JP2021189040A - インスリンの検出方法および検出キット - Google Patents
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Abstract
Description
本開示の第1の形態は、サンプルを、インスリンを特異的に認識するインスリン結合タンパク質が表面に固定されてなる電極に添加して、インスリンと前記インスリン結合タンパク質との複合体の形成に伴い生じる電気化学的変化を検出することを有し、前記インスリン結合タンパク質は、第1領域および第2領域を含み、前記第1領域および前記第2領域のいずれか一方が前記電極の表面に固定される、インスリンの検出方法である。
本開示の方法で使用されるサンプルは、インスリンの存在/不存在を調べるためまたはサンプル中に含まれるインスリン量を測定するための検出対象として使用される。当該サンプルとしては、以下に制限されないが、被検試料(血液、血漿、血清、組織、間質液、尿、リンパ液等の生体試料)、細胞(培養細胞、細胞株等)、その培養上清、それらの抽出物、それらの部分精製画分、さらには人工的に作製されたサンプル(例えば、糖尿病治療薬等の薬剤やインスリン水溶液)などが挙げられる。被検試料の由来も特に制限されず、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等の齧歯類;ヒツジ、ブタ、ウシやウマ等の家畜;ウサギ、ネコ、イヌ等のペット;アカゲザル、ミドリザル、カニクイザル、チンパンジー等の霊長類)由来のいずれであってもよい。これらのうち、有益性(例えば、診断目的)などを考慮すると、インスリンを含むサンプルは、被検試料が好ましく、血液(例えば、全血、血漿、血清など)、間質液および尿がより好ましい。すなわち、本開示の好ましい形態によると、サンプルは、血液、間質液および尿からなる群より選択される。
インスリンレセプターのα−CTセグメントを含みかつインスリンレセプターのβサブユニットを含まない第1領域(第1領域)は、インスリンレセプターのα−CTセグメントを含むポリペプチドである。α−CTセグメントは、インスリンレセプターの細胞外ドメインであるαサブユニットの部分領域であって、インスリン結合能を有するとともに、膜貫通領域は含んでいない。なお、本開示におけるα−CTセグメントの具体的な構成は特に限定されず、周知のあらゆるα−CTセグメントであり得る。
第2領域は、インスリンレセプターのL1ドメインを含むポリペプチドである。ここで、L1ドメインは、インスリンレセプターの細胞外ドメインであるαサブユニットの部分領域であって、インスリンに結合する能力を有しているとともに、膜貫通領域を含まない。なお、本開示におけるL1ドメインの具体的な構成は特に限定されず、周知のあらゆるL1ドメインであり得る。
本開示に係るインスリン結合タンパク質は、第1領域および第2領域のいずれか一方において電極の表面に固定される。ここで、インスリン結合タンパク質の電極表面への固定は、上記いずれかの一端側が電極表面に固定されるとともに、他端が自由状態となっている。具体的には、(a)第1領域(α−CTセグメント)及び第2領域(L1ドメイン)を連結させてインスリン結合タンパク質(L1ドメイン−(必要であればリンカー)−α−CTセグメント)を形成し、第1領域(α−CTセグメント)側が電極表面に固定される形態(L1ドメイン−(必要であればリンカー)−α−CTセグメント−電極);および(b)第1領域(α−CTセグメント)及び第2領域(L1ドメイン)を連結させてインスリン結合タンパク質(α−CTセグメント−(必要であればリンカー)−L1ドメイン)を形成し、第2領域(L1ドメイン)側が電極表面に固定される形態(α−CTセグメント−(必要であればリンカー)−L1ドメイン−電極)が挙げられる。これらのうち、(a)が好ましい。このように、第1領域(α−CTセグメント)および第2領域(L1ドメイン)がリンカーを介して接続し、いずれか一方の領域の端部が電極表面に固定されることにより、リンカーを介して結合する2つの領域の各々が、インスリンを挟み込むように結合して、インスリン−インスリン結合タンパク質複合体を形成する。このため、インスリンをより効率よくかつより確実に捕捉できるとともに、インスリンの結合に伴う構造変化を電気的な変化としてより確実に捉えることができる。ゆえに、より少量(低濃度)のインスリンをより高精度に検出できる。特に上記(a)の形態では、α−CTセグメントに比して分子量が大きなL1ドメインが、インスリン結合タンパク質の非固定端側に存在する。このため、電極上に固定されたインスリン結合タンパク質は、インスリン未結合状態とインスリン結合状態とで立体構造の差異が大きくなる。このため、インスリンとインスリン結合タンパク質との複合体形成に伴う電気信号変化を感度よく捉えることができ、さらにより少量(低濃度)のインスリンを検出することが可能になる。
本開示に係る第1領域および第2領域は、いずれか一方を有する端部が電極の表面に固定される。ここで、電極としては、特に制限されず、インスリン−インスリン結合タンパク質複合体の電気化学的検出方法に応じて適宜選択され得る。具体的には、金電極、白金電極などの金属電極、炭素電極などが使用できる。
本開示では、上記のようにして作製したインスリンの部位を特異的に認識する結合タンパク質が表面に固定されてなる電極(インスリン結合タンパク質固定化電極)に、サンプルを添加して、インスリン−インスリン結合タンパク質複合体の形成に伴う電気化学的変化を検出する。ここで、電気化学的検出方法は、特に制限されず、公知の方法が同様にして、または公知の方法を適宜修飾してできる。例えば、電気化学インピーダンス分光法(EIS)、などが使用できる。これらのうち、電気化学インピーダンス分光法(EIS)が好ましく使用できる。すなわち、本開示の好ましい形態では、インスリン−インスリン結合タンパク質複合体は、電気化学インピーダンス分光法(EIS)により、電気化学的に検出される。電気化学インピーダンス分光法(EIS)は、2つの電極間に小さな正弦波振幅(例えば、約10mV)のAC電圧摂動を印加し、AC周波数の関数として電極間で得られる電流を測定し、周波数の関数としてインピーダンスを計算することができる。そのようなインピーダンススペクトルの変化は、標識を用いずに高感度で測定することができるため好ましい。
本開示の第2の形態は、インスリンの部位を特異的に認識するインスリン結合タンパク質が表面に固定されてなる電極を有し、前記インスリン結合タンパク質は、インスリンレセプターのα−CTセグメントを含みかつインスリンレセプターのβサブユニットを含まない第1領域およびインスリンレセプターのL1ドメインを含みかつインスリンレセプターのβサブユニットを含まない第2領域を含み、前記第1領域および第2領域のいずれか一方が前記電極の表面に固定される、インスリンの検出キットである。
実施例1(簡略化のため、以下、実施例1のタンパク質を、「3GαL」または「3GαLタンパク質」とも称する)のアミノ酸配列を、下記アミノ酸配列(配列番号1)に示す。なお、下記アミノ酸配列において、一重下線部分(アミノ酸配列:METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQL)は細胞外分泌シグナルを表わし;点下線部分(アミノ酸配列:MHGKTQATSGTIQSの3回繰返し構造)は金結合ペプチド(Gold Binding Peptide;GBP)を表わし;中抜き部分(アミノ酸配列:TFEDYLHNVVFVPRPS)はインスリンレセプターα−CTセグメントを表わし;長点下線部分(アミノ酸配列:ASSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSAGSGGLE)はリンカーを表わし;二重下線部分(アミノ酸配列:HLYPGEVCPGMDIRNNLTRLHELENCSVIEGHLQILLMFKTRPEDFRDLSFPKLIMITDYLLLFRVYGLESLKDLFPNLTVIRGSRLFFNYALVIFEMVHLKELGLYNLMNITRGSVRIEKNNELCYLATIDWSRILDSVEDNYIVLNKDDNEECGDVCPGTAKGKTNCPATVINGQFVERCWTHSHCQKVCPTICKSHGCTAEGLCCHKECLGNCSEPDDPTKCVACRNFYLDGQCVETCPPPYYHFQDWRCVNFSFCQDLHFKCRNSRKPGCHQYVIHNNKCIPECPSGYTMNSSNLMCTPCLGPCPK)はインスリンレセプターL1ドメインとCRドメインを表わし;浮き彫り部分(アミノ酸配列:HHHHHH)はヒスチジンタグを表わす。下記アミノ酸配列において、ヒスチジンタグは、精製を容易にするためにL1ドメイン−CRドメインのC末端に連結されている。また、細胞外分泌シグナルは、分泌される際に、METDTLLLWVLLLWVPGSTGとDとの間で切断されるため、精製後取得されるタンパク質(3GαL)は、下記配列番号1におけるDQLMから開始するアミノ酸配列を有すると考えられる。
実施例2(簡略化のため、以下、実施例2のタンパク質を、「αL3G」または「αL3Gタンパク質」とも称する)のアミノ酸配列を、下記アミノ酸配列(配列番号3)に示す。
以下の方法に従い、図1に示されるような、3GαLタンパク質が表面に固定された電極(3GαL電極)を作製した。
以下の方法に従い、図2に示されるようなαL3Gが表面に固定された電極(αL3G電極)を作製した。
上記実施例1〜2で得られた3GαL電極およびαL3G電極について、下記方法により、インスリンを検出した。
Claims (6)
- サンプルを、インスリンを特異的に認識するインスリン結合タンパク質が表面に固定されてなる電極に添加して、インスリンと前記インスリン結合タンパク質との複合体の形成にともなう電気化学的変化を検出することを有し、
前記インスリン結合タンパク質は、インスリンレセプターのα−CTセグメントを含みかつインスリンレセプターのβサブユニットを含まない第1領域およびインスリンレセプターのL1ドメインを含みかつインスリンレセプターのβサブユニットを含まない第2領域を含み、前記第1領域および前記第2領域のいずれか一方が前記電極の表面に固定される、インスリンの検出方法。 - 前記第1領域および前記第2領域はリンカーを介して連結し、かつ前記第2領域が前記電極の表面に固定される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1領域および前記第2領域はリンカーを介して連結し、かつ前記第1領域が前記電極の表面に固定される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2領域は、インスリンレセプターのCRドメインを更に含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- インスリンと、前記インスリン結合タンパク質との複合体形成にともなう電気化学的変化は、電気化学インピーダンス分光法(EIS)により検出される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- インスリンの部位を特異的に認識するインスリン結合タンパク質が表面に固定されてなる電極を有し、
前記インスリン結合タンパク質は、インスリンレセプターのα−CTセグメントを含みかつインスリンレセプターのβサブユニットを含まない第1領域およびインスリンレセプターのL1ドメインを含みかつインスリンレセプターのβサブユニットを含まない第2領域を含み、前記第1領域および前記第2領域のいずれか一方が前記電極の表面に固定される、インスリンの検出キット。
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