CN107708699A - 肿瘤生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与WNT信号转导通路有关的生物标志物和方法以及包含该生物标志物的试剂盒。进一步，本发明涉及所述生物标志物在患者选择、伴随诊断和癌症治疗方面的应用。

Description

肿瘤生物标志物及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月26日提交的美国临时专利申请US 62/166,305的权益和优先权，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及与WNT信号传导通路有关的生物标志物和方法以及包含该生物标志物的试剂盒。进一步而言，本发明涉及所述生物标志物在患者选择、伴随式诊断以及癌症治疗方面的应用。
背景技术
癌症是一类影响全世界人的疾病。通常来说，良性肿瘤中的细胞保持其分化特性并且不会以完全不受控制的方式分裂。良性肿瘤通常是局部的并且是非转移的。
在恶性肿瘤中，细胞变为未分化的，不响应人体生长控制信号并且以不受控制的方式繁殖。恶性肿瘤通常分为两类：原发性肿瘤和继发性肿瘤。原发性肿瘤直接产生于发现该肿瘤的组织。继发性肿瘤可能起源于原发性肿瘤或可能起源于身体的其他地方，并且能够扩散至远位(转移至远位)或发生转移。转移的常见途径是直接生长至邻近结构，通过血管或淋巴系统或血流扩散。
WNT信号传导对于胚胎形成和成年动物体内的内稳态均非常重要。WNT通路总体上由调节如下过程的蛋白质网络构成，所述过程为：(1)WNT蛋白质的生成和分泌，(2)WNT与细胞受体的结合，以及(3)由相互作用触发的生物化学反应的细胞内转导(Mikels andNusse，2006；MacDonald，2009；Moon，2005)。
由WNT蛋白结合至细胞表面共受体Frizzled LRP5/6而引发的所谓的典型WNT通路导致到达细胞核的β-链蛋白(β-catenin)的数量发生改变，在细胞核中，β-链蛋白与TCF/LEF家族转录因子相互作用而促进特定基因的转录。
由一系列不同的胞内蛋白转导的非典型WNT通路控制昆虫体内的平面细胞极性以及诸如脊椎动物体内的原肠胚形成之类的几个过程。
本领域已知WNT信号传导在控制胚胎干细胞和成人干细胞的多能性和分化方面发挥作用(Nusse，2008)。例如，原肠胚形成过程中原条的形成与类胚体中局部WNT活化相关(Ten Berge，2008)。从胚胎干细胞或iPS细胞中衍生诸如心脏细胞、胰腺β细胞、多巴胺能神经元和肝脏细胞之类的多种类型的细胞均受到WNT调节的影响(Yang，2008；D’Amour，2006；Inestrosa和Arenas，2010；Sullivan，2010)。WNT通路在骨组织发育，例如，骨生成和软骨形成中起到了尤为重要的作用(Hoeppner，2009；Chun，2008)。WNT信号传导还与成人中枢神经系统的神经再生相关(Lie，2005)。
WNT通路活性的改变可能引起许多疾病。例如，典型WNT通路的超活化可能导致异常细胞生长(Reya和Clevers，2005)。值得注意的是，90％的结肠直肠癌是由结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)基因的缺失引起的，APC是WNT/β-链蛋白通路的抑制剂(Kinzler和Vogelstein，1996)。WNT蛋白表达的提高和通常抑制WNT蛋白功能的细胞外抑制剂的缺失可能引起WNT依赖性肿瘤(Polakis，2007)。另一方面，非典型WNT通路也表现出在某些癌症的发展过程中发挥作用(Camilli和Weeraratna，2010)。最近，WNT信号传导还涉及癌症干细胞(Takahashi-Yanaga和Kahn，2010)。
已有证据表明靶向Wnt介导的信号传导通路可能对多种疾病有治疗作用(Barker和Clevers，2006)。导致典型Wnt通路组成性激活的APC、β-链蛋白或轴蛋白-1的突变是多种人类癌症中的关键事件，所述人类癌症包括结肠直肠癌、黑色素瘤、肝细胞癌、胃癌、卵巢癌和其他癌症(Polakis，2007)。通过基因或化学方法阻断多种癌症中的Wnt通路已表现出终止异常细胞生长(Herbst Kolligs，2007)。此外，抑制这一通路可能直接影响维持癌细胞生长和使癌细胞转移的细胞，并且，这些细胞被认为对传统化疗药物有耐受性。
除了受体下游基因产物突变而引起异常Wnt通路激活之外，其他机制引起的异常Wnt通路活化与多种癌症相关。这些癌症包括但不限于：肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌、前列腺癌、类癌、膀胱癌、上皮恶性肿瘤、食道癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性粒细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。本领域目前已有多种依赖于上调的自分泌或旁分泌的Wnt信号传导的癌细胞的实例，并且来源于骨肉瘤、乳腺癌、头颈部癌和卵巢癌的细胞系已显示其通过自分泌或旁分泌的Wnt信号传导而不受细胞凋亡的影响。(Kansara，2009；Bafico，2004；Akiri，2009；DeAlmeida，2007；Chan，2007；Chen，2009；Rhee，2002)。
而且，异常Wnt通路涉及纤维化的发展，所述纤维化包括但不限于：肺纤维化(例如，特发性肺纤维化和辐射诱导的纤维化)、肾纤维化和肝纤维化(Morrisey，2003；Hwang，2009；Cheng，2008)。
与异常WNT信号传导相关的其他疾病包括但不限于：骨和软骨疾病(例如，骨质疏松症和骨关节炎)，与肥胖相关的II型糖尿病和神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏症)(Hoeppner，2009；Ouchi，2010；Blom，2010；Boonen，2009)。WNT信号传导还有助于造血干细胞(HSC)的自我更新和维护，功能失调的WNT信号传导导致由HSC引起的各种疾病(例如，白血病)和各种其他血液相关癌症(Reya，2005)。
发明内容
总体上，本发明提供WNT通路相关生物标志物以及这些生物标志物在疾病(例如，癌症)治疗的患者选择方面的应用。
一方面，本发明提供用于治疗已被诊断患有癌症并且需要这种治疗的受治者体内特征为R-spondin融合的表达的癌症的方法，所述方法包括：将包含治疗有效量的Porcupine拮抗剂的药物组合物给药于诊断为患有癌症的受治者，其中，所述受治者已被确定具有R-spondin融合。
在一些实施方式中，所述R-spondin融合包括：(1)PTPRKe1-Rspo3e2融合；(2)PTPRKe7-Rspo3e2融合；(3)EIF3Ee1-Rspo2e2融合；或(4)EIF3Ee1-Rspo2e3融合。
在一些实施方式中，所述R-spondin融合包括：(1)EMC2e1-Rspo2e2融合；(2)PVT1-Rspo2e2融合；(3)PVT1-Rspo2e3融合；(4)HNF4G-Rspo2e2融合；(5)PTPRKe13-Rspo3e2融合；或(6)PTPRKe6X-Rspo3e2融合。
在一些实施方式中，所述受治者被确定具有比在已确定不具有R-spondin融合的对照受治者体内的R-spondin mRNA表达水平高的R-spondin mRNA表达水平。
在一些实施方式中，所述Rspondin融合包括SEQ ID NO.：58，SEQ ID.：59，SEQ IDNO.：62，或SEQ ID NO.：63中任何一个的连接序列。
在一些实施方式中，所述EMC2e1-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：64的连接序列。
在一些实施方式中，所述PVT1-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：65的连接序列。
在一些实施方式中，所述PVT1-Rspo2e3融合包括SEQ ID NO.：66的连接序列。
在一些实施方式中，所述HNF4G-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：67的连接序列。
在一些实施方式中，所述PTPRKe13-Rspo3e2融合包括SEQ ID NO.：61的连接序列。
在一些实施方式中，所述PTPRKe6X-Rspo3e2融合包括SEQ ID NO.：60的接合序列。
在一些实施方式中，所述R-spondin是Rspo2或Rspo3，并且相比于未与另一基于融合的R-spondin，融合基因过表达。
在一些实施方式中，所述Porcupin拮抗剂包括通式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8独立地为CR4或N；
Y1是氢或CR4；Y2，Y3独立地为氢、卤素或CR3；
R1是吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R2是氢，卤素，吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R3是氢，卤素，氰基，C1-6烷基，被卤素、氨基、羟基、烷氧基或氰基任选地取代的C1-6烷氧基；
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代。
在一些实施方式中，所述5元或6元杂芳基选自：
其中，
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；以及
R8是氢或C1-6烷基。
在一些实施方式中，R1和R2被1个或2个R4基团独立地取代。
在一些实施方式中，所述化合物选自下列化合物：
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(嘧啶-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
3-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
6-(4-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-m-甲苯基-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((5-苯基吡啶-2-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(哒嗪-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-吗啉基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-((4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)氨基)-2，7-萘啶-3-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶e-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(4-氯苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-甲基苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-苄基-2-(3-氟苯基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((6-(3-氟苯基)吡啶-3-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2-氟联苯基-4-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)异喹啉-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡啶-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(3-氟苯基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(S)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(R)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
1-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙酮；
6-(1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(1H-四唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基-1，3，4-恶二唑-2-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(噻唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(恶唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-氟吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-羧酸甲酯；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-2-酮；
2-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙腈；
2-甲基-4-(4-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯基)吡啶1-氧化物；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯甲腈；
N-(3-甲氧基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氯-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
2′-甲基-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)-2，4′-联吡啶-3-腈；以及
N-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺。
在一些实施方式中，所述Porcupine拮抗剂包括下式(II)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3和X4选自：N和CR7；
X5，X6，X7和X8中的一个为N并且另一个为CH；
X9选自：N和CH；
Z选自：苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基；
其中，Z中的每个苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基被R6基团任选地取代；
R1，R2和R3是氢；
m是1；
R4选自：氢，卤素，二氟甲基，三氟甲基和甲基；
R6选自：氢，卤素和-C(O)R10，其中，R10是甲基；并且
R7选自：氢，卤素，氰基，甲基和三氟甲基。
在一些实施方式中，所述化合物选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基)吡啶-3-基]乙酰胺；
2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺(LGK974)；
N-(2，3′-联吡啶-6′-基)-2-(2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-甲基-3-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；以及
2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺。
在一些实施方式中，所述化合物是2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺。
在一些实施方式中，所述化合物的治疗有效量为每日剂量约0.01mg/kg体重至20mg/kg体重。
在一些实施方式中，对于人类而言，所述化合物的治疗有效量为约0.5mg至约1000mg。
在一些实施方式中，所述癌症是结肠直肠癌，胃癌，肝癌，食道癌，肠癌，胆道癌，胰腺癌，子宫内膜癌，或前列腺癌。
另一方面，本发明提供用于确定患有癌症的受治者是否应当接受抑制Wnt活性的组合物的治疗的方法，所述方法包括：(a)从所述受治者体内分离生物样本；(b)对所述生物样本进行分析以识别是否存在R-spondin融合；以及(c)如果所述生物样本包含R-spondin融合，那么确定所述受治者应当接受包含治疗有效量的Porcupine的拮抗剂的组合物的治疗。
在一些实施方式中，所述R-spondin融合包括：(1)PTPRKe1-Rspo3e2融合；(2)PTPRKe7-Rspo3e2融合；(3)EIF3Ee1-Rspo2e2融合；或(4)EIF3Ee1-Rspo2e3融合。
在一些实施方式中，所述R-spondin融合包括：(1)EMC2e1-Rspo2e2融合；(2)PVT1-Rspo2e2融合；(3)PVT1-Rspo2e3融合；(4)HNF4G-Rspo2e2融合；(5)PTPRKe13-Rspo3e2融合；或(6)PTPRKe6X-Rspo3e2融合。
在一些实施方式中，所述受治者被确定具有比在已确定不具有R-spondin融合的对照受治者体内的R-spondin mRNA表达水平高的R-spondin mRNA表达水平。
在一些实施方式中，所述R-spondin融合包括SEQ ID NO.：58，SEQ ID.：59，SEQ IDNO.：62，或SEQ ID NO.：63中任何一个的连接序列。
在一些实施方式中，所述EMC2e1-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：64的连接序列。
在一些实施方式中，所述PVT1-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：65的连接序列。
在一些实施方式中，所述PVT1-Rspo2e3融合包括SEQ ID NO.：66的连接序列。
在一些实施方式中，所述HNF4G-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：67的连接序列。
在一些实施方式中，所述PTPRKe13-Rspo3e2融合包括SEQ ID NO.：61的连接序列。
在一些实施方式中，所述PTPRKe6X-Rspo3e2融合包括SEQ ID NO.：60的连接序列。
在一些实施方式中，所述R-spondin是Rspo2或Rspo3，并且相比于未与另一基因融合的R-spondin，融合基因过表达。
在一些实施方式中，所述Porcupin拮抗剂包括通式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8独立地为CR4或N；
Y1是氢或CR4；Y2，Y3独立地为氢、卤素或CR3；
R1是吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R2是氢，卤素，吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R3是氢，卤素，氰基，C1-6烷基，被卤素、氨基、羟基、烷氧基或氰基任选地取代的C1-6烷氧基；
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代。
在一些实施方式中，所述5元或6元杂芳基选自：
其中，
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；以及
R8是氢或C1-6烷基。
在一些实施方式中，R1和R2被1或2个R4基团独立地取代。
在一些实施方式中，所述化合物选自下列化合物：
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(嘧啶-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
3-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
6-(4-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-m-甲苯基-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((5-苯基吡啶-2-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(哒嗪-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-吗啉基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-((4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)氨基)-2，7-萘啶-3-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶e-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(4-氯苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-甲基苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-苄基-2-(3-氟苯基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((6-(3-氟苯基)吡啶-3-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2-氟联苯基-4-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)异喹啉-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡啶-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(3-氟苯基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(S)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(R)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
1-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙酮；
6-(1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(1H-四唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基-1，3，4-恶二唑-2-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(噻唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(恶唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-氟吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-羧酸甲酯；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-2-酮；
2-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙腈；
2-甲基-4-(4-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯基)吡啶1-氧化物；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯甲腈；
N-(3-甲氧基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氯-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
2′-甲基-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)-2，4′-联吡啶-3-腈；以及
N-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺。
在一些实施方式中，所述Porcupine拮抗剂包括下式(II)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3和X4选自：N和CR7；
X5，X6，X7和X8中的一个为N并且另一个为CH；
X9选自：N和CH；
Z选自：苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基；
其中，Z中的每个苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基被R6基团任选地取代；
R1，R2和R3是氢；
m是1；
R4选自：氢，卤素，二氟甲基，三氟甲基和甲基；
R6选自：氢，卤素和-C(O)R10，其中，R10是甲基；并且
R7选自：氢，卤素，氰基，甲基和三氟甲基。
在一些实施方式中，所述化合物选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基)吡啶-3-基]乙酰胺；
2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺(LGK974)；
N-(2，3′-联吡啶-6′-基)-2-(2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-甲基-3-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；以及
2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺。
在一些实施方式中，所述化合物是2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺。
在一些实施方式中，所述癌症是结肠直肠癌，胃癌，肝癌，食道癌，肠癌，胆道癌，胰腺癌，子宫内膜癌，或前列腺癌。
通过引用并入
在本说明书中提到的所有公开出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本文，这如同明确地且单独地表明将各个公开出版物、专利或专利申请通过引用并入本文中。
附图说明
本发明的新颖性特征由所附的权利要求进行具体列举。通过结合下文列举的对示例性的实施方式的详细描述可更好地理解本发明的特征和优点，示例性的实施方式中的详细描述利用了本发明的原理，对示例性的实施方式中的附图说明如下：
图1显示了Rspo2 Nanostring nCounter决策图。
图2显示了Rspo3 Nanostring nCounter决策图。
图3显示了Nanostring nCounter基因分型分析对特征化肿瘤组织有效。阴影标记出了在特征化样本中期望的阳性信号。L440样本中Rspo2外显子1的信号数量接近其他外显子的数量，这说明在L440肿瘤样本中野生型Rspo2转录子进行表达，而非Rspo2融合进行表达。
图4显示了在带有Rspo2融合基因或Rspo3融合基因和不带有Rspo2融合基因或Rspo3融合基因的肿瘤样本中通过Nanostring nCounter分析对Rspo2和Rspo3转录子进行定量。
图5A和图5B显示了各种不同的Rspo2基因融合(表8)和Rspo3基因融合(表9)的序列。
图6A至图6C显示了CGX1321在带有RSPO3融合基因的肿瘤模型中的抗肿瘤作用。图6A：CGX1321对带有将PTPRK的外显子1融合至Rspo3的外显子2的PTPRKe1-Rspo3基因融合的直肠结肠肿瘤的CRC001PDX模型的剂量响应。在肿瘤生长至约150mm3之后，如所显示的那样给药各种不同剂量的CGX1321持续28天。每组(n＝8只动物/组)中每周测量两次肿瘤尺寸。图6B：带有将PTPRK的外显子7融合至Rspo3的外显子2的2型PTPRK-Rspo3基因融合的CRC141直肠结肠肿瘤PDX模型。在肿瘤生长至约150mm3之后，以7.5mg/kg QD的剂量口服给药CGX1321持续21天。每周测量两次肿瘤尺寸(n＝8只动物/组)。图6C：带有将外显子13融合至Rspo3外显子2的3型PTPRK-Rspo3基因融合的CR2506直肠结肠肿瘤PDX模型。左图：由服务供应商提供的作为历史对照的12个独立的实验中没有进行治疗的异种移植肿瘤CR2506模型的肿瘤生长曲线。右图：由CGX1321以1mg/kg QD剂量口服给药28天治疗的CR2506模型的肿瘤生长。每组每周两次测量肿瘤尺寸(n＝4只动物/组)。
图7A至图7C显示了CGX1321在带有Rspo2融合基因的肿瘤模型中的抗肿瘤作用。图7A：带有将EMC2的外显子1融合至Rspo2的外显子2的EMC2e1-Rspo2e2基因融合的GA67胃肿瘤PDX模型。在肿瘤生长至约100mm3之后，以1mg/kg QD的剂量口服给药CGX1321持续28天。每周测量两次肿瘤尺寸(n＝6只动物/组)。图7B：带有将PVT1的外显子1融合至Rspo2的外显子2的PVT1e1-Rspo2e2基因融合的CR3056结肠直肠肿瘤PDX模型。在肿瘤生长至约100mm3之后，以1mg/kg QD的剂量口服给药CGX1321持续28天。每组每周测量两次肿瘤尺寸(n＝6只动物/组)。图7C：带有将HFN4G 5’端融合至Rspo2外显子2的HFN4G-Rspo2e2基因融合的GA3055胃肿瘤PDX模型。(左图：由服务供应商提供的没有进行治疗的肿瘤生长。右图：通过口服给药剂量为1mg/kg QD的CGX1321进行治疗28天的肿瘤生长。每组每周测量两次肿瘤尺寸(n＝4只动物/组))。
具体实施方式
下面结合用于举例说明的示例性应用对本发明的几个方面进行描述。应当理解的是，列举的关系和方法是为了全面理解本发明。然而，本领域普通技术人员将容易地认识到，本发明可不通过具体细节中的一个或多个来实施而可通过其它方法实施。本发明并不限于所举例说明的操作顺序或事件顺序，因为一些操作可以不同的顺序发生和/或与其它操作或事件同时发生。
此外，并不要求将所有举例说明的操作或事件用于实施根据本发明的方法。
本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方式，而无意限定本发明。除非另有明确说明，本文所用的单数形式(“a”，“an”和“the”)也意在包括复数形式。此外，术语“包括”、“包含”、“具有”、“有”、“带有”或其变体用在具体实施方式和/或权利要求书中，这些术语意在包括与术语“包含”类似的方式。
术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的误差范围内，该误差范围部分取决于该值是如何被检测或确定的，即，测量系统的限制。例如，本领域中“约”可意味着每次实施在1或大于1的标准偏差范围以内。可选地，“约”可意味着高达给定值的20％的范围，优选地为高达给定值的10％的范围，更优选地为高达给定值的5％的范围，并且还更优选地为高达给定值的1％的范围。可选地，尤其对于生物系统或过程而言，该术语可意味着在某个数量级范围之内，优选地为某个值的5倍之内，更优选地为某个值的2倍之内。在本申请和权利要求书中对具体值进行描述的条件下，除非另有说明，假设术语“约”是指在特定值的可接受的误差范围内。
I.释义和缩写
除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语总体上具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。总体而言，本文所使用的命名法以及细胞培养，分子遗传学，有机化学，核酸化学和杂交中的实验操作是本领域众所周知的和普遍采用的。采用标准技术进行核酸和肽合成。通常依据本领域的常规方法和多种通用参考文献中的常规方法实施各种技术和操作，各种不同的常规方法和多种参考文献在本文中提供。本文使用的命名法以及下述分析化学和有机合成中的实验操作是本领域公知的和普遍采用的。采用标准技术或其改进进行化学合成和化学分析。
本文使用的“WNT信号传导通路”或“WNT通路”是指WNT蛋白与细胞受体结合导致细胞行为发生改变的通路。WNT通路涉及多种蛋白，包括卷曲蛋白(Frizzled)，蓬乱蛋白(Disheveled)，轴蛋白(Axin)，APC，GSK3β，β-链蛋白，LEF/TCF转录因子，以及涉及WNT蛋白合成和分泌的分子。功能性WNT分泌所涉及的蛋白的实例包括但不限于：wntless/evennessinterrupted(Wls/Evi)，porcupine(Porcn)和Vps35p。Wls/Evi是一个7次跨膜蛋白，其位于高尔基体中并且是Wg(果蝇)、MOM-2(秀丽隐杆线虫)和Wnt3A分泌所必需的。Wls/Evi包含保守结构基序，该基序的结构和功能尚未知。Porcupine(Porcn)是棕榈酰转移酶的膜结合O-酰基转移酶(MBOAT)家族中的一员。Wnt的脂肪酸修饰对于其功能而言至关重要。Wnt在一个或两个高度保守位点被棕榈酰化。因此，Porcn的抑制剂可阻碍所有功能性Wnt信号传导。Vps35是被称为retromer复合物的多蛋白复合物中的亚单位，retromer复合物涉及到胞内蛋白质转运。Vps35在结合诸如WNT这样的目标蛋白以将其招募进入囊泡方面发挥作用。
本文使用的“Wnt抑制剂”降低Wnt通路的活性。Wnt抑制剂是可抑制Wnt信号传导通路的化合物并且包括PORCN抑制剂。这种抑制可包括，例如，抑制PORCN及其对Wnt的棕榈酰化，或降低包括卷曲蛋白和蓬乱蛋白在内的Wnt通路组分之间的结合。优选地，Wnt抑制剂是PORCN抑制剂。
术语“抑制WNT通路的方法”是指抑制已知的与功能性WNT蛋白的产生相关的或与WNT蛋白的细胞应答相关的生化事件的方法。正如本文所讨论的，根据该定义，有机小分子可抑制WNT应答。
“WNT蛋白”是一种与卷曲蛋白和LRP5/6共受体结合以激活典型或非典型WNT信号传导的蛋白，WNT蛋白的具体实例包括WNT-1(NM005430)，WNT-2(NM003391)，WNT-2B/WNT-13(NM004185)，WNT-3(NM030753)，WNT3a(NM033131)，WNT-4(NM030761)，WNT-5A(NM003392)，WNT-5B(NM032642)，WNT-6(NM006522)，WNT-7A(NM004625)，WNT-7B(NM058238)，WNT-8A(NM058244)，WNT-8B(NM003393)，WNT-9A/WNT-14(NM003395)，WNT-9B/WNT-15(NM003396)，WNT-10A(NM025216)，WNT-10B(NM003394)，WNT-11(NM004626)，WNT-16(NM016087)。
“WNT通路紊乱”是一种具有异常WNT信号传导的病症或疾病状态。一方面，异常WNT信号传导是在疑似患病的细胞或组织中WNT信号传导的水平超过正常细胞或组织中的WNT信号传导水平。在一个具体方面，WNT介导的紊乱包括癌症或纤维化。
术语“癌症”是指人体中特征为不受控制的细胞增殖的病理状态。实例包括但不限于：恶性上皮肿瘤(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤和白血病。癌症的更具体的实例包括但不限于：肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌、前列腺癌、类癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞癌、结肠直肠癌、头颈鳞状细胞癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性粒细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。
术语“纤维化”是指人体中典型特征为成纤维细胞不受控制的增殖和组织硬化的病理状态。具体实例包括但不限于：肺纤维化(先天性肺纤维化和辐射诱导的纤维化)、肾脏纤维化和肝纤维化(包括肝硬化)。
术语“抑制”或“治疗(treating或treatment)”是指缓解方法、治疗方法和预防或防治方法，其目的是缓解或预防目标病理疾病或情况。在一个实例中，在给药WNT信号传导抑制剂之后，癌症患者可表现出肿瘤尺寸减小。“治疗(treating或treatment)”包括：(1)抑制患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病；(2)改善患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病；和/或，(3)使患有或表现出疾病的病理学或症状的受治者体内的疾病产生任何可测量的降低。WNT通路抑制剂可在一定程度上阻止癌细胞的生长和/或杀死癌细胞，该抑制剂可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受治者或哺乳动物体内的WNT通路紊乱的WNT通路抑制剂(例如，Porcupine拮抗剂)的量。在癌症案例中，药物的治疗有效量可减少癌症细胞的数量，降低肿瘤尺寸，抑制癌细胞渗透到周围器官，抑制肿瘤转移，在一定程度上抑制肿瘤生长，和/或在一定程度上缓解一个或多个与癌症相关的症状。
与一种或多种其他治疗试剂“联合”给药包括同时(同步)给药和以任何顺序连续给药。本文使用的术语“药物组合”是指通过混合或结合活性成分而获得的产品，且包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分(例如，通式(1)化合物)和联合药剂这两者以单个实体的形式或单个剂型同时给药于患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如，通式(1)化合物)和联合药剂这两者作为分开的实体同时、同步或顺序给药于患者而无特定时间限制，其中这种给药方式在患者体内提供治疗有效水平的活性成分。后一种给药方式也适用于鸡尾酒疗法，例如，给药三种或更多的活性成分。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。实例包括但不限于：吉西他滨、伊立替康、阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、三胺硫磷、白消安、细胞毒素、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春花碱和卡铂。
除非另有规定，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指含有指定数目的碳原子(例如，C1-C10是指1到10个碳原子)的直链或支链或环状烃自由基或其组合，所述直链或支链或环状烃自由基或其组合可为完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的并且可包括二价和多价自由基。饱和烃自由基的实例包括但不限于如下基团，例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，它们的类似物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。不饱和的烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于：乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意味着包括那些下文更加详细地定义的烷基的衍生物，例如，“杂烷基”。限定为烃基基因的烷基也被称为“均烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价自由基，例如，但不限于：-CH2CH2CH2CH2-，且进一步包括那些下文如“杂亚烷基”所描述的基团。通常地，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子，本发明优选那些具有小于或等于10个碳原子的烷基(或亚烷基)基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是通常具有小于或等于8个碳原子的短链烷基或亚烷基基团。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基(或硫代烷氧基)”以其常规含义使用，并且分别是指通过氧原子、氨基或硫原子连接于分子其余部分的那些烷基。
除非另有说明，单独或与另一术语组合的术语“杂烷基”是指由规定数目的碳原子和至少一个选自O，N，Si和S的杂原子组成的、稳定的直链或支链或环状烃自由基或其组合，其中所述氮原子和硫原子可被任选地氧化，所述氮杂原子可被任选地季铵化。杂原子O、N、S和Si可位于杂烷基的任何内部位置上，或位于烷基与分子其余部分连接的位置上。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3，-CH2-CH2-NH-CH3，-CH2-CH2-N(CH3)-CH3，-CH2-S-CH2-CH3，-CH2-CH2，-S(O)-CH3，-CH2-CH2-S(O)2-CH3，-CH＝CH-O-CH3，-Si(CH3)3，-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以相邻，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，单独或作为另一取代基的一部分的术语“杂亚烷基”是指由杂烷基衍生的二价自由基，例如但不限于：-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。在杂亚烷基中，杂原子也可占据链端中的一个末端或两个末端(例如，亚烷基氧、亚烷基二氧、亚烷基氨基、亚烷基二氨基，等)。而且进一步地，在亚烷基和杂亚烷基连接基团中，连接基团的化学式书写方向没有暗示连接基团的取向。例如，分子式-C(O)2R’-代表-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
总体而言，“酰基取代基”也选自上述基团。本文使用的术语“酰基取代基”是指连接至羰基碳且满足羰基碳的化合价的基团，所述羰基碳直接或间接地连接至本发明化合物的多环核心。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”自身或者与其他术语组合分别表示“烷基”或“杂烷基”的环状形式。此外，对于杂环烷基而言，杂原子可以占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于：环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括但不限于：1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。
除非另有说明，术语“卤代”或者“卤素”自身或者作为另一取代基的部分是指氟、氯、溴或者碘原子。此外，诸如“卤代烷基”之类的术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不限于：三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等等。
除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和芳香族烃取代基，其可以是单环或者多环(优选1到3个环)，它们稠合在一起或者共价连接。术语“杂芳基”指含有选自N、O和S的1到4个杂原子的芳基(或者环)，其中氮和硫原子可被任选地氧化，并且氮原子可被任选地季铵化。杂芳基基团可以通过杂原子连接至分子的其余部分。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括：苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一个的取代基选自下文描述的可接受的取代基。
为了简洁起见，当术语“芳基”与其他术语(例如，芳氧基、芳硫氧基、芳基烷基)组合使用时，术语“芳基”包括如上文定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基连接至烷基的那些自由基(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，所述烷基包括其中碳原子(例如，亚甲基)已经被例如氧原子替代的那些烷基(例如，苯氧基甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基等等)。
上文所述的术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)中的每一种包括上文指出的基团的取代和未取代的形式。每种类型的基团的优选的取代基在下文提供。
烷基和杂烷基自由基(包括通常称作亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基通常分别称作“烷基取代基”和“杂烷基取代基”，并且它们可以是选自下列多种基团中的一种或多种，但不限于下列基团：-OR’，＝O，＝NR’，＝N-OR’，-NR’R”，-SR’，-卤素，-SiR’R”R”’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R”’，-NR”C(O)2R’，-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””，-NR-C(NR’R”)＝NR”’，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R”，-NRSO2R’，-CN和-NO2，所述取代基的数目为0到(2m’+1)，其中m’是这种自由基中碳原子的总数。优选地，R’，R”，R”’和R””每一个独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如，由1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或者硫代烷氧基，或者芳基烷基基团。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，每个R基团如每个R’，R”，R”’和R””(当存在多于一个这些基团时)一样独立地选择。当R’和R”连接至相同的氮原子时，它们可以与氮原子组合形成5-元，6-元或者7-元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。基于上文对取代基的讨论，本领域技术人员将理解术语“烷基”意在包括包含连接到不同于氢的基团的碳原子的基团，例如，卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3，-C(O)CF3，-C(O)CH2OCH3等等)。
类似于对烷基自由基的取代基的描述，芳基取代基和杂芳基取代基通常分别称作“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，并且芳基取代基和杂芳基取代基是不同的，选自，例如：卤素，-OR’，＝O，＝NR’，＝N-OR’，-NR’R”，-SR’，-卤素，-SiR’R”R”’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R””，-NR”C(O)2R’，-NR-C(NR’R”)＝NR”’，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R”，-NRSO2R’，-CN和-NO2，-R’，-N3，-CH(Ph)2，氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，所述取代基的数目为0到芳香环系统上开放化合价的总数；并且其中R’，R”，R””和R””优选独立地选自：氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)基和(未取代的芳基)-氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括一个以上的R基团时，例如，每个R基团如每个R’，R”，R”’和R””(当存在一个以上的这些基团时)一样独立地选择。
芳基或者杂芳基环的相邻原子上的芳基取代基中的两个可以任选地被通式-T-C(O)-(CRR’)q-U-表示的取代基替代，其中T和U独立地为NR-，-O-，-CRR’-或者单键，q为0到3的整数。可选地，芳基或者杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被通式-A-(CH2)r-B-表示的取代基替代，其中A和B独立地为-CRR’-，-O-，-NR-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2NRR’-或者单键，并且r为1到4的整数。这样形成的新环的单键之一可以被双键任选地替代。可选地，芳基或者杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选用通式-(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-表示的取代基替代，其中s和d独立地为0到3的整数，X为-O-，-NR’-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R，R’，R”和R”’优选独立地选自氢或者取代或未取代的(C1-C6)烷基。
在本文中，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
II.组合物
一方面，本发明提供用于确定或预测如下患者的方法和组合物，所述患者最有可能响应使用Wnt抑制剂的治疗(例如，具有治疗收益)或最有可能响应使用与Wnt抑制剂具有基本类似的生物活性的药物的治疗，以及确定或预测如下患者的方法和组合物，所述患者最有可能不响应使用Wnt抑制剂的治疗。
在一些实施方式中，所述Wnt抑制剂是适用于人体的Porcupine抑制剂。所述Wnt抑制剂可以是具有与诸如IWP-2，IWP-3或IWP-4之类的已知的Porcupine抑制剂类似功能的Porcupine抑制剂，所述已知的Porcupine抑制剂通过Chen B等人的文章(Chen B等人，(2009)Nature Chem.Biol.5：100-107)描述并且可购自Miltenyi Biotech，例如，StemoleculeTM Wnt抑制剂IWP-2(#130-095-584)，StemoleculeTM Wnt抑制剂IWP-3(#130-095-585)以及StemoleculeTM Wnt抑制剂IWP-4。StemoleculeTM IWP-2，StemoleculeTM IWP-3，以及StemoleculeTM IWP-4防止Wnt蛋白被Porcupine(PORCN，膜结合O-酰基转移酶)棕榈酰化。
可选地，Wnt抑制剂可以是药物设计的产物并且可使用本领域已知的多种方法生产。参见，国际申请WO2010/101849，公开日2010年9月10日。用于设计模拟物或本发明使用的其他化合物的各种不同的药物设计方法在Maulik等人，(1997)MolecularBiotechnology：Therapeutic Applications and Strategies.Wiley-Liss，Inc.(其全部内容通过引用并入本文)中公开。Wnt抑制剂可获自分子多样性策略(允许快速构建大的化学上多样化的分子文库的相关策略的组合)，天然或合成化合物的文库，具体而言，Wnt抑制剂可获自化学或组合文库(即，在顺序或尺寸上有差异但具有类似构件的化合物的文库)或者Wnt抑制剂可由合理的、定向的或随机的药物设计获得。参见，例如，Maulik等人，(1997)Molecular Biotechnology：Therapeutic Applications and Strategies.Wiley-Liss，Inc。在分子多样性策略中，使用生物方法、酶方法或化学方法，由肽、寡核苷酸、天然或合成的类固醇化合物、糖类或天然或合成的有机且非类固醇分子合成大的化合物文库。开发分子多样性策略中的关键参数包括亚单位多样性、分子尺寸和文库多样性。筛选这种文库的总体目的在于顺序应用组合选择以获得对期望的目标具有高亲和性的配体并且随后通过随机或定向设计策略优化目标分子。分子多样性的方法在Maulik等人的文章(Maulik等人，(1997)Molecular Biotechnology：TherapeuticApplications and Strategies.Wiley-Liss，Inc)中详细描述。
另一方面，本发明提供作为Porcupine拮抗剂或抑制剂的化合物。
本文的“PORCN”是指Porcupine，其是一种膜结合酰基转移酶，是Wnt翻译后修饰所需的。除非另有明确说明，本文使用的PORCN是指人PORCN-登录号：NM_017617.3/NP_060087。
在一些实施方式中，Porcupine抑制剂包括下式(I)的结构或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8独立地为CR4或N；
Y1是氢或CR4；
Y2，Y3独立地为氢、卤素或CR3；
R1是吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R2是氢，卤素，吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
其中，5元或6元杂芳基包括下列基团但不限于此：
R1和R2可被1个至2个R4基团独立地且任选地取代；
R3是氢，卤素，氰基，C1-6烷基，被卤素、氨基、羟基、烷氧基或氰基任选地取代的C1-6烷氧基；
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代。
R8是氢或C1-6烷基。
本文使用的在任何取代基基团(例如，CH2)中的H原子包括所有合适的同位素变体，例如，H，2H和3H。
本文使用的在任何取代基基团中的其他原子包括所有合适的同位素变体，包括但不限于：11C，13C，14C，15N，17O，18O，35S，18F，36I和/或123I。
在一些实施方式中，本发明的化合物的实例包括但不限于下列化合物或其生理学上可接受的盐：
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(嘧啶-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
3-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
6-(4-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-m-甲苯基-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((5-苯基吡啶-2-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(哒嗪-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-吗啉基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-((4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)氨基)-2，7-萘啶-3-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉-1，1-二氧化物；
N-(4-氯苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-甲基苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-苄基-2-(3-氟苯基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((6-(3-氟苯基)吡啶-3-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2-氟联苯基-4-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)异喹啉-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡啶-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(3-氟苯基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(S)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(R)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
1-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙酮；
6-(1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(1H-四唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基-1，3，4-恶二唑-2-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(噻唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(恶唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-氟吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-羧酸甲酯；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-2-酮；
2-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙腈；
2-甲基-4-(4-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯基)吡啶1-氧化物；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯甲腈；
N-(3-甲氧基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氯-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
2′-甲基-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)-2，4′-联吡啶-3-腈；以及
N-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺。
在一些实施方式中，本发明的化合物的实例包括但不限于实施例1-5以及表1中提供的化合物。本领域技术人员可以清楚地理解并知晓可通过与实施例1-5相同的方案制备其他化合物。
表1.化合物表
在一些实施方式中，本文描述的用于治疗的Porcupine拮抗剂或抑制剂是WO2010/101849A1(PCT/US10/025813)中公开的任何合适的化合物，优选地为通式(II)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3和X4选自：N和CR7；
X5，X6，X7和X8中的一个为N并且另一个为CH；
X9选自：N和CH；
Z选自：苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基；
其中，Z中的每个苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基或哌嗪基被R6基团任选地取代；
R1，R2和R3是氢；
m是1；
R4选自：氢，卤素，二氟甲基，三氟甲基和甲基；
R6选自：氢，卤素和-C(O)R10，其中，R10是甲基；并且
R7选自：氢，卤素，氰基，甲基和三氟甲基。
在一些实施方式中，所述化合物选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基)吡啶-3-基]乙酰胺；
2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺(LGK974)；
N-(2，3′-联吡啶-6′-基)-2-(2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-甲基-3-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；以及
2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺。
在一些实施方式中，所述化合物是2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺。
III.医学和药学用途
本发明的化合物被表示为药物。根据本发明进一步的方面，本发明提供本发明的化合物用作药物(如上文所述，在可适用的地方用作药物，并不受任何限制)。本发明还提供本发明的化合物的合成形式用作药物(在可适用的地方用作药物，并不受任何限制)。
为避免疑义，尽管本发明的化合物可能具有药理活性，但是可存在或可制备本发明的化合物的一些药学上可接受的(例如，“受保护的”)衍生物，其可能不具有所述活性，但是其可在肠胃外给药或口服给药并且之后在体内代谢形成本发明的化合物。这类化合物(其可能具有一些药理活性，只要这种活性明显低于其代谢成的“活性”化合物的活性)因此被称为本发明化合物的“前药”。
“本发明化合物的前药”包括那些口服或肠胃外给药后，在预定时间内(例如，约一个小时)形成实验可检测的量的本发明的化合物的化合物。本发明的化合物的所有前药包含在本发明的范围内。
而且，本发明的一些化合物本身可能不具有所述药理活性或可能具有最小的药理活性，但是其可以在肠胃外给药或口服给药并且之后在体内代谢形成具有药理活性的本发明的化合物。这样的化合物(还包括可能具有一些药理活性的化合物，但是所述化合物的活性明显低于其代谢成的本发明“活性”化合物的活性)也可被称为“前药”。
因此，本发明的化合物是有用的，因为他们具有药理活性和/或在肠胃外给药或口服给药后在体内被代谢形成具有药理活性的化合物。
本发明的化合物(如上文所定义，但是不受限制)可用于治疗癌症。“癌症”是指由细胞的不受控的生长(例如，不受控的分裂)、侵入(例如，直接生长至临近组织)或转移而引起的任何疾病。“不受控的生长”包括癌细胞数量的增加和/或尺寸的增长(在本文中也称为“增殖”)。“转移”是指癌细胞从受治者体内的原发肿瘤位点移动或迁移到受治者体内的一个或多个其他区域(在该区域中细胞随后形成继发肿瘤)。因此，在一种实施方式中，本发明提供了用于完全或部分抑制患有癌症的受治者体内继发肿瘤形成的化合物和方法。
有利的是，本发明的化合物能够选择性抑制癌细胞的增殖和/或转移。
“选择性”是指本发明的化合物可在比其对非癌细胞的功能(例如，增殖)的调节更高的程度上抑制癌细胞的增殖和/或转移。优选地，本发明的化合物仅仅抑制癌细胞的增殖和/或转移。
另一方面，本发明提供了一种含有本发明化合物和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，其中，所述化合物是游离形式或药学上可接受的盐的形式。该组合物可以是口服组合物、注射组合物或栓剂。并且该组合可以通过混合、造粒或包被方法以常规方式制备。
在本发明的实施方式中，所述组合物是口服组合物，且可以是片剂或明胶胶囊。优选地，该口服组合物包括本发明化合物以及：a)稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸的镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂而言，该口服组合物包括：c)粘合剂，例如，硅酸镁铝盐、淀粉糊、明胶、tragamayth、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如有需要，该口服组合物还包括d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、褐藻酸或其钠盐或者泡腾混合物；和/或e)添加剂，例如，吸收剂、着色剂、调味剂和/或增甜剂。
在本发明的另一实施方式中，该组合物是注射组合物，且可以是水性等渗溶液或悬浮液。
在本发明的另一实施方式中，该组合物是栓剂，且由脂肪乳剂或悬浮液制备。
优选地，所述组合物是无菌的和/或包括佐剂。所述佐剂可以是防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂和/或它们的任意组合。
可选地或额外地，所述组合物可进一步包括其他治疗上有价值的针对不同应用的物质，例如，增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和/或防腐剂。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物可以是适用于透皮给药的剂型。该剂型包括有效量的本发明的化合物和载体。优选地，所述载体可包括帮助穿透宿主皮肤的可吸收的药学上可接受的溶剂。也可以采用含有所述剂型的透皮装置。该透皮装置可以是绷带形式，其包括背衬层；含有所述化合物和任选载体的贮库；任选地可在一段延长的时间内以控制的和预定的速度将所述化合物传递至宿主皮肤的控速屏障；以及将装置固定于皮肤的工具。此外，也可以采用骨架透皮剂型。
在本发明的另一实施方式中，所述组合物可以是适用于局部(例如，皮肤和眼睛)给药的剂型，且可以是本领域熟知的水溶液、软膏剂、乳剂或凝胶剂。
另一方面，本发明提供一种抑制从细胞分泌WNT的方法。
在一种实施方式中，细胞包含在哺乳动物体内，且给药量是治疗有效量。在另一实施方式中，WNT信号传导的抑制进一步导致细胞生长的抑制。在进一步的实施方式中，所述细胞是癌细胞。在又一实施方式中，所述细胞是纤维化细胞。
细胞增殖采用本领域技术人员已知的方法测量。例如，一种测量细胞增殖的简便方法是购自Promega(Madison，WI)的CellTiter-GloTM分析方法。该分析方法的步骤包括将试剂加至多孔培养板上培养的细胞中。由光度计或成像装置测量的发光信号与存在的ATP的量成比例，ATP与培养基中存在的活细胞的数目直接成比例。此外，细胞增殖也可以采用本领域已知的集落形成分析测量。
本发明还提供了一种采用有效量的本发明的化合物治疗WNT信号传导通路相关的癌症或纤维化的方法。本领域技术人员通过采用本领域已知的几种技术之一分析癌症细胞很容易确定癌症是否与WNT通路相关。例如，本领域技术人员可以利用免疫和核酸检测方法在Wnt信号传导中所涉及的蛋白质或mRNA水平上检测癌细胞畸变。
WNT通路相关的癌症或纤维化包括WNT信号传导通路中的一种或多种组分的活性相对于基准水平被上调的那些癌症或纤维化。在一种实施方式中，抑制WNT通路可包括抑制WNT分泌。在另一实施例中，抑制Wnt通路可包括抑制细胞表面受体的下游组分。在另一实施方式中，抑制WNT分泌可包括抑制功能性WNT分泌所涉及的任何蛋白质的活性。
而且，本发明提供一种通过将治疗有效量的WNT抑制剂给药于受治者来治疗患有疾病的受治者的WNT通路紊乱的方法。在一种实施方式中，所述疾病是与异常的(例如，上升的)WNT信号传导活性相关的细胞增殖紊乱。在另一实施方式中，所述疾病由WNT蛋白的量增加引起。在又一实施方式中，所述细胞增殖紊乱是癌症，所述癌症包括但不限于：肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳腺癌、前列腺癌、类癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、肝母细胞癌、结肠直肠癌、头颈鳞状细胞癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、硬纤维瘤、急性粒细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)。在再一实施方式中，所述细胞增殖紊乱是纤维化，所述纤维化包括但不限于肺纤维化(例如，特发性肺纤维化和辐射诱导的纤维化)，肾脏纤维化和肝纤维化(包括肝硬化)。在另一实施方式中，所述疾病是指骨关节炎、帕金森病、视网膜病变、黄斑变性。
对于治疗应用而言，本发明的化合物可以通过本领域已知的任何可接受的方式以治疗有效量单独给药。本文中使用的治疗有效量可以随着疾病的严重程度、受治者的年龄和相对健康状况、所使用的化合物的效力以及其他因素发生很大的变化。总体而言，在约0.03mg/kg受治者体重～2.5mg/kg受治者体重的每日剂量条件下显示出获得全身性满意结果。在一种实施方式中，针对大型哺乳动物(例如，人类)的规定日剂量为约0.5mg～约100mg。优选地，所述化合物以一天最多分成4次的形式给药或以缓释形式给药。在另一实施方式中，用于口服给药的合适的单位剂型包括ca.1～100mg活性成分。
可选地，本发明的化合物可作为活性成分以治疗有效量与一种或多种治疗剂联合(例如，药物组合)给药。当本发明的化合物和本领域已知的化疗剂一起使用时，它们可产生协同效应。共给药的化合物的剂量可基于所采用的共同药物的类型、所采用的具体药物、治疗情况等等而发生改变。
本发明的化合物或其组合物可以任何常规途径给药。在一种实施方式中，本发明的化合物或其组合物肠道给药，例如口服给药，并且以片剂或胶囊的形式给药。在另一实施方式中，本发明的化合物或其组合物肠胃外给药并且以可注射溶液或悬浮液的形式给药。在再一实施方式中，本发明的化合物或其组合物局部给药并且以乳液、凝胶、软膏或霜剂的形式给药，或以鼻喷剂或栓剂形式给药。
另一方面，本发明还提供了一种药物组合，优选为试剂盒，包括：a)第一试剂，即本文所公开的本发明的化合物，游离形式或药学上可接受的盐的形式；和b)至少一种共试剂。此外，该试剂盒可包括给药说明。
本发明的组合可以体内使用或体外使用。优选地，所期望的给药治疗效果可以通过使细胞、组织或器官与包括本发明的化合物以及一种或多种试剂的单一组合物或药物制剂接触来实现，或通过使细胞与两种或多种不同的组合物或制剂接触来实现，其中，一种组合物包括一种试剂，另一种组合物包括另一种试剂。组合中的试剂可以同时给药或在一段时间内分开给药。优选地，分开给药能够达到期望的治疗效果。本发明的化合物能够在数分钟至数周的时间间隔范围内，在其他试剂之前给药，与其他试剂同时给药，和/或在其他试剂之后给药。本领域的技术人员通常可确保每次递送的时间间隔，其中分开给药的试剂仍然能够在细胞、组织或器官上发挥有利的联合作用。在一种实施方式中，本发明还涉及作为候补物质的一种试剂以两种、三种、四种或更多形态几乎同时(即，在小于约1分钟之内)接触细胞、组织或器官。在另一实施方式中，一种或多种试剂在约1分钟到14天的时间内给药。
另一方面，本发明提供了一种制备本发明的化合物及其盐或衍生物的方法。
在一种实施方式中，通式(I)的化合物可以采用下文实施例部分所描述的合成方法中的任何一种制备。在所描述的反应中，那些期望出现在终产物中的反应性官能团(例如，羟基、氨基、亚氨基、巯基或羧基)可被保护以避免它们参与不需要的反应。可以依据标准操作(参见，例如，T.W.Greene和P.G.M.Wuts in“Protective Groups in OrganicChemistry”，John Wiley and Sons，1991)使用常规的保护基团。在所描述的合成方法中使用的合适的离去基团包括卤素离去基团和本领域已知的其他常规离去基团。优选地，离去基团为氯或溴。
在另一实施方式中，还可获得本发明的化合物及其盐的水合物的形式或其结晶，所述结晶可包括，例如，用于结晶的溶剂(作为溶剂化物存在)。盐通常可通过采用合适的碱试剂(优选地采用碱金属碳酸盐、碱土金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物，更优选地采用碳酸钾或氢氧化钠)进行处理转化成游离形式的化合物。碱加成盐形式的本发明的化合物可通过采用合适的酸(例如，盐酸)进行处理转化成相应的游离酸。鉴于游离形式的新化合物和它们的盐形式(包括那些可作为中间体的盐，例如，在新化合物纯化或鉴别过程中的盐)之间的紧密关系，任何涉及游离化合物的内容也可被酌情理解为涉及相应的盐的内容。
带有成盐基团的本发明化合物的盐可以通过本领域已知的方式制备。因此，通式(I)化合物的酸加成盐可以通过用酸或者合适的阴离子交换剂进行处理而获得。本发明化合物药学上可接受的盐可以使用碱性氮原子和有机酸或无机酸而形成为通式(I)的化合物的酸加成盐。
优选地，合适的无机酸包括但不限于：氢卤酸(例如，盐酸)、硫酸或磷酸。
优选地，合适的有机酸包括但不限于：羧酸、磷酸、磺酸或氨基磺酸；例如，乙酸，丙酸，辛酸，癸酸，十二酸，乙醇酸，乳酸，反丁烯二酸，丁二酸，己二酸，庚二酸，辛二酸，壬二酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，氨基酸(例如，谷氨酸或天冬氨酸)，马来酸，羟基马来酸，甲基马来酸，环己烷羧酸，金刚烷羧酸，苯甲酸，水杨酸，4-氨基水杨酸，邻苯二甲酸，苯乙酸，扁桃酸，肉桂酸，甲-磺酸或乙-磺酸，2-羟基乙磺酸，乙烷-1，2-二磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，1，5-萘二磺酸，2-，3-或4-甲基苯磺酸，甲基硫酸，乙基硫酸，十二烷基硫酸，N-环己基氨基磺酸，N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-氨基磺酸或其它有机质子酸(例如，抗坏血酸)。
可选地，还可能采用药学上不可接受的用于分离或纯化的盐，例如，苦味酸盐或高氯酸盐。但对于治疗用途而言，在应用于药物制剂形式中时，只能使用药学上可接受的盐或游离化合物。
在另一实施方式中，非氧化形式的本发明的化合物可通过在0～80℃下在合适的惰性有机溶剂中采用还原剂进行处理而由本发明的化合物的N-氧化物制备。优选地，还原剂是硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化物等等。优选地，惰性有机溶剂是乙腈、乙醇、水性二氧六环等等。
在另一实施方式中，本发明化合物的前药衍生物可以通过本领域已知的方法制备(进一步的细节参见Saulnier等人，(1994)，Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters，Vol.4，p.1985)。在优选的实施方式中，合适的前药可以通过使非衍生化的本发明化合物与合适的氨基甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基碳酸酯氯化物、对-硝基苯碳酸酯)反应而制备。
在另一实施方式中，本发明化合物的受保护的衍生物可以采用本领域已知的方法制备。可用于产生保护基团以及去除保护基团的技术的详细描述可以参考T.W.Greene，“Protecting Groups in Organic Chemistry”，第3版，John Wiley and Sons，Inc.，1999。
在另一实施方式中，本发明化合物能够制备成其单独的立体异构体。方法包括：使所述化合物的外消旋混合物与光学活性拆分剂反应以形成一对非对映异构体化合物，分离非对映异构体并回收光学纯的对映异构体。对映异构体的拆分可以使用本发明的化合物的共价非对映异构体衍生物来进行或可使用可离解的复合物(例如结晶非对映异构体盐)来进行。非对映异构体具有不同的物理性质(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)，利用这些差异可以很容易地对非对映异构体进行分离。非对映异构体可以通过分级结晶、色谱法或基于溶解度差异的分离/拆分技术进行分离。然后，光学纯的对映异构体以及拆分剂通过任何不会导致外消旋化的实用方法进行回收。可用于从本发明的化合物的外消旋混合物中拆分化合物的立体异构体的技术的更详细描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，SamuelH.Wilen，“Enantiomers，Racemates and Resolutions”，John Wiley And Sons，Inc.，1981。
总而言之，本发明的化合物可以通过实施例中描述的方法制备；任选地，药学上可接受的盐可以由本发明的化合物转化而来；任选地，药学上可接受的N-氧化物可以由本发明的化合物的非氧化形式转化而来；任选地，本发明的化合物的单个异构体可以由异构体混合物拆分而来；任选地，药学上可接受的前药衍生物可以由未衍生化的本发明的化合物转化而来。
在没有具体描述原料的生产的情况下，这些化合物是已知的或者可以用类似于本领域已知的方法或如下文实施例中所公开的方法制备。本领域技术人员应当理解的是，上述转化仅仅是制备本发明的化合物的方法的代表，类似地，可以采用其它公知的方法。
IV.患者选择和癌症治疗
一方面，本发明提供用于治疗受治者体内特征为R-spondin的过表达和/或R-spondin融合的表达的组合物和方法，所述受治者已被诊断为具有R-spondin的过表达和/或R-spondin融合的过表达并且所述受治者需要这种治疗。
R-spondin(RPSO)是四种富含半胱氨酸分泌蛋白的家族，所述半胱氨酸分泌蛋白包括单个血小板反应蛋白I型重复(TSR)结构域。Rspo基因家族是进化上保守的并且可在所有后口动物的基因组和转录子数据库中找到，所述后口动物包括半索类动物，Saccoglossus kowalevskii(囊舌虫)，脊索动物，Ciona intestinalis(尾索动物亚门)以及棘皮动物。来自不同脊柱动物物种的RSPO显示出经典WNT信号传导激活剂的性质。RSPO蛋白质的CR结构域主要负责介导WNT/β-连蛋白信号传导通路的活化。因为缺乏TSR和BR结构域的RSPO无法有效活化经典WNT信号传导，所以，TSR和BR结构域被认为调节在经典WNT信号传导上的RSPO活性强度。Yoon，J.K.&Lee，J.S.Cellular signaling and biologicalfunctions of R-spondins.Cell.Signal.24，369-377(2012)。
本文中的“R-spondin融合”是指Rspo基因(包括但不限于Rspo2和Rspo3基因)中的一个基因与另一基因(“融合搭档基因”)之间的融合，包括但不限于：PTPRK，EIF3E，EMC2，PVT1和HNF4G基因。所述融合可由缺失或倒置引起。Rspo基因和5’搭档基因的融合通常导致Rspo基因(全长的融合基因产物或融合基因产物的一部分)在受到不同基因(例如，融合搭档基因)的启动子的控制下表达，这使得Rspo基因(例如，融合基因)的表达水平在mRNA水平和/或蛋白质水平上发生改变(例如，表达提高)。Rspo融合基因可生成功能性或非功能性Rspo片段。
关于癌症和突变的R-spondin多核苷酸和多肽的“特征”是指相对于不存在R-spondin基因缺失和/或融合多肽的癌症，其中存在涉及R-spondin的基因缺失或易位和/或表达的融合多肽的癌症。突变多肽的存在可完全或部分促使该癌症的生长和存活。
本文提供的组合物用于治疗涉及Rspo融合的多种癌症，例如，结肠直肠癌、胃癌、肝癌、食道癌，肠癌，胆道癌，胰腺癌，子宫内膜癌和前列腺癌。
某些肿瘤(例如，结肠直肠肿瘤和前列腺肿瘤)获得激活WNT通路的机制是编码WNT配体增强子的两个基因(R-spondin-2和R-spondin-3)通过融合到其他基因(例如，PTPRK，EIF3E，EMC2，PVT1和HNF4G基因)而被转录激活。参考本文提供的实施例，Seshagiri S，等人的文章(Seshagiri S等人，Recurrent R-spondin fusions in coloncancer.Nature.2012Aug 30；488(7413)：660-4)及Robinson等人的文章(Robinson等人，Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cance，Cell 161，1215-1228May 21，2015)，该文献的全部内容通过引用并入本文。Rsop融合基因可产生功能性或非功能性的Rspo蛋白质片段。当产生功能性Rspo蛋白片段时，功能性Rspo蛋白片段可作为Wnt通路的激活剂，从而可引起肿瘤细胞的增殖。
本发明提供了利用本领域已知的方法和/或本文提供的方法筛选具有Rspo融合的癌症患者的方法和组合物，且任选地使用本文提供的Wnt抑制剂治疗所述患者。
Rspo基因可在基因组DNA水平、mRNA水平或蛋白水平上被检测。利用本领域已知的方法获取需要检测的受治者的生物样本。所述生物样本被任选地进行处理以获取蛋白质、RNA和/或DNA，进而用于检测Rspo融合的试验。
A.生物样本
本文中的“生物样本”是指任何疑似含有Rspo融合多核苷酸或多肽或其片段(包括Rspo-PTPRK和Rspo-EIF3E融合多核苷酸和多肽)的生物样本，并且可包括细胞，分离自细胞的染色体(例如，多个中期染色体)，基因组DNA(在溶液中或结合在例如用于Southern分析的固体载体上)，RNA(在溶液中或结合在例如用于northern分析的固体载体上)，cDNA(在溶液中或结合在固体载体上)，来自细胞、血液、尿液、骨髓或组织等的提取物。
用于本发明方法的实际操作中的生物样本可以获自任何哺乳动物，所述哺乳动物体内存在或正在形成特征为Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多肽表达的癌症。在一种实施方式中，所述哺乳生物是人类，所述人类可以是用于治疗癌症(例如，结肠癌、胃癌和食道癌)的Wnt抑制疗法的候选人。所述人类候选人可以是正在接受或正在考虑接受例如本文所提供的Wnt抑制剂治疗的患者。在另一实施方式中，所述哺乳动物是大型动物，例如，马或牛，而在其他实施方式中，所述哺乳动物是小型动物，例如，猫或狗，已知所有这些哺乳动物患有癌症，包括结肠癌、胃癌和食道癌。
含有来自哺乳动物癌症的细胞(或细胞提取物)的任何生物样本适用于本发明的方法。利用肿瘤标志物、角蛋白标志物或其他所描述的阴性选择方法(参见Ma等人，Anticancer Res.23(1A)：49-62(2003))也可以从血清中获得循环肿瘤细胞。对于白血病患者来说，血清和骨髓样本尤为优选。对于涉及实体瘤(例如，肉瘤和恶性上皮肿瘤(carcinomas))的癌症而言，所述生物样本可包括获自肿瘤活检的细胞，其可以根据标准临床技术获得。
例如，可以采用以商标Vita-AssaysTM，Vita-CapTM和(购自Vitatex，LLC(强生公司))销售的试剂盒和试剂纯化循环肿瘤细胞(“CTC”)。对其他用于分离CTC的方法进行了描述(参见，例如，公开号为WO/2002/020825的PCT申请，Cristofanilli等人，NewEngl.J.of Med.351(8)：781-791(2004)以及Adams等人，J.Amer.Chem.Soc.130(27)：8633-8641(2008年7月))。在具体实施方式中，可分离和鉴定来源于肺、结肠、胃、食道的循环肿瘤细胞(“CTC”)。
B.Rspo融合多肽的检测
在一些实施方式中，Rspo融合采用免疫分析法检测。产生Rspo融合蛋白或肽以制备Rspo融合蛋白特异性抗体(单克隆或多克隆)。所述抗体随后被用于检测Rspo融合存在的分析方法中。
Rspo融合通常采用Rspo融合特异性试剂检测。本文中的“Rspo融合多肽特异性试剂”是指任何能够特异性结合Rspo融合多肽、检测和/或量化生物样本中Rspo融合多肽的存在/表达水平的试剂(生物试剂或化学试剂)。该术语包括但不限于下述优选的抗体和试剂，以及在本发明保护范围之内的等同试剂。
适用于本发明的方法的实际操作的试剂包括PTPRK-Rspo3融合多肽特异性抗体和/或EIF3E-Rspo2融合多肽特异性抗体，或本文提供的其他Rspo2或Rspo3融合蛋白。本发明的融合特异性抗体是分离的抗体或如下抗体，所述抗体特异性结合本发明的PTPRK-Rspo3融合多肽(例如，对应于本文所提供的PTPRK-Rspo3融合序列的肽，或本文提供的其他Rspo2或Rspo3融合蛋白)但几乎不结合野生型Rspo或野生型PTPRK，或者特异性结合本文所述的EIF3E-Rspo2融合多肽(例如，对应于本文所提供的Rspo2-EIF3E融合序列的肽)但几乎不结合野生型的Rspo或野生型的EIF3E。
人类PTPRK-Rspo3或EIF3E-Rspo2融合多肽(或本文提供的其他Rspo2或Rspo3融合蛋白)特异性抗体也可结合到其他哺乳动物(例如，老鼠和兔)中的高度同源肽序列和等同表位肽序列，反之亦然。在本发明的方法的实际操作中有用的抗体包括(a)单克隆抗体；(b)纯化的多克隆抗体，其特异性结合至目标多肽(例如，Rspo3-PTPRK融合多肽或Rspo2-EIF3E融合多肽或本文提供的其它Rspo2或Rspo3融合蛋白的的融合连接)；(c)如上述(a)-(b)中所述的结合其他非人类物种(例如，大鼠和小鼠)中的等同且高度同源表位或磷酸化位点的抗体；以及(d)如上述(a)-(c)中所述的抗体的片段，其结合至被本文所公开的示例性抗体结合的抗原(或更优选为表位)。
在本文中，“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的，且可以是来源于任何物种，包括(例如)大鼠、小鼠、兔、马或人类，也可以是嵌合抗体，参见，例如，M.Walker等人，Molec.Immuno1.26：403-11(1989)；Morrision等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.81：6851(1984)；Neuberger等人，Nature 312：604(1984)。所述抗体可以是根据美国专利US 4,474,893(Reading)或US 4,816,567(Cabilly等人)中公开的方法制备的重组单克隆抗体。所述抗体还可以是根据美国专利US 4,676,980(Segel等人)中公开的方法制备的化学构建的特异性抗体。
本发明不限于使用抗体，还包括等同分子，例如，结合结构域的蛋白质或核酸适体，所述等同分子以融合蛋白或截短蛋白特异性的方式结合至如下表位，所述表位与本发明的方法中使用的Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多肽特异性抗体所结合的表位实质上相同。参见，例如，Neuberger等人，Nature 312：604(1984)。这样的等同非抗体试剂可适用于下文进一步描述的本发明的方法。
在本发明的方法的实际操作中使用的多克隆抗体可以根据标准技术如下制备：采用含有期望的融合蛋白特异性表位(例如，本文所述的Rspo融合蛋白的融合连接)的抗原免疫合适的动物(例如，兔或羊等)；从所述动物中采集免疫血清；从所述免疫血清中分离多克隆抗体；以及根据已知的步骤纯化具有期望的特异性的多克隆抗体。抗原可以是根据已知技术选择和构建的含有所期望的表位序列的合成肽抗原，参见，例如，ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL，Chapter 5，p.75-76，Harlow & Lane Eds.，Cold Spring HarborLaboratory(1988)；Czernik，Methods In Enzymology，201：264-283(1991)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：21-49(1962)。可以根据下文的进一步描述筛选和分离如本文所述的那样制备的多克隆抗体。
单克隆抗体也可以有利地用于本发明的方法，其可以根据熟知的Kohler和Milstein技术在杂交瘤细胞系中产生。Nature 265：495-97(1975)；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；还可以参考CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel et al.Eds.(1989)。如此制得的单克隆抗体是高度特异性的并且使本发明提供的分析方法的选择性和特异性得到改善。例如，含有合适抗原(例如，包含Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多肽的融合连接的合成肽)的溶液可以注射至小鼠体内，在足够的时间(用常规技术饲养)之后，处死小鼠，获得脾细胞。然后通过将脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞而使脾细胞永生化，该过程通常是在聚乙二醇存在下进行的。例如，兔融合杂交瘤可以根据1997年10月7日授权的美国专利US5,675,063(Knight)所描述的那样而制得。如下所述，杂交瘤细胞随后在适当选择的培养基中生长并且筛选具有所期望的特异性的单克隆抗体的上清液，所述培养基例如，次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)。分泌的抗体可以通过常规方法，例如，沉淀、离子交换或亲和层析法等从组织培养物上清液中回收。
单克隆的Fab片段还可以通过本领域技术人员已知的重组技术在大肠杆菌中制得。参见，例如W.Huse，Science 246：1275-81(1989)；Mullinax et al.，Proc.Nat′lAcad.Sci.87：8095(1990)。如果某一同种型的单克隆抗体优选用于特定应用，特定的同种型可以通过从最初融合中选择而直接制得，或使用近亲选择技术从分泌不同的同种型的单克隆抗体的亲本杂交瘤中分离类别转换的变异体而间接制得(Steplewski，等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，82：8653(1985)；Spira等人.，J.Immunol.Methods，74：307(1984))。单克隆抗体的抗原结合位点可以通过PCR克隆，并且单链抗体制成噬菌体展示的重组抗体或大肠杆菌中的可溶抗体(参见，例如，ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS，1995，1995，Humana Press，Sudhir Paul editor)。
进一步地，美国专利US 5,194,392(Geysen，1990)描述了一种检测或确认单体(氨基酸或其他化合物)序列的通用方法，所述单体是表位的拓扑等价物(例如，模拟表位)，所述表位与目标抗体的特定补位(抗原结合位点)互补。更普遍而言，该方法涉及检测或确认单体序列，所述单体是与特定目标受体的配体结合位点互补的配体的拓扑等价物。类似地，美国专利US 5,480,971(Houghten等人，1996)公开了线性C1-C-烷基全烷基化的寡聚肽以及所述肽的集合和文库，还公开了利用所述寡聚肽集合和文库确定优先结合到目标受体分子的全烷基化寡聚肽的序列的方法。因此，本发明的具有表位(epitope-bearing)的肽的非肽类似物也可以通过这些方法常规制备。
本发明方法中使用的抗体，无论是多克隆的或单克隆的，可以根据标准技术筛选出表位和融合蛋白特异性。参见，例如，Czernik等人，Methods in Enzymology，201：264-283(1991)。例如，可以通过ELISA从肽文库中筛选抗体，以确保对所期望的抗原的特异性以及在需要的情况下仅仅与，例如，本发明的Rspo3-PTPRK融合多肽反应而不与野生型Rspo3或野生型PTPRK的反应性。也可以通过Western印迹从含有靶蛋白的细胞制剂中检测抗体，以确认抗体仅仅与所期望的靶点的反应性，并确保抗体不与涉及Rspo的其他融合蛋白发生可检测的结合。融合蛋白特异性抗体的制备、筛选和使用是本领域技术人员已知的，且已经被公开。参见，例如，美国专利公开US 20050214301(Wetzel等人.，2005年9月29日)。
本发明方法中所用的融合多肽特异性抗体可显示出一些与其他融合蛋白中的相似融合表位的有限交叉反应性或与形成融合连接的野生型Rspo、野生型PTPRK和野生型EIF3E中的表位的有限交叉反应性。这是不期望的，因为大多数抗体显示出了一些程度的交叉反应性，所以，抗-肽抗体将会经常与具有与免疫肽高度同源性或同一性的表位发生交叉反应。参见，例如上述的Czernik。与其他融合蛋白质的交叉反应性很容易通过Western印迹以及已知的分子量标记物来表征。可以检查交叉反应蛋白的氨基酸序列以鉴别与抗体结合的Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多肽的序列具有高度同源性或同一性的位点。不理想的交叉反应性可以通过使用在肽柱上进行的抗体纯化的负选择去除(例如，选择除去与野生型Rspo、野生型PTPRK和/或野生型EIF3E结合的抗体)。
用于实践本文所公开的方法的本发明的Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多肽特异性抗体对于人类融合多肽具有理想的特异性，但是不限于仅仅结合人类自身。本发明包括制备和使用还结合其他哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、猴)中的保守且高度同源性或同一性表位的抗体。其他物种中的高度同源性或同一性序列可易于通过标准序列比对鉴定，例如，使用BLAST与人类Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多肽比对。
用于本发明方法的抗体可以进一步用特定的分析方式(例如，流式细胞术(FC)、免疫组化(IHC)和/或免疫细胞化学(ICC))进行表征和确认。抗体也可以有利地偶联至用于多参数分析的荧光染料(例如，Alexa488，PE)或者标记物(例如，量子点)，以及其他信号转导(磷酸-AKT，磷酸-Erk 1/2)和/或细胞标记物(细胞角蛋白)抗体。
C.Rspo融合多核苷酸的检测
本发明提供的融合特异性试剂还包括适用于检测Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多核苷酸或者本文提供的其他Rspo2或Rspo3融合多核苷酸的核酸探针和引物。其中，这些探针理想地包括对应于产生融合的野生型Rspo和/或野生型PTPRK基因或野生型Rspo和/或野生型EIF3E基因中的断点的两侧的断点探针。本文描述了这些探针在诸如荧光原位杂交(FISH)或聚合酶链式反应(PCR)扩增之类的分析中的特定用途。
在一些实施方式中，Rspo融合通过PCR(例如，常规PCR、实时PCR(Q-PCR)或数字PCR)进行检测。采用一对引物扩增所述融合基因。所述引物是基于待扩增的融合基因序列而设计的。优选地，一条引物与Rspo基因的第一序列杂交，另一引物与融合搭档基因的第二序列杂交。在如本领域已知的，在可优化的条件下，PCR可以在cDNA(利用生物样本由RNA制备而成)或在基因组DNA上进行。
在一些实施方式中，使用FISH(如Verma等人，HUMAN CHROMOSOMES：A MANUAL OFBASIC TECHNIQUES，Pergamon Press，New York，N.Y.(1988)中所描述)，并且FISH可与其他物理染色体定位技术和遗传图谱数据相关联。遗传图谱数据的实例可以在1994 GenomeIssue of Science(265：1981f)中找到。编码Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多肽的基因在物理染色体图谱上的位置与特定疾病或特定疾病易感性之间的关联可有助于划定与遗传疾病相关的DNA区域。受治者的核苷酸序列可用于检测正常个体、携带者或患者的基因序列之间的差异。
在一些实施方式中，第一探针与Rspo基因序列杂交，且被第一颜色(例如，红色)标记，第二探针与融合搭档基因序列杂交，且被第二颜色(例如，绿色)标记。在Rspo融合的情况下，这两个探针与融合基因杂交，且彼此接近。因此，这两个探针的图像合并，产生不同的颜色(例如，黄色)。
应当理解的是，所有检测本发明的Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多核苷酸的方法(例如，PCR和FISH)可以与检测突变Rspo多核苷酸或突变Rspo多肽的其他方法结合。例如，检测生物样本(例如，循环肿瘤细胞)的遗传物质中的Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多核苷酸之后可进行该样品的蛋白质的Western印迹分析或免疫组化分析(IHC)，以确定Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多核苷酸是否确实在生物样本中表达为Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多肽。这样的Western印迹或IHC分析可以采用特异性结合至由检测到的Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合多核苷酸编码的多肽的抗体进行，或者可以采用特异性结合至全长Rspo(例如，结合到该蛋白的N末端)或全长PTPRK(例如，结合至PTPRK激酶结构域的表位)的抗体进行分析。这样的分析是本领域已知的(参考，例如，美国专利US 7,468,252)。
在另一实施方式中，Dako的CISH技术使得显色原位杂交和免疫组化在同一个组织切片上进行。
在一些实施方式中，Rspo融合利用下述探针通过在Southern印迹分析中的杂交而进行检测，所述探针包括来自于Rspo基因和融合搭档基因两者的序列。
在一些实施方式中，Rspo融合通过其他基于杂交的方法(例如，基因芯片、分支DNA或进行检测。
在一些实施方式中，利用微阵列芯片通过杂交检测Rspo融合，其中定制的融合基因微阵列芯片用于检测癌症标本的Rspo融合转录子。寡核苷酸被设计成能够将嵌合转录子的联合测定与各个融合搭档的外显子方面(exon-wise)的测定结合起来。参考Skotheim，RI；Thomassen，GO；Eken，M；Lind，GE；Micci，F；Ribeiro，FR；Cerveira，N；Teixeira，MR等人.A universal assay for detection of oncogenic fusion transcripts by oligomicroarray analysis.Molecular Cancer 8：5.(2009)。
在一些实施方式中，利用分支DNA分析通过杂交检测Rspo融合。在这些实施方式中，定制的杂交和信号放大分析(例如，分支DNA分析)被用于检测癌症标本裂解液中的Rspo融合转录子。捕获扩展物探针和标记扩展物探针的序列来源于Rspo基因和融合搭档基因(例如，Rspo3的PTPRK，Rspo2的EIF3E)的外显子序列，如实施例9中示例的那些。参考Lu B.，等人，Detection of TMPRSS2-ERG fusion gene expression in prostatecancer specimens by a novel assay using branched DNA.Urology 74(5)：1156-61(2009)。
在一些实施方式中，利用原位杂交检测Rspo融合。定制的原位杂交和信号放大试验(例如，或)被用于检测来自癌症标本的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织或冷冻的组织中的Rspo融合转录子。捕获扩展物探针和标记扩展物探针的序列来源于Rspo基因和融合搭档基因(例如，Rspo3的搭档PTPRK，Rspo2的搭档EIF3E)的外显子序列，如实施例9中示例的那些。参见，Wang F，Flanagan J，Su N，Wang LC，Bui S，Nielson A，Wu X，Vo HT，MaXJ，Luo Y.RNAscope：a novel in situ RNA analysisplatform for formalin-fixed，paraffin-embedded tissues.J Mol Diagn.14(1)：22-9(2012)。
在一些实施方式中，利用测序检测Rspo融合，例如，Sanger测序或新一代测序技术。
通过对测序引物进行扩展或对延伸产物进行扩展的测序可利用多种方法进行。例如，测序可以采用标记的可逆终止子进行或通过与具有标记的寡核苷酸连接而进行。测序可以采用任何商售的方法进行，例如，商业上获自诸如Illumina，Inc.(圣地亚哥，加利福尼亚州)和Life Technologies(离子激流公司)之类的公司的基于可逆终止子的测序方法。
在一些实施方式中，高通量测序包括使用获自Roche/454 Lifesciences，Inc.(布兰福德，康乃迪克州)的技术。使用小珠扩大以及随后使用光纤检测的方法在下列参考文献中描述，Marguiles，M.，等人，″Genome sequencing in microfabricated high-densitypicolitre reactors″，Nature，doi：10.1038/nature03959以及美国公开申请US20020012930，US20030058629，US20030100102，US20030148344，US20040248161，US20050079510，US20050124022和US20060078909。
在一些实施方式中，高通量测序采用克隆单分子阵列(Solexa，Inc/Illumina，Inc.)进行或采用利用可逆终止子化学的合成测序(SBS)方法进行。这些技术在，例如，美国专利US 6,969,488；US6,897,023；US6,833,246；US6,787,308和美国专利申请公开US20040106130，US20030064398，US20030022207以及Constans，A.，The Scientist 2003，17(13)：36中进行了部分描述。
在一些实施方式中，本文提供的方法检测如下R-spondin融合，其是(1)PTPRKe1-Rspo3e2融合；(2)PTPRKe7-Rspo3e2融合；(3)EIF3Ee1-Rspo2e2融合；或(4)EIF3Ee1-Rspo2e3融合。
在一些实施方式中，本文提供的方法检测如下R-spondin融合，其是(1)EMC2e1-Rspo2e2融合；(2)PVT1-Rspo2e2融合；(3)PVT1-Rspo2e3融合；(4)HNF4G-Rspo2e2融合；或(5)PTPRKe13-Rspo3e2融合。
R-spondin融合通常产生由融合搭档(例如，PTPRK，EIF3E，EMC2，PVT1，或HNF4G)的启动子驱动的R-spondin基因的表达。
各种不同的Rspondin基因融合的连接在表8(图5A)和表9(图5B)中提供。并且还提供了各种不同的基因融合的连接的序列。对于本领域技术人员而言明显的是，任何序列包括通过对生物样本测序而确定的连接，其可包括表8(图5A)和表9(图5B)所示的部分序列或全部序列。
D.R-spondin过表达的检测
另一方面，本发明提供了用于检测R-spondin过表达或表达水平提高的组合物和方法。R-spondin的过表达可与Wnt的过表达或激活共存，也可不与Wnt的过表达或激活共存。
R-spondin过表达可以是R-spondin mRNA或多肽的过表达，或这两者的过表达。R-spondin可以是野生型的或R-spondin的变体，例如，本文所公开的R-spondin融合(例如，Rspo3-PTPRK或Rspo2-EIF3E融合)。
R-spondin过表达是相对于基准表达水平确定的，基准表达水平可以通过测定正常细胞或正常受治者群体(例如，正常人类群体)中的R-spodin(mRNA或多肽)的表达水平获得。
R-spodin在mRNA水平上的表达水平采用本领域已知的方法测定，例如，Northern印迹，RT-PCR，与实时PCR结合的RT-PCT，数字PCR，DNA芯片，高通量测序或原位杂交，Nanostring nCounter，等等。
R-spodin在mRNA水平或蛋白水平上的表达水平采用本领域已知的方法测定，例如，Western印迹，蛋白质芯片，免疫组化染色等等。
在任何方法的一些实施方式中，表达提高是指，与参比样本、参比细胞、参比组织、对照样本、对照细胞或对照组织相比，由本领域已知的标准方法检测的生物标志物(例如，蛋白质或核酸(例如，基因或mRNA))的水平总体上增加约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高中的任一种。在一些实施方式中，表达提高是指，样本中生物标志物的表达水平/量提高，其中，所述提高是参比样本、参比细胞、参比组织、对照样本、对照细胞或对照组织中的各个生物标志物的表达水平/量的至少约1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍中的任一种。在一些实施方式中，表达提高是指，与参比样本、参比细胞、参比组织、对照样本、对照细胞、对照组织或内参(例如，管家基因)相比，总体上提高超过约1.5倍、超过约1.75倍、超过约2倍、超过约2.25倍、超过约2.5倍、超过约2.75倍、超过约3.0倍、或超过约3.25倍。
E.采用Nanostring nCount检测Rspo过表达和/或Rspo融合基因
另一方面，R-spondin基因融合和/或R-spondin过表达采用分析系统(Nanostring Technologies，Seattle，WA)检测或确定。该系统在国际专利申请公开WO 08/124,847和美国专利US8,415,102中描述，这两篇专利文献的全部内容通过引用并入本文，用于教导该系统。
NanoString无需扩增RNA，样本需要量低并且有效评估FFPE样本中的基因表达，例如，肿瘤FFPE样本。而且，NanoString是用于检测基因表达的复用方法并且提供直接测量mRNA而无需使用转录或扩增的方法。从福尔马林固定的肿瘤标本中提取的RNA可能质量很差并且迄今无法进行这样的分析。然而，NanoString允许对这些标本进行分析。带有500attomolar灵敏度的NanoString可使用100纳克总RNA作为输入检测到仅仅1拷贝RNA/细胞。
分析系统的基础是分配给待分析的每个核酸靶点唯一的编码。所述编码由着色的荧光点的有序数列构成，所述有序数列建立了每个待分析的靶点的唯一条码。为每个DNA或RNA靶点设计一对探针，即，带有荧光条码的生物素化的捕获探针和报告探针。在本文中，该系统也被称为纳米报告编码系统。
为每个靶点合成特定的报告探针和捕获探针。简言之，将序列特异性DNA寡核苷酸探针连接至编码特异性报告分子。优选地，每个序列特异性报告探针包括能够与不超过一个目标基因(例如，Rspo2，Rspo3或它们的融合基因对中的一个)杂交的靶点特异性序列，并且任选地包括至少两个，至少三个或至少四个标签连接区域，所述连接区域包括一个或多个发光的标签单体。捕获探针通过将每个靶点的第二序列特异性DNA寡核苷酸连接至包含生物素的通用寡核苷酸而制得。报告探针和捕获探针均汇合至单个杂交混合物“探针文库”。优选地，所述探针文库包括本文提供的每个目标基因的探针对(捕获探针和报告体)。
每个靶点的相对丰度在单个复用杂交反应中进行测量。该方法包括：使生物样本接触探针文库，所述探针文库包括目标基因的探针对，这样，样本中存在的靶点建立了探针对和靶点复合物。随后纯化所述复合物。更加具体而言，样本与探针文库结合并且在溶液中发生杂交。杂交之后，采用连接至捕获探针和报告探针上存在的通用序列的寡核苷酸补体的磁珠，以两步步骤纯化一式三份的杂交复合物(探针对和靶点)。该两步纯化处理使得杂交反应在大大过量的靶点特异性探针的驱动下完成，因为，靶点特异性探针最终被除去，所以这些探针不会干扰样本的结合和成像。所有杂交后步骤在定制的液体-处理机器人上由机器人处理(Prep Station，NanoString Technologies)。
纯化的反应通过Prep Station沉积于样本筒的各个流动池中，通过捕获探针结合至链霉亲和素(streptavidm)包被的表面，经过电泳以拉长报告探针并进行固定。处理之后，将所述样本筒转移至全自动成像和数据收集装置(Digital Analyzer，NanoStringTechnologies)。靶点的表达水平通过使每个样本进行成像并对待检测的靶点的编码的倍数进行计数。数据以列出每个样本、每个靶点的计数的简单电子数据表的形式输出。
该系统可与纳报告体一同使用。关于纳报告体的其他公开内容可在国际申请WO07/076,129和WO 07/076,132，以及美国专利公开US2010/0015607和US2010/0261026中找到，上述专利文献的全部内容通过引用并入本文。而且，术语核酸探针和纳报告体可包括国际申请WO2010/019826和美国专利公开US2010/0047924中描述的合理设计的序列(例如，合成的序列)，上述专利文献的全部内容通过引用并入本文。
nCounter系统的一个优势在于能够在单个分析中测量基因融合和基因过表达这两者。nCounter元素化学分析使复用分析能够在单个反应中检测并识别超过200个表达的基因和基因融合。已知的基因融合可采用靶向融合连接序列的特异性探针对表征。不带有已知的搭档基因的新型融合基因型可通过5’和3’外显子不平衡来识别。融合连接的5’上游外显子表达和3’下游外显子表达的比例可采用序列特异性探针进行有力地评价。因此，偏离1的5’/3’表达的比例代表了已发生融合事件。在癌干细胞中由癌干细胞的5’融合搭档基因驱动Rspo2和Rspo3表达的提高是融合事件另外的强指示剂。参见，See Lira ME，Kim TM，Huang D，Deng S，Koh Y，Jang B，Go H，Lee SH，Chung DH，Kim WH，Schoenmakers EF，ChoiYL，Park K，Ahn JS，Sun JM，Ahn MJ，Kim DW，Mao M.Multiplexed gene expression andfusion transcript analysis to detect ALK fusions in lung cancer.J Mol Diagn2013 15(1)：51-61.Lira ME，Choi YL，Lim SM，Deng S，Huang D，Ozeck M，Han J，JeongJY，Shim HS，Cho BC，Kim J，Ahn MJ，Mao M.A single-tube multiplexed assay fordetecting ALK，ROS1，and RET fusions in lung cancer.J Mol Diagn 2014 16(2)：229-243。
NanoString及其各个方面在Geiss等人，″Direct multiplexed measurement ofgene expression with color-coded probe pairs″Nature Biotechnology 26，317-325(2008)；美国专利US7,473,767，US7,941,279和US7,919,237，以及美国专利申请公开US2010/0112710中描述，上述参考文献以及专利文献的全部内容通过引用并入本文。NanoString也在Payton等人，″High throughput digital quantification of mRNAabundance in primary human acute myeloid leukemia samples″The Journal ofClinical Investigation 119(6)：1714-1726(2009)；和Vladislav等人，″Multiplexedmeasurements of gene signatures in different analytes using theNanoStringnCounter Assay System″BMC Research Notes 2：80(2009)中进行讨论，上述参考文献的全部内容通过引用并入本文。
R-Spondin的基因表达总体上与WNT通路活化相关联，并且在大多数带有未活化的WNT信号传导的分化的组织中最小化。当Rspo2和Rspo3编码基因融合至活性转录的基因的3’端时，它们的表达显著提高并且可能驱动肿瘤形成。图4显示了在肿瘤的100ng总RNA中Rspo2和Rspo3转录子的Nanostring nCounter定量。带有Rspo2和Rspo3融合基因的肿瘤中的Rspo2或Rspo3转录子是不带有融合的肿瘤中的Rspo2或Rspo3转录子的100倍。此外，当Rspo2和Rspo3融合至其搭档时，不存在5’-端外显子，这导致5’和3’外显子不平衡。因此，在与其搭档基因融合的Rspo2和Rspo3mRNA中，5’-端外显子的量显著低于3’外显子的量。
在一些实施方式中，肿瘤(或正常组织)中的Rspo2和/或Rspo3融合的过表达是不带有融合的肿瘤(或正常组织)中的Rspo2和/或Rspo3融合的过表达的1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍或更多倍。
F.筛选和治疗带有Rspo过表达和/或Rspo融合基因的受治者
另一方面，本发明提供确定患有癌症的受治者是否应当接受抑制Wnt活性的组合物(例如，Procupine拮抗剂或抑制剂)的治疗的方法，所述方法包括：(a)从所述受治者中分离生物样本；(b)在所述生物样本上进行分析以确定Rspo mRNA或多肽的表达和/或识别是否存在R-spondin融合；以及(c)如果所述生物样本包含Rspo mRNA或多肽过表达和/或R-spondin融合，那么确定受治者应当接受抑制Porcupine活性的组合物的治疗，其中，所述组合物包含本文提供的Porcupine抑制剂。
在一些实施方式中，所述方法还包括采用本文提供的组合物治疗所述受治者。
虽然已在本文中显示并描述了本发明优选的实施方式，对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅以举例说明的方式提供。在不背离本发明的条件下，本领域技术人员能够做出多种改变、变化和替换。应当理解的是，在实施本发明时可对本文描述的本发明的实施方式做出各种不同的改变。后附的权利要求意在限定本发明的范围并且后附的权利要求也限定在这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们所覆盖的等同物。
IV.用于筛选带有Rspo过表达和/或Rspo融合基因的分析方法和试剂盒
另一方面，本发明提供用于筛选Rspo2和/或Rspo3基因融合和/或过表达的受治者(例如，人类患者)的试剂盒。
本发明的分析试剂盒和方法可用于识别预计会对特定Wnt抑制剂产生响应的患者、细胞或组织。这种伴随诊断试剂盒的使用类似于政府药物登记机构批准的与批准的药物一同使用的其他伴随诊断测试。参见，例如，2011年食品药品监督管理局批准的用于治疗ALK4-突变的肺癌的克唑替尼和用于治疗BRAF突变的黑色素瘤的威罗菲尼。
本发明的分析试剂盒和方法还可用于识别可改善对Wnt抑制剂具有耐受性的癌细胞的响应性的治疗并且用于开发提高Wnt抑制剂的响应的辅助治疗。
本发明的分析试剂盒和方法对于患有可由Wnt抑制剂进行治疗的任何癌症的患者有用，所述癌症例如，胰腺癌或结肠癌，或者Wnt抑制剂可减缓其生长的任何肿瘤，例如，导管癌，腺癌或黑色素瘤。通过使用本发明的方法，在患者并不具有Rspo2或Rspo2基因融合和/或过表达的情况下，这些患者可免受无效治疗的副作用和经济成本的影响。本发明的分析试剂盒和方法对于医师而言是有用的，医师可以基于患者的肿瘤的分子特征信息向特定患者推荐进行Wnt抑制剂治疗或不向特定患者推荐进行Wnt抑制剂治疗。本发明的分析试剂盒和方法还有用地提高了对开发有效的人Rspondin分析的需求，所述人Rspodin分析方法可与尚未开发的核苷酸探针一同使用。
在一种实施方式中，本发明提供用于选择癌症患者的分析试剂盒，所述癌症患者被预计能够得益于或不能得益于Wnt抑制剂的治疗给药。所述分析试剂盒包括：
(a)用于检测肿瘤细胞样本中生物标志物水平或选自下列的生物标志物的组合的水平的方式或系统，所述生物标志物选自：(i)Rspo2和/或Rspo3基因融合；或(ii)Rspo2和/或Rspo3基因的表达水平。
(b)对照，其选自：(i)用于检测对Wnt抑制剂的灵敏性的对照样本；(ii)用于检测对Wnt抑制剂的耐受性的对照样本；(iii)包含与对Wnt抑制剂的灵敏性有关联的生物标志物的预定对照水平的信息；或(iv)包含与对Wnt抑制剂的耐受性有关联的生物标志物的预定对照水平的信息。
在一种实施方式中，所述试剂盒还可包括用于检测Rspo2基因或Rspo3基因的融合的方式系统。
在一种实施方式中，用于检测突变的方式是与Rspo2基因或Rspo33基因的一部分杂交的核苷酸探针。在特定的实施方式中，检测方式是荧光原位杂交(FISH)探针。任何检测方式可包括可检测的标签。任何检测方式可固定在底物上。
分析试剂盒还包括一个或多个对照。所述对照可包括：(i)用于检测对正在被评估用于患者的Wnt抑制剂的灵敏性的对照样本；(ii)用于检测对Wnt抑制剂的耐受性的对照样本；(iii)包含待测量的与Wnt抑制剂灵敏性或耐受性相关的特定生物标志物的预定对照水平的信息(例如，与对Wnt抑制剂灵敏性或对Wnt抑制剂的耐受性相关联的Rspo2和/或Rspo3基因融合的预定对照水平和/或过表达水平)。
试剂盒还可包括用于检测对照标志物的方式，其特征为所采样的细胞类型，其通常可以是任何类型的试剂，该试剂可在检测样本中存在已知标志物(核酸水平或蛋白质水平)的方法中使用，例如，通过检测前文所述的生物标志物的存在的方法。具体而言，所述方式的特征为其识别正在被分析的细胞类型的特异性标志物，所述标志物阳性识别所述细胞类型。例如，在肺肿瘤分析中，理想的是，筛选生物标志物表达水平或生物活性水平的肺上皮细胞。因此，用于检测对照标志物的方式识别特征为上皮细胞，优选地为肺上皮细胞的标志物，这样，所述细胞与其他细胞类型区分开，所述其他细胞类型例如结缔组织或炎症细胞。这样的方式增加了本发明的分析方法的准确性和特异性。这种用于检测对照标志物的方式包括但不限于：在严格杂交条件下与编码蛋白质标志物的核酸分子杂交的探针；扩增这种核酸分子的PCR引物；特异性结合靶分子上的构象不同的位点的适体；或选择性结合样本中的对照标志物的抗体、其抗原结合片段或抗原结合肽。许多细胞标志物的核酸和氨基酸序列是本领域已知的并且用于生成这些检测试剂。
在一些实施方式中，分析或试剂盒包括nCounter系统的探针和其他必须的试剂。Nanostring nCounter分析可在检测融合连接和评估基因表达的多种设计中进行：(1)代码集设计使用在溶液中杂交的两个约50个碱基探针/mRNA。报告探针带有信号；捕获探针允许复合物被固定，用于数据收集；(2)元素标签集GRP设计使用基于NanoString的专利技术的数字分子条码化学，其允许用户组装其自己的分析方法；以及(3)通用连接序列设计使用具有一定优势的交换技术以产生高特异性检测。
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实施例
本发明进一步通过下文的实施例来举例说明，但不限于此，下文的实施例举例说明本发明的化合物的制备。
缩写 释义或解释
DCM 二氯甲烷
DIEA N，N’-二异丙基乙胺
DMF N，N-二甲基甲酰胺
eq. 当量
TEA 三乙胺
THF 四氢呋喃
RT 室温
EA 乙酸乙酯
Pd2(dba)3 三(二亚苄基丙酮)二钯(0)
s-Phos 2-双环己基膦-2′，6′-二甲氧基联苯
Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)钯
实施例1
合成N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺(化 合物1)
步骤1
将2-氰基乙酰胺(50g，601.8mmol)和乙酰乙酸乙酯(75mL，601.8mmol)溶解于MeOH中。将KOH(37.0g，1.1eq)溶解于MeOH中并滴加至混合物中，析出一些白色固体。在油浴中加热混合物至回流持续8小时，随后将其冷却至室温。过滤固体并随后再次溶解于热水中，然后再次过滤。将6N HCl加至滤液中以中和至pH＜7。再次产生白色固体并进行过滤。用MeOH，水和MeOH进一步洗涤固体，随后真空干燥，得到最终产物3-乙炔基-4-甲基吡啶-2，6-二醇(产率约41％)。
步骤2：
将3-乙炔基-4-甲基吡啶-2，6-二醇(28.0g，195.2mmol)溶解于POCl3(60.0mL)中。将反应混合物密封在压力管中并加热至180℃持续6小时。将反应冷却至室温之后，在真空条件下除去过量的POCl3。向混合物中缓慢加入碎冰，析出固体。过滤固体并在真空下干燥，得到最终产物2，6-d二氯-4-甲基吡啶-3-甲腈(产率约92％)无需进一步纯化。
步骤3：
将200mL 2，6-二氯-4-甲基吡啶-3-甲腈(20.0g，107.5mmol)的异丙醇溶液加至N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛中(12.82g，107.5mmol)并在65℃下搅拌反应持续18小时。将反应冷却至室温之后，通过过滤收集沉淀并用50mL异丙醇洗涤，风干，得到产物2，6-二氯-4-((E)-2-(二甲基氨基)乙烯基)吡啶-3-甲腈(产率约26％)无需进一步纯化。
步骤4：
在密封管中，向2，6-二氯-4-((E)-2-(二甲基氨基)乙烯基)吡啶-3-甲腈(4.0g，16.6mmol)中加入20mL浓盐酸。在45℃条件下搅拌反应持续18小时。将反应冷却至室温之后，将冰水加至溶液中，得到深黄色浆状物。通过过滤收集沉淀，用冰水，乙醚和乙酸乙酯洗涤沉淀，并在真空下干燥，得到浅黄色固体6，8-二氯-2，7-萘啶-1(2H)-酮(产率约80％).MSm/z 215.0(M+1).1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ11.75(s，1H)，7.76(s，1H)，7.50(t，J＝6.6Hz，1H)，6.52(d，J＝6.6Hz，1H).
步骤5：
将6，8-二氯-2，7-萘啶-1(2H)-酮(3.0g，13.96mmol)溶解于iPrOH(120mL)中以形成一种悬浮液。在冰浴中将溶液冷却至0℃，随后滴加肼溶液(5.6g，80％，10eq)。在室温下搅拌混合物持续15分钟，随后在油浴中，在55℃下加热混合物过夜。在将反应混合物冷却至室温之后，对反应混合物进行过滤，直接得到固体，随后用70mL MeOH洗涤所述固体并进行真空干燥。产物6-氯-8-肼基-2，7-萘啶-1(2H)-酮(产率约98％)直接用于下一步骤无需进一步纯化。
步骤6：
将6-氯-8-肼基-2，7-萘啶-1(2H)-酮(1.50g，7.12mmol)溶解于MeCN(90mL)中以形成一种悬浮液。向混合物中加入1N NaOH(17.80mL，2.5eq)并随后加入等量水(107.80mL)。在50℃下加热反应混合物，进行搅拌直至出现澄清溶液。将溶液再次冷却至0℃，并向其中滴加NaOCl(11.05g，12％solution，2.5eq)，随后在室温下搅拌反应过夜。反应完成之后，将溶液冷却至0℃并随后加入1N HCl进行中和(pH约为6)。收集沉淀并用100mL x 2 EA对滤液进行萃取。合并有机层并通过Na2SO4进行干燥、蒸发，得到额外的粗产物。合并的固体物质6-氯-2，7-萘啶-1(2H)-酮(产率约93％)用于下一反应无需进一步纯化。MS m/z 181.1(M+1).
步骤7：
在压力管中，将6-氯-2，7-萘啶-1(2H)-酮(400mg，2.2mmol)加至POCl3(20.0mL)中。将反应混合物加热至160℃持续4小时，得到透明溶液。将溶液冷却至室温并倒入DCM中，缓慢加入碎冰。将饱和NaHCO3加至混合物中以中和反应中产生的HCl。真空除去DCM并用100mL x 2 EA对剩下的水溶液进行萃取。采用盐水洗涤合并的有机层一次，并通过Na2SO4进行干燥，随后在真空下进行蒸发，得到固体1，6-二氯-2，7-萘啶(产率约73％)，其用于下一步反应无需进一步纯化。MS m/z 199.0(M+1).
步骤8：
将(4-溴苯基)甲胺(1.00g，5.37mmol)和2-甲基吡啶-4-基-4-硼酸(883.30mg，6.45mmol)溶解于BuOH(10.0mL)和水(2.0mL)中。在N2条件下添加K3PO4(2.28g，10.75mmol)，Pd2(dba)3(120.20mg，0.27mmol)和S-phos(220.70mg，0.54mmol)。将反应混合物密封在压力管中并加热至125℃持续1小时。在将反应冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用100mL x3 EA进行萃取。用盐水洗涤合并的有机层，通过Na2SO4进行干燥并在真空下浓缩，得到粗产物。采用10％MeOH(含有约2N NH3)的DCM通过硅胶柱纯化固体，得到纯的(4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基)甲胺(产率约89％)。MS m/z 199.1(M+1).
步骤9：
将1，6-二氯-2，7-萘啶(160mg，0.80mmol)和(4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基)甲胺(239.10mg，1.21mmol)溶解于BuOH(5.0mL)中并加热至115℃过夜。在将反应冷却至室温之后，在真空下除去有机溶剂。粗产物采用EA/己烷(1∶1)通过硅胶快速层析进行纯化，得到固体N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-氯-2，7-萘啶-1-胺(产率约90％)。MS m/z 361.1(M+1).
步骤10：
将N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-氯-2，7-萘啶-1-胺(50.00mg，0.14mmol)和2-甲基吡啶-4-基-4-硼酸(56.90mg，0.42mmol)溶解于BuOH(3.0mL)和水(0.6mL)中。在N2条件下，向混合物中添加K3PO4(88.20mg，0.028mmol)，Pd2(dba)3(6.20mg，0.014mmol)和S-phos(11.40mg，0.011mmol)。将反应密封在压力管中并加热至105℃过夜。在将反应冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用EA萃取三次。采用盐水洗涤合并的有机层，通过Na2SO4进行干燥，并在真空下浓缩。粗产物进一步通过制备型-TLC采用含有5％MeOH的DCM进行纯化，得到最终产物N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺(产率约70％)。MS m/z 418.2(M+1).1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.46(s，3H)，2.63(s，3H)，4.94(d，J＝5.10Hz，2H)，5.94(br，1H)，6.97(d，J＝5.70Hz，1H)，7.31(d，J＝4.20Hz，1H)，7.36(s，1H)，7.54(d，J＝8.10Hz，2H)，7.63(d，J＝8.40Hz，2H)，7.90(s，1H)，8.19(d，J＝6.00Hz，1H)，8.22(s，1H)，8.51(m，2H)，9.08(s，1H)，9.30(s，1H).
实施例2
合成N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶- 1-胺(化合物2）
步骤1：
将6-氯-2，7-萘啶-1(2H)-酮(200mg，1.10mmol)和2-甲基吡啶-4-基-4-硼酸(227.60mg，1.66mmol)溶解于BuOH(5.0mL)和水(1.0mL)中。在N2条件下添加K3PO4(705.20g，3.32mmol)，Pd2(dba)3(49.60mg，0.22mmol)和S-phos(91.00mg，0.11mmol)。将压力管中的反应混合物加热至130℃持续1小时。在将反应混合物冷却至室温之后，将其倒入水中，用EA萃取三次。采用盐水洗涤合并的有机层，通过Na2SO4进行干燥，在真空下浓缩，得到粗产物。该粗产物采用含有5％MeOH的DCM通过柱子进行纯化，得到最终化合物6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1(2H)-酮(产率约61％).MS m/z 238.1(M+1).
步骤2：
将6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1(2H)-酮(150mg，0.63mmol)溶解于POCl3(15.0mL)中，密封压力管并将其加热至160℃持续4小时。在将反应冷却至室温之后，在真空下除去过量的POCl3。将碎冰缓慢加至混合物中，随后加入NaHCO3以中和至pH～7.5。采用EA萃取溶液三次，合并的有机层用盐水洗涤，通过Na2SO4进行干燥并在真空下浓缩。粗产物采用EA/己烷(1∶1)通过柱子进行纯化，得到化合物1-氯-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶(产率约55％)。MS m/z256.1(M+1).
步骤3：
将1-氯-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶(10.00mg，0.039mmol)和(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基)甲胺(10.00mg，0.047mmol)溶解于甲苯(1.0mL)中。在N2条件下向混合物中添加KOtBu(8.80mg，0.078mmol)，Pd(OAc)2(0.90mg，0.0039mmol)和BINAP(4.90mg，0.0078mmol)。将反应加热至100℃过夜。在反应冷却至室温之后，将混合物倒入水中，采用EA萃取三次。合并的有机层用盐水洗涤，通过Na2SO4进行干燥，随后在真空下浓缩。粗产物采用EA/己烷(4∶1)通过制备型-TLC纯化，得到N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺(8.8mg，产率约52％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ2.31(s，3H)，2.63(s，3H)，2.70(s，3H)，4.91(d，J＝5.10Hz，2H)，5.88(br，1H)，7.00(d，J＝5.40Hz，1H)，7.08(d，J＝5.10Hz，1H)，7.12(s，1H)，7.22(d，J＝7.50Hz，1H)，7.36(m，2H)，7.77(d，J＝4.50Hz，1H)，7.88(s，1H)，7.98(s，1H)，8.24(d，J＝6.00Hz，1H)，8.53(d，J＝4.80Hz，1H)，8.64(d，J＝5.40Hz，1H)，9.31(s，1H).MS m/z432.2(M+1).
实施例3
合成6-（3-氟苯基）-N-（（6-（2-甲基吡啶-4-基）吡啶-3-基）甲基）异喹啉-1-胺(化 合物3)
步骤1：
将6-溴代异喹啉(1.80g，8.66mmol)溶解于DCM(40mL)，在将反应冷却至0℃之后，缓慢加入小部分m-CPBA(2.30g，1.3eq，77％最大)。反应升温至室温变为一种白色悬浮液。在4小时内，将100mL DCM加至溶液中，用饱和Na2CO3溶液、水和盐水洗涤溶液。分离的有机层通过Na2SO4干燥并在真空下除去有机溶剂，得到黄色固体N-氧化物6-溴代异喹啉，无需进一步纯化(1.82g，产率约93％)。
步骤2：
将N-氧化物6-溴代异喹啉(1.82g，8.12mmol)溶解于干燥的DCM(80mL)中，在室温下滴加POCl3(1.12ml，1.5eq)。将反应加热至45℃持续2小时。在将反应冷却至室温之后，在真空下除去DCM和过量的POCl3。粗产物再次溶解于100mL DCM中并采用饱和Na2CO3、水和盐水洗涤。分离的有机层通过Na2SO4干燥并进行浓缩，得到淡黄色固体。粗产物采用含有2％MeOH的DCM通过快速柱子进行纯化，得到浅黄色固体6-溴代-1-氯异喹啉(1.27g，产率约65％)。MS m/z 242.0(M+1).
步骤3：
将(6-氯吡啶-3-基)甲胺(300mg，2.1mmol)和2-甲基吡啶-4-基硼酸(345mg，2.52mmol)溶解于具有正丁醇(10mL)和水(2mL)的压力管中。在氮气保护条件下，加入K3PO4(893mg，4.2mmol)，Pd2(dba)3(96.3mg，0.105mmol)，和S-phos(86.4mg，0.21mmol)。将反应加热至125℃持续30分钟，随后冷却至室温。将溶液倒入水中并用EA萃取三次。合并的有机层采用盐水洗涤并通过Na2SO4干燥，在真空下浓缩。粗产物进一步采用10％MeOH(含有约2NNH3)的DCM通过快速层析进行纯化，得到纯的(6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基)甲胺(0.19g，产率约45％)。MS m/z 200.1(M+1).
步骤4：
将6-溴代-1-氯异喹啉(100mg，0.41mmol)和(6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基)甲胺(165mg，0.82mmol)溶解于密封管中的0.5mL正丁醇中。将反应加热至160℃持续6小时并冷却至室温。粗产物采用8％MeOH(含有约2N NH3)的DCM通过快速柱层析进行纯化，得到纯的6-溴代-N-((6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基)甲基)异喹啉-1-胺(116mg，约70％)。MSm/z 405.2(M+1).
步骤5：
将6-溴-N-((6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基)甲基)异喹啉-1-胺(20mg，0.05mmol)，3-氟苯基硼酸(10.5mg，0.075mmol)，Na2CO3(21mg，0.2mmol)和四(三苯基膦)钯(5.8mg，0.005mmol)加至压力管中。将二氧六环/水(3∶1，2mL)加至管中并加热至125℃持续10分钟。在将反应冷却至室温之后，用50mL水稀释溶液并用EA萃取三次。通过Na2SO4干燥合并的有机层并在真空下浓缩。粗产物进一步采用10％MeOH(含有约2N NH3)的DCM通过快速柱层析进行纯化，得到纯的6-(3-氟苯基)-N-((6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基)甲基)异喹啉-1-胺(15.8mg，约75％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ2.71(s，3H)，5.00(d，J＝5.6Hz，2H)，7.32-7.38(m，2H)，7.59-7.65(m，1H)，7.75-7.83(m，3H)，8.10(d，J＝8.4Hz，1H)，8.21(d，J＝8.8Hz，1H)，8.27-8.31(m，2H)，8.39(s，2H)，8.72(d，J＝8.8Hz，1H)，8.79(d，J＝6.0Hz，1H)，8.91(d，J＝1.6Hz，1H)，10.02(s，1H).MS m/z 421.2(M+1).
实施例4
合成N-(4-（2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基）-1，6-萘啶-5-胺(化 合物4)
步骤1：
将1，6-萘啶-5(6H)-酮(2.9g，19.84mmol)溶解于POCl3(40mL)中并加热至100℃持续24小时。在将反应冷却至室温之后，在真空下除去过量POCl3。缓慢加入带有少量碎冰的饱和Na2CO3溶液，产生大量气泡和固体。过滤固体，并用EA萃取溶液3次。通过Na2SO4干燥合并的有机层并在真空下浓缩。合并的固体进一步在真空下干燥，得到5-氯-1，6-萘啶，无需进一步纯化(2.6g，产率约80％)。MS m/z 165.1(M+1).
步骤2：
将5-氯-1，6-萘啶(1.5g，9.11mmol)溶解于DCM(45mL)中并在冰浴中冷却，缓慢加入少量m-CPBA(3.7g，2eq，77％最大)。将反应升温至室温并持续3小时。向溶液中加入多于100mL的DCM，并用饱和Na2CO3溶液、水和盐水洗涤该溶液。有机层通过Na2SO4干燥并在真空下浓缩，得到黄色固体N-氧化物5-氯-1，6-萘啶，无需进一步纯化(1.25g，产率约76％)。
步骤3：
将N-氧化物5-氯-1，6-萘啶(1.2g，6.64mmol)溶解于干燥的DCM(30mL)中，加入Et3N(1.85mL，13.29mmol)，随后滴加溶解于5mL干燥DCM中的POCl3(0.93mL，9.97mmol)。将反应加热至48℃持续2小时。将多于100mL的DCM加至溶液中，并用饱和Na2CO3溶液、水和盐水洗涤该溶液。通过Na2SO4干燥有机层，并在真空下浓缩，得到黄色固体。粗产物进一步采用EA/己烷(1∶4)通过硅胶柱进行纯化，得到白色固体2，5-二氯-1，6-萘啶(0.6g，产率约45％)。MSm/z 199.0(M+1)。
步骤4：
将2，5-二氯-1，6-萘啶(200mg，1.0mmol)，2-甲基吡啶-4-基-4-硼酸(137mg，1.0mmol)，Na2CO3(424mg，4.0mmol)和四(三苯基膦)钯(116mg，0.1mmol)加至烧瓶中，再添加16mL二氧六环和4mL水。均匀搅拌反应并将其加热至90℃持续4小时。在将反应冷却至室温之后，用100mL水稀释溶液并用EA萃取三次。合并的有机层通过Na2SO4干燥并在真空下浓缩。粗产物进一步采用EA/己烷(1∶1)通过快速柱层析进行纯化，得到固体5-氯-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶(143mg，产率约56％)。MS m/z 256.1(M+1)。
步骤5：
将5-氯-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶(20.00mg，0.078mmol)和(4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基)甲胺(25mg，0.118mmol)溶解于甲苯(2.0mL)中。在N2条件下向混合物中添加KOtBu(13.2mg，0.118mmol)，Pd(OAc)2(2.7mg，0.012mmol)和BINAP(15.0mg，0.024mmol)。将反应加热至100℃过夜。在反应冷却至室温之后，将混合物倒入水中，用EA萃取三次。合并的有机层用盐水洗涤，通过Na2SO4干燥，随后在真空下浓缩。粗产物采用8％MeOH的DCM通过制备型-TLC进行纯化，得到N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺(31mg，产率约61％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.12(d，J＝8.8Hz，1H)，8.77-8.83(m，2H)，8.49(d，J＝8.4Hz，1H)，8.40(s，1H)，8.31(d，J＝6.4Hz，1H)，8.21(s，1H)，8.11(d，J＝5.6Hz，1H)，8.06(d，J＝6.4Hz，1H)，7.99(d，J＝8.4Hz，2H)，7.65(d，J＝8.4Hz，2H)，7.23(d，J＝6.4Hz，1H)，5.76(s，1H)，4.93(d，J＝5.6Hz，2H)，2.72(s，6H).MS m/z 432.2(M+1).
实施例5
合成N-(4-(2-甲基吡啶-4基)苄基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺(化合物5)
步骤1：
向20mL乙醇中加入苯基乙二醛一水合物(940mg，6.99mmol)和2-氯-3，4-二氨基吡啶(1000mg，6.99mmol)。将混合物回流过夜。在冷却反应之后，过滤粗沉淀产物并用15mL乙醇洗涤，真空下干燥，得到5-氯-2-苯基吡啶并[3，4-b]吡嗪，无需进一步纯化(1.28g，产率约76％)。MS m/z 241.0(M+1)；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.82(s，1H)，8.64(d，J＝6.0Hz，1H)，8.38-8.43(m，2H)，8.07(d，J＝6.0Hz，1H)，7.64-7.68(m，3H).
步骤2：
将N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[3，4-b]吡嗪-5-胺(50mg，0.21mmol)和(4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基)甲胺(42mg，0.21mmol)溶解于甲苯(4.0mL)中。在N2条件下向混合物中添加KOtBu(24mg，0.21mmol)，Pd(OAc)2(4.5mg，0.021mmol)和BINAP(26.4mg，0.042mmol)。将反应加热至100℃过夜。在将反应冷却至室温之后，将混合物倒入水中，用EA萃取三次。合并的有机层用盐水洗涤，通过Na2SO4干燥，随后在真空下浓缩。粗产物采用7％MeOH的DCM通过快速柱层析进行纯化，得到N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺(61mg，产率约72％)。MS m/z＝404.2(M+1)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.53(s，1H)，8.77(d，J＝6.4Hz，1H)，8.35-8.39(m，2H)，8.21(s，1H)，8.11(d，J＝6.0Hz，1H)，8.07(d，J＝6.4Hz，1H)，7.96(d，J＝8.4Hz，2H)，7.60-7.65(m，5H)，7.14(d，J＝6.0Hz，1H)，5.76(s，1H)，4.90(d，J＝6.4Hz，2H)，2.71(s，3H).
实施例6
RNA提取和SYBR Green实时RT-PCR
根据厂商的说明，采用RNAeasy提取试剂盒(QIAGEN)，从冷冻的肿瘤组织中分离总RNA，并将其可逆转录至第一链cDNA。Rspo2的正向引物为5’-AGAGGCCGTTGCTTTGATGA-3’(SEQ ID NO.：1)，反向引物为5’-TCCCCATTCGCTCCAATGAC-3’(SEQ ID NO.：2)。GAPDH的正向引物为5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’(SEQ ID NO.：3)，反向引物为5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO.：4)。1∶200稀释的cDNA模板用于GAPDH扩增。Rspo2，Rspo3和GAPDH的PCR扩增曲线为94℃一个10分钟的循环，随后进行由94℃下15秒和60℃下1分钟构成的两个步骤的四十个循环。在每个循环结束时测量产物的荧光强度并进行PCR后的熔融曲线分析以检测引物-二聚物或其他非特异性产物并确认靶点的特异性。使用Applied Biosystems 7500实时PCR仪器(Life Technologies，Foster City，CA)进行扩增、数据获取和分析。具有特异性引物的每个样本的一式三份复制在96孔板上进行，并且96孔板上还具有阳性对照和阴性对照。阳性对照和阴性对照是来自肿瘤组织的总RNA，其中，Rspo2和Rspo3的表达先前进行了表征。通过ΔCt确定Rspo2和Rspo3的相对关系，其中，ΔCt＝Ct(Rspo2或Rspo3)-Ct(GAPDH)。
5’RACE，克隆和测序
根据厂商的说明，使用RACE 5’/3’试剂盒(Clontech Laboratories，Mountain View，CA)，将总RNA用于扩增人Rspo2或Rspo3mRNA的5’端。
Rspo2外显子2基因特异性引物：5′-GATTACGCCAAGCTTCGTCTCCATCGGTTGCCTTGGCAGTGGC-3′(SEQ ID NO.：5)，外显子3基因特异性引物：5′-GATTACGCCAAGCTTGCAGGCACTCTCCATACTGGCGCATCCC-3′(SEQ ID NO.：6)，外显子3嵌套的引物：5′-GATTACGCCAAGCTTGGGCTCGGTGTCCATAGTACCCGGATGGG-3′(SEQ ID NO.：7)。Rspo 3外显子3基因特异性引物：5’-GATTACGCCAAGCTTGGTTGTTGGCTTCCAACCCTTCTGGGC-3’(SEQ ID NO.：8)，外显子3嵌套的基因特异性引物：5’-GATTACGCCAAGCTTGGACCCGTGTTTCAGTCCCTCTTTTGAAGCC-3’(SEQ ID NO.：9)。使用RACE 5’/3’试剂盒(Clontech Laboratories，Mountain View，CA)将15nt in-fusion克隆引物(下划线部分)包括在RACE产物克隆的5’端。
5’RACE产物被克隆至In-Fusion载体中。通过M13引物对10个克隆的插入进行排序并通过NCBI核苷酸BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行分析。
Nanostring nCounter元素化学技术
根据厂商的规程(NanoString，Seattle，WA)采用定制设计的元素化学探针进行nCounter分析。简言之，在67℃下，将150ng总RNA杂交至nCounter探针集持续17.75小时并降温至4℃持续约3小时。使用自动nCounter样本制备工作站(NanoString Technologies，Inc.，Seattle，WA)处理样本。包含固定化的且对齐的报告复合物的药筒随后在nCounter数字分析仪(NanoString Technologies，Inc.)上成像。使用NanoString nSolver分析软件2.0采集报告计数，采用阳性对照和管家基因归一化并分析报告计数。
表2：Nanostring元素化学探针A(捕获探针)
表3：Nanostring元素化学探针B设计(报告探针)
通过Rspo2和Rspo3的5’融合基因使Rspo2和Rspo3的表达提高
在约5％和8％的肿瘤样本(n＝192)中Rspo2和Rspo3转录子的量增加。5’RACE和DNA测序表明Rspo2和Rspo3的5’融合基因的表达驱动Rspo2和Rspo3转录子的上调。
表4：实时RT-PCR定量Rspo2基因的表达
样本 GAPDH RSPO2 ΔCT
GAPF108 23.2 38.4 15.3
ESPF001 21.9 36.5 14.5
LUPF016 25.6 40.0 14.4
LIPF236 22.8 26.3 3.6
PAPF179 23.2 26.8 3.5
LIPF088 21.5 25.0 3.5
PAPF004 21.2 23.7 2.4
PAPF310 21.9 24.2 2.2
ESPF014 22.2 23.4 1.2
PAPF199 24.2 25.4 1.1
PAPF029 22.5 22.6 0.1
PAPF157 26.8 26.9 0.1
GAPF3055 23.7 23.5 -0.2
GAPF67 22.4 19.7 -2.7
CRPF3056 23.4 19.7 -3.7
CRPF2506 27.6 23.6 -4.0
GLPF0440 26.6 21.2 -5.4
识别新型Rspo2和Rspo3转录子
已识别了各种不同的新型Rspo2和Rspo3基因融合转录子。
表5：新型Rspo2和Rspo3融合基因
通过Nanostring nCounter分析表征融合基因
带有Rspo2或Rspo3融合基因的肿瘤组织用于验证Nanostring nCounter基因分型分析(图3，表7)。融合连接探针被特异性地设计为靶向由5’RACE和测序表征的融合基因分型。对已知的或新型Rspo2/Rspo3融合基因型的决策步骤在图1和图2中举例说明。
Rspo2的表达通过靶向外显子2，外显子5和外显子6的探针进行评估。起始密码子ATG位于外显子2上，通过融合基因产生全长Rspo2蛋白。在任何Rspo2融合基因型中均未观察到Rspo2外显子1，但发现Rspo2外显子1仅出现在野生型Rspo2转录子中。
Rspo3的表达通过靶向外显子3/4和外显子5的探针进行评估。开放阅读框Rspo3依赖于其5’融合基因的框内序列。
通过Nanostring nCounter基因分型分析，采用表征的新型Rspo2融合基因型和Rspo3融合基因型的融合连接准确识别了带有表征的新型Rspo2融合基因型的五个肿瘤组织以及带有Rspo3融合基因分型的一个样本。对应地，在这些样本中观察到了Rspo2或Rspo3表达。在外显子1、外显子2、外显子5和外显子6探针中发现L440的Rspo2信号提高。5’RACE和测序识别出L440明显带有完全Rspo2 mRNA并且其表达不由融合基因驱动。
表6：Rspo2和Rspo3融合基因分型的探针设计
实施例7
Rspo2/3融合模型的PDx效率研究
在小鼠异种移植物模型中，在带有Rspo2或Rspo3融合基因的结肠直肠肿瘤和胃肿瘤中检验CGX1321的抗肿瘤活性。在8-10周龄的BALB/c裸鼠的右侧皮下植入2x2x2mm的肿瘤碎片，用于肿瘤发展。不干扰肿瘤的发展直至肿瘤的平均体积达到约100-150mm3。随后将小鼠随机分为对照组和治疗组。以预定方案将CGX1321口服给药于带有肿瘤的小鼠持续21天至28天。使用卡尺每周测量肿瘤两次，肿瘤体积(mm3)使用如下公式计算：TV＝a x b2/2，其中，a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。在测量肿瘤的同时评估体重。

Claims (42)

1.用于治疗已被诊断为患有癌症且需要这种治疗的受治者体内特征为R-spondin融合的表达的癌症的方法，所述方法包括：
将包含治疗有效量的Porcupine拮抗剂的药物组合物给药于诊断为患有癌症的受治者，
其中，所述受治者已被确定具有R-spondin融合。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述R-spondin融合包括：
(1)PTPRKe1-Rspo3e2融合；
(2)PTPRKe7-Rspo3e2融合；
(3)EIF3Ee1-Rspo2e2融合；或
(4)EIF3Ee1-Rspo2e3融合。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述R-spondin融合包括：
(1)EMC2e1-Rspo2e2融合；
(2)PVT1-Rspo2e2融合；
(3)PVT1-Rspo2e3融合；
(4)HNF4G-Rspo2e2融合；
(5)PTPRKe13-Rspo3e2融合；或
(6)PTPRKe6X-Rspo3e2融合。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述受治者被确定为具有比对照受治者的R-spondin mRNA表达水平高的R-spondin mRNA表达水平，所述对照受治者已被确定为不具有R-spondin融合。
5.如权利要求2所述的方法，其中，所述Rspondin融合包括SEQ ID NO.：58，SEQ ID.：59，SEQ ID NO.：62，或SEQ ID NO.：63中任一个序列的连接序列。
6.如权利要求3所述的方法，其中，所述EMC2e1-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：64的连接序列。
7.如权利要求3所述的方法，其中，所述PVT1-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：65的连接序列。
8.如权利要求3所述的方法，其中，所述PVT1-Rspo2e3融合包括SEQ ID NO.：66的连接序列。
9.如权利要求3所述的方法，其中，所述HNF4G-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：67的连接序列。
10.如权利要求3所述的方法，其中，所述PTPRKe13-Rspo3e2融合包括SEQ ID NO.：61的连接序列。
11.如权利要求3所述方法，其中，所述PTPRKe6X-Rspo3e2融合包括SEQ ID NO.：60的连接序列。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述Rspondin是Rspo2或Rsp3，并且所述融合基因相对于没有融合至另一基因的Rspondin过表达。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述Porcupine拮抗剂包括通式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8独立地为CR4或N；
Y1是氢或CR4；
Y2，Y3独立地为氢、卤素或CR3；
R1是吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R2是氢，卤素，吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R3是氢，卤素，氰基，C1-6烷基，被卤素、氨基、羟基、烷氧基或氰基任选地取代的C1-6烷氧基；
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述5元或6元杂芳基选自下列基团：
其中，
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；以及
R8是氢或C1-6烷基。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中，R1和R2独立地被1个或2个R4基团取代。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述化合物选自下列化合物或其生理学上可接受的盐：
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(嘧啶-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
3-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
6-(4-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-m-甲苯基-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((5-苯基吡啶-2-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(哒嗪-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-吗啉基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-((4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)氨基)-2，7-萘啶-3-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶e-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(4-氯苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-甲基苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-苄基-2-(3-氟苯基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((6-(3-氟苯基)吡啶-3-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2-氟联苯基-4-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)异喹啉-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡啶-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(3-氟苯基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(S)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(R)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
1-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙酮；
6-(1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(1H-四唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基-1，3，4-恶二唑-2-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(噻唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(恶唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-氟吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-羧酸甲酯；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-2-酮；
2-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙腈；
2-甲基-4-(4-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯基)吡啶1-氧化物；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯甲腈；
N-(3-甲氧基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氯-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
2′-甲基-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)-2，4′-联吡啶-3-腈；以及
N-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺。
17.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述Porcupine拮抗剂包括通式(II)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3和X4选自：N和CR7；
X5，X6，X7和X8中的一个为N并且另一个为CH；
X9选自：N和CH；
Z选自：苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基；
其中，Z中的每个苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基被R6基团任选地取代；
R1，R2和R3是氢；
m是1；
R4选自：氢，卤素，二氟甲基，三氟甲基和甲基；
R6选自：氢，卤素和-C(O)R10，其中，R10是甲基；并且
R7选自：氢，卤素，氰基，甲基和三氟甲基。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述化合物选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基)吡啶-3-基]乙酰胺；
2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺(LGK974)；
N-(2，3′-联吡啶-6′-基)-2-(2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-甲基-3-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；以及
2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述化合物是2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，所述化合物的治疗有效量为每日剂量约0.01mg/kg体重至20mg/kg体重。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述化合物的治疗有效量对于人类而言为约0.5mg至约1000mg。
22.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，所述癌症是结肠直肠癌，胃癌，肝癌，食道癌，肠癌，胆道癌，胰腺癌，子宫内膜癌，或前列腺癌。
23.用于确定患有癌症的受治者是否应当接受抑制Wnt活性的组合物的治疗的方法，所述方法包括：
(a)从所述受治者中分离生物样本；
(b)对所述生物样本进行分析以识别是否存在R-spondin融合；以及
(c)如果所述生物样本包含R-spondin融合，那么确定所述受治者应当接受包含治疗有效量的Porcupine拮抗剂的组合物的治疗。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述R-spondin融合包括：
(1)PTPRKe1-Rspo3e2融合；
(2)PTPRKe7-Rspo3e2融合；
(3)EIF3Ee1-Rspo2e2融合；或
(4)EIF3Ee1-Rspo2e3融合。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述R-spondin融合包括：
(1)EMC2e1-Rspo2e2融合；
(2)PVT1-Rspo2e2融合；
(3)PVT1-Rspo2e3融合；
(4)HNF4G-Rspo2e2融合；
(5)PTPRKe13-Rspo3e2融合；或
(6)PTPRKe6X-Rspo3e2融合。
26.如权利要求23至25中任一项所述的方法，其中，所述受治者被确定具有比对照受治者的R-spondin mRNA表达水平高的R-spondin mRNA表达水平，所述对照受治者已被确定不具有R-spondin融合。
27.如权利要求24所述的方法，其中，所述R-spondin融合包括SEQ ID NO.：58，SEQID.：59，SEQ ID NO.：62，或SEQ ID NO.：63中任一个序列的连接序列。
28.如权利要求25所述的方法，其中，所述EMC2e1-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：64的连接序列。
29.如权利要求25所述的方法，其中，所述PVT1-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：65的连接序列。
30.如权利要求25所述的方法，其中，所述PVT1-Rspo2e3融合包括SEQ ID NO.：66的连接序列。
31.如权利要求25所述的方法，其中，所述HNF4G-Rspo2e2融合包括SEQ ID NO.：67的连接序列。
32.如权利要求25所述的方法，其中，所述PTPRKe13-Rspo3e2融合包括SEQ ID NO.：61的连接序列。
33.如权利要求25所述方法，其中，所述PTPRKe6X-Rspo3e2融合包括SEQ ID NO.：60的连接序列。
34.如权利要求23至33中任一项所述的方法，其中，所述R-spondin是Rspo2或Rspo3，并且所述融合基因相对于没有融合至另一基因的R-spondin过表达。
35.如权利要求23至34中任一项所述的方法，其中，所述Porcupine拮抗剂包括通式(I)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8独立地为CR4或N；
Y1是氢或CR4；
Y2，Y3独立地为氢、卤素或CR3；
R1是吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R2是氢，卤素，吗啉基，哌嗪基，喹啉基，芳基，C1-6杂环，包含1至2个选自N、O和S的杂原子的5元或6元杂芳基；
R3是氢，卤素，氰基，C1-6烷基，被卤素、氨基、羟基、烷氧基或氰基任选地取代的C1-6烷氧基；
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述5元或6元杂芳基选自下列基团：
其中，
R4是氢，卤素，C1-6烷氧基，-S(O)2R5，-C(O)OR5，-C(O)R5，-C(O)NR6R7，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；
R5，R6和R7独立地为氢，C1-6烷基，C2-6烯基或C2-6炔基，它们中的每一个可被卤素，氨基，羟基，烷氧基或氰基任选地取代；以及
R8是氢或C1-6烷基。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中，R1和R2独立地被1个或2个R4基团取代。
38.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中，所述化合物选自下列化合物：
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(嘧啶-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
3-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)苯甲腈；
6-(4-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-m-甲苯基-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((5-苯基吡啶-2-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-((2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(哒嗪-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-吗啉基-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-((4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)氨基)-2，7-萘啶-3-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(3-氟-4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′-氟-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(5-(((6-(3-氟苯基)-2，7-萘啶-1-基)氨基)甲基)吡啶e-2-基)硫代吗啉1，1-二氧化物；
N-(4-氯苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-甲基苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(吡啶-3-基甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-苄基-2-(3-氟苯基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((6-(3-氟苯基)吡啶-3-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(4-(2-氟吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)-1，6-萘啶-5-胺；
N-(联苯基-4-基甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2-氟联苯基-4-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(3-氯苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-苯基异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-4-基)异喹啉-1-胺；
6-(6-甲基吡啶-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
6-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(哒嗪-4-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡啶-2-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(3-氟苯基)异喹啉-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)异喹啉-1-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-苯基吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(3-氟苯基)-N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(3-氟苯基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶并[4，3-b]吡嗪-5-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(S)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
(R)-6-(2-甲基吗啉基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
1-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙酮；
6-(1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(1H-四唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(5-甲基-1，3，4-恶二唑-2-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(噻唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(恶唑-5-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-甲基吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氟-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(5-氟吡啶-3-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-甲基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-(3-氟-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(吡嗪-2-基)-2，7-萘啶-1-胺；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-羧酸甲酯；
4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-2-酮；
2-(4-(8-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基氨基)-2，7-萘啶-3-基)哌嗪-1-基)乙腈；
2-甲基-4-(4-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯基)吡啶1-氧化物；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-((2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-2，7-萘啶-1-胺；
6-(2-氯吡啶-4-基)-N-(4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-2，7-萘啶-1-胺；
2-(2-甲基吡啶-4-基)-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)苯甲腈；
N-(3-甲氧基-4-(2-甲基吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
N-((3-氯-2′-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)甲基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺；
2′-甲基-5-((6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-基氨基)甲基)-2，4′-联吡啶-3-腈；以及
N-(4-(2-(二氟甲基)吡啶-4-基)苄基)-6-(2-甲基吡啶-4-基)-2，7-萘啶-1-胺。
39.如权利要求24至34中任一项所述的方法，其中，所述Porcupine拮抗剂包括通式(II)的化合物或其生理学上可接受的盐：
其中：
X1，X2，X3和X4选自：N和CR7；
X5，X6，X7和X8中的一个为N并且另一个为CH；
X9选自：N和CH；
Z选自：苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基；
其中，Z中的每个苯基，吡嗪基，吡啶基，哒嗪基和哌嗪基被R6基团任选地取代；
R1，R2和R3是氢；
m是1；
R4选自：氢，卤素，二氟甲基，三氟甲基和甲基；
R6选自：氢，卤素和-C(O)R10，其中，R10是甲基；并且
R7选自：氢，卤素，氰基，甲基和三氟甲基。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述化合物选自下列化合物或其药学上可接受的盐：
N-[5-(3-氟苯基)吡啶-2-基]-2-[5-甲基-6-(哒嗪-4-基)吡啶-3-基]乙酰胺；
2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺(LGK974)；
N-(2，3′-联吡啶-6′-基)-2-(2′，3-二甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-甲基-3-(三氟甲基)-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；
N-(5-(4-乙酰基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)乙酰胺；以及
2-(2′-氟-3-甲基-2，4′-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺。
41.如权利要求39所述的方法，其中，所述化合物是2-[5-甲基-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]-N-[5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基]乙酰胺。
42.如权利要求24至41中任一项所述的方法，其中，所述癌症是结肠直肠癌，胃癌，肝癌，食道癌，肠癌，胆道癌，胰腺癌，子宫内膜癌，或前列腺癌。
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