JP2021130694A - 腫瘍バイオマーカー及びその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＷＮＴシグナル伝達経路に関連するバイオマーカー、ならびに方法及びそれを含む組成物を提供する。【解決手段】癌と診断され、そうした治療を必要としている対象における、Ｒ−スポンジン融合体の発現を特徴とする癌の治療方法であって、ポーキュパインのアンタゴニストの治療有効量を含む医薬組成物を、癌と診断された対象に投与することを含み、前記対象が、Ｒ−スポンジン融合体を有すると判定されている、方法である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体は参照によって本明細書に完全に援用される、２０１５年５月２６日に出願された米国特許仮出願第６２／１６６，３０５号明細書の利益及び優先権を主張する。
技術分野
本発明は、ＷＮＴシグナル伝達経路に関連するバイオマーカー、ならびに方法及びそれを含む組成物に関する。さらに本発明は、患者選択、比較診断、及び癌治療における該バイオマーカーの使用に関する。
癌は、世界中の人々が冒される疾患クラスである。一般に、良性腫瘍の細胞はその分化した特徴を保持し、完全に制御されない様式で分裂しない。良性腫瘍は、通常、局在化しており非転移性である。
悪性腫瘍では、細胞は未分化になり、体の増殖制御シグナルに応答せず、制御されない様式で増殖する。悪性腫瘍は、一般に２つのカテゴリー、すなわち原発性及び続発性に分けられる。原発腫瘍は、それが発見される組織から直接的に生じる。続発腫瘍は、原発腫瘍から発生する可能性もあるし、体の他の部位で発生する可能性もあり、遠位部位へ拡散（転移性）または転移することができる。転移の共通経路は、隣接する構造体への直接的な増殖、脈管もしくはリンパ系を介する拡散または血流である。
ＷＮＴシグナル伝達は、成体動物において、胚形成及び恒常性維持の両方に重要である。ＷＮＴ経路は、以下のプロセスを調節するタンパク質のネットワークを一般に含む：（１）、ＷＮＴタンパク質の生成及び分泌；（２）、細胞受容体とのＷＮＴの結合；（３）、この相互作用によって誘発される生化学的反応の細胞内伝達（Ｍｉｋｅｌｓ及びＮｕｓｓｅ、２００６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、２００９；Ｍｏｏｎ、２００５）。
細胞表面共受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ＬＲＰ５／６へのＷＮＴタンパク質の結合によって誘発される、いわゆる古典的ＷＮＴ経路は、β−カテニンがＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子と相互作用して特定の遺伝子の転写を促進する場である核に到達するβ−カテニン量を変化させる。
異なるセットの細胞内タンパク質によって伝達される非古典的ＷＮＴ経路は、昆虫の平面内細胞極性及び脊椎動物の原腸胚形成などのいくつかのプロセスを制御する。
ＷＮＴシグナル伝達は、胚性幹細胞及び成体幹細胞の多能性及び分化の制御におけるその役割についても知られている（Ｎｕｓｓｅ、２００８）。例えば、原腸胚形成間の原条形成胚様体における局在的ＷＮＴ活性化と関係があった（Ｔｅｎ Ｂｅｒｇｅ、２００８）。胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞からの、いくつかの細胞型、例えば心臓細胞、膵β細胞、ドーパミン作動性ニューロン及び肝細胞の誘導は、ＷＮＴモジュレーションの影響を受ける（Ｙａｎｇ、２００８；Ｄ’Ａｍｏｕｒ、２００６；Ｉｎｅｓｔｒｏｓａ及びＡｒｅｎａｓ、２０１０；Ｓｕｌｌｉｖａｎ、２０１０）。ＷＮＴ経路は、骨形成及び軟骨形成などの骨格組織の発達において特に重要な役割を果たす（Ｈｏｅｐｐｎｅｒ、２００９；Ｃｈｕｎ、２００８）。ＷＮＴシグナル伝達は、成体の中枢神経系の神経再生とも関係がある（Ｌｉｅ、２００５）。
疾患は、ＷＮＴ経路活性の変化から生じ得る。例えば、古典的ＷＮＴ経路の過剰な活性化は、異常な細胞増殖をもたらし得る（Ｒｅｙａ及びＣｌｅｖｅｒｓ、２００５）。特に、結腸直腸癌の９０％は、ＷＮＴ／β−カテニン経路のサプレッサーである大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子の欠損によって惹起される（Ｋｉｎｚｌｅｒ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９９６）。ＷＮＴタンパク質の発現増大、及び通常はＷＮＴタンパク質の機能を抑制する細胞外インヒビターの欠損は、ＷＮＴ依存性腫瘍を引き起こす可能性がある（Ｐｏｌａｋｉｓ、２００７）。一方で、非古典的ＷＮＴ経路も、ある種の癌の進行において役割を果たすことが示された（Ｃａｍｉｌｌｉ及びＷｅｅｒａｒａｔｎａ、２０１０）。ごく最近、ＷＮＴシグナル伝達はまた、癌幹細胞に関係付けられている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ−Ｙａｎａｇａ及びＫａｈｎ、２０１０）。
Ｗｎｔ媒介性シグナル伝達経路を標的にすることは、幅広い疾患で治療的に有用であろうことが、エビデンスによって示唆された（Ｂａｒｋｅｒ及びＣｌｅｖｅｒｓ、２００６）。古典的Ｗｎｔ経路の恒常的活性化につながるＡＰＣ、β−カテニンまたはアキシン−１の変異は、結腸直腸癌、黒色腫、肝細胞癌、胃癌、卵巣癌などを含めた、ヒトの様々な癌において、重要な事象である（Ｐｏｌａｋｉｓ、２００７）。遺伝子的または化学的なアプローチのいずれかを使用して様々な癌においてＷｎｔ経路を遮断することによって、異常な細胞増殖が抑止されることが示された（Ｈｅｒｂｓｔ及びＫｏｌｌｉｇｓ、２００７）。さらに、この経路の阻害は、癌細胞増殖を持続し転移を可能にし、従来の化学療法剤に抵抗性であると思われる細胞に直接的に影響し得る。
受容体下流の遺伝子産物の変異に起因する活性化に加えて、他の機構に起因する異常なＷｎｔ経路活性が、幅広い癌と関係があった。これらの癌としては、限定されないが、肺（小細胞及び非小細胞）、乳房、前立腺、カルチノイド、膀胱、スカルチノーマ、食道、卵巣、子宮頚部、子宮内膜、中皮腫、黒色腫、肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺、デスモイド、慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。今日では、アップレギュレートされた自己分泌またはパラクリンＷｎｔシグナル伝達に依存する癌細胞の複数の例があり、骨肉腫、乳房、頭頸部及び卵巣癌からの細胞系統は、自己分泌またはパラクリンＷＮＴシグナル伝達によって、アポトーシスから保護を受けることが示されている（Ｋａｎｓａｒａ、２００９；Ｂａｆｉｃｏ、２００４；Ａｋｉｒｉ、２００９；ＤｅＡｌｍｅｉｄａ、２００７；Ｃｈａｎ、２００７；Ｃｈｅｎ、２００９；Ｒｈｅｅ、２００２）。
さらに、異常なＷＮＴ経路は線維症の発達に関与しており、線維症としては、これらに限定されないが、特発性肺線維症及び放射線誘発性線維症などの肺線維症、腎線維症並びに肝線維症が挙げられる（Ｍｏｒｒｉｓｅｙ、２００３；Ｈｗａｎｇ、２００９；Ｃｈｅｎｇ、２００８）。
異常なＷＮＴシグナル伝達と関係がある他の障害としては、これらに限定されないが、骨粗鬆症及び骨関節症などの骨及び軟骨の障害、肥満に関連するＩＩ型糖尿病、並びにアルツハイマー病などの神経変性疾患が挙げられる。（Ｈｏｅｐｐｎｅｒ、２００９；Ｏｕｃｈｉ、２０１０；Ｂｌｏｍ、２０１０；Ｂｏｏｎｅｎ、２００９）。ＷＮＴシグナル伝達は、ＨＳＣの自己複製及びメンテナンスにも寄与し、機能が損なわれたＷＮＴシグナル伝達はＨＳＣから生じる様々な障害、例えば白血病及び様々な他の血液関連癌に関与する（Ｒｅｙａ、２００５）。
本発明は、一般に、ＷＮＴシグナル伝達経路に関連するバイオマーカー、及び癌などの疾患の治療のための患者選択におけるそうしたバイオマーカーの使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌を有すると診断され、そうした治療を必要としている対象における、Ｒ−スポンジン融合体の発現を特徴とする癌の治療方法であって、癌と診断された対象に、ポーキュパインのアンタゴニストの治療有効量を含む医薬組成物を投与することを含み、該対象が、Ｒ−スポンジン融合体を有すると判定されている、治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｒ−スポンジン融合体は、（１）ＰＴＰＲＫｅ１−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；（２）ＰＴＰＲＫｅ７−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；（３）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；または（４）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ−スポンジン融合体は、（１）ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；（２）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；（３）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体；（４）ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；（５）ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；または（６）ＰＴＰＲＫｅ６Ｘ−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、Ｒ−スポンジン融合体を有さないと判定された対照の対象におけるＲ−スポンジンのｍＲＮＡ発現レベルよりも高いＲ−スポンジンのｍＲＮＡ発現レベルを有すると判定されている。
いくつかの実施形態では、Ｒスポンジン融合体は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６２、または配列番号６３のうちのいずれか１つの接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体は、配列番号６４の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体は、配列番号６５の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体は、配列番号６６の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体は、配列番号６７の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体は、配列番号６１の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＴＰＲＫｅ６Ｘ−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体は、配列番号６０の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲスポンジンはＲｓｐｏ２またはＲｓｐ３であり、融合遺伝子は、別の遺伝子に融合されていないＲスポンジンと比べて過剰発現される。
いくつかの実施形態では、ポーキュパインアンタゴニストは、式（Ｉ）
：
Figure 2021130694
 の化合物または生理学的に許容し得るその塩を含み、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Χ６、Ｘ７、Ｘ８は独立に、ＣＲ４またはＮであり、
Ｙ１は水素またはＣＲ４であり、Ｙ２、Ｙ３は独立に、水素、ハロまたはＣＲ３であり、
Ｒ１は、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ２は、水素、ハロ、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ３は、水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されているＣ１〜６アルコキシであり、
Ｒ４は、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）である、治療方法を提供する。
いくつかの実施形態では、５または６員ヘテロアリールは、
Figure 2021130694
 から選択され、
式中、
Ｒ４は、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ８は、水素またはＣ１〜６アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は独立に、１または２個のＲ４基で置換されている。
いくつかの実施形態では、化合物は、以下から選択される：
６−（２−メチルピリジン−４−イル）Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’メチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリミジン−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
３−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
６−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−ｍ−トリル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（５−フェニルピリジン−２−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（ピリダジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−モルホリノ−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）アミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（４−クロロベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−メチルベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−ベンジル−２−（３−フルオロフェニル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（６−（３−フルオロフェニル）ピリジン−３−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２−フルオロビフェニル−４−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピリジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（３−フルオロフェニル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２（２−メチルピリジン−４−イル）−ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｓ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｒ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
１−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン；
６−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（チアゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（オキサゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−フルオロピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
メチル４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−２−オン；
２−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）アセトニトリル；
２−メチル−４−（４−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）フェニル）ピリジン１−オキシド；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）ベンゾニトリル；
Ｎ−（３−メトキシ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−クロロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル））−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２’−メチル−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）−２，４’ビピリジン−３−カルボニトリル；及び
Ｎ−（４−（２−（ジフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン。
いくつかの実施形態では、ポーキュパインアンタゴニストは、以下の式（ＩＩ）：
Figure 2021130694
 （ＩＩ）
の化合物または生理学的に許容し得るその塩を含み、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、Ｎ及びＣＲ７から選択され、
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８のうちの１つは、Ｎであり、他はＣＨであり、
Ｘ９は、Ｎ及びＣＨから選択され、
Ｚは、フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニル及びピペラジニルから選択され、
Ｚの各フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルまたはピペラジニルは、任意に、Ｒ６基で置換され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、水素であり、
ｍは１であり、
Ｒ４は、水素、ハロ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル及びメチルから選択され、
Ｒ６は、水素、ハロ、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０から選択され、このＲ１０はメチルであり、Ｒ７は、水素、ハロ、シアノ、メチル及びトリフルオロメチルから選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、
Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）ピリジン−２−イル］−２−［５−メチル−６−（ピリダジン−４−イル）ピリジン−３−イル］アセトアミド；
２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミド（ＬＧＫ９７４）；
Ｎ−（２，３’−ビピリジン−６’−イル）−２−（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−メチル−３−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；及び
２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）−Ｎ−（５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル）アセトアミド、ならびに製薬上許容し得るその塩の群から選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミドである。
いくつかの実施形態では、化合物の治療有効量は、１日投薬量で、体重あたり約０．０１から２０ｍｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、化合物の治療有効量は、ヒトに関して、約０．５ｍｇから約１０００ｍｇである。
いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、胆管癌、膵臓癌、子宮内膜癌、または前立腺癌である。
別の態様では、本発明は癌を患っている対象を、Ｗｎｔ活性を阻害する組成物で治療すべきかどうかについての判定方法であって、（ａ）対象から生体試料を単離すること、（ｂ）生体試料についてアッセイを実施して、Ｒ−スポンジン融合体の有無を特定すること、及び（ｃ）生体試料がＲ−スポンジン融合体を含む場合に、ポーキュパインのアンタゴニストの治療有効量を含む組成物で対象を治療すべきかどうかを判定すること含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ−スポンジン融合体は、（１）ＰＴＰＲＫｅ１−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；（２）ＰＴＰＲＫｅ７−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；（３）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；または（４）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ−スポンジン融合体は、（１）ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；（２）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；（３）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体；（４）ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；（５）ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；または（６）ＰＴＰＲＫｅ６Ｘ−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、Ｒ−スポンジン融合体を有さないと判定された対照の対象におけるＲ−スポンジンのｍＲＮＡ発現レベルよりも高いＲ−スポンジンのｍＲＮＡ発現レベルを有すると判定されている。
いくつかの実施形態では、Ｒスポンジン融合体は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６２、または配列番号６３のうちのいずれか１つの接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体は、配列番号６４の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体は、配列番号６５の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体は、配列番号６６の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体は、配列番号６７の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体は、配列番号６１の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＴＰＲＫｅ６Ｘ−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体は、配列番号６０の接合部配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲスポンジンはＲｓｐｏ２またはＲｓｐ３であり、融合遺伝子は、別の遺伝子に融合されていないＲスポンジンと比べて過剰発現される。
いくつかの実施形態では、ポーキュパインアンタゴニストは、式（Ｉ）:
Figure 2021130694
 の化合物または生理学的に許容し得るその塩を含み、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Χ６、Ｘ７、Ｘ８は独立に、ＣＲ４またはＮであり、
Ｙ１は水素またはＣＲ４であり、Ｙ２、Ｙ３は独立に、水素、ハロまたはＣＲ３であり、
Ｒ１は、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ２は、水素、ハロ、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ３は、水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されているＣ１〜６アルコキシであり、
Ｒ４は、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい。
いくつかの実施形態では、５または６員ヘテロアリールは、
Figure 2021130694
 から選択され、
式中、
Ｒ４は、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ８は、水素またはＣ１〜６アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は独立に、１または２個のＲ４基で置換されている。
いくつかの実施形態では、化合物は、以下から選択される：
６−（２−メチルピリジン−４−イル）Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’メチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリミジン−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
３−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
６−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−ｍ−トリル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（５−フェニルピリジン−２−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（ピリダジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−モルホリノ−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）アミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（４−クロロベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−メチルベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−ベンジル−２−（３−フルオロフェニル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（６−（３−フルオロフェニル）ピリジン−３−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２−フルオロビフェニル−４−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピリジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（３−フルオロフェニル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２（２−メチルピリジン−４−イル）−ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｓ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｒ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
１−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン；
６−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（チアゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（オキサゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−フルオロピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
メチル４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−２−オン；
２−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）アセトニトリル；
２−メチル−４−（４−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）フェニル）ピリジン１−オキシド；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）ベンゾニトリル；
Ｎ−（３−メトキシ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−クロロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル））−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２’−メチル−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）−２，４’ビピリジン−３−カルボニトリル；及び
Ｎ−（４−（２−（ジフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン。
いくつかの実施形態では、ポーキュパインアンタゴニストは、以下の式（ＩＩ）：
Figure 2021130694
 （ＩＩ）
の化合物または生理学的に許容し得るその塩を含み、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、Ｎ及びＣＲ７から選択され、
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８のうちの１つは、Ｎであり、他はＣＨであり、
Ｘ９は、Ｎ及びＣＨから選択され、
Ｚは、フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニル及びピペラジニルから選択され、
Ｚの各フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルまたはピペラジニルは、任意に、Ｒ６基で置換され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、水素であり、
ｍは１であり、
Ｒ４は、水素、ハロ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル及びメチルから選択され、
Ｒ６は、水素、ハロ、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０から選択され、このＲ１０はメチルであり、Ｒ７は、水素、ハロ、シアノ、メチル及びトリフルオロメチルから選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、
Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）ピリジン−２−イル］−２−［５−メチル−６−（ピリダジン−４−イル）ピリジン−３−イル］アセトアミド；
２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミド（ＬＧＫ９７４）；
Ｎ−（２，３’−ビピリジン−６’−イル）−２−（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−メチル−３−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；及び
２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）−Ｎ−（５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル）アセトアミド、ならびに製薬上許容し得るその塩の群から選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミドである。
いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、胆管癌、膵臓癌、子宮内膜癌、または前立腺癌である。
参照による援用
本明細書で言及される刊行物、特許及び特許出願のすべては、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されると具体的に且つ個々に示されたのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲で詳細に記載されている。本発明の原理が利用される例示的実施形態を記載する以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点についてより良く理解されるであろう。
Ｒｓｐｏ２のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ判断チャートを示す。 Ｒｓｐｏ３のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ判断チャートを示す。 特性評価された腫瘍組織（表７）を用いたＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子型決定アッセイの検証を示す。網掛けは、特性評価された試料における予想された陽性シグナルを強調する。Ｌ４４０試料におけるＲｓｐｏ２エクソンのシグナル数は、他のエクソンにおける数に近く、このことは、Ｌ４４０腫瘍試料中のＲｓｐｏ２融合体に代わる野生型Ｒｓｐｏ２転写物の発現を示唆している。 Ｒｓｐｏ２融合遺伝子またはＲｓｐｏ３融合遺伝子を含むか、または含まない、腫瘍試料におけるＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイによるＲｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３の定量を示す。 種々のＲｓｐｏ２（表８）及びＲｓｐｏ３（表９）遺伝子融合体の配列を示す。 種々のＲｓｐｏ２（表８）及びＲｓｐｏ３（表９）遺伝子融合体の配列を示す。 ＲＳＰＯ３融合遺伝子を担持する腫瘍モデルにおけるＣＧＸ１３２１の抗腫瘍効果を示す。図６Ａ：ＰＴＰＲＫのエクソン１をＲｓｐｏ３のエクソン２に融合させるＰＴＰＲＫｅ１−Ｒｓｐｏ３遺伝子融合体を有する結腸直腸腫瘍のＣＲＣ０１１ＰＤＸモデルに対するＣＧＸ１３２１の用量反応である。腫瘍がおよそ１５０ｍｍ３のサイズに達した際に、種々の用量のＣＧＸ１３２１を指示された通りに２８日間投与した。腫瘍サイズを、各群（ｎ＝８匹の動物／群）において１週間に２回測定した。 ＲＳＰＯ３融合遺伝子を担持する腫瘍モデルにおけるＣＧＸ１３２１の抗腫瘍効果を示す。図６Ｂ：ＰＴＰＲＫのエクソン７をＲｓｐｏ３のエクソン２に融合させる２型ＰＴＰＲＫ−Ｒｓｐｏ３遺伝子融合体を有するＣＲＣ１４１結腸直腸腫瘍のＰＤＸモデルである。腫瘍がおよそ１５０ｍｍ３のサイズに達した際に、ＣＧＸ１３２１を、７．５ｍｇ／ｋｇで１日１回２１日間経口投与した。腫瘍サイズを、１週間に２回測定した（ｎ＝８匹の動物／群）。 ＲＳＰＯ３融合遺伝子を担持する腫瘍モデルにおけるＣＧＸ１３２１の抗腫瘍効果を示す。図６Ｃ：エクソン１３をＲｓｐｏ３のエクソン２に融合させる３型ＰＴＰＲＫ−Ｒｓｐｏ３遺伝子融合体を有するＣＲ２５０６結腸直腸腫瘍のＰＤＸモデルである。左側：サービスプロバイダーから提供された既存対照としての独立した１２の実験における、処置なしの異種移植腫瘍ＣＲ２５０６モデルの腫瘍増殖曲線である。右側：ＣＧＸ１３２１を１ｍｇ／ｋｇで１日１回２８日間経口投与した場合のＣＲ２５０６モデルの腫瘍増殖である。腫瘍サイズは、各群（ｎ＝４匹の動物／群）において１週間に２回測定した。 Ｒｓｐｏ２融合遺伝子を担持する腫瘍モデルにおけるＣＧＸ１３２１の抗腫瘍効果を示す。図７Ａ：ＥＭＣ２のエクソン１をＲｓｐｏ２のエクソン２に融合させるＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２遺伝子融合体を有するＧＡ６７胃腫瘍のＰＤＸモデルである。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３のサイズに達した際に、ＣＧＸ１３２１を、１ｍｇ／ｋｇで１日１回２８日間経口投与した。腫瘍サイズを、１週間に２回測定した（ｎ＝６匹の動物／群）。 Ｒｓｐｏ２融合遺伝子を担持する腫瘍モデルにおけるＣＧＸ１３２１の抗腫瘍効果を示す。図７Ｂ：ＰＶＴ１のエクソン１をＲｓｐｏ２のエクソン２に融合させるＰＶＴ１ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２遺伝子融合体を有するＣＲ３０５６結腸直腸腫瘍のＰＤＸモデルである。腫瘍がおよそ１００ｍｍ３のサイズに達した際に、ＣＧＸ１３２１を、１ｍｇ／ｋｇで１日１回２８日間経口投与した。腫瘍サイズは、各群（ｎ＝６匹の動物／群）において１週間に２回測定した。 Ｒｓｐｏ２融合遺伝子を担持する腫瘍モデルにおけるＣＧＸ１３２１の抗腫瘍効果を示す。図７Ｃ：ＨＦＮ４Ｇの５’末端をＲｓｐｏ２のエクソン２に融合させるＨＦＮ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２遺伝子融合体を有するＧＡ３０５５胃腫瘍のＰＤＸモデルである（左側：サービスプロバイダーによって提供された処置なしの場合の腫瘍の増殖である。右側：ＣＧＸ１３２１を１ｍｇ／ｋｇで１日１回２８日間経口投与した場合の腫瘍増殖である）。腫瘍サイズは、各群（ｎ＝４匹の動物／群）において１週間に２回測定した。
本発明のいくつかの態様を、例示のための適用例を参照して以下に記載する。本発明を完全に理解するために、多数の具体的な詳細、関係及び方法が記載されていることを理解されたい。しかし、具体的な詳細の１つまたは複数がなくても、または他の方法を用いて、本発明を実施することができることを、当業者なら容易に認識するであろう。ある行為は、他の行為または事象とともに異なる順序で及び／または同時に生じ得るので、本発明は、行為または事象の例示順序によって制限されない。
さらに、例示した行為または事象のすべてが、本発明による方法論を実施することを必要とするわけではない。
本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明することを目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用する場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈において別段示さない限り、同様に複数形も含むことが意図される。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」またはそれらの変異形態が、詳細な説明及び／または特許請求の範囲のいずれかで使用されている限り、そうした用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であることが意図される。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）は、当業者によって決定される特定の値について許容できる誤差範囲内を意味し、これは、値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの制限にある程度依存する。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当技術分野の慣行により、１以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関して、該用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本願及び特許請求の範囲に記載されている場合は、別段の記載がない限り、特定の値に対する許容誤差範囲内を意味する用語「約（ａｂｏｕｔ）」が、想定されるべきである。
Ｉ．定義及び省略形
別段規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、一般に、この発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションにおける本明細書で使用される命名法及び実験法は、当技術分野で周知であり且つ一般に用いられるものである。核酸及びペプチドの合成について、標準的な手法を使用する。手法及び手順は、当技術分野の従来の方法及び本文書全体を通して提供される様々な一般的な参考文献に従って、一般に実施される。以下に記載される分析化学及び有機合成において本明細書で使用される命名法及び実験法は、当技術分野で周知であり且つ一般に用いられるものである。化学合成及び化学分析について、標準的な手法またはその変法を使用する。
本明細書で使用する場合、「ＷＮＴシグナル伝達経路」または「ＷＮＴ経路」は、細胞受容体へのＷＮＴタンパク質の結合が細胞挙動を変化させることになる経路を指す。ＷＮＴ経路は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ、アキシン、ＡＰＣ、ＧＳＫ３β、β−カテニン、ＬＥＦ／ＴＣＦ転写因子及びＷＮＴタンパク質の合成及び分泌に関与する分子を含めた様々なタンパク質を含む。機能的ＷＮＴの分泌に関与するタンパク質の例としては、これらに限定されないが、ｗｎｔｌｅｓｓ／ｅｖｅｎｎｅｓｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ（Ｗｌｓ／Ｅｖｉ）、ポーキュパイン（ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ）（Ｐｏｒｃｎ）及びＶｐｓ３５ｐが挙げられる。Ｗｌｓ／Ｅｖｉは、ゴルジ装置に存在し、Ｗｇ（ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））、ＭＯＭ−２（線虫（ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））及びＷｎｔ３Ａの分泌に必要とされる、７回膜貫通タンパク質である。これは、構造及び機能が両方とも不明である、保存された構造モチーフを含む。Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ（Ｐｏｒｃｎ）は、パルミトイルトランスフェラーゼの膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）ファミリーのメンバーである。Ｗｎｔの脂肪酸修飾は、その機能にとって重要である。Ｗｎｔは、１つまたは２つの高度に保存された部位でパルミトイル化される。したがって、Ｐｏｒｃｎのインヒビターは、すべての機能的なＷｎｔシグナル伝達を遮断し得る。Ｖｐｓ３５ｐは、細胞内タンパク質輸送に関与するレトロマー複合体と呼ばれる多タンパク質複合体のサブユニットである。Ｖｐｓ３５ｐは、ベシクル中に動員するために、ＷＮＴのような標的タンパク質と結合することにおいて機能を果たす。
本明細書で使用する場合、「Ｗｎｔインヒビター」は、Ｗｎｔ経路の活性を低減する。Ｗｎｔインヒビターは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することができ、またＰＯＲＣＮインヒビターを含むことができる化合物である。この阻害としては、例えば、ＰＯＲＣＮ、及びＷｎｔのそのパルミトイル化を阻害すること、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ及びＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄを含むＷｎｔ経路構成要素間の関連性を低下させることを挙げることができる。好ましくは、Ｗｎｔインヒビターは、ＰＯＲＣＮインヒビターである。
用語「ＷＮＴ経路を阻害する方法」は、機能的ＷＮＴタンパク質の生成またはＷＮＴタンパク質に対する細胞応答と関係する既知の生化学的事象を阻害する方法を指す。本明細書で論じるように、有機小分子は、本定義に基づいてＷＮＴ応答を阻害することができる。
「ＷＮＴタンパク質」は、古典的または非古典的ＷＮＴシグナル伝達を活性化するように、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰ５／６共受容体に結合するタンパク質である。ＷＮＴタンパク質の具体例としては以下が挙げられる：ＷＮＴ−１（ＮＭ００５４３０）、ＷＮＴ−２（ＮＭ００３３９１）、ＷＮＴ−２Ｂ／ＷＮＴ−１３（ＮＭ００４１８５）、ＷＮＴ−３（ＮＭ０３０７５３）、ＷＮＴ３ａ（ＮＭ０３３１３１）、ＷＮＴ−４（ＮＭ０３０７６１）、ＷＮＴ−５Ａ（ＮＭ００３３９２）、ＷＮＴ−５Ｂ（ＮＭ０３２６４２）、ＷＮＴ−６（ＮＭ００６５２２）、ＷＮＴ−７Ａ（ＮＭ００４６２５）、ＷＮＴ−７Ｂ（ＮＭ０５８２３８）、ＷＮＴ−８Ａ（ＮＭ０５８２４４）、ＷＮＴ−８Ｂ（ＮＭ００３３９３）、ＷＮＴ−９Ａ／ＷＮＴ−１４）（ＮＭ００３３９５）、ＷＮＴ−９Ｂ／ＷＮＴ−１５（ＮＭ００３３９６）、ＷＮＴ−１０Ａ（ＮＭ０２５２１６）、ＷＮＴ−１０Ｂ（ＮＭ００３３９４）、ＷＮＴ−１１（ＮＭ００４６２６）、ＷＮＴ−１６（ＮＭ０１６０８７）。
「ＷＮＴ経路障害」は、異常なＷＮＴシグナル伝達を伴う状態または病態である。一態様では、異常なＷＮＴシグナル伝達は、正常な細胞または組織中のＷＮＴシグナル伝達のレベルを超える、疾患になったことが疑われる細胞または組織中のＷＮＴシグナル伝達のレベルである。特定の一態様では、ＷＮＴ媒介性障害は癌または線維症を含む。
用語「癌」は、無秩序な細胞増殖を特徴とする、ヒトの病的状態を指す。例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：カルチノーマ、リンパ腫、芽腫及び白血病。癌のより特定の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：肺（小細胞及び非小細胞）、乳房、前立腺、カルチノイド、膀胱、胃、膵臓、肝臓（肝細胞性）、肝芽腫、結腸直腸、頭頸部扁平上皮癌、食道、卵巣、子宮頚部、子宮内膜、中皮腫、黒色腫、肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺、デスモイド、慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）。
用語「線維症」は、典型的には、制御されない線維芽細胞増殖及び組織硬化を特徴とする、ヒトの病的状態を指す。具体例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：肺線維症（特発性肺線維症及び放射線誘発性線維症）、腎線維症並びに肝硬変を含めた肝線維症。
「阻害すること」または「治療すること」または「治療」は、軽減、治療的処置及び予防的または防止的治療を指し、その目的は、目的の病的な障害または状態を軽減するまたは防止することである。一例を挙げれば、ＷＮＴシグナル伝達のインヒビターを投与した後に、癌患者は、腫瘍サイズの低下を経験することができる。「治療」または「治療すること」は、（１）疾患の病状もしくは症状を経験しているもしくは示している対象において、疾患を阻害すること、（２）疾患の病状もしくは症状を経験しているもしくは示している対象において、疾患を寛解させること、及び／または（３）疾患の病状もしくは症状を経験しているもしくは示している対象もしくは患者において、疾患の任意の測定可能な縮小に影響を及ぼすことを含む。ＷＮＴ経路インヒビターが癌細胞の増殖を防止する及び／または癌細胞を死滅させることができる限り、該インヒビターは、細胞増殖抑制性及び／または細胞傷害性であり得る。
用語「治療有効量」は、対象または哺乳類においてＷＮＴ経路障害を「治療する」のに有効な、ＷＮＴ経路インヒビター（例えば、ポーキュパインアンタゴニスト）の量を指す。癌の場合には、治療有効量の該薬物は、癌細胞数を減少させる、腫瘍サイズを減少させる、末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害する、腫瘍転移を阻害する、腫瘍増殖をある程度まで阻害する及び／または癌に付随する症状の１つもしくは複数をある程度緩和することのいずれかが可能である。
１種または複数のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（並行）投与及び任意の順序での連続投与を含む。本明細書で使用する場合、用語「医薬品の組み合わせ」は、活性成分を混合または組み合わせることから得られた生成物を指し、活性成分の固定された組み合わせ及び固定されていない組み合わせの両方を含む。用語「固定された組み合わせ」は、活性成分、例えば式（１）の化合物と併用剤を両方とも、単一の存在物または投薬の形で同時に患者に投与することを意味する。用語「固定されていない組み合わせ」は、活性成分、例えば式（１）の化合物と併用剤を両方とも別々の存在物として、同時に、同時発生的にまたは特定の時間制限なしに連続して患者に投与し、そうした投与が、患者の体内で治療的に有効な活性成分レベルを提供することを意味する。後者は、カクテル療法、例えば３つ以上の活性成分の投与にも適用される。
「化学療法剤」は、癌治療に有用な化学化合物である。例としては、これらに限定されないが以下がある：ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン及びカルボプラチン。
用語「アルキル」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、別段の記載がない限り、直鎖もしくは分枝鎖もしくは環状の炭化水素基またはそれらの組み合わせを意味し、これは、完全飽和でも一価不飽和でも多価不飽和でもよく、所定数の炭素原子（すなわちＣ１〜Ｃ１０は１から１０個の炭素を意味する）を有する二価基及び多価基を含むことができる。飽和炭化水素基の例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの同族体及び異性体などのような基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例としては、これらに限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、並びに高級な同族体及び異性体が挙げられる。用語「アルキル」、特記しない限り、以下でより詳細に定義されるアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」を含むことが意味される。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。
用語「アルキレン」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、限定されないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−によって例示されるような、アルカンに由来する２価の基を意味し、「ヘテロアルキレン」として以下に記載される基をさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有するそうした基が本発明では好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、短鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、８個以下の炭素原子を一般に有する。
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、それらの従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基または硫黄原子を介して分子の残部に結合しているアルキル基を指す。
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、別段の記載がない限り、規定数の炭素原子並びにＯ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、窒素原子及び硫黄原子が任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が、任意選択で４級化されていてもよい、安定的な直鎖もしくは分枝鎖もしくは環状の炭化水素基またはそれらの組み合わせを意味する。ヘテロ原子（複数可）のＯ、Ｎ及びＳ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が分子の残部に結合している位置に配置され得る。例としては、これらに限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、２つのまでのヘテロ原子が連続していてもよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−によって例示されるような、ヘテロアルキルに由来する２価の基を意味する。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子はまた、鎖末端のいずれかまたは両方を占め得る（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレン連結基及びヘテロアルキレン連結基については、連結基の配向は、連結基の式が書かれている方向によって示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
一般に、「アシル置換基」も上記の基から選択される。本明細書で使用する場合、用語「アシル置換基」は、本発明の化合物の多環核に直接的または間接的に結合しているカルボニル炭素に結合し、且つそのカルボニル炭素の原子価を満たす基を指す。
用語「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」は、それ自体でまたは他の用語と組み合わせて、別段の記載がない限り、それぞれ、「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状型を意味する。さらに、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残部に結合している位置を占め得る。シクロアルキルの例としては、これらに限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、これらに限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、別段の記載がない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことが意味される。例えば、用語「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」は、これらに限定されないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことが意味される。
用語「アリール」は、別段の記載がない限り、単環でも、互いに縮合しているまたは共有結合的に連結している多環（好ましくは１から３環）でもよい、多価不飽和芳香族炭化水素置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１から４個のヘテロ原子を含み、窒素原子及び硫黄原子が任意選択で酸化され、窒素原子（複数可）が任意選択で４級化されるアリール基（または環））を指す。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に結合することができる。アリール及びヘテロアリール基の非限定例としてはフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが挙げられる。上記のアリール及びヘテロアリール環系のそれぞれに対する置換基は、以下に記載の許容し得る置換基の群から選択される。
簡潔にするために、用語「アリール」は、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて使用される場合、上記で定義されたアリール及びヘテロアリール環の両方を含む。したがって、用語「アリールアルキル」は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子で置き換えられたアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含めて、アリール基がアルキル基に結合している基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことが意味される。
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」）のそれぞれは、示された基の置換形態及び無置換形態の両方を含む。各型の基についての好ましい置換基を以下に提供する。
アルキル及びヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルとしばしば称される基を含める）についての置換基は、一般に、それぞれ「アルキル置換基」及び「ヘテロアルキル置換基」と称され、これらは、限定されないが、以下から選択される様々な基の１つまたは複数であり得る：０から（２ｍ’＋１）に及ぶ数（ｍ’はそうした基の全炭素原子数である）において、ＯＲ’、＝０、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’はそれぞれ、好ましくは独立に、水素、置換もしくは無置換のヘテロアルキル、置換もしくは無置換のアリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは無置換のアルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が１個を超えるＲ基を含む場合、例えば、各々のＲ基は、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基の１個より多くが存在する場合の各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基と同様に、独立して選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一窒素原子に結合している場合は、これらは窒素原子と結合して、５−、６−または７−員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、これらに限定されないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むことが意味される。置換基に関する上記の議論から、用語「アルキル」は、水素基以外の基に結合している炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）並びにアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）を含むことが意味されることを、当業者なら理解するであろう。
アルキル基について記載した置換基と同様に、アリール置換基及びヘテロアリール置換基は、一般にそれぞれ、「アリール置換基」及び「ヘテロアリール置換基」と称され、多様であり、０から芳香族環系の開放原子価の総数に及ぶ数において、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、式中、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、好ましくは、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル及びヘテロアルキル、無置換のアリール及びヘテロアリール、（無置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル及び（無置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから独立に選択される。本発明の化合物が１個を超えるＲ基を含む場合、例えば、各々のＲ基は、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基の１個より多くが存在する場合の各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基と同様に、独立して選択される。
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上のアリール置換基の２つは任意選択で式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基で置き換えられてもよく、式中、Ｔ及びＵは独立に、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは０から３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意選択で式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置き換えられてもよく、式中、Ａ及びＢは独立に、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１から４の整数である。そのようにして形成された新しい環の単結合の１つは、任意選択で、二重結合で置き換えられてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意選択で式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基で置き換えられてもよく、式中、ｓ及びｄは独立に、０から３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基のＲ、Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は、好ましくは、水素または置換もしくは無置換の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立に選択される。
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）及びケイ素（Ｓｉ）を含む。
ＩＩ．組成物
一態様では、本発明は、ＷｎｔインヒビターまたはＷｎｔインヒビターと実質的に同様な生物活性を有する薬物を使用する療法に最も応答する可能性が高い（例えば、治療効果を有する）患者を判定または予測するための方法及び組成物、ならびにＷＮＴインヒビターを使用する療法に応答しない可能性が最も高い患者を判定または予測するための方法及び組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔインヒビターは、ヒトで使用することに好適なポーキュパインインヒビターである。Ｗｎｔインヒビターは、Ｃｈｅｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：１００−１０７によって記載されているＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３またはＩＷＰ−４、ならびにＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈから市販されているＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＷｎｔインヒビターＩＷＰ−２（＃１３０−０９５−５８４）、Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＷｎｔインヒビターＩＷＰ−３（＃１３０−０９５−５８５）及びＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＷｎｔインヒビターＩＷＰ−４などの既知のポーキュパインインヒビターと同様な機能を有するポーキュパインインヒビターであってもよい。Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＩＷＰ−２、Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＩＷＰ−３、及びＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＩＷＰ−４は、ポーキュパイン（ＰＯＲＣＮ）、膜結合型Ｏ−アシル化転移酵素によるＷｎｔタンパク質のパルミチル化を防止する。
あるいは、Ｗｎｔインヒビターは、薬物設計の産物とすることができ、当該技術分野において既知の種々の方法を用いて生成することができる。２０１０年９月１０日に公開された、国際特許出願第ＷＯ２０１０／１０１８４９号を参照されたい。本発明において有用な模倣物または他の化合物を設計するために有用な薬物設計の種々の方法は、Ｍａｕｌｉｋ ｅｆ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ.（その全体が参照により組み込まれる）に開示されている。Ｗｎｔインヒビターは、分子多様性ストラテジー（大規模な化学的に多様な分子ライブラリーの迅速な構築を可能にする関連するストラテジーの組み合わせ）、天然化合物もしくは合成化合物のライブラリー、特に化学もしくはコンビナトリアルライブラリー（すなわち、配列またはサイズが異なるが、同様な基本成分を有する化合物のライブラリー）から、または合理的、指向的もしくはランダムな薬物設計によって得ることができる。例えば、Ｍａｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい。分子多様性ストラテジーにおいて、大規模な化合物ライブラリーは、生物学的、酵素的または化学的アプローチを使用して、例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、天然もしくは合成ステロイド化合物、炭水化物、または天然もしくは合成有機及び非ステロイド分子から合成される。分子多様性ストラテジーを開発する上で重要なパラメータは、サブユニット多様性、分子サイズ、及びライブラリー多様性を含む。このようなライブラリーをスクリーニングすることの一般的な目的は、所望の標的に対して高親和性リガンドを得るためにコンビナトリアル選択の順次適用を利用すること、及びランダムまたは指向的設計ストラテジーのいずれかによるリード分子を最適化することである。分子多様性の方法は、Ｍａｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉnｃ．に詳細に記載されている。
別の態様では、本発明は、ポーキュパインアンタゴニストまたはインヒビターとしての化合物を提供する。
本明細書において「ＰＯＲＣＮ」とは、Ｗｎｔ翻訳後修飾に必要とされるポーキュパイン、膜結合型アシル化転移酵素を意味する。特に指定のない限り、本明細書で使用されるＰＯＲＣＮは、ヒトＰＯＲＣＮ−受け入れ番号ＮＭ＿０１７６１７．３／ＮＰ＿０６００８７を指す。
いくつかの実施形態では、ポーキュパインインヒビターは、式（Ｉ）：
Figure 2021130694
 または生理学的に許容し得るその塩の構造を有し、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８は独立に、ＣＲ４またはＮであり、
Ｙ１は水素またはＣＲ４であり、
Ｙ２、Ｙ３は独立に、水素、ハロまたはＣＲ３であり、
Ｒ１は、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ２は、水素、ハロ、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
ここでは、５または６員ヘテロアリールは、これらに限定されないが、以下の選択基を含み、
Figure 2021130694
 Ｒ１及びＲ２は、独立に且つ任意選択で、１〜２個のＲ４基で置換され得、
Ｒ３は、水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されているＣ１〜６アルコキシであり、
Ｒ４は、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ８は、水素またはＣ１〜６アルキルである。
本明細書で使用する場合、任意の置換基（例えばＣＨ２）中のＨ原子は、すべての適切な同位体変種、例えば、Ｈ、２Ｈ及び３Ｈを包含する。
本明細書で使用する場合、任意の置換基中の他の原子は、これらに限定されないが、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｉ及び／または１２３Ｉを含めた、すべての適切な同位体変種を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：
６−（２−メチルピリジン−４−イル）Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’メチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリミジン−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
３−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
６−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−ｍ−トリル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（５−フェニルピリジン−２−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（ピリダジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−モルホリノ−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）アミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（４−クロロベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−メチルベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−ベンジル−２−（３−フルオロフェニル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（６−（３−フルオロフェニル）ピリジン−３−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２−フルオロビフェニル−４−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピリジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（３−フルオロフェニル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２（２−メチルピリジン−４−イル）−ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｓ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｒ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
１−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン；
６−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（チアゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（オキサゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−フルオロピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
メチル４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−２−オン；
２−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）アセトニトリル；
２−メチル−４−（４−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）フェニル）ピリジン１−オキシド；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）ベンゾニトリル；
Ｎ−（３−メトキシ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−クロロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル））−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２’−メチル−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）−２，４’ビピリジン−３−カルボニトリル；及び
Ｎ−（４−（２−（ジフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；または生理学的に許容し得るその塩。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物の例としては、これらに限定されないが、実施例１〜５及び表１に提供される化合物が挙げられる。実施例１〜５と同じストラテジーによって他の化合物を調製することができることを、当業者なら明瞭に理解することができ、知っている。
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いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療のために使用されるポーキュパインアンタゴニストまたはインヒビターは、国際公開第２０１０／１０１８４９号（ＰＣＴ／ＵＳ１０／０２５８１３号）で開示されるような任意の好適な化合物であり、好ましくは、式（ＩＩ）：
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 （ＩＩ）
の化合物または生理学的に許容し得るその塩であり、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、Ｎ及びＣＲ７から選択され、
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８のうちの１つは、Ｎであり、他はＣＨであり、
Ｘ９は、Ｎ及びＣＨから選択され、
Ｚは、フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニル及びピペラジニルから選択され、
Ｚの各フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルまたはピペラジニルは、任意に、Ｒ６基で置換され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、水素であり、
ｍは１であり、
Ｒ４は、水素、ハロ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル及びメチルから選択され、
Ｒ６は、水素、ハロ、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０から選択され、このＲ１０はメチルであり、Ｒ７は、水素、ハロ、シアノ、メチル及びトリフルオロメチルから選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、
Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）ピリジン−２−イル］−２−［５−メチル−６−（ピリダジン−４−イル）ピリジン−３−イル］アセトアミド；
２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミド（ＬＧＫ９７４）；
Ｎ−（２，３’−ビピリジン−６’−イル）−２−（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−メチル−３−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；及び
２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）−Ｎ−（５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル）アセトアミド、ならびに製薬上許容し得るその塩からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミドである。
ＩＩＩ．医学的及び医薬的使用
本発明の化合物は、医薬品として示される。本発明のさらなる態様によれば、医薬品として使用するために、上記の本発明の化合物が（いかなる但し書きもなしに、必要に応じて）提供される。医薬品として使用するための合成形態の本発明の化合物も（いかなる但し書きもなしに、必要に応じて）提供される。
誤解を避けるために、本発明の化合物はそれ自体が薬理学的活性を有する可能性があるものの、そうした活性を有さない可能性があるが、非経口的または経口的に投与されて、その後体内で代謝されて本発明の化合物を形成し得る、ある種の医薬的に許容し得る（例えば「保護された」）、本発明の化合物の誘導体が、存在するまたは調製される可能性がある。そうした化合物（これはある種の薬理学的活性を有し得るが、但しそうした活性は、それらが代謝されて生じる「活性」化合物の活性よりかなり低いことを条件とする）は、したがって、本発明の化合物の「プロドラッグ」として記載され得る。
「本発明の化合物のプロドラッグ」については、経口的または非経口的投与の後に、実験的に検出可能な量で、あらかじめ決定された時間（例えば約１時間）内に本発明の化合物を形成する化合物を含める。本発明の化合物のすべてのプロドラッグは、本発明の範囲内に含まれる。
さらに、本発明のある種の化合物は、それ自体は薬理学的活性をまったくまたはほとんど有さない可能性があるが、非経口的または経口的に投与され、その後体内で代謝されて、それ自体が薬理学的活性を有する本発明の化合物を形成し得る。そうした化合物（これは、ある種の薬理学的活性を有し得るが、その活性が、それらが代謝されて生じる本発明の「活性」化合物の活性よりかなり低い化合物も含む）、も「プロドラッグ」として記載され得る。
したがって、本発明の化合物は、薬理学的活性を有する及び／または経口的または非経口的投与の後に体内で代謝されて、薬理学的活性を有する化合物を形成するので、有用である。
（上記で定義されたが、但し書き（複数可）がない）本発明の化合物は、癌治療において有用であり得る。「癌」は、制御されない細胞増殖（例えば、制御されない分裂）、浸潤（例えば、隣接する組織への直接的な増殖）または転移から生じる任意の疾患を意味する。「制御されない増殖」については、癌細胞の数及び／またはサイズの増加（本明細書では、「増殖」とも称する）を含める。「転移」は、対象の体内の原発腫瘍部位から対象の体内の１つまたは複数の他の領域（ここで、次いで癌細胞が続発腫瘍を形成し得る）への癌細胞の移動または移行（侵襲）を意味する。したがって一実施形態では、本発明は、癌を患っている対象での続発腫瘍の形成を全体または部分的に阻害するための化合物及び方法を提供する。
有利には、本発明の化合物は、癌細胞の増殖及び／または転移を選択的に阻害するができ得る。
「選択的に」は、本発明の化合物が、非癌細胞の機能（例えば増殖）をモジュレートするよりも大きな度合いで、癌細胞の増殖及び／または転移を阻害することができることを意味する。好ましくは、本発明の化合物は、癌細胞のみの増殖及び／または転移を阻害する。
別の態様では、本発明は本発明の化合物及び少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体または希釈剤を含む医薬組成物であって、前記化合物が遊離形態または医薬的に許容し得る塩形態である医薬組成物を提供する。そうした組成物は、経口組成物でも注射用組成物でも坐薬でもよい。そして、該組成物は、混合、顆粒化またはコーティング法による従来の方式で製造することができる。
本発明の一実施形態では、組成物は経口組成物であり、錠剤またはゼラチンカプセル剤であり得る。好ましくは、経口組成物は、ａ）希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／もしくはグリシン；ｂ）潤滑剤、例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩及び／もしくはポリエチレングリコールとともに；錠剤については、ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンのり、ゼラチン、トラガマイス、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びもしくはポリビニルピロリドン；並びに必要に応じて、ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩または発泡性混合物；並びに／またはｅ）添加剤、例えば、吸収剤、着色料、香料及び甘味料とともに、本発明の化合物を含む。
本発明の別の実施形態では、組成物は注射用組成物であり水性等張溶液または懸濁液であり得る。
さらに別の本発明の実施形態では、組成物は坐薬であり、脂肪性の乳濁液または懸濁液から調製することができる。
好ましくは、組成物は滅菌され、及び／または補助剤を含む。そうした補助剤は、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧調節用の塩、緩衝液及び／またはそれらの任意の組み合わせでもよい。
あるいはまたはさらに、組成物は、可溶化剤、安定剤、張性増強剤、緩衝液及び／または防腐剤のような、様々な適用のための他の治療的に有用な物質をさらに含むことができる。
本発明の一実施形態では、組成物は、経皮適用に適した製剤でもよい。そうした製剤は、有効量の本発明の化合物及び担体を含む。好ましくは、担体は、受容者の皮膚の通過を補助するための、吸収性の薬理学的に許容し得る溶媒を含むことができる。製剤を含む経皮デバイスを使用することもできる。経皮デバイスは、裏打ち部材、任意選択で担体とともに化合物を含むレザバー、任意選択で、制御され且つあらかじめ決定された速度で長時間にわたって、受容者の皮膚に化合物を送達するための速度制御バリア、及びデバイスを皮膚に固定するための手段を含む包帯の形でもよい。そうでなければ、マトリックス経皮製剤を使用することもできる。
本発明の別の実施形態では、組成物は、皮膚及び眼などへの局所適用に適した製剤でもよく、当技術分野で周知である水性液剤、軟膏剤、クリーム剤またはゲル剤でもよい。
別の態様では、本発明は細胞からのＷＮＴ分泌を阻害する方法を提供する。
一実施形態では、細胞は、哺乳類内に含まれ、投与量は治療有効量である。別の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達の阻害は、さらに細胞増殖の阻害をもたらす。さらなる実施形態では、細胞は癌細胞である。さらに別の実施形態では、細胞は線維形成細胞である。
細胞増殖は、当業者に既知の方法を使用することによって測定される。例えば、細胞増殖を測定するための簡便なアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から市販品として入手可能なＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）アッセイである。アッセイ手順は、マルチウェルディッシュで培養された細胞にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を添加することを含む。ルミノメーターまたはイメージングデバイスで測定した発光シグナルは存在するＡＴＰの量に比例し、これは、培養中に存在する生細胞の数に対して正比例である。さらに、当技術分野で既知のコロニー形成アッセイを使用して、細胞増殖を測定することもできる。
本発明はまた、有効量の本発明の化合物を用いる、ＷＮＴシグナル伝達経路と関係がある癌または線維症の治療方法を提供する。当技術分野で既知のいくつかの手法のうちの１つを使用して癌細胞を解析することによって、癌がＷｎｔ経路と関連しているかどうかを当業者なら容易に決定することができるであろう。例えば、免疫検出方法及び核酸検出方法を使用して、Ｗｎｔシグナル伝達に関与するタンパク質またはｍＲＮＡのレベルの異常について癌細胞を調べることができる。
ＷＮＴ経路と関係がある癌または線維症は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の１種または複数の構成成分の活性が基底レベルからアップレギュレートされるものを含む。一実施形態では、Ｗｎｔ経路を阻害することは、Ｗｎｔ分泌を阻害することを含むことができる。別の例として、Ｗｎｔ経路を阻害することは、細胞表面レセプターの下流の構成成分を阻害することを含むことができる。別の実施形態では、Ｗｎｔ分泌の阻害は、機能的ＷＮＴの分泌に関与するタンパク質のうちのいずれかの活性を阻害することを含むことができる。
さらに本発明は、ＷＮＴ経路障害を罹患する対象において、治療有効量のＷＮＴインヒビターを対象に投与することによって、該障害を治療する方法を提供する。一実施形態では、障害は、異常な、例えば増大したＷＮＴシグナル伝達活性と関係がある細胞増殖性障害である。別の実施形態では、障害は、増大したＷＮＴタンパク質の量に起因する。さらに別の実施形態では、細胞増殖性障害は癌であり、これらに限定されないが、以下が含まれる：肺（小細胞及び非小細胞）、乳房、前立腺、カルチノイド、膀胱、胃、膵臓、肝臓（肝細胞性）、肝芽腫、結腸直腸、頭部癌及び頚部扁平上皮癌、食道、卵巣、子宮頚部、子宮内膜、中皮腫、黒色腫、肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺、デスモイド、慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）。さらに別の実施形態では、細胞増殖性障害は線維症であり、これらに限定されないが、以下が含まれる：特発性肺線維症及び放射線誘発性線維症などの肺線維症、腎線維症並びに肝硬変を含めた肝線維症。さらに別の実施形態では、障害は、骨関節症、パーキンソン病、網膜症、黄斑変性症である。
治療的使用については、当技術分野で既知の任意の許容し得る方法単独によって、本発明の化合物を治療有効量で投与することができる。本明細書で使用する場合、治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的な健康状態、使用される化合物の効力及び他の因子に応じて大きく変動する可能性がある。一般に、対象の体重あたり約０．０３から２．５ｍｇ／ｋｇの１日投薬量で、満足な結果が全身的に得られることが示される。一実施形態では、ヒトのような大型哺乳類について指示される１日投薬量は、約０．５ｍｇから約１００ｍｇまでの範囲内である。好ましくは、化合物は１日４回までの分割投与で、または遅延形態で投与される。別の実施形態では、経口投与に適した単位剤形は、約１から１００ｍｇまでの活性成分を含む。
あるいは、本発明の化合物は、１種または複数の治療剤と組み合わせた活性成分、例えば医薬品の組み合わせとしての治療有効量で投与することができる。本発明の化合物を当技術分野で既知の化学療法剤とともに使用する場合、相乗効果があり得る。同時投与される化合物の投薬量は、用いられる併用薬の種類、用いられる特定の薬物、治療を受ける状態などに応じて変動し得る。
本発明の化合物またはその組成物は、任意の通常の経路によって投与することができる。一実施形態では、これらは、経腸的、例えば経口的に投与され、錠剤またはカプセル剤の形で投与される。別の実施形態では、これらは、非経口的に投与され、注射液剤または懸濁剤の形で投与される。さらに別の実施形態では、これらは、局所的に投与され、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤もしくはクリーム剤の形で、または経鼻もしくは坐薬の形態で投与される。
別の態様では、本発明はまた、ａ）遊離形態または医薬的に許容し得る塩形態での、本明細書で開示される本発明の化合物である、第一の薬剤、及びｂ）少なくとも１つの併用剤を含む医薬品の組み合わせ、好ましくはキットを提供する。さらに、キットはその投与のための指示書を含むことができる。
本発明の組み合わせは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも、ｉｎ ｖｉｖｏでも使用することができる。好ましくは、細胞、組織または生物体を、単一の組成物または本発明の化合物及び１種または複数の薬剤を含む薬理学的製剤と接触させることによって、または２種以上の異なる組成物または製剤（一方の組成物が１つの薬物を含み、他方が別の薬剤を含む）と細胞を接触させることによって、投与の所望の治療的利益を達成することができる。組み合わせの薬剤は、同時に投与することもできるし、一定期間内に別々に投与することもできる。好ましくは、分離投与は、所望の治療的利益をもたらすことができる。本発明の化合物は、数分から数週に及ぶ間隔で、他の薬剤に先行しても、他の薬剤と同時でも、及び／または他の薬剤の後でも良い。別々に投与された薬剤が、細胞、組織または生物体で、有利に組み合わされた効果を依然として発揮することができる各送達点の時間間隔を、当業者なら一般に保証することができる。一実施形態では、細胞、組織または生物体を、候補物質として、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のモダリティーと実質的に同時に、すなわち、おおよそ１分未満で接触させることができる企図される。別の実施形態では、１種または複数の薬剤を約１分から１４日の間で投与することができる。
別の態様では、本発明は、本発明の化合物またはその塩もしくは誘導体を調製する方法を提供する。
一実施形態では、以下の実施例に記載されている合成方法のうちのいずれか１つに従って、式（Ｉ）を有する化合物を調製することができる。記載されている反応では、反応性官能基、例えば、ヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基（これらは、最終生成物で所望される）を保護して、反応において、それらの不必要な関与を回避することができる。標準的技法に従って、従来の保護基を使用することができる（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ、１９９１を参照されたい）。記載されている合成方法で使用するのに適切な脱離基としては、ハロゲン脱離基及び当技術分野で既知の従来の他の脱離基が挙げられる。好ましくは、脱離基はクロロまたはブロモである。
別の実施形態では、本発明の化合物またはその塩は、水和物の形で得ることもでき、またはその結晶は、例えば結晶化に使用した溶媒（溶媒和化合物として存在する）を含むことができる。塩は、適切な塩基性薬剤で、好ましくはアルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩またはアルカリ金属水酸化物で、より好ましくは炭酸カリウムまたは水酸化ナトリウムで処理することによって、通常、遊離形態の化合物に変換することができる。塩基付加塩形態の本発明の化合物は、適切な酸、例えば塩酸で処理することによって、対応する遊離酸に変換することができる。遊離形態の新規化合物と、例えば新規化合物の精製または同定において中間体として使用され得る塩を含めたその塩形態のものとの間の密接な関係を考慮して、遊離化合物に対するいかなる言及も、必要に応じて、対応する塩に対しても言及するものとして理解されたい。
塩形成基を有する本発明の化合物の塩は、当技術分野で既知の方法で調製することができる。したがって、式（Ｉ）の化合物の酸付加塩は、酸または適切な陰イオン交換試薬で処理することによって得ることができる。本発明の化合物の医薬的に許容し得る塩は、有機酸または無機酸を用いて、塩基性窒素原子を有する式（Ｉ）の化合物から酸付加塩として形成することができる。
好ましくは、適切な無機酸としては、これらに限定されないが、ハロゲン酸、例えば塩酸、硫酸またはリン酸が挙げられる。
好ましくは、適切な有機酸としては、これらに限定されないが、カルボン酸、リン酸、スルホン酸またはスルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、−リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、桂皮酸、メタン−またはエタン−スルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレン−ジスルホン酸、２−、３−または４メチルベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、Ｎシクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−またはＮ−プロピル−スルファミン酸、または他の有機プロトン酸、例えばアスコルビン酸が挙げられる。
あるいは、単離または精製のために、医薬的に許容されない塩、例えばピクリン酸塩または過塩素酸塩を使用することも可能である。しかし治療的使用については、必要に応じて医薬調製物の形で、医薬的に許容し得る塩または遊離化合物のみが用いられる。
さらに別の実施形態では、０から８０℃の適切な不活性有機溶媒中で還元剤で処理することによって、未酸化形態の本発明の化合物を、本発明の化合物のＮ‐オキシドから調製することができる。好ましくは、還元剤は、硫黄、二酸化硫黄、トリフェニルホスフィン、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、三塩化リン、三臭化物などである。好ましくは、転化有機溶媒は、アセトニトリル、エタノール、水性ジオキサンなどである。
さらに別の実施形態では、本発明の化合物のプロドラッグ誘導体を、当技術分野で既知の方法によって調製することができる（さらなる詳細については、Ｓａｕｌｎｉｅｒら、（１９９４）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻、１９８５頁を参照されたい）。好ましい実施形態では、本発明の誘導体されていない化化合物を、適切なカルバミル化剤、例えば１，１−アシルオキシアルキルカルバノクロリデート、パラ−ニトロフェニルカーボネーなどと反応させることによって、適切なプロドラッグを調製することができる。
さらに別の実施形態では、本発明の化合物の保護された誘導体を、当技術分野で既知の手段によって作製することができる。保護基の作出及びその除去に適用可能な手法の詳細な説明は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ、Ｉｎｃ．、１９９９に見出すことができる。
さらに別の実施形態では、本発明の化合物を、それらの個々の立体異性体として調製することができる。この方法は、化合物のラセミ混合物を光学的に活性な分割剤と反応させて１対のジアステレオマー化合物を形成すること、ジアステレオマーを分離すること、及び光学的に純粋な鏡像異性体を回収することを含む。鏡像異性体の分割は、本発明の化合物の共有結合性ジアステレオマー誘導体を使用して、解離可能な複合体、例えば結晶性ジアステレオマー塩を使用することによって行うことができる。ジアステレオマーは、融点、沸点、溶解度、反応性などによって示される異なる物理的性質を有しており、これらの相違点を利用することにより容易に分離することができる。ジアステレオマーは、分画結晶化、クロマトグラフィーによって、または溶解度の違いに基づいた分離／分割手法によって分離することができる。次いで、ラセミ化をもたらさないと思われる任意の実用的手段によって、光学的に純粋な鏡像異性体を分割剤とともに回収する。化合物の立体異性体をそれらのラセミ混合物から分割するのに適用可能な手法に関するより詳細な説明は、Ｊｅａｎ Ｊａｃｑｕｅｓ、Ａｎｄｒｅ Ｃｏｌｌｅｔ、Ｓａｍｕｅｌ Ｈ．Ｗｉｌｅｎ、「Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８１に見出すことができる。
まとめると、本発明の化合物は、実施例に記載されている方法によって作製することができ、
任意選択で、医薬的に許容し得る塩が、本発明の化合物から変換され得、
任意選択で、医薬的に許容し得るＮ‐オキシドが、未酸化形態の本発明の化合物から変換され得、
任意選択で、本発明の化合物の個々の異性体が、異性体の混合物から分割され、
任意選択で、医薬的に許容し得るプロドラッグ誘導体が、本発明の誘導体されていない化化合物から変換され得る。
出発材料の生成が特に記載されていない限り、化合物は既知であるか、当技術分野で既知の方法と同様に、または以下の実施例に開示されているように調製することができる。上記の変換は、本発明の化合物の調製方法を単に代表するにすぎないこと、及び他の周知の方法を同様に使用することができることを、当業者なら認識するであろう。
ＩＶ．患者選択及び癌治療
別の態様では、本発明は、Ｒ−スポンジン及び／またはＲ−スポンジン融合体の過剰発現を有すると診断され、そうした治療を必要としている対象における、Ｒ−スポンジン及び／またはＲ−スポンジン融合体の発現の過剰発現を特徴とする癌の治療のための組成物及び方法を提供する。
Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）は、単一のトロンボスポンジンＩ型リピート（ＴＳＲ）ドメインを含む、４種のシステインリッチ分泌タンパク質のファミリーである。Ｒｓｐｏ遺伝子ファミリーは進化的に保存されており、半索動物、サッコグロースス・コワレフスキー（Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ ｋｏｗａｌｅｖｓｋｉｉ）（キボシムシ）、脊索動物、ユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（被嚢類）及び棘皮動物を含めたすべての後口動物のゲノム及び転写産物のデータベースで見出すことができる。様々な脊椎動物種由来のＲＳＰＯは、古典的ＷＮＴシグナル伝達活性化因子の性質を示す。ＲＳＰＯタンパク質のＣＲドメインは、ＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達経路の活性化を媒介することに主として関与する。ＴＳＲ及びＢＲドメインは、古典的ＷＮＴシグナル伝達でのＲＳＰＯ活性の強さを調節することが提唱されている。これは、ＴＳＲ及びＢＲドメインを欠くＲＳＰＯタンパク質は、古典的ＷＮＴシグナル伝達を非効率的に活性化するからである。Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｋ．＆Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎｓ．Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．２４、３６９〜３７７（２０１２）。
本明細書では、「Ｒ−スポンジン融合体」は、Ｒｓｐｏ遺伝子（これらに限定されないが、Ｒｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３遺伝子が含まれる）のうちの１つと別の遺伝子（「融合パートナー遺伝子」）（これらに限定されないが、ＰＴＰＲＫ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＭＣ２、ＰＶＴ１、及びＨＮＦ４Ｇ遺伝子が含まれる）との間の融合体を意味する。この融合は、欠失または逆位の結果であり得る。Ｒｓｐｏ遺伝子の５’パートナー遺伝子への融合は、一般に、様々な遺伝子（例えば融合パートナー遺伝子）のプロモーターの制御下にあるＲｓｐｏ遺伝子（融合遺伝子産物の一部としての完全長または部分的なもの）の発現をもたらし、これによって、ｍＲＮＡレベル及び／またはタンパク質レベルでの、Ｒｓｐｏ遺伝子（例えば融合遺伝子）の発現レベルの変化（例えば、発現の上昇）がもたらされる。Ｒｓｐｏ融合遺伝子は、機能的または非機能的なＲｓｐｏ断片を生成し得る。
癌並びに変異Ｒ−スポンジンポリヌクレオチド及びポリペプチドについての「を特徴とする」は、Ｒ−スポンジンに関する遺伝子欠失もしくは転座及び／または発現融合ポリペプチドが、そうした遺伝子欠失及び／または融合ポリペプチドが存在しない癌と比較した際に、存在する癌を意味する。変異ポリペプチドの存在によって、全体または部分的に、そうした癌の増殖及び生存が駆り立てられる。
本明細書で提供する組成物は、Ｒｓｐｏ融合体を伴う様々な癌、例えば結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、胆管癌、膵臓癌、子宮内膜癌、及び前立腺癌を治療するのに使用される。
ある種の腫瘍、例えば結腸直腸腫瘍及び前立腺腫瘍に関してＷＮＴ経路が活性化される機構は、ＷＮＴリガンドのエンハンサーをコードする２つの遺伝子である、Ｒスポンジン−２及びＲスポンジン−３が、他の遺伝子、例えばＰＴＰＲＫ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＭＣ２、ＰＶＴ１、及びＨＮＦ４Ｇ遺伝子との融合によって転写的に活性化されることである。本明細書で提供する実施例、ならびに参照によりその全体が援用されるＳｅｓｈａｇｉｒｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ａｕｇ ３０；４８８（７４１３）：６６０−４及びＲｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅ，Ｃｅｌｌ １６１，１２１５−１２２８ Ｍａｙ ２１，２０１５を参照されたい。Ｒｓｏｐ融合遺伝子は、機能的または非機能的なＲｓｏｐタンパク質断片をもたらし得る。機能的なＲｓｐｏタンパク質が産生される場合は、それはＷＮＴ経路の活性化因子として働くことができ、これによって、腫瘍細胞増殖が引き起こされ得る。
本発明は、当技術分野で既知の方法及び／または本明細書で提供する方法を使用して、Ｒｓｐｏ融合体を有する癌患者をスクリーニングするための、並びに任意選択で、本明細書で提供するＷｎｔインヒビターでそうした患者を治療するための、方法及び組成物を提供する。
Ｒｓｐｏ遺伝子は、ゲノムＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベル、またはタンパク質レベルで検出することができる。試験を必要としている対象由来の生体試料を、当技術分野で既知の方法を使用して得ることができる。任意選択で、生体試料を処理して、タンパク質、ＲＮＡ及び／またはＤＮＡを得て、次にこれを、Ｒｓｐｏ融合体を検出するためのアッセイで使用する。
Ａ．生体試料
本明細書では、「生体試料」は、（Ｒｓｐｏ−ＰＴＰＲＫ及びＲｓｐｏ−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含めた）Ｒｓｐｏ融合ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはそれらの断片を含むことが疑われる任意の生体試料を意味し、細胞、細胞から単離した染色体（例えば中期染色体のスプレッド）、（溶液中のまたはサザン解析用などの固体支持体に結合した）ゲノムＤＮＡ、（溶液中のまたはノーザン解析用などの固体支持体に結合した）ＲＮＡ、（溶液中のまたは固体支持体に結合した）ｃＤＮＡ、細胞、血液、尿、骨髄または組織などからの抽出物を含むことができる。
本発明の方法の実施において有用な生体試料は、Ｒｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチドの発現を特徴とする癌が存在するまたは発達している任意の哺乳類から得ることができる。一実施形態では、哺乳類はヒトであり、ヒトは、癌、例えば、結腸、胃及び食道の癌の治療のためのＷｎｔ阻害療法の候補であり得る。ヒトの候補は、Ｗｎｔインヒビター、例えば、本明細書で提供するものを用いた治療を現在受けている、またはそれを用いた治療が考慮されている患者でもよい。別の実施形態では、哺乳類は大型動物、例えばウマまたはウシであるが、他の実施形態では、哺乳類は小型動物、例えばイヌまたはネコであり、これらすべては、結腸、胃及び食道のカルチノーマを含めた癌を発達させることが知られている。
哺乳類の癌からの細胞（または細胞抽出物）を含む任意の生体試料は、本発明の方法での使用に適する。循環性腫瘍細胞は、腫瘍マーカー、サイトケラチンタンパク質マーカーまたは記載されているようなネガティブ選択の他の方法（Ｍａら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３（１Ａ）：４９〜６２（２００３）を参照されたい）を使用して、血清から得ることもできる。血清試料及び骨髄試料は、白血病患者にとって特に好ましい可能性がある。肉腫及びカルチノーマなどの固形腫瘍を含む癌については、生体試料は、標準的な臨床手法によって得ることができる腫瘍生検から得られる細胞を含むことができる。
循環性腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）は、例えば、商標Ｖｉｔａ−Ａｓｓａｙｓ（商標）、Ｖｉｔａ−Ｃａｐ（商標）及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）（Ｖｉｔａｔｅｘ，ＬＬＣ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販品として入手可能）で販売されているキット及び試薬を使用して、精製することができる。ＣＴＣを単離するための他の方法が記載されている（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ／２００２／０２０８２５号、Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３５１（８）：７８１〜７９１（２００４）、及びＡｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０（２７）：８６３３〜８６４１（Ｊｕｌｙ ２００８）を参照されたい）。特定の実施形態では、循環性腫瘍細胞（「ＣＴＣ」）は、肺または結腸、胃、食道から単離することができ、肺または結腸、胃、食道から発生したと特定することができる。
Ｂ．Ｒｓｐｏ融合ポリペプチドの検出
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ融合体はイムノアッセイによって検出される。Ｒｓｐｏ融合タンパク質またはペプチド を産生し、Ｒｓｐｏ融合タンパク質に対して特異的な抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を生成する。次いで、そうした抗体を、Ｒｓｐｏ融合体の存在を検出するためのアッセイで使用する。
Ｒｓｐｏ融合体は、一般に、Ｒｓｐｏ融合体特異的試薬を使用して検出される。本明細書では、「Ｒｓｐｏ融合ポリペプチド特異的試薬」は、生体試料中の発現したＲｓｐｏ融合ポリペプチドに特異的に結合することができ、発現したＲｓｐｏ融合ポリペプチドの存在／レベルを検出及び／または定量化することができる、生物学的または化学的な任意の試薬を意味する。この用語には、これらに限定されないが、以下に述べる好ましい抗体及び試薬が含まれ、均等な試薬は本発明の範囲内である。
本発明の方法の実施で使用するのに適する試薬としては、ＰＴＰＲＫ−Ｒｓｐｏ３融合ポリペプチド特異的抗体及び／またはＥＩＦ３Ｅ−Ｒｓｐｏ２融合ポリペプチド特異的抗体、もしくは本明細書に提供する他のＲｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３融合タンパク質が挙げられる。本発明の融合体特異的抗体は、本発明のＰＴＰＲＫ−Ｒｓｐｏ３融合ポリペプチド（例えば、本明細書で提供するＰＴＰＲＫ−Ｒｓｐｏ３融合体配列に対応するペプチド）、もしくは本明細書に提供する他のＲｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３融合タンパク質に特異的に結合するが、野生型Ｒｓｐｏと野生型ＰＴＰＲＫのどちらにも実質的に結合しない、あるいは本明細書に記載のＥＩＦ３Ｅ−Ｒｓｐｏ２融合ポリペプチド（例えば、本明細書で提供するＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合体配列に対応するペプチド）に特異的に結合するが、野生型Ｒｓｐｏと野生型ＥＩＦ３Ｅのどちらにも実質的に結合しない、１つまたは複数の単離抗体（複数可）である。
ヒトのＰＴＰＲＫ−Ｒｓｐｏ３またはＥＩＦ３Ｅ−Ｒｓｐｏ２融合ポリペプチド（もしくは本明細書に提供する他のＲｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３融合タンパク質）特異的抗体は、他の哺乳類種、例えばマウスまたはウサギの、高い相同性且つ均等なエピトープペプチド配列にも結合することができ、逆もまた同じである。本発明の方法の実施において有用な抗体としては、（ａ）モノクローナル抗体、（ｂ）標的ポリペプチド（例えば、Ｒｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫ融合ポリペプチドまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチド、もしくは本明細書に提供する他のＲｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３融合タンパク質の融合接合部）に特異的に結合する精製されたポリクローナル抗体、（ｃ）他の非ヒト種（例えば、マウス、ラット）の均等且つ高い相同性のエピトープまたはリン酸化部位に結合する、上記の（ａ）〜（ｂ）に記載されている抗体、及び（ｄ）本明細書に開示される例示的抗体に結合された抗原（またはより好ましくはエピトープ）に結合する、上記の（ａ）〜（ｃ）の断片が挙げられる。
本明細書では、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含めた、すべての種類の免疫グロブリンを意味する。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマまたはヒトを含めた任意の種由来のものでもよく、またはキメラ抗体でもよい。例えば、Ｍ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：４０３〜１１（１９８９）；Ｍｏｒｒｉｓｉｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４（１９８４））を参照されたい。抗体は、米国特許第４，４７４，８９３号明細書（Ｒｅａｄｉｎｇ）または米国特許第４，８１６，５６７号明細書（Ｃａｂｉｌｌｙら）に開示されている方法に従って生成された組換えモノクローナル抗体でもよい。抗体は、米国特許第４，６７６，９８０号明細書（Ｓｅｇｅｌら）に開示されている方法に従って作製された、化学的に構築された特異的抗体でもよい。
本発明は抗体の使用に限定されるわけでなく、均等な分子、例えばタンパク質結合ドメインまたは核酸アプタマーを含み、これらは、融合タンパク質またはトランケート型タンパク質に特異的な様式で、本発明の方法で有用なＲｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチド特異的抗体が結合するのと本質的に同一のエピトープに結合する。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４（１９８４）を参照されたい。そうした均等な非抗体試薬は、さらに以下に記載される本発明の方法で適切に用いることができる。
本発明の方法の実施において有用なポリクローナル抗体は、既知の手順に従って、適切な動物（例えば、ウサギ、ヤギなど）を所望の融合タンパク質特異的エピトープ（例えば、本明細書に記載のＲｓｐｏ融合タンパク質の融合接合部）を含む抗原で免疫化し、その動物から免疫血清を採取し、その免疫血清からポリクローナル抗体を分離し、所望の特異性を有するポリクローナル抗体を精製することによって、標準的な手法に従って、生成することができる。抗原は、周知の手法に従って選択及び構築された、所望のエピトープ配列を含む合成ペプチド抗原でもよい。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第５章、７５〜７６頁、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｃｚｅｒｎｉｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０１：２６４〜２８３（１９９１）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１〜４９（１９６２））を参照されたい。本明細書に記載のように生成したポリクローナル抗体を、さらに以下に記載されるように、スクリーニング及び単離することができる。
モノクローナル抗体も本発明の方法で有利に用いることができ、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２６５：４９５〜９７（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）の周知の手法に従って、ハイブリドーマ細胞系統において生成することができる。ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８９）も参照されたい。そのようにして生成されたモノクローナル抗体は非常に特異的であり、本発明によって提供されるアッセイ方法の選択性及び特異性を向上させる。例えば、適切な抗原（例えば、Ｒｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチドの融合接合部を含む合成ペプチド）を含有する溶液をマウスに注射することができ、（従来の手法に合わせて）十分な時間がたってから、このマウスを屠殺し、脾臓細胞を得る。次いで、この脾臓細胞を、典型的にはポリエチレングリコールの存在下で骨髄腫細胞と融合させることによって不死化して、ハイブリドーマ細胞を生成する。ウサギ融合ハイブリドーマは、例えば、１９９７年１０月７日に発行された、米国特許第５，６７５，０６３号明細書、Ｋ．Ｋｎｉｇｈｔに記載されているように生成することができる。次いで、ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）などの適切な選択培地中で増殖させ、以下に記載のように、この上清を、所望の特異性を有するモノクローナル抗体についてスクリーニングする。分泌された抗体を、沈殿、イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーなどのような従来の方法によって、組織培養物の上清から回収することができる。
モノクローナルＦａｂ断片を、当業者に知られている組換え手法によって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で生成することもできる。例えば、Ｗ．Ｈｕｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜８１（１９８９）；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８０９５（１９９０）を参照されたい。あるアイソタイプのモノクローナル抗体が特定の用途に好ましい場合は、特定のアイソタイプを、最初の融合から選択することによって直接的に調製することができ、またはクラス転換変異体を単離するための同胞選択手法を使用することによって、様々なアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌している親ハイブリドーマから二次的に調製することができる（Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８２：８６５３（１９８５）；Ｓｐｉｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７４：３０７（１９８４））。モノクローナル抗体の抗原結合部位をＰＣＲによってクローニングすることができ、単鎖抗体を、ファージディスプレイ組換え抗体または大腸菌中の可溶性抗体として生成することができる（例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ、１９９５、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｕｄｈｉｒ Ｐａｕｌ編を参照されたい）。
さらに、米国特許第５，１９４，３９２号明細書、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）には、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエピトープのトポロジー的均等物（すなわち「ミモトープ」）であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出するまたは決定する一般的な方法が記載されている。より一般的には、この方法は、目的の特定の受容体のリガンド結合部位に相補的なリガンドのトポグラフィー的均等物であるモノマーの配列を検出または決定することを含む。同様に、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９９６）には、直鎖状のＣ１〜Ｃ−アルキル過アルキル化オリゴペプチド並びにそうしたペプチドのセット及びライブラリー、並びに目的のアクセプター分子に優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために、そうしたオリゴペプチドのセット及びライブラリーを使用する方法が開示されている。したがって、本発明のエピトープ含有ペプチドの非ペプチド類似体はまた、こうした方法によって日常的に作製することができる。
ポリクローナルであろうとモノクローナルであろうと、標準的な手法に従って、本発明の方法で有用な抗体をエピトープ及び融合タンパク質特異性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｃｚｅｒｎｉｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０１：２６４〜２８３（１９９１）を参照されたい。例えば、所望の両方の抗原に対する特異性を確実にするために、及び必要に応じて、例えば、野生型Ｒｓｐｏ３または野生型ＰＴＰＲＫではなく本発明のＲｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫ融合ポリペプチドのみとの反応特異性を確実にするために、ＥＬＩＳＡによって、ペプチドライブラリーに対して抗体をスクリーニングすることができる。所望の標的のみとの反応性を確認するため、及びＲｓｐｏを含む他の融合タンパク質に対する感知できる結合がないことを確実にするために、標的タンパク質を含む細胞調製物に対するウエスタンブロッティングによって抗体を試験することもできる。融合タンパク質特異的抗体の生成、スクリーニング及び使用は、当業者に知られており、記載されている。例えば、米国特許公開第２００５０２１４３０１号明細書、Ｗｅｔｚｅｌら、２００５年９月２９日を参照されたい。
本発明の方法で有用な融合ポリペプチド特異的抗体は、他の融合タンパク質中の同様の融合エピトープと、野生型Ｒｓｐｏ、野生型ＰＴＰＲＫ及び野生型ＥＩＦ３Ｅ中の融合接合部を形成するエピトープと、若干の限られた交差反応性を示す可能性がある。ほとんどの抗体はある程度の交差反応性を示すのでこれは予想外ではなく、抗ペプチド抗体は免疫化ペプチドと高い相同性または同一性を有するエピトープと交差反応することが多い。例えば、上記のＣｚｅｍｉｋを参照されたい。他の融合タンパク質との交差反応性は、既知分子量のマーカーと並べたウエスタンブロッティングによって容易に特徴付けられる。交差反応するタンパク質のアミノ酸配列を調べて、抗体が結合するＲｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチド配列と高い相同性の部位または同一の部位を特定することができる。ペプチドカラムでの抗体精製を使用するネガティブ選択によって、望ましくない交差反応性を除去する（例えば、野生型Ｒｓｐｏ、野生型ＰＴＰＲＫ及び／または野生型ＥＩＦ３Ｅのいずれかと結合する抗体を選択して除く）ことができる。
本明細書に開示される方法の実施において有用な、本発明のＲｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチド特異的抗体は、理想的にはヒト融合ポリペプチドに対して特異的であるが、本質的には、ヒト種のみに結合することに限定されない。本発明は、他の哺乳類種（例えば、マウス、ラット、サル）の、保存され且つ高い相同性の、または同一のエピトープにも結合する抗体の生成及び使用を含む。他の種の高い相同性または同一の配列は、ヒトＲｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチドとの、ＢＬＡＳＴを使用するなどの標準的な配列比較によって容易に特定することができる。
本発明の方法で用いられる抗体は、特定のアッセイ形式、例えばフローサイトメトリー（ＦＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び／または免疫細胞化学（ＩＣＣ）で使用することによりさらに特徴付けすることができ、これらのアッセイ形式で使用することについて検証することができる。抗体は、他のシグナル伝達（リン酸化ＡＫＴ、リン酸化Ｅｒｋ１／２）及び／または細胞マーカー（サイトケラチン）抗体とともに多パラメータ解析で使用するために、有利には、蛍光色素（例えばＡｌｅｘａ４８８、ＰＥ）または量子ドットなどの標識にコンジュゲートすることもできる。
Ｃ．Ｒｓｐｏ融合ポリヌクレオチドの検出
本発明によって提供される融合体特異的試薬は、Ｒｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリヌクレオチド、もしくは本明細書に提供する他のＲｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３融合ポリヌクレオチドの検出に適した核酸プローブ及びプライマーも含む。そうしたプローブは、中でも、野生型Ｒｓｐｏ及び／もしくは野生型ＰＴＰＲＫ遺伝子または野生型Ｒｓｐｏ及び／もしくは野生型ＥＩＦ３Ｅ遺伝子の、融合をもたらす切断点の両側に対応する切断点プローブを望ましくは含む。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などのアッセイにおけるそうしたプローブの特定の使用は、本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ融合体は、ＰＣＲ、例えば、通常のＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）またはデジタルＰＣＲによって検出される。１対のプライマーを融合遺伝子を増幅するのに使用する。プライマーは、増幅される融合遺伝子の配列に基づいて設計される。好ましくは、一方のプライマーはＲｓｐｏ遺伝子の第一の配列にハイブリダイズし、第二のプライマーは融合パートナー遺伝子の第二の配列にハイブリダイズする。ＰＣＲは、当技術分野で既知のように最適化され得る条件下で、ｃＤＮＡ（生体試料を使用してＲＮＡから調製される）またはゲノムＤＮＡのいずれかについて実施することができる。
いくつかの実施形態では、ＦＩＳＨが、（Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＡＳＩＣ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されているように）用いられ、これは、他の物理的染色体マッピング手法及び遺伝子地図データと互いに関係づけることができる。遺伝子地図データの例は、１９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）に見出すことができる。Ｒｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチドをコードする遺伝子の物理的染色体地図上の位置と特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間の相関は、その遺伝性疾患と関係があるＤＮＡ領域の範囲を定めるのに役立ち得る。本発明のヌクレオチド配列は、正常個体、キャリア個体または罹患個体の間の遺伝子配列の違いを検出するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、第一のプローブはＲｓｐｏ遺伝子配列にハイブリダイズし、第一の色（例えば赤色）で標識されており、第二のプローブは、融合パートナー遺伝子配列にハイブリダイズし、第二の色（例えば緑色）で標識されている。Ｒｓｐｏ融合体の場合は、２つのプローブは、融合遺伝子にハイブリダイズし、互いに隣接することになる。その結果、２つのプローブの像が合併され、異なる色（例えば黄色）がもたらされる。
本発明のＲｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリヌクレオチドを検出するすべての方法（例えばＰＣＲ及びＦＩＳＨ）を、変異Ｒｓｐｏポリヌクレオチドまたは変異Ｒｓｐｏポリペプチドのいずれかを検出する他の方法と組み合わせることができることを理解されたい。例えば、生体試料（例えば循環性腫瘍細胞中）の遺伝子材料におけるＲｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリヌクレオチドの検出は、その後に、試料のタンパク質のウエスタンブロッティング解析または免疫組織化学（ＩＨＣ）解析が続いて、Ｒｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリヌクレオチドが、Ｒｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリペプチドとして生体試料中で実際に発現していたかどうかを決定することができる。そうしたウエスタンブロッティングまたはＩＨＣ解析は、検出されるＲｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用して実施することができ、またはこれらの解析は、完全長Ｒｓｐｏ（例えば、このタンパク質のＮ末端に結合する）または完全長ＰＴＰＲＫ（例えば、ＰＴＰＲＫのキナーゼドメイン中のエピトープに結合する）のいずれに特異的に結合する抗体を使用して実施することができる。そうしたアッセイは当技術分野で既知である（例えば、米国特許第７，４６８，２５２号明細書を参照されたい）。
別の例では、ＤａｋｏのＣＩＳＨ技術は、同一組織切片上で免疫組織化学とともに発色（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｅｎｉｃ）インサイチュハイブリダイゼーションを可能にする。
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ融合体は、Ｒｓｐｏ遺伝子と融合パートナー遺伝子の両方からの配列を含むプローブを使用するサザンブロットアッセイでのハイブリダイゼーションによって検出される。
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ融合体はハイブリダイゼーションに基づく他の方法、例えばマイクロアレイ、分岐ＤＮＡ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標））、ＶｉｅｗＲＮＡ（登録商標）またはＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）によって検出される。
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ融合体は、マイクロアレイを使用するハイブリダイゼーションによって検出され、ここでは、カスタム融合遺伝子マイクロアレイを使用して、癌検体からＲｓｐｏ融合転写産物を検出する。オリゴは、個々の融合パートナーのエクソンに関する測定との、キメラ転写産物の接合部の組み合わせ測定を可能にするように設計される。Ｓｋｏｔｈｅｉｍ，ＲＩ；Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ，ＧＯ；Ｅｋｅｎ，Ｍ；Ｌｉｎｄ，ＧＥ；Ｍｉｃｃｉ，Ｆ；Ｒｉｂｅｉｒｏ，ＦＲ；Ｃｅｒｖｅｉｒａ，Ｎ；Ｔｅｉｘｅｉｒａ，ＭＲら、Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｂｙ ｏｌｉｇｏ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ８：５．（２００９）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ融合体は、分岐ＤＮＡアッセイを使用するハイブリダイゼーションによって検出される。これらの実施形態では、カスタムハイブリダイゼーション及びシグナル増幅アッセイ、例えば分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標））を使用して、癌検体の溶解溶液中のＲｓｐｏ融合転写産物を検出する。捕獲エクステンダープローブ及び標識エクステンダープローブの配列は、Ｒｓｐｏ遺伝子及び融合パートナー遺伝子のエクソン配列（例えば、Ｒｓｐｏ３についてはＰＴＰＲＫ、Ｒｓｐｏ２についてはＥＩＦ３Ｅ）に由来し、例えば実施例９で例示されるものである。Ｌｕ Ｂ．ら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ．Ｕｒｏｌｏｇｙ７４（５）：１１５６〜６１（２００９）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ融合体は、インサイチュハイブリダイゼーションによって検出される。カスタムインサイチュハイブリダイゼーション及びシグナル増幅アッセイ、例えばＲＮＡｖｉｅｗ（登録商標）またはＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）を使用して、癌検体からのホルマリン固定パラフィン包埋化（ＦＦＰＥ）または凍結化組織について、Ｒｓｐｏ融合転写産物を検出する。捕獲エクステンダープローブ及び標識エクステンダープローブの配列は、Ｒｓｐｏ遺伝子及び融合パートナー遺伝子のエクソン配列（例えば、Ｒｓｐｏ３についてはＰＴＰＲＫ、Ｒｓｐｏ２についてはＥＩＦ３Ｅ）に由来し、例えば実施例９で例示されるものである。Ｗａｎｇ Ｆ，Ｆｌａｎａｇａｎ Ｊ，Ｓｕ Ｎ，Ｗａｎｇ ＬＣ，Ｂｕｉ Ｓ，Ｎｉｅｌｓｏｎ Ａ，Ｗｕ Ｘ，Ｖｏ ＨＴ，Ｍａ ＸＪ，Ｌｕｏ Ｙ．ＲＮＡｓｃｏｐｅ：ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．１４（１）：２２〜９（２０１２）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ融合体は、シーケンシング、例えばサンガーシーケンシングまたは次世代シーケンシングによって検出される。
シーケンシングプライマーを伸長させることによる、または生成物を伸長させることによるシーケンシングを、様々な方法を使用して行うことができる。例えば、シーケンシングは、標識された可逆的ターミネーターを用いて、または標識されたオリゴヌクレオチドとライゲーションすることによって行うことができる。シーケンシングは、任意の市販品として入手可能な方法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）などの企業から市販品として入手可能な可逆的ターミネーターに基づくシーケンシング法などを使用して、実施することができる。
いくつかの実施形態では、ハイスループットシーケンシングは、Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）から入手可能な技術の使用を伴う。ビーズ増幅の後に光ファイバー検出を使用する方法は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｍ．ら「Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｈｉｇｈ− ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ ｒｅａｃｔｏｒｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９；並びに米国特許出願公開第２００２００１２９３０号明細書、第２００３００５８６２９号明細書、第２００３０１００１０２号明細書、第２００３０１４８３４４号明細書、第２００４０２４８１６１号明細書、第２００５００７９５１０号明細書、第２００５０１２４０２２号明細書及び第２００６００７８９０９号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、ハイスループットシーケンシングは、クローナル単一分子アレイ（Ｃｌｏｎａｌ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙ）（Ｓｏｌｅｘａ，Ｉｎｃ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）または可逆的ターミネーター化学法利用する、合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＢＳ）を使用して実施される。これらの技術は、例えば、米国特許第６，９６９，４８８号明細書、第６，８９７，０２３号明細書、第６，８３３，２４６号明細書、第６，７８７，３０８号明細書、及び米国特許出願公開第２００４０１０６１３０号明細書、第２００３００６４３９８号明細書、第２００３００２２２０７号明細書並びにＣｏｎｓｔａｎｓ，Ａ．、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ２００３、１７（１３）：３６に部分的に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、（１）ＲＴＰＲＫｅ１−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体、（２）ＲＴＰＲＫｅ７−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；（３）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；または（４）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体であるＲ−スポンジン融合体を検出する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、（１）ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体、（２）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；（３）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体；（４）ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；または（５）ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体であるＲ−スポンジン融合体を検出する。
Ｒ−スポンジン融合体は、一般的に、ＰＴＰＲＫ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＭＣ２、ＰＶＴ１、またはＨＮＦ４Ｇ遺伝子などの融合パートナーのプロモーターによって駆動されるＲ−スポンジン遺伝子の発現をもたらす。
種々のＲスポンジン遺伝子融合体の接合部を表８（図５Ａ）及び表９（図５Ｂ）に提供する。種々の遺伝子融合体の接合部の配列も提供する。生体試料からのシーケンシングによって決定される接合部を包含するいかなる配列も、表８（図５Ａ）及び表９（図５Ｂ）に示す配列の一部分またはその全てを含んでもよいことが、当業者に明らかでなければならない。
Ｄ．Ｒ−スポンジンの過剰発現の検出
別の態様では、本発明は、Ｒ−スポンジンの過剰発現または上昇した発現レベルを検出するための組成物及び方法を提供する。Ｒ−スポンジンの過剰発現は、Ｗｎｔの過剰発現または活性化とともに存在してもよいし、これらとともに存在しなくてもよい。
Ｒ−スポンジンの過剰発現は、Ｒ−スポンジンのｍＲＮＡまたはポリペプチドまたは両方のいずれかの過剰発現であり得る。Ｒ−スポンジンは、Ｒ−スポンジンの野生型、または本明細書で開示されるようなＲ−スポンジン融合体（例えば、Ｒｓｐｏ３−ＰＴＰＲＫまたはＲｓｐｏ２−ＥＩＦ３Ｅ融合体）などの変異体のいずれかであり得る。
Ｒ−スポンジンの過剰発現は、正常細胞または正常な対象集団（例えば、正常なヒト集団）のおけるＲ−スポンジン（ｍＲＮＡまたはポリペプチド）の発現レベルを測定することによって得られるベースラインの発現レベルに関連して決定される。
Ｒ−スポンジンｍＲＮＡレベルの発現レベルは、当技術分野で既知の方法、例えばノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲと組み合わせたＲＴ−ＰＣＴ、デジタルＰＣＲ、ＤＮＡアレイ、ハイスループットシーケンシングまたはインサイチュハイブリダイゼーション、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒなどを使用して測定される。
ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかでのＲ−スポンジンの発現レベルは、当技術分野で既知の方法、例えばウェスタンブロット、プロテインアレイ、免疫組織学的染色などを使用して測定される。
方法のいずれかのいくつかの実施形態では、発現の増加とは、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織と比べた、本明細書に記載されるものなどの標準的な当該技術分野において既知の方法によって検出されるバイオマーカー（例えば、タンパク質または核酸（例えば、遺伝子もしくはｍＲＮＡ））のレベルにおける、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のいずれかの全体的な増加を指す。ある特定の実施形態では、発現の増加とは、試料中のバイオマーカーの発現レベル／量の増加を指し、この増加は、少なくとも約１．５×、１．７５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２５×、５０×、７５×、または１００×の、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、または対照組織における対応のバイオマーカーの発現レベル／量の増加を指す。いくつかの実施形態では、発現の増加とは、基準試料、基準細胞、基準組織、対照試料、対照細胞、対照組織、または内部対照（例えば、ハウスキーピング遺伝子）と比べた、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、または約３．２５倍を超える全体の増加を指す。
Ｅ．Ｒｓｐｏ過剰発現及び／またはＲｓｐｏ融合遺伝子のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒによる検出
別の態様では、Ｒ−スポンジン遺伝子融合体及び／またはＲ−スポンジン過剰発現は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システム（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて検出または判定される。このシステムは、それぞれが、このシステムの教示のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第０８／１２４，８４７号及び米国特許第８，４１５，１０２号明細書に記載されている。
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇは、ＲＮＡの増幅を必要とせず、低い試料要件を有し、腫瘍ＦＦＰＥ試料などのＦＦＰＥ試料における遺伝子発現のレベルを評価するために有効である。さらに、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇは、遺伝子発現を検出するための多重化された方法であり、転写または増幅を使用しない、ｍＲＮＡの直接測定のための方法を提供する。ホルマリン固定化腫瘍検体から抽出されたＲＮＡは、品質が非常に悪い場合があり、最近までこのような分析は不可能であった。しかしながら、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇは、これらの検体の分析を可能にする。５００アトモル濃度の感度で、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇは、１００ナノグラムの全ＲＮＡを入力として用いて、細胞当たりわずかにＲＮＡの１つのコピーを検出することができる。
ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムの原理は、アッセイされる各核酸標的に割り当てられる固有のコードである。このコードは、アッセイされる各標的に対して固有のバーコードを形成する順序付けられた一連の有色の蛍光スポットから構成される。１対のプローブが、各ＤＮＡまたはＲＮＡ標的、ビオチン化捕捉プローブ及び蛍光バーコードを担持するレポータープローブ用に設計される。このシステムは、本明細書では、ナノレポーターコードシステムとも称される。
特異的レポーター及び捕捉プローブは、各標的に対して合成される。簡単に言うと、配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブが、コード特異的レポーターに取り付けられる。好ましくは、各配列特異的レポータープローブは、対象の１つ以下の対象の遺伝子（例えば、Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、またはそれらの融合遺伝子対応物のうちの１つ）にハイブリダイズすることができ、任意に少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの標識付着領域と、光を発する１つ以上の標識モノマーを含む付着領域とを含む標的特異的配列を含む。捕捉プローブは、各標的についての第２の配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ビオチンを含有するユニバーサルオリゴヌクレオチドにライゲーションすることによって作製される。レポーター及び捕捉プローブは全て、単一のハイブリダイゼーション混合物、「プローブライブラリー」中にプールされる。好ましくは、このプローブライブラリーは、本明細書に提供される対象の遺伝子のそれぞれに対してプローブ対（捕捉プローブ及びレポーター）を含む。
各標的の相対存在量が、単一の多重化ハイブリダイゼーション反応で測定される。この方法は、生体試料をプローブライブラリーと接触させることを含み、このライブラリーは、対象の遺伝子のプローブ対を含み、これにより、試料中の標的の存在が、プローブ対と標的複合体とを形成する。次いで、複合体が精製される。より具体的には、試料がプローブライブラリーと結合されて、溶液中でハイブリダイゼーションが起こる。ハイブリダイゼーション後に、３成分からなるハイブリダイズされた複合体（プローブ対及び標的）を、捕捉及びレポータープローブ上に存在するユニバーサル配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合した磁気ビーズを用いて、２段階の手順で精製する。この二重精製プロセスは、標的特異的プローブが最終的に除去されるために、試料のハイブリダイゼーション反応が、大過剰の標的特異的プローブによって完了するように駆動させ、したがって、これらは試料の結合及び撮像を妨害することはない。ハイブリダイゼーション後の工程は、カスタム液体取り扱いロボット（Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でロボット制御により処理される。
精製された反応物は、Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎによって、試料カートリッジの個々のフローセル中に正確に置かれ、捕捉プローブを介してストレプトアビジンがコーティングされた表面に結合され、電気泳動してレポータープローブを伸長させて、固定化される。処理後に、試料カートリッジは、完全に自動化された撮像及びデータ収集装置（Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移される。標的の発現レベルを、各試料を撮像し、その標的についてのコードが検出される回数をカウントすることで測定する。データは、標的毎、試料毎のカウント数を列記する簡単なスプレッドシートフォーマットで出力される。
このシステムは、ナノレポーターと共に使用することができる。ナノレポーターに関する追加の開示は、国際公開第０７／０７６，１２９号及び同第０７／０７６，１３２号、ならびに米国特許公開第２０１０／００１５６０７号明細書及び２０１０／０２６１０２６号（これらの内容は、それらの全体が本明細書に組み込まれる）で見出すことができる。さらに、核酸プローブ及びナノレポーターという用語は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／０１９８２６号及び米国特許公開第２０１０／００４７９２４号明細書に記載される合理的に設計されたもの（例えば、合成配列）を含むことができる。
ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムの１つの利点は、遺伝子融合体及び遺伝子過剰発現の両方を単一のアッセイで測定するその容量である。ｎＣｏｕｎｔｅｒ成分化学アッセイは、２００個を超える発現された遺伝子及び遺伝子融合体を単一の反応で検出かつ識別することができる多重化アッセイを可能にする。既知の遺伝子融合体は、融合接合部配列を標的とする特異的プローブ対を用いて特性評価することができる。パートナー遺伝子が知られていない新規の融合体の遺伝子型は、５’及び３’エクソン不均衡によって特定することができる。融合接合部の５’上流及び３’下流のエクソン発現の比は、配列特異的プローブを用いてロバストに評価することができる。１からそれぞれ異なる５’／３’の発現の比は、したがって、融合事が発生の指標である。癌幹細胞中のＲｓｐｏ２およびＲｓｐｏ３のそれらの５’融合パートナー遺伝子によって駆動される発現の増加は、融合事象のさらなる強い指標である。Ｌｉｒａ ＭＥ，Ｋｉｍ ＴＭ，Ｈｕａｎｇ Ｄ，Ｄｅｎｇ Ｓ，Ｋｏｈ Ｙ，Ｊａｎｇ Ｂ，Ｇｏ Ｈ，Ｌｅｅ ＳＨ，Ｃｈｕｎｇ ＤＨ，Ｋｉｍ ＷＨ，Ｓｃｈｏｅｎｍａｋｅｒｓ ＥＦ，Ｃｈｏｉ ＹＬ，Ｐａｒｋ Ｋ，Ａｈｎ ＪＳ，Ｓｕｎ ＪＭ，Ａｈｎ ＭＪ，Ｋｉｍ ＤＷ，Ｍａｏ Ｍ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＡＬＫ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ２０１３ １５（１）：５１−６１、Ｌｉｒａ ＭＥ，Ｃｈｏｉ ＹＬ，Ｌｉｍ ＳＭ，Ｄｅｎｇ Ｓ，Ｈｕａｎｇ Ｄ，Ｏｚｅｃｋ Ｍ，Ｈａｎ Ｊ，Ｊｅｏｎｇ ＪＹ，Ｓｈｉｍ ＨＳ，Ｃｈｏ ＢＣ，Ｋｉｍ Ｊ，Ａｈｎ ＭＪ，Ｍａｏ Ｍ．Ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＡＬＫ，ＲＯＳ１，ａｎｄ ＲＥＴ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ２０１４ １６（２）：２２９−２４３を参照されたい。
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ及びその態様は、Ｇｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒ− ｃｏｄｅｄ ｐｒｏｂｅ ｐａｉｒｓ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６， ３１７−３２５（２００８）；米国特許第７，４７３，７６７号明細書、同第７，９４１，２７９号明細書及び同第７，９１９，２３７号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１０／０１１２７１０号明細書に記載されており、これらのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇはまた、Ｐａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｉｇｉｔａｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｓａｍｐｌｅｓ”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１９（６）：１７１４−１７２６（２００９）；及びＶｌａｄｉｓｌａｖ ｅｔ ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎａｌｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ”ＢＭＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｔｅｓ ２：８０（２００９）でも考察されており、これらのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｒ−スポンジンの遺伝子発現は、概して、ＷＮＴ経路の活性化と相関し、大部分の分化組織において不活性化されたＷＮＴシグナル伝達によって最小である。Ｒｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３コード遺伝子が、能動的に転写された遺伝子の３’末端に融合されるとき、それらの発現は、著しく増加して、腫瘍形成を推進する可能性が高い。図４は、腫瘍の１００ｎｇの全ＲＮＡ中のＲｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３転写物のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒによる定量化を示す。Ｒｅｐｏ２またはＲｓｐｏ３融合遺伝子を有する腫瘍におけるＲｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３転写物は、融合体を含まない腫瘍におけるものと比べて、１００×を超える。加えて、５’末端エクソンは、Ｒｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３がそれらのパートナーに融合するときには不在であり、その結果５’及び３’エクソンの不均衡をもたらす。したがって、Ｒｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３のｍＲＮＡにおける５’末端エクソンの量は、３’エクソンの量よりも顕著に低いが、これはそれらが、そのパートナー遺伝子に融合しているためである。
いくつかの実施形態では、Ｒｓｐｏ２及び／またはＲｓｐｏ３融合体の過剰発現は、融合体を含まない腫瘍（または正常組織）におけるものの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍を超えるか、またはそれ以上である。
Ｆ．Ｒｓｐｏ過剰発現及び／またはＲｓｐｏ融合遺伝子を有する対象のスクリーニングならびに治療
別の態様では、本発明は癌を患っている対象を、ポーキュパインアンタゴニストまたはインヒビターなどのＷｎｔ活性を阻害する組成物で治療すべきかどうかについての判定方法であって、（ａ）対象から生体試料を単離すること、（ｂ）生体試料についてアッセイを実施して、ＲｓｐｏのｍＲＮＡもしくはポリペプチドの発現を決定すること、及び／またはＲ−スポンジン融合体の有無を特定すること、ならびに（ｃ）生体試料がＲｓｐｏのｍＲＮＡまたはポリペプチドの過剰発現及び／またはＲ−スポンジン融合体を含む場合に、ポーキュパイン活性を阻害する組成物で対象を治療すべきかどうかを判定することを含み、ここでは、組成物は、本明細書に提供するポーキュパインインヒビターを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書で提供する組成物で対象を治療することをさらに含む。
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されているが、そうした実施形態は、例示のためだけに提供されることは当業者に明らかである。今や、多数の変形、変更及び置換が本発明を逸脱することなく当業者に思い浮かぶであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替形態を、本発明を実施する際に用いることができることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定め、こうした特許請求の範囲内の方法及び構造並びにこれらの均等物がそれに包含されることが意図される。
ＩＶ．Ｒｓｐｏ過剰発現及び／またはＲｓｐｏ融合遺伝子を有する対象のスクリーニングのためのアッセイならびにキット
別の態様では、本発明は、Ｒｓｐｏ２及び／またはＲｓｐｏ３遺伝子融合体ならびに／もしくは過剰発現について対象（例えば、ヒト患者）のスクリーニングを行うためのキットを提供する。
本発明のアッセイ用キット及び方法は、特定のＷｎｔインヒビターに応答性であると予測される患者、細胞、または組織を特定するために使用されてもよい。このようなコンパニオン診断用キットの使用は、承認された薬剤で使用するために政府の薬剤登録機関によって承認された他のコンパニオン診断検査と同様となる。例えば、ＡＬＫ４変異肺癌の治療用のクリゾチニブ及びＢＲＡＦ変異黒色腫の治療用のベムラフェニブに関する２０１１年の食品医薬品局（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）による承認書を参照されたい。
本発明のアッセイ用キット及び方法はまた、Ｗｎｔインヒビターに耐性である癌細胞の応答性を改善することができる治療の特定、及びＷＮＴインヒビターの応答を向上させる補助療法の開発にも有用であり得る。
本発明のアッセイ用キット及び方法は、膵臓癌または大腸癌などのＷｎｔインヒビターで治療され得るいずれかの癌、もしくは腺管癌、腺癌または黒色腫などのその増殖がＷｎｔインヒビターによって遅延され得るいずれかの腫瘍を有する患者に有用である。このような患者は、本明細書に提供する方法の結果として、Ｒｓｐｏ２またはＲｓｐｏ２遺伝子融合体及び／もしくは過剰発現を有さない場合、無効な療法の副作用及び経済的コストから免れることができる。本発明のアッセイ用キット及び方法は、医師にとっても有用であり、医師は、特定の患者に、彼らの腫瘍の分子特性に関する情報に基づいて、Ｗｎｔインヒビター療法を推奨することもでき、または推奨しないこともできる。本発明のアッセイ用キット及び方法はまた、まだ開発されていないヌクレオチドプローブで利用可能である有効なヒトＲスポンジンアッセイの開発の要求を増大させることにも有効である。
一実施形態では、本発明は、Ｗｎｔインヒビターの治療的投与から利益を得るかまたは利益を得ないと予測される癌患者を選択するためのアッセイ用キットを提供する。このアッセイ用キットは、
（ａ）腫瘍細胞の試料において、（ｉ）Ｒｓｐｏ２及び／またはＲｓｐｏ３遺伝子融合体；もしくは（ｉｉ）Ｒｓｐｏ２及び／またはＲｓｐｏ３遺伝子の発現レベルから選択されるバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせのレベルを検出するための手段またはシステムと、
（ｂ）（ｉ）Ｗｎｔインヒビターに対する感受性を検出するための対照試料、（ｉｉ）Ｗｎｔインヒビターに対する耐性を検出するための対照試料、（ｉｉｉ）Ｗｎｔインヒビターに対する感受性と相関したバイオマーカーの所定の対照レベルを含む情報、または（ｉｖ）Ｗｎｔインヒビターに対する耐性と相関したバイオマーカーの所定の対照レベルを含む情報から選択される対照と、を含む。
一実施形態では、このキットは、Ｒｓｐｏ２遺伝子またはＲｓｐｏ３遺伝子の融合体を検出するための手段システムをさらに含むことができる。
一実施形態では、突然変異を検出するための手段は、Ｒｓｐｏ２遺伝子またはＲｓｐｏ３遺伝子の一部とハイブリダイズするヌクレオチドプローブである。特定の実施形態では、検出手段は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）プローブである。検出手段のいずれも、検出可能な標識を含有する。検出手段のいずれも、基材上に固定化され得る。
このアッセイ用キットはまた、１つ以上の対照を含む。対照は、（ｉ）患者での使用について評価されるＷｎｔインヒビターに対する感受性を検出するための対照試料、（ｉｉ）Ｗｎｔインヒビターに対する耐性を検出するための対照試料、（ｉｉｉ）Ｗｎｔインヒビターに対する感受性または耐性に関して測定される特定のバイオマーカーの所定の対照レベル（例えば、Ｗｎｔインヒビターに対する感受性またはＷｎｔインヒビターに対する耐性と相関したＲｓｐｏ２及び／またはＲｓｐｏ３遺伝子融合体の所定の対照レベルならびに／もしくは過剰発現レベル）を含む情報を含むことができる。
このキットはまた、サンプリングされる細胞型に特徴的である対照マーカーを検出するための手段も含み、一般的に、例えば、本明細書に前に記載されたバイオマーカーの存在を検出するための方法によって、試料中の既知のマーカーの存在を検出する（核酸またはタンパク質レベルで）方法で使用することができる任意のタイプの試薬とすることができる。具体的には、この手段は、これが、細胞型を積極的に特定する、分析される細胞型の特定のマーカーを識別することを特徴とする。例えば、肺腫瘍アッセイにおいて、肺上皮細胞をバイオマーカー発現または生物活性のレベルについてスクリーニングすることが望ましい。したがって、対照マーカーを検出する手段は、上皮細胞及び好ましくは、肺上皮細胞に特徴的であるマーカーを特定し、これにより、細胞が、結合組織または炎症性細胞などの他の細胞型から識別される。このような手段は、本発明のアッセイの精度及び特異性を増加させる。このような対照マーカーを検出するための手段としては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でタンパク質マーカーをコードする核酸分子にハイブリダイズするプローブ、このような核酸分子を増幅するＰＣＲプライマー、標的分子上の立体配座的に区別できる部位に特異的に結合するアプタマー、または抗体、その抗原結合断片、もしくは試料中の対照マーカーに選択的に結合する抗原結合ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。多くの細胞マーカーについての核酸及びアミノ酸配列が当該技術分野において既知であり、このような検出用の試薬を生成するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、アッセイまたはキットは、ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムのプローブ及び他の必要な試薬を含む。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイは、融合接合部を検出し、遺伝子発現を評価する際に、複数の設計：（１）コードセット設計（溶液中でハイブリダイズするｍＲＮＡ当たり２〜５０個の塩基プローブを使用する。レポータープローブは、シグナルを運び、捕捉プローブは、データ収集のために複合体を固定化させる）、（２）成分タグセットＧＰＲ設計（使用者が彼らの独自のアッセイを組み立てることを可能にするＮａｎｏＳｔｒｉｎｇの特許技術に基づいて、デジタル分子バーコーディング化学を利用する）、及び（３）ユニバーサル接合部配列設計（高度に特異的な検出を可能にするために、足掛かり配列交換技術を利用する）で実行することができる。
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本発明の化合物の調製を説明する下記及び実施例によって本発明をさらに例示するが、これらに限定されない。
省略形 定義または説明
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＥＡ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ｅｑ． 当量
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＲＴ 室温
ＥＡ 酢酸エチル
Ｐｄ２（ｄｂａ）３ トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）
ｓ−Ｐｈｏｓ ２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジメトキシビフェニル
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４ テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム
実施例１
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン（化合物番号１）の合成
Figure 2021130694
ステップ１：
Figure 2021130694
２−シアノアセトアミド（５０ｇ、６０１．８ｍｍｏｌ）及びアセト酢酸エチル（７５ｍＬ、６０１．８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨに溶解した。ＫＯＨ（３７．０ｇ、１．１ｅｑ）をＭｅＯＨに溶解し、混合物に滴下すると、若干の白色固体が生じた。この混合物をリフレックス（ｒｅｆｌｅｘ）まで油浴で８時間加熱し、次いでＲＴに冷却した。固体を濾過し、次いで熱水に再溶解し、次いで再度濾過した。濾過物に６Ｎ ＨＣｌを加えて、ｐＨ＜７まで中和した。白色固体が再度生じ、これを濾過した。この固体をＭｅＯＨ、水及びＭｅＯＨでさらに洗浄し、次いで真空で乾燥させて、最終生成物の３−エチニル−４−メチルピリジン−２，６−ジオールを得た（収率約４１％）。
ステップ２：
Figure 2021130694
３−エチニル−４−メチルピリジン−２，６−ジオール（２８．０ｇ、１９５．２ｍｍｏｌ）をＰＯＣｌ３（６０．０ｍＬ）に溶解した。この反応混合物を圧力管中に密封し、１８０℃まで６時間加熱した。反応物を室温に冷却した後、過剰なＰＯＣｌ３を真空下で除去した。この混合物中にゆっくりと砕氷を加えると、固体が生じた。この固体を濾過して取り出し、真空下で乾燥させて、さらなる純度を要さずに、最終生成物の２，６−ジクロロ−４−メチルピリジン−３−カルボニトリルを得た（収率約９２％）。
ステップ３：
Figure 2021130694
２，６−ジクロロ−４−メチルピリジン−３−カルボニトリル（２０．０ｇ、１０７．５ｍｍｏｌ）を２００ｍＬのイソプロピルアルコールに入れたものをΝ，Ν−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１２．８２ｇ、１０７．５ｍｍｏｌ）に加え、この反応物を６５℃で１８時間攪拌した。この反応物をＲＴに冷却した後、濾過によって沈殿物を採取し、５０ｍＬのイソプロピルアルコールで洗浄し、風乾して、さらに精製することなしに、生成物の２，６−ジクロロ−４−（（Ｅ）−２−（ジメチルアミノ）ビニル）ピリジン−３−カルボニトリルを得た（収率約２６％）。
ステップ４：
Figure 2021130694
２，６−ジクロロ−４−（（Ｅ）−２−（ジメチルアミノ）ビニル）ピリジン−３−カルボニトリル（４．０ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの濃ＨＣｌとともに封管に加えた。この反応物を、４５℃で１８時間攪拌した。この反応物をＲＴに冷却した後、氷水を溶液に加えると、濃黄色スラリーが得られた。この沈殿物を濾過によって採取し、冷水、エーテル及び酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥させて、淡黄色固体の６，８−ジクロロ−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オンを得た（収率約８０％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２１５．０（Ｍ＋１）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．７５（ｓ，１Ｈ）、７．７６（ｓ，１Ｈ）、７．５０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）、６．５２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）。
ステップ５：
Figure 2021130694
６，８−ジクロロ−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オン（３．０ｇ、１３．９６ｍｍｏｌ）をｉＰｒＯＨ（１２０ｍＬ）に溶解して、一種の懸濁液を形成した。この溶液を氷浴中で０℃に冷却し、次いで、ヒドラジン溶液（５．６ｇ、８０％、１０ｅｑ）を滴下した。この混合物をＲＴで１５分間攪拌し、次いで、油浴中で５５℃で一晩加熱した。反応混合物をＲＴに冷却した後、濾過して固体を直接的に得、次いで、この固体を７０ｍＬのＭｅＯＨで洗浄し、真空で乾燥した。生成物の６−クロロ−８−ヒドラジニル−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オン（収率約９８％）を、さらに精製することなしに、直接的に次のステップの反応で使用した。
ステップ６：
Figure 2021130694
６−クロロ−８−ヒドラジニル−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オン（１．５０ｇ、７．１２ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ（９０ｍＬ）中に溶解して、一種の懸濁液を形成した。１Ｎ ＮａＯＨ（１７．８０ｍＬ、２．５ｅｑ）を加え、次いで、等量の水（１０７．８０ｍＬ）をこの混合物に加えた。この反応混合物を５０℃で加熱し、透明な溶液になるまで攪拌した。この溶液を再度０℃に冷却し、ＮａＯＣｌ（１１．０５ｇ、１２％溶液、２．５ｅｑ）を滴下し、次いで、反応物をＲＴで一晩攪拌した。反応が終了した後、この溶液を０℃に冷却し、次いで、１Ｎ ＨＣｌに加えて中和（ｐＨ約６）した。沈殿物を採取し、１００ｍＬ×２回のＥＡで濾液を抽出した。有機層を混合し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、さらなる粗生成物を得た。混合した固体材料の６−クロロ−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オン（収率約９３％）を、さらに精製することなしに次の反応に使用した。ＭＳ ｍ／ｚ １８１．１（Ｍ＋１）。
ステップ７：
Figure 2021130694
６−クロロ−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オン（４００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を、圧力管中のＰＯＣｌ３（２０．０ｍＬ）に加えた。この反応混合物を１６０℃まで４時間加熱して、透明な溶液を得た。この溶液を室温に冷却し、ＤＣＭ中に注ぎ、ゆっくりと砕氷を加えた。飽和ＮａＨＣＯ３をこの混合物に加えて反応物中に生成したＨＣｌを中和した。真空処理してＤＣＭを除去し、残った水溶液を１００ｍＬ×２回のＥＡで抽出した。混合した有機層をブラインで１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで真空下で蒸発させて、固体の１，６−ジクロロ−２，７−ナフチリジン（収率約７３％）を得て、さらに精製することなしに、次のステップの反応で使用した。ＭＳ ｍ／ｚ １９９．０（Ｍ＋１）。
ステップ８：
Figure 2021130694
（４−ブロモフェニル）メタンアミン（１．００ｇ、５．３７ｍｍｏｌ）及び２−メチルピリジン−４−イル−４−ボロン酸（８８３．３０ｍｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を、ＢｕＯＨ（１０．０ｍＬ）及び水（２．０ｍＬ）に溶解した。Ｋ３ＰＯ４（２．２８ｇ、１０．７５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１２０．２０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及びＳ−ｐｈｏｓ（２２０．７０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をＮ２下で加えた。この反応混合物を圧力管中に密封し、１２５℃まで１時間加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、この混合物を水に注ぎ、１００ｍＬ×３回のＥＡで抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮して、粗生成物を得た。（約２ＮのＮＨ３を含む）１０％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を用いるシリコンゲルカラムによってこの固体を精製して、純粋な（４−（２−メチルピリジン−４−イル）フェニル）メタンアミン（収率約８９％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １９９．１（Ｍ＋１）。
ステップ９：
Figure 2021130694
１，６−ジクロロ−２，７−ナフチリジン（１６０ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）及び（４−（２−メチルピリジン−４−イル）フェニル）メタンアミン（２３９．１０ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をＢｕＯＨ（５．０ｍＬ）に溶解し、１１５℃まで一晩加熱した。反応物をＲＴに冷却してから、真空下で有機溶媒を除去した。この粗生成物を、ＥＡ／ヘキサン（１：１）を用いるシリコンゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、固体のＮ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−クロロ−２，７−ナフチリジン−１−アミン（収率約９０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ３６１．１（Ｍ＋１）。
ステップ１０：
Figure 2021130694
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−クロロ−２，７−ナフチリジン−１−アミン（５０．００ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及び２−メチルピリジン−４−イル−４−ボロン酸（５６．９０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を、ＢｕＯＨ（３．０ｍＬ）及び水（０．６ｍＬ）に溶解した。Ｋ３ＰＯ４（８８．２０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（６．２０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）及びＳ−ｐｈｏｓ（１１．４０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下でこの混合物に加えた。この反応物を圧力管中に密封し、１０５℃まで一晩加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、この混合物を水に注ぎ、ＥＡで３回抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。この粗生成物を５％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を用いる分取ＴＬＣによってさらに精製して、最終生成物のＮ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン（収率約７０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ４１８．２（Ｍ＋１）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．４６（ｓ，３Ｈ）、２．６３（ｓ，３Ｈ）、４．９４（ｄ，Ｊ＝５．１０Ｈｚ，２Ｈ）、５．９４（ｂｒ，１Ｈ）、６．９７（ｄ，Ｊ＝５．７０Ｈｚ，１Ｈ）、７．３１（ｄ，Ｊ＝４．２０Ｈｚ，１Ｈ）、７．３６（ｓ，１Ｈ）、７．５４（ｄ，Ｊ＝８．１０Ｈｚ，２Ｈ）、７．６３（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ）、７．９０（ｓ，１Ｈ）、８．１９（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ）、８．２２（ｓ，１Ｈ）、８．５１（ｍ，２Ｈ）、９．０８（ｓ，１Ｈ）、９．３０（ｓ，１Ｈ）。
実施例２
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン（化合物番号２）の合成
Figure 2021130694
ステップ１：
Figure 2021130694
６−クロロ−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オン（２００ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）及び２−メチルピリジン−４−イル−４−ボロン酸（２２７．６０ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を、ＢｕＯＨ（５．０ｍＬ）及び水（１．０ｍＬ）に溶解した。Ｋ３ＰＯ４（７０５．２０ｇ、３．３２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（４９．６０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）及びＳ−ｐｈｏｓ（９１．００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＮ２下で加えた。圧力管中の反応混合物を１３０℃まで１時間加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、この混合物を水に注ぎ、ＥＡで３回抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮して、粗製物を得た。この粗生成物を５％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を用いるカラムで精製して、最終化合物の６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オンを得た（収率約６１％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２３８．１（Ｍ＋１）。
ステップ２：
Figure 2021130694
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１（２Ｈ）−オン（１５０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）をＰＯＣｌ３（１５．０ｍＬ）に溶解し、圧力管を密封し、１６０℃まで４時間加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、過剰なＰＯＣｌ３を真空下で除去した。砕氷を混合物中にゆっくりと加え、次いで、ＮａＨＣＯ３中に加えて、ｐＨ約７．５まで中和した。この溶液をＥＡで３回抽出し、混合した有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。この粗製物をＥＡ／ヘキサン（１：１）を用いるカラムで精製して、化合物の１−クロロ−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジンを得た（収率約５５％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２５６．１（Ｍ＋１）。
ステップ３：
Figure 2021130694
１−クロロ−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン（１０．００ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）及び（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）フェニル）メタンアミン（１０．００ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍＬ）に溶解した。ＫＯｔＢｕ（８．８０ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．９０ｍｇ、０．００３９ｍｍｏｌ）及びＢＩＮＡＰ（４．９０ｍｇ、０．００７８ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下でこの混合物に加えた。この反応物を、１００℃まで一晩加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、この混合物を水に注ぎ、ＥＡで３回抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで真空下で濃縮した。この粗生成物をＥＡ／ヘキサン（４：１）による分取ＴＬＣで精製し、Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン（８．８ｍｇ、収率約５２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．３１（ｓ，３Ｈ）、２．６３（ｓ，３Ｈ）、２．７０（ｓ，３Ｈ）、４．９１（ｄ，Ｊ＝５．１０Ｈｚ，２Ｈ）、５．８８（ｂｒ，１Ｈ）、７．００（ｄ，Ｊ＝５．４０Ｈｚ，１Ｈ）、７．０８（ｄ，Ｊ＝５．１０Ｈｚ，１Ｈ）、７．１２（ｓ，１Ｈ）、７．２２（ｄ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ，１Ｈ）、７．３６（ｍ，２Ｈ）、７．７７（ｄ，Ｊ＝４．５０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８８（ｓ，１Ｈ）、７．９８（ｓ，１Ｈ）、８．２４（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，１Ｈ）、８．５３（ｄ，Ｊ＝４．８０Ｈｚ，１Ｈ）、８．６４（ｄ，Ｊ＝５．４０Ｈｚ，１Ｈ）、９．３１（ｓ，１Ｈ）。ＭＳ ｍ／ｚ ４３２．２（Ｍ＋１）。
実施例３
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン（化合物番号３）の合成
Figure 2021130694
ステップ１：
Figure 2021130694
６−ブロモイソキノリン（１．８０ｇ、８．６６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶解し、この反応物０℃に冷却した後、ｍ−ＣＰＢＡ（２．３０ｇ、１．３ｅｑ、最大７７％）を少量ずつゆっくりと加えた。この反応物をＲＴまで温めると、一種の白色懸濁液になった。４時間内に、１００ｍＬのＤＣＭをこの溶液に加え、飽和Ｎａ２ＣＯ３溶液、水及びブラインで洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で除去して、さらに精製することなしに、黄色固体のＮ‐オキシド６−ブロモイソキノリンを得た（１．８２ｇ、収率約９３％）。
ステップ２：
Figure 2021130694
Ｎ‐オキシド６−ブロモイソキノリン（１．８２ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶解し、ＰＯＣｌ３（１．１２ｍＬ、１．５ｅｑ）をＲＴで滴下した。この反応物を４５℃に２時間加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、ＤＣＭ及び過剰なＰＯＣｌ３を真空下で除去した。この粗製物を１００ｍＬのＤＣＭに再溶解し、飽和Ｎａ２ＣＯ３、水及びブラインで洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、褐色固体を得た。この粗製物を、２％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を使用するフラッシュカラムで精製して、淡黄色固体の６−ブロモ−１−クロロイソキノリンを得た（１．２７ｇ、収率約６５％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２４２．０（Ｍ＋１）。
ステップ３：
Figure 2021130694
（６−クロロピリジン−３−イル）メタンアミン（３００ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）及び２−メチルピリジン−４−イルボロン酸（３４５ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を、ｎ−ブタノール（１０ｍＬ）及び水（２ｍＬ）を有する圧力管に溶解した。Ｋ３ＰＯ４（８９３ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（９６．３ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ）及びＳ−ｐｈｏｓ（８６．４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を窒素保護下で加えた。この反応物を１２５℃に３０分間加熱し、次いで室温に冷却した。この溶液を水に引き込み、 ＥＡで３回抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。この粗製物を（約２ＮのＮＨ３を含む）１０％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を用いるフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製し、純粋な（６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル）メタンアミンを得た（０．１９ｇ、収率約４５％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２００．１（Ｍ＋１）。
ステップ４：
Figure 2021130694
６−ブロモ−１−クロロイソキノリン（１００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）及び（６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル）メタンアミン（１６５ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を、封管中の０．５ｍＬのｎ−ＢｕＯＨに溶解した。この反応物を１６０℃まで６時間加熱し、ＲＴに冷却した。この粗製物を、（約２ＮのＮＨ３を含む）８％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を使用するフラッシュクロマトグラフィーで精製して、純粋な６−ブロモ−Ｎ−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル）メチル）イソキノリン−１−アミンを得た（１１６ｍｇ、約７０％）。ＭＳ ｍ／ｚ ４０５．２（Ｍ＋１）。
ステップ５：
Figure 2021130694
６−ブロモ−Ｎ−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、３−フルオロフェニルボロン酸（１０．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５．８ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を、圧力管に加えた。ジオキサン／水 （３：１、２ｍＬ）をこの管に加え、１２５℃に１０分間加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、この溶液を５０ｍＬの水で希釈し、ＥＡで３回抽出した。混合した有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。この粗製物を、（約２ＮのＮＨ３を含む）１０％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を用いるフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製し、純粋な６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル）メチル）イソキノリン−１−アミンを得た（１５．８ｍｇ、約７５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．７１（ｓ，３Ｈ）、５．００（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．３２〜７．３８（ｍ，２Ｈ）、７．５９〜７．６５（ｍ，１Ｈ）、７．７５〜７．８３（ｍ，３Ｈ）、８．１０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．２１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．２７〜８．３１（ｍ，２Ｈ）、８．３９（ｓ，２Ｈ）、８．７２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．７９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．９１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）、１０．０２（ｓ，１Ｈ）。ＭＳ ｍ／ｚ ４２１．２（Ｍ＋１）。
実施例４
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン（化合物番号４）の合成
Figure 2021130694
ステップ１：
Figure 2021130694
１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン（２．９ｇ、１９．８４ｍｍｏｌ）をＰＯＣｌ３（４０ｍＬ）に溶解し、１００℃まで２４時間加熱した。この反応物を室温に冷却した後、過剰なＰＯＣｌ３を真空下で除去した。飽和Ｎａ２ＣＯ３溶液に入れた少量の砕氷をゆっくりと加えると、多くの気泡及び固体が生じた。この固体を濾過し、溶液をＥＡで３回抽出した。混合した有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。混合した固体を真空下でさらに乾燥させて、さらに精製することなしに、５−クロロ−１，６−ナフチリジンを得た（２．６ｇ、収率約８０％）。ＭＳ ｍ／ｚ １６５．１（Ｍ＋１）。
ステップ２：
Figure 2021130694
５−クロロ−１，６−ナフチリジン（１．５ｇ、９．１１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４５ｍＬ）に溶解し、氷浴で冷却し、ｍ−ＣＰＢＡ（３．７ｇ、２ｅｑ、最大７７％）を少量ずつ、ゆっくりと加えた。この反応物をＲＴまで３時間続けて温めた。１００ｍＬを超えるＤＣＭをこの溶液に加え、飽和Ｎａ２ＣＯ３溶液、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮して、さらに精製することなしに、黄色固体のＮ‐オキシド５−クロロ−１，６−ナフチリジンを得た（１．２５ｇ、収率約７６％）。
ステップ３：
Figure 2021130694
Ｎ‐オキシド５−クロロ−１，６−ナフチリジン（１．２ｇ、６．６４ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ（１．８５ｍＬ、１３．２９ｍｍｏｌ）を加え、続いてＰＯＣｌ３（０．９３ｍＬ、９．９７ｍｍｏｌ）の５ｍＬ無水ＤＣＭ溶液を滴下した。この反応物を４８℃に２時間加熱した。１００ｍＬを超えるＤＣＭをこの溶液に加え、飽和Ｎａ２ＣＯ３溶液、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮して、黄色固体を得た。この粗製物を、ＥＡ／ヘキサン（１：４）を用いるシリコンカラムでさらに精製して、白色固体の２，５−ジクロロ−１，６−ナフチリジン（０．６ｇ、収率約４５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １９９．０（Ｍ＋１）
ステップ４：
Figure 2021130694
２，５−ジクロロ−１，６−ナフチリジン（２００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、２−メチルピリジン−４−イル−４−ボロン酸（１３７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（４２４ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１１６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、ジオキサン１６ｍＬ及び水４ｍＬをさらに加えた。この反応物を非常によく攪拌し、９０℃に４時間加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、この溶液を１００ｍＬの水で希釈し、ＥＡで３回抽出した。混合した有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で濃縮した。この粗製物をＥＡ／ヘキサン（１：１）を用いるフラッシュクロマトグラフィーでさらに精製して、固体の５−クロロ−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジンを得た（１４３ｍｇ、収率約５６％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２５６．１（Ｍ＋１）
ステップ５：
Figure 2021130694
５−クロロ−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン（２０．００ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）及び（４−（２−メチルピリジン−４−イル）フェニル）メタンアミン（２５ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）をトルエン（２．０ｍＬ）に溶解した。ΚＯｔＢｕ（１３．２ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（２．７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びＢＩＮＡＰ（１５．０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下でこの混合物に加えた。この反応物を、１００℃まで一晩加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、この混合物を水に注ぎ、ＥＡで３回抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで真空下で濃縮した。この粗生成物を、８％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液による分取ＴＬＣで、Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミンに精製した（３１ｍｇ、収率約６１％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．１２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．７７〜８．８３（ｍ，２Ｈ）、８．４９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．４０（ｓ，１Ｈ）、８．３１（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．２１（ｓ，１Ｈ）、８．１１（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）、８．０６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．２３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．７６（ｓ，１Ｈ）、４．９３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．７２（ｓ，６Ｈ）。ＭＳ ｍ／ｚ ４３２．２（Ｍ＋１）。
実施例５
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン（化合物番号５）の合成
Figure 2021130694
ステップ１：
Figure 2021130694
２０ｍＬのエタノールに、フェニルグリオキサール一水和物（９４０ｍｇ、６．９９ｍｍｏｌ）及び２−クロロ−３，４−ジアミノピリジン（１０００ｍｇ、６．９９ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を一晩還流した。反応物を冷却した後、粗製の沈殿生成物を濾過し、１５ｍＬのエタノールで洗浄し、真空下で乾燥させて、さらに精製することなしに、５−クロロ−２−フェニルピリド［３，４−ｂ］ピラジンを得た（１．２８ｇ、収率約７６％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２４１．０（Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．８２（ｓ，１Ｈ）、８．６４（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．３８〜８．４３（ｍ，２Ｈ）、８．０７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．６４〜７．６８（ｍ，３Ｈ）。
ステップ２：
Figure 2021130694
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−フェニルピリド［３，４−ｂ］ピラジン−５−アミン（５０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）及び（４−（２−メチルピリジン−４−イル）フェニル）メタンアミン（４２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）をトルエン（４．０ｍＬ）に溶解した。ＫＯｔＢｕ（２４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（４．５ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）及びΒＩΝΑΡ（２６．４ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下でこの混合物に加えた。この反応物を、１００℃まで一晩加熱した。この反応物をＲＴに冷却した後、この混合物を水に注ぎ、ＥＡで３回抽出した。混合した有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで真空下で濃縮した。この粗生成物を７％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液を使用するフラッシュクロマトグラフィーで精製して、Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミンを得た（６１ｍｇ、収率約７２％）。ＭＳ ｍ／ｚ＝４０４．２（Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５３（ｓ，１Ｈ）、８．７７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．３５〜８．３９（ｍ，２Ｈ）、８．２１（ｓ，１Ｈ）、８．１１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．０７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．６０〜７．６５（ｍ，５Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．７６（ｓ，１Ｈ）、４．９０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．７１（ｓ，３Ｈ）。
実施例６
ＲＮＡ抽出及びＳＹＢＲグリーンリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造元の指示に従って凍結腫瘍組織から単離し、第１のｃＤＮＡ中に逆転写した。Ｒｓｐｏ２フォワードプライマー５’−ＡＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡ−３’（配列番号１）及びリバースプライマー５’ＴＣＣＣＣＡＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣ−３’（配列番号２）。ＧＡＰＤＨフォワードプライマー５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴ−３’（配列番号３）及びリバースプライマー５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号４）。１：２００に希釈したｃＤＮＡテンプレートをＧＡＰＤＨ増幅に用いた。Ｒｓｐｏ２、Ｒｓｐｏ３、及びＧＡＰＤＨについてのＰＣＲ増幅プロファイルは、９４℃で１０分間の１サイクル、続いて９４℃で１５秒間及び６０℃で１分間からなる２段階での４０サイクルであった。産物の蛍光強度を、各サイクルの終わりに測定し、プライマー−ダイマーまたは他の非特異的産物を検出し、標的の特異性を確認するためにポストＰＣＲ融解曲線分析を実施した。増幅、データ取得及び分析を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲ装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実行した。特異的プライマーを用いる各試料の３回の複製を、陽性対照及び陰性対照と共に、９６ウェルプレートで実施した。陽性及び陰性対照は、Ｐｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３の発現が以前に特性評価された腫瘍組織からの全ＲＮＡであった。Ｒｓｐｏ２及びＥｓｐｏ３の関係性をΔＣｔ（ΔＣｔ＝Ｃｔ（Ｒｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）である）によって判定した。
５’ＲＡＣＥ、クローニング及びシーケンシング
ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＲＡＣＥ５’／３’キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、製造元の指示に従って、全ＲＮＡを用いてヒトＲｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３のｍＲＮＡの５’末端を増幅した。
Ｒｓｐｏ２エクソン２遺伝子特異的プライマー５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号５）、エクソン３遺伝子特異的プライマー５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＴＡＣＴＧＧＣＧＣＡＴＣＣＣ−３’（配列番号６）、エクソン３ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＣＡＴＡＧＴＡＣＣＣＧＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号７）。Ｒｓｐｏ３エクソン３遺伝子特異的プライマー５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣ−３’（配列番号８）及びエクソン３ネスティッド遺伝子特異的プライマー５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣ ＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＣＣ−３’（配列番号９）。１５ｎｔのインフュージョン（ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ）クローニングプライマー（下線部）を、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＲＡＣＥ５’／３’キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、ＲＡＣＥ産物クローニングの５’末端に組み込んだ。
５’ＲＡＣＥ産物を、インフュージョンベクター中にクローンした。１０個のクローンのインサートを、Ｍ１３プライマーによって配列決定し、ＮＣＢＩヌクレオチドＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）により分析した。
Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ成分化学技術
ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイを、特注設計された成分化学プローブを用いて、製造元のプロトコール（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）に従って実施した。簡単に言うと、１５０ｎｇの全ＲＮＡを、ｎＣｏｕｎｔｅｒプローブセットに、６７℃で１７．７５時間、次いで４℃に下降させて約３時間ハイブリダイズした。試料を、自動化ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を使用して処理した。次いで、固定化され整列されたレポーター複合体を含有するカートリッジを、ｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザー（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で画像撮影した。レポーター数をＮａｎｏＳｔｒｉｎｇのｎＳｏｌｖｅｒ分析ソフトウェア２．０．を使用して収集し、陽性対照及びハウスキーピング遺伝子で分析した。
Figure 2021130694
Figure 2021130694
Figure 2021130694
Figure 2021130694
Ｒｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３のそれらの５’融合遺伝子による発現の増加
Ｒｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３転写物の量は、腫瘍試料（ｎ＝１９２）の約５％及び８％で増加した。５’ＲＡＣＥ及びＤＮＡシーケンシングは、Ｒｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３転写物の上方制御が、その５’融合遺伝子発現によって駆動されることを特定した。
Figure 2021130694
特定された新規のＲｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３転写物
種々の新規のＲｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３遺伝子融合体転写物が特定された。
表５：新規のＲｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３融合遺伝子
Figure 2021130694
Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイによる融合遺伝子の特性評価
Ｒｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３融合遺伝子を担持する腫瘍組織を用いて、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子型決定アッセイを検証した（図３、表７）。融合体接合部プローブを、５’ＲＡＣＥ及びシーケンシングによって特性評価された融合遺伝子型を標的化するように特異的に設計した。既知のまたは新規のＲｓｐｏ２／Ｒｓｐｏ３融合遺伝子型に対する判断過程を、図１及び図２に示した。
Ｒｓｐｏ２発現を、エクソン２、エクソン５及びエクソン６を標的化するプローブによって評価した。エクソン２中の開始コドンＡＴＧ残基は、完全長ｒｓｐｏ２タンパク質を融合遺伝子から産生する。Ｒｓｐｏ２のエクソン１は、いかなるＲｓｐｏ２融合遺伝子型においても観察されなかったが、野生型Ｒｓｐｏ２転写物中でのみ存在することが判明した。
Ｒｓｐｏ３発現を、エクソン３／４及びエクソン５を標的化するプローブによって評価した。オープンリーディングフレームＲｓｐｏ３は、その５’融合遺伝子のインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）配列に依存する。
特性評価された新規のＲｓｐｏ２融合遺伝子型を有する５つの腫瘍組織及びＲｓｐｏ３融合遺伝子型を有する１つの試料を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子型決定アッセイにより、それらの融合体接合部を用いて正確に特定した。これに対応して、Ｒｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３発現がこれらの試料において観察された。Ｌ４４０のＲｓｐｏ２シグナルの増加を、エクソン１、２、５及び６プローブで見出した。５’ＲＡＣＥ及びシーケンシングは、Ｌ４４０が、主に完全なＲｓｐｏ２のｍＲＮＡを担持し、その発現が融合遺伝子によっては駆動されないことを特定した。
Figure 2021130694
実施例７
Ｒｓｐｏ２／３融合体モデルでのＰＤｘ有効性試験
ＣＧＸ１３２１の抗腫瘍活性を、マウス異種移植モデルにおいてＲｓｐｏ２またはＲｓｐｏ３融合遺伝子を有する結腸直腸及び胃腫瘍で調べた。８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、２×２×２ｍｍの腫瘍断片を右脇腹に皮下接種し、腫瘍を成長させた。平均体積がおよそ１００〜１５０ｍｍ３に達するまで、腫瘍の成長を妨害させなかった。次いでマウスを、対照群及び処置群に無作為に分けた。ＣＧＸ１３２１を、所定の投与計画で、腫瘍保有マウスに２１〜２８日間経口投与した。腫瘍の測定をノギスで週２回行い、腫瘍体積（ｍｍ３）を、式：ＴＶ＝ａ×ｂ２／２（式中、ａ及びｂは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である）を用いて推定した。体重を、腫瘍の測定と同時に評価した。
（付記）
（付記１）
癌と診断され、そうした治療を必要としている対象における、Ｒ−スポンジン融合体の発現を特徴とする癌の治療方法であって、
ポーキュパインのアンタゴニストの治療有効量を含む医薬組成物を、癌と診断された対象に投与することを含み、
前記対象が、Ｒ−スポンジン融合体を有すると判定されている、方法。
（付記２）
前記Ｒ−スポンジン融合体が、
（１）ＰＴＰＲＫｅ１−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；
（２）ＰＴＰＲＫｅ７−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；
（３）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；または
（４）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体を含む、付記１に記載の方法。
（付記３）
前記Ｒ−スポンジン融合体が、
（１）ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；
（２）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；
（３）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体；
（４）ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；
（５）ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；または
（６）ＰＴＰＲＫｅ６Ｘ−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体を含む、付記１に記載の方法。
（付記４）
前記対象が、Ｒ−スポンジン融合体を有さないと判定された対照の対象におけるＲ−スポンジンのｍＲＮＡ発現レベルよりも高い前記Ｒ−スポンジンのｍＲＮＡ発現レベルを有すると判定されている、付記１〜３のいずれか１つに記載の方法。
（付記５）
前記Ｒスポンジン融合体が、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６２、または配列番号６３のうちのいずれか１つの接合部配列を含む、付記２に記載の方法。
（付記６）
前記ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体が、配列番号６４の接合部配列を含む、付記３に記載の方法。
（付記７）
前記ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体が、配列番号６５の接合部配列を含む、付記３に記載の方法。
（付記８）
前記ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体が、配列番号６６の接合部配列を含む、付記３に記載の方法。
（付記９）
前記ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体が、配列番号６７の接合部配列を含む、付記３に記載の方法。
（付記１０）
前記ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体が、配列番号６１の接合部配列を含む、付記３に記載の方法。
（付記１１）
前記ＰＴＰＲＫｅ６Ｘ−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体が、配列番号６０の接合部配列を含む、付記３に記載の方法。
（付記１２）
前記Ｒスポンジンが、Ｒｓｐｏ２またはＲｓｐ３であり、前記融合遺伝子が、別の遺伝子に融合されていない前記Ｒスポンジンと比べて過剰発現される、付記１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
（付記１３）
前記ポーキュパインアンタゴニストが、式（Ｉ）：
Figure 2021130694
 の化合物または生理学的に許容し得るその塩を含み、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Χ６、Ｘ７、Ｘ８が独立に、ＣＲ４またはＮであり、
Ｙ１が水素またはＣＲ４であり、Ｙ２、Ｙ３は独立に、水素、ハロ、またはＣＲ３であり、
Ｒ１が、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ２が、水素、ハロ、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ３が、水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されているＣ１〜６アルコキシであり、
Ｒ４が、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）である、付記１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
（付記１４）
前記５または６員ヘテロアリールが、
Figure 2021130694
 から選択され、式中、
Ｒ４が、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ８が水素またはＣ１〜６アルキルである、付記１３に記載の方法。
（付記１５）
Ｒ１及びＲ２が独立に、１または２個のＲ４基で置換されている、付記１３または１４に記載の方法。
（付記１６）
前記化合物が、
６−（２−メチルピリジン−４−イル）Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’メチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリミジン−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
３−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
６−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−ｍ−トリル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（５−フェニルピリジン−２−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（ピリダジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−モルホリノ−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）アミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（４−クロロベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−メチルベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−ベンジル−２−（３−フルオロフェニル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（６−（３−フルオロフェニル）ピリジン−３−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２−フルオロビフェニル−４−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピリジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（３−フルオロフェニル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２（２−メチルピリジン−４−イル）−ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｓ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｒ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
１−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン；
６−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（チアゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（オキサゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−フルオロピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
メチル４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−２−オン；
２−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）アセトニトリル；
２−メチル−４−（４−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）フェニル）ピリジン１−オキシド；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）ベンゾニトリル；
Ｎ−（３−メトキシ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−クロロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル））−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２’−メチル−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）−２，４’ビピリジン−３−カルボニトリル；及び
Ｎ−（４−（２−（ジフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン、または生理学的に許容し得るその塩から選択される、付記１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
（付記１７）
前記ポーキュパインアンタゴニストが、式（II）：
Figure 2021130694
 （ＩＩ）
の化合物または生理学的に許容し得るその塩を含み、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が、Ｎ及びＣＲ７から選択され、
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８のうちの１つが、Ｎであり、他はＣＨであり、
Ｘ９が、Ｎ及びＣＨから選択され、
Ｚが、フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニル及びピペラジニルから選択され、
Ｚの各フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルまたはピペラジニルが、任意に、Ｒ６基で置換され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、水素であり、
ｍが１であり、
Ｒ４が、水素、ハロ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル及びメチルから選択され、
Ｒ６が、水素、ハロ、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０から選択され、Ｒ１０はメチルであり、及び
Ｒ７が、水素、ハロ、シアノ、メチル及びトリフルオロメチルから選択される、付記１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
（付記１８）
前記化合物が、
Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）ピリジン−２−イル］−２−［５−メチル−６−（ピリダジン−４−イル）ピリジン−３−イル］アセトアミド；
２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミド（ＬＧＫ９７４）；
Ｎ−（２，３’−ビピリジン−６’−イル）−２−（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−メチル−３−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；及び
２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）−Ｎ−（５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル）アセトアミド、または製薬上許容し得るその塩の群から選択される、付記１７に記載の方法。
（付記１９）
前記化合物が、２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミドである、付記１８に記載の方法。
（付記２０）
前記化合物の前記治療有効量が、１日投薬量で、体重あたり約０．０１から２０ｍｇ／ｋｇである、付記１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
（付記２１）
前記化合物の治療有効量が、ヒトに関して、約０．５ｍｇから約１０００ｍｇである、付記２０に記載の方法。
（付記２２）
前記癌が、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、胆管癌、膵臓癌、子宮内膜癌、または前立腺癌である、付記１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
（付記２３）
癌を患っている対象を、Ｗｎｔ活性を阻害する組成物で治療すべきかどうかについての判定方法であって、
（ａ）前記対象から生体試料を単離すること、
（ｂ）前記生体試料についてアッセイを実施して、Ｒ−スポンジン融合体の有無を特定すること、及び
（ｃ）前記生体試料がＲ−スポンジン融合体を含む場合に、ポーキュパインのアンタゴニストの治療有効量を含む組成物で前記対象を治療すべきと判定することを含む、方法。
（付記２４）
前記Ｒ−スポンジン融合体が、
（１）ＰＴＰＲＫｅ１−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；
（２）ＰＴＰＲＫｅ７−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；
（３）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；または
（４）ＥＩＦ３Ｅｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体を含む、付記２３に記載の方法。
（付記２５）
前記Ｒ−スポンジン融合体が、
（１）ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；
（２）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；
（３）ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体；
（４）ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体；
（５）ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体；または
（６）ＰＴＰＲＫｅ６Ｘ−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体を含む、付記２３に記載の方法。
（付記２６）
前記対象が、Ｒ−スポンジン融合体を有さないと判定された対照の対象におけるＲ−スポンジンのｍＲＮＡ発現レベルよりも高いＲ−スポンジンのｍＲＮＡ発現レベルを有すると判定されている、付記２３〜２５のいずれか１つに記載の方法。
（付記２７）
前記Ｒスポンジン融合体が、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６２、または配列番号６３のうちのいずれか１つの接合部配列を含む、付記２４に記載の方法。
（付記２８）
前記ＥＭＣ２ｅ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体が、配列番号６４の接合部配列を含む、付記２５に記載の方法。
（付記２９）
前記ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体が、配列番号６５の接合部配列を含む、付記２５に記載の方法。
（付記３０）
前記ＰＶＴ１−Ｒｓｐｏ２ｅ３融合体が、配列番号６６の接合部配列を含む、付記２５に記載の方法。
（付記３１）
前記ＨＮＦ４Ｇ−Ｒｓｐｏ２ｅ２融合体が、配列番号６７の接合部配列を含む、付記２５に記載の方法。
（付記３２）
前記ＰＴＰＲＫｅ１３−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体が、配列番号６１の接合部配列を含む、付記２５に記載の方法。
（付記３３）
前記ＰＴＰＲＫｅ６Ｘ−Ｒｓｐｏ３ｅ２融合体が、配列番号６０の接合部配列を含む、付記２５に記載の方法。
（付記３４）
前記Ｒスポンジンが、Ｒｓｐｏ２またはＲｓｐ３であり、前記融合遺伝子が、別の遺伝子に融合されていない前記Ｒスポンジンと比べて過剰発現される、付記２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
（付記３５）
前記ポーキュパインアンタゴニストが、式（Ｉ）：
Figure 2021130694
 の化合物または生理学的に許容し得るその塩を含み、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Χ６、Ｘ７、Ｘ８が独立に、ＣＲ４またはＮであり、
Ｙ１が水素またはＣＲ４であり、Ｙ２、Ｙ３は独立に、水素、ハロまたはＣＲ３であり、
Ｒ１が、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ２が、水素、ハロ、モルホリニル、ピペラジニル、キノリニル、
Figure 2021130694
 、アリール、Ｃ１〜６ヘテロ環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５または６員ヘテロアリールであり、
Ｒ３が、水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜６アルキル、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されているＣ１〜６アルコキシであり、
Ｒ４が、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）である、付記２３〜３４のいずれか１つに記載の方法。
（付記３６）
前記５または６員ヘテロアリールが、
Figure 2021130694
 から選択され、式中、
Ｒ４が、水素、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルまたはＣ２〜６アルキニル（それぞれ、任意選択でハロ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシまたはシアノで置換されていてもよい）であり、
Ｒ８が水素またはＣ１〜６アルキルである、付記３５に記載の方法。
（付記３７）
Ｒ１及びＲ２が独立に、１または２個のＲ４基で置換されている、付記３５または３６に記載の方法。
（付記３８）
前記化合物が、
６−（２−メチルピリジン−４−イル）Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’メチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリミジン−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
３−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ベンゾニトリル；
６−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−ｍ−トリル−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（５−フェニルピリジン−２−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（ピリダジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−モルホリノ−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）アミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−フルオロ−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
４−（５−（（（６−（３−フルオロフェニル）−２，７−ナフチリジン−１−イル）アミノ）メチル）ピリジン−２−イル）チオモルホリン１，１−ジオキシド；
Ｎ−（４−クロロベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−メチルベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−ベンジル−２−（３−フルオロフェニル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（６−（３−フルオロフェニル）ピリジン−３−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（４−（２−フルオロピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−（トリフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）−１，６−ナフチリジン−５−アミン；
Ｎ−（ビフェニル−４−イルメチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２−フルオロビフェニル−４−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（３−クロロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−フェニルイソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
６−（６−メチルピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
６−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピリダジン−４−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピリジン−２−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（３−フルオロフェニル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）イソキノリン−１−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−フェニルピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（３−フルオロフェニル）−Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（３−フルオロフェニル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２（２−メチルピリジン−４−イル）−ピリド［４，３−ｂ］ピラジン−５−アミン；
Ｎ−（（２’３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｓ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
（Ｒ）−６−（２−メチルモルホリノ）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
１−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）エタノン；
６−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（チアゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（オキサゾール−５−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−メチルピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−フルオロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−６−（５−フルオロピリジン−３−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−メチル−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（ピラジン−２−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
メチル４−（８−（（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート；
４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−２−オン；
２−（４−（８−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジルアミノ）−２，７−ナフチリジン−３−イル）ピペラジン−１−イル）アセトニトリル；
２−メチル−４−（４−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）フェニル）ピリジン１−オキシド；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
６−（２−クロロピリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２−（２−メチルピリジン−４−イル）−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）ベンゾニトリル；
Ｎ−（３−メトキシ−４−（２−メチルピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
Ｎ−（（３−クロロ−２’−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）メチル））−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミン；
２’−メチル−５−（（６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−イルアミノ）メチル）−２，４’ビピリジン−３−カルボニトリル；及び
Ｎ−（４−（２−（ジフルオロメチル）ピリジン−４−イル）ベンジル）−６−（２−メチルピリジン−４−イル）−２，７−ナフチリジン−１−アミンから選択される、付記３５〜３７のいずれか１つに記載の方法。
（付記３９）
前記ポーキュパインアンタゴニストが、式（II）：
Figure 2021130694
 （ＩＩ）
の化合物または生理学的に許容し得るその塩を含み、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が、Ｎ及びＣＲ７から選択され、
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８のうちの１つが、Ｎであり、他はＣＨであり、
Ｘ９が、Ｎ及びＣＨから選択され、
Ｚが、フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニル及びピペラジニルから選択され、
Ｚの各フェニル、ピラジニル、ピリジニル、ピリダジニルまたはピペラジニルが、任意に、Ｒ６基で置換され、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、水素であり、
ｍが１であり、
Ｒ４が、水素、ハロ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル及びメチルから選択され、
Ｒ６が、水素、ハロ、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０から選択され、このＲ１０はメチルであり、及び
Ｒ７が、水素、ハロ、シアノ、メチル及びトリフルオロメチルから選択される、付記２４〜３４のいずれか１つに記載の方法。
（付記４０）
前記化合物が、
Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）ピリジン−２−イル］−２−［５−メチル−６−（ピリダジン−４−イル）ピリジン−３−イル］アセトアミド；
２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミド（ＬＧＫ９７４）；
Ｎ−（２，３’−ビピリジン−６’−イル）−２−（２’，３−ジメチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−メチル−３−（トリフルオロメチル）−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；
Ｎ−（５−（４−アセチルピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）−２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）アセトアミド；及び
２−（２’−フルオロ−３−メチル−２，４’−ビピリジン−５−イル）−Ｎ−（５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル）アセトアミド、または製薬上許容し得るその塩の群から選択される、付記３９に記載の方法。
（付記４１）
前記化合物が、２−［５−メチル−６−（２−メチルピリジン−４−イル）ピリジン−３−イル］−Ｎ−［５−（ピラジン−２−イル）ピリジン−２−イル］アセトアミドである、付記３９に記載の方法。
（付記４２）
前記癌が、結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、腸癌、胆管癌、膵臓癌、子宮内膜癌、または前立腺癌である、付記２４〜４１のいずれか１つに記載の方法。

Claims (1)

  1. 癌と診断され、そうした治療を必要としている対象における、Ｒ−スポンジン融合体の発現を特徴とする癌の治療方法であって、
    ポーキュパインのアンタゴニストの治療有効量を含む医薬組成物を、癌と診断された対象に投与することを含み、
    前記対象が、Ｒ−スポンジン融合体を有すると判定されている、方法。
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