WO2015125920A1 - 生体分子シーケンシング装置用電極、生体分子シーケンシング装置、方法、及びプログラム - Google Patents

生体分子シーケンシング装置用電極、生体分子シーケンシング装置、方法、及びプログラム Download PDF

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upstream
electrode
biomolecule
shape
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川合　知二
正輝 谷口
敬人 大城
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国立大学法人大阪大学
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    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode

Definitions

  • the present invention relates to an electrode for a biomolecule sequencing apparatus, a biomolecule sequencing apparatus, a method, and a program.
  • sequencing of a single molecule constituting a biomolecule is determined by sequencing.
  • a biopolymer such as a sequence of amino acids constituting a protein, a sequence of nucleotides constituting a nucleic acid, and a sequence of monosaccharides constituting a sugar chain.
  • the protein sequence is determined by using HPLC (High Performance Liquid Chromatography) method, mass spectrometry, X-ray crystal structure analysis, Edman degradation method and the like by an enzymatic degradation method.
  • the single molecule electric measurement method that performs single molecule identification by tunnel current is a method that enables single molecule identification by directly measuring the electron energy state of a sample molecule.
  • the conventional method for introducing sample molecules in single-molecule electrical measurement methods uses an accidental probability event due to Brownian motion due to thermal fluctuations, so that molecules pass between sensing electrodes at a low frequency and molecules are detected. There was a problem that the accuracy was low.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and is an electrode for a biomolecule sequencing device, a biomolecule sequencing device, a method, and a method capable of identifying single molecules constituting a biomolecule with high accuracy.
  • the purpose is to provide a program.
  • the biomolecule sequencing apparatus electrode allows a tunnel current to flow when a biomolecule in which at least one kind of single molecule contained in a sample is linked passes through an opposing position.
  • the strength of the electric field at a position separated by a predetermined distance downstream from the facing position is greater than the strength of the electric field at a position spaced by the distance upstream from the facing position.
  • the shape of the upstream side and the shape of the downstream side of the electrode pair are made different so as to become stronger.
  • the strength of the electric field at a position spaced a predetermined distance downstream from the facing position of the electrode pair is stronger than the strength of the electric field at a position spaced by the distance upstream from the facing position.
  • the upstream shape and the downstream shape of the electrode pair are different. That is, the shape of the electrode pair is asymmetric between the upstream side, which is the biomolecule introduction side, and the downstream side, which is the biomolecule discharge side.
  • the electrophoresis force of the biomolecules in the sample can be promoted to induce a stable steady flow, and the biomolecules can be electrophoresed stably, so that single molecules can be identified with high accuracy. Can do.
  • the shape of the upstream upstream flow channel is a shape that gradually expands as the distance from the facing position to the upstream side, and the shape of the downstream downstream flow channel is from the facing position to the
  • the shape of the electrode pair is gradually expanded as the distance from the downstream side increases, and the upstream side shape and the downstream side of the electrode pair are set such that the expansion angle of the downstream channel is smaller than the expansion angle of the upstream channel.
  • the shape on the side may be different.
  • the length of the downstream channel in the orthogonal direction orthogonal to the opposing direction of the electrode pair is longer than the length of the upstream channel in the orthogonal direction.
  • the shape may be different from the downstream shape.
  • the length of the downstream flow path in the orthogonal direction is not less than 2 times and not more than 4 times the length of the upstream flow path in the orthogonal direction.
  • the length of the arc formed by the intersection of the circle centered between the narrowest electrodes of the electrode pair and the end of the downstream downstream flow path is such that the circle and the upstream upstream
  • the shape of the upstream side and the shape of the downstream side of the electrode pair may be made different so as to be shorter than the length of the arc formed by intersecting with the end portion of the side flow path.
  • an area of the downstream downstream flow path included in a predetermined range centering on a center between the narrowest electrodes of the electrode pair is an upstream upstream flow included in the predetermined range.
  • the shape of the upstream side and the shape of the downstream side of the electrode pair may be made different so as to be smaller than the area of the path.
  • the electrode pairs may be a plurality of electrode pairs having different inter-electrode distances.
  • the biomolecule sequencing apparatus of the present invention is a measurement for measuring a tunnel current generated when an electrode pair of the biomolecule sequencing apparatus electrode and the biomolecule sequencing apparatus electrode pair are opposed to each other. And an identification unit for identifying the type of at least one single molecule constituting the biomolecule based on the detected physical quantity obtained from the tunnel current measured by the measurement unit.
  • the biomolecule sequencing method of the present invention is a biomolecule sequencing method executed in a biomolecule sequencing apparatus including the electrode for the biomolecule sequencing apparatus, wherein the biomolecule is used for the biomolecule sequencing apparatus. Measures the tunnel current generated when the electrode passes through the opposing position of the electrode pair, and identifies the type of at least one single molecule constituting the biomolecule based on the detected physical quantity obtained from the measured tunnel current To do.
  • the biomolecule sequencing program of the present invention causes a computer to function as a measurement unit and an identification unit of the biomolecule sequencing apparatus.
  • single molecules constituting a biomolecule can be identified with high accuracy.
  • FIG. 4 is a partially enlarged view of FIG. 3. It is a figure for demonstrating the electric field which generate
  • the biomolecule sequencing apparatus 10 includes a nanogap electrode pair 12 (12a, 12b) as an electrode for a biomolecule sequencing apparatus, a measurement power supply 18, and an ammeter. 24 and the control part 26 are comprised. Each configuration will be described below.
  • the nanogap electrode pair 12 is composed of two opposing nanogap electrodes 12a and 12b.
  • the nanogap electrodes 12a and 12b are arranged at a distance such that a tunnel current flows when the single molecule 52 constituting the biomolecule contained in the sample 50 flows in the direction of arrow A in FIG. 1 and passes between the electrodes.
  • biomolecules include proteins, peptides, nucleic acids, sugar chains and the like that are biopolymers.
  • single molecules constituting biomolecules include, but are not limited to, amino acids constituting proteins or peptides, nucleotides constituting nucleic acids, monosaccharides constituting sugar chains, and the like.
  • the distance between the electrodes is too longer than the molecular diameter of the single molecule 52, it becomes difficult for a tunnel current to flow between the electrodes of the nanogap electrode pair 12, or two or more single molecules 52 are simultaneously attached to the nanogap electrode pair 12. Get in between.
  • the distance between the electrodes is too shorter than the molecular diameter of the single molecule 52, the single molecule 52 cannot enter between the electrodes of the nanogap electrode pair 12.
  • the distance between the electrodes is preferably slightly shorter than, equal to, or slightly longer than the molecular diameter of the single molecule 52.
  • the distance between the electrodes is 0.5 to 2 times the molecular diameter of the single molecule 52, preferably 1 to 1.5 times, and preferably 1 to 1.2 times. More preferably, the length is.
  • the specific manufacturing method of the nanogap electrode pair 12 is not particularly limited. An example of a manufacturing method is shown below.
  • the above-described nanogap electrode pair 12 can be manufactured by using a known nanofabricated mechanically-controllable break junction method.
  • This nano-machined mechanical fracture joining method is an excellent method capable of controlling the distance between electrodes excellent in mechanical stability with a resolution of picometer or less.
  • the material for the electrode include any metal such as gold.
  • the nanogap electrode pair 12 can be produced by the following procedure.
  • a flexible metal substrate coated with polyimide by nano-scale gold bonding by a known electron beam lithography and lift-off technique using an electron beam drawing apparatus manufactured by JEOL Ltd., catalog number: JSM6500F. Patterned on top.
  • the polyimide under the bonding is removed by etching based on a known etching method (reactive ion etching method or the like) using a reactive ion etching apparatus (manufactured by Samco, catalog number: 10NR).
  • a nanoscale gold bridge with a structure folded at three points is fabricated by bending the substrate.
  • the distance between the electrodes of the electrode pair can be controlled with a resolution of a picometer or less by precisely operating the bending of the substrate using a piezo actuator (manufactured by CEDRAT, catalog number: APA150M).
  • the produced bridge is pulled and a part of the bridge is broken. Further, the bridge is pulled, and the size of the gap (distance between the electrodes) generated by the breakage is set to the length of the target single molecule 52.
  • the single molecule 52 is an amino acid molecule constituting a peptide obtained by decomposing a protein that is a biopolymer into an appropriate length
  • the length is about 1 nm.
  • the distance between the electrodes of the electrode pair can be accurately controlled by adjusting the bridge tension using self-breaking technology (M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008) and M. Tsutsui. M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)).
  • a resistance feedback method (M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, using a data acquisition board (National Instruments, catalog number: NIPCIe-6321) 345 (2008) and M. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008)), under a stretch rate of the programmed junction, 10k ⁇ in series resistance Is used to apply a DC bias voltage (Vb) of 0.1 V to the bridge to pull the gold nanojunction and break the bridge. Then, the bridge is further pulled, and the size of the gap (distance between the electrodes) generated by the breakage is set to a target length. In this way, the nanogap electrode pair 12 is formed.
  • Vb DC bias voltage
  • the measurement power supply 18 applies a voltage to the nanogap electrode pair 12.
  • the magnitude of the voltage applied to the nanogap electrode pair 12 by the measurement power supply 18 is not particularly limited, and can be, for example, 0.25V to 0.75V.
  • the specific configuration of the measurement power supply 18 is not particularly limited, and a known power supply device can be used as appropriate.
  • the ammeter 24 measures a tunnel current generated when the single molecule 52 passes between the electrodes of the nanogap electrode pair 12 to which a voltage is applied by the measurement power supply 18.
  • the specific configuration of the ammeter 24 is not particularly limited, and a known current measuring device may be used as appropriate.
  • FIG. 2 shows an enlarged plan view of the gap between the electrodes of the nanogap electrode pair 12.
  • the nanogap electrodes 12a and 12b have a bilaterally symmetric shape, each having a narrow tip.
  • FIG. 3 shows an enlarged plan view of a region 60 indicated by a broken line in FIG.
  • the inter-electrode distance d of the nanogap electrode pair 12 is preferably slightly shorter than, equal to, or slightly longer than the molecular diameter of the single molecule 52, for example, several hundred pm. ⁇ 1.0 nm.
  • the tip portions of the nanogap electrodes 12a and 12b have a symmetrical shape, and the electric field at a position separated by a predetermined distance downstream from the facing position 64 where the distance between the electrodes is the narrowest.
  • the shape on the upstream side and the shape on the downstream side of the nanogap electrode pair 12 are made different so that the strength is stronger than the strength of the electric field at the position separated by the distance upstream from the facing position 64.
  • the shape on the upstream side refers to the shape on the upper side in FIG. 3 with respect to the facing position 64
  • the shape on the downstream side refers to the shape on the lower side in FIG.
  • the shape of the upstream upstream flow channel 62A in the flow channel through which the sample 50 flows is a shape that gradually expands as it moves away from the facing position 64 to the upstream side, and the downstream downstream flow channel.
  • the nanogap electrode is such that the shape of 62B gradually expands as it moves away from the facing position 64 toward the downstream side, and the expansion angle of the downstream flow channel 62B is smaller than the expansion angle of the upstream flow channel 62A.
  • the shapes on the upstream side and the downstream side of 12a and 12b are different.
  • the electric field lines of the electric field formed in the downstream flow path 62B are higher than the density of the electric field lines of the electric field formed in the upstream flow path 62A when a voltage is applied to the nanogap electrodes 12a and 12b.
  • the electric field strength at the position 68 ⁇ / b> B separated by the predetermined distance c downstream from the facing position 64 is equal to the electric field at the position 68 ⁇ / b> A separated by the same distance c upstream from the facing position 64. It becomes stronger than the strength of. Thereby, the electrophoretic force of the biomolecule contained in the sample 50 can be promoted to induce a stable steady flow, and the biomolecule can be stably electrophoresed. Can be identified.
  • the shape of the nanogap electrode pair 12 is such that the strength of the electric field at a position 68B separated by a predetermined distance c downstream from the facing position 64 is a position 68A separated by the same distance c upstream from the facing position 64. As long as the shape is different between the upstream side and the downstream side so as to be stronger than the electric field strength in FIG.
  • the circle centering on the center 70 between the narrowest electrodes intersects with the end of the downstream channel 62B (the end on the downstream side of the nanogap electrode pair 12).
  • the length of the circular arc formed in such a manner is shorter than the length of the circular arc formed by the intersection of the circle and the end of the upstream channel 62A (the upstream end of the nanogap electrode pair 12). It can also be said that the shape is different between the upstream side and the downstream side.
  • the nanogap electrode pair 12 shown in FIG. 4 has an upstream side in which the area of the downstream flow path 62B included in a predetermined range centered on the center 70 between the narrowest electrodes is included in the predetermined range. It can be said that the upstream side and the downstream side have different shapes so as to be smaller than the area of the flow path 62A.
  • the predetermined range is represented by a symmetrical shape such as a circle, a square, or a rectangle.
  • the nanogap electrode pair 12 is configured such that the length b of the downstream flow path 62B in the orthogonal direction A orthogonal to the facing direction B of the nanogap electrodes 12a and 12b is the upstream side in the orthogonal direction.
  • the shape is different between the upstream side and the downstream side so as to be longer than the length a of the flow path 62A.
  • the length a of the upstream flow path 62A is the distance from the facing position 64 to the upstream end 72A of the nanogap electrode pair 12, and the length of the downstream flow path 62B is from the facing position 64. This is the distance to the downstream end 72B of the nanogap electrode pair 12.
  • the length b of the downstream flow path 62B in the orthogonal direction A is preferably at least twice the length a of the upstream flow path 62A in the orthogonal direction A.
  • FIG. 5 when the upstream shape and the downstream shape of the nanogap electrode pair 12 are the same as in the prior art, that is, the length a of the upstream channel 62A and the length of the downstream channel 62B.
  • the graph of the base read time when the ratio to b was 1: 1 was shown.
  • a thick line 80 in the graph is a straight line representing an ideal base read time, which is about 1 ms per base.
  • a plurality of thin lines 82 in the graph represent the read time of each base, and a broken line 84 represents an average value of the plurality of thin lines 82.
  • the variation in the lead time is smaller as the plurality of thin wires 82 are closer to the broken line 84, and the ideal lead time is closer as the broken line 84 is closer to the thick line 80, but as shown in FIG. In this case, the variation of the plurality of thin lines 82 is large, and the broken line 84 is separated from the thick line 80.
  • FIG. 6 shows a graph of the base read time when the upstream shape and the downstream shape are different as in the nanogap electrode pair 12 according to the present embodiment.
  • FIG. 6 shows a graph of the base read time when the ratio of the length a of the upstream channel 62A to the length b of the downstream channel 62B is 1: 2.
  • the plurality of thin lines 82 are closer to the broken line 84, and it can be said that the variation in the lead time is small.
  • FIG. 7 shows a graph of the base read time when the ratio of the length a of the upstream flow path 62A to the length b of the downstream flow path 62B is 1: 4.
  • the plurality of thin lines 82 are closer to the broken line 84 and the variation in the lead time is small.
  • the broken line 84 approaches the thick line 80, and it can be said that the lead time is close to the ideal time.
  • FIG. 8 shows the result of measuring the nucleic acid base chain read time (ms) when the ratio of the length a of the upstream flow path 62A to the length b of the downstream flow path 62B is 1: Ratio. showed that.
  • the measurement result of FIG. 8 is the result of having measured the measurement acquisition speed of the signal according to the tunnel current as 10 kHz.
  • P Ratio in the figure is plotted at a position representing the average value of Ratio and lead time.
  • the vertical line VL around the P Ratio indicates the measured lead time range (variation)
  • horizontal lines HL centered on P Ratio indicates the measured Ratio range (variation).
  • the read time has a small variation around 1 ms, but as shown in FIG. 8, the ratio of 2 to 4 is preferable because the average read time is close to 1 ms and the variation is small.
  • the length b of the downstream flow path 62B is preferably not less than 2 times and not more than 4 times the length a of the upstream flow path 62A in the orthogonal direction A.
  • the control unit 26 controls each component of the biomolecule sequencing apparatus 10 and identifies the type of the single molecule 52 based on a signal corresponding to the measured tunnel current.
  • the control unit 26 can be configured by a computer having a CPU (Central Processing Unit), a RAM (Random Access Memory), a ROM (Read Only Memory) in which a biomolecule sequencing program described later is stored, and the like.
  • the control unit 26 configured by this computer can be functionally represented by a configuration including a measurement control unit 32 and an identification unit 34 as shown in FIG. Hereinafter, each part is explained in full detail.
  • the measurement control unit 32 controls the ammeter 24 so as to measure the tunnel current flowing between the electrodes of the nanogap electrode pair 12.
  • the measurement time of the tunnel current is not limited, but may be, for example, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 1 hour.
  • the measurement time may be appropriately set according to the length of the single molecule 52.
  • the measurement control unit 32 acquires the current value of the tunnel current measured by the ammeter 24, calculates conductance from the acquired current value, and creates a conductance-time profile.
  • the conductance can be calculated by dividing the current value of the tunnel current by the voltage V applied to the nanogap electrode pair 12 when the tunnel current is measured. By using the conductance, a uniform reference profile can be obtained even when the voltage value applied between the nanogap electrode pair 12 differs for each measurement. In addition, when the voltage value applied between the nanogap electrode pair 12 is made constant for each measurement, the current value of the tunnel current and the conductance can be handled equally.
  • the measurement control unit 32 may acquire the tunnel current measured by the ammeter 24 after having been amplified using a current amplifier.
  • a current amplifier By using a current amplifier, a weak tunnel current value can be amplified, so that the tunnel current can be measured with high sensitivity.
  • the current amplifier for example, a commercially available variable high-speed current amplifier (manufactured by Femto, catalog number: DHPCA-100) can be used.
  • the identification unit 34 compares the detected physical quantity obtained from the conductance-time profile created by the measurement control unit 32 with the relative conductance of the single molecule 52 of the known type stored in the relative conductance table 36.
  • the type of the single molecule 52 is identified.
  • the detected physical quantity is a conductance for each measurement point of the conductance-time profile created by the measurement control unit 32.
  • the relative conductance is the relative conductance for each type of the single molecule 52 measured from the single molecule 52 of the known type, and is the maximum value of the conductance measured for each type of the single molecule 52. It is calculated by dividing the conductance of one molecule.
  • the solution is not particularly limited.
  • ultrapure water can be used.
  • Ultrapure water can be produced, for example, by using Milli-Q Integral 3 (device name) (Milli-Q Integral 3/5/10/15 (catalog number)) manufactured by Millipore.
  • the concentration of the single molecule 52 in the solution is not particularly limited, but can be, for example, 0.01 to 1.0 ⁇ M.
  • the nanogap electrode pair 12 is arranged in the sample, and a voltage is applied to the nanogap electrode pair 12 by the measurement power source 18.
  • the CPU of the computer constituting the control unit 26 reads out and executes the biomolecule sequencing program stored in the ROM, so that the biomolecule sequencing apparatus 10 performs the biomolecule sequencing process shown in FIG. Is called.
  • step S10 the measurement control unit 32 controls the ammeter 24 to measure the tunnel current generated when the single molecule 52 passes between the electrodes of the nanogap electrode pair 12 for a predetermined time.
  • step S12 the measurement control unit 32 acquires the current value of the measured tunnel current, calculates conductance for each measurement point, and creates a conductance-time profile.
  • step S14 the identification unit 34 acquires the relative conductance of the single molecule 52 to be identified from the relative conductance table 36.
  • step S16 the identification unit 34 compares the conductance-time profile created in step S12 with the relative conductance obtained in step S14, and identifies the type of single molecule indicated by each signal.
  • step S18 the identification unit 34 outputs the identification result and ends the single molecule identification process.
  • the nanogap electrode is configured such that the strength of the electric field downstream from the facing position 64 is higher than the strength of the upstream electric field. Since the shape on the upstream side and the shape on the downstream side of the pair 12 are different, the electrophoretic force of the biomolecule contained in the sample 50 can be promoted to induce a stable steady flow. Since the electrophoresis can be stably performed, the single molecule 52 can be identified with high accuracy.
  • FIG. 11 shows a case where the upstream side shape and the downstream side shape of the nanogap electrode pair 12 are symmetrical as in the conventional case (Sim), and the upstream side of the nanogap electrode pair 12 as in this embodiment.
  • the results of measuring the number of reads for each base length to be read are shown for each of the cases where the shape and the downstream shape are asymmetric (Usim).
  • the number of leads is increased as a whole when the upstream shape and the downstream shape of the nanogap electrode pair 12 are asymmetric as in this embodiment.
  • the number of leads can be increased and lead conversion can be reduced by making the upstream shape and the downstream shape asymmetric. It turns out that you can.
  • the biomolecule sequencing apparatus 210 includes nanogap electrodes 12A, 12B, and 12C, a measurement power source 18, an ammeter 24, and a control unit 226. ing.
  • each of the nanogap electrodes 12a, 12B, and 12C is the same as that of the nanogap electrode pair 12 in the first embodiment.
  • Each of the nanogap electrodes 12A, 12B, and 12C is laminated via an insulator 14 so that the centers between the electrodes are aligned on the same axis. That is, a single passage through which the single molecule 52 passes is formed between the electrodes of the nanogap electrodes 12A, 12B, and 12C.
  • the distance between the electrodes of the nanogap electrode 12a is d1
  • the distance between the electrodes of the nanogap electrode pair 12B is d2
  • the distance between the electrodes of the nanogap electrode pair 12C is d3.
  • d1 1.0 nm
  • d2 0.7 nm
  • d3 0.5 nm.
  • control unit 226 can be represented by a configuration including a measurement control unit 232 and an identification unit 234.
  • the measurement control unit 232 controls the ammeter 24 so as to measure the tunnel current generated between each of the nanogap electrodes 12a, 12B, and 12C. Further, the measurement control unit 232 acquires the current value of the tunnel current for each interelectrode distance measured by the ammeter 24, calculates conductance, and creates a conductance-time profile for each interelectrode distance.
  • the identification unit 234 detects the physical quantity obtained from the conductance-time profile for each inter-electrode distance created by the measurement control unit 32, and the relative conductance of the single molecule 52 of the known type stored in the relative conductance table 236. To identify the type of the single molecule 52.
  • the nanogap electrodes 12A, 12B, and 12C are arranged in the sample, and a voltage is applied to each of the nanogap electrodes 12A, 12B, and 12C by the measurement power source 18.
  • the CPU of the computer constituting the control unit 226 reads and executes the biomolecule sequencing program stored in the ROM, so that the biomolecule sequencing apparatus 210 performs the biomolecule sequencing process shown in FIG. Is called.
  • step S20 the measurement control unit 232 controls the ammeter 24, and a tunnel generated when the single molecule 52 passes through one passage formed between each of the nanogap electrodes 12A, 12B, and 12C.
  • the current is measured for a predetermined time.
  • step S22 the measurement control unit 232 acquires the current value of the measured tunnel current, calculates conductance for each measurement point, and creates a conductance-time profile for each inter-electrode distance.
  • step S24 the identification unit 234 sets 1 to the variable i.
  • step S26 the identification unit 234 determines from the relative conductance table 236 the relative conductance of the single molecule 52 corresponding to the interelectrode distance di, that is, the relative of the single molecule 52 to be identified that can be identified by the interelectrode distance di. Get conductance.
  • step S28 the identification unit 234 compares the conductance-time profile of the interelectrode distance di created in step S22 with the relative conductance obtained in step S26, and the single molecule indicated by each signal Identify the type.
  • step S30 the identification unit 234 determines whether or not the processing has been completed for all the inter-electrode distances di. If there is an unprocessed inter-electrode distance di, the process proceeds to step S32, i is incremented by 1, and the process returns to step S26. When the process is completed for all the inter-electrode distances di, the process proceeds to step S34, the identification unit 234 outputs the identification result, and the biomolecule sequencing process is terminated.
  • the biomolecule sequencing apparatus by using the conductance obtained from the tunnel current generated between the nanogap electrodes having a plurality of interelectrode distances, In addition to the effects of the embodiment, the identification can be performed with higher accuracy.
  • the case where a plurality of nanogap electrode pairs having different interelectrode distances is provided has been described.
  • a mechanism for changing the interelectrode distance of one nanogap electrode pair may be provided.
  • the distance between the electrodes can be changed by adjusting the geometrical arrangement of the force point, the fulcrum, and the action point using the principle of leverage. More specifically, by pushing up a part of the nanogap electrode pair with a piezo element, the electrode end portion serving as the action point can be moved to change the inter-electrode distance.
  • the desired inter-electrode distance can be set based on the correspondence between the push-up distance of the piezo element and the inter-electrode distance.
  • the program has been described as an embodiment in which the program is installed in advance.
  • the program stored in an external storage device or recording medium is read as needed, and is downloaded and executed via the Internet. You may make it do.
  • the program can be provided by being stored in a computer-readable recording medium.

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Abstract

　ナノギャップ電極対１２は、試料に含まれる少なくとも１種類以上の単分子が連結した生体分子が対向位置を通過する際に、トンネル電流が流れるように配置された電極対であり、対向位置６４より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、対向位置６４より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、上流側の形状と下流側の形状とを異ならせた電極対である。

Description

生体分子シーケンシング装置用電極、生体分子シーケンシング装置、方法、及びプログラム
　本発明は、生体分子シーケンシング装置用電極、生体分子シーケンシング装置、方法、及びプログラムに関する。
　従来、タンパク質を構成するアミノ酸の配列、核酸を構成するヌクレオチドの配列、糖鎖を構成する単糖の配列など、生体分子、特に生体高分子を構成する単分子の配列をシーケンシングにより決定することが行われている。例えば、酵素分解法によるＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）法、質量分析、Ｘ線結晶構造解析、エドマン分解法等を用いて、タンパク質の配列を決定することが行われている。
　また、電極間距離を１ｎｍ以下に固定したナノギャップ電極を用いて、１分子を流れるトンネル電流を測定することにより、単分子識別を行うシーケンシング技術が提案されている。また、このような技術において、試料が流れる流路に関して様々な技術が提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。
特開２０１０－２２７７３５号公報 特開２０１２－１１０２５８号公報
　トンネル電流による単分子識別を行う単分子電気計測法は、試料分子の電子エネルギー状態を直接計測することによって単分子識別が可能となる方法である。従来の単分子電気計測法における試料分子の導入方法では、熱揺らぎによるブラウン運動による偶発的確率事象を利用しているため、分子がセンシング電極間を通過する頻度が低頻度であり且つ分子の検出精度が低精度である、という問題があった。
　溶液中の試料分子の導入方法としては、ポンプ圧や電気浸透流を用いた方法があるが、何れも分子スケールで制御できる定常流を誘起させることはできないため、分子がセンシング電極間を通過する頻度が低頻度となるのを解決するには不十分である。このため、従来のトンネル電流による単分子電気計測法では、高濃度の純粋試料溶液を用いるような限定的な条件におけるリシーケンシングを目的とする場合しか適用できない、という問題があった。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、生体分子を構成する単分子を高精度で識別することができる生体分子シーケンシング装置用電極、生体分子シーケンシング装置、方法、及びプログラムを提供することを目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子シーケンシング装置用電極は、試料に含まれる少なくとも１種類以上の単分子が連結した生体分子が対向位置を通過する際に、トンネル電流が流れるように配置された電極対を備え、前記対向位置より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、前記対向位置より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせている。
　この発明によれば、電極対の対向位置より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、前記対向位置より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、電極対の上流側の形状と下流側の形状とを異ならせている。すなわち、電極対の形状が、生体分子の導入側である上流側と、生体分子の排出側である下流側とで非対称となっている。これにより、試料の生体分子の電気泳動力を促進して安定的な定常流を誘起することができ、生体分子を安定的に電気泳動させることができるため、単分子を高精度で識別することができる。
　なお、前記上流側の上流側流路の形状が、前記対向位置から前記上流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であると共に、前記下流側の下流側流路の形状が、前記対向位置から前記下流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であり、前記下流側流路の拡がり角度が、前記上流側流路の拡がり角度よりも小さくなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせてもよい。
　また、前記電極対の対向方向と直交する直交方向における前記下流側流路の長さが、前記直交方向における前記上流側流路の長さよりも長くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせてもよい。
　また、前記直交方向における前記下流側流路の長さが、前記直交方向における前記上流側流路の長さの２倍以上で且つ４倍以下であることが好ましい。
　また、前記電極対の最も狭い電極間の中心を中心とする円と前記下流側の下流側流路の端部とが交わって形成される円弧の長さが、前記円と前記上流側の上流側流路の端部とが交わって形成される円弧の長さより短くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせてもよい。
　また、前記電極対の最も狭い電極間の中心を中心とする予め定めた範囲に含まれる前記下流側の下流側流路の面積が、前記予め定めた範囲に含まれる前記上流側の上流側流路の面積より小さくなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせてもよい。
　また、前記電極対を、電極間距離が各々異なる複数の電極対としてもよい。
　本発明の生体分子シーケンシング装置は、前記生体分子シーケンシング装置用電極と、前記生体分子が前記生体分子シーケンシング装置用電極の電極対の対向位置を通過したときに生じるトンネル電流を測定する測定部と、前記測定部により測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて、前記生体分子を構成する少なくとも１種類の単分子の種類を識別する識別部と、を備える。
　本発明の生体分子シーケンシング方法は、前記生体分子シーケンシング装置用電極を備えた生体分子シーケンシング装置において実行される生体分子シーケンシング方法であって、前記生体分子が前記生体分子シーケンシング装置用電極の電極対の対向位置を通過したときに生じるトンネル電流を測定し、測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて、前記生体分子を構成する少なくとも１種類の単分子の種類を識別する。
　本発明の生体分子シーケンシングプログラムは、コンピュータを、前記生体分子シーケンシング装置の測定部及び識別部として機能させる。
　本発明によれば、生体分子を構成する単分子を高精度に識別することができる。
第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置の構成を示す概略図である。 第１の実施の形態におけるナノギャップ電極対の周辺の拡大図である。 図３の一部拡大図である。 ナノギャップ電極対に電圧が印加されることにより発生する電界について説明するための図である。 ナノギャップ電極対の上流側流路の長さと下流側流路の長さとの比が１：１の場合におけるリード時間の測定結果を示す図である。 ナノギャップ電極対の上流側流路の長さと下流側流路の長さとの比が１：２の場合におけるリード時間の測定結果を示す図である。 ナノギャップ電極対の上流側流路の長さと下流側流路の長さとの比が１：４の場合におけるリード時間の測定結果を示す図である。 ナノギャップ電極対の上流側流路の長さに対する下流側流路の長さとリード時間との関係の測定結果を示す図である。 第１の実施の形態における制御部の機能的構成を示すブロック図である。 第１の実施の形態における生体分子シーケンシング処理を示すフローチャートである。 読み取る塩基の長さ毎にリード数を測定した結果を示すグラフである。 リード転換の回数に対する正常にリードできた回数の割合毎にリード数を測定した結果を示すグラフである。 第２の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置の構成を示す概略図である。 第２の実施の形態における制御部の機能的構成を示すブロック図である。 第２の実施の形態における生体分子シーケンシング処理を示すフローチャートである。
　以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。以下の実施の形態では、電極間を単分子が通過した際に流れるトンネル電流を測定することにより生体分子をシーケンシングする場合について説明する。
＜第１の実施の形態＞
　図１に示すように、第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置１０は、生体分子シーケンシング装置用電極としてのナノギャップ電極対１２（１２ａ、１２ｂ）、測定用電源１８、電流計２４、及び制御部２６を含んで構成されている。以下に、各構成について説明する。
　ナノギャップ電極対１２は、対向する２つのナノギャップ電極１２ａ、１２ｂにより構成されている。ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂは、試料５０に含まれる生体分子を構成する単分子５２が図１における矢印Ａ方向に流れて電極間を通過する際に、トンネル電流が流れるような距離を隔てて配置されている。ここで、生体分子には、生体高分子であるタンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖等が含まれる。また、生体分子を構成する単分子には、タンパク質またはペプチドを構成するアミノ酸、核酸を構成するヌクレオチド、糖鎖を構成する単糖等が含まれるが、これらに限られるものではない。
　電極間距離が、単分子５２の分子直径よりも長すぎると、ナノギャップ電極対１２の電極間にトンネル電流が流れ難くなったり、２つ以上の単分子５２が、同時にナノギャップ電極対１２の間に入り込んだりする。反対に、電極間距離が単分子５２の分子直径よりも短すぎると、ナノギャップ電極対１２の電極間に単分子５２が入り込めなくなる。
　電極間距離が、単分子５２の分子直径よりも長すぎたり、短すぎたりすると、単分子５２を介したトンネル電流を検出することが困難になる。よって、電極間距離は、単分子５２の分子直径よりも少し短いか、等しいか、または、それよりも少し長い程度であることが好ましい。例えば、電極間距離は、単分子５２の分子直径の０．５倍～２倍の長さであり、１倍～１．５倍の長さであることが好ましく、１倍～１．２倍の長さであることがより好ましい。
　ナノギャップ電極対１２の具体的な作製方法は特に限定されない。以下に、作製方法の一例を示す。
　上述したナノギャップ電極対１２は、公知のナノ加工機械的破断接合法（nanofabricated mechanically-controllable break junctions)を用いることによって作製することができる。このナノ加工機械的破断接合法は、ピコメーター以下の分解能にて、機械的安定性に優れた電極間距離を制御することができる優れた方法である。ナノ加工機械的破断接合法を用いた電極対の作製方法は、例えば、J. M. van Ruitenbeek, A. Alvarez, I. Pineyro, C. Grahmann, P. Joyez, M. H. Devoret, D. Esteve, C. Urbina, Rev. Sci. Instrum. 67. 108 (1996）またはM. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008）に記載されている。電極の材料としては、金などの任意の金属が挙げられる。
　例えば、以下に示す手順によってナノギャップ電極対１２を作製することができる。
　まず、ナノスケールの金の接合を、電子線描画装置（日本電子社製、カタログ番号：ＪＳＭ６５００Ｆ）を用いて、公知の電子ビームリソグラフィー及びリフトオフ技術によって、ポリイミドでコーティングされた可撓性の金属基板上にパターン成形する。次いで、この接合の下にあるポリイミドを、反応性イオンエッチング装置（サムコ社製、カタログ番号：１０ＮＲ）を用いて、公知のエッチング法（反応性イオンエッチング法など）に基づくエッチングによって取り除く。
　そして、基板を折り曲げることによって、３点にて折り曲げられた構造のナノスケールの金のブリッジを作製する。この場合、ピエゾアクチュエータ（CEDRAT社製、カタログ番号：ＡＰＡ１５０Ｍ）を用いて基板の折曲げを精密に操作することによって、電極対の電極間距離をピコメーター以下の分解能にて制御することができる。
　次いで、作製したこのブリッジを引っ張り、ブリッジの一部を破断させる。さらにブリッジを引っ張り、破断によって生じたギャップの大きさ（電極間距離）が目的の単分子５２の長さになるように設定する。例えば単分子５２が、生体高分子であるタンパク質を適当な長さに分解したペプチドを構成するアミノ酸分子である場合、その長さは約１ｎｍである。この場合、自己破断技術を利用してブリッジの引っ張りを調節することによって電極対の電極間距離を正確に制御することができる（M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008）、及びM. Tsutsui. M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008）参照）。
　具体的には、データ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ社製、カタログ番号：NIPCIe-6321）を用いて、レジスタンスフィードバック法（M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 （2008）、及びM. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 （2008）参照）によって、プログラミングされた接合の引き延ばし速度の下で、１０ｋΩの直列の抵抗を用いて、０．１ＶのＤＣバイアス電圧（Ｖｂ）をこのブリッジに印加して、金のナノ接合を引っ張り、ブリッジを破断させる。そして、ブリッジをさらに引っ張り、破断によって生じたギャップの大きさ（電極間距離）が、目的の長さになるように設定する。このようにして、ナノギャップ電極対１２を形成する。
　測定用電源１８は、ナノギャップ電極対１２に対して電圧を印加する。測定用電源１８によってナノギャップ電極対１２に印加する電圧の大きさは特に限定されず、例えば、０．２５Ｖ～０．７５Ｖとすることができる。測定用電源１８の具体的な構成は特に限定されず、適宜、公知の電源装置を用いることが可能である。
　電流計２４は、測定用電源１８により電圧が印加されたナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２が通過した際に生じるトンネル電流を測定する。電流計２４の具体的な構成は特に限定されず、適宜、周知の電流測定装置を用いればよい。
　次に、生体分子シーケンシング装置１０のナノギャップ電極対１２周辺の具体的な構成について説明する。
　図２には、ナノギャップ電極対１２の電極間周辺の拡大平面図を示した。図２に示すように、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂは左右対称の形状であり、各々先端部が細くなっている。
　図３には、図２の破線で示した領域６０の拡大平面図を示した。ナノギャップ電極対１２の電極間距離ｄは、前述したように、単分子５２の分子直径よりも少し短いか、等しいか、または、それよりも少し長い程度であることが好ましく、例えば数百ｐｍ～１．０ｎｍである。
　また、図３に示すように、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂの先端部は左右対称の形状であり、電極間が最も狭くなる対向位置６４より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、対向位置６４より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、ナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを異ならせている。ここで、上流側の形状とは、対向位置６４よりも図３において上側の形状をいい、下流側の形状とは、対向位置６４よりも図３において下側の形状をいう。
　具体的には、試料５０が流れる流路のうち上流側の上流側流路６２Ａの形状が、対向位置６４から上流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であると共に、下流側の下流側流路６２Ｂの形状が、対向位置６４から下流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であり、下流側流路６２Ｂの拡がり角度が、上流側流路６２Ａの拡がり角度よりも小さくなるように、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂの上流側の形状と下流側の形状とを異ならせている。
　これにより、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂに電圧が印加された際に上流側流路６２Ａに形成される電界の電気力線の密度よりも、下流側流路６２Ｂに形成される電界の電気力線の密度の方が高くなる。
　従って、図４に示すように、対向位置６４より下流側に予め定めた距離ｃだけ離間した位置６８Ｂにおける電界の強さは、対向位置６４より上流側に同じ距離ｃだけ離間した位置６８Ａにおける電界の強さより強くなる。これにより、試料５０に含まれる生体分子の電気泳動力を促進して安定的な定常流を誘起することができ、生体分子を安定的に電気泳動させることができるため、単分子５２を高精度で識別することができる。
　なお、ナノギャップ電極対１２の形状は、対向位置６４より下流側に予め定めた距離ｃだけ離間した位置６８Ｂにおける電界の強さが、対向位置６４より上流側に同じ距離ｃだけ離間した位置６８Ａにおける電界の強さより強くなるように、上流側と下流側とで形状を異ならせたものであれば、図３、４に示した形状に限られるものではない。
　また、図４に示すナノギャップ電極対１２は、最も狭い電極間の中心７０を中心とする円と下流側流路６２Ｂの端部（ナノギャップ電極対１２の下流側の端部）とが交わって形成される円弧の長さが、前記円と上流側流路６２Ａの端部（ナノギャップ電極対１２の上流側の端部）とが交わって形成される円弧の長さより短くなるように、上流側と下流側とで形状を異ならせたものということもできる。
　また、図４に示すナノギャップ電極対１２は、最も狭い電極間の中心７０を中心とする予め定めた範囲に含まれる下流側流路６２Ｂの面積が、前記予め定めた範囲に含まれる上流側流路６２Ａの面積より小さくなるように、上流側と下流側とで形状を異ならせたものということもできる。ここで、予め定めた範囲は、例えば円、正方形、長方形等の対称な形状で表される。
　また、図３に示すように、ナノギャップ電極対１２は、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂの対向方向Ｂと直交する直交方向Ａにおける下流側流路６２Ｂの長さｂが、前記直交方向における上流側流路６２Ａの長さａよりも長くなるように、上流側と下流側とで形状を異ならせている。ここで、上流側流路６２Ａの長さａは、対向位置６４からナノギャップ電極対１２の上流側の端部７２Ａまでの距離であり、下流側流路６２Ｂの長さは、対向位置６４からナノギャップ電極対１２の下流側の端部７２Ｂまでの距離である。
　そして、直交方向Ａにおける下流側流路６２Ｂの長さｂが、直交方向Ａにおける上流側流路６２Ａの長さａの２倍以上であることが好ましい。
　図５には、従来のように、ナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とが同一の場合、すなわち上流側流路６２Ａの長さａと下流側流路６２Ｂの長さｂとの比が１：１の場合における塩基のリード時間のグラフを示した。グラフ中の太線８０は、塩基のリード時間の理想を表す直線であり、１塩基当たり約１ｍｓである。また、グラフ中の複数の細線８２は、各塩基のリード時間を表しており、破線８４は、複数の細線８２の平均値を表す。ここで、複数の細線８２が破線８４に近づくほどリード時間のばらつきが小さいと言え、破線８４が太線８０に近づくほど理想のリード時間に近いと言えるが、図５に示すように、従来構成の場合は、複数の細線８２のばらつきが大きく且つ破線８４は太線８０から離れている。
　図６には、本実施形態に係るナノギャップ電極対１２のように、上流側の形状と下流側の形状とを異ならせた場合における塩基のリード時間のグラフを示した。図６は、上流側流路６２Ａの長さａと下流側流路６２Ｂの長さｂとの比が１：２の場合における塩基のリード時間のグラフを示した。図６に示すように、図５の従来構成の場合と比較すると、複数の細線８２が破線８４により近づいており、リード時間のばらつきが小さいと言える。
　また、図７には、上流側流路６２Ａの長さａと下流側流路６２Ｂの長さｂとの比が１：４の場合における塩基のリード時間のグラフを示した。図７に示すように、図５の従来構成の場合と比較すると、複数の細線８２が破線８４に近づいており、リード時間のばらつきが小さいと言える。また、破線８４が太線８０に近づいており、リード時間が理想の時間に近いと言える。
　また、図８には、上流側流路６２Ａの長さａと下流側流路６２Ｂの長さｂとの比を１：Ｒａｔｉｏとした場合における核酸塩基鎖のリード時間（ｍｓ）を測定した結果を示した。なお、図８の測定結果は、トンネル電流に応じたシグナルの計測取得速度を１０ｋＨｚとして測定した結果である。また、図中のＰＲａｔｉｏは、Ｒａｔｉｏ及びリード時間の各々の平均値を表す位置にプロットされている。また、ＰＲａｔｉｏを中心とした縦線ＶＬは、測定したリード時間の範囲（ばらつき）を示し、ＰＲａｔｉｏを中心とした横線ＨＬは、測定したＲａｔｉｏの範囲（ばらつき）を示している。リード時間は、１ｍｓ付近にばらつきが小さくなることが理想的であるが、図８に示すように、Ｒａｔｉｏ＝２～４の場合がリード時間の平均値が１ｍｓに近く且つばらつきが小さいため好ましい。
　以上より、下流側流路６２Ｂの長さｂは、直交方向Ａにおける上流側流路６２Ａの長さａの２倍以上で且つ４倍以下であることが好ましい。
　制御部２６は、生体分子シーケンシング装置１０の各構成を制御すると共に、測定されたトンネル電流に応じたシグナルに基づいて、単分子５２の種類を識別する。
　制御部２６は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、及び後述する生体分子シーケンシングプログラムが格納されたＲＯＭ（Read Only Memory）等を備えたコンピュータで構成することができる。このコンピュータで構成される制御部２６は、機能的には、図９に示すように、測定制御部３２及び識別部３４を含んだ構成で表すことができる。以下、各部について詳述する。
　測定制御部３２は、ナノギャップ電極対１２の電極間に流れるトンネル電流を測定するように電流計２４を制御する。トンネル電流の測定時間は限定されないが、例えば、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間とすることができる。測定時間は、単分子５２の長さに応じて適宜設定すればよい。
　また、測定制御部３２は、電流計２４で測定されたトンネル電流の電流値を取得し、取得した電流値からコンダクタンスを計算し、コンダクタンス－時間プロファイルを作成する。コンダクタンスは、トンネル電流を測定した際にナノギャップ電極対１２に印加されていた電圧Ｖで、トンネル電流の電流値を除することにより、計算することができる。コンダクタンスを用いることにより、ナノギャップ電極対１２間に印加する電圧値が測定毎に異なる場合でも、統一された基準のプロファイルを得ることができる。なお、測定毎にナノギャップ電極対１２間に印加する電圧値を一定とした場合には、トンネル電流の電流値とコンダクタンスとは、同等に扱うことができる。
　また、測定制御部３２は、電流計２４で測定されたトンネル電流を、電流増幅器を用いて一旦増幅してから取得するようにしてもよい。電流増幅器を用いることによって、微弱なトンネル電流の値を増幅することができるため、トンネル電流を高感度に測定することが可能となる。電流増幅器としては、例えば、市販の可変高速電流アンプ(Femto社製、カタログ番号：ＤＨＰＣＡ－１００）を用いることができる。
　識別部３４は、測定制御部３２により作成されたコンダクタンス－時間プロファイルから得られる検出物理量と、相対コンダクタンステーブル３６に格納された、種類が既知の単分子５２についての相対コンダクタンスとを比較することにより、単分子５２の種類を識別する。本実施の形態では、検出物理量は、測定制御部３２により作成されたコンダクタンス－時間プロファイルの測定点毎のコンダクタンスである。ここで、相対コンダクタンスは、種類が既知の単分子５２から測定した、単分子５２の種類毎の相対コンダクタンスであり、単分子５２の種類毎に測定したコンダクタンスの最大値で、単分子５２それぞれの１分子のコンダクタンスを除することにより算出したものである。
　次に、第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置１０の作用について説明する。
　まず、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子５２を溶液に溶解させる。溶液は、特に限定されない。例えば、超純水を用いることができる。超純水は、例えば、ミリポア社のMilli-Q Integral 3 （装置名）（Milli-Q Integral 3/5/10/15 （カタログ番号））を用いることによって作製することができる。溶液中の単分子５２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１．０μＭとすることができる。
　そして、試料中にナノギャップ電極対１２を配置し、測定用電源１８により、ナノギャップ電極対１２に電圧を印加する。そして、制御部２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭに格納された生体分子シーケンシングプログラムを読み出して実行することにより、生体分子シーケンシング装置１０により、図１０に示す生体分子シーケンシング処理が行われる。
　ステップＳ１０では、測定制御部３２が、電流計２４を制御し、ナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２が通過する際に生じたトンネル電流を、所定時間測定させる。
　次に、ステップＳ１２で、測定制御部３２が、測定されたトンネル電流の電流値を取得し、測定点毎にコンダクタンスを計算し、コンダクタンス－時間プロファイルを作成する。
　次に、ステップＳ１４で、識別部３４が、相対コンダクタンステーブル３６から、識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを取得する。
　次に、ステップＳ１６で、識別部３４が、上記ステップＳ１２で作成されたコンダクタンス－時間プロファイルと、上記ステップＳ１４で取得した相対コンダクタンスとを比較して、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。次に、ステップＳ１８で、識別部３４が、識別結果を出力して、単分子識別処理を終了する。
　以上説明したように、第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置によれば、　対向位置６４より下流側の電界の強さが上流側の電界の強さより強くなるように、ナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを異ならせているので、試料５０に含まれる生体分子の電気泳動力を促進して安定的な定常流を誘起することができ、生体分子を安定的に電気泳動させることができるため、単分子５２を高精度で識別することができる。
　図１１には、従来のようにナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを対称にした場合（Ｓｉｍ）と、本実施形態のように、ナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを非対称にした場合（Ｕｓｉｍ）と、の各々について、読み取る塩基の長さ毎にリード数を測定した結果を示した。図１１に示すように、本実施形態のようにナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを非対称にした方が、全体的にリード数が増加しているのが判る。
　また、図１２には、上記と同様にナノギャップ電極対１２が従来構成の場合（Ｓｉｍ）と本実施形態の場合（Ｕｓｉｍ）との各々について、塩基の泳動方向が転換してしまうリード転換の回数に対する正常にリードできた回数の割合毎に、リード数を測定した結果を示した。図１２に示すように、横軸の数値が大きいほどリード転換の発生頻度が少ないことを示すが、従来構成と比較して本発明の方がリード転換が減少し、正常のリードできる頻度が高いことが判る。
　このように、本実施形態に係るナノギャップ電極対１２のように、上流側の形状と下流側の形状とを非対称にすることにより、リード数を増加させることができると共に、リード転換を減少させることができることが判った。
＜第２の実施の形態＞
　次に、第２の実施の形態について説明する。なお、第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置１０と同一の部分については、同一符号を付して詳細な説明を省略する。
　図１３に示すように、第２の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置２１０は、ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、測定用電源１８、電流計２４、及び制御部２２６を含んで構成されている。
　ナノギャップ電極１２ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の構成は、第１の実施の形態におけるナノギャップ電極対１２と同様である。ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々は、各電極間の中心が同一軸上に並ぶように、絶縁体１４を介して積層されている。すなわち、ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間により、単分子５２が通過する一つの通路を形成している。ナノギャップ電極１２ａの電極間距離はｄ１、ナノギャップ電極対１２Ｂの電極間距離はｄ２、ナノギャップ電極対１２Ｃの電極間距離はｄ３で各々異なる。図１３の例では、ｄ１＞ｄ２＞ｄ３である。例えば、ｄ１＝１．０ｎｍ、ｄ２＝０．７ｎｍ、ｄ３＝０．５ｎｍとすることができる。
　制御部２２６は、図１４に示すように、測定制御部２３２及び識別部２３４を備えた構成で表すことができる。
　測定制御部２３２は、ナノギャップ電極１２ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間で生じたトンネル電流を、各々測定するように電流計２４を制御する。また、測定制御部２３２は、電流計２４で測定された電極間距離毎のトンネル電流の電流値を取得してコンダクタンスを計算し、電極間距離毎のコンダクタンス－時間プロファイルを作成する。
　識別部２３４は、測定制御部３２により作成された電極間距離毎のコンダクタンス－時間プロファイルから得られる検出物理量と、相対コンダクタンステーブル２３６に格納された、種類が既知の単分子５２についての相対コンダクタンスとを比較することにより、単分子５２の種類を識別する。
　次に、第２の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置２１０を用いて行われる生体分子シーケンシング方法について説明する。
　まず、第１の実施の形態と同様に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子５２を溶液に溶解させる。そして、試料中にナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃを配置し、測定用電源１８により、ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々に電圧を印加する。そして、制御部２２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭに格納された生体分子シーケンシングプログラムを読み出して実行することにより、生体分子シーケンシング装置２１０により、図１５に示す生体分子シーケンシング処理が行われる。
　ステップＳ２０では、測定制御部２３２が、電流計２４を制御し、ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間により形成された一つの通路を、単分子５２が通過する際に生じたトンネル電流を、所定時間測定させる。
　次に、ステップＳ２２で、測定制御部２３２が、測定されたトンネル電流の電流値を取得し、測定点毎にコンダクタンスを計算し、コンダクタンス－時間プロファイルを、電極間距離毎に作成する。
　次に、ステップＳ２４で、識別部２３４が、変数ｉに１を設定する。
　次に、ステップＳ２６で、識別部２３４が、相対コンダクタンステーブル２３６から、電極間距離ｄｉに対応した単分子５２の相対コンダクタンス、すなわち、電極間距離ｄｉで識別可能な識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを取得する。
　次に、ステップＳ２８で、識別部２３４が、上記ステップＳ２２で作成された電極間距離ｄｉのコンダクタンス－時間プロファイルと、上記ステップＳ２６で取得した相対コンダクタンスとを比較して、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。
　次に、ステップＳ３０で、識別部２３４が、全ての電極間距離ｄｉについて処理を終了したか否かを判定する。未処理の電極間距離ｄｉが存在する場合には、ステップＳ３２へ移行して、ｉを１インクリメントして、ステップＳ２６へ戻る。全ての電極間距離ｄｉについて処理が終了した場合には、ステップＳ３４へ移行して、識別部２３４が、識別結果を出力して、生体分子シーケンシング処理を終了する。
　以上説明したように、第２の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置によれば、複数の電極間距離のナノギャップ電極間で生じたトンネル電流から得られたコンダクタンスを用いることで、第１の実施の形態の効果に加え、より精度の高い識別を行うことができる。
　また、第２の実施の形態では、電極間距離が異なる複数のナノギャップ電極対を設ける場合について説明したが、１つのナノギャップ電極対の電極間距離を変更する機構を設けた構成としてもよい。例えば、てこの原理を利用して、力点、支点、及び作用点の幾何学的配置を調整することで、電極間距離を変更する構成とすることができる。より具体的には、ピエゾ素子によりナノギャップ電極対の一部を押し上げることにより、作用点となる電極端部を移動させて、電極間距離を変更する構成とすることができる。この場合、ピエゾ素子の押し上げ距離と電極間距離との対応関係に基づいて、所望の電極間距離に設定することができる。
　また、本発明は、上記各実施形態で説明した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、本願明細書中において、プログラムが予めインストールされている実施の形態として説明したが、外部の記憶装置や記録媒体等に格納されたプログラムを随時読み込んで、またインターネットを介してダウンロードして実行するようにしてもよい。また、当該プログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して提供することも可能である。
１０、２１０ 生体分子シーケンシング装置
１２、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ ナノギャップ電極対
１８ 測定用電源
２４ 電流計
２６、２２６ 制御部
３２、２３２ 測定制御部
３４、２３４ 識別部
３６、２３６ 相対コンダクタンステーブル
５０ 試料
５２ 単分子

Claims (10)

  1. 　試料に含まれる少なくとも１種類以上の単分子が連結した生体分子が対向位置を通過する際に、トンネル電流が流れるように配置された電極対を備え、
    　前記対向位置より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、前記対向位置より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
    　生体分子シーケンシング装置用電極。
  2. 　前記上流側の上流側流路の形状が、前記対向位置から前記上流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であると共に、前記下流側の下流側流路の形状が、前記対向位置から前記下流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であり、前記下流側流路の拡がり角度が、前記上流側流路の拡がり角度よりも小さくなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
    　請求項１記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
  3. 　前記電極対の対向方向と直交する直交方向における前記下流側流路の長さが、前記直交方向における前記上流側流路の長さよりも長くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
    　請求項２記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
  4. 　前記直交方向における前記下流側流路の長さが、前記直交方向における前記上流側流路の長さの２倍以上で且つ４倍以下である
    　請求項３記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
  5. 　前記電極対の最も狭い電極間の中心を中心とする円と前記下流側の下流側流路の端部とが交わって形成される円弧の長さが、前記円と前記上流側の上流側流路の端部とが交わって形成される円弧の長さより短くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
    　請求項１～４の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
  6. 　前記電極対の最も狭い電極間の中心を中心とする予め定めた範囲に含まれる前記下流側の下流側流路の面積が、前記予め定めた範囲に含まれる前記上流側の上流側流路の面積より小さくなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
    　請求項１～５の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
  7. 　前記電極対を、電極間距離が各々異なる複数の電極対とした
    　請求項１～６の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
  8. 　請求項１～７の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極と、
    　前記生体分子が前記生体分子シーケンシング装置用電極の電極対の対向位置を通過したときに生じるトンネル電流を測定する測定部と、
    　前記測定部により測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて、前記生体分子を構成する少なくとも１種類の単分子の種類を識別する識別部と、
    　を備えた生体分子シーケンシング装置。
  9. 　請求項１～７の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極を備えた生体分子シーケンシング装置において実行される生体分子シーケンシング方法であって、
    　前記生体分子が前記生体分子シーケンシング装置用電極の電極対の対向位置を通過したときに生じるトンネル電流を測定し、
    　測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて、前記生体分子を構成する少なくとも１種類の単分子の種類を識別する
    　生体分子シーケンシング方法。
  10. 　コンピュータを、
    　請求項８記載の生体分子シーケンシング装置の測定部及び識別部として機能させるための生体分子シーケンシングプログラム。
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