WO2020195413A1 - 電流測定方法 - Google Patents

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WO2020195413A1
WO2020195413A1 PCT/JP2020/006901 JP2020006901W WO2020195413A1 WO 2020195413 A1 WO2020195413 A1 WO 2020195413A1 JP 2020006901 W JP2020006901 W JP 2020006901W WO 2020195413 A1 WO2020195413 A1 WO 2020195413A1
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WO
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current
electrodes
distance
value
measuring method
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Application number
PCT/JP2020/006901
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English (en)
French (fr)
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正輝 谷口
敬人 大城
真田　雅和
聡 宮城
Original Assignee
株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス
国立大学法人大阪大学
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Publication date
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Priority to US17/598,726 priority patent/US20220187244A1/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
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    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
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    • G01N27/49—Systems involving the determination of the current at a single specific value, or small range of values, of applied voltage for producing selective measurement of one or more particular ionic species
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores

Definitions

  • the present invention relates to a current measuring method for measuring a tunneling current of a biopolymer passing between a pair of electrodes.
  • Patent Document 1 describes a method for identifying a specific molecule using a fine electrode.
  • a single molecule constituting a biopolymer passing between electrodes is identified by measuring a tunnel current using an electrode pair having a short distance between electrodes.
  • Patent Document 1 does not consider such an effect on the electric current of molecules such as ions and dipoles contained in the liquid used for the liquid sample. Therefore, when a liquid containing an electrolyte is used as the liquid sample, it may cause an erroneous operation or an analysis error in the operation on the electrode or the analysis of the current value.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a current measuring method for more accurately measuring the tunneling current of a biopolymer contained in a liquid sample containing an electrolyte. ..
  • the first invention of the present application is a current measuring method for measuring a tunnel current of a biopolymer passing between a pair of electrodes, and a) the electrodes are arranged in a liquid containing an electrolyte.
  • the second invention of the present application is the current measuring method of the first invention.
  • B) The distance between the electrodes is fixed, and a predetermined voltage is applied from the state where the voltage between the electrodes is not applied.
  • a step of measuring the current flowing through the above step and a step of calculating the feature amount due to the electric double layer with respect to the current value measured in the step b) are included.
  • the third invention of the present application is the current measuring method of the second invention, in which the step b) and the step c) are performed before the step a), and the measurement timing in the step a) is the feature. Determined based on quantity.
  • the fourth invention of the present application is the current measuring method of the second invention, and the feature amount is a time constant of the current value measured in the step b).
  • the fifth invention of the present application is the current measuring method of the fourth invention, and a plurality of the time constants are calculated in the step c).
  • the sixth invention of the present application is the current measuring method of the fourth invention or the fifth invention, and the step b) and the step c) are performed before the step a), and the measurement timing in the step a). Is determined based on the time constant.
  • the seventh invention of the present application is the current measuring method of the fifth invention, and in the step a), an operation is performed so as to change the distance between the electrodes while applying a predetermined voltage between the electrodes.
  • the step a) is a step of waiting for a standby time calculated based on p1) the time constant and p2) a distance between the electrodes.
  • the step of acquiring the value of the operation amount used for changing the above and the current value between the electrodes, and p3) the step of changing the operation amount and changing the distance between the electrodes are repeated a plurality of times.
  • the eighth invention of the present application is the current measuring method of the seventh invention, and d) a step of calculating an approximate function that functionally approximates the relationship between the plurality of the manipulated variables and the plurality of the current values in the step a). Further have.
  • the ninth invention of the present application is the current measuring method of the seventh invention, and the waiting time in the step p1) is calculated by multiplying the time constant by a constant.
  • the tenth invention of the present application is the current measuring method of the fifth invention, in which, after the step b) and the step c), e) the distance between the electrodes where a tunnel current does not flow between the electrodes.
  • the step of measuring the value of the reference current flowing between the electrodes, f) the value of the tunnel current corresponding to the target distance between the electrodes, and the value of the reference current measured in e) are added to add up the target total. Further including a step of calculating the current value, the step e) and the step f) were performed before the step a), and the step a) was calculated based on q1) the time constant.
  • the process of manipulating the distance between the electrodes is repeated a plurality of times.
  • the eleventh invention of the present application is the current measuring method of the fifth invention, in which a tunnel current is generated between the electrodes g) after the step b) and the step c) and before the step a).
  • r2) a step of measuring the base current between the electrodes, and r3) a step of manipulating the distance between the electrodes in a direction in which the value of the base current approaches the intermediate target total current value calculated in the step h). Is repeated a plurality of times, and after the step a), i) an operation of a pre-calculated operation amount from the intermediate target electrode-to-electrode distance to the final target electrode-to-electrode distance is performed to match the final target.
  • the step of adjusting the distance between the electrodes is further included.
  • the current can be measured in consideration of the electric double layer.
  • the thickness direction of the electrode substrate is the vertical direction
  • the metal layer side is the upper side with respect to the substrate layer
  • the substrate layer side is the lower side with respect to the metal layer.
  • the orientation of the electrode substrate when used does not necessarily have to be vertically upward on the metal layer side.
  • FIG. 1 is a top view of the electrode substrate 1.
  • 2 to 4 are partial top views of the electrode substrate 1.
  • 5 and 6 are schematic views showing a state of pushing and bending of the electrode substrate 1 using the current measuring device 9.
  • 7 and 8 are schematic partial cross-sectional views showing a state of pushing and bending of the electrode substrate 1.
  • the electrode substrate 1 and the current measuring device 9 are composed of amino acids constituting proteins, which are biopolymers, nucleotides constituting nucleic acids (DNA, RNA), monosaccharides constituting sugar chains, and simple biopolymers. It is used to analyze the arrangement of molecules and each single molecule. Specifically, the biopolymer is passed between the nanoelectrodes 34 in a state where a voltage is applied between the nanoelectrodes 34 described later. Then, during this period, the tunnel current flowing between the nanoelectrode 34 and the biopolymer is detected, and the current is analyzed to analyze the single molecule constituting the biopolymer.
  • amino acids constituting proteins which are biopolymers, nucleotides constituting nucleic acids (DNA, RNA), monosaccharides constituting sugar chains, and simple biopolymers. It is used to analyze the arrangement of molecules and each single molecule. Specifically, the biopolymer is passed between the nanoelectrodes 34 in a state where a voltage
  • the electrode substrate 1 is a substantially rectangular plate-shaped substrate. As shown in FIGS. 1 to 4, 7 and 8, the electrode substrate 1 has a substrate layer 20 and a metal layer 30.
  • the longitudinal direction of the electrode substrate 1 is referred to as a first direction
  • the lateral direction of the electrode substrate 1 is referred to as a second direction.
  • the second direction is orthogonal to the first direction.
  • orthogonal includes "substantially orthogonal”.
  • the substrate layer 20 of this embodiment is formed of an insulating material.
  • the substrate layer 20 of the present embodiment has a two-layer structure in which a substrate layer formed of polyimide is superimposed on a substrate layer formed of silicon (Si).
  • the substrate layer 20 of the present embodiment has a two-layer structure, but the present invention is not limited to this.
  • the substrate layer 20 may be composed of only one layer formed of one kind of material, or may be composed of three or more layers. Further, the substrate layer 20 may be formed of a material other than silicon and polyimide, such as polyethylene terephthalate resin, ceramics, silicone rubber or alumina, as long as it is formed of an insulating material.
  • the metal layer 30 is located at the center of the two connecting electrode portions 31, the wiring portion 32 extending in the first direction between the two connecting electrode portions 31, and the wiring portion 32. It has an arranged measurement electrode unit 33.
  • the metal layer 30 is formed of, for example, a metal such as gold (Au), platinum (Pt), silver (Ag), copper (Cu), or tungsten (W), which are conductors.
  • the metal layer 30 may be formed by stacking a plurality of metal layers.
  • the structure may be such that the metal layer made of the metal such as gold, platinum, silver, and copper is superposed on the metal layer formed of chromium (Cr). Even in that case, it is preferable that the measurement electrode portion 33 is composed of only one metal layer.
  • the thickness of the metal layer 30 is, for example, 50 to 300 nm.
  • the uppermost surfaces of the substrate layer 20 and the metal layer 30 are covered with an insulating film (not shown).
  • an insulating film By covering the surface of the metal layer 30 with an insulating film, when the measurement electrode portion 33 is used in a liquid, the metal and the liquid constituting the metal layer 30 are formed in a portion of the metal layer 30 other than the measurement electrode portion 33. It is possible to suppress the exchange of electrons between them.
  • the insulating film is a TEOS oxide film, but it may be formed of another material as long as it is an insulating material. An insulating film is not formed on at least a part of the upper surface of the connecting electrode portion 31. Therefore, at least a part of the upper surface of the connection electrode portion 31 is exposed.
  • the two connecting electrode portions 31 are arranged apart from each other in the first direction.
  • the width of each of the two wiring portions 32 gradually decreases from each connection electrode portion 31 toward the measurement electrode portion 33.
  • a measurement electrode portion 33 having a width smaller in the second direction than the wiring portion 32 is arranged between the wiring portions 32 on both sides.
  • the measurement electrode portion 33 is composed of a pair of nanoelectrodes 34.
  • the pair of nanoelectrodes 34 are in a state where the tips of the nanoelectrodes 34 are in contact with each other when no load (external force) is applied to the electrode substrate 1.
  • the substrate layer 20 has a flow path 50 recessed downward from the upper surface.
  • the flow path 50 has a first flow path 51, a second flow path 52, and a measurement flow path 53.
  • the first flow path 51 and the second flow path 52 are arranged so as to face each other in the second direction with the measurement electrode portion 33 interposed therebetween.
  • the measurement flow path 53 is a groove extending in the second direction.
  • the measurement flow path 53 connects the first flow path 51 and the second flow path 52 in the second direction.
  • the first flow path 51 and the second flow path 52 are composed of a plurality of grooves connected in a grid pattern. With such a shape, when the first flow path 51 and the second flow path 52 are filled with a liquid containing a biopolymer, each biopolymer is easily arranged along the extending direction of these grooves. Therefore, clogging of the biopolymer at the boundary between the first flow path 51 and the second flow path 52 and the measurement flow path 53 is suppressed. As a result, the decrease in the fluidity of the liquid at the boundary is suppressed, and each biopolymer is arranged in the measurement flow path 53 along the extending direction of the measurement flow path 53.
  • Each groove of the first flow path 51 and the second flow path 52 has a width of about 1 ⁇ m and a depth of about 2 ⁇ m.
  • the measurement flow path 53 extends along the second direction.
  • the measurement flow path 53 is arranged at a position where it vertically overlaps with the tip of the nanoelectrode 34. As a result, biomolecules moving in the second direction in the measurement flow path 53 can easily pass between the nanoelectrodes 34.
  • the depth of the measurement flow path 53 is about 2 ⁇ m, similarly to the first flow path 51 and the second flow path 52.
  • the width of the measurement flow path 53 is narrow near the nanoelectrode 34.
  • FIGS. 5 and 6 are views showing a state of performing current measurement in the current measuring device 9.
  • FIG. 5 is a side view showing a state of the current measuring device 9 in which the electrode substrate 1 is set in an initial state.
  • FIG. 6 is a side view showing a state of the current measuring device 9 at the time of pushing and bending the electrode substrate 1. Note that FIG. 6 exaggerates the deformation of the electrode substrate 1.
  • the current measuring device 9 includes a mounting table 91, a fixture 92, a push-up tool 93, an elevating mechanism 94, a power supply 95, an ammeter 96, and a control unit 90.
  • a mounting table 91 a fixture 92, a push-up tool 93, an elevating mechanism 94, a power supply 95, an ammeter 96, and a control unit 90.
  • the mounting table 91 has a flat upper surface on which the electrode substrate 1 is mounted.
  • the fixture 92 of the present embodiment is four plate-shaped members arranged substantially perpendicular to the first direction. The fixture 92 presses and fixes the electrode substrate 1 from above and below at two locations in the first direction sandwiching the measurement electrode portion 33.
  • the push-up tool 93 is a columnar member having a hemispherical upper surface.
  • the push-up tool 93 is connected to the elevating mechanism 94.
  • the elevating mechanism 94 includes a motor 941 and a piezo actuator 942.
  • the motor 941 largely moves the push-up tool 93 up and down in millimeters.
  • the piezo actuator 942 moves the push-up tool 93 up and down in nanometer units.
  • the elevating mechanism 94 realizes both large movement and fine movement by combining the motor 941 and the piezo actuator 942.
  • the elevating mechanism 94 may be a mechanism using other power as long as it can control the push-up height.
  • the power supply 95 applies a voltage between the pair of connection electrode portions 31.
  • the ammeter 96 measures the current value of the current flowing between the nanoelectrodes 34 of the measuring electrode portion 33.
  • the control unit 90 is electrically connected to the elevating mechanism 94, the power supply 95, and the ammeter 96, and controls each unit.
  • the control unit 90 of the present embodiment is composed of a computer including an arithmetic processing unit such as a CPU, a memory such as a RAM, and a storage unit such as a hard disk drive.
  • the function of the control unit 90 is realized by operating the arithmetic processing unit based on the computer program stored in the storage unit.
  • the electrode substrate 1 When setting the electrode substrate 1 on the current measuring device 9, first, the electrode substrate 1 is placed on the mounting table 91. After that, the electrode substrate 1 is fixed by four fixtures 92 from above and below in a state where no load is applied to the vicinity of the measurement electrode portion 33 of the electrode substrate 1. At this time, the electrode substrate 1 is arranged so that the push-up tool 93 is located directly below the measurement electrode portion 33.
  • a predetermined voltage is applied between the connection electrode portions 31 by the power supply 95, and the measurement of the current value by the ammeter 96 is started. Then, the elevating mechanism 94 is driven to push up the push-up tool 93, and the distance between the tips of the nanoelectrodes 34 (distance between electrodes) is adjusted.
  • FIG. 7 is a partial cross-sectional view of the electrode substrate 1 at the initial position.
  • FIG. 8 is a partial cross-sectional view of the electrode substrate 1 when pushed up. As shown in FIGS. 4 and 7, when the electrode substrate 1 is not pressed and bent, the tips of the nanoelectrodes 34 are in contact with each other. As shown in FIG. 8, when the push-up tool 93 is pushed up, the vicinity of the measurement electrode portion 33 of the electrode substrate 1 is pushed up from the lower surface side. Then, the side walls of the substrate layer 20 constituting the measurement flow path 53 move in directions away from each other as shown by the solid line arrows in FIG.
  • the nanoelectrodes 34 move in the direction away from each other as shown by the broken line arrows in FIG. As a result, the distance between the electrodes is increased. In this way, the distance between the electrodes is adjusted by pushing up the electrode substrate 1 with the push-up tool 93.
  • FIG. 9 is a flowchart showing the flow of the tunnel current measurement process of the biopolymer in a liquid sample in which the biopolymer floats in a liquid containing an electrolyte.
  • the biopolymer contained in the liquid sample is a nucleotide.
  • the liquid containing an electrolyte contained in the liquid sample is a liquid such as an aqueous NaCl solution in which the solute is dissolved in a highly polar solvent such as water.
  • step the characteristic amount of the influence of molecules such as ions and dipoles / organic dipoles in a liquid sample on the measurement current is analyzed (step). S100).
  • the behavior of the current flowing between the nanoelectrodes 34 when a voltage is applied between the nanoelectrodes 34 in a state where the nanoelectrodes 34 are arranged in a liquid containing an electrolyte will be described.
  • FIG. 10 is a diagram schematically showing the behavior of the current flowing between the nanoelectrodes 34 when a predetermined voltage is applied between the nanoelectrodes 34 arranged in the liquid containing the electrolyte.
  • FIG. 11 is a diagram showing experimental data of initial current values when a voltage is applied between nanoelectrodes 34 arranged in a NaCl aqueous solution for a plurality of concentrations of NaCl solution.
  • the current flowing between the nanoelectrodes 34 includes a base current Ib which is a current value between the nanoelectrodes 34 in a steady state and a transient current caused by the electrolyte contained in the liquid sample.
  • the base current Ib includes a reference current Ic due to the leakage current, the device configuration of the current measuring device 9, and the environment, and a tunnel current It1 flowing between the nanoelectrodes 34. Further, the maximum value of the transient current is Io.
  • the above reference current Ic and the tunnel current It2 between the nanoelectrodes 34 flow between the nanoelectrodes 34.
  • a current as shown by the alternate long and short dash line in FIG. 10 flows between the nanoelectrodes 34.
  • the nanoelectrode 34 when the nanoelectrode 34 is arranged in a liquid containing an electrolyte, when a voltage is applied between the nanoelectrodes 34, a reference current Ic and a tunnel current It1 flow between the nanoelectrodes 34, and between the nanoelectrodes 34. In, movements and movements of ions in the liquid and molecules such as dipoles and organic dipoles occur. Due to the movement and movement of the ions and molecules, the current value between the nanoelectrodes 34 temporarily increases. This temporary increase in current value is the transient current.
  • the tunnel current It1 in the liquid containing the electrolyte is ⁇ It larger than the tunnel current It2 in the vacuum by the increase in the tunnel current due to the electric double layer.
  • FIG. 11 shows the behavior of the initial current value when a voltage is applied between the nanoelectrodes 34 for NaCl aqueous solutions having NaCl concentrations of 1 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM and 50 mM.
  • the NaCl concentration is 10 mM or more, the transient phenomenon of the current value appears remarkably.
  • the concentration of NaCl which is an electrolyte, increases, the number of ions and molecules constituting the solvent / solute involved in the formation of the electric double layer increases, so that the current value after the transient phenomenon has settled increases.
  • step S100 the feature amount analysis process of step S100 for each liquid sample to be measured. The specific flow of step S100 will be described later.
  • step S200 the calibration process (calibration) of the nanoelectrode 34 is subsequently performed (step S200).
  • the voltage Vp applied to the piezo actuator 942 which is an operation amount for varying the inter-electrode distance d of the nanoelectrodes 34, and the current value I between the nanoelectrodes 34 detected by the ammeter 96 Analyze the relationship.
  • the applied voltage Vp which is the amount of operation for the pair of nanoelectrodes 34, and the distance d between the electrodes is estimated.
  • the specific flow of step S200 will be described later.
  • step S300 the inter-electrode distance d of the nanoelectrode 34 is set to a desired distance.
  • step S200 The specific flow of step S200 will be described later.
  • the control unit 90 may perform feedback control so that the distance d between the electrodes is within a desired range.
  • the acquired current data is analyzed (step S500).
  • the single molecules that make up biopolymers have unique tunneling current values depending on the type. Therefore, the arrangement of a single molecule in the biopolymer can be estimated by analyzing the current data of the tunnel current of the biopolymer that floats in the liquid sample and passes between the nanoelectrodes 34.
  • FIG. 12 is a flowchart showing the flow of the feature amount analysis process.
  • the nanoelectrode 34 is placed in the liquid sample, and the nanoelectrode 34 is placed so that the distance d between the electrodes is larger than 0 (step S110).
  • a voltage is applied between the nanoelectrodes 34 and flows between the nanoelectrodes 34. It may be confirmed that the current value I of the current is smaller than the predetermined voltage value. In that case, after confirming the current value I, the application of the voltage to the nanoelectrode 34 is stopped, and the process waits for a while.
  • step S120 the current value I between the nanoelectrodes 34 is measured for a predetermined period from the start of voltage application (step S120).
  • the current value I obtained at this time has a transient response as shown in FIG.
  • the biopolymer may pass between the nanoelectrodes 34.
  • the obtained current value I sometimes includes a signal that appears when the biopolymer passes between the nanoelectrodes 34.
  • the obtained current data is analyzed and the time constant, which is a feature amount, is calculated (step S130).
  • the calculated time constant is until the transient phenomenon generated based on the change in the applied voltage between the nanoelectrodes 34 and the distance d between the electrodes converges and the amount of change caused by the transient phenomenon decreases to about 36.2%. Represents time.
  • the feature amount calculated in the present invention is not limited to the time constant. Other parameters may be calculated as features as long as they are parameters that represent the convergence state of the transient phenomenon.
  • the transient phenomenon of the current value I between the nanoelectrodes 34 as shown in FIG. 10 is described below by using the base current Ib, which is the current value between the nanoelectrodes 34 in the steady state, and the maximum value Io of the transient current component. It can be expressed as the formula (1).
  • the base current Ib is a superposition of the above-mentioned reference current Ic and the tunnel current value flowing between the nanoelectrodes 34 via the liquid containing the electrolyte contained in the liquid sample.
  • the second term on the right side of the equation (1) is the transient current component.
  • ⁇ is the time constant of the transient current component. Since the current value I between the nanoelectrodes 34 can be approximated by such a mathematical formula (1), the time constant ⁇ of the transient phenomenon is calculated by approximating the current data obtained in step S110 with the mathematical formula (1). It is possible.
  • the time constant ⁇ is used as a feature quantity of the transient phenomenon in the subsequent calibration process, the distance setting process between electrodes, and the current measurement process. In each of the subsequent processes, by performing the process using the time constant ⁇ in consideration of the transient phenomenon, it is possible to suppress errors in the operation content, acquired data, analysis content, etc. caused by the transient phenomenon in each process.
  • the current value I between the nanoelectrodes 34 is approximated as in the following mathematical formula (2), assuming that five types of transient current components are superimposed.
  • the five time constants ⁇ 1 to ⁇ 5 are set to ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4, ⁇ 5 in order from the one with the smallest value of the time constant.
  • the number of time constants to be calculated is 5, but the present invention is not limited to this.
  • the number of time constants to be calculated may be 1 to 4, or 6 or more.
  • a plurality of transient current components are superimposed on the current value I between the nanoelectrodes 34. Therefore, in order to more accurately eliminate the influence of the plurality of transient current components appearing in the current value I, it is preferable to consider three or more transient current components.
  • the number of time constants to be calculated is preferably 3 to 6.
  • FIG. 13 is a flowchart showing the flow of the calibration process of the nanoelectrode 34.
  • the amount of pushing up of the electrode substrate 1 by the pusher 93 is changed to change the distance d between the electrodes, and the current value I of the current flowing between the nanoelectrodes 34 during that time is measured. Then, the relationship between the operation amount and the distance d between the electrodes is estimated from the relationship between the operation amount of the push-up tool 93 and the current value I.
  • the electrode substrate 1 is repeatedly pushed up and pulled back by the push-up tool 93 to change the distance d between the electrodes of the nanoelectrodes 34, and the value of the tunnel current flowing between the nanoelectrodes 34 between them is acquired. To do.
  • the electrode substrate 1 is placed on the current measuring device 9 and set at the initial position (step S210).
  • control unit 90 measures the reference current Ic (step S230). Specifically, the push-up tool 93 is pushed up, and the current value of the current flowing between the nanoelectrodes 34 is measured while maintaining a sufficiently large distance d between the electrodes so that the tunnel current does not flow between the nanoelectrodes 34. This makes it possible to measure the leak current and the reference current Ic caused by the device configuration of the current measuring device 9 and the environment.
  • the control unit 90 determines the reference current Ic after the predetermined initial standby time t0 elapses after the distance between the nanoelectrodes 34 reaches the distance at which the reference current Ic can be measured. Make a measurement.
  • the initial waiting time t0 is calculated based on the time constant ⁇ 5 having the largest value among the five time constants ⁇ 1 to ⁇ 5 calculated in the feature quantity analysis process in step S100.
  • the initial waiting time t0 is calculated, for example, by multiplying the time constant ⁇ 5 by a predetermined real number.
  • the measurement timing for measuring the reference current Ic is determined based on the time constant ⁇ 5, which is a feature quantity.
  • the control unit 90 pulls down the push-up tool 93 to a predetermined position.
  • control unit 90 After the push-up tool 93 is pulled down to a predetermined position, the control unit 90 performs a push-up step of the electrode substrate 1 by the push-up tool 93 (step S240). That is, the control unit 90 operates in the direction in which the distance d between the electrodes of the nanoelectrode 34 increases.
  • the position of the push-up tool 93 at the start of the push-up process is a position where the tips of the nanoelectrodes 34 come into contact with each other as long as the current value measured by the ammeter 96 is larger than the first threshold value described later.
  • the tips of the nanoelectrodes 34 may be separated from each other.
  • the pushing-up and lowering of the pushing tool 93 is performed by increasing or decreasing the voltage Vp applied to the piezo actuator 942. Therefore, the amount of operation for pushing up and down is the voltage value of the voltage Vp applied to the piezo actuator 942.
  • the voltage value of the applied voltage Vp becomes large
  • the amount of pushing up by the pushing tool 93 becomes large
  • the distance d between the electrodes becomes large.
  • the voltage value of the applied voltage Vp becomes small
  • the amount of pushing up by the pushing tool 93 becomes small, and the distance d between the electrodes becomes small.
  • step S240 The pushing-up step of step S240 is performed until the current value measured by the ammeter 96 becomes equal to or less than a predetermined first threshold value.
  • FIG. 14 is a flowchart showing a specific flow of the push-up process in step S240.
  • step S240 the control unit 90 first waits for a predetermined waiting time (step S241). As a result, it waits for the influence of the transient phenomenon due to the change in the inter-electrode distance d performed immediately before the standby step of step S241 to be sufficiently reduced. As a result, it is possible to prevent an error due to a transient phenomenon from occurring in the measured current value during the current measurement in step S242 thereafter.
  • the standby time in the first step S241 is, for example, the same initial standby time t0 as when measuring the reference current Ic in step S230.
  • the waiting time in the second and subsequent steps S241 is a predetermined first waiting time t1.
  • the first waiting time t1 is calculated based on the time constant ⁇ 1 having the smallest value among the five time constants ⁇ 1 to ⁇ 5 calculated in the feature amount analysis process in step S100.
  • the first waiting time t1 is calculated by multiplying the time constant ⁇ 1 by a predetermined real number, for example.
  • the first waiting time t1 may be calculated based on other time constants ⁇ 2 to ⁇ 5.
  • the waiting time in the first step S241 is preferably longer than the waiting time in the second step S241. This is because the amount of change in the inter-electrode distance d before the start of the first step S241 is larger than the amount of change in the inter-electrode distance d before the start of the second and subsequent steps S241.
  • the standby time in the first step S241 is not limited to the same initial standby time t0 as when measuring the reference current Ic in step S230, and may be the first standby time t1 or more, which is the standby time in the second step S241.
  • the waiting time calculated by another method may be used.
  • control unit 90 stores the voltage value of the voltage Vp applied to the piezo actuator 942 at that time and the current value measured by the ammeter 96 (step S242). That is, the control unit 90 acquires the value of the operation amount used for changing the distance d between the electrodes and the current value of the nanoelectrode 34.
  • control unit 90 increases the applied voltage Vp by a predetermined amount and increases the distance d between the electrodes (step S243). That is, the control unit 90 changes the inter-electrode distance d by changing the operation amount used for changing the inter-electrode distance d.
  • the control unit 90 determines whether or not the current value measured by the ammeter 96 is equal to or less than a predetermined first threshold value (step S244).
  • a predetermined first threshold value step S244: No
  • the control unit 90 returns to step S241 to perform standby, measure the current value, and increase the distance d between the electrodes. repeat.
  • the control unit 90 ends the push-up step of step S240.
  • step S50 the control unit 90 subsequently performs a pull-down step of the push-up tool 93 (step S50). That is, the control unit 90 operates in the direction in which the distance d between the electrodes of the nanoelectrode 34 becomes smaller.
  • step S250 The lowering step of step S250 is performed until the current value measured by the ammeter 96 becomes equal to or higher than a predetermined second threshold value.
  • FIG. 15 is a flowchart showing a specific flow of the lowering step of step S250.
  • step S250 the control unit 90 first waits for a predetermined first standby time t1 (step S251).
  • This first waiting time t1 is the same as the waiting time in the second and subsequent steps S241.
  • control unit 90 stores the voltage value of the voltage Vp applied to the piezo actuator 942 at that time and the current value measured by the current meter 96 (step S252). That is, the control unit 90 acquires the value of the operation amount used for changing the distance d between the electrodes and the current value I between the nanoelectrodes 34.
  • control unit 90 reduces the applied voltage Vp by a predetermined amount and reduces the distance d between the electrodes (step S253). That is, the control unit 90 changes the inter-electrode distance d by changing the operation amount used for changing the inter-electrode distance d.
  • the control unit 90 determines whether or not the current value measured by the current meter 96 is equal to or higher than a predetermined second threshold value (step S254).
  • a predetermined second threshold value step S254: No
  • the control unit 90 returns to step S251 to perform standby, measure the current value, and reduce the distance d between the electrodes. repeat.
  • the control unit 90 ends the lowering step of step S250.
  • step S260 determines whether or not the count number n has reached the predetermined number of repetitions N (step S260).
  • the control unit 90 proceeds to step S270 and increments the count number n. After that, the process returns to step S240, and the pushing-up step and the pull-down step of the push-up tool 93 are executed again.
  • step S280 determines whether or not the count number n has reached the number of repetitions N (step S260: Yes).
  • step S240 and the pulling-down step of step S250 an operation is performed so as to change the distance d between the electrodes while applying a predetermined voltage between the nanoelectrodes 34, and between the nanoelectrodes 34. Acquire the current value I.
  • step S250 by repeating the pushing-up step of step S240 and the pulling-down step of step S250 a plurality of times, the approximation function described later can be obtained more accurately.
  • FIG. 16 is a diagram showing an outline of changes over time in the voltage Vp applied to the piezo actuator 942 and the current value between the nanoelectrodes 34 in the calibration process of the nanoelectrodes 34.
  • the first stage is the voltage Vp applied to the piezo actuator 942
  • the second stage is the distance between the electrodes of the nanoelectrodes 34 d
  • the third stage is the time lapse of the current value I between the nanoelectrodes 34 detected by the current meter 96.
  • the change is shown on the proportional axis
  • the fourth stage shows the change over time of the current value between the nanoelectrodes 34 detected by the current meter 96 on the logarithmic axis. Note that FIG. 16 omits the waiting steps in steps S241 and S251 in order to make it easier to understand the relationship between the values.
  • the first threshold value is 0.01 nA and the second threshold value is 2.00 nA.
  • the first threshold value is set to a value larger than the reference current Ic.
  • the second threshold value is set to a value larger than the first threshold value and smaller than the current value flowing when the nanoelectrodes 34 come into contact with each other.
  • the operation amount for pushing up or lowering the push-up tool 93 is the voltage Vp applied to the piezo actuator 942.
  • the applied voltage Vp and the pushing amount are substantially proportional.
  • the pushing amount and the distance d between the electrodes are substantially proportional. Therefore, the amount of change in the voltage value of the applied voltage Vp is substantially proportional to the amount of change in the distance d between the electrodes.
  • the relationship between the distance between the electrodes d and the applied voltage Vp is expressed by the following mathematical formula (3), where ⁇ is the proportional coefficient.
  • step S240 as shown in FIG. 16, the applied voltage Vp is gradually increased. Specifically, each time step S243 is executed, the applied voltage Vp is increased by a predetermined amount. Therefore, the distance d between the electrodes also increases as the applied voltage Vp increases. Further, as shown in FIG. 16, in step S250, the applied voltage Vp is gradually reduced. Specifically, each time step S253 is executed, the applied voltage Vp is reduced by a predetermined amount. Therefore, in step S250, the distance d between the electrodes decreases at a substantially constant rate.
  • the distance d between the electrodes and the tunnel current It flowing between the electrodes have a relationship as shown in the following formula (4).
  • K is a constant.
  • ⁇ is a known constant.
  • the current value I measured by the ammeter 96 is the sum of the reference current Ic and the tunnel current It, the current value I is represented by the following mathematical formula (5).
  • step S240 when the push-up tool 93 is gradually pushed up in step S240, the current value I becomes exponentially smaller. Then, in step S250, when the push-up tool 93 is gradually pulled back, the current value I becomes exponentially large.
  • control unit 90 approximates the relationship between the amount of operation on the push-up tool 93 in steps S240 and step S250 repeated N times and the current value I measured by the ammeter 96. Is calculated (step S280).
  • FIG. 17 is a diagram showing an example of measurement data of the applied voltage Vp and the current value I in the calibration process.
  • FIG. 18 is a diagram showing an approximate function of the measurement data of the example of FIG.
  • the horizontal axis is a real number axis and the vertical axis is a logarithmic axis.
  • the black data points indicate the measurement data in the pushing step (step S240)
  • the white data points indicate the measurement data in the pulling step (step S250).
  • the applied voltage Vp and the measured current value I are stored at predetermined time intervals (for example, 50 msec).
  • step S280 using this relationship, an approximate expression such as the following mathematical expression (6) is calculated, and the constants A, B, and C are calculated.
  • the proportional coefficient ⁇ between the distance d between the electrodes and the applied voltage Vp can be obtained as shown in the following equation (10).
  • This proportional coefficient ⁇ is an eigenvalue obtained for each electrode substrate 1.
  • an estimation function that estimates the relationship between the applied voltage Vp, which is an operation amount, and the distance d between the electrodes is calculated (step S290).
  • the current measurement process described later is performed using the proportional coefficient ⁇ and the estimation function.
  • step S200 the relationship between the operation amount (applied voltage Vp) for the pair of nanoelectrodes 34 and the inter-electrode current value (current value I) is obtained.
  • the above calibration process is performed in the liquid sample itself to be measured or in a liquid containing an electrolyte which is a liquid component of the liquid sample. Therefore, the standby steps of steps S241 and S251 are executed in consideration of the transient phenomenon of the electric double layer and the like. Thereby, the error of the current value due to the transient phenomenon can be suppressed.
  • the approximation function of the measurement data in the pushing step of step S240 and the approximation function of the measurement data in the lowering step of step S250 are calculated separately.
  • the estimation function calculation step of step S290 the estimation function when the push-up tool 93 is pushed up and the estimation function when the push-up tool 93 is lowered are calculated separately.
  • Hysteresis also appears in the relationship between the applied voltage Vp and the current value I in the pushing-up process and the lowering process due to the hysteresis of the applied voltage Vp and the movement amount of the piezo actuator 942. Therefore, it is preferable to separately calculate the approximate function and the estimation function in the push-up process and the approximate function and the estimate function in the lowering process as in the present embodiment.
  • FIG. 19 is a flowchart showing the flow of the distance setting process between electrodes in step S300.
  • FIG. 20 is a flowchart showing the flow of the electrode-to-electrode distance adjusting process in the small gap mode.
  • FIG. 21 is a flowchart showing the flow of the electrode-to-electrode distance adjusting process in the large gap mode.
  • the target electrode-to-electrode distance which is the target inter-electrode distance
  • the control unit 90 is input to the outside (step S310).
  • the distance between the target electrodes may be input in advance.
  • control unit 90 determines whether or not the distance between the target electrodes input in step S310 is equal to or less than a predetermined threshold value (step S320).
  • This threshold value is set so that the tunnel current value between the nanoelectrodes 34 when the distance between the electrodes becomes the threshold value is larger than the noise component included in the base current Ib.
  • step S320 it may be determined whether or not the target tunnel current value Iu corresponding to the target desired distance between electrodes is equal to or greater than a predetermined threshold value.
  • the target tunnel current value Iu is calculated using, for example, the above-mentioned equation (4).
  • step S320 If it is determined in step S320 that the distance between the target electrodes is equal to or less than the threshold value (step S320: Yes), the control unit 90 proceeds to the step of adjusting the distance between the electrodes in the small gap mode of step S330. On the other hand, if it is determined that the distance between the target electrodes is larger than the threshold value (step S320: No), the control unit 90 proceeds to the step of adjusting the distance between the electrodes in the large gap mode of step S340. In step S330 and step S340, a predetermined voltage is continuously applied to the nanoelectrode 34, and the current between the nanoelectrodes 34 is measured.
  • the reference current Ic is measured with the distance between the electrodes sufficiently large so that the tunnel current does not flow between the nanoelectrodes 34 (step S331).
  • the push-up tool 93 is returned to a position where the tips of the nanoelectrodes 34 come into contact with each other.
  • the reference current Ic is measured by extracting the base current Ib from the current value I measured by the ammeter 96 in step S331.
  • FIG. 22 is a diagram showing an example of the time-dependent change of the measured current value I. As shown in FIG. 22, when the current value I is measured in a liquid containing a biopolymer, the current value I is the base current Ib measured when the biopolymer is not present between the nanoelectrodes 34. And the component of the sample current Is measured when the biopolymer passes between the nanoelectrodes 34. The sample current Is is a tunnel current flowing between the biopolymer and the nanoelectrode 34.
  • the sample current Is has a current value larger than the base current Ib. Therefore, the measured current value I can be separated into a component of the base current Ib and a component of the sample current Is. Since the sample current Is in step S331 is not a measured value at the desired distance between the electrodes, it cannot be used as experimental data.
  • step S331 the control unit 90 extracts a base current Ib component from the measured current value I, and a reference current which is a current value of the base current Ib in a state where no tunnel current flows between the nanoelectrodes 34 from the component. Calculate Ic.
  • the control unit 90 calculates the target total current value Ia (step S332).
  • the target total current value Ia is the value of the tunnel current between the nanoelectrodes 34, which corresponds to the target distance d between the electrodes.
  • the target tunnel current value Iu is calculated by substituting the target inter-electrode distance d into the inter-electrode distance d in the equation (4).
  • the target tunnel current value Iu is the value of the tunnel current corresponding to the target inter-electrode distance d.
  • the target tunnel current value Iu is added to the reference current Ic to calculate the target total current value Ia.
  • control unit 90 operates the push-up tool 93 to arrange the nanoelectrode 34 at a target position where the base current Ib of the measured current value I matches the target total current value Ia, in steps S333 to S335. I do.
  • control unit 90 operates the push-up tool 93 so that the current base current Ib approaches the target total current value Ia, and changes the distance d between the electrodes (step S333).
  • the upper limit of the amount of change in the voltage Vp applied to the piezo actuator 942, which can be changed in one step S333, is determined. Therefore, the maximum amount of change in the distance d between electrodes in one step S333 is determined.
  • control unit 90 waits for a predetermined second standby time t2 (step S334).
  • the influence of the transient phenomenon accompanying the change of the distance d between the electrodes in step S333 is waited to be sufficiently reduced.
  • the second waiting time t2 which is the waiting time in step S334, is the smallest time constant ⁇ 1, the second smallest time constant ⁇ 2, and the second smallest time constant ⁇ 2 among the five time constants ⁇ 1 to ⁇ 5 calculated by the feature quantity analysis process in step S100. It is calculated based on the third smallest time constant ⁇ 3.
  • the second waiting time t2 is calculated, for example, by multiplying the average value of the time constant ⁇ 1, the time constant ⁇ 2, and the time constant ⁇ 3 by a predetermined real number.
  • control unit 90 causes the ammeter 96 to measure the current value I (step S335).
  • the control unit 90 determines whether or not the base current Ib of the current value I measured in step S335 is included in the predetermined current value range (step S336).
  • the predetermined range in which the determination is made in step S336 is set with reference to the target total current value Ia. For example, it is based on whether or not the base current Ib is within the range of ⁇ 0.0005 nA from the target total current value Ia.
  • step S336 If it is determined in step S336 that the base current Ib has not reached the predetermined range (step S336: No), the control unit 90 returns to step S333 and continuously adjusts the distance d between the electrodes.
  • step S336 determines whether the base current Ib has reached a predetermined range. If it is determined in step S336 that the base current Ib has reached a predetermined range (step S336: Yes), the control unit 90 completes the inter-electrode adjustment process in step S300.
  • the flow of the inter-electrode distance adjusting step in the large gap mode of step S340 will be described.
  • the value of the tunnel current at the distance between the electrodes is relatively small. If the value of the tunnel current is smaller than the noise component of the reference current Ic, the difference between the reference current Ic and the target total current value Ia becomes difficult to understand. Therefore, even if an attempt is made to set the electrode position by the same method as in the small gap mode, it is difficult to accurately set the electrode position at a desired distance between the electrodes. Therefore, by setting the electrode position in the large gap mode described below, the electrode position is set so as to obtain a desired distance between the electrodes.
  • FIG. 23 is a schematic view showing the state between the nanoelectrodes 34 in the step of adjusting the distance between the electrodes in the large gap mode in step S340.
  • the reference current Ic is measured with the distance between the electrodes sufficiently large so that the tunnel current does not flow between the nanoelectrodes 34 (step S341).
  • the push-up tool 93 is returned to a position where the tips of the nanoelectrodes 34 come into contact with each other.
  • the reference current Ic is measured in the same manner as in step S331 of the small gap mode.
  • the control unit 90 calculates the intermediate target total current value Id and the movement operation amount ⁇ Vp (step S342). Specifically, first, the intermediate tunnel current value Iv is calculated.
  • the intermediate tunnel current value Iv is a tunnel current value corresponding to the distance d1 between the intermediate electrodes set as the intermediate target position.
  • the distance between the intermediate electrodes d1 as the intermediate target position is a distance between the electrodes smaller than the distance d2 between the target electrodes as the final target position.
  • the intermediate tunnel current value Iv is calculated by substituting the intermediate electrode distance d1 for the inter-electrode distance d in the equation (4).
  • the intermediate tunnel current value Iv and the reference current Ic measured in step S341 are added to calculate the intermediate target total current value Id.
  • the distance d1 between the intermediate electrodes is set so that the intermediate tunnel current value Iv becomes a current value sufficiently larger than the noise component of the reference current Ic.
  • the movement operation amount ⁇ Vp is an operation amount required to move from the intermediate electrode distance d1 which is the intermediate target position to the target electrode distance d2 which is the final target position.
  • the movement operation amount ⁇ Vp is the amount of change in the voltage Vp applied to the piezo actuator 942 for moving from the intermediate electrode distance d1 to the target electrode distance d2.
  • This movement operation amount ⁇ Vp is obtained based on the estimation function obtained by the calibration process in steps S101 to S111. That is, it is obtained from the relationship of the following mathematical formula (11) by using the mathematical formula (3) and the proportional coefficient ⁇ between the inter-electrode distance d and the applied voltage Vp obtained in the calibration process.
  • control unit 90 operates the push-up tool 93 to arrange the nanoelectrode 34 at the intermediate target position where the base current Ib of the measured current value I matches the intermediate target total current value Id.
  • the distance d between the electrodes between the nanoelectrodes 34 can be set to the distance d1 between the intermediate electrodes.
  • control unit 90 operates the push-up tool 93 so that the current base current Ib approaches the intermediate target total current value Id, and changes the distance d between the electrodes (step S343).
  • Step S343 is performed in the same manner as step S243 in the small gap mode.
  • the control unit 90 waits for a predetermined second standby time t2 (step S344).
  • a predetermined second standby time t2 the influence of the transient phenomenon accompanying the change of the distance d between the electrodes in step S333 is waited to be sufficiently reduced.
  • the standby time in step S343 is, for example, a second standby time t2 which is the same as the standby time in step S333 in the small gap mode.
  • control unit 90 causes the current meter 96 to measure the current value I (step S345).
  • the control unit 90 determines whether or not the base current Ib of the current value I measured in step S345 is included in the predetermined current value range (step S346).
  • the predetermined range in which the determination is made in step S336 is set with reference to the intermediate target total current value Id. For example, it is based on whether or not the base current Ib is within the range of ⁇ 0.0005 nA from the intermediate target total current value Id.
  • step S346 If it is determined in step S346 that the base current Ib has not reached the predetermined range (step S346: No), the control unit 90 returns to step S343 and continues to adjust the distance d between the electrodes.
  • step S346 determines whether the base current Ib has reached a predetermined range. If it is determined in step S346 that the base current Ib has reached a predetermined range (step S346: Yes), the control unit 90 proceeds to step S347. Then, the electrode substrate is pushed up by the push-up tool 93 by the amount of the movement operation amount ⁇ Vp calculated in step S342 (step S347). Specifically, the control unit 90 changes the applied voltage Vp to a voltage value obtained by adding the movement operation amount ⁇ Vp to the applied voltage Vp at the distance d1 between the intermediate electrodes. As a result, the control unit 90 sets the distance d between the nanoelectrodes 34 to the distance d2 between the target electrodes at the final target position.
  • control unit 90 waits for a predetermined third standby time t3 (step S348). As a result, it waits for the influence of the transient phenomenon accompanying the change in the distance d between the electrodes in step S347 to become sufficiently small. As a result, it is possible to prevent an error due to a transient phenomenon from occurring in the measured current value during the tunnel current measurement process of the biopolymer in the subsequent step S400.
  • the control unit 90 completes the inter-electrode adjustment process in step S300.
  • the third waiting time t3, which is the waiting time in step S348, is the smallest time constant ⁇ 1 and the second smallest time constant ⁇ 2 among the five time constants ⁇ 1 to ⁇ 5 calculated in the feature analysis process of step S100. It is calculated based on.
  • the third waiting time t3 is calculated by multiplying, for example, the time constant ⁇ 1 and the average value by a predetermined real number.
  • the metal layer of the electrode substrate has only a pair of connection electrodes to which electric power is input from the outside, but the present invention is not limited to this.
  • One electrode substrate may have a plurality of pairs of electrodes to which electric power is input from the outside.
  • a voltage for electrophoresis may be applied between the first flow path and the second flow path.
  • Electrode substrate 9 Current measuring device 34 Nano electrode 50 Flow path 90 Control unit 93 Push-up tool 94 Lifting mechanism 95 Power supply 96 Current meter 942 Piezo actuator

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Abstract

この電流測定方法は、一対の電極間を通過する生体高分子のトンネル電流を測定する電流測定方法であって、電解質を含む液体中に前記電極を配置し、前記電極間に電圧を印加しつつ、前記電極の表面に形成される電気二重層を介して前記電極間を流れる電流を測定する工程を含む。これにより、電気二重層を考慮して電流を測定することができる。その結果、電解質を含む液体試料に含まれる生体高分子のトンネル電流を、より正確に測定することができる。

Description

電流測定方法
　本発明は、一対の電極間を通過する生体高分子のトンネル電流を測定する電流測定方法に関する。
　従来、微細な先端部を有する電極を用いて、特定の分子や原子を測定または識別する方法が知られている。微細な電極を用いて特定の分子を識別する方法については、例えば、特許文献１に記載されている。特許文献１に記載の単分子識別方法では、電極間距離の短い電極対を用いて、電極間を通過する生体高分子を構成する単分子を、トンネル電流を測定することにより識別する。
国際公開２０１１／１０８５４０号
　特許文献１に記載のように、生体高分子の識別を目的として電極間のトンネル電流を測定するためには、電極間の距離を精度良く調整する必要がある。このとき、一対の電極が生体高分子を含む液体試料中に配置される。
　生体高分子を遊動させるための液体が電解質を含む場合、電極間に電圧を印加すると、液体内のイオンの移動および溶媒・溶質が構成する双極子の配置などによって電極表面付近に形成される電気二重層が、電極間電流の挙動に影響を与える。しかしながら、特許文献１では、液体試料に用いられる液体に含まれるイオンや双極子等の分子が電流に与えるこのような影響については考慮されていない。このため、液体試料に電解質を含む液体を使用した場合に、電極への操作や電流値の解析において誤操作や解析誤差の原因となり得る。
　本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、電解質を含む液体試料に含まれる生体高分子のトンネル電流を、より正確に測定するための電流測定方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本願の第１発明は、一対の電極間を通過する生体高分子のトンネル電流を測定する電流測定方法であって、ａ）電解質を含む液体中に前記電極を配置し、前記電極間に電圧を印加しつつ、前記電極の表面に形成される電気二重層を介して前記電極間を流れる電流を測定する工程を含む。
　本願の第２発明は、第１発明の電流測定方法であって、ｂ）前記電極間の距離を固定したまま、電極間電圧をかけていない状態から所定の電圧印加を行いつつ、前記電極間を流れる電流を測定する工程と、ｃ）前記工程ｂ）において測定した電流値について、前記電気二重層に起因する特徴量を算出する工程と、を含む。
　本願の第３発明は、第２発明の電流測定方法であって、前記工程ｂ）および前記工程ｃ）は、前記工程ａ）の前に行われ、前記工程ａ）における測定タイミングは、前記特徴量に基づいて決定される。
　本願の第４発明は、第２発明の電流測定方法であって、前記特徴量は、前記工程ｂ）において測定した前記電流値の時定数である。
　本願の第５発明は、第４発明の電流測定方法であって、前記工程ｃ）において、複数の前記時定数を算出する。
　本願の第６発明は、第４発明または第５発明の電流測定方法であって、前記工程ｂ）および前記工程ｃ）は、前記工程ａ）の前に行われ、前記工程ａ）における測定タイミングは、前記時定数に基づいて決定される。
　本願の第７発明は、第５発明の電流測定方法であって、前記工程ａ）は、前記電極間に所定の電圧を印加しつつ、電極間距離を変更させるように操作を行って前記電極間の電流値を取得するキャリブレーション用電流測定工程であって、前記工程ａ）は、ｐ１）前記時定数に基づいて算出された待機時間の間、待機する工程と、ｐ２）前記電極間距離の変更に用いられる操作量の値と、前記電極間の電流値とを取得する工程と、ｐ３）前記操作量を変更して前記電極間距離を変更する工程と、を複数回繰り返す。
　本願の第８発明は、第７発明の電流測定方法であって、ｄ）前記工程ａ）における、複数の前記操作量と複数の前記電流値との関係を関数近似した近似関数を算出する工程
をさらに有する。
　本願の第９発明は、第７発明の電流測定方法であって、前記工程ｐ１）における前記待機時間は、前記時定数を定数倍して算出される。
　本願の第１０発明は、第５発明の電流測定方法であって、前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の後であって、ｅ）前記電極間にトンネル電流が流れない電極間距離において、前記電極間に流れる基準電流の値を測定する工程と、ｆ）目標とする電極間距離に対応するトンネル電流の値と、前記ｅ）で測定した前記基準電流の値とを加算して、目標合計電流値を算出する工程と、をさらに含み、前記工程ｅ）および前記工程ｆ）は、前記工程ａ）の前に行われ、前記工程ａ）は、ｑ１）前記時定数に基づいて算出された待機時間の間、待機する工程と、ｑ２）前記電極間のベース電流を測定する工程と、ｑ３）前記ベース電流の値が、前記工程ｆ）で算出した前記目標合計電流値に近づく方向に前記電極間距離を操作する工程と、を複数回繰り返す。
　本願の第１１発明は、第５発明の電流測定方法であって、前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の後であって、前記工程ａ）の前に、ｇ）前記電極間にトンネル電流が流れない電極間距離において、前記電極間に流れる基準電流の値を測定する工程と、ｈ）中間目標とする電極間距離に対応するトンネル電流の値と、前記工程ｇ）で測定した前記基準電流の値とを加算して、中間目標合計電流値を算出する工程と、をさらに含み、前記工程ａ）は、ｒ１）前記時定数に基づいて算出された待機時間の間、待機する工程と、ｒ２）前記電極間のベース電流を測定する工程と、ｒ３）前記ベース電流の値が、前記工程ｈ）で算出した前記中間目標合計電流値に近づく方向に前記電極間距離を操作する工程と、を複数回繰り返し、前記工程ａ）の後に、ｉ）中間目標とする電極間距離から最終目標とする電極間距離までの予め算出された操作量の操作を行うことにより、を前記最終目標と一致するように前記電極間距離を調整する工程をさらに含む。
　本願の第１発明から第１１発明によれば、電気二重層を考慮して電流を測定することができる。
　特に、本願の第２発明から第１１発明によれば、電気二重層等によって生じる過渡現象に起因する誤差が生じるのを抑制できる。
電極基板の上面図である。 電極基板の部分上面図である。 電極基板の部分上面図である。 電極基板の部分上面図である。 電極基板の押し曲げの様子を示した概略図である。 電極基板の押し曲げの様子を示した概略図である。 電極基板の押し曲げ時の様子を示した概略部分断面図である。 電極基板の押し曲げ時の様子を示した概略部分断面図である。 生体高分子のトンネル電流測定処理の流れを示したフローチャートである。 電解質を含む液体中に配置されたナノ電極間を流れる電流の挙動を模式的に示した図である。 ＮａＣｌ水溶液中に配置されたナノ電極間に電圧を印加した場合の初期電流値の挙動を示した図である。 特徴量解析処理の流れを示したフローチャートである。 ナノ電極の校正処理の流れを示したフローチャートである。 押し上げ工程の具体的な流れを示したフローチャートである。 引き下げ工程の具体的な流れを示したフローチャートである。 ナノ電極の校正処理における印加電圧および電流値の経時変化の概略を示した図である。 校正処理における印加電圧と電流値の測定データの一例を示した図である。 校正処理における印加電圧と電流値の測定データの近似関数を示した図である。 電極間距離設定処理の流れを示したフローチャートである。 スモールギャップモードにおける電極間距離調整工程の流れを示したフローチャートである。 ラージギャップモードにおける電極間距離調整工程の流れを示したフローチャートである。 測定された電流値の経時変化の一例を示した図である。 ラージギャップモードの電極間距離調整工程においてナノ電極間の様子を示した概略図である。
　以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。なお、本願では、電極基板の厚み方向を上下方向とし、基板層に対して金属層側を上側、金属層に対して基板層側を下側として説明を行っている。しかしながら、電極基板の使用時の向きは必ずしも金属層側を鉛直上向きとしなくてもよい。
　＜１．電極基板および電流測定装置の構成＞
　本発明の一実施形態に係る電極基板１と、電流測定装置９とについて、図１～図８を参照しつつ説明する。図１は、電極基板１の上面図である。図２～図４は、電極基板１の部分上面図である。図５および図６は、電流測定装置９を用いた電極基板１の押し曲げの様子を示した概略図である。図７および図８は、電極基板１の押し曲げの様子を示した概略部分断面図である。
　この電極基板１および電流測定装置９は、生体高分子であるタンパク質を構成するアミノ酸、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）を構成するヌクレオチド、糖鎖を構成する単糖、その他の生体高分子を構成する単分子の配列や、各単分子を解析するために用いられる。具体的には、後述するナノ電極３４間に電圧を印加した状態でナノ電極３４間に生体高分子を通過させる。そして、この期間にナノ電極３４と生体高分子との間に流れるトンネル電流を検知し、当該電流を解析することにより、生体高分子を構成する単分子の解析を行う。
　図１に示すように、電極基板１は、略長方形の板状の基板である。図１～図４、図７および図８に示すように、電極基板１は、基板層２０と、金属層３０とを有する。以下では、電極基板１の長手方向を第１方向と称し、電極基板１の短手方向を第２方向と称する。第２方向は、第１方向と直交する。なお、「直交する」とは、「略直交する」を含むものとする。
　本実施形態の基板層２０は、絶縁材料により形成される。本実施形態の基板層２０は、シリコン（Ｓｉ）により形成された基板層の上にポリイミドにより形成された基板層が重なった２層構造である。なお、本実施形態の基板層２０は２層構造であるが、本発明はこれに限られない。基板層２０は１種類の材料により形成される１層のみから構成されてもよいし、３つ以上の層から構成されてもよい。また、基板層２０は、絶縁性の材料により形成されていれば、ポリエチレンテレフタラート樹脂、セラミック、シリコーンゴムまたはアルミナなどの、シリコンおよびポリイミド以外の材料により形成されてもよい。
　金属層３０は、図１～図４に示すように、２つの接続用電極部３１と、２つの接続用電極部３１の間において第１方向に延びる配線部３２と、配線部３２の中央に配置された測定電極部３３とを有する。
　金属層３０は、例えば、導体である金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、タングステン（Ｗ）等の金属により形成される。なお、金属層３０は、複数の金属層を重ねて構成されてもよい。例えば、クロム（Ｃｒ）により形成された金属層の上に、上記の金、白金、銀、銅等の金属からなる金属層が重なる構造であってもよい。なお、その場合であっても、測定電極部３３は、１層の金属層のみから構成されることが好ましい。金属層３０の厚みは、例えば、５０～３００ｎｍである。
　基板層２０および金属層３０の最上面は、絶縁膜（図示せず）により覆われている。金属層３０の表面を絶縁膜で覆うことにより、測定電極部３３を液体中で用いる場合に、金属層３０のうち測定電極部３３以外の箇所において、金属層３０を構成する金属と液体との間における電子のやりとりが生じるのを抑制できる。なお、本実施形態では、絶縁膜はＴＥＯＳ酸化膜であるが、絶縁性の材料であれば、他の材料により形成されてもよい。なお、接続用電極部３１の上面の少なくとも一部には、絶縁膜が形成されない。このため、接続用電極部３１の上面の少なくとも一部は露出している。
　２つの接続用電極部３１は、第１方向に離れて配置されている。２つの配線部３２はそれぞれ、各接続用電極部３１から測定電極部３３へ向かうにつれて次第にその幅が小さくなる。両側の配線部３２の間には、配線部３２よりも第２方向の幅が小さい測定電極部３３が配置される。図４に示すように、測定電極部３３は、１対のナノ電極３４により構成される。一対のナノ電極３４は、電極基板１に負荷（外力）がかかっていない状態では、図４に示すように、ナノ電極３４の先端部同士が接触した状態となっている。
　基板層２０は、図１～図４に示すように、上面から下方へ凹む流路５０を有する。流路５０は、第１流路５１、第２流路５２および測定流路５３を有する。第１流路５１および第２流路５２は、測定電極部３３を挟んで第２方向に対向して配置される。測定流路５３は、第２方向に延びる溝である。測定流路５３は、第１流路５１と第２流路５２を第２方向に繋ぐ。
　第１流路５１および第２流路５２は、格子状に繋がる複数の溝により構成される。このような形状により、第１流路５１および第２流路５２に生体高分子を含む液体が充填されると、各生体高分子がこれらの溝の延びる方向に沿って配置されやすくなる。したがって、第１流路５１および第２流路５２と測定流路５３との境界部で生体高分子が詰まるのが抑制される。これにより、当該境界部において液体の流動性が低下するのが抑制されるとともに、測定流路５３内において各生体高分子が測定流路５３の延びる方向に沿って配置される。第１流路５１および第２流路５２の各溝は、幅が約１μｍであり、深さが約２μｍである。
　測定流路５３は、第２方向に沿って延びる。測定流路５３は、ナノ電極３４の先端部と上下に重なる位置に配置される。これにより、測定流路５３内を第２方向に移動する生体分子が、ナノ電極３４の間を通過しやすい。
　測定流路５３の深さは、第１流路５１および第２流路５２と同様に、約２μｍである。測定流路５３はナノ電極３４付近においてその幅が狭くなっている。これにより、電流値測定時に、生体高分子が、測定流路５３の延びる第２方向に沿う向きで、ナノ電極３４間を通過しやすい。
　次に、電流測定装置９について、図５および図６を参照しつつ説明する。図５および図６は、電流測定装置９において電流測定を行う際の様子を示した図である。図５は、電極基板１がセットされた電流測定装置９の初期状態における様子を示した側面図である。図６は、電極基板１の押し曲げ時における電流測定装置９の様子を示した側面図である。なお、図６では、電極基板１の変形を誇張して示している。
　図６に概念的に示すように、電流測定装置９は、載置台９１と、固定具９２と、押し上げ具９３と、昇降機構９４と、電源９５と、電流計９６と、制御部９０とを有する。
　載置台９１は、電極基板１を載置する平らな上面を有する。本実施形態の固定具９２は、第１方向に対して略垂直に配置される４つの板状部材である。固定具９２は、測定電極部３３を挟んだ第１方向の２箇所において、電極基板１を上下から押えて固定する。
　押し上げ具９３は、半球状の上面を有する円柱状の部材である。押し上げ具９３は、昇降機構９４に接続されている。昇降機構９４は、モータ９４１とピエゾアクチュエータ９４２とを有する。モータ９４１は、押し上げ具９３をミリメートル単位で大きく上下に移動させる。ピエゾアクチュエータ９４２は、押し上げ具９３をナノメートル単位で小さく上下に移動させる。昇降機構９４は、モータ９４１とピエゾアクチュエータ９４２とを組み合わせることにより、大きな動きと細かな動きとの双方を実現している。なお、昇降機構９４は、押し上げ高さを制御できる機構であれば、その他の動力を用いた機構であってもよい。
　電源９５は、一対の接続用電極部３１間に電圧を印加する。電流計９６は、測定電極部３３のナノ電極３４間に流れる電流の電流値を測定する。
　制御部９０は、昇降機構９４、電源９５および電流計９６とそれぞれ電気的に接続し、各部を制御する。本実施形態の制御部９０は、ＣＰＵ等の演算処理部、ＲＡＭ等のメモリ、およびハードディスクドライブ等の記憶部を備えたコンピュータにより構成されている。制御部９０の機能は、記憶部に記憶されたコンピュータプログラムに基づいて、演算処理部が動作することにより実現される。
　電極基板１を電流測定装置９にセットする際には、まず、載置台９１上に電極基板１を載置する。その後、電極基板１の測定電極部３３付近に負荷のかからない状態で電極基板１を上下から４つの固定具９２で固定する。このとき、測定電極部３３の真下に押し上げ具９３が位置するように、電極基板１を配置する。
　そして、電流測定時には、まず、電源９５により、接続用電極部３１間に所定の電圧を印加するとともに、電流計９６による電流値の測定を開始する。そして、昇降機構９４を駆動させて押し上げ具９３を押し上げて、ナノ電極３４の先端部同士の距離（電極間距離）を調整する。
　図７は、初期位置における電極基板１の部分断面図である。図８は、押し上げ時における電極基板１の部分断面図である。図４および図７に示すように、電極基板１が押し曲げられていない状態では、ナノ電極３４の先端部同士は接触している。図８に示すように、押し上げ具９３を押し上げると、電極基板１の測定電極部３３付近が下面側から押し上げられる。すると、測定流路５３を構成する基板層２０の側壁が、図８中に実線矢印で示すように、互いに離れる方向へと移動する。これにより、ナノ電極３４同士が、図８中に破線矢印で示すように、互いに離れる方向へと移動する。その結果、電極間距離が拡がる。このように、押し上げ具９３によって電極基板１を押し上げることにより、電極間距離の調整を行う。
　＜２．生体高分子のトンネル電流測定処理＞
　次に、電極基板１および電流測定装置９を用いた生体高分子のトンネル電流測定処理の流れについて、図９を参照しつつ説明する。図９は、電解質を含む液体中に生体高分子が遊動する液体試料について、当該生体高分子のトンネル電流測定処理の流れを示したフローチャートである。本実施形態において、液体試料に含まれる生体高分子は、ヌクレオチドである。また、液体試料に含まれる電解質を含む液体は、水等の極性の大きな溶媒に溶質が溶解された、ＮａＣｌ水溶液等の液体である。
　図９に示すように、生体高分子のトンネル電流測定処理では、まず、液体試料中のイオンや双極子・有機双極子等の分子が測定電流に与える影響について、その特徴量を解析する（ステップＳ１００）。ここで、ナノ電極３４を電解質を含む液体中に配置した状態で、ナノ電極３４間に電圧を印加した場合のナノ電極３４間を流れる電流の挙動について説明する。
　図１０は、電解質を含む液体中に配置されたナノ電極３４間に所定の電圧を印加した場合のナノ電極３４間を流れる電流の挙動を模式的に示した図である。図１１は、複数の濃度のＮａＣｌ溶液について、ＮａＣｌ水溶液中に配置されたナノ電極３４間に電圧を印加した場合の初期電流値の実験データを示した図である。
　図１０のように、ナノ電極３４間に時間ｔにおいて電圧の印加が開始されると、ナノ電極３４間には、図１０中に実線で示すような電流が流れる。このとき、ナノ電極３４間に流れる電流には、定常時のナノ電極３４間の電流値であるベース電流Ｉｂと、液体試料に含まれる電解質に起因する過渡電流とが含まれる。ベース電流Ｉｂは、リーク電流や電流測定装置９の装置構成や環境に起因する基準電流Ｉｃと、ナノ電極３４間を流れるトンネル電流Ｉｔ１とを含む。また、過渡電流の最大値をＩｏとする。
　ナノ電極３４が真空中に配置されている場合、ナノ電極３４間には、上記の基準電流Ｉｃと、ナノ電極３４間のトンネル電流Ｉｔ２とが流れる。この場合、ナノ電極３４間には、図１０中に二点鎖線で示すような電流が流れる。
　これに対し、ナノ電極３４が電解質を含む液体中に配置されている場合、ナノ電極３４間に電圧を印加すると、ナノ電極３４間に基準電流Ｉｃおよびトンネル電流Ｉｔ１が流れるとともに、ナノ電極３４間において液体中のイオンや双極子・有機双極子等の分子の運動や移動が生じる。このイオンおよび分子の運動や移動により、一時的にナノ電極３４間の電流値が大きくなる。この一時的な電流値の増加が過渡電流である。
また、イオンおよび分子の運動や移動が落ち着くと、液体中には、ナノ電極３４の表面に沿って電気二重層が形成されている。この電気二重層を介してナノ電極３４間に電流が流れる場合、電気二重層が介在しない場合と比べて、ナノ電極３４間に流れるトンネル電流が大きくなる。このため、電解質を含む液体中におけるトンネル電流Ｉｔ１は、真空中におけるトンネル電流Ｉｔ２と比べて、電気二重層に起因するトンネル電流の増加分ΔＩｔ大きくなる。
　図１１には、ＮａＣｌ濃度が１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭおよび５０ｍＭのＮａＣｌ水溶液について、ナノ電極３４間に電圧を印加した場合の初期電流値の挙動が示されている。図１１に示すように、ＮａＣｌ濃度が１０ｍＭ以上の場合、電流値の過渡現象が顕著に表れている。また、電解質であるＮａＣｌの濃度が高くなるにつれて、電気二重層の形成にかかわるイオンや溶媒・溶質を構成する分子が多くなるために、過渡現象が落ち着いた後の電流値が大きくなる。
　このように、ナノ電極３４間に電圧を印加した際に、ナノ電極３４が電解質を含む液体中に配置されていると、ナノ電極３４間を流れる電流には、過渡現象が生じる。このため、ナノ電極３４間に印加する電圧を変化させる場合、または、ナノ電極３４の電極間距離を変化させる場合に、過渡現象を考慮せずに操作や電流値の解析を行うと、操作内容、取得データまたは解析内容等に誤差が生じる。
　また、同じ電極基板１および電流測定装置９を用いた場合であっても、ナノ電極３４間に介在する液体の電解質の種類や濃度に応じて、電気二重層に起因するトンネル電流の増加量が異なる。このため、測定する液体試料ごとにステップＳ１００の特徴量解析処理を行う必要がある。ステップＳ１００の具体的な流れについては、後述する。
　ステップＳ１００の特徴量解析処理が行われた後、続いて、ナノ電極３４の校正処理（キャリブレーション）が行われる（ステップＳ２００）。ステップＳ２００の校正処理では、ナノ電極３４の電極間距離ｄを変動させるための操作量であるピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐと、電流計９６の検出したナノ電極３４間の電流値Ｉとの関係を解析する。これにより、一対のナノ電極３４に対する操作量である印加電圧Ｖｐと電極間距離ｄとの関係が推定される。ステップＳ２００の具体的な流れについては、後述する。
　続いて、生体高分子のトンネル電流を測定するために、ナノ電極３４の電極間距離ｄを所望の距離にセットする（ステップＳ３００）。ステップＳ２００の具体的な流れについては、後述する。
　ナノ電極３４の電極間距離ｄが所望の距離にセットされた後、ナノ電極３４間を流れる電流値を測定し、生体高分子のトンネル電流を測定する（ステップＳ４００）。このとき、必要に応じて、制御部９０は、電極間距離ｄが所望の範囲内となるように、フィードバック制御を行ってもよい。
　ステップＳ４００における生体高分子のトンネル電流の測定が行われた後、取得した電流データの解析を行う（ステップＳ５００）。生体高分子を構成する単分子は、その種類によって特有のトンネル電流値をとる。このため、液体試料中を遊動しナノ電極３４間を通過する生体高分子のトンネル電流の電流データを解析することにより、当該生体高分子における単分子の配列を推定することができる。
　＜３．特徴量解析処理＞
　次に、ステップＳ１００の特徴量解析処理について、図１２を参照しつつ説明する。図１２は、特徴量解析処理の流れを示したフローチャートである。
　特徴量解析処理では、まず、ナノ電極３４を液体試料中に配置し、ナノ電極３４の電極間距離ｄが０よりも大きくなるように配置する（ステップＳ１１０）。なお、電極間距離ｄが０でない、すなわち、一対のナノ電極３４の先端部同士が接触していないことを確認するために、ナノ電極３４間に電圧を印加して、ナノ電極３４間を流れる電流の電流値Ｉが所定の電圧値よりも小さいことを確認してもよい。その場合、電流値Ｉの確認後、ナノ電極３４への電圧の印加を停止し、しばらく待機する。
　その後、ナノ電極３４間の距離を固定したまま、ナノ電極３４間に所定の電圧を印加する。そして、電圧の印加開始から所定の期間、ナノ電極３４間の電流値Ｉを測定する（ステップＳ１２０）。このとき得られる電流値Ｉは、図１１に示すような過渡応答性を有する。なお、ステップＳ１２０の電流測定工程中において、生体高分子がナノ電極３４間を通過する場合がある。そのような場合には、得られた電流値Ｉには、生体高分子がナノ電極３４間を通過した際に現れるシグナルが時々含まれる。
　そして、得られた電流データの解析を行い、特徴量である時定数を算出する（ステップＳ１３０）。算出される時定数は、ナノ電極３４間の印加電圧や電極間距離ｄの変化に基づいて生じた過渡現象が収束し、過渡現象によって生じた変化量が約３６．２％まで減少するまでの時間を表す。なお、本発明で算出する特徴量は時定数に限られない。過渡現象の収束状態を表すパラメータであれば、その他のパラメータが特徴量として算出されても良い。
　図１０に示すようなナノ電極３４間の電流値Ｉの過渡現象は、定常時のナノ電極３４間の電流値であるベース電流Ｉｂと、過渡電流成分の最大値Ｉｏとを用いて、次の数式（１）のように示すことができる。なお、ベース電流Ｉｂとは、上述の基準電流Ｉｃと、液体試料に含まれる電解質を含む液体を介してナノ電極３４間を流れるトンネル電流値とが重畳したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　数式（１）の右辺の第２項が過渡電流成分となる。ここで、τは、過渡電流成分の時定数である。ナノ電極３４間の電流値Ｉがこのような数式（１）で近似できることから、ステップＳ１１０で得られた電流データを、数式（１）で近似することによって、過渡現象の時定数τを算出することが可能である。時定数τは、過渡現象の特徴量として、以降の校正処理、電極間距離設定処理および電流測定処理において用いられる。以降の各処理において、過渡現象を考慮して時定数τを用いた処理を行うことにより、各処理において過渡現象に起因した操作内容、取得データまたは解析内容等の誤差を抑制することができる。
　ここで、現実の電流値データを解析すると、ナノ電極３４間の電流値Ｉには、複数の過渡電流成分が重畳されていることがわかった。そこで、本実施形態では、ナノ電極３４間の電流値Ｉについて、５種類の過渡電流成分が重畳しているものとして、次の数式（２）のように近似する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　数式（２）の右辺の第２項は、ｎ＝１～５の５つの過渡電流成分の和となっている。５つの過渡電流成分はそれぞれ、ｎ＝１～５について、最大電流成分がＩｎであり、時定数がτｎである。すなわち、５つの過渡電流成分は、最大電流成分がそれぞれＩ１，Ｉ２，Ｉ３，Ｉ４，Ｉ５であり、時定数がτ１，τ２，τ３，τ４，τ５である。ここで、以下では、５つの時定数τ１～τ５は、時定数の値が小さいものから順にτ１，τ２，τ３，τ４，τ５とする。
　なお、本実施形態では、算出する時定数の数が５つであるが、本発明はこれに限られない。算出する時定数の数は、１つ～４つであってもよいし、６つ以上であってもよい。ナノ電極３４間の電流値Ｉには、上述の通り、複数の過渡電流成分が重畳している。このため、電流値Ｉに現れる複数の過渡電流成分の影響をより正確に排除するためには、３つ以上の過渡電流成分を考慮することが好ましい。また、算出する時定数の数が多すぎると、ナノ電極３４間の電流値測定に影響が殆どない過渡電流成分の時定数まで算出したり、実際には生じていない過渡電流成分を算出したりすることとなりかねない。このため、算出する時定数の数は、３つ～６つであることが好ましい。
　＜４．電極対の校正処理＞
　次に、ステップＳ２００のナノ電極３４の校正処理について、図１３を参照しつつ説明する。図１３は、ナノ電極３４の校正処理の流れを示したフローチャートである。
　ナノ電極３４の校正処理では、押し上げ具９３による電極基板１の押し上げ量を変動させて電極間距離ｄを変動させ、その間のナノ電極３４間に流れる電流の電流値Ｉを測定する。そして、押し上げ具９３の操作量と電流値Ｉの関係から、当該操作量と電極間距離ｄとの関係を推定する。
　本実施形態の校正処理では、押し上げ具９３による電極基板１の押し上げと引き戻しとを繰り返して、ナノ電極３４の電極間距離ｄを変動させ、その間のナノ電極３４間に流れるトンネル電流の値を取得する。
　校正処理において、まず、電極基板１を電流測定装置９に載置し、初期位置にセットする（ステップＳ２１０）。次に、制御部９０は、カウント数ｎをｎ＝１に設定する（ステップＳ２２０）。
　そして、制御部９０は、基準電流Ｉｃを測定する（ステップＳ２３０）。具体的には、押し上げ具９３を押し上げて、ナノ電極３４間にトンネル電流が流れない程度の十分に大きな電極間距離ｄを保ちつつ、ナノ電極３４間を流れる電流の電流値を測定する。これにより、リーク電流や電流測定装置９の装置構成や環境に起因する基準電流Ｉｃを測定できる。
　なお、基準電流Ｉｃの測定を行う場合、制御部９０は、ナノ電極３４間の距離が基準電流Ｉｃを測定可能な距離まで達した後、所定の初期待機時間ｔ０が経過した後に基準電流Ｉｃの測定を行う。この初期待機時間ｔ０は、ステップＳ１００の特徴量解析処理で算出された５つの時定数τ１～τ５のうち、最も値の大きな時定数τ５に基づいて算出される。初期待機時間ｔ０は、例えば、時定数τ５に所定の実数を乗じて算出される。
　このように、基準電流Ｉｃの測定を行う測定タイミングは、特徴量である時定数τ５に基づいて決定される。これにより、基準電流Ｉｃを測定する際に、過渡現象の影響によって測定値に誤差が生じるのが抑制される。基準電流Ｉｃの測定後、制御部９０は、押し上げ具９３を所定の位置まで引き下げる。
　押し上げ具９３が所定の位置まで引き下げられた後、制御部９０は、押し上げ具９３による電極基板１の押し上げ工程を行う（ステップＳ２４０）。すなわち、制御部９０は、ナノ電極３４の電極間距離ｄが大きくなる方向へ操作を行う。
　押し上げ工程の開始時における押し上げ具９３の位置は、電流計９６の測定した電流値が後述する第１閾値よりも大きくなる位置であれば、ナノ電極３４の先端部同士が接触する位置であってもよいし、ナノ電極３４の先端部同士が離間した位置であってもよい。
　なお、このステップＳ２４０における押し上げ工程と、後述するステップＳ２５０における引き下げ工程とにおいて、押し上げ具９３の押し上げおよび引き下げは、ピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐを増減させることによって行う。このため、押し上げおよび引き下げを行うための操作量は、ピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐの電圧値となる。印加電圧Ｖｐの電圧値が大きくなると、押し上げ具９３による押し上げ量が大きくなり、電極間距離ｄが大きくなる。一方、印加電圧Ｖｐの電圧値が小さくなると、押し上げ具９３による押し上げ量が小さくなり、電極間距離ｄが小さくなる。
　ステップＳ２４０の押し上げ工程は、電流計９６の測定した電流値が所定の第１閾値以下となるまで行われる。図１４は、ステップＳ２４０の押し上げ工程の具体的な流れを示したフローチャートである。
　図１４に示すように、ステップＳ２４０では、制御部９０は、まず、所定の待機時間の間、待機を行う（ステップＳ２４１）。これにより、ステップＳ２４１の待機工程の直前において行われた電極間距離ｄの変更に伴う過渡現象の影響が十分小さくなるのを待つ。これにより、その後のステップＳ２４２における電流測定時に、測定した電流値に過渡現象に起因する誤差が生じるのを抑制できる。
　なお、１回目のステップＳ２４１における待機時間は、例えば、ステップＳ２３０の基準電流Ｉｃの測定時と同じ初期待機時間ｔ０である。２回目以降のステップＳ２４１における待機時間は、所定の第１待機時間ｔ１である。この第１待機時間ｔ１は、ステップＳ１００の特徴量解析処理で算出された５つの時定数τ１～τ５のうち、最も値の小さな時定数τ１に基づいて算出される。第１待機時間ｔ１は、例えば、時定数τ１に所定の実数を乗じて算出される。なお、第１待機時間ｔ１は、他の時定数τ２～τ５に基づいて算出されてもよい。
　このように、１回目のステップＳ２４１における待機時間は、２回目のステップＳ２４１における待機時間よりも長いことが好ましい。これは、１回目のステップＳ２４１開始前における電極間距離ｄの変更量が、２回目以降のステップＳ２４１開始前における電極間距離ｄの変更量よりも大きいためである。なお、１回目のステップＳ２４１における待機時間は、ステップＳ２３０の基準電流Ｉｃの測定時と同じ初期待機時間ｔ０には限られず、２回目のステップＳ２４１における待機時間である第１待機時間ｔ１以上であれば、他の方法により算出された待機時間であってもよい。
　次に、制御部９０が、その時点でのピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐの電圧値と、電流計９６の測定した電流値とを記憶する（ステップＳ２４２）。すなわち、制御部９０が、電極間距離ｄの変更に用いられる操作量の値と、ナノ電極３４の電流値とを取得する。
　続いて、制御部９０は、印加電圧Ｖｐを所定量増加させ、電極間距離ｄを増加させる（ステップＳ２４３）。すなわち、制御部９０は、電極間距離ｄの変更に用いられる操作量を変更して電極間距離ｄを変更する。
　電極間距離ｄの変更後、制御部９０は、電流計９６の測定した電流値が所定の第１閾値以下となったか否かを判断する（ステップＳ２４４）。電流計９６の測定した電流値が第１閾値よりも大きい場合（ステップＳ２４４：Ｎｏ）、制御部９０は、ステップＳ２４１に戻り、待機と、電流値の測定と、電極間距離ｄの増加とを繰り返す。一方、電流計９６の測定した電流値が第１閾値以下となった場合（ステップＳ２４４：Ｙｅｓ）、制御部９０は、ステップＳ２４０の押し上げ工程を終了する。
　ステップＳ２４０の押し上げ工程が終了すると、続いて、制御部９０は、押し上げ具９３の引き下げ工程を行う（ステップＳ５０）。すなわち、制御部９０は、ナノ電極３４の電極間距離ｄが小さくなる方向へ操作を行う。
　ステップＳ２５０の引き下げ工程は、電流計９６の測定した電流値が所定の第２閾値以上となるまで行われる。図１５は、ステップＳ２５０の引き下げ工程の具体的な流れを示したフローチャートである。
　図１５に示すように、ステップＳ２５０では、制御部９０は、まず、所定の第１待機時間ｔ１の間、待機を行う（ステップＳ２５１）。この第１待機時間ｔ１は、２回目以降のステップＳ２４１における待機時間と同じである。
　次に、制御部９０が、その時点でのピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐの電圧値と、電流計９６の測定した電流値とを記憶する（ステップＳ２５２）。すなわち、制御部９０が、電極間距離ｄの変更に用いられる操作量の値と、ナノ電極３４間の電流値Ｉとを取得する。
　続いて、制御部９０は、印加電圧Ｖｐを所定量減少させ、電極間距離ｄを減少させる（ステップＳ２５３）。すなわち、制御部９０は、電極間距離ｄの変更に用いられる操作量を変更して電極間距離ｄを変更する。
　電極間距離ｄの変更後、制御部９０は、電流計９６の測定した電流値が所定の第２閾値以上となったか否かを判断する（ステップＳ２５４）。電流計９６の測定した電流値が第２閾値未満である場合（ステップＳ２５４：Ｎｏ）、制御部９０は、ステップＳ２５１に戻り、待機と、電流値の測定と、電極間距離ｄの減少とを繰り返す。一方、電流計９６の測定した電流値が第２閾値以上となった場合（ステップＳ２５４：Ｙｅｓ）、制御部９０は、ステップＳ２５０の引き下げ工程を終了する。
　続いて、制御部９０は、カウント数ｎが所定の繰り返し回数Ｎに達したか否かを判断する（ステップＳ２６０）。カウント数ｎが繰り返し回数Ｎに達していない場合（ステップＳ２６０：Ｎｏ）、制御部９０は、ステップＳ２７０へと進み、カウント数ｎをインクリメントする。その後、ステップＳ２４０へと戻り、再び押し上げ具９３の押し上げ工程および引き下げ工程を実行する。一方、カウント数ｎが繰り返し回数Ｎに達している場合（ステップＳ２６０：Ｙｅｓ）、制御部９０は、ステップＳ２８０へと進む。
　このように、ステップＳ２４０の押し上げ工程と、ステップＳ２５０の引き下げ工程とにおいて、ナノ電極３４間に所定の電圧を印加しつつ、電極間距離ｄを変更させるように操作を行い、ナノ電極３４間の電流値Ｉを取得する。このとき、ステップＳ２４０の押し上げ工程と、ステップＳ２５０の引き下げ工程とを複数回繰り返し行うことにより、後述する近似関数をより正確に求めることができる。
　ここで、図１６は、ナノ電極３４の校正処理におけるピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐおよびナノ電極３４間の電流値の経時変化の概略を示した図である。図１６において、１段目はピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐ、２段目はナノ電極３４の電極間距離ｄ、３段目は電流計９６の検出したナノ電極３４間の電流値Ｉの経時変化を比例軸で示したもの、４段目は、電流計９６の検出したナノ電極３４間の電流値の経時変化を対数軸で示したものである。なお、図１６は、各値の関係性を理解しやすくするために、ステップＳ２４１およびステップＳ２５１における待機工程を省略して示している。
　図１６の３段目および４段目に示すように、本実施形態では、第１閾値は０．０１ｎＡであり、第２閾値は２．００ｎＡである。第１閾値は、基準電流Ｉｃよりも大きい値に設定する。また、第２閾値は、第１閾値よりも大きく、かつ、ナノ電極３４同士が接触した際に流れる電流値よりも小さい値に設定する。
　上記の通り、本実施形態のステップＳ２４０およびステップＳ２５０において、押し上げ具９３の押し上げまたは引き下げを行うための操作量は、ピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐである。本実施形態のピエゾアクチュエータ９４２は、印加電圧Ｖｐと押し上げ量とが略比例する。さらに、押し上げ量と、電極間距離ｄとが略比例する。したがって、印加電圧Ｖｐの電圧値の変化量と、電極間距離ｄの変化量とは略比例する。ここで、電極間距離ｄと印加電圧Ｖｐとの関係は、比例係数をαとすると、以下の数式（３）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　ステップＳ２４０では、図１６に示すように、印加電圧Ｖｐを次第に増加させる。具体的には、ステップＳ２４３を実行するごとに、印加電圧Ｖｐを所定量増加させる。このため、電極間距離ｄも印加電圧Ｖｐの増加に従って増加する。また、図１６に示すように、ステップＳ２５０では、印加電圧Ｖｐを次第に減少させる。具体的には、ステップＳ２５３を実行するごとに、印加電圧Ｖｐを所定量減少させる。このため、ステップＳ２５０では、電極間距離ｄは略一定の割合で減少する。
　一方、電極間距離ｄと、電極間を流れるトンネル電流Ｉｔとは、以下の数式（４）のような関係を有する。なお、Ｋは定数である。βは、既知の定数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 　一方、電流計９６の測定する電流値Ｉは、基準電流Ｉｃと、トンネル電流Ｉｔとを加算したものであるから、電流値Ｉは、以下の数式（５）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 　このため、図１６に示すように、ステップＳ２４０において、押し上げ具９３を次第に押し上げていくと、電流値Ｉは指数関数的に小さくなる。そして、ステップＳ２５０において、押し上げ具９３を次第に引き戻していくと、電流値Ｉは指数関数的に大きくなる。
　ステップＳ２６０からステップＳ２８０へと進むと、制御部９０は、Ｎ回繰り返し行ったステップＳ２４０およびステップＳ２５０における押し上げ具９３に対する操作量と電流計９６の測定した電流値Ｉとの関係を近似した近似関数を算出する（ステップＳ２８０）。
　図１７は、校正処理における印加電圧Ｖｐと電流値Ｉの測定データの一例を示した図である。図１８は、図１７の例の測定データの近似関数を示した図である。なお、図１７および図１８はいずれも、横軸が実数軸、縦軸が対数軸の片対数グラフである。図１７中、黒いデータ点は、押し上げ工程（ステップＳ２４０）における測定データを示し、白いデータ点は、引き下げ工程（ステップＳ２５０）における測定データを示したものである。ステップＳ２４０～ステップＳ２５０では、所定の時間間隔（例えば５０ｍｓｅｃ）ごとに、印加電圧Ｖｐと測定した電流値Ｉとを記憶する。
　図１７に示すように、ステップＳ２４０およびステップＳ２５０における印加電圧Ｖｐと電流値Ｉとは、印加電圧Ｖｐが大きくなるにつれて、電流値Ｉが指数関数的に小さくなる。ステップＳ２８０では、この関係を用いて以下の数式（６）のような近似式を算出し、定数Ａ，Ｂ，Ｃを算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 　このようにすれば、次の数式（７）～（９）のように各値が求まる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
 　以上より、電極間距離ｄと印加電圧Ｖｐとの比例係数αが以下の数式（１０）の通り求められる。この比例係数αが、電極基板１ごとに求められる固有値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
 　算出された比例係数αを、数式（３）に代入して、操作量である印加電圧Ｖｐと電極間距離ｄとの関係を推定した推定関数が算出される（ステップＳ２９０）。この比例係数αおよび推定関数を用いて、後述する電流測定処理を行う。
　このような校正処理（ステップＳ２００）により、一対のナノ電極３４に対する操作量（印加電圧Ｖｐ）と電極間電流値（電流値Ｉ）との関係が求められる。なお、上記の校正処理は、測定対象とする液体試料そのもの、または、当該液体試料の液体成分である電解質を含む液体内で行われる。このため、電気二重層等の過渡現象を考慮して、ステップＳ２４１およびステップＳ２５１の待機工程を実行する。これにより、過渡現象に起因する電流値の誤差を抑制することができる。
　なお、本実施形態では、ステップＳ２８０の近似関数算出工程において、ステップＳ２４０の押し上げ工程における測定データの近似関数と、ステップＳ２５０の引き下げ工程における測定データの近似関数とを別々に算出する。そして、ステップＳ２９０の推定関数算出工程においても、押し上げ具９３の押し上げ時における推定関数と、押し上げ具９３の引き下げ時における推定関数とを別々に算出する。
　ピエゾアクチュエータ９４２の印加電圧Ｖｐと移動量とについてのヒステリシスなどに起因して、押し上げ工程と引き下げ工程とでは、印加電圧Ｖｐと電流値Ｉとの関係にもヒステリシスが現れる。このため、本実施形態のように、押し上げ工程における近似関数および推定関数と、引き下げ工程における近似関数および推定関数とを別々に算出することが好ましい。
　＜５．電極間距離設定処理＞
　続いて、電極基板１を用いた生体高分子の電流測定処理を行うための、電極間距離ｄの設定処理について、図１９～図２１を参照しつつ説明する。図１９は、ステップＳ３００の電極間距離設定処理の流れを示したフローチャートである。図２０は、スモールギャップモードにおける電極間距離調整工程の流れを示したフローチャートである。図２１は、ラージギャップモードにおける電極間距離調整工程の流れを示したフローチャートである。
　生体高分子のトンネル電流を測定する場合、適切な電極間距離で測定を行うことが重要である。また、測定対象とする生体高分子ごとに、適切な電極間距離が異なる。この電流測定処理は、測定対象である生体高分子を含む液体試料中で行われる。図１９に示すように、測定処理において、まず、制御部９０に、外部から目標とする電極間距離である目標電極間距離が入力される（ステップＳ３１０）。なお、目標電極間距離は、予め入力されていてもよい。
　次に、制御部９０は、ステップＳ３１０で入力された目標電極間距離が、所定の閾値以下であるか否かを判断する（ステップＳ３２０）。この閾値は、電極間距離が当該閾値となる場合のナノ電極３４間のトンネル電流値が、ベース電流Ｉｂに含まれる雑音成分よりも大きい値となるように設定される。
　なお、ステップＳ３２０において、目標とする所望の電極間距離に相当する目標トンネル電流値Ｉｕが、所定の閾値以上であるか否かを判断してもよい。その場合、目標トンネル電流値Ｉｕは、例えば、前述した数式（４）を用いて算出される。
　ステップＳ３２０において、目標電極間距離が閾値以下であると判断すると（ステップＳ３２０：Ｙｅｓ）、制御部９０は、ステップＳ３３０のスモールギャップモードにおける電極間距離調整工程へと進む。一方、目標電極間距離が閾値よりも大きいと判断すると（ステップＳ３２０：Ｎｏ）、制御部９０は、ステップＳ３４０のラージギャップモードにおける電極間距離調整工程へと進む。なお、ステップＳ３３０およびステップＳ３４０では、引き続きナノ電極３４に所定の電圧を印加して、ナノ電極３４間の電流を測定する。
　続いて、図２０を参照しつつ、スモールギャップモードにおける電極間距離調整工程の流れについて説明する。まず、ナノ電極３４間にトンネル電流が流れないように電極間距離を十分大きくした状態で、基準電流Ｉｃの測定を行う（ステップＳ３３１）。基準電流Ｉｃの測定後は、押し上げ具９３を、ナノ電極３４の先端部同士が接触する位置に戻す。
　基準電流Ｉｃは、ステップＳ３３１において電流計９６の測定した電流値Ｉからベース電流Ｉｂを抽出することにより測定される。図２２は、測定された電流値Ｉの経時変化の一例を示した図である。図２２に示すように、生体高分子を含む液体中で電流値Ｉの測定をする場合、電流値Ｉは、ナノ電極３４間に生体高分子が存在していない場合に測定されるベース電流Ｉｂの成分と、ナノ電極３４間に生体高分子が通過した場合に測定されるサンプル電流Ｉｓの成分とを含む。サンプル電流Ｉｓは、生体高分子とナノ電極３４との間に流れるトンネル電流である。
　図２２に示すように、サンプル電流Ｉｓは、ベース電流Ｉｂよりも大きな電流値を有する。このため、計測した電流値Ｉを、ベース電流Ｉｂの成分とサンプル電流Ｉｓの成分とに分離することが可能である。なお、ステップＳ３３１におけるサンプル電流Ｉｓは、所望の電極間距離における測定値ではないため、実験データとして用いることはできない。
　ステップＳ３３１において、制御部９０は、測定した電流値Ｉから、ベース電流Ｉｂ成分を抽出し、当該成分から、ナノ電極３４間にトンネル電流が流れない状態におけるベース電流Ｉｂの電流値である基準電流Ｉｃを算出する。
　次に、制御部９０は、目標合計電流値Ｉａを算出する（ステップＳ３３２）。目標合計電流値Ｉａは、目標とする電極間距離ｄに相当する、ナノ電極３４間のトンネル電流の値である。具体的には、まず、数式（４）の電極間距離ｄに目標電極間距離を代入して、目標トンネル電流値Ｉｕを算出する。目標トンネル電流値Ｉｕは、目標とする電極間距離ｄに相当するトンネル電流の値である。そして、基準電流Ｉｃに目標トンネル電流値Ｉｕを加算して、目標合計電流値Ｉａを算出する。
　その後、制御部９０は、押し上げ具９３を動作させて、測定した電流値Ｉのベース電流Ｉｂが目標合計電流値Ｉａと一致する目標位置に、ナノ電極３４を配置するために、ステップＳ３３３～Ｓ３３５を行う。
　まず、制御部９０は、現在のベース電流Ｉｂが目標合計電流値Ｉａに近づくように、押し上げ具９３を操作し、電極間距離ｄを変更する（ステップＳ３３３）。本実施形態では、１回のステップＳ３３３で変更可能なピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐの変化量の上限値が決められている。このため、１回のステップＳ３３３における電極間距離ｄの最大変更量が決められている。
　次に、制御部９０は、所定の第２待機時間ｔ２の間、待機を行う（ステップＳ３３４）。これにより、ステップＳ３３３の電極間距離ｄの変更に伴う過渡現象の影響が十分小さくなるのを待つ。その結果、その後のステップＳ３３５における電流測定時に、測定した電流値に過渡現象に起因する誤差が生じるのを抑制できる。
　ステップＳ３３４における待機時間である第２待機時間ｔ２は、ステップＳ１００の特徴量解析処理で算出された５つの時定数τ１～τ５のうち、最も小さな時定数τ１、２番目に小さな時定数τ２、および３番目に小さな時定数τ３に基づいて算出される。第２待機時間ｔ２は、例えば、時定数τ１、時定数τ２および時定数τ３の平均値に所定の実数を乗じて算出される。
　その後、制御部９０は、電流計９６に電流値Ｉを測定させる（ステップＳ３３５）。
　そして、制御部９０は、ステップＳ３３５において測定した電流値Ｉのベース電流Ｉｂが、所定の電流値範囲内に含まれるか否かを判断する（ステップＳ３３６）。ステップＳ３３６において判断が行われる所定の範囲は、目標合計電流値Ｉａを基準として設定される。例えば、ベース電流Ｉｂが、目標合計電流値Ｉａから±０．０００５ｎＡの範囲内であるか否かを基準とする。
　ステップＳ３３６において、ベース電流Ｉｂが所定の範囲内に達していないと判断すると（ステップＳ３３６：Ｎｏ）、制御部９０は、ステップＳ３３３へと戻り、引き続き電極間距離ｄの調整を行う。
　一方、ステップＳ３３６において、ベース電流Ｉｂが所定の範囲内に達していると判断すると（ステップＳ３３６：Ｙｅｓ）、制御部９０は、ステップＳ３００の電極間調整処理を完了する。
　続いて、図２１を参照しつつ、ステップＳ３４０のラージギャップモードにおける電極間距離調整工程の流れについて説明する。電流測定時における電極間距離が比較的大きい場合、当該電極間距離におけるトンネル電流の値は比較的小さくなる。当該トンネル電流の値が、基準電流Ｉｃのノイズ成分に比べて小さいと、基準電流Ｉｃと目標合計電流値Ｉａとの差がわかりにくくなる。このため、スモールギャップモードと同じ方法で電極位置を設定しようとしても、所望の電極間距離となる電極位置に正確にセットするのが困難である。そこで、以下に説明するラージギャップモードにより電極位置をセットすることにより、所望の電極間距離となるように電極位置をセットする。
　図２３は、ステップＳ３４０のラージギャップモードの電極間距離調整工程において、ナノ電極３４間の様子を示した概略図である。図２３に示すように、まず、ナノ電極３４間にトンネル電流が流れないように電極間距離を十分大きくした状態で、基準電流Ｉｃの測定を行う（ステップＳ３４１）。基準電流Ｉｃの測定後は、押し上げ具９３を、ナノ電極３４の先端部同士が接触する位置に戻す。基準電流Ｉｃの測定は、スモールギャップモードのステップＳ３３１と同様に行う。
　次に、制御部９０は、中間目標合計電流値Ｉｄおよび移動操作量ΔＶｐを算出する（ステップＳ３４２）。具体的には、まず、中間トンネル電流値Ｉｖを算出する。中間トンネル電流値Ｉｖは、中間目標位置とする中間電極間距離ｄ１に対応するトンネル電流値である。中間目標位置とする中間電極間距離ｄ１は、最終目標位置とする目標電極間距離ｄ２よりも小さい電極間距離である。中間トンネル電流値Ｉｖは、数式（４）の電極間距離ｄに、中間電極間距離ｄ１を代入することにより算出される。そして、この中間トンネル電流値Ｉｖと、ステップＳ３４１で測定した基準電流Ｉｃとを加算して、中間目標合計電流値Ｉｄを算出する。なお、中間トンネル電流値Ｉｖが、基準電流Ｉｃのノイズ成分よりも十分大きな電流値となるように、中間電極間距離ｄ１を設定する。
　一方、移動操作量ΔＶｐは、中間目標位置である中間電極間距離ｄ１から最終目標位置である目標電極間距離ｄ２まで移動させるために必要な操作量である。この移動操作量ΔＶｐは、具体的には、中間電極間距離ｄ１から目標電極間距離ｄ２まで移動するためのピエゾアクチュエータ９４２への印加電圧Ｖｐの変化量である。この移動操作量ΔＶｐは、ステップＳ１０１～Ｓ１１１の校正処理によって求められた推定関数に基づいて求められる。すなわち、数式（３）と、校正処理で求められた電極間距離ｄと印加電圧Ｖｐとの比例係数αとを用いて、以下の数式（１１）の関係から求められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
 　続いて、制御部９０は、押し上げ具９３を動作させて、測定した電流値Ｉのベース電流Ｉｂが中間目標合計電流値Ｉｄと一致する中間目標位置に、ナノ電極３４を配置するために、ステップＳ３４３～Ｓ３４５を行う。これにより、ナノ電極３４間の電極間距離ｄを、中間電極間距離ｄ１とすることができる。
　まず、制御部９０は、現在のベース電流Ｉｂが中間目標合計電流値Ｉｄに近づくように、押し上げ具９３を操作し、電極間距離ｄを変更する（ステップＳ３４３）。ステップＳ３４３は、スモールギャップモードのステップＳ２４３と同様に行う。
　次に、制御部９０は、所定の第２待機時間ｔ２の間、待機を行う（ステップＳ３４４）。これにより、ステップＳ３３３の電極間距離ｄの変更に伴う過渡現象の影響が十分小さくなるのを待つ。これにより、その後のステップＳ３３５における電流測定時に、測定した電流値に過渡現象に起因する誤差が生じるのを抑制できる。ステップＳ３４３における待機時間は、例えば、スモールギャップモードのステップＳ３３３における待機時間と同じ第２待機時間ｔ２である。
　その後、制御部９０は、電流計９６に電流値Ｉを測定させる（ステップＳ３４５）。
　そして、制御部９０は、ステップＳ３４５において測定した電流値Ｉのベース電流Ｉｂが、所定の電流値範囲内に含まれるか否かを判断する（ステップＳ３４６）。ステップＳ３３６において判断が行われる所定の範囲は、中間目標合計電流値Ｉｄを基準として設定される。例えば、ベース電流Ｉｂが、中間目標合計電流値Ｉｄから±０．０００５ｎＡの範囲内であるか否かを基準とする。
　ステップＳ３４６において、ベース電流Ｉｂが所定の範囲内に達していないと判断すると（ステップＳ３４６：Ｎｏ）、制御部９０は、ステップＳ３４３へと戻り、引き続き電極間距離ｄの調整を行う。
　一方、ステップＳ３４６において、ベース電流Ｉｂが所定の範囲内に達していると判断すると（ステップＳ３４６：Ｙｅｓ）、制御部９０は、ステップＳ３４７に進む。そして、ステップＳ３４２で算出した移動操作量ΔＶｐの分、押し上げ具９３による電極基板の押し上げを行う（ステップＳ３４７）。具体的には、制御部９０は、印加電圧Ｖｐを、中間電極間距離ｄ１における印加電圧Ｖｐに移動操作量ΔＶｐを加算した電圧値に変化させる。これにより、制御部９０はナノ電極３４間の電極間距離ｄを、最終目標位置における目標電極間距離ｄ２にセットする。
　続いて、制御部９０は、所定の第３待機時間ｔ３の間、待機を行う（ステップＳ３４８）。これにより、ステップＳ３４７における電極間距離ｄの変更に伴う過渡現象の影響が十分小さくなるのを待つ。その結果、この後に続くステップＳ４００の生体高分子のトンネル電流測定処理時に、測定した電流値に過渡現象に起因する誤差が生じるのを抑制できる。制御部９０は、ステップＳ３４９の後、ステップＳ３００の電極間調整処理を完了する。
　ステップＳ３４８における待機時間である第３待機時間ｔ３は、ステップＳ１００の特徴量解析処理で算出された５つの時定数τ１～τ５のうち、最も小さな時定数τ１と、２番目に小さな時定数τ２とに基づいて算出される。第３待機時間ｔ３は、例えば時定数τ１および平均値に所定の実数を乗じて算出される。
　＜６．変形例＞
　以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。
　上記の実施形態では、電極基板の有する金属層が外部から電力が入力される接続用電極間を一対のみ有したが、本発明はこれに限られない。１つの電極基板が、外部から電力が入力される電極を複数対有していてもよい。例えば、第１流路と第２流路との間に電気泳動用の電圧を印加してもよい。
　また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。
　１　電極基板
　９　電流測定装置
　３４　ナノ電極
　５０　流路
　９０　制御部
　９３　押し上げ具
　９４　昇降機構
　９５　電源
　９６　電流計
　９４２　ピエゾアクチュエータ

Claims (11)

  1. 　一対の電極間を通過する生体高分子のトンネル電流を測定する電流測定方法であって、
    　ａ）電解質を含む液体中に前記電極を配置し、前記電極間に電圧を印加しつつ、前記電極の表面に形成される電気二重層を介して前記電極間を流れる電流を測定する工程
    を含む、電流測定方法。
  2. 　請求項１に記載の電流測定方法であって、
    　ｂ）前記電極間の距離を固定したまま、電極間電圧をかけていない状態から所定の電圧印加を行いつつ、前記電極間を流れる電流を測定する工程と、
    　ｃ）前記工程ｂ）において測定した電流値について、前記電気二重層に起因する特徴量を算出する工程と、
    を含む、電流測定方法。
  3. 　請求項２に記載の電流測定方法であって、
    　前記工程ｂ）および前記工程ｃ）は、前記工程ａ）の前に行われ、
    　前記工程ａ）における測定タイミングは、前記特徴量に基づいて決定される、電流測定方法。
  4. 　請求項２に記載の電流測定方法であって、
    　前記特徴量は、前記工程ｂ）において測定した前記電流値の時定数である、電流測定方法。
  5. 　請求項４に記載の電流測定方法であって、
    　前記工程ｃ）において、複数の前記時定数を算出する、電流測定方法。
  6. 　請求項４または請求項５に記載の電流測定方法であって、
    　前記工程ｂ）および前記工程ｃ）は、前記工程ａ）の前に行われ、
    　前記工程ａ）における測定タイミングは、前記時定数に基づいて決定される、電流測定方法。
  7. 　請求項５に記載の電流測定方法であって、
    　前記工程ａ）は、前記電極間に所定の電圧を印加しつつ、電極間距離を変更させるように操作を行って前記電極間の電流値を取得するキャリブレーション用電流測定工程であって、
    　前記工程ａ）は、
    　　ｐ１）前記時定数に基づいて算出された待機時間の間、待機する工程と、
    　　ｐ２）前記電極間距離の変更に用いられる操作量の値と、前記電極間の電流値とを取得する工程と、
    　　ｐ３）前記操作量を変更して前記電極間距離を変更する工程と、
    を複数回繰り返す、電流測定方法。
  8. 　請求項７に記載の電流測定方法であって、
    　ｄ）前記工程ａ）における、複数の前記操作量と複数の前記電流値との関係を関数近似した近似関数を算出する工程
    をさらに有する、電流測定方法。
  9. 　請求項７に記載の電流測定方法であって、
    　前記工程ｐ１）における前記待機時間は、前記時定数を定数倍して算出される、電流測定方法。
  10. 　請求項５に記載の電流測定方法であって、
    　前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の後であって、
    　ｅ）前記電極間にトンネル電流が流れない電極間距離において、前記電極間に流れる基準電流の値を測定する工程と、
    　ｆ）目標とする電極間距離に対応するトンネル電流の値と、前記ｅ）で測定した前記基準電流の値とを加算して、目標合計電流値を算出する工程と、
    をさらに含み、
    　前記工程ｅ）および前記工程ｆ）は、前記工程ａ）の前に行われ、
    　前記工程ａ）は、
    　　ｑ１）前記時定数に基づいて算出された待機時間の間、待機する工程と、
    　　ｑ２）前記電極間のベース電流を測定する工程と、
    　　ｑ３）前記ベース電流の値が、前記工程ｆ）で算出した前記目標合計電流値に近づく方向に前記電極間距離を操作する工程と、
    を複数回繰り返す、電流測定方法。
  11. 　請求項５に記載の電流測定方法であって、
    　前記工程ｂ）および前記工程ｃ）の後であって、前記工程ａ）の前に、
    　　ｇ）前記電極間にトンネル電流が流れない電極間距離において、前記電極間に流れる基準電流の値を測定する工程と、
    　　ｈ）中間目標とする電極間距離に対応するトンネル電流の値と、前記工程ｇ）で測定した前記基準電流の値とを加算して、中間目標合計電流値を算出する工程と、
    をさらに含み、
    　前記工程ａ）は、
    　　ｒ１）前記時定数に基づいて算出された待機時間の間、待機する工程と、
    　　ｒ２）前記電極間のベース電流を測定する工程と、
    　　ｒ３）前記ベース電流の値が、前記工程ｈ）で算出した前記中間目標合計電流値に近づく方向に前記電極間距離を操作する工程と、
    を複数回繰り返し、
    　前記工程ａ）の後に、
    　　ｉ）中間目標とする電極間距離から最終目標とする電極間距離までの予め算出された操作量の操作を行うことにより、を前記最終目標と一致するように前記電極間距離を調整する工程
    をさらに含む、電流測定方法。
     
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