JP2021194004A - 水中油中水型多相エマルションの製造方法 - Google Patents

水中油中水型多相エマルションの製造方法 Download PDF

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Chia-Chen Hsu
ナイ‐イ ワン，
Nai-Yi Wang
ユ‐チェン チェン，
Yu-Chen Cheng
ジン‐ツィ ライ，
Jinn-Tsyy Lai
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Abstract

【課題】封入された活性成分の安定性が改善された水中油中水型多相エマルションの製造方法を提供する。【解決手段】（ａ）活性成分を内部水性相と混合して、均質化混合物を得るステップと；（ｂ）均質化混合物を油性相と混合して、油中水型エマルションを得るステップと；（ｃ）油中水型エマルションを外部水性相と混合して、水中油中水型多相エマルションを得るステップとを含み、外部水性相が水及び賦形剤を含み、賦形剤が乳清タンパク質濃縮物及び加工デンプンを含む、水中油中水型多相エマルションを製造する方法を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野
[0001]本発明は、エマルションの製造方法に関し、特に水中油中水型多相エマルションの製造方法に関する。
背景
[0002]Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（食品工業発展研究所）（ＦＩＲＤＩ）のＩｎｄｕｓｔｒｙ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ（産業技術情報サービス）（ＩＴＩＳ）による統計的解析データによれば、台湾における栄養補助食品の市場は２０１３年に５４１億ニュー台湾ドルであり、市場は成長し続けている。中でも、ラクトバチルス細菌は市場の５％を占め、ラクトバチルス細菌を使用して改良品を開発することができる人々に対してその価値を実証している。新しいプロバイオティクス製品の重要な開発目標は、製造中及び保存中、並びに胃腸管における、生存率及び安定性を改善することである。
概要
[0003]本発明の主な目的は、封入された活性成分の安定性が改善された水中油中水型多相エマルションの製造方法を提供することである。
[0004]したがって、本発明は、
（ａ）活性成分を内部水性相と混合して均質化混合物を得るステップと；
（ｂ）均質化混合物を油性相と混合して油中水型エマルションを得るステップと；
（ｃ）油中水型エマルションを外部水性相と混合して水中油中水型多相エマルションを得るステップと
を含む水中油中水型多相エマルションの製造方法であって、外部水性相が水及び賦形剤を含み、賦形剤が乳清タンパク質濃縮物及び加工デンプンを含む、製造方法を提供する。
[0005]本発明は、上記の方法により得られる組成物をさらに提供する。
４℃で分析される、ラクトバチルスカゼイ（カゼイ菌）多相エマルション粉末の安定性を示す図である。 再水和多相エマルション粉末の胃酸耐性の結果を示す図である。 再水和多相エマルション粉末の胆汁酸塩耐性の結果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの排泄物中のカゼイ菌数の変化を経時的に示す図である（３日目、７日目、及び１４日目）。 ２１日目における、マウスの盲腸内容物中のカゼイ菌の量に対する試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの排泄物中のビフィズス菌数の変化を経時的に示す図である（３日目、７日目、及び１４日目）。 試験終了時（２１日目）における、試験物質を投与されたマウスの盲腸内容物中のビフィズス菌の量に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの排泄物中のウェルシュ菌数の変化を経時的に示す図である（３日目、７日目、及び１４日目）。 試験終了時（２１日目）における、試験物質を投与されたマウスの盲腸内容物中のウェルシュ菌の量に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの腸管内のマルターゼ活性に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの腸管内のスクラーゼ活性に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの腸管内のロイシンアミノペプチダーゼ活性に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの腸管内のリパーゼ活性に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの排泄物中のカゼイ菌数の変化を経時的に示す図である（１日前、７日目、及び１４日目）。 試験終了時（２１日目）における、試験物質を投与されたマウスの盲腸内容物中のカゼイ菌の量に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの排泄物中のビフィズス菌数の変化を経時的に示す図である（１日前、７日目、及び１４日目）。 試験終了時（２１日目）における、試験物質を投与されたマウスの盲腸内容物中のビフィズス菌の量に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの排泄物中のウェルシュ菌数の変化を経時的に示す図である（１日前、７日目、及び１４日目）。 試験終了時（２１日目）における、試験物質を投与されたマウスの盲腸内容物中のウェルシュ菌の量に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの腸管内のマルターゼ活性に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの腸管内のスクラーゼ活性に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの腸管内のロイシンアミノペプチダーゼ活性に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与されたマウスの腸管内のリパーゼ活性に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与された正常マウスモデルの盲腸内容物中のカゼイ菌遺伝子の発現に対する、試験物質の効果を示す図である。 試験物質を投与された抗生物質処理マウスモデルの盲腸内容物中のカゼイ菌遺伝子の発現に対する、試験物質の効果を示す図である。
詳細な説明
[0031]本発明は、本発明の様々な実施形態の以下の詳細な説明、実施例、並びに化学的な図面及び表とそれらに伴う関連する説明を参照することにより、より容易に理解することができる。
[0032]本開示にしたがって使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下の意味を有すると理解するべきである。
[0033]本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、文脈上別途必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むことになり、複数形の用語は単数を含むことになる。
[0034]多くの場合、範囲は本明細書において、「およその」１つの特定の値から及び／又は「およその」別の特定の値までと表される。そのような範囲を表す場合、実施形態は一方の特定の値から及び／又は他方の特定の値までの範囲を含む。同様に、「約」という語を使用して値が近似値として表される場合、特定の値は別の実施形態をなすことを理解することになる。各々の範囲の終点は、他方の終点と関連してかつ独立に意味があるものであることをさらに理解することになる。
[0035]本発明は、経口投与製品の開発に多相乳化技術を導入し、処方及びプロセスの設計によって経口投与製品のための封入技術を確立する。多相乳化技術は多層膜構造を使用して空間的分離を実現し、活性成分は単離及び保護の目的のために内部水性相内に封入される。多相乳化技術は多様な製品に利用されてもよい。
[0036]乳化技術は、本来は非混和性である二相について言及するものであり、二相の一方が他方の相に微粒子として分散している。エマルションは水中油（Ｏ／Ｗ）系及び油中水（Ｗ／Ｏ）系に分類することができる。多相エマルションは、Ｗ／Ｏエマルション及びＯ／Ｗエマルションの両方が同時に存在する複合系である。分散相の特性及び連続相の特性にしたがって、多相エマルションは、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）系及び油中水中油（Ｏ／Ｗ／Ｏ）系に分類することができる。多層フィルム構造に起因して、多相エマルションは単離、保護、味のマスキング、徐放などの目的で水溶性及び油溶性物質を一体的に封入することができる。したがって、多相エマルション技術は工業用途の可能性を有する。
[0037]すなわち、本発明は、
（ａ）活性成分を内部水性相と混合して均質化混合物を得るステップと；
（ｂ）均質化混合物を油性相と混合して油中水型エマルションを得るステップと；
（ｃ）油中水型エマルションを外部水性相と混合して水中油中水型多相エマルションを得るステップと
を含む、水中油中水型多相エマルションの製造方法であって、外部水性相が水及び賦形剤を含み、賦形剤が乳清タンパク質濃縮物及び加工デンプンを含む、
製造方法を提供する。
[0038]本発明の水中油中水型多相エマルションは、内部水性相、油性相、及び外部水性相を含んでいてもよい。内部水性相及び外部水性相は独立に、水又は水溶液で構成されていてもよい。油性相は疎水性液体又は疎水性溶液で構成されていてもよい。以下、「水中油中水型多相エマルション」は、「多相エマルション」と呼ぶ場合がある。
[0039]本発明において、活性成分は薬剤又は微生物であってもよい。薬剤としては、限定はされないが、小分子薬剤、生物学的製剤、又は伝統的な漢方薬製剤を挙げることができる。好ましくは、薬剤は可溶性であり、水中で安定である。
[0040]本発明で使用される微生物の種類に対する制限はない。例えば、微生物は、細菌、真菌、放線菌、原生動物、又は藻であってもよい。いくつかの実施形態において、微生物は、１つ又は複数のプロバイオティクス、例えばラクトバチルスアシドフィルス、ビフィズス菌種、ラクトバチルスカゼイ（カゼイ菌）、ラクトバチルスロイテリ、ビフィドバクテリウムラクティス、ビフィドバクテリアムロンガム、及びそれらの任意の組み合わせなどであってもよい。
[0041]いくつかの実施形態において、内部水性相は水及び賦形剤を含む。本明細書において使用される賦形剤としては、油中水型エマルションに適している１つ又は複数が挙げられる。例えば、賦形剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、アラビアゴム、カゼイン酸ナトリウム、大豆タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。
[0042]内部水性相は、任意選択により１つ又は複数の塩も含んでいてもよい。好ましくは、塩は、生理的に許容可能な塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、リンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸水素二カリウムなどである。
[0043]いくつかの実施形態において、内部水性相は、内部水性相の総重量を基準として約３ｗｔ％のゼラチン及び約２ｗｔ％の塩化ナトリウムを含んでいてもよい。
[0044]活性成分及び内部水性相を混合するための本発明の方法に対する制限はない。例えば、活性成分は１つ又は複数の微生物（例えば、プロバイオティクス）であってもよく、これらの微生物は乾燥粉末の形態又は培養液を含有する形態であってもよい。いくつかの実施形態において、培養後に、微生物の培地を遠心分離により取り除いてもよく、得られるペレットを次いで同体積（上清と同じ体積）の内部水性相中に再懸濁させて均質化混合物を得ることができる。
[0045]本明細書で使用する油性相は、油中水型エマルションに適している任意の疎水性液体、例えば植物油又は動物性油などであってもよい。例えば、油性相は、１つ又は複数の植物油、例えばヒマワリ油、大豆油、オリーブ油、キャノーラ油、亜麻仁油、パーム油、及び任意のそれらの組み合わせなどを含んでいてもよい。
[0046]油性相は、任意選択により１つ又は複数の親油性界面活性剤、例えばポリグリセリンポリリシノレエート（ＰＧＰＲ）、レシチン、糖エステル、乳化ワックス、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリソルベート、モノグリセリド、ジグリセリド、及びそれらの任意の組み合わせなども含んでいてもよい。
[0047]いくつかの実施形態において、油性相はヒマワリ油を含み、油性相の総重量を基準として約８ｗｔ％のＰＧＰＲを含む。
[0048]均質化混合物を油性相と混合する場合、好ましい方法は均質化混合物を油性相へ加えることである。さらなる好ましい実施形態において、活性成分の活性を維持するために、混合プロセスは低温で行われる（例えば、約０℃〜約１０℃、好ましくは約４℃）。例えば、油性相を氷冷浴中でホモジナイザーによりゆっくり撹拌し、均質化混合物を連続的に油性相へ加え、次いで撹拌スピードを例えば約１２０００ｒｐｍまで約３分間上昇させて油中水型エマルションを得る。いくつかの実施形態において、均質化混合物及び油性相を約１：１．５の体積比で混合する。
[0049]乳清タンパク質は、チーズ製造からの液体副生成物である乳清から単離されたタンパク質の混合物である。乳清タンパク質はα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、血清アルブミン、及びイムノグロブリンで構成され得る。他の形態の乳清タンパク質と比較して、乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）は典型的には脂肪及びコレステロールをより少なく含むが、乳糖で形成される炭水化物をより多く含む。さらに、乳清タンパク質濃縮物中のタンパク質の総量は、乳清タンパク質濃縮物の総重量を基準として約２９ｗｔ％〜約８９ｗｔ％の範囲であってもよい。本発明の好ましい実施形態において、使用される乳清タンパク質濃縮物はその総重量を基準として約８０ｗｔ％を超えるタンパク質を有していてもよい。
[0050]外部水性相の賦形剤の１つとして有用である加工デンプンは、食品添加剤として使用できる任意の加工デンプンであってもよい。いくつかの実施形態において、加工デンプンはオクテニルコハク酸加工デンプン（オクテニルコハク酸デンプンナトリウム（ＯＳＡデンプン））である。
[0051]いくつかの実施形態において、乳清タンパク質濃縮物と加工デンプンとの重量比は約４：１〜約１：４、例えば約３：１〜約１：３、又は約２：１〜約１：２などの範囲である。好ましくは、乳清タンパク質濃縮物と加工デンプンとの重量比は約２：１である。
[0052]いくつかの実施形態において、外部水性相は任意選択により、ＨＰＭＣ、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、アラビアゴム、カゼイン酸ナトリウム、大豆タンパク質、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、追加の賦形剤を含んでいてもよい。外部水性相中の追加の賦形剤は、内部水性相中の賦形剤と同じ又は異なっていてもよい。
[0053]追加の賦形剤がアルギン酸ナトリウムである場合、追加の賦形剤は好ましくはゼラチンの形態ではない。すなわち、アルギン酸ナトリウムはゲル化していない。したがって、多相エマルションは好ましくは、アルギン酸ナトリウムゼラチンを生じさせることがある、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋などのいかなる二価のカチオンも含有しない。
[0054]いくつかの実施形態において、追加の賦形剤はＨＰＭＣである。いくつかの実施形態において、外部水性相は、賦形剤の総重量を基準として、約５５ｗｔ％〜約７０ｗｔ％の乳清タンパク質濃縮物、約２５ｗｔ％〜約３５ｗｔ％の加工デンプン、及び約１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の追加の賦形剤を含む。好ましくは、乳清タンパク質濃縮物と、加工デンプンと、追加の賦形剤との重量比は３８：１９：３である。いくつかの実施形態において、外部水性相は、その総重量を基準として、約２５ｗｔ％の賦形剤（複数可）、例えば、乳清タンパク質濃縮物、加工デンプン、及び追加の賦形剤を含む。
[0055]上記と同様に、油中水型エマルションを外部水性相と混合する場合、外部水性相をホモジナイザーにより低速で撹拌し、次いで油中水型エマルションを外部水性相へ加える。添加される油中水型エマルションと外部水相との体積比は約２：８とすることができる。次いで撹拌スピードを例えば約８，０００ｒｐｍまで約２分間上昇させて水中油中水型多相エマルションを得る。
[0056]本発明の上記の方法は、水中油中水型多相エマルションの多層膜構造中に活性成分を封入して活性成分の安定性を改善することができ、単離、保護、味のマスキング、及び徐放の効果を実現することができる。活性成分が微生物である場合、その生存率を改善することもできる。
[0057]いくつかの実施形態において、水中油中水型多相エマルションを噴霧乾燥させて多相エマルション粉末を得ることができる。一実施形態において、入口温度及び出口温度はそれぞれ約１３０℃及び約８０℃とすることができる。噴霧乾燥プロセスによって、水中油中水型多相エマルションの水分を部分的又は完全に除去することができ、その結果得られる多相エマルション粉末は改善された保存の安定性を有する。
[0058]本発明は、上記の方法により製造される組成物をさらに提供する。したがって、組成物は水中油中水型多相エマルション又は上記の噴霧乾燥多相エマルション粉末であってもよい。
[0059]以下の実施例は例証の目的のためにのみ示され、本発明の範囲を限定することを意図していない。
１．材料
Figure 2021194004
２．実験方法
水中油中水型多相エマルションの調製
[0060]多相エマルションを２段階乳化法により製造した。内部水性相、油性相、及び外部水性相を個々に調製した。それらの成分を以下の表に列挙する。外部水性相の賦形剤の処方を、「結果及び考察」の章に記載する。
Figure 2021194004
[0061]ラクトバチルスカゼイ（カゼイ菌）培養液を６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを同体積の内部水性相に再懸濁させて均質化混合物を得た。次いで、１倍の体積の均質化混合物を、低速で撹拌されたホモジナイザー中にある１．５倍の体積の油性相へ加えた。均質化混合物を完全に加えた後、撹拌スピードを次いで１２，０００ｒｐｍまで３分間上昇させて、均質化混合物を油性相と適切に混合して油中水型エマルションを得た。均質化プロセスは、カゼイ菌の死を防ぐために氷冷浴で行った。
[0062]２倍の体積の油中水型エマルションを、低速で撹拌されたホモジナイザー中にある８倍の体積の外部水性相へ加えた。油中水型エマルションを完全に加えた後、撹拌スピードを８，０００ｒｐｍまで２分間上昇させて水中油中水型多相エマルションを得た。
多相エマルション粉末の調製
[0063]上記のカゼイ菌含有水中油中水型多相エマルションを１３０℃の入口温度及び８０℃の出口温度で噴霧乾燥させて多相エマルション粉末を得た。得られる粉末を収集し秤量して回収率を計算した（回収率＝収集された粉末の重量／噴霧乾燥前の固形分の重量）。多相エマルション粉末を培養プレートに広げることにより、多相エマルション粉末中のカゼイ菌の生存率を測定した。その後使用される「カゼイ菌含有多相エマルション粉末」は、「プロバイオティクス含有多相エマルション剤形」又は「カゼイ菌含有多相エマルション剤形」とも呼ばれる。
動物モデル
プレスクリーニング試験
[0064]どの多相エマルション剤形がプロバイオティクスに最良の保護をもたらすことができるかを迅速に特定するために、様々な処方についての排泄物のプロバイオティクス数の変化を測定した。
動物試験
[0065]月齢２か月のオスのＩＣＲマウスを以下の投与群：対照群、ブランクエマルション投与群、プロバイオティクス含有多相エマルション剤形投与群、及び非製剤化カゼイ菌投与群に割り当てた（１つの群に１０匹のマウス）。試験において、１０ｍＬ／ｋｇ体重の脱イオン水（対照群）、１×１０８ｃｆｕ／ｋｇ体重の各々のプロバイオティクス含有多相エマルション剤形Ｅ１〜Ｅ７（「結果及び考察」の章の表３を参照）、及び１×１０８ｃｆｕ／ｋｇ体重の非製剤化カゼイ菌（すなわち、カゼイ菌の培養液）をそれぞれ、各群のマウスに経口投与した。プロバイオティクス分析のためのマウスの排泄物を、投与の前日（Ｐｒｅ−Ｄ１）、並びに投与後７日目（Ｄ７）、及び１４日目（Ｄ１４）に採取した。
正常マウスモデル
[0066]プレスクリーニング試験の結果に基づいて選択された１つの特定のプロバイオティクス含有多相エマルション剤形を使用してマウス胃腸管におけるその有効性を評価した。試験において、非製剤化カゼイ菌及びマイクロカプセル化カゼイ菌の有効性も測定した。
[0067]月齢２か月のオスのＩＣＲマウスを以下の投与群：対照群（Ｈ２Ｏ）、ブランクエマルション（「結果及び考察」の章の表３に示されるＥ５の賦形剤のみを含有する）投与群、ブランクマイクロカプセル（マイクロカプセルのみを含有する）投与群、非製剤化カゼイ菌（カゼイ菌培養液）投与群、プロバイオティクス含有多相エマルション剤形（Ｅ５を配合したカゼイ菌）投与群、及びマイクロカプセル化カゼイ菌（マイクロカプセル中に封入されたカゼイ菌）投与群に割り当てた（１つの群に１０匹のマウス）。試験において、１０ｍＬ／ｋｇ体重の脱イオン水（対照群）、１０ｍＬ／ｋｇ体重のブランクエマルション、１０ｍＬ／ｋｇ体重のブランクマイクロカプセル（９：１の比の大豆タンパク質及びアルギン酸ナトリウムで構成される外部水性相を含有する）、１×１０８ｃｆｕ／ｋｇ体重の非製剤化カゼイ菌、１×１０８ｃｆｕ／ｋｇ体重のプロバイオティクス含有多相エマルション剤形、及び１×１０８ｃｆｕ／ｋｇ体重のマイクロカプセル化カゼイ菌をそれぞれ、１日１回、３週間にわたって各群のマウスに経口投与した。プロバイオティクス分析のためのマウスの排泄物を、投与の前日（Ｐｒｅ−Ｄ１）、並びに投与後３日目（Ｄ３）、７日目（Ｄ７）、及び１４日目（Ｄ１４）に採取した。マウスを投与後２１日目（Ｄ２１）に屠殺し、小腸及び盲腸を採取して、腸消化酵素の活性、及び盲腸内の細菌叢の量を測定した。
抗生物質処理モデル
[0068]マウスの胃腸機能に対する試験物質の効果を評価するために、試験物質の投与前に広域抗生物質をマウスに投与した（参照文献： Ｙａｎｇ，Ｌ．Ｃ．、Ｌｕ，Ｔ．Ｊ．、及びＬｉｎ，Ｗ．Ｃ．、Ｔｈｅ ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｆｕｎｃ Ｆｏｏｄ １０月５日、（４）；１６４２〜５３）。
[0069]月齢２か月のオスのＩＣＲマウスを以下の投与群：ＮＴ群（ＮＴ−Ｈ２Ｏ；抗生物質処理されていない）、対照群（Ｈ２Ｏ）、ブランクエマルション投与群（ブランクＥ５）、ブランクマイクロカプセル投与群（ブランクマイクロカプセル）、非製剤化カゼイ菌（カゼイ菌培養液）投与群、プロバイオティクス含有多相エマルション剤形投与群（Ｅ５＋カゼイ菌）、及びマイクロカプセル化カゼイ菌投与群（マイクロカプセル＋カゼイ菌）に割り当てた（１つの群に１０匹のマウス）。ＮＴ群を除いて、試験物質の投与前に７日間にわたって広域抗生物質であるストレプトマイシンをすべての他の群の飲料水に加えた。次いで、１０ｍＬ／ｋｇ体重の脱イオン水（ＮＴ群及び対照群）、１０ｍＬ／ｋｇ体重のブランクＥ５、１０ｍＬ／ｋｇ体重のブランクマイクロカプセル、１×１０８ｃｆｕ／ｋｇ体重のカゼイ菌培養液、１×１０８ｃｆｕ／ｋｇ体重のＥ５＋カゼイ菌、及び１×１０８ｃｆｕ／ｋｇ体重のマイクロカプセル＋カゼイ菌をそれぞれ、１日１回、３週間にわたって各群のマウスに経口投与した。プロバイオティクス分析のためのマウスの排泄物を、投与の前日（Ｐｒｅ−Ｄ１）、並びに投与後３日目（Ｄ３）、７日目（Ｄ７）、及び１４日目（Ｄ１４）に採取した。マウスを投与後２１日目（Ｄ２１）に屠殺し、小腸及び盲腸を採取して、腸の消化酵素の活性、及び盲腸内の細菌叢の量を測定した。
腸消化酵素の分析
[0070]リパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、及びジサッカリダーゼを含めた消化酵素の活性を下記のように測定した。
試料調製
[0071]屠殺後、各マウスの小腸の切片を採取してロイシンアミノペプチダーゼ及びジサッカリダーゼの活性を分析し、腸粘膜を採取してリパーゼの活性を分析した。０．２ｇの小腸又は腸粘膜をプロテアーゼ阻害剤（１Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び２．２ｍＭヨード酢酸）及び０．９％ＮａＣｌを含有する４℃の２ｍＬの溶液へ加え、次いで溶液を均質化させて小腸均質溶液又は腸粘膜均質溶液を得た。
ジサッカリダーゼ活性試験
[0072]この試験の目的は、マウス小腸のジサッカリダーゼ（マルターゼ及びスクラーゼ）の活性を測定することとした。
[0073]使用する方法は一般に、Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ，Ａ．（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓａｙ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄａｓｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９６４年１月７日：１８〜２５）により開示されるプロトコルにしたがうものとした。簡潔に言えば、３０μＬの腸粘膜均質溶液を１５μＬの５６ｍＭ二糖溶液（乳糖、マルトース、又はスクロースを含有する）へ加え、混合物を３７℃で３０分間反応させた。反応後、１００μＬの０．６Ｎ水酸化ナトリウム溶液を混合物へ加えて細胞を溶解させ、次いで１０μＬの６Ｎ塩酸溶液を加えて処理済みの腸粘膜均質溶液を中和させた。４５μＬの中和した腸粘膜均質溶液及び４５μＬの濃度が０〜４０ｍｇ／ｍＬである様々なグルコース標準溶液の各々を独立に、６２５μＬの反応緩衝液（５０ｍＭのトリスマレイン酸塩、３３ｍＭのリン酸ナトリウムカリウム、及び３０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ６．８）、１５０μＬの１ｍＭ ＡＴＰ、１５０μＬの１ｍＭ ＮＡＤＰ、１５μＬの３３０ＩＵ／ｍＬ ヘキソキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．１１）、及び１５μＬの１７０ＩＵ／ｍＬ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）と混合し、得られる混合物を３７℃で３０分間反応させた。混合物を氷冷意欲中に置くことにより反応を停止させた。反応の開始時に吸光度Ａ１を３４０ｎｍの波長で測定し、反応の３０分後に吸光度Ａ２を測定した。ＮＡＤＰＨの増加量△Ａ＝Ａ２−Ａ１を使用してグルコースの濃度を計算した（Ｒａｎｄｏｘ ＧＬ １６１１試薬キットの説明書を参照）。反応済み混合物中のたんぱく質の含量を改良ローリー法により測定し（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．（１９７７） Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ． ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｍｏｒｅ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３：３４６〜３５６）、ジサッカリダーゼの活性をＩＵ／ｍｇタンパク質として示した。
リパーゼ活性試験
[0074]この試験の目的は、マウス小腸のリパーゼの活性を測定することとした。
[0075]使用する方法は一般に、Ｖｅｒｄｕｉｎ，ＰＡら（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．、１９７３年６月１４日；４６（１）：１１〜９）により開示されるプロトコルにしたがうものとした。簡潔に言えば、市販のキット（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｐａｓｅ−ＰＳ（商標））を使用してリパーゼの活性を測定した。９００μＬの基質溶液（１．１ｍＭの１，２−ジグリセリド、２ｍＭのＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ナトリウムメタホルメート、０．６６ｍＭのＡＴＰ、８６０Ｕ／Ｌのモノグリセリド脂肪分解酵素、１３４０Ｕ／Ｌのグリセロールキナーゼ、４０，０００Ｕ／Ｌの３−リン酸グリセロールオキシダーゼ、１３４０Ｕ／Ｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ、４０，０００Ｕ／Ｌのコリパーゼ、及び緩衝剤を含有する）を、１５μＬの小腸均質溶液及びそれぞれの標準溶液（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｐａｓｅ−ＰＳ（商標）において供給される）と混合し、得られた混合物を３７℃で３〜５分間反応させた。次いで、３００μＬの活性化剤（３６ｍＭのデオキシコール酸、６ｍＭの４−アミノアンチピリン、０．０５％のアジ化ナトリウム、及び緩衝剤溶液を含有する）を混合物の各々へ加えて３７℃で３〜５分間さらに反応させた。反応済みの混合物を次いで分光光度計により５５０ｎｍの波長で２分間で検出し、反応済み混合物中のタンパク質の含量を改良ローリー法により測定した。リパーゼの活性をＫＵ／ｍｇタンパク質として示した。
ロイシンアミノペプチダーゼ活性試験
[0076]この試験の目的は、小腸絨毛の刷子縁のタンパク質消化酵素の活性を測定することとした。
[0077]使用する方法は一般に、Ｍａｒｔｉｎｅｋ，ＰＧら（Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＬＡＰ） ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９６４年１２月；１０：１０８７〜９７）により開示されるプロトコルにしたがうものとした。簡潔に言えば、市販のキット（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）ＬＡＰ）を使用してロイシンアミノペプチダーゼの活性を測定した。０．５ｍＬの腸粘膜均質溶液を０．５ｍＬのＬＡＰ基質溶液（リン酸緩衝剤に溶解させた２０ｍｇ／ｄＬのＬ−ロイシル−β−ナフチルアミン、ｐＨ７．１）と混合し３７℃で１時間反応させ、次いで０．５ｍＬの２Ｎ ＨＣｌを反応混合物へ加えた。１．５ｍＬの反応済み腸粘膜混合物及び１．５ｍＬのそれぞれの標準溶液（０〜１２シグマ単位／ｍＬ）を、０．５ｍＬの亜硝酸ナトリウム溶液と混合し室温で３分間反応させ、混合物を１．０ｍＬの０．５％（ｗ／ｖ）スルファミン酸アンモニウムとさらに混合し室温で３分間反応させた。反応済み混合物を次いで２．０ｍＬのＮ−１−ナフタレンエチレンジアミンアルコール溶液と混合し室温で４５分間反応させた。５８０ｎｍの波長における最終生成物の吸光度を分光光度計により測定し、最終生成物中のタンパク質含量を改良ローリー法により測定した。ロイシンアミノペプチダーゼの活性をシグマ単位／ｍｇタンパク質として示した。１シグマ単位は、３７℃及びｐＨ７．１において１時間当たりに１ｍｏｌのナフチルアミンを生成させる酵素の量と定義される。
[0078]上記の試験のいずれにおいても示される改善は、胃腸の消化の機能が改善されていることを示している。
盲腸細菌叢及び排泄物細菌叢の分析
[0079]試験において設定された時点で採取されたマウスの新鮮な排泄物を使用して、排泄物中の試験されるプロバイオティクスの量を測定した。マウスを屠殺した後、盲腸の採取された内容物を使用して盲腸の細菌叢の量を測定した。排泄物／盲腸細菌叢分析は、プロバイオティクス（カゼイ菌及びビフィズス菌を含める）及び１種の有害な（又は有益でない）細菌、すなわちウェルシュ菌の量の測定を含むものとした。
サンプリング及び均質化の方法
[0080]マウスの腹部をマッサージすることにより排泄物試料を採取し、気密容器中に個々に保存した（約３〜１０片）。秤量後、排泄物試料を個々に無菌無酸素希釈剤（０．１％ペプトン溶液）へ１：９（ｗ／ｗ）の比で加え、混合及び懸濁させて排泄物均質溶液を得た。給餌ステップの後、マウスに麻酔を施し解剖して盲腸内容物を採取した。約１ｇの盲腸内容物試料の各々を試験管内の９ｍＬの無菌無酸素希釈剤へ加え、混合及び懸濁させて均質溶液を得た（「Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｆｏｏｄ」のプロトコル、１９９９年８月２日に公表されたＤＯＨ Ｆｏｏｄ Ｎｏ．８８０３７８０３、及び２００３年８月２９日に改正されたＤＯＨ Ｆｏｏｄ ０９２０４０１６２９；並びにＹａｎｇ，Ｌ．Ｃ．、Ｌｕ，Ｔ．Ｊ．、及びＬｉｎ，Ｗ．Ｃ．；Ｔｈｅ ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ、Ｊ Ｆｕｎｃ Ｆｏｏｄ Ｏｃｔ ５（４）；１６４２〜５３を参照）。
[0081]無酸素グローブボックスで、各排泄物均質溶液及び各盲腸均質溶液を適切な濃度まで順次に１０倍希釈した。各々の適当な希釈液を培養プレート上に塗布し（平板塗抹法）、無酸素グローブボックスにおいて３７℃で２４〜７２時間インキュベートした。インキュベーション後に、各プレートで成長したコロニーの数をカウントした。
[0082]この実験において、各プロバイオティクスをその選択培地でインキュベートした。
[0083]ＩＳＯ ７９３７（２００４ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｕｆｆｓ − Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ − Ｃｏｌｏｎｙ−ｃｏｕｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）にしたがい、ウェルシュ菌をトリプトースサルファイトシクロセリン（ＴＳＣ）寒天培地でインキュベートした。
[0084]盲腸試料又は排泄物試料中のプロバイオティクスの数が著しく増加する場合、及び盲腸試料又は排泄物試料中のウェルシュ菌の数が減少するか又は著しく増加しない場合、試験物質は腸細菌叢の改善機能を有すると考えられる。
統計的分析
[0085]実験データを一元配置分散分析により分析し、ダネット又はダンカン検定によりさらに分析した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意であることを表す。
３．結果及び考察
多相乳化系の確立
[0086]この実験において、カゼイ菌に様々な賦形剤を含有する外部水性相を配合して上記の方法により様々な油中水中油型多相エマルションを得た。これらの油中水中油型多相エマルションを次いで噴霧乾燥させて粉末状の様々なカゼイ菌生成物を得た（すなわち、多相エマルション粉末）。この実験は、様々な賦形剤の処方についての、粉末回収率及びカゼイ生菌数に対する噴霧乾燥プロセスの影響を評価するために行われた。様々な賦形剤の処方の外部水性相の成分を下記の表１に示す。表１及び以下において、乳清タンパク質濃縮物を「ＷＰＣ」と呼び、オクテニルコハク酸加工デンプンを「加工デンプン」又は「ＯＳＡ」と呼ぶ。
[0087]表１に示すように、乳清タンパク質濃縮物のみを含有する外部水性相を有する群（ＷＰＣ群）において、粉末回収率は不十分である（１０％未満）。乳清タンパク質濃縮物を加工デンプンと組み合わせると（ＷＰＣ：ＯＳＡ群）、粉末回収率は改善する。表１から分かるように、ＷＰＣ群及びＷＰＣ：ＯＳＡ＝２：１群のカゼイ菌数は高い方であり、噴霧乾燥プロセス後のカゼイ菌の生存率（生存率＝粉末中のカゼイ菌数／噴霧乾燥前のカゼイ菌数）も両方の群で高い方である（カゼイ菌数の低下は２ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇ未満であり、カゼイ菌数は６×１０７ＣＦＵ／ｇを超える）。粉末回収率及びカゼイ菌数を比較した後、ＷＰＣ：ＯＳＡ＝２：１の群が最良の処方と考えられ、以下の実験で使用された。
Figure 2021194004
[0088]ＷＰＣ：ＯＳＡ＝２：１の外部水性相における賦形剤の総重量の５％を置き換えるように、様々な追加の賦形剤を使用して（ＷＰＣ：ＯＳＡ：追加の賦形剤＝３８：１９：３）様々な多相エマルション粉末を得て、得られる多相エマルション粉末の回収率及びカゼイ菌数に対する様々な追加の賦形剤（下記の表２に示す）の効果を評価した。
[0089]表２に示すように、乳清タンパク質濃縮物及び加工デンプンのみを使用する群（ＷＰＣ：ＯＳＡ＝２：１の群）の粉末回収率、及び賦形剤の総重量の５％が様々な追加の賦形剤で置き換えられた群の粉末回収率は、約２０％〜約３２％の範囲である。追加の賦形剤としてそれぞれＨＰＭＣ及びアルギン酸ナトリウムを使用する群（すなわち、ＷＰＣ：ＯＳＡ：ＨＰＭＣ＝３８：１９：３の群、及びＷＰＣ：ＯＳＡ：Ｎａ−アルギン酸＝３８：１９：３の群）は、それぞれ９×１０７ＣＦＵ／ｇ及び８×１０７ＣＦＵ／ｇまでのカゼイ菌数を有する。ＨＰＭＣを追加の賦形剤として使用する群（ＷＰＣ：ＯＳＡ：ＨＰＭＣ＝３８：１９：３の群）は、カゼイ菌生存率が最良であり（７．５％）、追加の賦形剤としてゼラチンを使用する群（ＷＰＣ：ＯＳＡ：ゼラチン＝３８：１９：３の群）ではカゼイ菌生存率が２番目に良好である（５．８％）。このことは、前記の群が噴霧乾燥プロセスの間により良好な保護効果をカゼイ菌に与えることができることを表す。多くの群が噴霧乾燥プロセス中に一定の保護効果をカゼイ菌に与えて回収率を改善することができるので、カゼイ菌数が１０７ＣＦＵ／ｇを超える群をさらなる試験に使用した。
Figure 2021194004
[0090]カゼイ菌を封入するための多相エマルション系（すなわち、カゼイ菌多相エマルション粉末）の安定性を調べるために、様々な賦形剤の処方（表３に列挙）を有する様々な多相エマルション粉末を４℃で維持した。結果を図１に示す。各群の最初のカゼイ菌数は１０７ＣＦＵ／ｇを超えており、カゼイ菌数を１４日後に再び測定した。各群のカゼイ菌数の減少量は０．３ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｇ未満であった。生存率が最も低い群は、加工デンプンのみを賦形剤として有する群（ＯＳＡ群）であったが、一方その生存率はやはり５０％を超えたままであった。カゼイ菌数を２８日後にさらに測定した。最初のカゼイ菌数と比較して、ＯＳＡ群の生存率は６４％であり、他の群の生存率はすべて６４％を超えていた。４℃で２８日間維持した後、すべての群のカゼイ菌数は２×１０７ＣＦＵ／ｇを超えており、本発明のカゼイ菌多相エマルション粉末が高い安定性を実現できることを示している。
[0091]耐性分析のために、上記で得られたカゼイ菌多相エマルション粉末を水に再水和させた。胃酸及び胆汁酸塩のシミュレーション溶液をそれぞれ、再水和したカゼイ菌多相エマルション溶液へ加えた。あらかじめ定められた時間の後、各投与群のカゼイ菌生存率を測定した。胃酸耐性の結果を図２Ａに示す。様々な処方を有する様々な多相エマルション再水和群のカゼイ菌数の減少は０．７ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｇ〜３．２ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｇの範囲である。胆汁酸塩耐性 の結果を図２Ｂに示す。多相エマルション再水和群のカゼイ菌数の減少はすべて１．０ ｌｏｇ ｃｆｕ／ｇ未満である。非カプセル化カゼイ菌群（カゼイ菌培養液）及びマイクロカプセル化カゼイ菌群（マイクロカプセル＋カゼイ菌）と比較すると、本発明のカゼイ菌多相エマルション粉末はより良好な保護効果を実現できる。４℃で２８日間維持した後、本発明の多相エマルション粉末のカゼイ菌数はすべて２×１０７ＣＦＵ／ｇを超えており、本発明の多相エマルション粉末がより良好な粉末安定性を有することを示している。
動物試験
予備試験
[0092]脱イオン水（対照）、プロバイオティクス封入多相エマルション粉末Ｅ１〜Ｅ７（処方物の外部水性相の賦形剤を下記の表３に示す）、又は非封入カゼイ菌（カゼイ菌培養液）を、マウスに１４日間経口投与した。マウスの排泄物を投与の前日（Ｐｒｅ−Ｄ１）、並びに投与後の７日目（Ｄ７）及び１４日目（Ｄ１４）に採取した。採取した排泄物をペトリ皿上に塗布した。下記の表４に示すように、Ｅ５群のカゼイ菌数は７日目に著しく増加した。１４日目に、対照群のカゼイ菌数と比較して、非封入カゼイ菌群（カゼイ菌培養液）のカゼイ菌数及びＥ２〜Ｅ７群のカゼイ菌数は著しく増加した。Ｅ５〜Ｅ７群の増加が最も高かった。
Figure 2021194004
Figure 2021194004
正常マウスモデル
[0093]正常マウスモデルにおいて、マウスに試験物質を３週間まで投与した。実験期間中に中毒反応は見られなかった。これらの試験物質はマウスの体重に対して有意の効果はなかった。Ｅ５＋カゼイ菌群の排泄物（図３Ａ）及び盲腸内容物（図３Ｂ）のカゼイ菌数は迅速かつ著しく増加し、Ｅ５＋カゼイ菌群の排泄物（図４Ａ）及び盲腸内容物（図４Ｂ）のビフィズス菌数も増加したが、Ｅ５＋カゼイ菌群の排泄物（図５Ａ）及び盲腸内容物（図５Ｂ）のウェルシュ菌数は減少したことが分かった。Ｅ５＋カゼイ菌群の賦形剤処方が、腸のマルターゼ（図６Ａ）、スクラーゼ（図６Ｂ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（図６Ｃ）、及びリパーゼ（図６Ｄ）の活性を増加させることができたことも分かった。
[0094]腸細菌叢に関しては、カゼイ菌含有多相エマルション粉末（Ｅ５＋カゼイ菌）及びカゼイ菌含有マイクロカプセル（マイクロカプセル＋カゼイ菌）をそれぞれ投与された群のマウス腸管のカゼイ菌数及びビフィズス菌数はすべて増加したが、カゼイ菌含有多相エマルション粉末（Ｅ５＋カゼイ菌）のみがウェルシュ菌数（悪玉菌）を著しく減少させることができたことが分かった。試験物質の投与が、主にカゼイ菌の存在によって、腸細菌叢を改善させた。カゼイ菌は主に盲腸よりもむしろ小腸でコロニー形成するので、このことが、盲腸内容物が試験物質によって影響を受けなかった理由である可能性があると考えられる。
[0095]使用されたカゼイ菌はデンプン分解活性を有する株である。したがって、腸消化酵素活性試験は、カゼイ菌培養液、カゼイ菌含有多相エマルション粉末（Ｅ５＋カゼイ菌）、及びカゼイ菌含有マイクロカプセル（マイクロカプセル＋カゼイ菌）を含めたカゼイ菌含有試験物質の投与が、腸粘膜のジサッカリダーゼの活性を増加させることができることを示し、増加した活性レベルは腸のカゼイ菌数と正の相関を示す。さらに、カゼイ菌含有多相エマルション粉末（Ｅ５＋カゼイ菌）を投与された群は、消化酵素活性の最も高い増加レベルを示し、このことは本発明の多相エマルション粉末が腸管のカゼイ菌数を著しく増加させることができることを示している。
抗生物質処理マウスモデル
[0096]抗生物質処理マウスモデルでは、排泄物のラクトバチルスの量を減少させる広域抗生物質の投与後に、試験物質をマウスに投与した。試験物質での処理後、Ｅ５＋カゼイ菌群の排泄物（図７Ａ）及び盲腸内容物（図７Ｂ）のカゼイ菌数は迅速かつ著しく増加し、Ｅ５＋カゼイ菌群の排泄物（図８Ａ）及び盲腸内容物（図８Ｂ）のビフィズス菌数も増加したが、Ｅ５＋カゼイ菌群の排泄物（図９Ａ）及び盲腸内容物（図９Ｂ）のウェルシュ菌は減少したことが分かった。Ｅ５＋カゼイ菌群の賦形剤処方が、腸のマルターゼ（図１０Ａ）、スクラーゼ（図１０Ｂ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（図１０Ｃ）、及びリパーゼ（図１０Ｄ）の活性を増加させることができたことも分かった。
[0097]図７〜９に示すように、抗生物質処理はマウス腸管内のラクトバチルス、ビフィズス菌、及びウェルシュ菌の数を著しく減少させた。しかし、抗生物質処理を停止し試験物質を投与した後、ラクトバチルス、ビフィズス菌、及びウェルシュ菌の数はすべて、ブランクＥ５群、ブランクマイクロカプセル群、及びすべてのカゼイ菌含有群（カゼイ菌培養液、Ｅ５＋カゼイ菌、及びマイクロカプセル＋カゼイ菌）において徐々に回復した。多相エマルション粉末中に封入されたカゼイ菌（Ｅ５＋カゼイ菌）を投与した群の腸のラクトバチルス及びビフィズス菌の数は、他のカゼイ菌含有群よりも高く回復したが、一方でＥ５＋カゼイ菌群のウェルシュ菌数の回復はより遅かった。これはおそらく、Ｅ５＋カゼイ菌群におけるプロバイオティクスの速い成長がウェルシュ菌の成長を遅らせたためである。
[0098]カゼイ菌含有多相エマルション粉末によるビフィズス菌の成長の刺激は、抗生物質処理マウスモデルにおいて見られたが、そのような効果は正常マウスモデルでは見られなかった。これはおそらく、抗生物質による前処理が大部分の細菌（ビフィズス菌を含める）の成長を最初に阻害し、次いでカゼイ菌含有多相エマルション粉末の投与後にビフィズス菌の成長が見られるためである。したがって、本発明のカゼイ菌含有多相エマルション粉末は腸の環境を改善することができ、そのためカゼイ菌の成長だけでなく、ビフィズス菌などの他のプロバイオティクスの成長も促進させることができる。
[0099]腸の酵素活性の結果は、カゼイ菌含有多相エマルション群（Ｅ５＋カゼイ菌）がジサッカリダーゼ、リパーゼ、及びロイシンアミノペプチダーゼの活性を増加させることができることを示している。そのような結果はマウスの体重変化と一致する。腸の酵素分析プロセスの間、表５に示すようにマウスの体重を記録した。抗生物質処理後、すべてのマウスの体重が減少し、次いで徐々に回復したことが表から分かる。カゼイ菌含有多相エマルション粉末を７日間投与した後、処理マウスの体重は、ＮＴ群（抗生物質で処理されていない）のマウスの体重と同レベルまで回復した。そのような結果にしたがって、本発明のカゼイ菌含有多相エマルション粉末は、マウス腸管内の栄養分の消化及び吸収を改善することができると仮定できる。
Figure 2021194004
[0100]排泄物及び盲腸の塗布試験はカゼイ菌数のみを分析することができ、カゼイ菌の増加量がマウス腸管内に元々住んでいたカゼイ菌の成長に起因するのか、又は投与された試験物質に由来するカゼイ菌のコロニー形成に起因するのかを解明することができない。したがって、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びカゼイ菌特異的なプライマーを使用してマウス腸管内のカゼイ菌のコロニー形成をモニタリングした。
[0101]試験では、ブランクエマルション群及び対照群のマウスを除いて、すべてのマウスに同量のカゼイ菌を投与した。ＰＣＲの結果を図１１Ａ（正常マウスモデル）及び図１１Ｂ（抗生物質処理マウスモデル）に示す。結果は、投与後に、投与されたカゼイ菌細胞が実際にマウス腸管内にコロニー形成したこと、並びにカゼイ菌含有多相エマルション群（Ｅ５＋カゼイ菌）のコロニー形成及びマイクロカプセル化カゼイ菌群（マイクロカプセル＋カゼイ菌）の細菌叢がブランクエマルション群及び対照群の細菌叢よりも良好であっただけでなく、非封入カゼイ菌群（カゼイ菌培養液）の細菌叢よりもはるかに良好であったことを示している。本発明のカゼイ菌含有多相エマルションは、目標とする物質（例えば、カゼイ菌）が胃酸及び胆汁酸塩によって破壊されるのを防ぐことができると考えられる。
[0102]上記の分析及び試験のすべてを通して、本発明の多相エマルション粉末が実際に、プロバイオティクス（例えば、カゼイ菌）などの活性成分を保護して胃を通過し、ひいては胃腸管内の活性成分の生理的活性を高めることができることを裏付けることができる。
[0103]本開示は本開示の特定の実施形態を参照して説明及び例証されているが、これらの説明及び例証は限定的なものではない。当業者は、様々な変更を行うことができること、及び添付の特許請求の範囲により定義される本開示の真の精神及び範囲から逸脱せずに等価物に置き換えることができることを理解するべきである。

Claims (20)

  1. （ａ）活性成分を内部水性相と混合して、均質化混合物を得るステップと；
    （ｂ）前記均質化混合物を油性相と混合して、油中水型エマルションを得るステップと；
    （ｃ）前記油中水型エマルションを外部水性相と混合して、水中油中水型多相エマルションを得るステップと
    を含み、前記外部水性相が水及び賦形剤を含み、該賦形剤が乳清タンパク質濃縮物及び加工デンプンを含む、水中油中水型多相エマルションを製造する方法。
  2. 前記活性成分がプロバイオティクスである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記プロバイオティクスが、ラクトバチルス、ビフィズス菌、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. ラクトバチルスが、ラクトバチルスアシドフィルス、ラクトバチルスカゼイ、及びラクトバチルスロイテリから成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウムラクティス、及びビフィドバクテリアムロンガムから成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
  6. 前記内部水性相が水及び賦形剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記内部水性相の前記賦形剤が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、アラビアゴム、カゼイン酸ナトリウム、大豆タンパク質、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記内部水性相が塩を更に含む、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、リンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記油性相が植物油及び親油性界面活性剤を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記植物油が、ヒマワリ油、大豆油、オリーブ油、キャノーラ油、亜麻仁油、パーム油、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記親油性界面活性剤が、ポリグリセリンポリリシノレエート（ＰＧＰＲ）、レシチン、糖エステル、乳化ワックス、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリソルベート、モノグリセリド、ジグリセリド、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記乳清タンパク質濃縮物と前記加工デンプンとの重量比が約４：１〜約１：４の範囲である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記乳清タンパク質濃縮物と前記加工デンプンとの重量比が約２：１である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記外部水性相が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、アラビアゴム、カゼイン酸ナトリウム、大豆タンパク質、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される追加の賦形剤を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記追加の賦形剤がヒドロキシプロピルメチルセルロースである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記外部水性相が、前記賦形剤の総重量に対して、約５５ｗｔ％〜約７０ｗｔ％の前記乳清タンパク質濃縮物、約２５ｗｔ％〜約３５ｗｔ％の前記加工デンプン、及び約１ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の前記追加の賦形剤を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 前記乳清タンパク質濃縮物と、前記加工デンプンと、前記追加の賦形剤との重量比が３８：１９：３である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. （ｄ）前記水中油中水型多相エマルションを噴霧乾燥させて、多相乳化粉末を得るステップ
    を更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法により得られる水中油中水型多相エマルション、又は請求項１９に記載の方法により得られる多相乳化粉末を含む、組成物。
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