CN112791062B - 一种细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
一种细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种细胞膜包覆Au‑Fe3O4的靶向纳米材料及其制备方法和应用，属于靶向纳米材料技术领域。本发明提供的靶向纳米材料癌细胞膜和包裹于所述癌细胞膜内的Au‑Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12‑肉豆蔻酸酯13‑乙酸酯。PMA可以有效刺激细胞产生H2O2和活性氧O2 ‑，可以对癌细胞中不足的H2O2进行补充，为Fenton反应补充原料；Fe3O4在单宁酸的存在下能够部分分解，形成Fe2+和Fe3+，Fe2+能够催化癌细胞中的H2O2分解成羟基自由基，TA能够促进Fe3O4产生的Fe3+向Fe2+的快速转化；同时，Au和Fe3O4具有良好的光热转化效率，能充分发挥PTT的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及靶向纳米材料技术领域，特别涉及一种细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
几个世纪以来，癌症一直是威胁人类健康的焦点问题之一，许多科研工作者也为克服这一问题而努力工作。迄今为止，已经研究和开发了多种治疗方法，例如化学动力疗法(CDT疗法)，光动力疗法(PDT疗法)，光热疗法(PTT疗法)等，其中，CDT疗法和PTT疗法的结合产生了良好的治疗效果。CDT治疗主要利用金属与H2O2之间的Fenton反应产生的高活性羟基自由基(·OH)来杀伤肿瘤细胞。目前可以用于CDT疗法的纳米催化药物的主要含有Fe2+、Cu2 +、Mn2+和Co2+等几种金属离子。PTT疗法利用光热纳米材料将光能转化为热能，达到局部高温杀死癌细胞的效果。更重要的是，CDT治疗 /PTT治疗的联合策略使肿瘤不易从被损害的状态中恢复。
然而，在肿瘤细胞中，H2O2的含量较少，不足以产生足够的羟基自由基，这极大地阻碍了CDT疗法的疗效；同时，引入无组织特异性的纳米药物，对正常细胞仍然会产生较大的影响，会对人体正常机能产生伤害。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料及其制备方法和应用。本发明提供的细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料兼具良好的CDT和PTT疗效，且具有良好的靶向性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料，包括癌细胞膜和包裹于所述癌细胞膜内的Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯。
优选的，所述Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13- 乙酸酯在合成过程中的质量比为90～110:35～55:2～6。
优选的，所述Au-Fe3O4纳米颗粒的粒径为7～10nm，所述Au-Fe3O4纳米颗粒中Au元素与Fe元素的质量比为1:1～10。
优选的，所述癌细胞膜为MCF-7乳腺癌细胞膜。
本发明提供了上述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和溶剂震荡混合，得到混合液；
(2)将癌细胞膜与所述混合液混合，进行多孔膜挤压，得到细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料。
优选的，所述Au-Fe3O4纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
(a)在无氧条件下，将金纳米颗粒、氯化十六铵、1-十八烯、油胺和有机铁盐加热混合，得到Au-Fe纳米颗粒；
(b)在有氧条件下，将所述Au-Fe纳米颗粒与1-十八烯、油胺加热混合，得到Au-Fe3O4纳米颗粒。
优选的，所述步骤(a)中加热混合的温度为120℃，所述步骤(b)中加热混合的温度为180℃。
优选的，所述多孔膜挤压使用的多孔膜为孔径为200～400nm的聚碳酸酯多孔膜；所述多孔膜挤压的次数为5～10次。
本发明提供了上述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料在制备抗癌药物中的应用。
本发明提供了上述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料在制备靶向药物中的应用。
本发明提供了一种细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料，包括癌细胞膜和包裹于所述癌细胞膜内的Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯。在本发明中，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA) 可以有效刺激细胞产生H2O2和活性氧O2 -，产生的H2O2可以对癌细胞中不足的H2O2进行补充，为Fenton反应补充原料，从而提高CDT疗法的疗效，产生的活性氧O2 -可以对癌细胞产生毒性作用；本发明利用Au-Fe3O4纳米颗粒作为CDT治疗的催化剂，其中Fe3O4分解，形成Fe2+和Fe3+，其中Fe2+能够催化癌细胞中的H2O2分解成羟基自由基，单宁酸能够促进Fe3O4产生的 Fe3+向Fe2+的快速转化，使Fenton反应更加彻底；同时，Au和Fe3O4具有良好的光热转化效率，能充分发挥PTT的治疗作用。本发明提供的靶向纳米材料无论在低H2O2含量和正常H2O2含量下都能进行强烈的Fenton反应，从而剧烈破坏癌细胞。同时，本发明提供的靶向纳米材料具有良好的磁性能，在制备过程中能够更方便地对药物洗涤和分离从而用于靶向治疗。本发明以癌细胞膜作为包覆材料，完美地靶向癌细胞，避免对正常细胞产生毒性作用。
附图说明
图1是金纳米颗粒、Au-Fe3O4纳米颗粒、AFTP@CM放入透射电镜图；
图2是Au-Fe3O4纳米颗粒的mapping分析图；
图3是AFTP@CM与Au-Fe3O4纳米颗粒的粒径比较图；
图4是Au-Fe3O4纳米颗粒表面存在的微孔的氮气吸附脱附图；
图5是AFTP@CM与AFTP混合液、MCF-7细胞膜的的zeta电位比较图；
图6是Au-Fe3O4的正己烷分散液、AFT混合液的显色图；
图7是Au-Fe3O4的正己烷分散液、AFT混合液的吸光度图；
图8是AFTP@CM存在下MCF-7细胞和A549细胞的细胞活性图；
图9是AFT@CM存在下MCF-7细胞和A549细胞的细胞活性图；
图10是AFP@CM存在下MCF-7细胞和A549细胞的细胞活性图；
图11是MCF-7乳腺癌细胞与AFTP@CM孵育30分钟后的成像结果；
图12是MCF-7乳腺癌细胞与AFTP@CM孵育60分钟后的成像结果；
图13是808nm激光激发下，AFTP@CM-PBS溶液与PBS溶液的的热响应图像；
图14是808nm激光激发下，AFTP@CM-PBS溶液与PBS溶液不同时间下的温度变化曲线；
图15是外部磁铁吸引前后AFTP@CM的PBS分散液的图像。
具体实施方式
本发明提供了一种细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料，包括癌细胞膜和包裹于所述癌细胞膜内的Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯。在本发明中，所述Au-Fe3O4纳米颗粒为表面修饰有Fe3O4纳米颗粒的Au纳米颗粒，所述Au纳米颗粒的粒径优选为3～5nm，所述Au-Fe3O4纳米颗粒的粒径优选为7～10nm。在本发明中，所述Au-Fe3O4纳米颗粒中Au 元素与Fe元素的质量比优选为1:1～10，更优选为1:8～12。
在本发明中，所述Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13- 乙酸酯在合成过程中的质量比优选为90～110:35～55:2～6，更优选为100:45:4。
在本发明中，所述细胞膜优选为MCF-7乳腺癌细胞膜。
在本发明中，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)可以有效刺激细胞产生H2O2和活性氧O2 -，产生的H2O2可以对癌细胞中不足的H2O2进行补充，为Fenton反应补充原料，从而提高CDT疗法的疗效，产生的活性氧O2 -可以对癌细胞产生毒性作用；本发明利用Au-Fe3O4纳米颗粒作为CDT治疗的催化剂，其中Fe3O4分解，形成Fe2+和Fe3+，其中Fe2+能够催化癌细胞中的H2O2分解成羟基自由基，单宁酸能够促进Fe3O4产生的Fe3+向Fe2+的快速转化，使 Fenton反应更加彻底；同时，Au和Fe3O4具有良好的光热转化效率，能充分发挥PTT的治疗作用。本发明提供的靶向纳米材料无论在低H2O2含量和正常 H2O2含量下都能进行强烈的Fenton反应，从而剧烈破坏癌细胞。同时，本发明提供的靶向纳米材料具有良好的磁性能，为药物的洗涤和分离过程提供了更高效的方法。本发明以癌细胞膜作为包覆材料，完美地靶向癌细胞，避免对正常细胞产生毒性作用。
本发明提供了上述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和溶剂震荡混合，得到混合液；
(2)将癌细胞膜与所述混合液混合，进行多孔膜挤压，得到细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料。
本发明将Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和溶剂震荡混合，得到混合液。在本发明中，所述Au-Fe3O4纳米颗粒的制备方法优选包括以下步骤：
(a)在无氧条件下，将金纳米颗粒、氯化十六铵、1-十八烯、油胺和有机铁盐加热混合，得到Au-Fe纳米颗粒；
(b)在有氧条件下，将所述Au-Fe纳米颗粒与1-十八烯、油胺加热混合，得到Au-Fe3O4纳米颗粒。
本发明优选在无氧条件下，将金纳米颗粒、氯化十六铵、1-十八烯、油胺和有机铁盐加热混合，得到Au-Fe纳米颗粒。在本发明中，所述金纳米颗粒的粒径优选为4nm。本发明对所述金纳米颗粒的来源没有特殊的要求，使用本领域常规市售的金纳米颗粒或自行制备均可。当自行制备所述金纳米颗粒时，所述制备方法优选包括以下步骤：
在N2氛围中，将HAuCl4溶液与硼烷-叔丁胺溶液混合，进行还原反应，得到金纳米颗粒。
在本发明中，所述HAuCl4溶液的溶剂优选为1,2,3,4-四氢萘和油酸胺，所述1,2,3,4-四氢萘和油酸胺的体积比优选为0.8～1:0.8～1，更优选为1:1；所述 HAuCl4溶液中HAuCl4的质量与溶剂的体积比优选为0.8g～1g:90mL～100mL，更优选为1g:100mL。在本发明中，所述硼烷-叔丁胺溶液优选为1,2,3,4-四氢萘和油酸胺，所述1,2,3,4-四氢萘和油酸胺的体积比优选为0.8～1:0.8～1，更优选为1:1；所述硼烷-叔丁胺溶液中硼烷-叔丁胺的摩尔量与溶剂的体积比优选为0.8mmol～1mmol:3.5mL～4.5mL，更优选为1mmol:4mL。在本发明中，所述 HAuCl4的质量与硼烷-叔丁胺摩尔量的比为1.8g～2g:4.8mmol～5mmol，更优选为2g:5mmol。
本发明优选在冰浴的条件下进行所述还原反应，在本发明中，所述还原反应的温度优选为2℃～4℃，更优选为4℃，时间优选为1.5h～2h，更优选为 1.6～1.8h。
所述还原反应后，本发明优选对所得还原反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
向所述还原反应液中加入丙酮并离心，得到金纳米颗粒；
对所述金纳米颗粒进行洗涤。
本发明对所述丙酮的加入量没有特殊的要求，能够使金纳米颗粒沉降即可；在本发明中，所述离心的速率优选为9000～10000r/min，时间优选为 8～10min。
在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为正己烷和乙醇，所述洗涤的方式优选为离心洗涤，所述离心的速率优选为8500～9000r/min，时间优选为 8～10min。所述洗涤后，所得金纳米颗粒优选置于正己烷中在4℃条件下保存。
在本发明中，所述氯化十六铵(HDA.HCl)的制备方法优选包括以下步骤：
将HCl、乙醚、HDA与正己烷在冰浴条件下混合，得到氯化十六铵沉淀。
在本发明中，所述HCl的体积、乙醚的体积、HDA的摩尔量与正己烷的体积比优选为0.8～1mL:10～11mL:9～10mmol:130～150mL，更优选为 1mL:11mL:10mmol:150mL。
在本发明中，所述有机铁盐优选为二壬羰基铁和/或五羰基铁。在本发明中，所述金纳米颗粒的质量、氯化十六铵的摩尔量、1-十八烯的体积、油胺的体积和有机铁盐的质量比优选为24mg：1mmol：12mL：1mL：2.91g。本发明优选先将金纳米颗粒、氯化十六铵、1-十八烯和油胺混合，进行脱气，再加入有机铁盐。在本发明中，所述金纳米颗粒、氯化十六铵、1-十八烯和油胺混合的温度优选为115～125℃，更优选为120℃；时间优选为30～40min，更优选为30min。本发明对所述脱气的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的脱气方式即可；本发明通过脱气去除体系中的氧气。
在本发明中，所述金纳米颗粒、氯化十六铵、1-十八烯、油胺和有机铁盐加热混合的温度优选为175～185℃，更优选为180℃；时间优选为30～40min，更优选为30min。本发明通过在无氧条件下进行混合，使有机铁盐中的Fe离子被还原，得到Au-Fe纳米颗粒，即表面修饰有Fe纳米颗粒的金纳米颗粒。
得到所述Au-Fe纳米颗粒后，本发明在有氧条件下，将所述Au-Fe纳米颗粒与1-十八烯、油胺加热混合，得到Au-Fe3O4纳米颗粒。在本发明中，所述有氧条件优选为向混合体系中通入空气。在本发明中，所述Au-Fe纳米颗粒的质量与1-十八烯的体积、油胺的体积比优选为18～20mg:11～13mL:0.8～1 mL，更优选为20mg:12mL:1mL。
在本发明中，所述加热混合的温度优选为155～165℃，更优选为160℃；时间优选为15～20min。
将得到的Au-Fe3O4纳米颗粒后，本发明在Ar的温和流动下，将Au-Fe3O4纳米颗粒与油胺、油酸、苄基醚混合，脱气30分钟并加热，得到表面有微孔的Au-Fe3O4纳米颗粒。在本发明中，所述Au-Fe3O4纳米颗粒的质量与油胺的体积、油酸的体积、苄基醚的体积比优选625mg:1mL:1mL:125mL。在本发明中加热的时间优选为240℃，时间为30min。
本发明将Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和溶剂震荡混合，得到混合液。在本发明中，所述溶剂优选为PBS或灭菌水。在本发明中，所述单宁酸优选以单宁酸溶液的形式加入；所述单宁酸溶液的质量浓度优选为3.5～5.5mg/mL，更优选为4～5mg/mL。在本发明中，所述佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯优选以佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯溶液的形式加入，所述佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯溶液的质量浓度优选为 0.08～0.12mg/mL，更优选为0.1mg/mL；在本发明中，所述Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸与佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯溶液的质量比优选为 90～110:35～45:2～6，更优选为100:45:4。本发明优选在摇床上进行所述震荡混合，所述震荡混合的速率优选为100～120次/min，温度优选为2～4℃，时间优选为6～8h，更优选为6h。
得到所述混合液后，本发明将癌细胞膜与所述混合液混合，进行多孔膜挤压，得到细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料。在本发明中，所述癌细胞膜优选为MCF-7乳腺癌细胞膜。本发明对所述MCF-7乳腺癌细胞膜的来源没有特殊的要求，使用本领域熟知的MCF-7乳腺癌细胞膜或自行制备均可；当自行制备时，所述制备方法优选包括以下步骤：
将MCF-7乳腺癌细与胰蛋白酶、DMEM混合，依次进行超声和离心，所得沉淀物为MCF-7乳腺癌细胞膜。
在本发明中，所述MCF-7乳腺癌细胞与胰蛋白酶、DMEM的用量比优选为5×106个:1mL:5mL，细胞膜提取完毕后溶解在1mL PBS中。在本发明中，所述超声的功率优选为90～100W，时间优选为30～50min。
在本发明中，所述离心优选包括依次进行的第一离心和第二离心，所述第一离心的速率优选为2500～3000rpm，温度优选为2～4℃，时间优选为 8～10min；所述第一离心后，除去沉淀物，保留上清液。
在本发明中，所述第二离心的速率优选为14000～15000rpm，时间优选为 20～25min。
在本发明中，所述细胞膜的体积(uL)与Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸溶液和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯在合成过程中的质量比优选为 30～50:90～110:35～55:2～6，更优选为30:100:45:4。本发明优选使用挤出机进行所述多孔挤压；在本发明中，多孔膜挤压使用的多孔膜优选为400nm的聚碳酸酯多孔膜；所述多孔膜挤压的次数优选为5～10次，更优选为6～8次。
本发明优选对所得多孔膜挤压后的产物进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
对所得多孔膜挤压后的产物依次进行磁吸，并将磁吸出的物质与磷酸缓冲液进行混合。
本发明优选在磁力架上进行所述磁吸，所述磁吸的时间优选为30～60s。本发明对所述磷酸缓冲液的用量没有特殊的要求，能够将磁吸出的物质完全分散即可。
在本发明中，上述后处理的重复次数优选为3次。本发明通过所述后处理，能够去除多余的细胞膜。
本发明提供了上述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料在制备抗癌药物中的应用。
本发明提供了上述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料在制备靶向药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)金纳米颗粒的合成
(1)在氮气的温和流动下，将0.2g HAuCl4·3H2O，10mL 1,2,3,4-四氢萘和10mL油酸胺搅拌混合，直至液体呈橙黄色；在冰浴中将上述溶液冷却至 4℃；
(2)将0.5mmol的硼烷-叔丁胺溶于1mL 1,2,3,4-四氢萘和1mL的油胺的混合溶液中，使其完全溶解，然后将其倒入步骤(1)所得溶液中，此时，溶液呈深紫色，反应持续2h；
(3)反应完成后，加入50mL丙酮，在10000r/min下离心8min，向所得固体中加入20mL正己烷和50mL乙醇，在9000r/min下离心8min，得到金纳米颗粒，存储于4℃正己烷中备用。
(二)Au-Fe纳米颗粒的合成
(1)在氩气流下，将1mmol的HDAHCl溶液与12mL的1-十八烯和1mL 的油胺混合，加热至120℃，添加24mg金纳米颗粒，脱气30分钟；
(2)将该溶液进一步加热至180℃，加入2.91g的二壬羰基铁，反应继续进行30分钟，然后冷却至室温；
(3)加入45mL异丙醇，在8500r/min下离心8min，向所得固体中加入 20mL正己烷，50mL乙醇，然后在8500r/min下离心8min，得到Au-Fe纳米颗粒，存储于4℃正己烷中备用。
(三)Au-Fe3O4纳米颗粒的合成
(1)将20mg的Au-Fe纳米颗粒与20mL的1-十八烯和1mL的油胺混合，并在空气的流动下在160℃条件下反应15分钟然后冷却至室温；
(2)加入45mL异丙醇，在8500r/min下离心8min，向所得固体中加入 20mL正己烷，50mL乙醇，然后在8500r/min下离心8min，得到Au-Fe3O4纳米颗粒，存储于4℃正己烷中备用；
(3)在Ar的温和流动下，将50mg的第(2)步中的产品与0.08mL油胺、 0.08mL油酸和10mL苄基醚充分混合，然后转移到三颈烧瓶中，在室温下脱气30分钟。然后用磁力搅拌混合物并以每分钟5℃的速率加热至240℃，在此温度下保持30分钟，然后冷却至室温；
(4)加入45mL异丙醇，在8500r/min下离心8min，向所得固体中加入 20mL正己烷，50mL乙醇，然后在8500r/min下离心8min，得到表面带有微孔的Au-Fe3O4纳米颗粒，存储于4℃正己烷中备用。
(四)MCF-7细胞膜的获取
将MCF-7细胞在95％的湿度，5％的CO2浓度环境中进行培养，当细胞在直径为10cm的细胞培养皿中生长直至完全融合时，下加入1mL胰蛋白酶，并在37℃的细胞培养箱中培养，在恒定温度下保持1分钟。然后加入补充有双抗和胎牛血清的5mL DMEM以防止消化，并将细胞转移到15mL离心管中进行离心。用100W的超声波细胞粉碎机将获得的细胞粉碎50min，将其在4℃以2500rpm离心10分钟。除去沉淀物，将上清液以15000rpm离心20分钟，并收集最终的沉淀物，用作后续实验的纯化细胞膜。
(五)细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料(AFTP@CM)的合成
(1)将100μL Au-Fe3O4的正己烷分散液与100μL浓度为4.5mg/mL的单宁酸(TA)和20μL浓度为0.1mg/mL的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA) 在4℃的条件下在摇床上以120次/min的速率震荡孵育6小时，得到AFTP混合液；
(2)然后将制备的MCF-7细胞膜与AFTP混合，并在小型挤出机上使用 400nm的聚碳酸酯多孔膜连续挤压5次，得到AFTP@CM；
(3)将装有AFTP@CM的试管放在磁力架上，静置60s，吸出液体中添加PBS，超声1min，然后将其放在磁力架上。重复此过程三遍，以去除多余的细胞膜。
按照同样的方法省略PMA的加入，得到AFT@CM；省略TA的加入，得到AFP@CM。
对所得金纳米颗粒、Au-Fe3O4纳米颗粒、AFTP@CM进行透射电镜分析，所得结果如图1所示。图1中(a)为金纳米颗粒的透射电镜图，(b)为Au-Fe3O4纳米颗粒的透射电镜图，(c)为AFTP@CM的透射电镜图。从图1中可以看出，金纳米颗粒的粒径为4nm，Au-Fe3O4纳米颗粒的粒径为10nm，AFTP@CM 的粒径为20nm，且(b)中可以看出Fe3O4已经修饰在Au纳米颗粒表面。
对所得Au-Fe3O4纳米颗粒进行mapping分析，所得结果如图2所示。从图 2中可以看出，Au-Fe3O4纳米颗粒中含有Au，Fe和O元素。
对所得AFTP@CM的粒径、zeta电位进行测试，其与Au-Fe3O4纳米颗粒的粒径比较图如图3所示，Au-Fe3O4纳米颗粒表面存在的微孔的氮气吸附脱附图如图4所示，Au-Fe3O4纳米颗粒与AFTP混合液、MCF-7细胞膜的的zeta 电位比较图如图5所示。由图3、图4、图5可以看出Au-Fe3O4纳米颗粒表面存在1.2nm左右的微孔，且经过一系列修饰后，AFTP@CM的粒径粒径从大约 10nm增加到20nm，并且zeta电位发生了显着变化，说明癌细胞膜已完美包裹 AFTP@CM。
对比例1
将100μL Au-Fe3O4的正己烷分散液与100uL浓度为4.5mg/mL的单宁酸 (TA)在4℃的条件下在摇床上以120次/min的速率震荡孵育6小时，得到AFT 混合液。
分别向1mL Au-Fe3O4的正己烷分散液、1mL AFT混合液中加入80uL30％的H2O2和100uL3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，观察溶液颜色，结果如图6 所示。对其吸光度进行测试，所得结果如图7所示。由图6、图7可以看出，与Au-Fe3O4相比，AFT在650nm处具有更高的吸光度，这充分表明TA有效地促进了Fe3+向Fe2+的转化，能够提高Fenton反应的效率。
性能测试
(一)细胞培养
将实验中涉及的所有MCF-7乳腺癌细胞和A549细胞在恒温恒湿箱中于 37℃，湿度为95％，CO2浓度为5％的条件下进行培养。用于细胞的培养基是具有10％胎牛血清和1％双重抗体(青霉素-链霉素)的DMEM。
(二)细胞毒性试验
将MCF-7细胞和A549细胞分别与AFTP@CM，AFT@CM和AFP@CM在细胞培养箱中孵育3小时、6小时、9小时、12小时和24小时。小心吸出上清液，加入10μL MTT和90μL新鲜培养基，在37℃保持4小时。然后吸出上清液，加入110μL的二甲基亚砜(DMSO)溶液，并在振荡器上低速振荡10分钟。使用 MTT试剂盒来检测AFTP@CM，AFT@CM，AFP@CM对MCF-7细胞和A549 细胞的毒性，其中AFTP@CM对MCF-7细胞和A549细胞细胞活力的影响如图 8所示，AFT@CM对MCF-7细胞和A549细胞细胞活力的影响如图9所示， AFP@CM对MCF-7细胞和A549细胞细胞活力的影响如图10所示。由图8～10 可以看出，AFT@CM和AFP@CM对细胞具有很强的细胞毒性，而AFTP@CM 对细胞更具毒性。这充分说明了TA和PMA对CDT治疗的促进作用以及 AFTP@CM对细胞的杀伤作用。
(三)细胞内成像和靶标识别
将MCF-7细胞膜用DiI荧光染料染色，并用染色的细胞膜制备 AFTP@CM。将MCF-7细胞(1mL，1×105细胞)的细胞核中用DAPI荧光染料染色，然后分别与AFTP@CM孵育30分钟和60分钟。用激光共聚焦仪观察并拍照，孵育30min的成像结果如图11所示，孵育60min的成像结果如图12 所示。由图11和图12可以看出，孵育30分钟后，AFTP@CM已成功进入MCF-7 细胞的细胞质。当孵化时间达到60分钟时，AFTP@CM已成功地将药物递送至MCF-7细胞的细胞核。
(四)AFTP@CM的光热性能
将AFTP@CM分散于PBS溶液中，在808nm激光激发下，AFTP@CM-PBS 溶液与PBS溶液的的热响应图像如图13所示。由图13可以看出，AFTP@CM 具有很强的热响应。
在808nm激光激发下，AFTP@CM-PBS溶液与PBS溶液不同时间下的温度变化曲线如图14所示。由图14可以看出，在808nm激光激发下AFTP@CM 温度迅速升高，迅速达到67℃。这说明AFTP@CM可以成功应用于PTT治疗。
(五)AFTP@CM的磁性能
使用外部磁铁对AFTP@CM的PBS分散液的磁性能进行测试，外部磁铁吸引前后的图像如图15所示。由图15可以看出，AFTP@CM具有出色的磁性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料，包括癌细胞膜和包裹于所述癌细胞膜内的Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯。
2.根据权利要求1所述的细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料，其特征在于，所述Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯在合成过程中的质量比为90～110:35～55:2～6。
3.根据权利要求1所述的细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料，其特征在于，所述Au-Fe3O4纳米颗粒的粒径为7～10nm，所述Au-Fe3O4纳米颗粒中Au元素与Fe元素的质量比为1:1～10。
4.根据权利要求1所述的细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料，其特征在于，所述癌细胞膜为MCF-7乳腺癌细胞膜。
5.权利要求1～4任意一项所述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Au-Fe3O4纳米颗粒、单宁酸、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和溶剂震荡混合，得到混合液；
(2)将癌细胞膜与所述混合液混合，进行多孔膜挤压，得到细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述Au-Fe3O4纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
(a)在无氧条件下，将金纳米颗粒、氯化十六铵、1-十八烯、油胺和有机铁盐加热混合，得到Au-Fe纳米颗粒；
(b)在有氧条件下，将所述Au-Fe纳米颗粒与1-十八烯、油胺加热混合，得到Au-Fe3O4纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中加热混合的温度为120℃，所述步骤(b)中加热混合的温度为180℃。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述多孔膜挤压使用的多孔膜为孔径为200～400nm的聚碳酸酯多孔膜；所述多孔膜挤压的次数为5～10次。
9.权利要求1～4任意一项所述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料或权利要求5～8任意一项所述制备方法制备得到的细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料在制备抗癌药物中的应用。
10.权利要求1～4任意一项所述细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料或权利要求5～8任意一项所述制备方法制备得到的细胞膜包覆Au-Fe3O4的靶向纳米材料在制备靶向药物中的应用。
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