCGGCCATGTATTACTGTGCAAGGGCGACAGCTCGGGCTACAGAGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-————— PF Rl ----—-> CDRI <-----FR2-----> CDR2 <-==-===-=------
DIQMTOSTSSLSASLGDRVT ISCRASQDISNYLNWYQOQKPDGTVKLLIYYTSRLYSGVPSRFSGSGSGTDY FR3-------------> CDR3 <---FR3-->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKLEI Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGACACAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG CTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTATACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA Clone 25D6: Cadeia pesada done ERI== ===> CDRI<----FR2-—---> CDR2 <a—
QVOLOQOSGAELVKPGASVKMSCKASVNTFTGYNMHWVKOT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKGKATLT me======FR3===============> CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYNGOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACACATTTACCGGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCEGECCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAG Cadeia leve
<-———=—======FRI>=======> — CDRI <-----FR2-----> CDR2 <r==========-=-
DIQMTOSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3-------—------> CDR3 <---FR3-->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWIFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGACCCAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Clone 25G9: Cadeia pesada <-=—=—=————————==FR] =====--=-=-=-> CDRl<----FR2-----> CDR2 <-——
EVOLKESGAE LVKPGASVKMSCKASVNIFTGYNMHWVKQT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKDKATLT Te—T====FR3-==============> — CDR3 <----FR3---->
ADRSSNTAYMQOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYWGQOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
GAGGTGCAGCTGAAGGAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTEGEGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACATATTTACCGGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GACAAGGCCACATTGACTGCAGACAGATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGEGCCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <o-——— RR e——.. CDRI <-————FRQ=—--—-> CDR2 <=
DIQMTOSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYOQOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FRi-————————— > CDR3 <-——FR3-->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWIFGGGTRLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGACTCAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAGACTGGAAATAMAA Clone 35A7: Cadeia pesada Exu a PR La o CDRIL—— PRA > CDR2 <—
QVOLKOSGAE LVKPGASVKMSCTASGNIFSGYNMHWIKQOTPGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKGKATLT prTe====FR3===============> —CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYNGQOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGEGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CACGGCTTCAGGCAATATATTTAGTGGTTATAATATGCACTGGATAAAGCAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGEEGCCTEGTTTGCTTACT GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
Cadeia leve <-———— .--FRl ==------> CDRI <-----FR2-----> CDR2 <-------------
DIQMNQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYOOKPDGTIKLLIYYTSRLYSGVPSRFSGSGSGTDY FR3-------------> CDR3 <---FR3-->
SLTISNLEEEDIATYFCQQGNTIPYTFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGAACCAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACCA TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTATACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGGAAGAAGATATTGCCACTTATTT
TTGCCAACAGGGTAATACGATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA Clone 31B9: Cadeia pesada <r=mmeeeeee===FPRI============> CDRI<----FR2--=---> CDR2 <-——
EVOLOQOSGAELVKPGASVKMSCKASVNIFTGYNMHWVKQT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKDKATLT —====——"FR3========-"=-==="> . CDR3 <----FR3---->
ADRSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYWGQOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
GAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGECCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACATATTTACCGGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GACAAGGCCACATTGACTGCAGACAGATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGEGGCCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-——————— FR] ===--—--—-> CDRI <---—-FR2-----> CDR2 <-==========--
DIQMTOSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FRI------——————— > .CcDR$ <---FR3-->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWIFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGACACAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAA Clone 34A2: Cadeia pesada <=" FR] ===========-> CDRl<----FR2-----> CDR2 <-——
EVOLOOSGAELVKPGASVKMSCKASVNIFTSYNMHWVKQT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQNFKGKATLT ————— — FRie--=e ee eeee====> CDR3I <----FR3---->
ADKSSSTAYMQVSNLTSEDSAVYYCVLTTAGRAWFAYWGQOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
GAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGEGCCTCAGTGAAGATGTCTTG CAAGGCTTCTGTCAACATATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAACTTCAAA GGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAGGTCAGCAACCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGTCCTTACTACGGCTGGCCGGECCTGEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-———————==-FRl =-------> CDRI <-----FR2-----> CDR2 <---=======-=--
DIQMTOSTSSLSASLGDRVT ISCRASQDISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3----—-——-=-—-----> CDR3 <---FR3-->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWIFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGACACAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Clone 34H11: Cadeia pesada <rmmmmemmm eme PRI======m==m====> CDRI<----FR2-----> CDR2 <-——
QVOLQESGAE LVKPGASVKMSCKASVNTFTGYNMHWVKQOT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKGKATLT ——— PR a e ==> — CDR3I <-———FR3-——->
ADKSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYNGOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACACATTTACCGGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGGECCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve <-———— .—--FRl1 --------> CDRI <---—-FR2-----> CDR2 <-------------
DIQMTOTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3----==-==-====-> —CDR3 <---FR3-->
SLTISNLEQEDVATYFCQQGNTLPWIFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATGTTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAA Clone 35D5: Cadeia pesada <rmmmmmmmmem==FRI======m=mn===> CDRI<----FR2-----> CDR2 <-——---
QVOLKOSGAELVKPGASVKMSCKASVNTFTGYNMHWVKQOT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKGKATLT pe—=====FR3===============> — CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYNWGQOGTLVTVSA
Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACACATTTACCGGTTACAATATGCACTGGGTAAAGCAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGEGCCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve desemcesereERl eramos) ODORI desen ERDen===> CDRO Qemenenennanar
DIQMTOSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3--------—-—----> CDR3 <---FR3-->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWIFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGACACAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT
TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Clone 35A7: Cadeia pesada <-======eee===FRlI============> CDRI<----FR2-----> CDR2 <-——
QVOLKOSGAELVKPGASVKMSCTASGNIFSGYNMHWIKQOTPGQOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKGKATLT ————— RR eeseeeee——==> CDR3I <-———FRi-—-->
ADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYWGQOGTLVTVSA Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGEGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CACGGCTTCAGGCAATATATTTAGTGGTTATAATATGCACTGGATAAAGCAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGEGCCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Cadeia leve desrasasessERI=e=ana<r> CORI <<< FRI<<<=—> ODRA Qemsnenenenaaa
DIQMNOSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYOQOKPDGTIKLLIYYTSRLYSGVPSRFSGSGSGTDY PRG=——=———— .... CDRs <-—ER$-->
SLTISNLEEEDIATYFCQQGNTIPYTFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCCAGATGAACCAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACCA TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTATACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGGAAGAAGATATTGCCACTTATTT
TTGCCAACAGGGTAATACGATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAMATCAAA Clone 36F4: Cadeia pesada <-==—=—— FR] ===========-> CDRl<----FR2-----> CDR2 <----
QVOLQOQSGAELVKPGASVKMSCKASVNIFTGYNMHWVKQOT PGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKDKATLT a PR > = CDRS L———ERI-=———>
ADRSSNTAYMOLSSLTSEDSAVYYCALTTAGRAWFAYWGQOGTLVTVSA
Sequência de ácidos nucleicos
CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGEGTGAAGCCTGGEGCCTCAGTGAAGATGTCCTG CAAGGCTTCTGTCAACATATTTACCGGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGACAGG GCCTGGAATGGATTGGAGGTCTTCATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAA GACAAGGCCACATTGACTGCAGACAGATCCTCCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCCCTTACTACGGCTGGCCGGECCTEGTTTGCTTACT
GGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAG Cadeia leve <-——=———————FRl] ====----> CDRI <-----FR2-----> CDR2Q <-==========--
DIKMTQOSTSSLSASLGDRVT ISCRASQDISNYLNWYOOKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FR3---————————— > — CDR3 <---FR3--->
SLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPPWIFGGGTKLEIK Sequência de ácidos nucleicos
GACATCAAGATGACCCAGTCTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAG TTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTG TTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTT TTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
6. Construto do vetor de expressão de anticorpo quimérico
[00267] Os fragmentos de sequência da região variável das cadeias pesada e leve descritos acima são amplificados por PCR, e a região variável da cadeia pesada é clonada em um vetor que contém a região constante da cadeia pesada humana e elementos reguladores para expressar toda a cadeia pesada de IgG em células de mamíferos. De modo similar, a região variável da cadeia leve é clonada em um vetor contendo a região constante da cadeia leve humana e elementos reguladores para expressar toda a cadeia leve da IgG em células de mamíferos. Após o sequenciamento correto, o vetor é transfectado para células de mamífero HEK293-6E, e a IgG é secretada no meio de cultura por expressão, e o sobrenadante é reunido e coletado, e purificado por filtração. A IgG é purificada por cromatografia em proteína A, e o sobrenadante da cultura é carregado em uma coluna de proteína A com tamanho adequado e lavado com Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) e NaCl 250 mM, e a IgG ligada é removida por eluição com Glicina-HCl 0,1 M (pH 3,0). A proteína é concentrada por ultrafiltração usando um tubo de concentração (Millipore) o OD280 é detectado e a concentração de IgG é determinada espectrofotometricamente. A agregação ou degradação de IgG purificada é analisada por SDS-PAGE.
7. Ensaio Fortebio de afinidade de anticorpos
[00268] O PBS é adicionado a qualquer coluna da placa de 96 cavidades, 100 nul/cavidade, e a placa de 96 cavidades é colocada no cassete do portador de sonda. Ao pegar a sonda, ter cuidado para pendurá-la completamente no portador para impedir que a sonda toque no portador. O hIL-4Ra rotulado com biotina imobilizada é diluído para 5 ug/ml com PBS; é tomada uma nova placa de 96 cavidades, e o material imobilizado diluído é adicionado coluna por coluna, 100 ul/cavidade. O anticorpo é diluído para 50 ug/ml com PBS e depois diluído a 1:1 para preparar 6 séries de concentração: 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml, 6,25 po/ml, 3,125 pg/ml, O ug/ml, com 100 ul por cavidade, cuja quantidade pode ser ajustada adequadamente, dependendo da capacidade de ligação do analito específico. Uma nova placa de 96 cavidades é retirada, e o PBS é adicionado às colunas 1 e 2, 100 ul/cavidade (o mesmo tampão para a linha de base e a dissociação); Oo material imobilizado diluído é adicionado à coluna 3; o analito diluído de acordo com a série é adicionado à coluna 4; HCl 10 mM (pH 1,9) é adicionado à coluna 11; e PBS é adicionado à coluna 12. A sonda SA liga- se fortemente ao material de biotina imobilizado. Quando regenerado, o material imobilizado ainda está ligado à sonda, para que possa ser reutilizado após a imobilização apenas uma vez. Em seguida, o método experimental é configurado no software Fortebio, e o programa experimental é executado para detecção. Os resultados da detecção da afinidade do anticorpo são mostrados na Tabela 1 abaixo. N KD (nm) (1/Ms) Eaiss o. nm kass s (1/s) 31H7 9,6 2,66E+04 2,56E-04 31B9 1,9 3,30E+04 6,28E-05 34A2 0,001 2,90E+04 1,00E-07 34H11 6,6 2,69E+04 1,76E-04 35D5 1,3 3,87E+04 5,05E-05 3587 0,001 2,47E+04 1,00E-07 24G10 0,94 2,53E+04 2,37E-05 25D6 5,9 2,65E+04 1,57E-04 1H9 8,9 2,93E+04 2,62E-04 Tabela 1
8. Humanização de anticorpos
[00269]A sequência da região variável do anticorpo monoclonal selecionado é alinhada com as sequências da linha germinal dos anticorpos humanos para encontrar uma sequência com alta homologia para enxerto de CDR; então, um computador é usado para realizar a modelagem da homologia, as sequências de aminoácidos da região CDR e sua estrutura circundante são analisadas, e sua combinação estereoscópica espacial é investigada. Ao calcular a força eletrostática, a força de van der Wàls, a hidrofilicidade e a entropia, são analisados os principais indivíduos de aminoácidos que podem interagir com IL-4Ra e manter a estrutura espacial na sequência gênica do anticorpo monoclonal positivo, e os sítios de mutação de reversão são projetados em nesta base. A afinidade de HLA- DR é analisada e investigada para selecionar uma sequência estrutural embrionária humana com baixa imunogenicidade.
[00270] UM total de 8 derivados de cadeia pesada (VH1021 a VH1028) e 4 derivados da cadeia leve (VL1011 a VL1014) são projetados; os derivados da cadeia leve e pesada são sintetizados separadamente (SynbioTech, Suzhou e GENE WIZ, Suzhou) e clonados nos vetores pHCT2 e HCT1 contendo a região constante da cadeia capa do anticorpo Ckappa ou a região constante da TIgGl humana CH1-CH3; os plasmídeos são correspondentes e são usados para transfectar células HEK293.6E para expressão por 5-6 dias; e o sobrenadante é tomado e purificado pela coluna de proteína A.
[00271] Sequências da região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado: VH1021: <onn==———..-=FRl=====r—=————=> CDRI<==--FR2===--> CDR2 <----
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVROAPGKGLEWVSTISSGGSYTNYADSVKGRFTIS e———. Ra es--—--———---> CDR3 <----FR3=--->
RDNVKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARATARATEFAYWGOGTLVTVSS Sequência de Ácidos Nucleicos
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTAAGCCTGGCGECTCTCTGAGACTGTCTTG TGCCGCTTCTGGCTTCACCTTCAGCAGATACGCCATGAGCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGCAAAG GACTGGAATGGGTGTCCACAATCAGCAGCGGCGGCAGCTACAÇAAACTACGCCGATAGCGTGAAG GGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGTGAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAG AGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGCCACAGCCAGAGCTACCGAGTTTGCTTACT
GGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT VH1022: <-rrereeneeensFRlI====naenen==>. CDRIC=-="-=FR2-==--> CDR2 <—— QVQOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTETGYNMHWIQO0SPGÇGLEWNMGGLHPGNGDSSYNQKFQOGRVTLT e====-=-FRji>=======nena=n=> CDR3 <===-FR$--=-->
ADKSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCALTTAGRAWEPYWGOGTLVTVSS Sequência de Ácidos Nucleicos
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTG CAAGGCTAGCGGCAACACATTCACCGGCTACAACATGCATTGGATCCAGCAGAGCCCTGGACAGG GCCTCGAATGGATGGGAGGACTGCATCCTGGCAACGGCGACAGCAGCTACAACCAGAAATTCCAG GGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAG AAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCTTACAACAGCCGGCAGAGCCTGGTTTCCTTACT
GGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTTAGCTCT VH1023:
<rmmmeeeeeee==PRlI===e=n=n======> CDRI<----FR2==---> CDR2 <-—--
QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTFTGYNMHWIQOS PGOGLEWMGGLHPGNGDSSYNQKFOGRVTLT peseee==FRien=n=enen=nn=n===> CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCALTTAGRAWPPYWGOGTLVTVSS Sequência de Ácidos Nucleicos
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCOTG CAAGGCTAGCGGCAACACATTCACCGGCTACAACATGCATTGGATCCAGCAGAGCCCTGGAÇAGG GCCTCGAATGGATGGGAGGACTGCATCCTGGCAACGGCGACAGCAGCTACAACCAGAAATTCCAG GGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAG AAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCTTACAACAGCCGGCAGAGCCTGGTTTCCTTACT
GGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTTAGCTCT VH1024: <rmmnemeeeeeee= FR] =e=eeem=====> CDRI<----FR2==---> CDR2 <---- QVOLVOSGAEVKKPGASVKMSCKASVYTFTGYNMHNIO0SPGOGLEWIGGLHPGNGDSSYNQKFKGRATLT peseee==FRiA=eeeeeee======> CDR3 <----FR3---->
ADKSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCALTTAGRAWEPYNGQOGTLVTVSS Sequência de Ácidos Nucleicos
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGAGCTG CAAGGCTAGCGTGTACACCTTCACCGGCTACAACATGCATTGGATCCAGCAGAGCCCTGGACAGG GCCTCGAATGGATTGGAGGACTGCACCCTGGCAACGGCGACAGCTCTTACAACCAGAAGTTCAAG GGCAGAGCCACACTGACCGCCGACAAGTCTAGCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAG AAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCTTACAACAGCCGGCAGAGCCTGGTTTCCTTACT
GGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTTAGCTCT VH1025: <reeeeeeeeee== FR] ==eeeee=nn==> CDRIC===-FR2Q====-> CDR2 <----
QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGNI FTGYNMHNVROAPGQOGLENMGGLHPGNGDTSYNQKFQGRVTLT pemeeeeFRÍ=ro=eeenn=n=n=====> CDR3 <----FR3---->
ADRSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCALTTAGRAWFAYNGOGTLVTVSS Sequência de Ácidos Nucleicos
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGGTGTCCTG CAAGGCTAGCGGCAACATCTTCACCGGCTACAACATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAGG GACTTGAATGGATGGGAGGACTGCACCCTGGCAACGGCGACACAAGCTACAACCAGAAATTCCAG GGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAGATCTAGCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAG AAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCTTACAACAGCCGGCAGAGCTTGGTTTGCTTACT
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT VH1026: <r=mmmeneeeeee= PRI=====ne=====> CDRI<==>-FR2==---> CDR2 <----
QVOLVOSGAEVKKPGASVKMSCKASVYTFTGYNMHWVRQOAPGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQKFKDRATLT messes PRI=eseeeeeeee=n==> CDR3 <----FR3==-->
ADRSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCALTTAGRAWFAYNWGQOGTLVTVSS Sequência de Ácidos Nucleicos
CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGAGCTG CAAGGCTAGCGTGTACACCTTCACCGGCTACAACATGCACTGGGTCCGACAGGCTCCAGGACAGG GACTTGAATGGATCGGAGGACTGCACCCTGGCAACGGCGACACAAGCTACAACCAGAAGTTCAAG GACAGAGCCACACTGACCGCCGACAGAAGCAGCAACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAG AAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCTTACAACAGCCGGCAGAGCTTGGTTTGCTTACT GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
VH1027: <emnnenaaeaae= PRI=eneeeenanand CDRIK===-FR2====-> CDR2 <----
EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCKASGNIFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGGLHPGNGDTSYNQKFQOGRVTLT preco FRIoennennannnnnn=> CDR3I <----FRÍ-=-=->
ADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVLTTAGRAWFAYWGQOGTLVTVSS Sequência de Ácidos Nucleicos
GAAGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCACCGTGAAGATCAGCTG CAAGGCTAGCGGCAACATCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTEGACAGE GACTTGAATGGATGGGAGGACTGCACCCTGGCAACGGCGACACAAGCTACAACCAGAAATTCCAG GGCAGAGTGACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAG AAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTGCTGACAACAGCCGGCAGAGCTTGGTTTGCTTACT
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT VH1028: <-===nreeeranrFRIo=n=eennn——==> CDRI<----FR2==---> CDR2 <----
EVQLVOSGAEVKKPGATVKMSCKASVYTFTSYNMHWVRQOAPGOGLEWIGGLHPGNGDTSYNQNFKGRATLT pesso PRIoAnonnnnenn=n===> CDR3 <----FRÍ---->
ADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVLTTAGRAWEAYNWGQOGTLVTVSS Sequência de Ácidos Nucleicos
GAAGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCACCGTGAAGATGAGCTG CAAGGCTAGCGTGTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAGG GACTTGAATGGATCGGAGGACTGCACCCTGGCAACGGCGACACAAGCTACAACCAGAACTTCAAG GGCAGAGCCACACTGACCGCCGACAAGTCTAGCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAG AAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTGCTGACAACAGCCGGCAGAGCTTGGTTTGCTTACT GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTTTCTTCT
[00272] Sequências da região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado: VL1011: <rmeeeeee== ER] =e==n==n==> CDRI <-----FR2Q=----> CDR2Q <nmmmnmemnnno
DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRQASQDISNYLNWYOOKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FRI==2ennnnen===> CDRI <---FR3I-->
TFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPWIFGGGTKVEIK Sequência de Ácidos Nucleicos
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCAC CTGTCAGGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCC CTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGC GGCTCTGGCACCGACTACACCTTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATATCGCTACCTACTT
CTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTTGGACATTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG VL1012: Sequência de Ácidos Nucleicos
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCAC CTGTCAGGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCC CTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGC
GGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCTACCTACTT CTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTtaGACATTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
«=== =PRI=A=-=n==> CDRI c<e====FRQe==2=> ODR2Q Messsnnaananao
DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYOQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY ERS====nTemoTEn=>D (CDRI <---FRI-->
TLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK VL1013: <-=———— ...=FRl =-=-—.> CDRI <--—-—FR2=----> CDR2 <-===-———
DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYOOKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FRI====ene=e=n==> CDR3 <-=-FR3-->
TLTISSLQPEDFATY FCQQGNTLPLTFGGGTKVEIK Sequência de Ácidos Nucleicos
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCAC CTGTCAGGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCC CTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGC GGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCTACCTACTT
CTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTCTGACATTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG VL1014: Conama FRI=Ann=n—==> CDRI <-----FR2===--> CDR2Q <-===-=====-=--
DIQMTOSPSSLSASVGDRVT ITCQASQDISNYLNWYOOKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY FRIA nnaen==n===> CDRÍ <---FR$-->
TLTISSLOPEDFATYFCQQGNTLPPWTFGGGTKVEIK Sequência de Ácidos Nucleicos
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCAC CTGTCAGGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCC CTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCTCTAGATTTTCTGGCAGC
GGCTCTGGCACCGACTACACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCTACCTACTT CTGCCAGCAAGGCAACACCCTGCCTCcCatgGACATTTGGCGGAGGCACÇAAGGTGGAAATCAAGÇ
9. Análise por FACS para ligação de anticorpos humanizados candidatos a IL-4RMl
9.1 Análise por FACS para ligação de anticorpos humanizados candidatos à linha celular estavelmente transfectada de HEK293-IL-4R0
[00273] De modo a verificar adicionalmente a ligação de anticorpos humanizados candidatos a IL-4R%M por FACS, as células HEK293 e as células transfectadas estavelmente 293- hIL-4Ra são preparadas com 5*10º células por cavidade; são adicionados 5 ml de BSA/PBS a 0,5% e centrifugados a 1000 rpm durante 3 minutos, e lavados 3 vezes. Cada 1*10º células corresponde a 100 mL de solução de BSA/PBS a 3%, e a solução é bloqueada a 4ºC por 20 minutos. As células preparadas são adicionadas a uma placa do tipo U de 96 cavidades a um volume de 100 ul/cavidade, e centrifugadas a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; e a solução primária de anticorpo é adicionada e incubada por 1 hora em gelo.
Os anticorpos Fab purificados são preparados em 5 séries de concentrações com uma concentração inicial de 500 nM (12,5 ug/ml), e diluídos de acordo com uma série de 1:5. Após incubação com a solução primária de anticorpo, 0,5% de BSA/PBS adicional é adicionado a um volume de 150 ul, centrifugado a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado. 150 u7ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionados, centrifugados a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; antes de adicionar um anticorpo secundário IgG anti-humano, Fab'2-AF647, o mesmo é diluído a 1:300 com BSA/PBS a 1%. 40 ul da solução secundária de anticorpo são adicionados a cada cavidade e incubados em gelo por 45 minutos.
Após a incubação com a solução secundária de anticorpo, BSA/PBS a 0,5% adicional é adicionado a um volume de 150 ul, centrifugado a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 150 ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionados, centrifugados a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 20-100 À1yl de PBS são adicionados para recolocar em suspensão as células para 1*10º células por ml, e a suspensão obtida é carregada em um citômetro de fluxo (peneira I-Que). Depois de abrir o instrumento e o sistema operacional de acordo com o processo correto e definir os parâmetros corretos, as células são carregadas na placa de teste e o sinal fluorescente é detectado, a análise é realizada usando o software Graph Pad Prism 5. Os resultados são como mostrados na Figura 5A, mostrando que os anticorpos candidatos humanizados estão especificamente ligados às células HEK293 estavelmente transfectadas que expressam IL-4Ra.
9.2 Análise de FACS para inibir a ligação de IL-4 humana a células estavelmente transfectadas HEK293-IL-4RO0 por anticorpos candidatos humanizados
[00274] As células HEK293 e as células transfectadas de forma estável 293-hIL-4RM são preparadas com 3*10º células por cavidade; são adicionados 5 ml de BSA/PBS a 0,5% e centrifugados a 1000 rpm durante 3 minutos, e lavados 3 vezes. Cada 1*10º células corresponde a 100 mL de solução de BSA/PBS a 3%, e a solução é bloqueada a 4ºC por 20 minutos. As células preparadas são adicionadas a uma placa do tipo U de 96 cavidades a um volume de 100 ypul/cavidade, e centrifugadas a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; e a solução primária de anticorpo é adicionada e incubada por l1 hora em gelo. Os anticorpos candidatos purificados são transformados em 5 séries de concentrações com uma concentração inicial de 100 nM, e diluídos de acordo com uma série de 1:5. Após incubação com à solução primária de anticorpos, BSA/PBS a 0,5% adicional é adicionado a um volume de 150 ul, centrifugado a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado. 150 ul de BSA/PBS a 0,5% são adicionalmente adicionados, centrifugados a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; IL-4 rotulada com biotina a uma concentração final de 0,15 ug/ml é adicionada e incubada em gelo durante 45 minutos. O anticorpo secundário SA-PE é diluído a 1:300 com BSA/PBS a 1%; 40 pl da solução secundária de anticorpo são adicionados a cada cavidade e incubados em gelo por 45 minutos. Após a incubação com a solução secundária de anticorpo, BSA/PBS a 0,5% adicional é adicionado a um volume de 150 ul, centrifugado a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado; 150 1pl de BSA/PBS a 0,5% são adicionados, centrifugados a 1100 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante é descartado. 20-100 pl de PBS são adicionados para recolocar em suspensão as células para 1*10º células por ml, e a suspensão obtida é carregada em um citômetro de fluxo (peneira I-Que). Depois de abrir o instrumento e o sistema operacional de acordo com o processo correto, e definir os parâmetros corretos, as células são carregadas na placa de teste, e o sinal fluorescente é detectado, a análise é realizada usando o software Graph Pad Prism 5. Os resultados são como mostrados na Figura 5B, mostrando que os anticorpos candidatos podem inibir a ligação da IL-4 humana a células que expressam hIL-4Ra.
10. Inibição do efeito de hIL-4 ou hIL-13 na proliferação de células TF-l1 por anticorpos humanizados candidatos
10.1 Experimento de estimulação da proliferação de células TF-1 por hIL-4 ou hIL-13
[00275]As células TF-l criopreservadas (ATCC: CRL- 2003M) são retiradas do tanque de nitrogênio líquido e agitadas suavemente em banho-maria a 37ºC para dissolver o mesmo rapidamente. A suspensão de células dissolvidas é transferida para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 10 ml de meio 1640 pré-aquecido (Gibco, Cat: C11875500BT), e centrifugada a 1000 rpm por 3 min; o sobrenadante é descartado, meio completo 1640 contendo GM-CSF é adicionado e transferido para o balão de cultura de células T75, e colocado em uma incubadora de células de dióxido de carbono a 5% a 37ºC para cultura estática. A suspensão de células é tirada a cada 2-3 dias, e centrifugada a 800 rpm por 3 min; as células são recolocadas em suspensão com a adição de 15 ml de meio completo 1640, e são tiradas 1 x 10º células e colocadas no balão de cultura T75 contendo 10 ml de meio completo 1640 por 2-3 passagens consecutivas. Quando as células são cristalinas, em um único estado de suspensão e levemente irregulares em morfologia, e a viabilidade celular é maior que 90%, é realizado o experimento de detecção da atividade celular.
[00276] De acordo com o projeto experimental, uma solução celular contendo 1,5 x 10º células é preparada, centrifugada a 1000 rpm por 5 min e, em seguida, o sobrenadante é descartado; o sedimento celular é recolocado em suspensão com meio completo sem GM-CSF, centrifugado a 1000 rpm por 5 min, e o sobrenadante é descartado, e o sedimento celular obtido é recolocado em suspensão com 4,2 ml de meio completo sem GM-CSF. A amostragem é contada por um microscópio, e a densidade do líquido celular é ajustada para 3x10º” células/ml com base no resultado da contagem. Em seguida, a solução celular e o meio de cultura são adicionados a uma placa de 96 cavidades, 100 nul/cavidade, 200 ul de PBS são adicionados aos grupos em branco, e a placa é cultivada em uma incubadora por 24 horas sob as condições de 37ºC e CO; a 5%. Em primeiro lugar, hIL-4 (Sino Biological, Cat: 11846-HNAC) e hIL-13 (Sino Biological, Cat: 10369-HNAC) são diluídos para 100 ng/ml e 800 ng/ml, respectivamente, e o mesmo é diluído 9 vezes na série 2x, e de acordo com o projeto da experiência, a IL-4 e a IL-13 diluídas são adicionadas às cavidades da placa por uma pipeta multicanal com 10 ul por cavidade e misturadas uniformemente. A placa é devolvida à incubadora por mais 72 horas, a placa é tirada, as células são misturadas uniformemente com uma pipeta multicanal, e 80 ul da solução celular são pipetados uniformemente e adicionados à cavidade correspondente da placa ELISA preta de 96 cavidades. Em seguida, 80 ul de Cell titer-Glo (Promega, Cat: G7570) dissolvidos e previamente uniformemente misturados são adicionados a cada cavidade, a placa ELISA preta de 96 cavidades (JET, Cat: LTP-021-896) é então suavemente agitada em um agitador (Thermo, Cat: 8880024) por 2 minutos, e incubada por 10 minutos em temperatura ambiente para produzir um sinal luminescente estável. A luminescência é detectada com um leitor ELISA e o tempo de detecção é definido em 1 segundo. Os resultados são mostrados na Figura 6A e Figura 6B, mostrando que o hIL 4 pode estimular a proliferação de células TF-1 e que o hIL-13 pode estimular a proliferação de células TF-l1, respectivamente.
10.2 Detecção de ELISA para inibição do efeito de hIL-4 ou hIL-13 na proliferação de células TF-l por anticorpos humanizados candidatos
[00277]As células TF-l são cultivadas como descrito em
5.1, e 100 ul de solução celular (3 x 10º células/ml) são adicionados a uma placa de 96 cavidades de acordo com o projeto experimental e cultivada por 24 horas em condições sem citocinas, e os furos das bordas são vedados com PBS. O anticorpo é diluído para uma concentração de 1 mM, o hIL-4 é diluído para 3 ng/ml, e o hIL-13 é diluído para 30 ng/ml. O anticorpo é diluído em uma série 2x e adicionado às células com 10 ul/cavidade, misturado uniformemente, e incubado por 1 hora sob as condições de 37ºC e CO; a 5%; 10 ul de meio 1640 são adicionados aos grupos em branco, misturados uniformemente, e incubados por 1 hora sob as condições de 37ºC e COr a 5%. De acordo com o projeto experimental, hIL- 4 e hIL-13 são adicionados às células com 10 unul/cavidade, misturados uniformemente, e cultivados por 72 horas sob as condições de 37ºC e CO, a 5%; 10 ul de meio 1640 são adicionados aos grupos em branco, misturados uniformemente, e cultivados por 72 horas sob as condições de 37ºC e CO: a 5%. A solução celular uniformemente misturada é inoculada na placa ELISA preta de 96 cavidades, 80 ul/cavidade; 80 ul de Cell Titer-Glo são adicionados a cada cavidade, e a placa de microcavidades é então suavemente agitada e misturada uniformemente em um agitador por 2 minutos, e incubada por min em temperatura ambiente para produzir um sinal luminescente estável. A luminescência é detectada com um leitor ELISA e o tempo de detecção é definido em 1 segundo. Os resultados são mostrados nas Figura 6C, Figura 6D e Figura 6E, mostrando que os anticorpos humanizados podem inibir a proliferação celular TF-1 estimulada por hILH4, os anticorpos humanizados podem inibir a proliferação celular TF-1 estimulada por hIL-13, os anticorpos humanizados podem inibir simultaneamente a proliferação de células TF-1l estimulada por hIL-4 e estimulada por hIL-13 respectivamente.
11. Ligação de anticorpos candidatos humanizados a proteínas IL-4RM de cinomolgo, camundongos e ratos
[00278]] ug/ml de hIL-4Ra de humano, 10 ug/ml de cinomolgo cynoIL-4Ra, 1 ug/ml de mIL-4Ra de camundongo (Sino Biological, Cat: 80198-R08H) e 1 ug/ml de ratIL-4Ra derivado de rato (Sino Biological, Cat: 51180-MO8H) são diluídos em tampão de revestimento de carbonato a 0,05 M (pH 9,5) a 4ºC durante a noite.
A solução nas cavidades é descartada no dia seguinte e as cavidades são lavadas 3 vezes com tampão de lavagem com PBS.
Em seguida, é adicionada uma solução de PBS contendo 2% de BSA para bloqueio por 2 horas.
Após lavagem 3 vezes com tampão de lavagem PBS, 100 ul de anticorpos candidatos humanizados a diferentes concentrações diluídas são adicionados, incubados durante 1 h em temperatura ambiente, e depois lavados 3 vezes com tampão de lavagem PBS; o anticorpo reticulado com HRP (Jackson Immuno Research) é diluído a 1:10.000 com tampão de lavagem com PBS e incubado por 1 hora em temperatura ambiente.
Após lavagem 3 vezes com tampão de lavagem com PBS, 100 ul de solução de substrato TMB são adicionados para desenvolver a cor, e após reação em temperatura ambiente por 10 minutos; a reação é parada pela adição de 50 ul de solução de ácido sulfúrico concentrado a 0,5 Me a absorbância a 450 nm é lida.
Os resultados são: a Figura 7A mostra que os anticorpos candidatos humanizados se ligam à proteína IL-4Ra humana; a Figura 7B mostra os anticorpos candidatos humanizados que se ligam à proteína IL-4R% do macaco cinomolgo; a Figura 7C mostra que os anticorpos humanizados candidatos não se ligam à proteína IL-4Ra de camundongo; a Figura 7D mostra que os anticorpos candidatos humanizados se ligam à proteína IL-4Ra de rato; pode ser observado que os anticorpos humanizados podem se ligar à proteína IL-4Ra humana ou de cinomolgo ou rato com afinidade semelhante, mas não interagem com a proteína IL- 4Ra de camundongo.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo que se liga especificamente a IL-4R0, caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 2-4, 12-14, 22-24, 32- 34, 42-44 , 52-54, 62-64, 72-74, 82-84, 92-94, 102-104, 112- 114, 122-124, 132-134, 142-144, 152-154, 162-164, 172 174, 177-179, 182-184, 187-189, 192-194, 197-199, 202-204, 207- 209 ou qualquer variante das mesmas, e/ou uma CDR da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 7-9, 17-19, 27-29, 37-39, 47-49, 57-59, 67-69, 77-79, 87-89 97-99, 107-109, 117-119, 127 -129, 137-139, 147-149, 157- 159, 167-169, 212-214, 217-219, 222-224, 227-229 ou qualquer variante das mesmas.
2. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo que se liga especificamente a IL-4R0, caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1 da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 2, 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 177, 182, 187, 192, 197, 202, 207 ou qualquer variante das mesmas, uma CDR2 da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 178, 183, 188, 193, 198, 203, 208 ou qualquer variante das mesmas, e uma CDR3 da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 4, 14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 179, 184, 189, 194, 199, 204, 209 ou qualquer variante das mesmas; e/ou uma CDR1 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117,
127, 137, 147, 157, 167, 212, 217, 222, 227 ou qualquer variante das mesmas, uma CDR2 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 8, 18, 28, 38, 48, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128 , 138, 148, 158, 168, 213, 218, 223, 228 ou qualquer variante das mesmas, e uma CDR3 da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 9, 19, 29, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 119, 129, 139, 149, 159, 169, 214, 219, 224, 229 ou qualquer variante das mesmas.
3. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo que se liga especificamente a IL-4RM, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 176, 181, 186, 191, 196, 201, 206 ou qualquer variante das mesmas e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 211, 216, 221, 226 ou qualquer variante das mesmas.
4. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo inibe a interação de hIL-4 com hIL-4RQO; de preferência, o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo também inibe a ligação de hIL-4RM a um complexo hIL- 13RM/hIL-13; e opcionalmente, o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo é humanizado.
5. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 171 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
6. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 176 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 221 ou qualquer variante da mesma.
7. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 196 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 211 ou qualquer variante da mesma.
8. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 196 ou qualquer variante da mesma, e/ou uma região variável da cadeia leve selecionada da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 216 ou qualquer variante da mesma.
9. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, e/ou vetor compreendendo o ácido nucleico conforme definido em qualquer um dos aspectos precedentes, e/ou célula que compreende o vetor como definido em qualquer um dos aspectos precedentes, e/ou composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, ou ácido nucleico que codifica o mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável.
10. Uso do anticorpo ou de um fragmento funcional do mesmo, ou da molécula de ácido nucleico, ou do vetor, da célula ou da composição farmacêutica conforme definido(a) em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um fármaco para oO tratamento de doenças alérgicas ou asma ou doenças pulmonares obstrutivas crônicas em mamíferos.
BR112020009211-8A 2018-05-29 2019-05-29 Inibidor autoimune e aplicação do mesmo BR112020009211A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810528489.8A CN110540590B (zh) 2018-05-29 2018-05-29 一种自免疫抑制物的开发和应用
CN201810528489.8 2018-05-29
PCT/CN2019/089031 WO2019228405A1 (zh) 2018-05-29 2019-05-29 一种自免疫抑制剂及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020009211A2 true BR112020009211A2 (pt) 2020-12-08

Family

ID=68698480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020009211-8A BR112020009211A2 (pt) 2018-05-29 2019-05-29 Inibidor autoimune e aplicação do mesmo

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11725057B2 (pt)
EP (1) EP3674323A4 (pt)
JP (1) JP7072077B2 (pt)
CN (2) CN113101364B (pt)
BR (1) BR112020009211A2 (pt)
RU (1) RU2759946C1 (pt)
WO (1) WO2019228405A1 (pt)
ZA (1) ZA202002171B (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113101364B (zh) * 2018-05-29 2023-12-01 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种自免疫抑制剂的开发和应用
CN113527485A (zh) * 2020-04-17 2021-10-22 上海麦济生物技术有限公司 抗人白细胞介素-4受体α抗体及其制备方法和应用
WO2023215750A2 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipase activity
TW202406572A (zh) 2022-05-02 2024-02-16 美商再生元醫藥公司 抗介白素－４受體（ｉｌ－４ｒ）抗體調配物

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
NZ249677A (en) * 1992-02-19 1996-08-27 Schering Corp Monoclonal antibodies and compositions useful for treating il-4 diseases and intermediates for making such antibodies
US6664227B1 (en) 1996-03-01 2003-12-16 Genetics Institute, Llc Treatment of fibrosis by antagonism of IL-13 and IL-13 receptor chains
US7229619B1 (en) 2000-11-28 2007-06-12 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
EP1283851B1 (en) * 2000-05-26 2012-03-28 Immunex Corporation Use of il-4r antibodies and compositions thereof
US20040023338A1 (en) 2001-10-26 2004-02-05 Heavner George A. IL-4 mutein proteins, antibodies, compositions, methods and uses
CA2464695A1 (en) 2001-10-26 2003-05-01 Centocor, Inc. Il-13 mutein proteins, antibodies, compositions, methods and uses
AU2003243189B2 (en) 2002-05-01 2008-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of using cytokine antagonists to treat HIV infection and AIDS
UA93653C2 (ru) * 2003-11-07 2011-03-10 Иммунекс Корпорейшн Выделенное антитело, kotopoe специфически связывается c человеческим рецептором il-4 (il-4r)
DK1711528T3 (da) 2003-12-23 2012-08-20 Genentech Inc Behandling af cancer med hidtil ukendte anti-il 13 monoklonale antistoffer
US7652146B2 (en) 2004-02-06 2010-01-26 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing 2-aminothiazole-5-carboxamides useful as kinase inhibitors
LT2769992T (lt) 2006-10-02 2021-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Didelio afiniškumo žmogaus antikūnai, atpažįstantys žmogaus il-4 receptorių
US7608693B2 (en) * 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
SI2170956T1 (sl) 2007-06-15 2015-02-27 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Zdravljenje tumorjev z uporabo specifičnega protitelesa proti L1
US8092804B2 (en) * 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
MY177331A (en) * 2012-06-15 2020-09-12 Pfizer Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
AU2013305885B2 (en) * 2012-08-20 2017-12-21 Gliknik Inc. Molecules with antigen binding and polyvalent Fc gamma receptor binding activity
TWI634900B (zh) * 2013-07-11 2018-09-11 再生元醫藥公司 藉由投與ｉｌ－４ｒ抑制劑治療嗜酸性食道炎的方法
RU2017107847A (ru) * 2014-09-03 2018-10-03 Медиммун Лимитед Стабильный состав на основе антитела к il-4r-альфа
CA3007898A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Innate Pharma Variable regions for nkp46 binding proteins
JOP20170017B1 (ar) * 2016-01-25 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh تركيب صيدلي يتضمن تركيبات جسم مضاد ثنائي الاختصاص
CN107474134B (zh) * 2016-06-08 2021-07-27 苏州康乃德生物医药有限公司 用于结合白细胞介素4受体的抗体
CN113101364B (zh) * 2018-05-29 2023-12-01 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种自免疫抑制剂的开发和应用
US20230295312A1 (en) * 2018-12-27 2023-09-21 Akeso Biopharma, Inc Antibody against human il-4ra and use thereof
CN114634567A (zh) * 2020-12-16 2022-06-17 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种免疫调节剂的开发及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP7072077B2 (ja) 2022-05-19
RU2759946C1 (ru) 2021-11-19
CN110540590B (zh) 2023-08-18
CN113101364B (zh) 2023-12-01
US20210087284A1 (en) 2021-03-25
CN113101364A (zh) 2021-07-13
WO2019228405A1 (zh) 2019-12-05
ZA202002171B (en) 2022-10-26
CN110540590A (zh) 2019-12-06
EP3674323A4 (en) 2021-09-29
JP2021505196A (ja) 2021-02-18
US20240092920A1 (en) 2024-03-21
EP3674323A1 (en) 2020-07-01
US11725057B2 (en) 2023-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6938383B2 (ja) イヌインターロイキン４受容体アルファに対する抗体
BR112020009211A2 (pt) Inibidor autoimune e aplicação do mesmo
JP5502752B2 (ja) 抗ｍｉｆ抗体
WO2021104053A1 (zh) 一种tslp相关病症治疗剂的开发和应用
CN110577597A (zh) 一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体
US20100040616A1 (en) Treatment of autoimmune and inflammatory disease
WO2020108611A1 (zh) 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
JP2019506146A (ja) ヒトおよびイヌｉｌ−４ｒアルファに対するイヌ化ヒト抗体
WO2019042153A1 (zh) 重组双特异性抗体
WO2023173258A1 (zh) 一种抗cd3抗体及其制备方法和用途
CN112512572A (zh) 抗cd40抗体及其用途
BR112020005766A2 (pt) anticorpo il-5, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e aplicação médica do mesmo
US20240002518A1 (en) Caninized rat antibodies to canine interleukin-31 receptor alpha
WO2023070502A1 (zh) 分离的抗原结合蛋白及其用途
WO2023111148A1 (en) Caninized antibodies to canine interleukin-31 receptor alpha 1
AU2022409610A1 (en) Caninized antibodies to canine interleukin-31 receptor alpha 1

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: KEYMED BIOSCIENCES CO., LTD (CN)

B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: KEYMED BIOSCIENCES CO., LTD (CN)

B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]