JP2021504727A - リアルタイムなグルタチオンの測定による治療用細胞の品質測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
R1及びR2は、それぞれ独立して、水素又はC1−4直鎖若しくは分枝鎖アルキルであるか、R1、R2及びXがともに5員又は6員環をなすヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルであり;R3は、水素又はC1−4直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり;R4及びR5は、それぞれ独立して、水素、C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル、−(CH2)m−COO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキルである(前記mは1〜5の整数である)か、R4、R5及びYは、ともにC3−7ヘテロシクロアルキルをなし、前記ヘテロシクロアルキルは、非置換若しくはR6で置換されたヘテロシクロアルキルであり;前記R6は、−COO(CH2)n−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル(前記nは1〜5の整数である)、−(CONH)−(CH2)o−PPh3 +Cl−(前記oは1〜5の整数である)又は−(CONH)−CHR7−COO(CH2)p−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり(前記pは1〜5の整数である);前記R7は、−(CH2)q−COO(CH2)r−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル(前記q及びrはそれぞれ1〜5の整数である)であり;X及びYは、それぞれ独立して、N又はOである。
i)細胞のグルタチオン平均値又は中央値(Glutathione Mean Level、GM);
ii)細胞のグルタチオン散布度(Glutathione Heterogeneity、GH);
iii)細胞のグルタチオン再生産能力(Glutathione Regeneration Capacity、GRC);及び
iv)酸化ストレス抵抗能力(Oxidative Stress Resistance Capacity、ORC)が挙げられ、ここで、GMは、細胞FR(FreSHtracer Ratio)又はF510の平均値又は中央値で算出し、GHは、細胞FR又はF510の変動係数(Coefficient of variation)又はロバスト変動係数(Robust coefficient of variation)で算出し、GRCは、生きている細胞に酸化剤処理後にリアルタイムにFR又はF510をモニタリングして得られる数値で、第1酸化剤処理群の第1曲線下面積(area under the curve、AUC)から第2酸化剤処理群の第2曲線下面積を引いた値を、無処理対照群の第3曲線下面積から第2酸化剤処理群の第2曲線下面積を引いた値で割った後、100を乗じた値で算出し、ORCは、生きている細胞に第1酸化剤処理後にGSHのレベルを定量して得られる数値で、GSHのレベルを、第1酸化剤処理しなかった対照群細胞又は第1酸化剤処理する前の対照群細胞で定量されたGSHのレベルを比較して、GSHの発現が変動した細胞量で算出した値である、
方法を提供する。
R1及びR2は、それぞれ独立して、水素又はC1−4直鎖若しくは分枝鎖アルキルであるか、R1、R2及びXがともに5員又は6員環をなすヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルであり;R3は、水素又はC1−4直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり;R4及びR5は、それぞれ独立して、水素、C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル、−(CH2)m−COO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキルである(前記mは1〜5の整数である)か、R4、R5及びYは、ともにC3−7ヘテロシクロアルキルをなし、前記ヘテロシクロアルキルは、非置換若しくはR6で置換されたヘテロシクロアルキルであり;前記R6は、−COO(CH2)n−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル(前記nは1〜5の整数である)、−(CONH)−(CH2)o−PPh3 +Cl−(前記oは1〜5の整数である)又は−(CONH)−CHR7−COO(CH2)p−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり(前記pは1〜5の整数である);前記R7は、−(CH2)q−COO(CH2)r−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル(前記q及びrはそれぞれ1〜5の整数である)であり;X及びYは、それぞれ独立して、N又はOであるか;
R1は、1つ以上のNを含む3〜7員環であるヘテロシクロアルキルである。本発明の他の具体例において、化学式A又はBは、下記の化学式A−2〜化学式A−6、化学式B−2〜化学式B−8のうちのいずれか1つである。本発明のさらに他の具体例において、FRは、430〜550nmにおける蛍光強度(F510)及び550〜680nmにおける蛍光強度(F580)の比率である。本発明のさらに他の具体例において、酸化ストレスを処理する前や処理した後に、細胞のグルタチオン平均値又は中央値は増加するほど良質の品質である。本発明のさらに他の具体例において、酸化ストレスを処理する前や処理した後に、細胞のグルタチオン散布度(Glutathione Heterogeneity、GH)は減少するほど良質の品質である。本発明のさらに他の具体例において、細胞のグルタチオン再生産能力(Glutathione Regeneration Capacity、GRC)は増加するほど良質の品質である。本発明のさらに他の具体例において、酸化ストレス抵抗能力(Oxidative Stress Resistance Capacity、ORC)は、酸化剤処理時に測定したGSHの量が、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞のGSHの量に比べて減少した細胞の数が少ないか、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞のGSHの量より高いか、その量と同じ細胞の数が多いほど良質の品質である。本発明のさらに他の具体例において、第1酸化剤は、H2O2、及びtert−ブチル過酸化物を含むヒドロ過酸化物(hydroperoxide);ジアミド、GSSG(oxidized GSH)、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)、マレイミド、N−エチルマレイミド、4−マレイミド酪酸、3−マレイミドプロピオン酸及びヨードアセトアミドを含むチオール酸化剤;ビス−クロロエチルニトロソウレアを含むグルタチオン還元酵素抑制剤;PX−12を含むチオレドキシン抑制剤;アンチマイシンA、ロテノン、オリゴマイシン及びカルボニルシアニドm−クロロフェニルヒドラゾンを含むミトコンドリア電子伝達系抑制剤;ホルボール12−ミリステート13−アセテートを含むNADPH酸化酵素活性化剤;1S,3R−RAS−セレクティブリーサル3(1S,3R−RAS−selective lethal3;1S,3R−RSL3)、DPI19、DPI18、DPI17、DPI13、DPI12、DPI10(ML210)、DPI7(ML162)、又はアルトレタミンを含むgpx4抑制剤;エラスチン(Erastin)、スルファサラジン、ソラフェニブ、グルタメート、ピペラジンエラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、及びエラスチン類似体を含むシステムx− c抑制剤;フェロトーシス誘導体56(FIN56)を含むGPX4タンパク質量及びCoQ10量減少誘導剤;カスパーゼ−依存性リーサル56(CIL56)及びフェロトーシス誘導体エンドペルオキシド(FINO2)を含む脂質過酸化誘導剤;ブチオニン−(S,R)−スルホキシミンを含むグルタミン酸塩システイン連結酵素(GCL)抑制剤;ジエチルマレイン酸塩を含むGSH減少誘導剤;DPI2、シスプラチン、システイナーゼ(cysteinase)、スタチン、クエン酸鉄アンモニウム、トリゴネリン、四塩化炭素、シリカ系ナノ粒子及び非熱プラズマを含む。本発明のさらに他の具体例において、第2酸化剤は、マレイミド、4−マレイミド酪酸、3−マレイミドプロピオン酸、エチルマレイミド、N−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)、又はヨードアセトアミドプロピオン酸を含む。目的の細胞は、成体幹細胞、胚幹細胞及び誘導万能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)からなる群より選択されたいずれか1つである幹細胞;樹状細胞(dendritic cell)、ナチュラルキラー細胞(natural killer cell)、T細胞(T cell)、B細胞(B cell)、制御性T細胞(regulatory T cell、Treg cell)、ナチュラルキラーT細胞(natural killer T cell)、先天性リンパ球細胞(Innate lymphoid cell)、大食細胞(macrophage)、顆粒球(Granulocyte)、キメラ抗原受容体発現T細胞(CAR−T:Chimeric antigen receptor−T cell)、リンホカイン活性キラー細胞(LAK:Lymphokine−activated killer Cell)及びサイトカイン誘導性キラー細胞(CIK:Cytokine Induced Killer Cell)からなる群より選択されたいずれか1つである兔疫細胞;線維芽細胞(fibroblast)、軟骨細胞(chondrocyte)、滑液膜細胞(synovial cell)、皮膚角質細胞(keratinocyte)、脂肪細胞(adipocyte)、造骨細胞(osteoblast)、破骨細胞(osteoclast)及び末梢血液単核細胞(peripheral blood mononuclear cell)からなる群より選択されたいずれか1つである体細胞(Somatic cell);CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、BHK細胞、C127細胞、HEK293細胞、HT−1080細胞、PER.C6細胞からなる群より選択されたいずれか1つであるタンパク質製剤の生産に使用される細胞株;又は人体若しくは動物の口腔、鼻腔、肺、皮膚、胃腸管、及び泌尿管に由来する微生物からなる群より選択されたいずれか1つである人体マイクロバイオーム(Microbiome)である。本発明のさらに他の具体例において、T細胞は、制御性T細胞(Treg cell)を除いたものである。
FreSH−トレーサーで使用するために、下記の化学式Aで表される化合物又はその塩を含む組成物を用意した:
FreSH−トレーサーを用いて生細胞の細胞活性を測定し、細胞活性が高い細胞を分離するために、下記の実験条件構築を行った。
2−1.hBM−MSCの分離]
1×103細胞/cm2の密度でhBM−MSC幹細胞を培養培地(MSCGM Bullet Kit;Lonza #PT−3001)に播種(seeding)し、3日後、2μM FreSHを含む培養液で1.5時間細胞を標識した。DPBS(WELGENE #LB 001−02)で2回洗浄した後、TrypsinLE(gibco #12604−013)溶液を処理して細胞を脱着させた後、2μM FreSHを含む新しい培地でトリプシンを不活性化させた。この後、4℃、1800rpmで10分間遠心分離した後、細胞を2μM FreSHを含む新しい培地で懸濁(resuspend)した。これをFACSにローディングする直前、2μM FreSHを含むPBSで1/5希釈した(4℃維持のために1回に約1mlずつ希釈)。
ヒト陰茎の包皮から分離して製造したヒト線維芽細胞(HDF:Human diploid fibroblast)を老化(Old)細胞(p32)にした後[継代培養(passsage)による複製性老化モデル]、150pi組織培養培地(tissue culture media)に播種(seeding)し、2μM FreSHを含む10%ウシ胎児血清(Fetal bovine serum)と1%penicillin−streptomycinを含むフェノールレッドを含まない(Phenol red free)DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培地で2時間細胞を標識した。2時間後、PBSで2回洗浄し、TrypsinLE(Invitrogen)溶液を処理して細胞を脱着させた後、新しい培地でトリプシンを不活性化させた後、氷上で5分間放置した。この後、4℃、1000rpmで10分間遠心分離した後、細胞を2×107細胞/mlの密度となるように2μM FreSHを含む新しい培地で懸濁(resuspend)した。
ヒト血液を採取した後、DPBS(WELGENE #LB 001−02)で3倍容量となるように希釈し、Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare、17−1440−02)溶液を用いて密度差分離方式で有核細胞のみ分離する。分離された細胞の個数を確認し、1×107細胞あたり90μLの2%FBSが含有されたDPBSと10μLのCD14 MicroBead(Milteny biotech #130−050−201)を入れて、15分間4℃で反応させた後、LS Columnを用いてCD14+単核球を分離した。6ウェルプレートにウェルあたり1×106個の細胞を2mLの樹状細胞分化培地(RPMI1640、2mM L−Glutamine、10%FBS、1%penicillin−streptomycin、100μM β−mercaptoethanol、20ng/mL hGMCSF、20ng/mL IL−4)で6日間分化させた。6日後に分化完了した樹状細胞は未成熟樹状細胞と見なし、0.5μg/mL LPSを24時間処理して成熟樹状細胞を培養した。
5μg/mLのCD3抗体(Biolegend #100340)を37℃で4時間24ウェルプレートにコーティングした後、DPBSを用いて洗浄した。ネズミの脾臓とリンパ節からMouse Pan T Cell Isolation Kit II(Milteny biotech #130−095−130)を用いて分離したTリンパ球をウェルあたり2×106個入れて、1μg/mLの濃度のCD28抗体(Biolegend #102112)とともに10%FBSが含まれたRPMI1640培地で3日間培養した。FreSHを最終的に2μMの濃度となるように培養培地に添加し、2時間細胞を標識後、4℃、1500rpmで5分間遠心分離した後、細胞を2×107細胞/mlの密度となるように2μM FreSHを含む新しい培地で懸濁(resuspend)した。その後、次のようなFACS Instruction条件(BD ARIAIII、波長405(F510測定のため)及び488(F580測定のため)のレーザ、ノズルサイズ70μM)でF510/F580比率によって3つの細胞群に分離した。
3×106細胞/mlの密度のhES−MSC幹細胞を150pi組織培養培地(tissue culture media)に播種(seeding)し、12時間後、30ml PBSで2回洗浄した後、2μM FreSHを含むEGM−2 MV培養液で2時間細胞を標識した。2時間後、2μM FreSHを含むPBSで2回洗浄し、TrypsinLE(Invitrogen)溶液を処理して細胞を脱着させた後、2μM FreSHを含む新しいEGM−2 MV培地でトリプシンを不活性化させた。この後、4℃、2000rpmで20分間遠心分離した後、細胞を5×107細胞/mlの密度となるように2μM FreSHを含む新しいEGM−2 MV培地で懸濁(resuspend)した。これをFACSにローディングする直前、2μM FreSHを含むPBSで1/5希釈した(4℃維持のために1回に約1mlずつ希釈)。
[3−1:FreSH−トレーサーベースの分離された幹細胞の細胞学的特性分析]
hBM−MSC幹細胞の治療効能を決定する主要因子であるコロニー形成単位(CFU−F、colony forming unit−fibroblast)と生着率を細胞培養モデルで評価した。200細胞/100pi dishに播種後、14日間培養した後、クリスタルバイオレット染色を実施した結果、GSHHigh細胞がGSHMidやGSHLow細胞に比べて著しく高いCFU−F数値を示すことを確認した(図4A)。また、トランスウェル培養を活用してSDF−1(150ng/ml)やPDGF−AA(10ng/mL)±STI571(0.5μg/mL)に関する走化性を測定した結果、GSHHigh細胞がGSHLow細胞に比べて著しく高い細胞移動性を示すことを確認した(図4B)。
ヒト陰茎の包皮から分離して製造したヒト線維芽細胞(HDF:Human diploid fibroblast)を若い(Young)細胞(p6)と老化(Old)細胞(p32)[継代培養(passsage)による複製性老化モデル]にした後、Promega社のGSH/GSSG−GloTM分析キットを用いてGSHのレベルを測定した場合、老化細胞に比べて、若い細胞のGSHのレベルが約44%減少していることを確認した(図5A)。
ヒト単核球由来樹状細胞の免疫活性に関連する多様な表面タンパク質に対する抗体をFreSH Tracerと同時に染色した後、フロー細胞分析法を利用して、GSHHigh(上位0.2−30.2%細胞群)、GSHMid(上位30.2−62.5%細胞群)とGSHLow(下位0.3−32.7%細胞群)をゲーティング(gating)し、それぞれの細胞群における表面タンパク質の発現程度を確認した。その結果、Tリンパ球の活性に重要な役割を果たすと知られたCD80の細胞表面の発現程度が樹状細胞の成熟の有無にかかわらず、GSHHigh、GSHMid、GSHLowの順に減少することを確認した(図6)。これによって、GSHが高い樹状細胞の免疫活性が大きいと予想することができる。実験に使用した表面タンパク質抗体は表2の通りである。
ネズミのTリンパ球をCD3及びCD28抗体を用いて活性化させた後、FreSHtracerを用いてGSHの濃度によって3つの実験群に分離した。分離されたTリンパ球をTrizol(Invitrogen #15596026)を用いてmRNAを抽出し、Treg細胞特異的に発現する転写因子であるfoxp3 mRNAのレベルをRQ−PCRにより分析した結果、GSHHigh、GSHMidに比べてGSHLowで4倍程度増加していることを確認した(図7)。これによって、GSHが高いT細胞群でTreg細胞の存在比率が低いと予想することができる。
治療用細胞の品質を評価するために、下記に述べるように、FreSH−トレーサーを用いたリアルタイムなグルタチオン測定法に基づく4つの評価パラメータを開発して分析した(図8)。その4つはそれぞれ、細胞のグルタチオン平均値(又は中央値;Glutathione Mean Level、GM)、及びグルタチオン散布度(Glutathione Heterogeneity、GH)、グルタチオン再生産能力(Glutathione Regeneration Capacity、GRC)、酸化ストレス抵抗能力(Oxidative Stress Resistance Capacity、ORC)である。
直接的に幹細胞内のGSHの量を調節する場合、細胞機能の変化をもたらすかをテストするために、ブチオニンスルホキシミン(BSO、buthionine sulfoximine;グルタチオン合成抑制剤)とグルタチオンエチルエステル(GSH−EE、Glutathione ethyl ester)をFreSH−トレーサーによって分離されたhES−MSCに処理した。GSHHigh細胞にBSO(80μM、24h)を処理して細胞内GSHを低下させる場合、CFU−Fが増加することを確認し、逆に、GSHLow細胞にGSH−EE(1mM、2h)を処理してGSHを高めた場合、CFU−Fが減少することを確認した(図13A)。また、FreSH−トレーサーで分離しなかったhES−MSCにBSOを処理するか、GSH−EEを処理した場合、それぞれPDGF−AAに対する細胞移動能が減少又は増加することを確認した(図13B)。
本研究室で培養されたhUC−MSC継代培養4、7、15に相当する細胞にRSL3を多様な濃度で処理した後、Mito−FreSHを用いて染色後、フロー細胞分析とコンフォーカルイメージングにより細胞のミトコンドリアGSH(mGSH)の分布様相を、ヒストグラムを通して確認した。
1)実験過程
<フロー細胞分析法によるMSCにおけるGSH分布の測定>
臍帯由来中間葉幹細胞(human umbilical cord−derived mesenchymal stem cell、hUC−MSC)の継代培養4、7、15を用意した後、6−well細胞培養プレートにwellあたり70000cellsを入れた後、37℃で24時間培養した。この時使用される培地は、α−MEMに10%ウシ胎児血清(fetal bovine serum)、1Xペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。培地を除去した後、グルタチオンペルオキシダーゼ4(glutathione peroxidase4、GPX4)抑制剤であるRSL3を0.1/0.5/1μMの濃度で入れて、37℃で1.5時間培養した。この時使用される培地は、α−MEMに10%ウシ胎児血清(fetal bovine serum)、1Xペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。RSL3が含まれた培地を除去した後、5μM Mito−FreSHtracerを入れて、37℃で1.5時間培養した。この時使用される培地は、α−MEMに10%ウシ胎児血清(fetal bovine serum)、1Xペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。Mito−FreSHtracerが含まれた培地を除去した後、2mLのDPBSで細胞を2回洗浄した。250μLのTrypLE Expressを入れて、37℃で2分30秒間反応した後、2%FBSが含まれたDPBSを同量入れて、細胞をプレートから引き離した。プレートから引き離した細胞をFACS tubeに移して氷に保管した後、Flow cytometry装置を用いて蛍光値を測定した。
臍帯由来中間葉幹細胞(human umbilical cord−derived mesenchymal stem cell、hUC−MSC)の継代培養4、7、15を用意した後、96−well細胞培養プレートにwellあたり7000cells/100μlを入れた後、37℃で24時間培養した。この時使用される培地は、α−MEMに10%ウシ胎児血清(fetal bovine serum)、1Xペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。培地を除去した後、グルタチオンペルオキシダーゼ4(glutathione peroxidase4、GPX4)抑制剤であるRSL3を0.1/0.5/1μMの濃度で100μlを入れて、37℃で2時間培養した。この時使用される培地は、α−MEMに10%ウシ胎児血清(fetal bovine serum)、1Xペニシリン−ストレプトマイシンが含まれた。RSL3が含まれた培地を除去した後、15μM Mito−FreSHtracerを100μlずつ入れて、37℃で1時間培養した。この時使用される培地は、10mM HEPESを含むHBSS(Hanks’ Balanced Salt Solution)が使用された。測定前に培地上のMito−FreSHtracerを除去するために、10mM HEPESを含むHBSSに培地を交換した後、共焦点イメージ装置であるoperettaを用いて蛍光イメージを測定した。
各細胞内のF510(Mito−FreSHtracerがSH基と結合した時の蛍光値)とF580(Mito−FreSHtracerがSHと結合しない状態で自己蛍光値)の蛍光値を測定した後、F510値をF580値で割った値を、細胞内GSHの平均値を意味するF510/F580 ratio値として求めた。prism5プログラムを用いて、各細胞が有するF510/F580 ratio値をX軸とし、F510/F580 ratio値に相当する細胞の%量をY軸としてヒストグラムで示した。Flow cytometryを分析するFlowjoソフトウェアを用いて、すべてのサンプルでAlexa430/PE(F510/F580)パラメータを分析し、F510/F580の分布を示すヒストグラムが2つのpeakに分かれる地点を基準としてGSH High(右側ピーク)、Low cell(左側ピーク)を分けて、該当する細胞の比率を%で表した。
本研究室で培養されたhUC−MSC継代培養4、7、15に相当する細胞とも、RSL3を処理しなかった場合、ほぼ同じパターンのmGSHの分布を示したが、RSL3の濃度と継代培養数に依存的にmGSH量が減少した集団が観察されることを確認することができた(図29、図30、及び図31)。
MSCを通した実験と同じく、多様な回数で継代培養されたHuman dermal fibrolastにRSL3を処理した後、Mito−FreSHtracerで細胞を染色し、コンフォーカルイメージングによりmGSHの量を維持する細胞と維持できなかった細胞の比率を百分率で表した。その結果、中間葉幹細胞の結果と同じく、継代培養を続けるほどRSL3の処理によってmGSHが減少する細胞の比率が増加することが明らかになった(図34参照)。
1)実験過程
実際にRSL3処理による脂質酸化ストレス条件でmGSHレベルが低下した細胞は幹細胞の機能が低下しているかを確認するために、既存の文献を通して明らかになった良い幹細胞が高く発現すると知られた細胞表面タンパク質であるCD146の発現量をフロー細胞分析により確認した。
RSL3処理後、Mito−FreSHとCD146抗体を同時に染色してmGSH High細胞とLow細胞においてCD146の表面発現量を比較すれば、P4 hUC−MSCでRSL3によってmGSHレベルが低くなった集団は、CD146 mGSHレベルを維持した集団に比べて、CD146の陽性比率が25%程度低くなったことを確認した(図33)。これは、P15幹細胞のCD146の陽性比率と類似する数値であった。P7は、P4と比較してCD146の陽性比率の差がないため、このような表面タンパク質の発現比率を用いた細胞の品質評価方法では2つの細胞の品質を区分することができなかったが、図31のように、現技術を利用すればこれらの品質も区分して評価することができた。
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Claims (12)
- 目的の細胞を分離するステップと、
分離した細胞のグルタチオンのレベルを測定するステップと、
グルタチオンのレベルによる細胞の品質を判断するステップと、
を含む細胞の品質を測定する方法において、
グルタチオンのレベルによる細胞の品質を判断するステップは、下記の評価パラメータのうちのいずれか1つ以上である方法:
i)細胞のグルタチオン平均値又は中央値(Glutathione Mean Level、GM);
ii)細胞のグルタチオン散布度(Glutathione Heterogeneity、GH);
iii)細胞のグルタチオン再生産能力(Glutathione Regeneration Capacity、GRC);及び
iv)酸化ストレス抵抗能力(Oxidative Stress Resistance Capacity、ORC)
ここで、
GMは、細胞FR(FreSHtracer Ratio)又はF510の平均値又は中央値で算出し、
GHは、細胞FR又はF510の変動係数(Coefficient of variation)又はロバスト変動係数(Robust coefficient of variation)で算出し、
GRCは、生きている細胞に酸化剤処理後にリアルタイムにFR又はF510をモニタリングして得られる数値で、第1酸化剤処理群の第1曲線下面積(area under the curve、AUC)から第2酸化剤処理群の第2曲線下面積を引いた値を、無処理対照群の第3曲線下面積から第2酸化剤処理群の第2曲線下面積を引いた値で割った後、100を乗じた値で算出し、
ORCは、生きている細胞に第1酸化剤処理後にGSHのレベルを定量して得られる数値で、GSHのレベルを、第1酸化剤処理しなかった対照群細胞又は第1酸化剤処理する前の対照群細胞で定量されたGSHのレベルを比較して、GSHの発現が変動した細胞量で算出した値である、方法。 - グルタチオンのレベルの測定は、下記の化学式A又はBを添加してグルタチオンのレベルを測定する、請求項1に記載の方法:
R1及びR2は、それぞれ独立して、水素又はC1−4直鎖若しくは分枝鎖アルキルであるか、R1、R2及びXがともに5員又は6員環をなすヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルであり;R3は、水素又はC1−4直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり;R4及びR5は、それぞれ独立して、水素、C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル、−(CH2)m−COO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキルである(前記mは1〜5の整数である)か、R4、R5及びYは、ともにC3−7ヘテロシクロアルキルをなし、前記ヘテロシクロアルキルは、非置換若しくはR6で置換されたヘテロシクロアルキルであり;前記R6は、−COO(CH2)n−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル(前記nは1〜5の整数である)、−(CONH)−(CH2)o−PPh3 +Cl−(前記oは1〜5の整数である)又は−(CONH)−CHR7−COO(CH2)p−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキルであり(前記pは1〜5の整数である);前記R7は、−(CH2)q−COO(CH2)r−OCO−C1−5直鎖若しくは分枝鎖アルキル(前記q及びrはそれぞれ1〜5の整数である)であり;X及びYは、それぞれ独立して、N又はOであるか;
R1は、1つ以上のNを含む3〜7員環であるヘテロシクロアルキルである。 - 化学式A又はBは、下記の化学式のうちのいずれか1つである、請求項2に記載の方法。
- FRは、430〜550nmにおける蛍光強度(F510)及び550〜680nmにおける蛍光強度(F580)の比率である、請求項1に記載の方法。
- 酸化ストレスを処理する前又は処理した後に、細胞のグルタチオン平均値又は中央値は増加するほど良質の品質である、請求項1に記載の方法。
- 酸化ストレスを処理する前又は処理した後に、細胞のグルタチオン散布度(Glutathione Heterogeneity、GH)は減少するほど良質の品質である、請求項1に記載の方法。
- 細胞のグルタチオン再生産能力(Glutathione Regeneration Capacity、GRC)は増加するほど良質の品質である、請求項1に記載の方法。
- 酸化ストレス抵抗能力(Oxidative Stress Resistance Capacity、ORC)は、酸化剤処理時に測定したGSHの量が、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞のGSHの量に比べて減少した細胞の数が少ないか、酸化剤処理しなかった対照群細胞又は酸化剤処理する前の対照群細胞のGSHの量より高いか、その量と同じ細胞の数が多いほど良質の品質である、請求項1に記載の方法。
- 第1酸化剤は、H2O2、及びtert−ブチル過酸化物を含むヒドロ過酸化物(hydroperoxide);ジアミド、GSSG(oxidized GSH)、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)、マレイミド、N−エチルマレイミド、4−マレイミド酪酸、3−マレイミドプロピオン酸及びヨードアセトアミドを含むチオール酸化剤;ビス−クロロエチルニトロソウレアを含むグルタチオン還元酵素抑制剤;PX−12を含むチオレドキシン抑制剤;アンチマイシンA、ロテノン、オリゴマイシン及びカルボニルシアニドm−クロロフェニルヒドラゾンを含むミトコンドリア電子伝達系抑制剤;ホルボール12−ミリステート13−アセテートを含むNADPH酸化酵素活性化剤;1S,3R−RAS−セレクティブリーサル3(1S,3R−RAS−selective lethal3;1S,3R−RSL3)、DPI19、DPI18、DPI17、DPI13、DPI12、DPI10(ML210)、DPI7(ML162)、又はアルトレタミンを含むgpx4抑制剤;エラスチン(Erastin)、スルファサラジン、ソラフェニブ、グルタメート、ピペラジンエラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、及びエラスチン類似体を含むシステムx− c抑制剤;フェロトーシス誘導体56(FIN56)を含むGPX4タンパク質量及びCoQ10量減少誘導剤;カスパーゼ−依存性リーサル56(CIL56)及びフェロトーシス誘導体エンドペルオキシド(FINO2)を含む脂質過酸化誘導剤;ブチオニン−(S,R)−スルホキシミンを含むグルタミン酸塩システイン連結酵素(GCL)抑制剤;ジエチルマレイン酸塩を含むGSH減少誘導剤;DPI2、シスプラチン、システイナーゼ(cysteinase)、スタチン、クエン酸鉄アンモニウム、トリゴネリン、四塩化炭素、シリカ系ナノ粒子及び非熱プラズマを含む、請求項1に記載の方法。
- 第2酸化剤は、マレイミド、4−マレイミド酪酸、3−マレイミドプロピオン酸、エチルマレイミド、N−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)、又はヨードアセトアミドプロピオン酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 目的の細胞は、成体幹細胞、胚幹細胞及び誘導万能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)からなる群より選択されたいずれか1つである幹細胞;
樹状細胞(dendritic cell)、ナチュラルキラー細胞(natural killer cell)、T細胞(T cell)、B細胞(B cell)、制御性T細胞(regulatory T cell、Treg cell)、ナチュラルキラーT細胞(natural killer T cell)、先天性リンパ球細胞(Innate lymphoid cell)、大食細胞(macrophage)、顆粒球(Granulocyte)、キメラ抗原受容体発現T細胞(CAR−T:Chimeric antigen receptor−T cell)、リンホカイン活性キラー細胞(LAK:Lymphokine−activated killer Cell)及びサイトカイン誘導性キラー細胞(CIK:Cytokine Induced Killer Cell)からなる群より選択されたいずれか1つである兔疫細胞;
線維芽細胞(fibroblast)、軟骨細胞(chondrocyte)、滑液膜細胞(synovial cell)、皮膚角質細胞(keratinocyte)、脂肪細胞(adipocyte)、造骨細胞(osteoblast)、破骨細胞(osteoclast)及び末梢血液単核細胞(peripheral blood mononuclear cell)からなる群より選択されたいずれか1つである体細胞(Somatic cell);
CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、BHK細胞、C127細胞、HEK293細胞、HT−1080細胞、PER.C6細胞からなる群より選択されたいずれか1つであるタンパク質製剤の生産に使用される細胞株;又は
人体又は動物の口腔、鼻腔、肺、皮膚、胃腸管、泌尿管などに由来する微生物からなる群より選択されたいずれか1つである人体マイクロバイオーム(Microbiome)である、請求項1に記載の方法。 - T細胞は、制御性T細胞(Treg cell)を除いたものである、請求項11に記載の方法。
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