JP2021180660A - 抗ヒプシン抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年8月28日出願の米国仮特許出願第62/211,642号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる:コンピュータ可読形式(CRF)の配列表(ファイル名:146392034440SEQLIST.txt、記録日:2016年8月25日、サイズ:42KB)。
本発明は、ヒプシン及び/またはデオキシヒプシンを含有するポリペプチドを検出及び単離するための方法及び試薬に関する。
本発明を詳細に記載する前に、本発明が特定の組成物または生物学的系に限定されず、当然変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図されていないことも理解されたい。
100×分数X/Y
式中、Xは、配列整列プログラムALIGN−2によってそのプログラムのAとBとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性%値は、直前の段落に記載されるようにALIGN−2コンピュータプログラムを使用して得られる。
一態様において、本発明は、ポリペプチド中のヒプシンに結合する単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、以下の 特質のうちの1つ以上を有する。(1)ポリペプチド中のヒプシンに結合する、(2)ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない、(3)ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する、(4)ヒプシンに隣接する異なるアミノ酸を有するヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンに結合する、(5)デオキシヒプシンに隣接する異なるアミノ酸を有するデオキシヒプシン含有ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する、(6)900nM以下の結合親和度でヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンに結合する、(7)300nM以下の結合親和度でヒプシン含有ポリペプチド中のヒプシンに結合し、200nM以下の結合親和度でデオキシヒプシン含有ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する。
a)HVR−H1(DYAMI(配列番号9))、
b)HVR−H2(IIYGGSNKLAYAKWA(配列番号13)またはIIYGVINDLAYAKWA(配列番号14))、及び
c)HVR−H3(GYGSMDGYDRLNL(配列番号17))。
a)HVR−H1(TYTIN(配列番号10))、
b)HVR−H2(DIWSDGNTYYANWA(配列番号15))、及び
c)HVR−H3(DSWDTSIYYGLDL(配列番号18))。
a)HVR−H1(TYTMN(配列番号11)、またはHCTMN(配列番号12)、
b)HVR−H2(DIYTDGNTYYANWA(配列番号16))、及び
c)HVR−H3(DSWDASSYYGLDL(配列番号19))。
a)HC−FR1(QEQLKESGGRLVAPGTPLTLTCTVSGFDIS(配列番号46)、
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSAFSLS(配列番号47)、
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLS(配列番号48)、または
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSACSLY(配列番号49))、
b)HC−FR2(WVRQAPGKGLEWIG(配列番号50)、
c)HC−FR3(KGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAR(配列番号51)、または
KGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAR(配列番号52))、及び
d)HC−FR4(WGQGTLVTVSS(配列番号53))。
a)HVR−L1(QSSETVYRGDWLS(配列番号1)、またはRSRQRVYLGDWLS(配列番号2))、
b)HVR−L2(DASYLAS(配列番号4)、またはDASFRGD(配列番号5))、及び
c)HVR−L3(LGGYYDDADDT(配列番号7))。
a)HVR−L1(QASEDIKRYLA(配列番号3))、
b)HVR−L2(AASKLAS(配列番号6))、及び
c)HVR−L3(QQGYTSSNVNNA(配列番号8)、またはQQGYTSTNVNNA(配列番号72))。
a)LC−FR1(AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISC(配列番号38)、またはAIKMTQTPSSVSAAVGGTVTINC(配列番号39))、
b)LC−FR2(WFQKKPGQPPKLLIY(配列番号40)、またはWYQQKPGQPPKLLIY(配列番号41))、
c)LC−FR3(GVSSRFSGSGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYC(配列番号42)、
GVSSRFTGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYC(配列番号43)、または
GVSSRFKGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYC(配列番号44))、及び
d)LC−FR4(FGGGTEVVVK(配列番号45))。
(a)重鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号46〜49から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号50のアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号51もしくは52のアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、及び
(7)配列番号53のアミノ酸配列を含むHC−FR4を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに/または
(b)軽鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号38もしくは39のアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号1のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号40もしくは41のアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号42〜44から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR−L3、ならびに
(7)配列番号45のアミノ酸配列を含むLC−FR4を含む、軽鎖可変ドメイン。
(a)重鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号46〜49から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号50のアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号51もしくは52のアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、及び
(7)配列番号53のアミノ酸配列を含むHC−FR4を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに/または
(b)軽鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号38もしくは39のアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号2のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号40もしくは41のアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号42〜44から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR−L3、ならびに
(7)配列番号45のアミノ酸配列を含むLC−FR4を含む、軽鎖可変ドメイン。
(a)重鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号46〜49から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号50のアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号51もしくは52のアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H3、及び
(7)配列番号53のアミノ酸配列を含むHC−FR4を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに/または
(b)軽鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号38もしくは39のアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号40もしくは41のアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号42〜44から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号72のアミノ酸配列を含むHVR−L3、及び
(7)配列番号45のアミノ酸配列を含むLC−FR4を含む、軽鎖可変ドメイン。
(a)重鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号46〜49から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号50のアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号51もしくは52のアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H3、及び
(7)配列番号53のアミノ酸配列を含むHC−FR4を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに/または
(b)軽鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号38もしくは39のアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号40もしくは41のアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号42〜44から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR−L3、及び
(7)配列番号45のアミノ酸配列を含むLC−FR4を含む、軽鎖可変ドメイン。
(a)重鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号46〜49から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号50のアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号51もしくは52のアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H3、及び
(7)配列番号53のアミノ酸配列を含むHC−FR4を含む、重鎖可変ドメイン、
ならびに/または
(b)軽鎖可変ドメインであって、
(1)配列番号38もしくは39のアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号40もしくは41のアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号42〜44から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR−L3、及び
(7)配列番号45のアミノ酸配列を含むLC−FR4を含む、軽鎖可変ドメイン。
ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下(例えば10−8M以下、例えば10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(KD)を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、1nM以下、10nM以下、20nM以下、40nM以下、60nM以下、80nM以下、100nM 以下、150nM以下、200nM以下、250nM以下、300nM以下、350nM以下、400nM以下、450nM以下、500nM以下、550nM以下、600nM以下、650nM以下、700nM以下、750nM以下、800nM以下、または900nM以下の解離定数(KD)を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、1mM以下、5mM以下、10mM以下、15mM以下、20mM以下、25mM以下、30mM以下、35mM以下、40mM以下、45mM以下、50mM以下、55mM以下、60mM以下、65mM以下、70mM以下、75mM以下、80mM以下、85mM以下、90mM以下、95mM以下、または100mM以下の解離定数(KD)を有する。ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、本明細書の表2に示される、KDを有する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない。さらなる実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない抗ヒプシン抗体は、ヒプシンを含有するポリペプチドに対して少なくとも900nM以下の結合親和性(KD)を呈する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ヒプシン抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する。さらなる実施形態において、デオキシヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体は、(i)ヒプシンを含有するポリペプチドに対して300nM以下の結合親和性(KD)、及び(ii)デオキシヒプシンを含有するポリペプチドに対して200nM以下の結合親和性(KD)を呈する。ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下(例えば10−8M以下、例えば10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(KD)を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、1nM以下、5nM以下、10nM以下、15nM以下、20nM以下、30nM以下、40nM以下、50nM以下、60nM以下、70nM以下、80nM以下、90nM以下、100nM 以下、110nM以下、120nM以下、130nM以下、140nM以下、150nM以下、160nM以下、170nM以下、180nM以下、190nM以下、または200nM以下の解離定数(KD)を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、1mM以下、5mM以下、10mM以下、15mM以下、20mM以下、25mM以下、30mM以下、35mM以下、40mM以下、45mM以下、50mM以下、55mM以下、60mM以下、65mM以下、70mM以下、75mM以下、80mM以下、85mM以下、90mM以下、95mM以下、または100mM以下の解離定数(KD)を有する。ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する本明細書に提供される抗ヒプシン抗体は、本明細書の表2に示される、KDを有する。本明細書のいくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、配列番号24もしくは25のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び/または配列番号20もしくは21のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び/または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書のいくつかの実施形態において、抗ヒプシン抗体は、配列番号27もしくは28のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む重鎖可変領域、及び/または配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗原結合断片である。
一態様において、本発明の抗ヒプシン抗体は、例えば酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ウエスタンブロット、放射免疫測定、表面プラズモン共鳴法、クロマトグラフィー、免疫沈殿法、免疫蛍光検査法、蛍光標識細胞分取法等の既知の方法によりその抗原結合活性に関して試験される。
本明細書に記載される抗体は、抗体を生成するための当該技術分野で利用可能な技法を使用して調製され、その例示的な方法は、以下の節により詳細に記載される。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv、及びscFv断片、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Hudson et al.Nat.Med.9:129−134(2003)を参照のこと。scFv断片の概説については、例えば、Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer−Verlag,New York),pp.269−315(1994)を参照のこと、また、WO 93/16185、ならびに米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号も参照のこと。エピトープ残基を結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むFab及びF(ab’)2断片の考察に関しては、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
本発明の抗体は、所望の活性(複数可)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を保有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が、当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1−37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)に概説され、例えば、McCafferty et al.,Nature 348:552−554、Clackson et al.,Nature 352:624−628(1991)、Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581−597(1992)、Marks and Bradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161−175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)、Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299−310(2004)、Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073−1093(2004)、Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467−12472(2004)、及びLee et al.,J.Immunol.Methods 284(1−2):119−132(2004)にさらに記載されている。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異型が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異型は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列の残基からの欠失、及び/またはそこへの挿入、及び/またはその置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
ある特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異型が提供される。置換型変異誘発の目的とする部位には、HVR及びFRが含まれる。保存的置換は、表Aに「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表Aに「例示的な置換」の見出しの下に示され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換は、目的とする抗体に導入され得、生成物が所望の活性、例えば、保持された/改善された抗原結合について、スクリーニングされる。
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。
ある特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のFc領域に導入され、それによりFc領域変異型が生成され得る。Fc領域変異型は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域)を含み得る。
ある特定の実施形態において、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「チオMAb」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、検出剤等の他の部分に抗体を複合体化して、本明細書にさらに記載されるように、免疫複合体を作製することができる。ある特定の実施形態において、以下の残基、軽鎖のV205(Kabat付番)、重鎖のA118(EU付番)、及び重鎖Fc領域のS400(EU付番)のうちの任意の1つ以上をシステインで置換してもよい。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるように生成され得る。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、1つを超えるポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
本発明の抗体の組換え産生では、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)のため、または発現のために、複製可能ベクターに挿入される。抗体をコードするDNAは、従来の手技を使用して(例えば、抗体の重鎖軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、宿主細胞は、原核生物または真核細胞(一般に哺乳動物)起源のいずれかの宿主細胞である。IgG、IgM、IgA、IgD、及び、IgE定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得、かかる定常領域が任意のヒトまたは動物種から得られ得ることが理解されるであろう。
a)ベクター構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準の組換え技法を使用して得られ得る。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離及び配列決定され得る。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはPCR技法を用いて合成され得る。得られた時点で、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主内で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、かつ当該技術分野で既知の多くのベクターが本発明のために使用され得る。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞によって異なるであろう。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方)及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて種々の成分を含有する。ベクター成分には、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地で培養される。
一実施形態において、本明細書で産生される抗体タンパク質は、さらなるアッセイ及び使用のために、実質的に同種の調製物を得るようにさらに精製される。当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が用いられ得る。以下の手順は、好適な精製手順の例示である:免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、DEAE等のシリカまたは陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばSephadex G−75を使用したゲル濾過。
真核性宿主細胞において使用するためのベクターは、一般に、非限定的構成成分:シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの1つ以上を含む。
真核宿主細胞において使用するためのベクターもまた、目的とする成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドを含有してもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシング(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものであり得る。哺乳類細胞発現においては、哺乳類シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域のDNAは、リーディングフレームにおいて、抗体をコードするDNAに連結される。
一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターに必要とされない。例えば、SV40起点は、ただ初期プロモーターを含有するため、一般的に、使用され得る。
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択遺伝子、別名、選択可能なマーカーを含有し得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、(b)栄養要求性欠損を補完するか(関連性のある場合)、または(c)複合培地から入手不可能な必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、かつ目的とするポリペプチド(例えば、抗体)をコードする核酸に作動可能に連結するプロモーターを含有する。真核生物のためのプロモーター配列が知られている。例えば、実質的に全ての真核遺伝子が、転写が始まる部位からおよそ25〜30塩基上流に位置するATに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から70〜80塩基上流に見られる別の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大半の真核遺伝子の3’末端は、コード配列の3’末端へのポリA尾部の付加のためのシグナルであり得るAATAAA配列である。ある特定の実施形態において、これらの配列のうちのいずれかまたは全てが、真核性発現ベクターに好適に挿入され得る。
より高次の真核生物による本発明の抗体をコードするDNAの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン)からの多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後半側のSV40エンハンサー(bp100〜270)、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサー要素を記載している、Yaniv,Nature 297:17−18(1982)も参照されたい。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の5’位または3’位でベクターにスプライスされ得るが、通常、プロモーターから5’部位に位置する。
真核性宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含有し得る。かかる配列は、一般に、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの5’非翻訳領域、時折、3’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026及びそれらで開示される発現ベクターを参照されたい。
本明細書におけるベクター内でのDNAのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載される高等真核生物の細胞が含まれる。培養(組織培養)における脊椎動物細胞の調製は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7、ATCC CRL 1651)、ヒト胚腎臓株(293細胞または懸濁培養下での増殖のためにサブクローニングされた293細胞、Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10)、チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO、Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));マウスセルトリ細胞(TM4、Mather,Biol.Reprod.23:243−251(1980))、サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587)、ヒト子宮頸癌腫細胞(HELA、ATCC CCL 2)、イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065)、マウス乳房腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44−68(1982));MRC 5細胞;FS4細胞;CHOK1または誘導体及びヒト肝臓癌株(Hep G2)である。
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、多様な培地中で培養され得る。Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、Sigma)、RPMI−1640(Sigma)、及びダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma)等の市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)、米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、同第4,560,655号、もしくは同第5,122,469号、WO90/03430、WO87/00195、または米国特許第30,985号に記載の培地のうちのいずれも、宿主細胞のための培地として使用され得る。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び/または他の増殖因子(インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子等)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等)、緩衝液(HEPES等)、ヌクレオチド(アデノシン及びチミジン等)、抗生物質(GENTAMYCIN(商標)薬等)、微量要素(マイクロモルの範囲の最小濃度で通常存在する無機化合物と定義される)、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の補充物もまた、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、pH等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞にこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技法を使用するとき、抗体は、細胞内、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第1のステップとして、微粒子残屑(宿主細胞または溶解断片のいずれか)が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去され得る。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系の上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを使用して、まず濃縮され得る。タンパク質分解を阻害するためのPMSF等のプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を阻止するための抗生物質が含まれてもよい。
本明細書に記載される抗ヒプシン抗体の組成物または製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、1つ以上の任意の許容される担体と混合することによって調製される(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。許容される担体は、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、アクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);ならびに/または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)等のヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の分散剤をさらに含む。rHuPH20を含む、ある特定の例示的なsHASEGP及び使用方法が、米国特許公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号に記載されている。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗ヒプシン抗体はいずれも、試料中のヒプシン含有ポリペプチドの存在の検出に有用である。本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、定量または定性検出を包含する。ある特定の実施形態において、試料は生体試料である。実施形態において、生体試料は、細胞、または臓器からの組織等の組織を含む。いくつかの実施形態において、組織は、乳房組織、皮膚組織、脳組織、肝臓組織、腎臓組織、卵巣組織、子宮組織、頸部組織、心臓組織、肺組織、またはリンパ系組織であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、循環腫瘍細胞、組織から単離された細胞、細胞株であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、生体試料は、洗浄液、細胞溶解物、血漿、血液、または血清等の流体である。本明細書に記載される試料は、試料中のポリペプチドの検出を可能にするために、当該技術分野で常法を用いてプロセスされる。
本発明はまた、本明細書に記載される方法で用いるためのキットも提供する。
周囲のアミノ酸配列に最低限依存してポリペプチド中のヒプシンに結合する抗ヒプシン抗体が生成された。かかる抗ヒプシン抗体はまた、本明細書において、「汎抗ヒプシン抗体」と称される。
Fab産生及び精製
劇的に改善された収率及び95%超の純度を有するヒプシン化ペプチドの自動化固相合成のために直角に保護されているヒプシン試薬が、これまでに開発されている(Song et al.,J.Org.Chem.,80:3677−3681,2015)。汎ヒプシン抗体を生成するために、10匹のウサギを、キーホールリンペットヘモシアニンまたはチログロブリンに複合化したI1及びI2ペプチド(YenZym Antibodies,South San Francisco,CA)のカクテルで免疫化した。ブースト間の3週間で3ラウンドの免疫付与後、ウサギを、対応する非ヒプシン化ペプチドを上回るヒプシン含有ペプチドへの結合のそれらの選択性について、ELISAによってスクリーニングした。結合の最高の選択性を有する4匹のウサギを、1つのさらなるラウンドの免疫化に供した。次いで、ウサギモノクローナル抗体を生成した(Abcam,Burlingame,CA)(Chen et al.,J.Virol.,87:10232−10243,2013)。ハイブリドーマウェルからの上清を、ヒプシン化及び一致した非ヒプシン化ペプチドへの結合のために、ELISAによってスクリーニングした(表1)。隣接する配列を有するヒプシン化ペプチドの全てに結合することができた5つのハイブリドーマクローンである、例えば、ヒプシン化eIF5Aペプチドを、さらなる特性評価のために選択した。
1peg6は、ポリエチレングリコールを示し、Hpuは、ヒプシンを示し、デオキシHpuは、デオキシヒプシンを示す。ペプチドのアミノ末端は、ビオチンまたはアセチル基によって遮断される。ペプチドのカルボキシ末端は、アセチル基によって覆われる。
Flagタグ化ヒトWTまたはK50A eIF5Aを、Mycタグ化DHS及びHAタグ化DOHHとともに、ヒト胎児腎臓293T細胞内において発現させた。トランスフェクトした293T細胞を、溶解緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM EDTA、1% Triton−X100、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル、pH7.4)中で溶解した。上清を、遠心分離(30分、16,000g、及び4℃)後に回収した。次いで、試料を、各抗ヒプシンモノクローナル抗体の特異性を決定するために、ウエスタンブロット法によって分析した。
ヒプシンを、以前に記載のように作成し(Song et al.,J.Org.Chem.,80:3677−3681,2015)、異なるヒプシン化ペプチドのパネルを合成するために使用した(表1)。あるいは、10匹のウサギを、キーホールリンペットヘモシアニンまたはチログロブリンのいずれかに複合化したアセチル−ヒプシン−peg6−C−アミド及びアセチル−GSG−ヒプシン−GSG−peg6−C−アミドペプチドで免疫化した。3ラウンドの免疫付与後、10匹のウサギのうちの4匹のウサギがELISAによりそれらの非ヒプシン化対照物よりもヒプシン含有ペプチドに対してわずかに高い反応を示したため、それらをモノクローナル抗体の生成のために追求した。非精製のウサギハイブリドーマ上清を、免疫付与のために使用したヒプシン化ペプチドへの選択的結合のために、ELISAによってスクリーニングし、陽性ウェルは、異なるヒプシン化ペプチドのパネルへの結合のためにさらにスクリーニングした(表1)。7,680のうちの146のハイブリドーマ上清が、免疫付与のために使用したヒプシン化ペプチドに選択的に結合することが見出されたが、対応する非ヒプシン化ペプチドには見出されなかった。これらの146のうちの5つのハイブリドーマ上清は、対応する非ヒプシン化ペプチドに最低限結合してヒプシン化ペプチドの全てに結合した。これらの5つのウサギモノクローナル抗体を、分子クローニングし、組換え発現し、精製し、特性評価した。これらの5つのウサギのうちの3つのウサギモノクローナル抗体(mAbHpu24、mAbHpu91、及びmAbHpu98)は、異なるヒプシン化ペプチドの全てを認識することが確認されたが、対応する非修飾ペプチドは確認されなかった(図1A〜D及び図2A)。これらの結果は、これらの抗ヒプシン抗体が多くの異なるヒプシン化タンパク質と相互作用する可能性があり、ヒプシン、すなわち、汎抗ヒプシン抗体の一次配列及び二次構造環境から独立していることを示唆している。
ファージディスプレイ技術を用いて、汎抗ヒプシン抗体の親和性をさらに増強した。
親和性成熟のためのファージディスプレイ
E.coliにおけるウサギFabHpu24及びFabHpu98のファージディスプレイを改善するために、細菌コドン最適化されたウサギFabHpu24及びFabHpu98配列を合成し(Genewiz)、ファージディスプレイベクターにクローン化した。ファージディスプレイライブラリーを、Kunkel変異誘発によって作成した(Kunkel et al.,PNAS,82:488−492,1985)。各ライブラリーにおいて、ヌクレオチド塩基と過剰量の野生型ヌクレオチドの70−10−10−10の混合物で合成された縮重オリゴヌクレオチドを用いて、変異を、同じCDRループ上にすべての位置に導入した。その結果として、得られたライブラリーは、約50%の頻度で野生型残基を好む。標準プロトコルに従って、すべてのファージ調製を行った(Bostrom et al.,Methods Mol.Biol.,525:353−376,2009)。簡潔には、96ウェルMaxisorpプレートを、5μg/mlのNeutrAvidinで、4℃で一晩コーティングし、続いて、Superblock(商標)T20(PBS)ブロッキング緩衝液で、20℃で1時間ブロックした。第1ラウンドでは、P1−Hpuペプチドを、500nMの濃度で10分間振とうした後に、プレート上に捕捉した。過剰なペプチドを除去した後、100μlのライブラリーファージ(ブロッキング緩衝液中3×1012粒子/ml)を各ウェルに添加し、プレートを、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを、PBS中の0.05%(v/v) Tween 20で10回洗浄した。結合ファージを、0.1M HCl及び0.5M KClで20分間プレートから溶出し、等体積の1M Tris−HCl(pH7.5)で中和させ、その後のラウンドのために増幅した。第2ラウンド以降は、Fab提示ファージを、まず、低下している濃度のビオチン化ペプチドと混合し、NeutrAvidinコーティングしたウェル上で15分間捕捉した。数ラウンド後に、選択されたクローンを、IgGとして再フォーマットし、Expi293細胞に一過性にトランスフェクトした(Life Technologies,Grand Island,NY)。
ペプチドとFabとの間の相互作用の検出を、Octet RED 96システム(ForteBio,Menlo Park,CA)を用いて、バイオ層干渉分光法によって行った。ペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサチップ(ForteBio)上に固定化した。使用前に、センサチップを、1×動態緩衝液に1分間浸漬した。Fabを、200nMの濃度に調節した。Octetに使用されるマイクロプレートを、1ウェル当たり200μlの緩衝液または試料で充填した。データは、Octet Data Acquisition 7.0ソフトウェアによって自動作成された。
表面プラズモン共鳴法データは、BiacoreモデルT200(Biacore,Uppsala,Sweden)において測定した。Biacore CM5チップを、約300RUのNeutrAvidinでコーティングし、ビオチン化抗原を、10RU未満捕捉した。10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、及び0.005% Surfactant P20中の段階希釈のFab断片を、固定化ペプチドに流し、1:1のLangmuir結合モデルを使用して、各Fab:抗原対のkon、koff、及びKDを計算した。
4つのプレート(150mm)のサブコンフルエント状態の293T細胞を回収し、5mlの氷冷溶解緩衝液(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、2mM EDTA、1% Triton−X100、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル、pH7.4)中で溶解した。上清を、遠心分離(30分、5×104g、4℃)後に収集し、1、2、4、または8倍に希釈した。各希釈物からの試料(500μl)を、5μgの精製されたmAbHpu24、mAbHpu24.B、mAbHpu98、またはmAbHpu98.61が予め充填された50μlのプロテインAダイナビーズ(Invitrogen)に添加し、4℃で4時間インキュベートした。次いで、ビーズを、溶解緩衝液で3回洗浄し、50μlの1×NuPAGE LDS試料緩衝液とともに、70℃で10分間インキュベートした。電気泳動後に、タンパク質を、クマシーブルー染色によって可視化した。
P1ヒプシン化ペプチドに対するFabHpu98及びFabHpu24の結合親和性(KD)(表2)は、それぞれ、約113nM及び約192nMであった。これまでの研究は、eIF5Aが多くの異なる細胞型において豊富なヒプシン化タンパク質であることを示している(Cooper et al.,Cell,29:791−797,1982)。ヒプシンに対する抗体の高い親和性は、少量のヒプシン化タンパク質を特定する可能性を高めるために望ましい。
1 Hpuは、ヒプシンを示し、デオキシHpuは、デオキシヒプシンを示す。親和性測定(平均±標準偏差)は、表面プラズモン共鳴法によって行われた。結合親和性における改善倍率(「倍率」として示される)は、親及び対応する親和性成熟抗体のKD値の比率として計算した
ヒプシン化またはデオキシヒプシン化ペプチドと複合した汎抗ヒプシン抗体を、構造分析によって特徴付けた。
X線結晶学的構造分析
精製したFabHpu24を、10mg/mlに濃縮し、シッティングドロップ法によって結晶化する前に、アセチル−GSG−ヒプシン−GSG−アミドペプチドと1:2のモル比で混合した。FabHpu24の複合体の最適化結晶条件は、4℃で、20% ポリエチレングリコール(peg) 3350、0.1M ビス−トリスプロパンpH7.0、及び0.2M カリウム/リン酸ナトリウムである。データ収集のために、液体窒素中で瞬間冷凍する前に、結晶を、抗凍結剤溶液(25% グリセロール、20% peg 3350、0.1M ビス−トリスプロパンpH7.0、及び0.2M カリウム/リン酸ナトリウム)中に短時間浸漬し、データセットを、ビームラインALS 5.0.2で収集した。
FabHpu24−ヒプシン化ペプチド複合体
FabHpu24−ヒプシン化C1ペプチド複合体のX線結晶学的構造を、ヒプシンへの抗体結合に対する分子的洞察を得るために2.0Åの解像度で決定した(表3)。複合体は、非対称単位(0.15Åのrmsd)で、2つのすべて類似のFabHpu24−ヒプシン複合体とともにP21空間群で結晶化した。ヒプシンの4−アミノ−2−ヒドロキシブチル基は、模擬アニーリングmFo−dFcオミット電子密度マップにおいて明確に視認できたが(図8A)、ヒプシンの残りは、視認できなかった。これらの観察は、FabHpu24が、ヒプシンのみに結合し、隣接アミノ酸残基には結合しなかったことを示唆した。実際に、ヒプシンは、FabHpu24の重鎖及び軽鎖可変ドメインによって形成された深いポケットに挿入された(図9A)。ヒプシン結合ポケットは、VH鎖及びVL鎖によって、それぞれ与えられた、112Å2及び189Å2の、全体で約301Å2の溶媒曝露された表面積に埋め込まれた。
1括弧内の値は、最高分解能シェルのものである。
FabHpu98は、ヒプシン及びデオキシヒプシンの両方に結合したという点で二重特異性を有した。FabHpu98−ヒプシン及びFabHpu98−デオキシヒプシン複合体の結晶を、同じ条件下で成長させ、それらのX線結晶学的構造を、2.0Åの解像度で決定した。複合体は、非対称単位(0.764Åのrmsd)で、2つのすべて類似のFabHpu98とともにC222空間群で結晶化した。1つのFabHpu98分子は、ヒプシンまたはデオキシヒプシンとの複合体を形成したが、一方、他方のFabHpu98分子は、そのパラトープが分子間の接触によってブロックされたため、複合されていない形態であった。
ヒプシン及びデオキシヒプシンは、FabHpu98によって構成された深いポケットに挿入するために同様の立体構造に採用した。しかしながら、デオキシヒプシン及びヒプシンの相互作用の差があった。第一に、ヒプシンのヒドロキシル基は、Fo(ヒプシン)−Fo(デオキシヒプシン)差マップに明確に示され、これを、FabHpu98:ヒプシンモデルからの相を用いることによって計算した(図11A)。ヒプシンのヒドロキシル基は、VL S94、VH Y52、及び硫酸イオンとともに水素ネットワークを形成した(図11B)。
FabHpu24.Bヒプシン化C1ペプチド複合体の結晶構造を、FabHpu24.Bの30倍の親和性改善のための分子基盤をより理解するために、2.4Åの解像度で決定した。単位格子は、FabHpu24の2倍の大きさであるが、FabHpu24.Bの結晶は、FabHpu24に同形であった。FabHpu24.Bの一次配列は、CDR L1、L2、及びH2においてその親FabHpu24とは異なったが、主鎖立体構造変化は、CDR H2においてのみ観察され、ヒプシン部分に対してCDR H3をさらに押し込んだ(図12A)。結果として、FabHpu24.B VH D100とVL Y28との間の水素結合は、ヒプシンを包含するために、より大きな接触領域を形成した。ヒプシンは、配位水の代わりに、第3のヘテロ原子(7−N)がFabHpu24.BにおいてVH G100aのカルボニル基で水素結合を直接形成したことを除いては、同じ水素ネットワークを有する深いポケットに明らかに固定した(図12B)。さらに、ヒプシンに隣接する隣接残基もまた、FabHpu24.Bとの相互作用に関与した。VHM99及びVH D56側鎖のカルボニル基は、C1ペプチドの主鎖と水素結合を形成した。さらに、VH残基D56はまた、ペプチドS6中の隣接残基の側鎖と相互作用した。これらの結果は、6nMから186nMの間で異なる、FabHpu24.Bと異なる隣接配列を有するヒプシンとの間の結合親和性の差の説明となり得る。ヒプシンのみが、FabHpu24−ヒプシン複合体において観察されたが、隣接配列もまた、FabHpu24とヒプシンとの間の相互作用に影響を及ぼした。それにもかかわらず、FabHpu24.Bは、すべての6つの合成されたヒプシン化ペプチドに結合することができた。
FabHpu98.61−ヒプシン化C1ペプチド複合体のX線結晶学的構造を、ヒプシンへの抗体結合に対する分子的洞察を得るために2.2Åの解像度で決定した。複合体は、非対称単位(0.14Åのrmsd)で、2つのすべて類似のFabHpu98.61−ヒプシン複合体とともにC2空間群で結晶化した。FabHpu98.61及びFabHpu98は、CDR H1ループを除いては、非常に類似の様式でヒプシン化C1ペプチドに結合し、その中で、C27及びC32は、ジスルフィドを形成した(図12C)。結果として、FabHpu98.61 CDR H1は、VH W9の方向に傾き、ヒプシンに対してその充填を改善し得る。加えて、VH T33は、より接近し、ヒプシンの11−NでさらなるH結合を形成し、他の相互作用は、同じ相互作用を維持した。
配列
Hpu24軽鎖CDR1のアミノ酸配列(Kabat)
QSSETVYRGDWLS(配列番号1)
Hpu24.B軽鎖CDR1のアミノ酸配列(Kabat)
RSRQRVYLGDWLS(配列番号2)
Hpu91、Hpu98及びHpu98.61軽鎖CDR1のアミノ酸配列(Kabat)
QASEDIKRYLA(配列番号3)
Hpu24軽鎖CDR2のアミノ酸配列(Kabat)
DASYLAS(配列番号4)
Hpu24.B軽鎖CDR2のアミノ酸配列(Kabat)
DASFRGD(配列番号5)
Hpu91、Hpu98、及びHpu98.61軽鎖CDR2のアミノ酸配列(Kabat)
AASKLAS(配列番号6)
Hpu24及びHpu24.B軽鎖CDR3のアミノ酸配列(Kabat)
LGGYYDDADDT(配列番号7)
Hpu98及びHpu98.61軽鎖CDR3のアミノ酸配列(Kabat)
QQGYTSSNVNNA(配列番号8)
Hpu24及びHpu24.B重鎖CDR1のアミノ酸配列(Kabat)
DYAMI(配列番号9)
Hpu91重鎖CDR1のアミノ酸配列(Kabat)
TYTIN(配列番号10)
Hpu98重鎖CDR1のアミノ酸配列(Kabat)
TYTMN(配列番号11)
Hpu98.61重鎖CDR1のアミノ酸配列(Kabat)
HCTMN(配列番号12)
Hpu24重鎖CDR2のアミノ酸配列(Kabat)
IIYGGSNKLAYAKWA(配列番号13)
Hpu24.B重鎖CDR2のアミノ酸配列(Kabat)
IIYGVINDLAYAKWA(配列番号14)
Hpu91重鎖CDR2のアミノ酸配列(Kabat)
DIWSDGNTYYANWA(配列番号15)
Hpu98及びHpu98.61重鎖CDR2のアミノ酸配列(Kabat)
DIYTDGNTYYANWA(配列番号16)
Hpu24及びHpu24.B重鎖CDR3のアミノ酸配列(Kabat)
GYGSMDGYDRLNL(配列番号17)
Hpu91重鎖CDR3のアミノ酸配列(Kabat)
DSWDTSIYYGLDL(配列番号18)
Hpu98及びHpu98.61重鎖CDR3のアミノ酸配列(Kabat)
DSWDASSYYGLDL(配列番号19)
Hpu24軽鎖可変領域のアミノ酸配列
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSETVYRGDWLSWFQKKPGQPPKLLIYDASYLASGVSSRFSGSGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYYDDADDTFGGGTEVVVK(配列番号20)
Hpu24.B軽鎖可変領域のアミノ酸配列
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCRSRQRVYLGDWLSWFQKKPGQPPKLLIYDASFRGDGVSSRFSGSGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYYDDADDTFGGGTEVVVK(配列番号21)
Hpu91軽鎖可変領域のアミノ酸配列
AIKMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASEDIKRYLAWYQQKPGQPPKLLIYAASKLASGVSSRFTGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYCQQGYTSTNVNNAFGGGTEVVVK(配列番号22)
Hpu98及びHpu98.61軽鎖可変領域のアミノ酸配列
AIKMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASEDIKRYLAWYQQKPGQPPKLLIYAASKLASGVSSRFKGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYCQQGYTSSNVNNAFGGGTEVVVK(配列番号23)
Hpu24重鎖可変領域のアミノ酸配列
QEQLKESGGRLVAPGTPLTLTCTVSGFDISDYAMIWVRQAPGKGLEWIGIIYGGSNKLAYAKWAKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYGSMDGYDRLNLWGQGTLVTVSS(配列番号24)
Hpu24.B重鎖可変領域のアミノ酸配列
QEQLKESGGRLVAPGTPLTLTCTVSGFDISDYAMIWVRQAPGKGLEWIGIIYGVINDLAYAKWAKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYGSMDGYDRLNLWGQGTLVTVSS(配列番号25)
Hpu91重鎖可変領域のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSAFSLSTYTINWVRQAPGKGLEWIGDIWSDGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSWDTSIYYGLDLWGQGTLVTVSS(配列番号26)
Hpu98重鎖可変領域のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSTYTMNWVRQAPGKGLEWIGDIYTDGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSWDASSYYGLDLWGQGTLVTVSS(配列番号27)
Hpu98.61重鎖可変領域のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSACSLYHCTMNWVRQAPGKGLEWIGDIYTDGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSWDASSYYGLDLWGQGTLVTVSS(配列番号28)
Hpu24軽鎖のアミノ酸配列
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSETVYRGDWLSWFQKKPGQPPKLLIYDASYLASGVSSRFSGSGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYYDDADDTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(配列番号29)
Hpu24.B軽鎖のアミノ酸配列
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCRSRQRVYLGDWLSWFQKKPGQPPKLLIYDASFRGDGVSSRFSGSGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYCLGGYYDDADDTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(配列番号30)
Hpu91軽鎖のアミノ酸配列
AIKMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASEDIKRYLAWYQQKPGQPPKLLIYAASKLASGVSSRFTGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYCQQGYTSTNVNNAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(配列番号31)
Hpu98及びHpu98.61軽鎖のアミノ酸配列
AIKMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASEDIKRYLAWYQQKPGQPPKLLIYAASKLASGVSSRFKGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYCQQGYTSSNVNNAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(配列番号32)
Hpu24重鎖のアミノ酸配列
QEQLKESGGRLVAPGTPLTLTCTVSGFDISDYAMIWVRQAPGKGLEWIGIIYGGSNKLAYAKWAKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYGSMDGYDRLNLWGQGTLVTVSSGQPKGPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPT(配列番号33)
Hpu24.B重鎖のアミノ酸配列
QEQLKESGGRLVAPGTPLTLTCTVSGFDISDYAMIWVRQAPGKGLEWIGIIYGVINDLAYAKWAKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYGSMDGYDRLNLWGQGTLVTVSSGQPKGPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPT(配列番号34)
Hpu91重鎖のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSAFSLSTYTINWVRQAPGKGLEWIGDIWSDGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSWDTSIYYGLDLWGQGTLVTVSSGQPKGPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPT(配列番号35)
Hpu98重鎖のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSTYTMNWVRQAPGKGLEWIGDIYTDGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSWDASSYYGLDLWGQGTLVTVSSGQPKGPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPT(配列番号36)
Hpu98.61重鎖のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSACSLYHCTMNWVRQAPGKGLEWIGDIYTDGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSWDASSYYGLDLWGQGTLVTVSSGQPKGPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPT(配列番号37)
Hpu24及びHpu24.B軽鎖FR1のアミノ酸配列
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVTISC(配列番号38)
Hpu91、Hpu98、及びHpu98.61軽鎖FR1のアミノ酸配列
AIKMTQTPSSVSAAVGGTVTINC(配列番号39)
Hpu24及びHpu24.B軽鎖FR2のアミノ酸配列
WFQKKPGQPPKLLIY(配列番号40)
Hpu91、Hpu98、及びHpu98.61軽鎖FR2のアミノ酸配列
WYQQKPGQPPKLLIY(配列番号41)
Hpu24及びHpu24.B軽鎖FR3のアミノ酸配列
GVSSRFSGSGSGTHFTLTISGVQCDDAATYYC(配列番号42)
Hpu91軽鎖FR3のアミノ酸配列
GVSSRFTGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYC(配列番号43)
Hpu98及びHpu98.61軽鎖FR3のアミノ酸配列
GVSSRFKGSGSGTEYTLTISGVQCDDAATYYC(配列番号44)
Hpu24、Hpu24.B、Hpu91、Hpu98、及びHpu98.61軽鎖FR4のアミノ酸配列
FGGGTEVVVK(配列番号45)
Hpu24及びHpu24.B重鎖FR1のアミノ酸配列
QEQLKESGGRLVAPGTPLTLTCTVSGFDIS(配列番号46)
Hpu91重鎖FR1のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSAFSLS(配列番号47)
Hpu98重鎖FR1のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLS(配列番号48)
Hpu98.61重鎖FR1のアミノ酸配列
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSACSLY(配列番号49)
Hpu24、Hpu24.B、Hpu91、Hpu98、及びHpu98.61重鎖FR2のアミノ酸配列
WVRQAPGKGLEWIG(配列番号50)
Hpu24及びHpu24.B重鎖FR3のアミノ酸配列
KGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAR(配列番号51)
Hpu91、Hpu98、及びHpu98.61重鎖FR3のアミノ酸配列
KGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAR(配列番号52)
Hpu24、Hpu24.B、Hpu91、Hpu98、及びHpu98.61重鎖FR4のアミノ酸配列
WGQGTLVTVSS(配列番号53)
Hpu91軽鎖CDR3のアミノ酸配列(Kabat)
QQGYTSTNVNNA(配列番号72)
Claims (46)
- ポリペプチド中のヒプシンに特異的に結合する単離された抗体であって、ヒプシンに隣接する、異なるアミノ酸配列を有するヒプシン含有ポリペプチドに結合する、前記抗体。
- 前記抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合しない、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は、ポリペプチド中のデオキシヒプシンに結合する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は、前記ヒプシンを含有するポリペプチドに対して900nM以下の結合親和性(KD)を呈する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体は、(i)前記ヒプシンを含有するポリペプチドに対して300nM以下の結合親和性(KD)、及び(ii)前記デオキシヒプシンを含有するポリペプチドに対して200nM以下の結合親和性(KD)を呈する、請求項3に記載の抗体。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体は、抗原結合断片である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号13もしくは14のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、(i)配列番号1もしくは2のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号4もしくは5のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、請求項1、2、及び4〜7のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記重鎖可変領域は、配列番号24もしくは25のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、配列番号20もしくは21のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む、請求項8に記載の抗体。
- 前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、(i)配列番号11もしくは12のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、請求項1及び3〜7のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記重鎖可変領域は、配列番号27もしくは28のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む、請求項10に記載の抗体。
- 前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、(i)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号72のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、請求項1及び3〜7のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記重鎖可変領域は、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む、請求項12に記載の抗体。
- ポリペプチド中のヒプシンに結合する単離された抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号13もしくは14のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、(i)配列番号1もしくは2のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号4もしくは5のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、単離された抗体。
- 前記重鎖可変領域は、配列番号24もしくは25のアミノ酸配列を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、配列番号20もしくは21のアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の単離された抗体。
- 前記重鎖は、配列番号33もしくは34のアミノ酸配列を含み、かつ/または前記軽鎖は、配列番号29もしくは30のアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の単離された抗体。
- ポリペプチド中のヒプシンと特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、(i)配列番号11もしくは12のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、単離された抗体。
- 前記重鎖可変領域は、配列番号27もしくは28のアミノ酸配列を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、配列番号23のアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の単離された抗体。
- 前記重鎖は、配列番号36もしくは37のアミノ酸配列を含み、かつ/または前記軽鎖は、配列番号32のアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の単離された抗体。
- ポリペプチド中のヒプシンと特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、(i)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、(i)配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(iii)配列番号72のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、単離された抗体。
- 前記重鎖可変領域は、配列番号26のアミノ酸配列を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域は、配列番号22のアミノ酸配列を含む、請求項20に記載の単離された抗体。
- 前記重鎖は、配列番号35のアミノ酸配列を含み、かつ/または前記軽鎖は、配列番号31のアミノ酸配列を含む、請求項20に記載の単離された抗体。
- 前記抗体は、検出剤に結合している、請求項1〜22のいずれか一項に記載の単離された抗体。
- 請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体をコードする配列を含む、単離された核酸。
- 請求項24に記載の核酸を含む、ベクター。
- 発現ベクターである、請求項25に記載のベクター。
- 請求項24に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- 抗体を産生するための方法であって、請求項27に記載の宿主細胞を、前記抗体を産生する条件下で培養することを含む、前記方法。
- 前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法であって、(a)前記試料を請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、(b)前記試料中の前記ポリペプチドに結合した前記抗体を検出するステップと、を含む、前記方法。
- 前記抗体は、検出剤に結合している、請求項30に記載の方法。
- 前記ポリペプチドに結合した前記抗体は、二次薬剤を使用することによって検出される、請求項30に記載の方法。
- 前記検出剤は、化学発光標識、発色団、発蛍光団、磁性粒子、染料、放射標識、または酵素である、請求項31に記載の方法。
- 前記検出は、酵素結合免疫吸着測定法、放射免疫測定法、免疫沈殿法、クロマトグラフィー、免疫組織化学法、免疫蛍光検査法、表面プラズモン共鳴法、蛍光標識細胞分取法、及び質量分析法からなる群から選択される1つ以上のアッセイによる、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は、生体試料である、請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料は、細胞または組織を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記生体試料は流体である、請求項35に記載の方法。
- 試料中のヒプシン含有ポリペプチドを単離するための方法であって、(a)前記試料を請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップと、(b)前記抗体に結合した前記ポリペプチドを単離するステップと、を含む、前記方法。
- 前記抗体は、固体表面に固定化される、請求項38に記載の方法。
- 前記試料は生体試料である、請求項38または39に記載の方法。
- 前記生体試料は、細胞または組織を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記生体試料は流体である、請求項40に記載の方法。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載の抗体を含む、組成物。
- 請求項1〜23のいずれか一項に記載の抗体または請求項43に記載の組成物を含む、キット。
- 試料中のヒプシン含有ポリペプチドを検出するための方法で前記抗体を使用するための1つ以上の薬剤をさらに含む、請求項44に記載のキット。
- 試料中のヒプシン含有ポリペプチドを単離するための方法で前記抗体を使用するための1つ以上の薬剤をさらに含む、請求項44に記載のキット。
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