JP2021165634A - 電流値データ取得方法および電流計測装置 - Google Patents

Abstract

【課題】一対の電極間を流れるトンネル電流を測定して生体高分子を識別する装置において、生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを、安定した測定環境において取得する技術を提供する。【解決手段】生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを取得する電流値データ取得方法であって、ａ）電極間の距離を所定の目標距離に一致するようにフィードバック制御を行う工程と、ｂ）フィードバックの安定条件を満たしているか否かを判定する工程と、ｃ）電極間の電流値に含まれるシグナルの出現頻度が所定の条件を満たしているか否かを判定する工程と、を含む。工程ｂ）および工程ｃ）の双方において、各条件を満たした場合に、前記生体高分子のシグナル電流の取得を開始する。これにより、安定した条件下で電流値データの取得工程を行うことができる。【選択図】図９

Description

本発明は、一対の電極間を流れるトンネル電流を測定することにより、生体高分子を識別する電流計測装置と、当該装置において生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを取得するシグナル取得方法に関する。

従来、微細な先端部を有する電極を用いて、特定の分子や原子を測定または識別する方法が知られている。微細な電極を用いて特定の分子を識別する方法については、例えば、特許文献１に記載されている。

特許文献１に記載の単分子識別方法では、電極間距離の短い電極対を用いて、電極間を通過する生体高分子を構成する単分子を、トンネル電流を測定することにより識別する。

特開２０１５−６４２４８号公報

特許文献１に記載のように、生体高分子の識別を目的として電極間のトンネル電流を測定するためには、できる限りノイズを排除した安定した測定環境において電極間電流を測定することが好ましい。そのようにすれば、より精度良く生体高分子の識別を行うことができる。

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、一対の電極間を流れるトンネル電流を測定することにより生体高分子を識別する装置において、生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを、安定した測定環境において取得する技術を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、一対の電極間を流れるトンネル電流を測定することにより、生体高分子を識別する装置において、前記生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを取得する電流値データ取得方法であって、ａ）電極間距離を所定の目標距離に一致するようにフィードバック制御を行う工程と、ｂ）前記工程ａ）のフィードバックの安定条件を満たしているか否かを判定する工程と、ｃ）前記電極間の電流値に含まれるシグナルの出現頻度が所定の条件を満たしているか否かを判定する工程と、を含み、前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の双方において、各条件を満たした場合に、前記生体高分子のシグナル電流の取得を開始する。

本願の第２発明は、第１発明の電流値データ取得方法であって、前記工程ｃ）における条件が、前記シグナルの出現頻度が所定の値以下であるという条件を含む。

本願の第３発明は、第１発明または第２発明の電流値データ取得方法であって、前記工程ｃ）における条件が、前記シグナルの出現頻度の変動量が所定の範囲内であるという条件を含む。

本願の第４発明は、第１発明ないし第３発明のいずれかの電流値データ取得方法であって、前記工程ｂ）における条件が、前記電極間の電流値と、目標とするターゲット電流値との差分が所定の範囲内であるという条件を含む。

本願の第５発明は、第１発明ないし第４発明のいずれかの電流値データ取得方法であって、前記工程ｂ）における条件が、前記電極間の電流値の変動量が所定の範囲内であるという条件を含む。

本願の第６発明は、第１発明ないし第５発明のいずれかの電流値データ取得方法であって、前記工程ｂ）における条件が、前記電極間の電流値の移動平均と、目標とするターゲット電流値との差分が所定の範囲内であるという条件を含む。

本願の第７発明は、第１発明ないし第６発明のいずれかの電流値データ取得方法であって、前記工程ｂ）における条件が、前記電極間距離の操作量の変動量が所定の範囲内であるという条件を含む。

本願の第８発明は、第１発明ないし第７発明のいずれかの電流値データ取得方法であって、前記工程ｂ）における条件が、前記電極間の電流値の変位量が所定の範囲内であるという条件を含む。

本願の第９発明は、第１発明ないし第８発明のいずれかの電流値データ取得方法であって、前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の双方において各条件を満たした状態で、所定の時間が経過した後で、前記生体高分子のシグナル電流の取得を開始する。

本願の第１０発明は、一対の電極間を流れるトンネル電流を測定して生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを取得する電流計測装置であって、前記電極間の距離を変動させる電極間距離変更部と、前記電極間の電流値を計測する電流計と、各部を動作制御する制御部と、を有し、前記制御部は、ａ）電極間距離を所定の目標距離に一致するようにフィードバック制御を行う工程と、ｂ）前記工程ａ）のフィードバックの安定条件を満たしているか否かを判定する工程と、ｃ）前記電極間の電流値に含まれるシグナルの出現頻度が所定の条件を満たしているか否かを判定する工程と、を実行し、前記制御部は、前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の双方において、各条件を満たした場合に、前記生体高分子のシグナル電流の取得を開始する。

本願の第１発明から第１０発明によれば、生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを、安定した測定環境において取得できる。

特に、本願の第２発明および第３発明によれば、擬似シグナルの出現頻度の低い安定した条件下で電流値データの取得を行うことができる。

一実施形態に係る電極基板の上面図である。 一実施形態に係る電極基板の部分上面図である。 一実施形態に係る電極基板の部分上面図である。 一実施形態に係る電極基板の部分上面図である。 一実施形態に係る電極基板の金属線の基端部間の距離の調整を行う際の様子を示した図である。 一実施形態に係る電極基板の計測電極部の基端部間の距離の調整を行う際の様子を示した図である。 一実施形態に係る電極基板の押し曲げ時の様子を示した部分断面図である。 一実施形態に係る電極基板の押し曲げ時の様子を示した部分断面図である。 ナノ電極を用いた電流値データ取得処理の流れを示したフローチャートである。 電流値データの一例を示した図である。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。なお、本願では、電極基板の厚み方向を上下方向とし、基板層に対して金属層側を上側、金属層に対して基板層側を下側として説明を行っている。しかしながら、電極基板の使用時の向きは必ずしも金属層側を鉛直上向きとしなくてもよい。

＜１．電極基板および電流計測装置の構成＞
本発明の一実施形態に係る電極基板１と、電流計測装置９とについて、図１〜図８を参照しつつ説明する。図１は、電極基板１の上面図である。図２〜図４は、電極基板１の部分上面図である。図５および図６は、電流計測装置９を用いた電極基板１の押し曲げの様子を示した概略図である。図７および図８は、電極基板１の部分断面図である。

この電極基板１および電流計測装置９は、生体高分子であるタンパク質を構成するアミノ酸、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）を構成するヌクレオチド、糖鎖を構成する単糖、その他の生体高分子を構成する単量体の配列や、各単量体を解析するために用いられる。具体的には、後述するナノ電極３４間に電圧を印加した状態でナノ電極３４間に生体高分子を通過させる。そして、ナノ電極３４と生体高分子との間に流れるトンネル電流を検知し、解析することにより、生体高分子を構成する単量体の解析を行う。

図１に示すように、電極基板１は、略長方形の板状の基板である。図１〜図４、図７および図８に示すように、電極基板１は、基板層２０と、金属層３０とを有する。以下では、電極基板１の長手方向を第１方向と称し、電極基板１の短手方向を第２方向と称する。第２方向は、第１方向と直交する。なお、「直交する」とは、「略直交する」を含むものとする。

本実施形態の基板層２０は、絶縁材料により形成される。本実施形態の基板層２０は、シリコン（Ｓｉ）により形成された基板層の上にポリイミドにより形成された基板層が重なった２層構造である。なお、本実施形態の基板層２０は２層構造であるが、本発明はこれに限られない。基板層２０は１種類の材料により形成される１層のみから構成されてもよいし、３つ以上の層から構成されてもよい。また、基板層２０は、絶縁性の材料により形成されていれば、ポリエチレンテレフタラート樹脂、セラミック、シリコーンゴムまたはアルミナなどの、シリコンおよびポリイミド以外の材料により形成されてもよい。

金属層３０は、図１〜図４に示すように、２つの接続用電極部３１と、２つの接続用電極部３１の間において第１方向に延びる配線部３２と、配線部３２の中央に配置された計測電極部３３とを有する。

金属層３０は、例えば、導体である金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、タングステン（Ｗ）等の金属により形成される。なお、金属層３０は、複数の金属層を重ねて構成されてもよい。例えば、クロム（Ｃｒ）により形成された金属層の上に、上記の金、白金、銀、銅等の金属からなる金属層が重なる構造であってもよい。なお、その場合であっても、計測電極部３３は、１層の金属層のみから構成されることが好ましい。金属層３０の厚みは、例えば、５０〜３００ｎｍである。

基板層２０および金属層３０の最上面は、絶縁膜（図示せず）により覆われている。金属層３０の表面を絶縁膜で覆うことにより、計測電極部３３を液中で用いる場合に、金属層３０のうち計測電極部３３以外の箇所において、金属層３０を構成する金属と液体との間における電子のやりとりが生じるのを抑制できる。なお、本実施形態では、絶縁膜はＴＥＯＳ酸化膜であるが、絶縁性の材料であれば、他の材料により形成されてもよい。なお、接続用電極部３１の上面の少なくとも一部には、絶縁膜が形成されない。このため、接続用電極部３１の上面の少なくとも一部は露出している。

２つの接続用電極部３１は、第１方向に離れて配置されている。２つの配線部３２はそれぞれ、各接続用電極部３１から計測電極部３３へ向かうにつれて次第にその幅が小さくなる。両側の配線部３２の間には、配線部３２よりもさらに第２方向の幅が小さい計測電極部３３が配置される。図４に示すように、計測電極部３３は、一対のナノ電極３４により構成される。電極基板１に負荷（外力）がかかっていない状態では、図４に示すように、一対のナノ電極３４の先端部同士は、互いに接触した状態となっている。

基板層２０は、上面から下方へ凹む流路５０を有する。流路５０は、第１流路５１、第２流路５２および計測流路５３を有する。第１流路５１および第２流路５２は、計測電極部３３を挟んで第２方向に対向して配置される。計測流路５３は、第１流路５１と第２流路５２を第２方向に繋ぐ。

第１流路５１および第２流路５２は、格子状に繋がる複数の溝により構成される。このような形状により、第１流路５１および第２流路５２に生体高分子を含む液体が充填されると、各生体高分子が溝の延びる方向に沿って配置されやすくなる。したがって、第１流路５１および第２流路５２と計測流路５３との境界部で生体高分子が詰まって液体の流動性が低下するのが抑制されるとともに、計測流路５３内において各生体高分子が計測流路５３の延びる方向に沿って延びた状態で配置される。第１流路５１および第２流路５２の各溝は、幅が約１μｍであり、深さが約２μｍである。

計測流路５３は、第２方向に延びる溝である。計測流路５３は、ナノ電極３４の先端部と上下に重なる位置に配置される。これにより、計測流路５３内を第２方向に移動する生体高分子が、ナノ電極３４の間を通過しやすい。計測流路５３の深さは、第１流路５１および第２流路５２と同様、約２μｍである。計測流路５３はナノ電極３４付近においてその幅が狭くなっている。これにより、電流値計測時に、生体高分子が、計測流路５３の延びる第２方向に沿う向きで、ナノ電極３４間を１つずつ通過しやすい。なお、第１流路５１、第２流路５２および計測流路５３のそれぞれの深さは、２μｍ未満であってもよいし、２μｍより大きくてもよい。

次に、電流計測装置９について、図５および図６を参照しつつ説明する。図５および図６は、電流計測装置９において電流計測を行う際の様子を示した図である。図５は、電極基板１がセットされた電流計測装置９の初期状態における様子を示した側面図である。図６は、電極基板１の押し曲げ時における電流計測装置９の様子を示した側面図である。なお、図６では、電極基板１の変形を誇張して示している。

図６に概念的に示すように、電流計測装置９は、載置台９１と、固定具９２と、押し上げ具９３と、昇降機構９４と、電源９５と、電流計９６と、制御部９０とを有する。

載置台９１は、電極基板１を載置する平らな上面を有する。本実施形態の固定具９２は、第１方向に対して略垂直に配置される４つの板状部材である。固定具９２は、計測電極部３３を挟んだ第１方向の２箇所において、電極基板１を上下から押えて固定する。

押し上げ具９３には、例えば、半球状の上面を有する円柱状の部材が用いられる。押し上げ具９３は、昇降機構９４に接続されている。昇降機構９４は、モータ９４１とピエゾアクチュエータ９４２とを有する。モータ９４１は、押し上げ具９３をミリメートル単位で大きく上下に移動させる。ピエゾアクチュエータ９４２は、押し上げ具９３をナノメートル単位で小さく上下に移動させる。昇降機構９４は、モータ９４１とピエゾアクチュエータ９４２とを組み合わせることにより、大きな動きと細かな動きとの双方を実現している。なお、昇降機構９４は、押し上げ高さを制御できる機構であれば、その他の動力を用いた機構であってもよい。

電源９５は、一対の接続用電極部３１間に電圧を印加する。電流計９６は、計測電極部３３のナノ電極３４間に流れる電流の電流値を測定する。

制御部９０は、昇降機構９４、電源９５および電流計９６とそれぞれ電気的に接続し、各部を制御する。本実施形態の制御部９０は、ＣＰＵ等の演算処理部、ＲＡＭ等のメモリ、およびハードディスクドライブ等の記憶部を備えたコンピュータにより構成されている。制御部９０の機能は、記憶部に記憶されたコンピュータプログラムに基づいて、演算処理部が動作することにより実現される。これにより、後述する電流計測装置９における電流値データ取得処理や、生体高分子の配列決定処理が進行する。

電極基板１を電流計測装置９にセットする際には、まず、載置台９１上に電極基板１を載置する。その後、電極基板１の計測電極部３３付近に負荷のかからない状態で電極基板１を上下から４つの固定具９２で固定する。このとき、計測電極部３３の真下に押し上げ具９３が位置するように、電極基板１を配置する。

そして、電流計測時には、まず、電源９５により、接続用電極部３１間に所定の電圧を印加するとともに、電流計９６による電流値の計測を開始する。そして、昇降機構９４を駆動させて押し上げ具９３を押し上げて、ナノ電極３４の先端部同士の距離（電極間距離）を調整する。

図７は、初期位置における電極基板１の部分断面図である。図８は、押し上げ時における電極基板１の部分断面図である。図４および図７に示すように、電極基板１が押し曲げられていない状態では、ナノ電極３４の先端部同士は接触している。図８に示すように、押し上げ具９３を押し上げると、電極基板１の計測電極部３３付近が下面側から押し上げられる。すると、計測流路５３を構成する基板層２０の側壁が、図８中に実線矢印で示すように、互いに離れる方向へと移動する。これにより、ナノ電極３４同士が、図８中に破線矢印で示すように、互いに離れる方向へと移動する。その結果、電極間距離が拡がる。このように、押し上げ具９３によって電極基板１を押し上げることにより、電極間距離の調整を行う。すなわち、押し上げ具９３および昇降機構９４によって、ナノ電極３４間の距離を変動させる電極間距離変更部が構成される。

＜２．電流値データ取得処理＞
次に、電極対である１対のナノ電極３４を用いて、生体高分子の電流値データを取得する電流値データ取得処理について、図９および図１０を参照しつつ説明する。図９は、ナノ電極３４を用いた電流値データ取得処理の流れを示したフローチャートである。図１０は、電流値Ｉの一例を示した図である。なお、図１０は、電流値Ｉの時系列データの特徴を誇張して表示したものであり、実験データではない。

本実施形態では、ポリヌクレオチドであるＲＮＡのシグナル電流を取得するために、ＲＮＡを含む液体試料の電流値データを取得する。まず、ＲＮＡを含む液体試料を電極基板１の流路５０に満たし、流路５０の上部をカバー（図示省略）によって覆う。これによって、液体試料の溶媒の蒸発を抑制するとともに、液体試料に粉塵等が混入するのを抑制する。そして、この電極基板１を電流計測装置９にセットする（ステップＳ１０１）。

次に、この電極基板１について校正（キャリブレーション）工程を行う（ステップＳ１０２）。ナノ電極３４の校正工程では、押し上げ具９３による電極基板１の押し上げと引き下げとを繰り返して、ナノ電極３４の電極間距離ｄを変動させ、その間のナノ電極３４間に流れるトンネル電流Ｉｔの値を取得する。押し上げ具９３の押し上げおよび引き下げは、ピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐを増減させることによって行う。

ピエゾアクチュエータ９４２の操作量（ここでは印加電圧Ｖｐ）と、電極間距離ｄとの関係は予め求められている。一方で、電極間距離ｄと、電極間を流れるトンネル電流Ｉｔとの関係は、理論的に、
Ｉｔ＝Ｋ＊ｅｘｐ（−β＊ｄ）
で示される。校正工程（ステップＳ１０２）では、取得した電極間距離ｄとトンネル電流Ｉｔとの関係から、定数Ｋおよび定数βを算出する。これにより、電極間距離ｄとトンネル電流Ｉｔとの関係が求められる。さらに、印加電圧Ｖｐと電極間距離ｄとの関係を考慮して、一対の電極（ナノ電極３４）に対する操作量（印加電圧Ｖｐ）と電極間電流値（電流値Ｉ）との関係が求められる。

続いて、電極間距離ｄを所定の目標距離ｄｏに設定する（ステップＳ１０３）。具体的には、まず、ナノ電極３４間にトンネル電流が流れないように電極間距離ｄを十分大きくした状態で、基準電流Ｉｋの計測を行う。一方で、ステップＳ１０２で算出した推定関数から、目標距離ｄｏにおけるトンネル電流である目標トンネル電流Ｉｐを算出する。そして、基準電流Ｉｋと、目標トンネル電流Ｉｐとを合算して、目標距離ｄｏにおける推定ベース電流値であるターゲット電流値Ｉｏを算出する。そして、制御部９０は、電流計９６の検出した電流値Ｉがターゲット電流値Ｉｏと一致するように、フィードバック制御を行う。

なお、ステップＳ１０３において、目標距離ｄｏにおける目標トンネル電流Ｉｐが基準電流Ｉｋのノイズに対して小さい場合、いったん目標距離ｄｏよりも小さい中間距離（すなわちトンネル電流が目標トンネル電流Ｉｐよりも大きい距離）へ電極間距離を設定する。その後、Ｓ１０２で算出した推定関数に基づいて、中間距離から目標距離ｄｏまでの印加電圧Ｖｐの差分を算出し、当該差分に基づいて電極間距離ｄを調整する。これにより、電極間距離ｄを所定の目標距離ｄｏに設定することができる。

その後、制御部９０は、電流値Ｉがターゲット電流値Ｉｏと一致し続けるようにフィードバック制御を開始する（ステップＳ１０４）。

そして、制御部９０は、フィードバック制御工程において、所定のフィードバック安定条件を満たしているか否かを判断する（ステップＳ１０５）。すなわち、制御部９０は、電極間距離ｄが安定して目標距離ｄｏと略同一と見なせる範囲に調整されているか否かを判断する。具体的な判断条件については、後述する。

ステップＳ１０５において、所定のフィードバック安定条件を満たしていないと判断すると、制御部９０は、ステップＳ１０５へ戻り、制御部９０によるフィードバック制御を引き続き行う。一方、ステップＳ１０５において、所定のフィードバック安定条件を満たしていると判断すると、制御部９０は、ステップＳ１０６へと進む。

ステップＳ１０６では、制御部９０は、引き続き、ナノ電極３４間の電流値Ｉに含まれるシグナルの出現頻度が所定の条件（「シグナル安定条件」と称する）を満たしているか否かを判断する。ここで、「シグナル」とは、電流値Ｉのうち、ナノ電極３４間に試料中の液体のみが存在する場合のベース電流比べて大きな電流値を有する部分を意味する。ステップＳ１０６においては、判定対象とするシグナル部分の電流値である判定用シグナル電流値Ｉｓが、所定の条件を満たしているか否かを判断する。これにより、ポリヌクレオチドの電流値データを適切に取得できる状態となっているか否かを判断する。

ステップＳ１０６において、シグナルの出現頻度が所定の条件を満たしていないと判断すると、制御部９０は、ステップＳ１０５へ戻り、制御部９０によるフィードバック制御を引き続き行う。一方、ステップＳ１０６において、シグナルの出現頻度が所定の条件を満たしていると判断すると、制御部９０は、ステップＳ１０７へと進む。

ステップＳ１０７では、ステップＳ１０５およびステップＳ１０６の条件を全て満たした状態で所定の期間が経過したか否かを判断する。本実施形態では、ステップＳ１０６において、ステップＳ１０５およびステップＳ１０６の条件を全て満たした状態で１０ｓｅｃ経過したか否かを判断する。

なお、ステップＳ１０７において、ステップＳ１０５およびステップＳ１０６のうちの少なくとも一部の条件が満たされた状態で所定の期間が経過したか否かを判断するようにしてもよい。

ステップＳ１０７において、所定の期間が経過する前に、ステップＳ１０５およびステップＳ１０６の条件のいずれかが満たされなくなった場合、ステップＳ１０５へ戻り、制御部９０によるフィードバック制御を引き続き行う。一方、ステップＳ１０７において、ステップＳ１０５およびステップＳ１０６の条件を全て満たした状態で所定の期間が経過したと判断すると、制御部９０は、ステップＳ１０８へと進む。

そして、制御部９０は、電流値データの取得を行う（ステップＳ１０８）。具体的には、制御部９０は、電流計９６に、所定の間隔で電流値Ｉを測定させ、当該複数の電流値Ｉを電流値データとして記憶する。本実施形態では、０．１ｍｓｅｃ毎に電流値Ｉを測定する。ただし、電流値Ｉの測定間隔は、０．１ｍｓｅｃに限られない。電流値Ｉの測定間隔は、０．１ｍｓｅｃ未満であってもよいし、０．１ｍｓｅｃより長くてもよい。ステップＳ１０８における電流測データの取得は、所定の期間行うようにしてもよいし、所定の終了条件を満たした場合に終了するようにしてもよい。電流値データの取得が終了するとともに、制御部９０は、電極間距離ｄのフィードバック制御も終了する。

上記の電流値データ取得処理では、ステップＳ１０５〜Ｓ１０７において、それぞれ、所定の条件を満たしている場合にのみ、電流値データの取得を行う。このようにすることにより、安定した環境で電流値データを取得できる。したがって、信頼度の高い電流値データに基づいて、生体高分子の識別や配列決定を行うことができる。

本実施形態では、上記の通り、ステップＳ１０５において、フィードバック安定条件を満たしているか否かを判断する。本実施形態のステップＳ１０５の判定に用いるフィードバック安定条件は、以下の５つの条件である。

第１のフィードバック安定条件は、電流値Ｉと、目標とするターゲット電流値Ｉｏとの差分が所定の範囲内であるという条件である。

第１のフィードバック安定条件の判定においては、例えば、直近の小区間（例えば０．５ｓｅｃ）における電流値Ｉの平均値Ｉａと、ターゲット電流値Ｉｏとの差分ΔＩ１＝Ｉａ−Ｉｏの絶対値が、所定の閾値よりも小さいか否かを判断する。

第１のフィードバック安定条件の判定においては、例えば、電流値Ｉの特殊履歴平均Ｉｃと、目標とするターゲット電流値Ｉｏとの差分ΔＩ２＝Ｉｃ−Ｉｏの絶対値が、所定の閾値よりも小さいか否かを判断してもよい。この場合、特殊履歴平均Ｉｃを算出する際、初めに小区間（例えば０．５ｍｓｅｃ）毎の電流値Ｉの平均値Ｉａを算出し、当該平均値Ｉａの履歴を大区間（例えば５０ｍｓｅｃ）分保存する。そして、新たなＩａが算出される度に、当該履歴から異常データの最上位を除去した上で、当該履歴に新たなＩａを加える。このような特殊履歴の平均値を特殊履歴平均Ｉｃとする。このようにして、第１のフィードバック安定条件を判断してもよい。なお、第１のフィードバック安定条件の判定に、その他の方法により算出されるパラメータを用いてもよい。

第２のフィードバック安定条件は、電流値Ｉの変動量が所定の範囲内であるという条件である。

第２のフィードバック安定条件の判定においては、例えば、小区間（例えば０．５ｍｓｅｃ）毎の電流値Ｉの平均値Ｉａと、電流値Ｉの標準偏差σｉとを算出する。そして、最新の標準偏差σｉ、最新の平均値Ｉａおよび最新の小区間の直前の小区間における標準偏差σｉ’を用いたパラメータＰ１＝（σｉ−σｉ’）／Ｉａを算出する。そして、当該パラメータＰ１の絶対値が所定の閾値よりも小さいか否かを判断する。なお、第２のフィードバック安定条件の判定に、その他の方法により算出されるパラメータを用いてもよい。

第３のフィードバック安定条件は、電流値Ｉの最新の最頻値とターゲット電流値Ｉｏとの差分が所定の範囲内であるという条件である。

第３のフィードバック条件としては、例えば、最新の小区間（０．５ｍｓｅｃ）の電流値Ｉの最頻値であるＩｍと、目標とするターゲット電流値Ｉｏとの差分ΔＩ３＝Ｉｍ−Ｉｏの絶対値が、所定の閾値よりも小さいか否かを判断する。なお、第３のフィードバック安定条件の判定に、その他の方法により算出されるパラメータを用いてもよい。

第４のフィードバック安定条件は、電極間距離ｄの変動量の指標となる、印加電圧Ｖｐの変動量が所定の範囲内であるという条件である。印加電圧Ｖｐは、電極間距離ｄの操作量である。なお、本実施形態では、印加電圧Ｖｐについては、小区間（０．５ｍｓｅｃ）毎に制御により印加電圧Ｖｐを変更可能としている。

第４のフィードバック安定条件の判定においては、例えば、最新の印加電圧Ｖｐｐと、印加電圧Ｖｐの特殊履歴平均Ｖｐａとの差分ΔＶｐ１＝Ｖｐｐ−Ｖｐａの絶対値が、所定の閾値よりも小さいか否かを判断する。なお、特殊履歴平均Ｖｐａを算出する際、初めに、印加電圧Ｖｐの履歴を大区間（例えば５０ｍｓｅｃ）分保存する。そして、新たな小区間となって印加電圧Ｖｐｐが更新される度に、当該履歴から異常データの最上位を除去した上で、当該履歴に新たな印加電圧Ｖｐｐを加える。このような特殊履歴の平均値を特殊履歴平均Ｖｐａとする。このようにして、第４のフィードバック安定条件を判定してもよい。

また、第４のフィードバック安定条件の判定においては、例えば、印加電圧Ｖｐの特殊履歴の標準偏差σｖが所定の閾値よりも小さいか否かを判断する。特殊履歴の平均値Ｖｐｍを算出する際、上記と同様に印加電圧Ｖｐの特殊履歴を更新し、その特殊履歴に含まれる印加電圧Ｖｐの各値からその標準偏差σｖを算出する。このようにして、第４のフィードバック安定条件を判定してもよい。なお、第４のフィードバック安定条件の判定に、その他の方法により算出されるパラメータを用いてもよい。

第５のフィードバック安定条件は、電流値Ｉの変位量が所定の範囲内であるという条件である。なお、「電流値Ｉの変位量が所定の範囲内」に代えて、「電流値Ｉの微分値が所定の範囲内」としてもよい。

第５のフィードバック安定条件の判定においては、例えば、電流値Ｉの特殊履歴の移動平均Ｉｄと、最新の小区間の電流値の平均値Ｉａとの差分ΔＩ４＝Ｉｄ−Ｉａの絶対値が、所定の閾値よりも小さいか否かを判断してもよい。この場合、特殊履歴の移動平均Ｉｄを算出する際、初めに小区間（例えば０．５ｍｓｅｃ）毎の電流値Ｉの平均値Ｉａを算出し、当該平均値Ｉａの履歴を大区間（例えば５０ｍｓｅｃ）分保存する。そして、新たなＩａが算出される度に、当該履歴から異常データの最上位を除去した上で、当該履歴に新たなＩａを加える。このような特殊履歴の最新の中区間（例えば５ｍｓｅｃ）の平均値を特殊履歴の移動平均Ｉｄとする。このようにして、第５のフィードバック安定条件を判断してもよい。なお、第５のフィードバック安定条件の判定に、その他の方法により算出されるパラメータを用いてもよい。

本実施形態では、これら５つのフィードバック安定条件を全て満たしている場合のみ、ステップＳ１０６へと進む。しかしながら、本発明はこれに限られない。ステップＳ１０５で判断する条件は、これらのフィードバック安定条件の一部であってもよい。また、ステップＳ１０５において、その他の条件が追加されてもよい。また、上記の説明では、５つのフィードバック安定条件について、具体例を示したが、各フィードバック安定条件は上記の条件に限られず、その他の条件を用いてもよい。また、５つのフィードバック安定条件のそれぞれが、２つ以上の条件を有していてもよい。

これらのフィードバック安定条件のうち、第１および第２のフィードバック安定条件は、フィードバック制御の目的であるベース電流値Ｉｂをターゲット電流値Ｉｏに一致させることができているかを判断する基本的な指標となっている。このため、ステップＳ１０５において、当該２つの条件を含めることが好ましい。

また、第３のフィードバック安定条件は、ベース電流値Ｉｂのノイズが大きすぎないかを判断する指標となっている。第４のフィードバック安定条件は、電極間距離ｄを細かく変動させることなくベース電流値Ｉｂをターゲット電流値Ｉｏと一致させることができているかを判断する指標となっている。第５のフィードバック安定条件は、ベース電流値Ｉｂの急激な変動がないかを判断する指標となっている。これらの追加的な３つの条件のうちの少なくとも１つを、ステップＳ１０５における条件に含めることにより、より安定した条件下で電流値データを取得できる。

なお、本実施形態の第１〜第５のフィードバック安定条件に代えて、その他のフィードバック安定条件が用いられてもよい。

ステップＳ１０５に続いて、ステップＳ１０６においてシグナルの出現頻度についてのシグナル安定条件を満たしているか否かを判断する。ステップＳ１０６において、シグナル安定条件を満たしているか否かを判断する場合、電流値Ｉのデータからシグナルと認識される箇所を抽出する。本実施形態のステップＳ１０６の判定に用いるシグナル条件は、以下の２つの条件である。

第１のシグナル条件は、シグナルの出現頻度が所定の値以下であるという条件である。第１のシグナル条件の判定においては、例えば、直近の大区間（５０ｍｓｅｃ）における単位時間当たりのシグナル数が所定の閾値以下であるか否かを判断する。

第２のシグナル条件は、シグナルの出現頻度の変動量が所定の範囲内であるという条件である。第２のシグナル条件の判定においては、例えば、小区間（例えば０．５ｍｓｅｃ）毎のシグナル数Ｓについての大区間（例えば５０ｍｓｅｃ）における特殊履歴の標準偏差σｓが所定の閾値以下であるか否かを判断する。なお、シグナル数Ｓの標準偏差σｓを算出する際、初めに、小区間毎のシグナル数Ｓを大区間分保存する。そして、新たな小区間のシグナル数Ｓが算出される度に、当該履歴から異常データの最上位を除去した上で、当該履歴に新たなシグナル数Ｓを加える。このような特殊履歴の標準偏差σｓを算出する。

ここで、本実施形態のステップＳ１０６におけるシグナルの抽出方法について説明する。シグナルの抽出時には、まず、電流値Ｉの移動平均である移動平均電流値Ｉｖを算出する。移動平均電流値Ｉｖの算出の基礎となる区間は、例えば０．２ｍｓｅｃとする。一方で、所定区間（例えば５０ｍｓｅｃ）毎の電流値Ｉの標準偏差σを算出する。そして、移動平均電流値Ｉｖをベースラインとした第１閾値Ｔ１＝Ｉｖ＋６σと、第２閾値Ｔ２＝Ｉｖ＋３σとを算出する。

図１０において、説明の簡便のため、移動平均電流値Ｉｖを一定の値として示している。図１０に示すように、電流値Ｉが第１閾値Ｔ１を超えた時点をシグナルの開始点とし、開始点の後で初めて電流値Ｉが第２閾値Ｔ２を下回った時点をシグナルの終点とする。このようにしてシグナルを抽出し、当該部分の電流値Ｉを判定用シグナル電流値Ｉｓとし、所定の期間内のシグナルの出現回数をシグナル数Ｓとする。

電流値Ｉに含まれる判定用シグナル電流値Ｉｓには、ポリヌクレオチドがナノ電極３４間を通過した際に取得されるトンネル電流である真のシグナルと、ポリヌクレオチドの通過に起因しない擬似シグナルとが含まれる。

擬似シグナルの一因として、ナノ電極３４の先端の金原子の再構成が挙げられる。電流値データを取得する前に、ナノ電極３４の先端同士が接触しているために、ナノ電極３４同士の間隔を空けた際に、ナノ電極３４の先端の金原子が再構成によって移動する。これにより、ナノ電極３４間のトンネル電流が一時的に変化し、擬似シグナルとなる場合がある。なお、擬似シグナルの他の原因として、例えば、電極基板１の動きに起因してノイズが生じることや、試料中のコンタミネーション等が考えられる。

これらの擬似シグナルは安定した頻度で出現しないため、擬似シグナルが多く発生していると、判定用シグナル電流値Ｉｓの出現頻度は不安定となる。擬似シグナルは、時間の経過や、試料の流動の安定とともに減少する。判定用シグナル電流値Ｉｓに含まれる擬似シグナルが減少すると、判定用シグナル電流値Ｉｓは主に真のシグナルのみから構成されるようになる。その結果、判定用シグナル電流値Ｉｓの出現頻度が安定する。

ステップＳ１０６において、上記の２つのシグナル条件は、いずれも、判定用シグナル電流値Ｉｓの出現頻度が安定しているかを判断する指標となっている。このため、ステップＳ１０６において、これらの条件のうち少なくとも１つについて判断を行うことが好ましい。そうすれば、擬似シグナルの出現頻度の低い安定した条件下でその後の電流値データの取得を行うことができる。

さらに、本実施形態では、ステップＳ１０７においてステップＳ１０５およびステップＳ１０６の条件を全て満たした状態で所定の期間が経過したかと判断した後に、ステップＳ１０７における電流値データの取得を行う。このように、測定条件が安定した状態が所定の期間保たれていることを確認することにより、より安定した条件下で電流値データの取得を行うことができる。

なお、本実施形態では、ステップＳ１０５およびステップＳ１０６の判定は、０．５ｓｅｃ毎に行われる。しかしながら、これらの判定を行う間隔は、これに限られない。

＜３．変形例＞
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。

上記の実施形態では、電極基板の有する金属層が外部から電力が入力される接続用電極部を一対のみ有したが、本発明はこれに限られない。１つの電極基板が、外部から電力が入力される接続用電極部を複数対有していてもよい。例えば、電極基板は、上記の実施形態の接続用電極部に加えて、第１流路と第２流路との間に電気泳動用の電圧を印加するための接続用電極部を有していてもよい。

また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。

１ 電極基板
９ 電流計測装置
３４ ナノ電極
４３ ナノ電極
５０ 流路
５１ 第１流路
５２ 第２流路
５３ 計測流路
９０ 制御部

Claims (10)

1. 一対の電極間を流れるトンネル電流を測定することにより、生体高分子を識別する装置において、前記生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを取得する電流値データ取得方法であって、
   ａ）電極間距離を所定の目標距離に一致するようにフィードバック制御を行う工程と、
   ｂ）前記工程ａ）のフィードバックの安定条件を満たしているか否かを判定する工程と、
   ｃ）前記電極間の電流値に含まれるシグナルの出現頻度が所定の条件を満たしているか否かを判定する工程と、
   を含み、
   前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の双方において、各条件を満たした場合に、前記生体高分子のシグナル電流の取得を開始する、電流値データ取得方法。
2. 請求項１に記載の電流値データ取得方法であって、
   前記工程ｃ）における条件が、
   前記シグナルの出現頻度が所定の値以下であるという条件
   を含む、電流値データ取得方法。
3. 請求項１または請求項２に記載の電流値データ取得方法であって、
   前記工程ｃ）における条件が、
   前記シグナルの出現頻度の変動量が所定の範囲内であるという条件
   を含む、電流値データ取得方法。
4. 請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の電流値データ取得方法であって、
   前記工程ｂ）における条件が、
   前記電極間の電流値と、目標とするターゲット電流値との差分が所定の範囲内であるという条件
   を含む、電流値データ取得方法。
5. 請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の電流値データ取得方法であって、
   前記工程ｂ）における条件が、
   前記電極間の電流値の変動量が所定の範囲内であるという条件
   を含む、電流値データ取得方法。
6. 請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の電流値データ取得方法であって、
   前記工程ｂ）における条件が、
   前記電極間の電流値の移動平均と、目標とするターゲット電流値との差分が所定の範囲内であるという条件
   を含む、電流値データ取得方法。
7. 請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の電流値データ取得方法であって、
   前記工程ｂ）における条件が、
   前記電極間距離の操作量の変動量が所定の範囲内であるという条件
   を含む、電流値データ取得方法。
8. 請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の電流値データ取得方法であって、
   前記工程ｂ）における条件が、
   前記電極間の電流値の変位量が所定の範囲内であるという条件
   を含む、電流値データ取得方法。
9. 請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の電流値データ取得方法であって、
   前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の双方において各条件を満たした状態で、所定の時間が経過した後で、前記生体高分子のシグナル電流の取得を開始する、電流値データ取得方法。
10. 一対の電極間を流れるトンネル電流を測定して生体高分子のシグナル電流を含む電流値データを取得する電流計測装置であって、
    前記電極間の距離を変動させる電極間距離変更部と、
    前記電極間の電流値を計測する電流計と、
    各部を動作制御する制御部と、
    を有し、
    前記制御部は、
    ａ）電極間距離を所定の目標距離に一致するようにフィードバック制御を行う工程と、
    ｂ）前記工程ａ）のフィードバックの安定条件を満たしているか否かを判定する工程と、
    ｃ）前記電極間の電流値に含まれるシグナルの出現頻度が所定の条件を満たしているか否かを判定する工程と、
    を実行し、
    前記制御部は、前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の双方において、各条件を満たした場合に、前記生体高分子のシグナル電流の取得を開始する、電流計測装置。

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