JP2021119204A - 固相ペプチド合成プロセスおよび関連システム - Google Patents

固相ペプチド合成プロセスおよび関連システム Download PDF

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Abstract

【課題】固相ペプチド合成を行うためのシステムおよびプロセスを提供すること。【解決手段】固相ペプチド合成は、固体支持体に固定化されたペプチドにアミノ酸残基が付加される公知のプロセスである。ある特定の実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、高収率を維持しつつ速く固相ペプチド合成を行うために使用することができる。ある特定の実施形態は、固相ペプチド合成を行うために必要とされる時間の量を低減させる仕方で、試薬を加熱、輸送および／または混合するために使用することができるプロセスおよびシステムに関する。【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、２０１３年３月１５日に出願され、「固相ペプチド合成プロセスおよび関連システム」との表題の米国特許出願第１３／８３３，７４５号（これは、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）の一部継続である。
固相ペプチド合成を行うためのシステムおよびプロセスについて全般的に記載されている。
固相ペプチド合成は、固体支持体におけるペプチドの化学合成に使用されるプロセスである。固相ペプチド合成において、アミノ酸またはペプチドは、通常Ｃ末端を介して固体支持体に結合する。カップリング反応により、新たなアミノ酸が、結合したアミノ酸またはペプチドに付加される。企図されない反応の可能性があるため、保護基が典型的に使用される。今日までに、固相ペプチド合成は、化学的ペプチド合成の慣例となった。固相ペプチド合成の広範な有用性は、自動固相ペプチド合成機の商業的成功によって実証された。固相ペプチド合成は、３０年間を超えて使用されてきたが、迅速な合成技法は、未だに開発されていない。したがって、改善されたプロセスおよびシステムが必要とされる。
固相ペプチド合成プロセスおよび関連するシステムについて全般的に記載されている。ある特定の実施形態は、高収率を維持しつつ速く固相ペプチド合成を行うために使用することができるシステムおよび方法に関する。一部の実施形態において、試薬は、固相ペプチド合成を行うために必要とされる時間の量を低減させる仕方で加熱、輸送および／または混合することができる。本発明の主題は、一部の事例において、相互関係する生成物、特定の問題の代替的解決策および／または、１種または複数のシステムおよび／または物品の複数の異なる使用に関与する。
一部の実施形態において、アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスが提供される。本プロセスは、ある特定の実施形態において、アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、アミノ酸を含む流れを加熱するステップと、加熱されたアミノ酸を、固体支持体に固定化された複数のペプチドに曝露するステップとを含み、加熱ステップは、加熱されたアミノ酸をペプチドに曝露するステップに先立ちその約３０秒以内に行われる
。
ある特定の実施形態において、本プロセスは、各ペプチドが固体支持体に固定化された、保護基を含む複数のペプチドを提供するステップと、アミノ酸残基が、固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加されるように、アミノ酸を固定化されたペプチドに曝露するステップを含む第１のアミノ酸付加サイクルを行うステップと、アミノ酸残基が、固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加されるように、アミノ酸を固定化されたペプチドに曝露するステップを含む第２のアミノ酸付加サイクルを行うステップとを含む。一部の実施形態において、第１および第２のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量は、約１０分間またはそれ未満であり、保護基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含み、かつ／または第１および第２のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量は、約５分間またはそれ未満である。
ある特定の実施形態において、本プロセスは、固体支持体に固定化された複数のペプチドを提供するステップと、活性化されたアミノ酸の少なくとも一部が、固定化されたペプチドに結合するように、活性化されたアミノ酸を固定化されたペプチドに曝露して、新たに結合したアミノ酸残基を形成するステップとを含み、アミノ酸残基は、約１分間またはそれ未満以内に、固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加される。
ある特定の実施形態において、本プロセスは、アミノ酸を含む第１の流れを流すステップと、アミノ酸活性化剤を含む第２の流れを流すステップと、第１および第２の流れを統合して、活性化されたアミノ酸を含む混合された流体を形成するステップと、第１および第２の流れを統合して混合された流体を形成するステップの後の約３０秒以内に、混合された流体を、固体支持体に固定化された複数のペプチドに曝露するステップとを含む。
ある特定の実施形態において、本プロセスは、各ペプチドが固体支持体に固定化された、保護基を含む複数のペプチドを提供するステップと、脱保護試薬を固定化されたペプチドに曝露して、固定化されたペプチドの少なくとも一部から保護基を除去するステップと、脱保護試薬の少なくとも一部を除去するステップと、活性化されたアミノ酸の少なくとも一部が、固定化されたペプチドに結合するように、活性化されたアミノ酸を固定化されたペプチドに曝露して、新たに結合したアミノ酸残基を形成するステップと、固定化されたペプチドに結合しない活性化されたアミノ酸の少なくとも一部を除去するステップとを含む。一部の実施形態において、アミノ酸残基は、アミノ酸曝露ステップの間において、固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加される。ある特定の実施形態において、脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量は、約１０分間またはそれ未満であり、保護基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含み、かつ／または脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量は、約５分間またはそれ未満である。
本発明の他の利点および新規特色は、添付の図面と併せて考慮すると、本発明の様々な非限定的な実施形態の次の詳細な説明から明らかとなる。本明細書および参照により援用されている文書が、矛盾するおよび／または一致しない開示を含む場合、本明細書を優先するべきである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスであって、
アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、前記アミノ酸を含む流れを加熱するステップと、
前記加熱されたアミノ酸を、固体支持体に固定化された複数のペプチドに曝露するステップと
を含み、前記加熱ステップが、前記加熱されたアミノ酸を前記ペプチドに曝露するステップに先立ちその約３０秒以内に行われる、プロセス。
（項目２）
前記固体支持体が、ポリスチレンおよび／またはポリエチレングリコールを含む、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
前記固体支持体が、樹脂を含む、項目１〜２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目４）
前記固体支持体が、細孔性ポリスチレン樹脂を含む、項目３に記載のプロセス。
（項目５）
前記固体支持体が、充填カラムおよび／または流動床内に含有される、項目１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６）
前記加熱されたアミノ酸を前記固定化されたペプチドに曝露した後に、アミノ酸残基が、前記固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加される、項目１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７）
前記加熱されたアミノ酸を前記固定化されたペプチドに曝露した後に、複数コピーの前記アミノ酸残基が、前記固定化されたペプチドの約１％未満に結合する、項目１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目８）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、単一のアミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目９）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、２個またはそれを超えるアミノ酸残基を含むペプチドを、前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目６〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１０）
前記アミノ酸の温度が、少なくとも約１０℃上昇する、項目１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１１）
前記アミノ酸の温度が、少なくとも約２５℃上昇する、項目１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１２）
アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスであって、
各ペプチドが固体支持体に固定化された、保護基を含む複数のペプチドを提供するステップと、
アミノ酸残基が、前記固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加されるように、アミノ酸を前記固定化されたペプチドに曝露するステップを含む第１のアミノ酸付加サイクルを行うステップと、
アミノ酸残基が、前記固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加されるように、アミノ酸を前記固定化されたペプチドに曝露するステップを含む第２のアミノ酸付加サイクルを行うステップと
を含み、前記第１および第２のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量が、約１０分間またはそれ未満であり、前記保護基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含み、かつ／または
前記第１および第２のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量が約５分間またはそれ未満である、プロセス。
（項目１３）
前記保護基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含む、項目１２に記載のプロセス。
（項目１４）
前記保護基が、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を含む、項目１２に記載のプロセス。
（項目１５）
前記第１および第２のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量が、約５分間またはそれ未満である、項目１２〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１６）
前記第１および第２のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量が、約１０秒間〜約１０分間であり、前記保護基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含む、項目１２〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１７）
前記第１および第２のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量が、約１０秒間〜約５分間である、項目１２〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１８）
前記第１および第２のアミノ酸付加サイクルの間において、前記固体支持体を横切る圧力降下が、前記サイクルが行われる期間の約５％超において約７００ｐｓｉを超えない、項目１２〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１９）
前記固体支持体が、充填カラムおよび／または流動床内に含有される、項目１２〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２０）
前記固体支持体が、ポリスチレンおよび／またはポリエチレングリコールを含む、項目１２〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２１）
前記固体支持体が、樹脂を含む、項目１２〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２２）
前記固体支持体が、細孔性ポリスチレン樹脂を含む、項目２１に記載のプロセス。
（項目２３）
前記固体支持体への前記アミノ酸の曝露に先立つ約３０秒以内に、アミノ酸を含む第１の流体の流れおよびアミノ酸活性化剤を含む第２の流れを統合して、活性化されたアミノ酸を含む混合された流体を形成するステップを含む、項目１２〜２２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２４）
前記アミノ酸活性化剤が、アルカリ性液体、カルボジイミドおよび／またはウロニウム活性化剤を含む、項目２３に記載のプロセス。
（項目２５）
複数コピーの前記アミノ酸残基が、前記第１のアミノ酸付加サイクルの間において、前記固定化されたペプチドの約１％未満に結合する、項目１２〜２４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２６）
複数コピーの前記アミノ酸残基が、前記第２のアミノ酸付加サイクルの間において、前記固定化されたペプチドの約１％未満に結合する、項目１２〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２７）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、単一のアミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目１２〜２６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２８）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、２個またはそれを超えるアミノ酸残基を含むペプチドを、前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目１２〜２７のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２９）
前記アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、前記アミノ酸を含む流れを加熱するステップを含み、前記加熱ステップが、前記固定化されたペプチドへの前記加熱されたアミノ酸の曝露に先立ちその約３０秒以内に行われる、項目１２〜２８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３０）
アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスであって、
固体支持体に固定化された複数のペプチドを提供するステップと、
活性化されたアミノ酸の少なくとも一部が、前記固定化されたペプチドに結合するように、前記活性化されたアミノ酸を前記固定化されたペプチドに曝露して、新たに結合したアミノ酸残基を形成するステップと
を含み、アミノ酸残基が、約１分間またはそれ未満以内に前記固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加される、プロセス。
（項目３１）
前記曝露ステップの間において、前記固体支持体を横切る圧力降下が、前記曝露ステップが行われる期間の約５％超において約７００ｐｓｉを超えない、項目３０に記載のプロセス。
（項目３２）
前記固体支持体が、充填カラムおよび／または流動床内に含有される、項目３０〜３１のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３３）
前記アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、前記アミノ酸を加熱するステップを含み、前記加熱ステップが、前記固定化されたペプチドへの前記アミノ酸の曝露に先立ちその３０秒以内に行われる、項目３０〜３２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３４）
前記固体支持体が、ポリスチレンおよび／またはポリエチレングリコールを含む、項目３０〜３３のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３５）
前記固体支持体が、樹脂を含む、項目３０〜３４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３６）
前記固体支持体が、細孔性ポリスチレン樹脂を含む、項目３５に記載のプロセス。
（項目３７）
前記固体支持体への前記アミノ酸の曝露に先立つ約３０秒以内に、アミノ酸を含む第１の流体の流れおよびアミノ酸活性化剤を含む第２の流れを統合して、前記活性化されたアミノ酸を含む混合された流体を形成するステップを含む、項目３０〜３６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３８）
前記アミノ酸活性化剤が、アルカリ性液体、カルボジイミドおよび／またはウロニウム活性化剤を含む、項目３７に記載のプロセス。
（項目３９）
複数コピーの前記アミノ酸残基が、前記曝露ステップの間において、前記固定化されたペプチドの約１％未満に結合する、項目３０〜３８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目４０）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、単一のアミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目３０〜３９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目４１）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、２個またはそれを超えるアミノ酸残基を含むペプチドを、前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目３０〜４０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目４２）
アミノ酸残基が、約１分間またはそれ未満以内に、前記固定化されたペプチドの少なくとも約９９．９％に付加される、項目３０〜４１のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目４３）
アミノ酸残基が、約３０秒間またはそれ未満以内に、前記固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加される、項目３０〜４２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目４４）
前記アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、前記アミノ酸を含む流れを加熱するステップを含み、前記加熱ステップが、前記固定化されたペプチドへの前記加熱されたアミノ酸の曝露に先立ちその約３０秒以内に行われる、項目３０〜４３のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目４５）
アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスであって、
アミノ酸を含む第１の流れを流すステップと、
アミノ酸活性化剤を含む第２の流れを流すステップと、
前記第１および第２の流れを統合して、活性化されたアミノ酸を含む混合された流体を形成するステップと、
前記第１および第２の流れを統合して前記混合された流体を形成するステップの後約３０秒以内に、前記混合された流体を、固体支持体に固定化された複数のペプチドに曝露するステップと
を含むプロセス。
（項目４６）
前記アミノ酸活性化剤が、アルカリ性液体、カルボジイミドおよび／またはウロニウム活性化剤を含む、項目４５に記載のプロセス。
（項目４７）
前記アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、前記アミノ酸を加熱するステップを含み、前記加熱ステップが、前記固定化されたペプチドへの前記アミノ酸の曝露に先立ちその３０秒以内に行われる、項目４５〜４６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目４８）
前記加熱ステップが、前記統合ステップに先立ち行われる、項目４７に記載のプロセス。
（項目４９）
前記加熱ステップが、前記統合ステップの間において行われる、項目４７〜４８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５０）
前記加熱ステップが、前記統合ステップの後に行われる、項目４７〜４９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５１）
前記固体支持体が、ポリスチレンおよび／またはポリエチレングリコールを含む、項目４５〜５０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５２）
前記固体支持体が、樹脂を含む、項目４５〜５１のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５３）
前記固体支持体が、細孔性ポリスチレン樹脂を含む、項目５２に記載のプロセス。
（項目５４）
前記固体支持体が、充填カラムおよび／または流動床内に含有される、項目４５〜５３のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５５）
前記混合された流体を前記固定化されたペプチドに曝露した後に、アミノ酸残基が、前記固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加される、項目４５〜５４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５６）
前記混合された流体を前記固定化されたペプチドに曝露した後に、複数コピーの前記アミノ酸残基が、前記固定化されたペプチドの約１％未満に結合する、項目４５〜５５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５７）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、単一のアミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目５５〜５６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５８）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、２個またはそれを超えるアミノ酸残基を含むペプチドを、前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目５５〜５７のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５９）
前記アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、前記アミノ酸を含む前記第１の流れを加熱するステップを含み、前記加熱ステップが、複数の前記固定化されたペプチドへの前記加熱されたアミノ酸の曝露に先立ちその約３０秒以内に行われる、項目４５〜５８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６０）
アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスであって、
各ペプチドが固体支持体に固定化された、保護基を含む複数のペプチドを提供するステップと、
脱保護試薬を前記固定化されたペプチドに曝露して、前記固定化されたペプチドの少なくとも一部から保護基を除去するステップと、
前記脱保護試薬の少なくとも一部を除去するステップと、
活性化されたアミノ酸の少なくとも一部が、前記固定化されたペプチドに結合するように、前記活性化されたアミノ酸を前記固定化されたペプチドに曝露して、新たに結合したアミノ酸残基を形成するステップと、
前記固定化されたペプチドに結合しない活性化されたアミノ酸の少なくとも一部を除去するステップと
を含み、アミノ酸残基が、アミノ酸曝露ステップの間において、前記固定化されたペプチドの少なくとも約９９％に付加され、
脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量が、約１０分間またはそれ未満であり、前記保護基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含み、かつ／または
前記脱保護試薬曝露ステップ、前記脱保護試薬除去ステップ、前記活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび前記活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量が、約５分間またはそれ未満である、プロセス。
（項目６１）
前記保護基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含む、項目６０に記載のプロセス。
（項目６２）
前記保護基が、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を含む、項目６０に記載のプロセス。
（項目６３）
前記脱保護試薬曝露ステップ、前記脱保護試薬除去ステップ、前記活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび前記活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量が、約１０秒間〜約１０分間であり、前記保護基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含む、項目６０〜６２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６４）
前記脱保護試薬曝露ステップ、前記脱保護試薬除去ステップ、前記活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび前記活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量が、約５分間またはそれ未満である、項目６０〜６３のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６５）
前記脱保護試薬曝露ステップ、前記脱保護試薬除去ステップ、前記活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび前記活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量が、約１０秒間〜約５分間である、項目６０〜６４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６６）
前記脱保護試薬曝露ステップ、前記脱保護試薬除去ステップ、前記活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび前記活性化されたアミノ酸の除去ステップのそれぞれの間において、前記固体支持体を横切る圧力降下が、前記ステップが行われる期間の約５％超において約７００ｐｓｉを超えない、項目６０〜６５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６７）
前記固体支持体が、充填カラムおよび／または流動床内に含有される、項目６０〜６６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６８）
前記アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、前記アミノ酸を加熱するステップを含み、前記加熱ステップが、前記固定化されたペプチドへの前記アミノ酸の曝露に先立ちその３０秒以内に行われる、項目６０〜６７のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６９）
前記固体支持体が、ポリスチレンおよび／またはポリエチレングリコールを含む、項目６０〜６８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７０）
前記固体支持体が、樹脂を含む、項目６０〜６９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７１）
前記固体支持体が、細孔性ポリスチレン樹脂、細孔性ポリエチレングリコール樹脂および／または細孔性コポリマー樹脂を含む、項目７０に記載のプロセス。
（項目７２）
前記固体支持体への前記アミノ酸の曝露に先立つ約３０秒以内に、前記アミノ酸を含む第１の流体の流れおよびアミノ酸活性化剤を含む第２の流れを統合して、前記活性化されたアミノ酸を含む混合された流体を形成するステップを含む、項目６０〜７１のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７３）
前記アミノ酸活性化剤が、アルカリ性液体、カルボジイミドおよび／またはウロニウム活性化剤を含む、項目７２に記載のプロセス。
（項目７４）
複数コピーの前記アミノ酸残基が、前記アミノ酸曝露ステップの間において、前記固定化されたペプチドの約１％未満に結合する、項目６０〜７３のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７５）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、単一のアミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目６０〜７４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７６）
アミノ酸残基を前記固定化されたペプチドに付加することが、２個またはそれを超えるアミノ酸残基を含むペプチドを、前記固定化されたペプチドに付加することを含む、項目６０〜７５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７７）
前記アミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇するように、前記アミノ酸を含む前記第１の流れを加熱するステップを含み、前記加熱ステップが、複数の前記固定化されたペプチドへの前記加熱されたアミノ酸の曝露に先立ちその約３０秒以内に行われる、項目６０〜７６のいずれか一項に記載のプロセス。
添付の図面を参照しつつ、本発明の非限定的な実施形態を例として記載するが、これは模式的なものであり、縮尺を合わせて描くことを企図しない。図面において、図解されている同一またはほとんど同一の構成要素のそれぞれは、典型的に、単一の数字によって表される。明確となることを目的として、あらゆる図面においてあらゆる構成要素が標識されているとは限らず、当業者が本発明を理解するために図解が必要でない場合、本発明の各実施形態のあらゆる構成要素が示されているとは限らない。図面には次の事柄が示されている。
図１は、１セットの実施形態に係る、ペプチド合成を行うためのシステムの略図である。 図２Ａ〜図２Ｄは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）ペプチド合成システムの例示的な模式図、（Ｂ）例示的なペプチド合成システムの写真、（Ｃ）合成ペプチドＦｍｏｃ−ＡＬＦＡＬＦＡ−ＣＯＮＨ２のクロマトグラムおよび（Ｄ）リアクタの例示的な模式図である。 図２Ａ〜図２Ｄは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）ペプチド合成システムの例示的な模式図、（Ｂ）例示的なペプチド合成システムの写真、（Ｃ）合成ペプチドＦｍｏｃ−ＡＬＦＡＬＦＡ−ＣＯＮＨ２のクロマトグラムおよび（Ｄ）リアクタの例示的な模式図である。 図３Ａ〜図３Ｃは、１セットの実施形態に係る、（Ａ）異なる活性化アミノ酸曝露時間により合成されたＬＹＲＡＧ−ＣＯＮＨ２ペプチドのクロマトグラム、（Ｂ）異なる活性化アミノ酸曝露時間により合成されたＦｍｏｃ−ＡＬＦ−ＣＯＮＨ２ペプチドのクロマトグラムおよび（Ｃ）例示的な合成タイムラインである。 図４Ａ〜図４Ｄは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）６０℃においてＨＡＴＵを使用して合成された、（Ｂ）６０℃においてＨＢＴＵを使用して合成された、（Ｃ）ＲＴにおいてＨＢＴＵを使用して合成された、（Ｄ）同じ合成タイムラインを使用したバッチ条件下でＨＢＴＵを使用して合成された、ＡＣＰ（６５−７４）ペプチドのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図４Ａ〜図４Ｄは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）６０℃においてＨＡＴＵを使用して合成された、（Ｂ）６０℃においてＨＢＴＵを使用して合成された、（Ｃ）ＲＴにおいてＨＢＴＵを使用して合成された、（Ｄ）同じ合成タイムラインを使用したバッチ条件下でＨＢＴＵを使用して合成された、ＡＣＰ（６５−７４）ペプチドのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図５Ａ〜図５Ｂは、１セットの実施形態に係る、（Ａ）合成ＰｎＩＡ（Ａ１０Ｌ）ペプチドのクロマトグラムおよび質量スペクトルならびに（Ｂ）合成ＨＩＶ−１ ＰＲ（８１−９９）ペプチドのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図６Ａ〜図６Ｅは、ある特定の実施形態に係る、表１に示す様々な条件下（Ａ）５、（Ｂ）７、（Ｃ）８および（Ｄ）４で合成されたＧＣＦペプチドの全イオン電流クロマトグラフであり、（Ｅ）は、確証済みのＧｌｙ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｌ−Ｐｈｅ試料の例示的な全イオン電流クロマトグラフである。 図６Ａ〜図６Ｅは、ある特定の実施形態に係る、表１に示す様々な条件下（Ａ）５、（Ｂ）７、（Ｃ）８および（Ｄ）４で合成されたＧＣＦペプチドの全イオン電流クロマトグラフであり、（Ｅ）は、確証済みのＧｌｙ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｌ−Ｐｈｅ試料の例示的な全イオン電流クロマトグラフである。 図７Ａ〜図７Ｅは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）３個のペプチド断片からのアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）タンパク質の化学的ライゲーションのための例示的なスキーム、（Ｂ）第１のアフィボディ断片のクロマトグラムおよび質量スペクトル、（Ｃ）第２のアフィボディ断片のクロマトグラムおよび質量スペクトル、（Ｄ）第３のアフィボディペプチド断片のクロマトグラムおよび質量スペクトルならびに（Ｅ）精製アフィボディのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図７Ａ〜図７Ｅは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）３個のペプチド断片からのアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）タンパク質の化学的ライゲーションのための例示的なスキーム、（Ｂ）第１のアフィボディ断片のクロマトグラムおよび質量スペクトル、（Ｃ）第２のアフィボディ断片のクロマトグラムおよび質量スペクトル、（Ｄ）第３のアフィボディペプチド断片のクロマトグラムおよび質量スペクトルならびに（Ｅ）精製アフィボディのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図７Ａ〜図７Ｅは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）３個のペプチド断片からのアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）タンパク質の化学的ライゲーションのための例示的なスキーム、（Ｂ）第１のアフィボディ断片のクロマトグラムおよび質量スペクトル、（Ｃ）第２のアフィボディ断片のクロマトグラムおよび質量スペクトル、（Ｄ）第３のアフィボディペプチド断片のクロマトグラムおよび質量スペクトルならびに（Ｅ）精製アフィボディのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図８Ａ〜図８Ｆは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ〜Ｂ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用したＮ末端アフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｃ〜Ｄ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用した中央アフィボディ断片の全イオンクロマトグラムならびに（Ｅ〜Ｆ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用したＣ末端アフィボディ断片の全イオンクロマトグラムである。 図８Ａ〜図８Ｆは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ〜Ｂ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用したＮ末端アフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｃ〜Ｄ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用した中央アフィボディ断片の全イオンクロマトグラムならびに（Ｅ〜Ｆ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用したＣ末端アフィボディ断片の全イオンクロマトグラムである。 図８Ａ〜図８Ｆは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ〜Ｂ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用したＮ末端アフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｃ〜Ｄ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用した中央アフィボディ断片の全イオンクロマトグラムならびに（Ｅ〜Ｆ）それぞれＦｍｏｃ Ｎ末端保護基、およびＢｏｃ Ｎ末端保護基を使用した伝統的な手動配置を使用したＣ末端アフィボディ断片の全イオンクロマトグラムである。 図９Ａ〜図９Ｅは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）精製された第１のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｂ）精製された第２のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｃ）精製された第３のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｄ）第１および第２の断片のライゲーションから得られる精製されたアフィボディ断片の全イオンクロマトグラムならびに（Ｅ）精製されたアフィボディのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図９Ａ〜図９Ｅは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）精製された第１のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｂ）精製された第２のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｃ）精製された第３のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｄ）第１および第２の断片のライゲーションから得られる精製されたアフィボディ断片の全イオンクロマトグラムならびに（Ｅ）精製されたアフィボディのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図９Ａ〜図９Ｅは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）精製された第１のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｂ）精製された第２のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｃ）精製された第３のアフィボディ断片の全イオンクロマトグラム、（Ｄ）第１および第２の断片のライゲーションから得られる精製されたアフィボディ断片の全イオンクロマトグラムならびに（Ｅ）精製されたアフィボディのクロマトグラムおよび質量スペクトルである。 図１０は、１セットの実施形態に係る、ペプチドの合成の際に記録された時間の関数としての紫外線吸光度のプロットである。 図１１は、１セットの実施形態に係る、流量対洗浄時間のグラフである。 図１２Ａ〜図１２Ｇは、１セットの実施形態に係る、（Ａ）入口（左）および出口（右）の写真、（Ｂ）スペーサーの写真、（Ｃ）リアクタ本体ユニットの写真、（Ｄ）組み立てたリアクタの写真ならびに（Ｅ）リアクタ本体、フリット（ｆｒｉｔ）およびスペーサーを示すリアクタの模式図、（Ｆ）リアクタの切り取り断面図ならびに（Ｇ）リアクタにより使用した合成タイムラインである。 図１３は、１セットの実施形態に係る、ペプチド合成を行うための例示的なシステムの略図である。 図１４は、ある特定の実施形態に係る、合成ペプチドＡＬＦＡＬＦＡ−ＣＯＮＨＮＨ２の例示的な全イオンクロマトグラムである。 図１５は、本明細書に記載されているある特定のペプチド合成システムを使用して作製したペプチドの２種の例示的なクロマトグラムを示す。 図１６Ａ〜図１６Ｈは、１セットの実施形態に係る、（Ａ）ＨＡＴＵを使用した６０℃、（Ｂ）ＨＢＴＵを使用した６０℃、（Ｃ）ＨＢＴＵを使用した室温および（Ｄ）匹敵する手動バッチ方法を使用した室温における第二世代プロトコールにより合成されたＡＣＰ（６５−７４）、ならびに（Ｅ）ＨＡＴＵを使用した６０℃、（Ｆ）ＨＢＴＵを使用した６０℃、（Ｇ）ＨＢＴＵを使用した室温および（Ｈ）匹敵する手動バッチ方法を使用した室温における第一世代プロトコールにより合成されたＡＣＰ（６５−７４）の粗ＬＣＭＳクロマトグラムである。 図１７は、一部の実施形態に係る合成ビオチン化ペプチドのクロマトグラムを含む。 図１８Ａ〜図１８Ｄは、１セットの実施形態に係る、（Ａ）第二世代プロトコールにより合成されたＰｎＩＡ（Ａ１０Ｌ）コノトキシン、（Ｂ）第二世代プロトコールにより合成されたＨＩＶ−１ ＰＲ（８１−９９）、（Ｃ）第一世代プロトコールにより合成されたＰｎＩＡ（Ａ１０Ｌ）コノトキシンおよび（Ｄ）第一世代プロトコールにより合成されたＨＩＶ−１ ＰＲ（８１−９９）のクロマトグラムである。 図１９Ａ〜図１９Ｆは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ〜Ｃ）第二世代プロトコールによりクロロトリチル（ｃｈｌｏｒｏｔｒｙｔｙｌ）ヒドラジド官能化ポリスチレンにおいて合成されたアフィボディ断片および（Ｄ〜Ｆ）第一世代プロトコールによる修飾Ｗａｎｇ樹脂において合成されたアフィボディ断片のクロマトグラムである。 図２０は、１セットの実施形態に係る、合成されたグルタチオン類似体のライブラリのクロマトグラムを含む。 図２１Ａ〜図２１Ｃは、ある特定の実施形態に係る、合成されたシステインリッチペプチドのクロマトグラムである。 図２２Ａ〜図２２Ｂは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）自動プロセスを使用して合成された（ＡＬＦ）７および（Ｂ）手動プロセスを使用して合成された（ＡＬＦ）７のクロマトグラムである。 図２３Ａ〜図２３Ｄは、１セットの実施形態に係る、（Ａ）自動フロープラットフォームの模式図、（Ｂ）アミノ酸残基を取り込むために自動フロープラットフォームにより使用される合成タイムライン、（Ｃ）ＡＬＦＡＬＦＡを示すクロマトグラム、（Ｄ）ＡＣＰ（６５−７４）を示すクロマトグラムおよび（Ｅ）（ＡＬＦ）７を示すクロマトグラムである。 図２４Ａ〜図２４Ｂは、（Ａ）除去ステップを含む付加サイクルを使用して合成されたペプチドのクロマトグラムおよび（Ｂ）１回または複数の除去ステップを欠く付加サイクルを使用して合成されたペプチドのクロマトグラムを示す。 図２５Ａ〜図２５Ｆは、１セットの実施形態に係る、（Ａ）ＤＡＲＰｉｎ合成のための合成スキーム、（Ｂ〜Ｅ）断片ＤＡＲＰｉｎのクロマトグラムおよび（Ｆ）ＤＡＲＰｉｎのクロマトグラムを示す。 図２６Ａ〜図２６Ｆは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）バルナーゼ合成のための合成スキーム、（Ｂ〜Ｅ）断片バルナーゼのクロマトグラムおよび（Ｆ）バルナーゼのクロマトグラムを示す。 図２７Ａ〜図２７Ｃは、ある特定の実施形態に係る、（Ａ）ヒトインスリンＡ鎖のクロマトグラム、（Ｂ）ヒトインスリンＢ鎖のクロマトグラムおよび（Ｃ）進化したＥＥＴＩ−ＩＩインテグリン結合ペプチドのクロマトグラムを示す。
固相ペプチド合成を行うためのシステムおよびプロセスについて全般的に記載されている。固相ペプチド合成は、固体支持体に固定化されているペプチドにアミノ酸残基が付加される公知のプロセスである。ある特定の実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、高収率を維持しつつ速く固相ペプチド合成を行うために使用することができる。ある特定の実施形態は、固相ペプチド合成を行うために必要とされる時間の量を低減させる仕方で試薬を加熱、輸送および／または混合するために使用することができるプロセスおよびシステムに関する。
ある特定の実施形態は、固定化されたペプチドにアミノ酸（複数可）を付加するためのプロセスに関する。図１は、本明細書に記載されているある特定の本発明のプロセスを行うために使用することができる、例示的なシステム５の略図である。本明細書に記載されているシステムおよび方法（例えば、図１におけるシステム５）は、ある特定の実施形態において、流動に基づく合成（多くの伝統的な固相ペプチド合成システムにおいて用いられるバッチに基づく合成とは対照的な）に関与し得る。一部のこのような実施形態において、固定化されたペプチドの上を流体（ある形態または別の形態の）が実質的に連続的に輸送される、連続的ペプチド合成を行うことができる。例えば、ある特定の実施形態において、固定化されたペプチドの上を試薬およびリンス用流体が交互に（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）および連続的に輸送されてよい。
一部の実施形態において、ペプチド２０は、固体支持体１５に固定化され得る。固体支持体１５は、リアクタ１０等、容器内に含有され得る。一部の実施形態において、図１に示す通り、複数の試薬リザーバを、リアクタ１０の上流にこれに流体的に接続して置くことができる。一部の実施形態において、試薬リザーバ２５は、アミノ酸（例えば、予備活性化されたアミノ酸および／または十分に活性化されていないアミノ酸）を含有する。場合によっては、試薬リザーバ２６は、アミノ酸の活性化を完了することができるアミノ酸活性化剤（例えば、アルカリ性液体、カルボジイミドおよび／またはウロニウム活性化剤）を含有する。ある特定の実施形態において、試薬リザーバ２７は、ピペリジンまたはトリフルオロ酢酸等、脱保護試薬を含有する。試薬リザーバ２８は、例えば、試薬除去ステップにおいて使用することができる、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒を含有することができる。単純にするために単一のリザーバが図１に図解されているが、単一のリザーバが図解されている図１において、単一のリザーバの代わりに複数のリザーバ（例えば、それぞれ異なる種類のアミノ酸、異なる種類の脱保護剤等を含有する）を使用することができることを理解されたい。
ある特定の実施形態において、ペプチド２０は、例えば、ペプチドのＮ末端に保護基を含む。本明細書において、用語「保護基」は、本技術分野におけるその通常の意義が与えられる。保護基は、保護基が、保護された基が反応するのを防止さもなければ阻害するように、分子（例えば、ペプチド）内の反応基（即ち、保護された基）に付着したまたは付着するよう構成された化学的部分を含む。保護は、分子に保護基を付着することにより生じ得る。脱保護は、例えば、保護基を除去する化学転換により保護基が分子から除去されたときに生じ得る。
一部の実施形態において、保護基を含む複数のペプチドは、各ペプチドが固体支持体に固定化されるように、固体支持体に結合され得る。例えば、ペプチドは、それらのＣ末端を介して固体支持体に結合されて、これにより、ペプチドを固定化することができる。
一部の実施形態において、固定化されたペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、固定化されたペプチドに脱保護試薬を曝露して、固定化されたペプチドの少なくとも一部から保護基の少なくとも一部を除去するステップを含む。脱保護試薬曝露ステップは、ある特定の実施形態において、Ｎ末端保護基が除去されながら側鎖保護基が保存されるように構成され得る。例えば、ある特定の実施形態において、ペプチドの保護に使用される保護基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を含む。一部のこのような実施形態において、ピペリジン（例えば、ピペリジン溶液）を含む脱保護試薬は、固定化されたペプチドの少なくとも一部からＦｍｏｃ保護基が除去されるように、固定化されたペプチドに曝露され得る。一部の実施形態において、ペプチドの保護に使用される保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含む。一部のこのような実施形態において、トリフルオロ酢酸を含む脱保護試薬は、固定化されたペプチドの少なくとも一部からＢｏｃ保護基が除去されるように、固定化されたペプチドに曝露され得る。場合によっては、保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、即ち、Ｂｏｃ）は、ペプチドのＮ末端に結合され得る。
一部の実施形態において、固定化されたペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、脱保護試薬の少なくとも一部を除去するステップを含む。一部の実施形態において、脱保護ステップの間において形成されることができたいずれかの反応副産物（例えば、除去された保護基）の少なくとも一部を除去することができる。場合によっては、脱保護試薬（および、ある特定の実施形態において副産物）は、例えば、任意選択のリザーバ２８に貯蔵されている流体（例えば、水性もしくは非水性溶媒等の液体、超臨界流体および／またはその他）でペプチド、固体支持体および／または周囲の区域を洗浄することにより除去することができる。場合によっては、脱保護試薬および反応副産物の除去は、その後のステップの性能を改善することができる（例えば、副反応を防止することにより）。ある特定の実施形態において、その後のステップの性能は、脱保護試薬および／または反応副産物の少なくとも一部（例えば、実質的に全て）の除去に依存しない。一部のこのような事例において、除去ステップは任意選択である。除去ステップが任意選択である実施形態において、除去ステップは、低減（例えば、除去ステップの時間の低減、除去ステップにおいて使用される溶媒の量の低減）および／または排除されてよい。１回または複数の除去ステップの低減または排除は、全体的なサイクル時間を低減することができる。任意選択の除去ステップが低減または排除される場合、付加サイクルにおけるその後のステップが、例えば、システムにおける流体流動により、脱保護試薬および／または反応副産物の少なくとも一部の除去に役立ち得ることを理解されたい。
固定化されたペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、ある特定の実施形態において、活性化されたアミノ酸の少なくとも一部が、固定化されたペプチドに結合するように、活性化されたアミノ酸を固定化されたペプチドに曝露して、新たに結合したアミノ酸残基を形成するステップを含む。例えば、ペプチドは、ペプチドの脱保護されたＮ末端と反応する活性化されたアミノ酸に曝露され得る。ある特定の実施形態において、アミノ酸は、より詳細に後述する通り、アミノ酸を含有する流れを活性化剤の流れと混合することにより、脱保護されたペプチドとの反応のために活性化され得る。場合によっては、アミノ酸の付加が、保護されたＮ末端を有する固定化されたペプチドをもたらすように、活性化されたアミノ酸のアミン基は保護され得る。
一部の実施形態において、固定化されたペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、固定化されたペプチドに結合しない活性化されたアミノ酸の少なくとも一部を除去するステップを含む。一部の実施形態において、活性化されたアミノ酸の曝露ステップの間に形成することができた反応副産物の少なくとも一部を除去することができる。場合によっては、活性化されたアミノ酸および副産物は、例えば、任意選択のリザーバ２８に貯蔵された流体（例えば、水性もしくは非水性溶媒等の液体、超臨界流体および／またはその他）でペプチド、固体支持体および／または周囲の区域を洗浄することにより除去することができる。場合によっては、活性化されたアミノ酸および反応副産物の少なくとも一部の除去は、その後のステップの性能を改善することができる（例えば、副反応を防止することにより）。ある特定の実施形態において、その後のステップの性能は、活性化されたアミノ酸および／または反応副産物の少なくとも一部（例えば、実質的に全て）の除去に依存しない。一部のこのような事例において、除去ステップは、任意選択である。除去ステップが任意選択である実施形態において、除去ステップは、低減（例えば、除去ステップの時間の低減、除去ステップにおいて使用される溶媒の量の低減）および／または排除されてよい。１回または複数の除去ステップの低減または排除は、全体的なサイクル時間を低減することができる。任意選択の除去ステップが低減または排除される場合、付加サイクルにおけるその後のステップが、例えば、システムにおける流体流動により、活性化されたアミノ酸および／または反応副産物の少なくとも一部の除去に役立ち得ることを理解されたい。
上に参照したステップが例示的なものであり、アミノ酸付加サイクルが、必ずしも上に参照したステップの全てを含む必要がないことを理解されたい。例えば、アミノ酸付加サイクルは、脱保護試薬除去ステップおよび／または活性化されたアミノ酸の除去ステップを含まなくてもよい。一般に、アミノ酸付加サイクルは、ペプチドへのアミノ酸残基の付加をもたらすいずれか一連のステップを含む。
ある特定の実施形態において、アミノ酸付加ステップにおいて、アミノ酸の付加は、ペプチドによる単一の追加的なアミノ酸残基の取り込みをもたらすことができる（即ち、付加ステップの後に所定のペプチドが単一の追加的なアミノ酸残基を含むように、単一のアミノ酸残基を固定化されたペプチドに付加することができる）。一部のこのような実施形態において、その後のアミノ酸付加ステップを使用して、所望のペプチドが合成されるまでアミノ酸残基を個々に付加することにより、ペプチドを築くことができる。一部の実施形態において、２個以上のアミノ酸残基（例えば、ペプチドの形態の）を、固体支持体に固定化されたペプチドに付加することができる（即ち、複数のアミノ酸残基を含むペプチドを、所定の固定化されたペプチドに付加することができる）。固定化されたペプチドへのペプチドの付加は、当業者に公知のプロセス（例えば、断片縮合、化学的ライゲーション）により達成することができる。換言すると、アミノ酸付加ステップにおいて、固定化されたペプチドへのアミノ酸の付加は、固定化されたペプチドへの単一のアミノ酸残基の付加または固定化されたペプチドへの複数のアミノ酸残基（例えば、ペプチドとして）の付加を含むことができる。
一部の実施形態において、アミノ酸は、従来の方法よりも有意に迅速にペプチドに付加することができる。ある特定の実施形態において、ステップの組合せを行うのにかかる時間の総量は、保護基に影響され得る。例えば、保護基がフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を含むある特定の実施形態において、脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量は、約１０分間もしくはそれ未満、約９分間もしくはそれ未満、約８分間もしくはそれ未満、約７分間もしくはそれ未満、約６分間もしくはそれ未満、約５分間もしくはそれ未満、約４分間もしくはそれ未満、約３分間もしくはそれ未満、約２分間もしくはそれ未満、約１分間もしくはそれ未満、約１０秒間〜約１０分間、約１０秒間〜約９分間、約１０秒間〜約８分間、約１０秒間〜約７分間、約１０秒間〜約６分間、約１０秒間〜約５分間、約１０秒間〜約４分間、約１０秒間〜約３分間、約１０秒間〜約２分間または約１０秒間〜約１分間である。ある特定の実施形態において（保護基がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）および／または他の種類の保護基を含む実施形態を含む）、脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量は、約５分間もしくはそれ未満、約４分間もしくはそれ未満、約３分間もしくはそれ未満、約２分間もしくはそれ未満、約１分間もしくはそれ未満、約１０秒間〜約５分間、約１０秒間〜約４分間、約１０秒間〜約３分間、約１０秒間〜約２分間または約１０秒間〜約１分間である。
一般に、脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の除去ステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量は、脱保護試薬曝露ステップを行うのにかかる時間の量を、脱保護試薬除去ステップを行うのにかかる時間の量および活性化されたアミノ酸の曝露ステップを行うのにかかる時間の量および活性化されたアミノ酸の除去ステップを行うのにかかる時間の量に加えることにより計算される。
本明細書に記載されている通り、付加サイクルが１回または複数の除去ステップを欠き、保護基がフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を含む実施形態において、付加サイクルのステップの全ての組合せ（例えば、脱保護試薬曝露ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の除去ステップ；脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップおよび活性化されたアミノ酸の曝露ステップ；脱保護試薬曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の曝露ステップ）を行うのにかかる時間の総量は、約１０分間もしくはそれ未満、約９分間もしくはそれ未満、約８分間もしくはそれ未満、約７分間もしくはそれ未満、約６分間もしくはそれ未満、約５分間もしくはそれ未満、約４分間もしくはそれ未満、約３分間もしくはそれ未満、約２分間もしくはそれ未満、約１分間もしくはそれ未満、約０．７５分間もしくはそれ未満、約１０秒間〜約１０分間、約１０秒間〜約９分間、約１０秒間〜約８分間、約１０秒間〜約７分間、約１０秒間〜約６分間、約１０秒間〜約５分間、約１０秒間〜約４分間、約１０秒間〜約３分間、約１０秒間〜約２分間または約１０秒間〜約１分間である。ある特定の実施形態において（保護基がｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）および／または他の種類の保護基を含む実施形態を含む）、１回または複数の除去ステップを欠く付加サイクルにおけるステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量は、約５分間もしくはそれ未満、約４分間もしくはそれ未満、約３分間もしくはそれ未満、約２分間もしくはそれ未満、約１分間もしくはそれ未満、約１０秒間〜約５分間、約１０秒間〜約４分間、約１０秒間〜約３分間、約１０秒間〜約２分間または約１０秒間〜約１分間である。
一般に、１回または複数の除去ステップを欠く付加サイクルにおけるステップの全ての組合せを行うのにかかる時間の総量は、脱保護試薬曝露ステップを行うのにかかる時間の量を、存在するのであれば脱保護試薬除去ステップを行うのにかかる時間の量、および存在するのであれば活性化されたアミノ酸の曝露ステップを行うのにかかる時間の量および活性化されたアミノ酸の除去ステップを行うのにかかる時間の量に加えることにより計算される。
ある特定の実施形態において、第１のアミノ酸付加ステップ（および／またはその後のアミノ酸付加ステップ）は、比較的高収率でアミノ酸を付加することができる。例えば、ある特定の実施形態は、アミノ酸残基が、固定化されたペプチドの少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％または実質的に１００％に付加されるように、固定化されたペプチドにアミノ酸を曝露するステップを含む。ある特定の実施形態において、アミノ酸残基が、固定化されたペプチドの少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％または実質的に１００％に付加されるように、固定化されたペプチドにアミノ酸を曝露するステップを含むことができる、第２の（および一部の実施形態において、第３の、第４の、第５のおよび／またはその後の）アミノ酸付加サイクルを行うことができる。ある特定の実施形態において、本発明のプロセスおよびシステムの使用は、高い反応収率を維持しつつ、固定化されたペプチドへの２個以上のアミノ酸の付加を、比較的速く（上述または本明細書の他の箇所に開示されている時間範囲のいずれか以内を含む）生じさせることができる。
ある特定の実施形態において、１回または複数のアミノ酸付加ステップは、二重取り込み（即ち、単一の付加ステップにおける所望のアミノ酸の複数コピー（例えば、単一のアミノ酸残基またはペプチド）の付加）が殆どないまたは全くないように行うことができる。例えば、ある特定の実施形態において、第１の（および／または第２の、第３の、第４の、第５のおよび／またはその後の）アミノ酸付加ステップにおいて、所望のアミノ酸の複数コピーは、固定化されたペプチドの約１％未満（または約０．１％未満、約０．０１％未満、約０．００１％未満、約０．０００１％未満、約０．００００１％未満もしくは実質的に結合なし）に結合する。
一部の実施形態において、複数のアミノ酸付加サイクルを行うことができる。複数のアミノ酸付加サイクルの実行は、ペプチドに付加される２個以上の単一のアミノ酸残基（または２個以上のペプチドおよび／または少なくとも１個の単一のアミノ酸残基および少なくとも１個のペプチド）をもたらし得る。ある特定の実施形態において、固定化されたペプチドに２個以上のアミノ酸を付加するためのプロセスは、第１のアミノ酸付加サイクルを行って第１のアミノ酸を付加するステップと、第２のアミノ酸付加サイクルを行って第２のアミノ酸を付加するステップを含むことができる。ある特定の実施形態において、第３の、第４の、第５のおよびその後のアミノ酸付加サイクルを行って、いずれか所望の長さの固定化されたペプチドを産生することができる。一部の実施形態において、少なくとも約１０回のアミノ酸付加サイクル、少なくとも約５０回のアミノ酸付加サイクルまたは少なくとも約１００回のアミノ酸付加サイクルを行い、固定化されたペプチドへの少なくとも約１０アミノ酸残基、少なくとも約５０アミノ酸残基または少なくとも約１００アミノ酸残基の付加をもたらす。ある特定のこのような実施形態において、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、このようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％）は、高収率（例えば、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％または実質的に１００％）で行うことができる。一部のこのような実施形態において、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、このようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％）は、速く、例えば、上述または本明細書の他の箇所に指定されている時間範囲のいずれか以内で行うことができる。一部のこのような実施形態において、アミノ酸付加サイクルの比較的高いパーセンテージ（例えば、このようなアミノ酸付加サイクルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％）は、二重取り込みが限定的なまたは全くないように、例えば、上述または本明細書の他の箇所に指定されている二重取り込み範囲のいずれか以内で行うことができる。
２回以上の付加サイクルが存在する実施形態において、あるアミノ酸付加サイクルおよびその後のアミノ酸付加サイクルの終わりの間で経過する時間の総量は、比較的短くなり得る。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基が用いられるある特定の実施形態において、第１および第２のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量は、約１０分間もしくはそれ未満、約９分間もしくはそれ未満、約８分間もしくはそれ未満、約７分間もしくはそれ未満、約６分間もしくはそれ未満、約５分間もしくはそれ未満、約４分間もしくはそれ未満、約３分間もしくはそれ未満、約２分間もしくはそれ未満、約１分間もしくはそれ未満、約１０秒間〜約１０分間、約１０秒間〜約９分間、約１０秒間〜約８分間、約１０秒間〜約７分間、約１０秒間〜約６分間、約１０秒間〜約５分間、約１０秒間〜約４分間、約１０秒間〜約３分間、約１０秒間〜約２分間、約１０秒間〜約１分間である。フルオレニルメチルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルおよび／またはいずれか他の適した保護基を含む保護基が用いられるある特定の実施形態において、あるアミノ酸付加サイクルおよびその後のアミノ酸付加サイクルの終わりの間の時間の総量は、約５分間もしくはそれ未満、約４分間もしくはそれ未満、約３分間もしくはそれ未満、約２分間もしくはそれ未満、約１分間もしくはそれ未満、約１０秒間〜約５分間、約１０秒間〜約４分間、約１０秒間〜約３分間、約１０秒間〜約２分間または約１０秒間〜約１分間となり得る。
上述されている通り、ある特定の態様は、以前の固相ペプチド合成方法と比較して、１回または複数の付加サイクルに必要とされる合計時間を有意に低減させることができるプロセスおよびシステムに関する。３０年よりも前の連続的固相ペプチド合成の出現から、たゆまぬ努力がその有用性および適用性の改善に集中されてきた。これらの改善は、自動固相ペプチド合成機の商業的成功に寄与してきたが、合成時間の低減は、依然として顕著な障壁であり続けている。当該分野における３０年間を超える研究および開発は、迅速合成技法を生み出すことができなかった。ＦｍｏｃまたはＢｏｃ保護基を使用した典型的な連続的固相ペプチド合成は、単一のアミノ酸の付加に３０〜９０分間を必要とする。本発明の文脈により、合成時間を減少させるための長年にわたる切実な必要に取り組む、ある特定のプロセスおよび技法が発見された。例えば、迅速な合成時間は、混合、加熱および／または圧力降下制御のために特殊化された技法を用いることにより達成することができる。
アミノ酸付加サイクルにおけるある特定のステップは、試薬の混合を必要とし得る。一部の従来システムにおいて、試薬は、固定化されたペプチドへの曝露前に長時間混合され、これにより、固定化されたペプチドへの曝露に先立つ望ましくない副反応および／または試薬分解を生じ得る。場合によっては、副反応および／または分解は、アミノ酸付加サイクルにおける１または複数のステップ（例えば、アミノ酸曝露ステップ）の収率および速度論に有害な影響を与える。一部の従来システムにおいて、試薬は、固定化されたペプチドの存在下で混合され、これにより、例えば、より遅い反応速度論を生じ得る。急速ペプチド合成を達成するための一技法は、図１に示す通り、固定化されたペプチドへの到着に先立つ、但し、それに至るまで短い時間量内での試薬の流れの統合に関与し得る。
一部の実施形態において、アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスは、アミノ酸を含む第１の流れを流すステップと、アミノ酸活性化剤（例えば、アルカリ性液体、カルボジイミドおよび／またはウロニウム活性化剤）を含む第２の流れを流すステップとを含む。例えば、振り返って図１を参照すると、試薬リザーバ２５は、アミノ酸を含むことができる。試薬リザーバ２６は、一部のこのような実施形態において、アミノ酸活性化剤を含むことができる。第１および第２の流れが統合されて、活性化されたアミノ酸を含む混合された流体を形成することができる。例えば、図１を参照すると、リザーバ２５由来のアミノ酸を第１の流れ３０において流し、アミノ酸活性化剤を第２の流れ３２において流すことができる。第１の流れ３０および第２の流れ３２は、例えば、流れ４０のポイント３４において混合することができる。混合された流体は、アミノ酸活性化剤によるアミノ酸の活性化による、活性化されたアミノ酸を含むことができる。
ある特定の実施形態において、アミノ酸が活性化された後に、固定化されたペプチドは、比較的短い期間内で、混合された流体に曝露され得る。例えば、ある特定の実施形態において、固体支持体に固定化された複数のペプチドは、第１および第２の流れを統合して混合された流体を形成するステップの後の約３０秒以内（または約１５秒以内、約１０秒以内、約５秒以内、約３秒以内、約２秒以内、約１秒以内、約０．１秒以内または約０．０１秒以内）に、混合された流体に曝露され得る。
ある特定の実施形態において、試薬の流れの統合は、本明細書に記載されているアミノ酸付加サイクルにおいて使用することができる。例えば、固体支持体に固定化されたペプチドへの活性化されたアミノ酸の曝露に先立つ約３０秒以内に、アミノ酸を含む第１の流体の流れおよびアミノ酸活性化剤を含む第２の流れが統合されて、活性化されたアミノ酸を含む混合された流体を形成することができる。２回以上のアミノ酸付加サイクルが行われる一部の実施形態において、１回または複数のアミノ酸付加サイクル（例えば、第１および第２のアミノ酸付加サイクル）は、固体支持体へのアミノ酸の曝露に先立つ約３０秒以内に、アミノ酸を含む第１の流体の流れおよびアミノ酸活性化剤を含む第２の流れを統合して、活性化されたアミノ酸を含む混合された流体を形成するステップを含むことができる。試薬の流れの統合は、付加サイクルにおけるいずれか適したステップに関連して使用することができ、アミノ酸付加サイクルにおける１または複数のステップに関連して使用することができることを理解されたい。
一般に、流れは、当業者に公知のいずれか適した技法を使用して統合することができる。一部の実施形態において、流れは、第１の流れおよび第２の流れを、単一の流れへと実質的に同時に流すことにより（例えば、流れを流す統合チャネルにより）統合することができる。他の統合方法を使用することもできる。
迅速な合成時間を達成するための別の技法は、リアクタへの到着に先立つ、但し、それに至るまでの短い期間内における流れの加熱に関与し得る。リアクタに加熱された流れを供給することは、リアクタにおいて生じるプロセスの速度論を変更することができる。例えば、加熱された流れへと固定化されたペプチド、固体支持体または他の合成構成要素を曝露することは、アミノ酸付加プロセスの反応速度論および／または拡散速度論を変更することができる。例えば、活性化されたアミノ酸を含む加熱された流れへのペプチドの曝露は、アミノ酸がペプチドに付加される速度を増加させることができる。一部の実施形態において、リアクタへの到着に先立つ、但し、それに至るまで短い期間内における流れの加熱は、リアクタに補助的な熱（即ち、１種または複数の予熱された流れに由来しない熱）を供給する必要を実質的に低減または排除することができる。場合によっては、リアクタへと供給される熱の大部分または実質的に全ては、予熱された流れに起源を有する。例えば、一部の実施形態において、予熱された流れ（複数可）に起源を有する、リアクタの加熱に使用される熱エネルギーのパーセンテージは、約５０％を超えるもしくはこれに等しい、約６０％を超えるもしくはこれに等しい、約７０％を超えるもしくはこれに等しい、約８０％を超えるもしくはこれに等しい、約９０％を超えるもしくはこれに等しい、約９５％を超えるもしくはこれに等しいまたは約９９％を超えるもしくはこれに等しくなることができる。一部のこのような実施形態において、この仕方におけるシステムの加熱は、望ましい反応温度へとリアクタ、固定化されたペプチド、固体支持体、活性化されたアミノ酸、脱保護試薬、洗浄流体および／または他の合成構成要素を加熱するために必要とされる時間を低減することができる。
よって、一部の実施形態において、アミノ酸残基をペプチドに付加するためのプロセスは、加熱されたアミノ酸が固定化されたペプチドへと曝露される前に、活性化されたアミノ酸の温度が、少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃および／または約４５０℃未満もしくはこれに等しい、約３００℃未満もしくはこれに等しい、約２００℃未満もしくはこれに等しい、約１００℃未満もしくはこれに等しい、および／または約７５℃未満もしくはこれに等しい）増加されるように、活性化されたアミノ酸を含む流れを加熱するステップを含むことができる。ある特定の実施形態において、流れの内容物が固定化されたペプチドに曝露される前に、流れの内容物の温度が、少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃および／または約４５０℃未満もしくはこれに等しい、約３００℃未満もしくはこれに等しい、約２００℃未満もしくはこれに等しい、約１００℃未満もしくはこれに等しい、および／または約７５℃未満もしくはこれに等しい）増加されるように、他のいずれかの構成要素（例えば、洗浄剤、脱保護剤または他のいずれかの構成要素）を含む流れを加熱することができる。場合によっては、加熱ステップ（例えば、活性化されたアミノ酸の加熱および／または固定化されたペプチドへと輸送される流れ内の他のいずれかの構成要素の加熱）は、固定化されたペプチドへの流れの内容物（例えば、加熱された活性化されたアミノ酸）の曝露の約３０秒以内（または約１５秒以内、約１０秒以内、約５秒以内、約３秒以内、約２秒以内、約１秒以内、約０．１秒以内または約０．０１秒以内）に行うことができる。一部のこのような実施形態において、また、図１の例示的な実施形態に図解されている通り、このような加熱は、固定化されたペプチドの上流の場所を加熱することにより達成することができる。一部のこのような実施形態において、アミノ酸の加熱は、固定化されたペプチドへのアミノ酸の曝露の少なくとも約０．０１秒、少なくとも約０．０５秒、少なくとも約０．１秒、少なくとも約０．５秒、少なくとも約１秒、少なくとも約５秒または少なくとも約１０秒前に始まる。ある特定の実施形態において、アミノ酸は、固定化されたペプチドにアミノ酸が曝露される少なくとも約０．１秒、少なくとも約１秒、少なくとも約５秒または少なくとも約１０秒前に、少なくとも約１℃（または少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約５０℃および／または約４５０℃未満もしくはこれに等しい、約３００℃未満もしくはこれに等しい、約２００℃未満もしくはこれに等しい、約１００℃未満もしくはこれに等しい、および／または約７５℃未満もしくはこれに等しい）加熱される。
振り返って図１を参照すると、例えば、システム５は、その中で流れ４０の内容物を加熱することができる加熱帯４２を含むことができる。加熱帯４２は、ヒーターを含むことができる。一般に、いずれか適した加熱方法を使用して、流れの温度を増加させることができる。本明細書に記載されているある特定のシステムおよび方法の利点の１つは、単純および／または安価な加熱方法および／または装置を使用する能力である。例えば、加熱帯４２は、液体槽（例えば、ウォーターバス）、抵抗性ヒーター、ガス対流に基づく加熱要素または他のいずれかの適したヒーターを含むことができる。一部の実施形態において、入口の流れ（および／またはリアクタ）の加熱に使用される熱エネルギーの比較的低いパーセンテージは、電磁放射（例えば、マイクロ波放射）に起源を有することができる。例えば、一部の実施形態において、電磁放射に起源を有する、入口の流れ（複数可）および／またはリアクタの加熱に使用される熱エネルギーのパーセンテージは、約２０％未満もしくはこれに等しい、約１５％未満もしくはこれに等しい、約１０％未満もしくはこれに等しい、約５％未満もしくはこれに等しい、約１％未満もしくはこれに等しいまたは約０．５％未満もしくはこれに等しくなることができる。一部の実施形態において、入口の流れ（複数可）および／またはリアクタは、電磁放射を使用せずに加熱することができる。ある特定の実施形態において、マイクロ波放射に起源を有する、入口の流れ（複数可）および／またはリアクタの加熱に使用される熱エネルギーのパーセンテージは、約２０％未満もしくはこれに等しい、約１５％未満もしくはこれに等しい、約１０％未満もしくはこれに等しい、約５％未満もしくはこれに等しい、約１％未満もしくはこれに等しいまたは約０．５％未満もしくはこれに等しくなることができる。一部の実施形態において、入口の流れ（複数可）および／またはリアクタは、マイクロ波放射を使用せずに加熱することができる。場合によっては、加熱機構は、固定化されたペプチドの短い距離内、例えば、約５メートル以内、約１メートル以内、約５０ｃｍ以内または約１０ｃｍ以内となり得る。
図１に図解されている実施形態を含む一部の実施形態において、アミノ酸の加熱およびアミノ酸活性化剤（例えば、アルカリ性液体、カルボジイミドおよび／またはウロニウム活性化剤）とアミノ酸との統合の両方は、固定化されたペプチドへのアミノ酸の接触の前およびそれに至るまで比較的短い時間内で行うことができる。アミノ酸の加熱は、アミノ酸活性化剤を含む流れとアミノ酸を含む流れとの統合の前、最中および／または後に行うことができる。
ある特定の実施形態において、固定化されたペプチドに曝露される直前での流れの加熱は（固定化されたペプチドへと流れの内容物を輸送するかなり前での流れの加熱とは対照的に）、流れにおける１種または複数の試薬（例えば、ペプチドに付加しようとするアミノ酸および／または脱保護試薬等）の熱分解を最小化することができる。当然ながら、上に記述されている通り、流れ構成要素の到着に先立つ流れの加熱は、反応または洗浄ステップを行うことができるスピードを増強することができる。
一部の実施形態において、加熱ステップは、本明細書に記載されているアミノ酸付加サイクルにおいて使用することができる。例えば、活性化されたアミノ酸の温度が少なくとも約１℃上昇されるような、活性化されたアミノ酸の加熱は、固定化されたペプチドへの活性化されたアミノ酸の曝露に先立ちその約３０秒以内に（または他の箇所で言及されている他の時間範囲のいずれか以内に）行うことができる。アミノ酸付加サイクルのいずれかのステップ（例えば、脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップ、活性化されたアミノ酸の除去ステップ）に先立ちその３０秒以内に加熱ステップを使用することができることを理解されたい。一部の実施形態において、アミノ酸付加サイクルは、２回以上の加熱ステップを含むことができる。例えば、加熱ステップは、脱保護試薬曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の曝露ステップの前に行うことができる。
２回以上のアミノ酸付加サイクルが行われるある特定の実施形態において、１回または複数のアミノ酸付加サイクル（例えば、第１および第２のアミノ酸付加サイクル）は、ステップ（例えば、脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップ、活性化されたアミノ酸の除去ステップ）の実行に先立ちその約３０秒以内に（または他の箇所で言及されている他の時間範囲のいずれか以内に）１回または複数の加熱ステップを含むことができる。例えば、１回または複数のアミノ酸付加サイクル（例えば、第１および第２のアミノ酸付加サイクル）は、固定化されたペプチドへの活性化されたアミノ酸の曝露に先立ちその約３０秒以内に（または他の箇所で言及されている他の時間範囲のいずれか以内に）、活性化されたアミノ酸の加熱を含むことができる。一般に、加熱ステップは、付加サイクルにおけるいずれかの適したステップに関連して使用することができ、いずれかの個々の付加サイクルの１種もしくは複数のステップまたは一連の付加サイクルの全ステップに関連して使用することができる。
上に記す通り、一部の実施形態において、流れの加熱は、流れの内容物の温度を少なくとも約１℃、少なくとも約２℃、少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約２５℃または少なくとも約５０℃上昇させることができる（例えば、流れ内のアミノ酸の温度を増加させることができる）。加熱後の流れの温度が、異なる付加サイクルステップおよび／または付加サイクルで同じまたは異なり得ることを理解されたい。場合によっては、加熱後の流れの温度は、１または複数の付加サイクルステップおよび／または付加サイクルで同じとなり得る。場合によっては、流れの加熱は、流れの内容物の温度を約４５０℃未満もしくはこれに等しく、約３００℃未満もしくはこれに等しく、約２００℃未満もしくはこれに等しく、約１００℃未満もしくはこれに等しくまたは約７５℃未満もしくはこれに等しく増加させることができる（例えば、流れ内のアミノ酸の温度を増加させることができる）。上に参照した範囲の組合せも可能である（例えば、少なくとも約１℃かつ約１００℃未満またはこれに等しい、少なくとも約１℃かつ約４５０℃未満またはこれに等しい等）。
ある特定の実施形態において、固定化されたペプチドにわたる圧力降下を低減させるためのシステムおよび方法を使用して、ペプチド合成のスピードを改善することができる。一部の実施形態において、固定化されたペプチドにわたる試薬の流量は、ペプチド合成のスピードに影響を与え得る。例えば、アミノ酸付加サイクルにおける１種または複数のステップ（例えば、脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップ、活性化されたアミノ酸の除去ステップ）に必要とされる時間は、流量増加と共に減少し得る。一般に、高い流量の使用は、固定化されたペプチド付近の試薬の濃度が、低い流量が用いられる場合に観察される濃度ほど酷くは枯渇しないことを確実にする。多くの伝統的な連続的固相ペプチド合成システムにおいて、流量は、リアクタにわたる圧力降下によって限定される。圧力降下は、合成における固体支持体の拡大によりおよび／またはプロセス機器の不適切なサイジングにより生じ得る。ある特定の実施形態において、アミノ酸付加サイクルにおける固体支持体を横切る圧力降下は、サイクルが行われる期間の約５％超（または約１％超）において約７００ｐｓｉを超え得ない。例えば、ある特定の実施形態において、アミノ酸付加サイクルの各ステップ（例えば、脱保護試薬曝露ステップ、脱保護試薬除去ステップ、活性化されたアミノ酸の曝露ステップおよび活性化されたアミノ酸の除去ステップ）の間において、固体支持体を横切る圧力降下は、ステップが行われる期間の約５％超（または約１％超）において約７００ｐｓｉを超え得ない。２回以上の付加サイクルが行われる実施形態において、１回または複数の付加サイクル（例えば、第１および第２のアミノ酸付加サイクル）における圧力降下は、サイクルが行われる期間の約５％超（または約１％超）において約７００ｐｓｉを超え得ない。
一部の実施形態において、アミノ酸付加サイクルの各ステップおよび／または１回もしくは複数の付加サイクルの間において、リアクタにわたる圧力降下は、ステップが行われる期間の約５％超（または約１％超）において約７００ｐｓｉ、約６００ｐｓｉ、約５００ｐｓｉ、約４００ｐｓｉ、約２５０ｐｓｉ、約１００ｐｓｉまたは約５０ｐｓｉを超え得ない。
ある特定の実施形態において、リアクタにわたる圧力降下は、望ましいアスペクト比を有するプロセス容器（例えば、充填カラムのカラム）を使用することにより低減させることができる。一般に、プロセス容器のアスペクト比は、容器の長さ（容器を通る流動の方向に実質的に平行）の容器の最短の幅（容器の長さに垂直に測定される）に対する比である。例として、円柱状容器の場合、アスペクト比は、円柱の高さの円柱の横断面直径に対する比となる。振り返って図１を参照すると、例えば、リアクタ１０のアスペクト比は、寸法Ａの長さの寸法Ｂの長さに対する比（即ち、Ａ：Ｂ）となる。一部の実施形態において、リアクタのアスペクト比は、約２０：１未満もしくはこれに等しく、約１０：１未満もしくはこれに等しく、約５：１未満もしくはこれに等しく、約３：１未満もしくはこれに等しく、約２：１未満もしくはこれに等しく、約１：１未満もしくはこれに等しく、約０．５：１未満もしくはこれに等しく、約０．２：１未満もしくはこれに等しくまたは約０．１：１未満もしくはこれに等しく（および／または、ある特定の実施形態において、僅か０．０１：１またはそれより低く）なることができる。
一部の実施形態において、高収率を有する、ならびに／または二重取り込みが限定されたおよび／もしくは全くない比較的短い付加サイクルは、本明細書に記載されている技法のうち１種または複数を用いることにより達成することができる。例えば、本明細書に記載されているある特定のシステムおよび方法は、アミノ酸曝露ステップ（即ち、固定化されたペプチドに活性化されたアミノ酸を曝露するステップ）が、約１分間もしくはそれ未満（例えば、約３０秒間もしくはそれ未満、約１５秒間もしくはそれ未満、約１０秒間もしくはそれ未満、約７秒間もしくはそれ未満または約５秒間もしくはそれ未満、および／または、ある特定の実施形態において、僅か１秒間またはそれ未満）で行われる（例えば、高収率を達成しつつおよび／または本明細書に記載されている程度のいずれかまで二重取り込みを回避しつつ）ことを可能にする。場合によっては、本明細書に記載されているある特定のシステムおよび方法は、脱保護試薬除去ステップおよび／または活性化されたアミノ酸の除去ステップが、約２分間またはそれ未満（例えば、約１．５分間もしくはそれ未満、約１分間もしくはそれ未満、約４５秒間もしくはそれ未満、約３０秒間もしくはそれ未満、約１５秒間もしくはそれ未満、約１０秒間もしくはそれ未満、約５秒間もしくはそれ未満および／または、ある特定の実施形態において、僅か１秒間もしくはそれ未満）で行われることを可能にする。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されているある特定のシステムおよび方法は、脱保護試薬曝露ステップ（即ち、脱保護試薬に固定化されたペプチドを曝露するステップ）が、約２０秒間またはそれ未満（例えば、約１５秒間もしくはそれ未満、約１０秒間もしくはそれ未満、約８秒間もしくはそれ未満、約５秒間もしくはそれ未満、約１秒間もしくはそれ未満および／または、ある特定の実施形態において、僅か０．５秒間もしくはそれ未満）で行われることを可能にする。
ある特定の事例において、ペプチド合成に必要とされる時間は、保護基の選択に影響され得る。例えば、Ｆｍｏｃ保護基の使用は、より長い合成サイクル時間を必要とすることが一般に理解されている。しかし、Ｆｍｏｃ保護基化学が用いられている場合であっても、本明細書に記載されているシステムおよび方法は、迅速なアミノ酸付加の実行に使用することができる。一部の実施形態において、使用されている保護基の種類にかかわらず、アミノ酸付加サイクルのための合計時間は少なくなることができる。
一般に、当業者に公知のいずれかの保護基を使用することができる。保護基（例えば、Ｎ末端保護基）の非限定例として、フルオレニルメチルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）、カルボキシベンジルおよび感光性保護基が挙げられる。ある特定の実施形態において、固定化されたペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル保護基を含む。一部の実施形態において、固定化されたペプチドは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を含む。
他の箇所に記載されている通り、固定化されたペプチドにアミノ酸を曝露する前に、アミノ酸活性化剤を使用して、アミノ酸を活性化または活性化を完了することができる。いずれかの適したアミノ酸活性化剤を使用することができる。ある特定の実施形態において、アミノ酸活性化剤は、アルカリ性液体を含む。アミノ酸活性化剤は、一部の実施形態において、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）その他等、カルボジイミドを含む。ある特定の実施形態において、アミノ酸活性化剤は、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＢＴＵ）；２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）；１−［（１−（シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルフォリノ）］ウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）；その他等、ウロニウム活性化剤を含む。
他の箇所に記載されている通り、ペプチドは、固体支持体に固定化することができる。一般に、本明細書に記載されている付加サイクルのいずれかにより、いかなる固体支持体が使用されてもよい。固体支持体材料の非限定例として、ポリスチレン（例えば、細孔性ポリスチレン樹脂、メソ多孔性ポリスチレン樹脂、マクロ多孔性ポリスチレン樹脂等、樹脂形態の）、ガラス、多糖（例えば、セルロース、アガロース）、ポリアクリルアミド樹脂、ポリエチレングリコールまたはコポリマー樹脂（例えば、ポリエチレングリコール、ポリスチレン等を含む）が挙げられる。
固体支持体は、いずれかの適した形態の因子を有することができる。例えば、固体支持体は、ビーズ、粒子、繊維の形態または他のいずれかの適した形態の因子となり得る。
一部の実施形態において、固体支持体は、多孔性となり得る。例えば、一部の実施形態において、マクロ多孔性材料（例えば、マクロ多孔性ポリスチレン樹脂）、メソ多孔性材料および／または細孔性材料（例えば、細孔性ポリスチレン樹脂）を固体支持体として用いることができる。用語「マクロ多孔性」、「メソ多孔性」および「細孔性」は、ペプチド合成のための固体支持体に関して使用される場合、当業者に公知のものであり、国際純正および応用化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（ＩＵＰＡＣ）Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ、バージョン２．３．２、２０１２年８月１９日（非公式には、「Ｇｏｌｄ Ｂｏｏｋ」として公知）におけるそれらの記載と一貫した様式で本明細書において使用される。一般に、細孔性材料は、約２ナノメートル未満の横断面直径を有する孔を有する材料を含む。メソ多孔性材料は、約２ナノメートル〜約５０ナノメートルの横断面直径を有する孔を有する材料を含む。マクロ多孔性材料は、約５０ナノメートルを超えるおよび１マイクロメートルもの大きさの横断面直径を有する孔を有する材料を含む。
本明細書に記載されている本発明のシステムおよび方法の利点の１つは、性能を劣化させず標準固体支持体材料と共に使用できることである。例えば、ある特定の実施形態において、標準市販ポリスチレン樹脂支持体を使用することができる。多くの以前のシステムにおいて、このような支持体は、流動に基づく固相ペプチド合成システムにおいて使用されると、圧力降下の増加を引き起こし、崩壊した。合成において樹脂が膨張するにつれ、ますます崩壊の可能性が高くなり、これは、樹脂にわたる圧力降下の増加を引き起こし、一定の流量を維持するために加えられる圧力の増加を必要とする。加えられる圧力の増加は、樹脂のより酷い崩壊をもたらし、流体に加えられた圧力が繰り返し増加されることになる正のフィードバック効果をもたらし得る。十分な高圧において、樹脂は、その画定に使用されるフリットまたは他のシステムから押し出ることができる。本明細書に記載されているシステムおよび方法を使用して、樹脂（標準ポリスチレン樹脂および他の標準樹脂を含む）が、合成において崩壊しないように、あるいは上述の正のフィードバック効果を生じない程度までしか崩壊しないように、圧力降下を管理して、より安定的かつ制御可能なシステムをもたらすことができる。ある特定の実施形態において、固体支持体は、充填カラム内に含有される。
一般に、本明細書に記載されている方法およびシステムを使用して、任意のペプチドおよび／またはタンパク質を合成することができる。本明細書に記載されている方法および／またはシステムを使用して合成することのできるペプチドおよび／またはタンパク質の非限定例として、グルカゴン様ペプチド（例えば、ＧＬＰ−１）、エキセナチド、リラグルチド、ＧＬＰ−１類似体（例えば、ＺＰ１０）、プラムリンチド（Ｐｒａｍｌｉｎｉｔｉｄｅ）、ペプチドＹＹ、グルカゴン、テデュグルチド、デルミチド、カルシトニン（例えば、サケカルシトニン）、副甲状腺ホルモン、ボルテゾミブ、シレンジタイド、リュープロレリン、ヒストレリン、ゴセレリン、スティミュバックス、プリモバックス、ネシリチド、エプチフィバチド、ビバリルジン、イカチバント、ロチガプチド、シクロスポリン、ＭＰＢ８２９８、オクトレオチド、ランレオチド、デスモプレシン、リプレシン、テルリプレシン、オキシトシン、アトシバン、エンフビルチド、サイマルファシン、ダプトマイシン（Ｄａｐｔａｍｙｃｉｎ）、デントニン、バシトラシン、グラミシジン（Ｇｒａｍｉｄｉｃｉｎ）、コリスチン、ペキシガナン、オミガナン、カスポファンギン、ミカファンギン、アニデュラファンギン、ヒスタチン、ラクトフェリン、コノトキシン、ネミフィチド、ナトリウム利尿ペプチド、バソプレシン、バソプレシン類似体（例えば、Ａｒｇバソプレシン、Ｌｙｓバソプレシン）、ジコノチド、エキノキャンディン、サイマルファシンおよびソマトスタチン類似体（例えば、オクトレオチド、ランレオチド）が挙げられる。糖尿病、胃腸病学的障害、整形外科的障害（例えば、骨粗鬆症）、がん、心血管疾患、免疫学的障害（即ち、自己免疫障害）、先端巨大症、遺尿症、感染症（例えば、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症）および中枢神経系障害等が挙げられるがこれらに限定されない疾患の治療のためのペプチドおよび／またはタンパク質は、本明細書に記載されている方法およびシステムを使用して合成することができる。
本明細書において、用語「ペプチド」は、本技術分野におけるその通常の意義を有し、水の形式的損失による一方のカルボニル炭素からもう一方の窒素原子への共有結合の形成による、２個またはそれを超えるアミノカルボン酸分子（同じまたは異なる）に由来するアミドを指すことができる。「アミノ酸残基」も、本技術分野におけるその通常の意義を有し、ペプチド、別のアミノ酸またはアミノ酸残基と組み合わされた後のアミノ酸（単一のアミノ酸として、あるいはペプチドの一部として）の組成を指す。一般に、アミノ酸を別のアミノ酸またはアミノ酸残基と組み合わせるときに、水が除去され、アミノ酸の残りをアミノ酸残基と呼ぶ。用語「アミノ酸」も、本技術分野におけるその通常の意義を有し、タンパク質生成および非タンパク質生成アミノ酸を含むことができる。
次の実施例は、本発明のある特定の実施形態を図解するよう企図されているが、本発明の全範囲を例証するものではない。
例えば、保護基としてＦｍｏｃを利用する標準固相ペプチド合成方法は、各アミノ酸残基を取り込むために約６０〜１００分間を必要とする場合があり、一部の特殊化された手順は、複雑なマイクロ波システムを使用して、これを１残基当たり約２０分間に低減させる。本実施例は、マイクロ波照射なしで、手動制御下において１０分間未満で（例えば、５分毎に、３分毎に、２分毎に）または自動制御下において１．８分間でアミノ酸残基を取り込む、フロープラットフォームの開発について記載する。
本明細書に記載されている流動に基づくプラットフォームは、流動に基づくアプローチを活用することにより、マイクロ波支援または他の急速ペプチド合成機により現在可能であると考えられる速度をはるかに超えてＳＰＰＳ化学をさらに加速する。高濃度試薬を絶えず供給することに加えて、流動に基づくプラットフォームは、標準およびマイクロ波支援アプローチを妨げ得る多数の顕著な障害物を克服する。第一に、完全に密封されたリアクタおよび熱交換器を温度制御された槽に浸漬することができ、これにより、樹脂床に達する直前に、一貫したおよび制御された様式で溶媒および試薬が加熱されることが可能となる。急速予熱は、ある特定の実施形態において、所望の温度に速く達しながら、試薬の熱分解を回避するために重要である。しかし、これは、バッチシステムにおいて極めて困難である。第二に、フロープラットフォームは、サイクル時間を増加させることなく縮尺することができる。第一から第二世代リアクタへの移行において実証される通り、直径および流量の増加は、合成を遅くすることなく最大スケールを効果的に増加させる。第三に、適切な質量移動をもたらすために撹拌が必要とされず、失敗を導きがちな可動部を排除し、スケールアップを容易にする。第四に、二重カップリング、二重脱保護またはカップリング効率の比色検査を行うことなく、高品質ペプチドを速く得ることができる。最後に、バッチ合成の多くの場合遅い自動化とは対照的に、本システムの自動化は、より迅速なサイクル時間を可能にし得る。
（実施例１）
本実施例は、各アミノ酸付加サイクルが５分間未満で完了した、急速Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成のための流動に基づくプラットフォームについて記載する。本実施例において、小型のフリットプラスチックチューブ内に画定されている樹脂を通過する流体の一定の流れの下で、アミノ酸付加のための各ステップ（例えば、アミド結合形成、洗浄およびＮ末端脱保護）を行った。流動方法は、一般的に使用されているバッチ方法とは対照的に、溶媒および試薬の一貫した急速予熱、添加および除去を可能にした。溶媒および試薬の一貫した急速予熱、添加および除去は、３０秒間のアミド結合形成ステップを含む５分間のサイクル時間を可能にした。二重カップリングまたは二重脱保護を為すことなく、多数のモデルペプチドを調製した。加えて、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって示される優れた収率および高純度が達成された。このアプローチは、３個のポリペプチドセグメントからの５８残基のタンパク質の合成にも適用した。従来のＦｍｏｃ方法よりも１０倍迅速な、２．３時間で２７残基のペプチドの最長断片を調製した。様々なプロセシングステップの自動化、流量の増加、不必要に長い洗浄時間の低減およびより小さいアスペクト比のリアクタの使用が、本明細書に報告される合成時間を実質的に低減させると考えられる。
図２Ａに示す通り、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ポンプを使用して、ピペリジン脱保護溶液またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）洗浄溶媒のいずれかをリアクタに送達した。手動で発動される三方弁を使用して、いずれの試薬をリアクタに送達するか選択した。ＨＰＬＣポンプ出口を、ルアーロック急速継ぎ手（ｑｕｉｃｋ ｃｏｎｎｅｃｔ）を介してリアクタに取り付けた。ルアーロック急速継ぎ手およびリアクタの間に、熱交換器または「予熱ループ」として機能する８フィートの１／１６”ＯＤ×０．０３”ＩＤチューブを設置した。カップリングステップのために、急速継ぎ手をシリンジポンプへと手動で動かし、活性化されたアミノ酸の溶液を送達した。このステップを自動化することにより、本明細書に報告されているものよりもさらに迅速な実行を達成することができることが考えられる。リアクタ流出液をＵＶ検出器に通過させて、Ｆｍｏｃアミノ酸が強く吸収する領域である３０４ｎｍにおける吸光度を連続的にモニターした。構築が単純および容易となるようリアクタを設計した。入口および出口としてＳｗａｇｅｌｏｋ異型ユニオン（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｏｎ）を備える３．５”長ペルフルオロアルコキシチューブによる１／４”内径を使用した。外径の１／４を有する短いチューブ片を使用して、出口にフリットを配置した。図２Ｂから分かる通り、出口フィッティングの設置ならびにフェルールおよびチューブの同時発生的圧縮は、フリットを適所に密封した。リアクタの総容積は、約２．５ｍｌであった。この設計は、最大１００ｍｇの樹脂を保持し、最大２７残基の長さのペプチドの調製に使用された。
この流動に基づくＳＰＰＳシステムによるＦｍｏｃ ＳＰＰＳの実行可能性を検証するために、１００ｍｇの樹脂を使用して、モデルペプチドＦｍｏｃ−ＡＬＦＡＬＦＡ−ＣＯＮＨ２を０．１ｍｍｏｌスケールで合成した。初期見積に基づき、アミノ酸付加サイクルのための出発点として、１０ｍＬ／分における２分間のＤＭＦ洗浄、６ｍＬ／分における２分間のＦｍｏｃ脱保護ステップおよびさらにもう一度のＤＭＦ洗浄および１ｍＬ／分で送達される活性化されたアミノ酸との６分間の室温カップリングを選択した。この一連の流れは、１残基当たり１２分間での効率的ペプチド合成を可能にした。粗ペプチドの逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣトレースを図２Ｃに示す。
このアプローチを検証した後に、改善された洗浄ステップ、Ｆｍｏｃ除去およびカップリング時間を決定した。その後の試験は全て、副生物の形成を有意に増加させることなくサイクル時間を低減させるために６０℃で行った。より高い温度が、合成成果を改善し得る、および／または各アミノ酸付加サイクルに必要とされる合計時間を低減し得ることが考えられる。本実施例におけるあらゆるその後の実験において使用した最終合成タイムラインを図３Ｃに示す。最終合成タイムラインは、１０ｍＬ／分における２分間のＤＭＦ洗浄、１０ｍＬ／分における２０秒間のＦｍｏｃ脱保護ステップ、さらにもう一度の２分間ＤＭＦ洗浄および１２ｍＬ／分で送達される活性化されたアミノ酸との３０秒間のカップリングステップを有する。ペプチドＡＣＰ（６５−７４）を合成することによりこのアプローチを試験した。ＡＣＰ（６５−７４）は、調製が困難であると考慮されたため、このペプチドは、流動に基づくＳＰＰＳプラットフォームを検証するためのモデルとして機能した。調製がより容易なペプチドを合成する場合、合成時間の実質的低減が達成され得ることが考えられる。
従来のシステムにおいて、ＡＣＰ（６５−７４）の合成における主要な合成不純物は、クロマトグラフィーによる分解能を有するＶａｌ欠失である。流動に基づくＳＰＰＳプラットフォーム方法論によるＡＣＰ（６５−７４）の合成のためのＬＣＭＳデータを、２種の対照と共に図４Ａ〜図４Ｄに示す。上述のプロトコールおよびＨＡＴＵカップリング剤の使用により、僅かなＶａｌ欠失生成物が観察された。ＨＢＴＵを使用する場合、より多くのＶａｌ欠失が観察され、以前の報告と一貫する。流動に基づくＳＰＰＳプラットフォームにより、但し室温で合成されたＡＣＰ（６５−７４）は、大きなＶａｌおよびＧｌｎ欠失を示し、温度が重要であることを確認した。室温合成および類似のバッチ合成由来の生成物組成の間に大きな差は観察されなかった。２種の追加的な「困難な」ペプチドである、コノトキシンバリアントおよびＨＩＶ−１プロテアーゼ断片も合成した。ＬＣＭＳデータを図５Ａ〜図５Ｂに示す。これらのペプチドは両者共に、活性化においてラセミ化するために観察されたシステイン残基を含有した。したがって、ペプチドＧＣＦを使用したモデル試験を行った。モデル試験において、図６Ａ〜図６Ｅに示す通り、１％未満のジアステレオマーを産生したいくつかの条件が見出された。このレベルのラセミ化は、Ｆｍｏｃプロトコールの文献と一貫する。
システインのための修飾されたカップリング条件を使用して、コノトキシンバリアントおよびＨＩＶ−１プロテアーゼ断片を０．１ｍｍｏｌスケールで調製した。８９ミリグラム（５３％）の粗コノトキシンおよび９０ｍｇ（４３％）の粗ＨＩＶ−Ｉプロテアーゼ断片を単離した。合成タンパク質の調製におけるフロープラットフォームの有用性を探索するために、プロテインＡのＺドメインに基づく５８残基のトリヘリックスタンパク質（アフィボディと称される）を調製した。図７Ａに示す合成戦略は、天然の化学的ライゲーションにおける使用のためのチオエステル前駆体としてペプチド−ヒドラジドを使用した。ペプチドヒドラジドをＮａＮＯ２により酸化して、Ｃ末端ペプチド−アジドを形成することができ、これはチオールと反応して、ペプチドチオエステルを形成することができる。粗合成ペプチドのためのＬＣＭＳデータを図７Ｂ〜図７Ｄに示す。Ｂｏｃ ｉｎ−ｓｉｔｕ中和方法を使用してこれらのペプチドのバリアントも調製したところ、これらのペプチドが、同様の粗品質であることが判明した（図８Ａ〜図８Ｆ）。保持時間シフトは、異なるクロマトグラフィー条件ならびにＢｏｃおよびＦｍｏｃ戦略による天然の化学的ライゲーションのために調製されたペプチドにおける僅かな変動によるものである。アフィボディのための各ペプチドを精製し（図９）、次に、アフィボディを合成し、精製後に高度に純粋な全長アフィボディを単離した（図７Ｅ）。
バッチモードにおいてこのプロトコールを実行することが可能であったが、流動に基づくプラットフォームは、多数の顕著な障害物を克服した。第一に、完全に密封されたリアクタおよび予熱ループを温度制御された槽に浸漬し、これにより、樹脂床に達する直前に一貫した制御された様式で試薬が加熱されることが可能となった。これは、一部のバッチシステムでは困難であると思われる。第二に、溶媒および試薬の送達のための低容積リアクタ（約２．５ｍＬ）および細いチューブの使用は、僅か２０ｍＬの溶媒による効率的な洗浄を可能にした。対照的に、バッチモード自動および手動合成は、典型的に、大容積の溶媒（洗浄につき約７０ｍＬ）を使用する。第三に、低コストで、機械またはガラスショップ支持体を用いることなく、一般実験機器からフロープラットフォームを組み立てた。第四に、二重カップリング、二重脱保護、比色検査または樹脂混合を為すことなく、高品質ペプチドを速く得た。ＡＣＰ（６５−７４）による試験において、Ｖａｌの二重カップリングおよび先行するＧｌｎの二重脱保護の後に、Ｖａｌ欠失ペプチドの減少は観察されなかった。これらの追加的なステップは、多くの場合、バッチモード合成において用いられる。最後に、流動に基づくＳＰＰＳシステムは、リアクタの直径を増加させることにより、より大規模な合成スケールに適応させることができた。例えば、リアクタ直径を倍加させ、得られたリアクタを使用して、正確に同じプロトコールを使用して０．２ｍｍｏｌスケールでＡＣＰ（６５−７４）を合成した。合成スケールを増加させるための別の選択肢は、リアクタの長さを単純に増加させることである。しかし、この戦略は、背圧を有意に増加させ、これにより合成の際に困難が生じ得る。本実施例における流動に基づくＳＰＰＳプラットフォームは、ポリペプチドの急速Ｆｍｏｃ合成を可能にした。６０℃における流動下で、アミド結合形成およびＦｍｏｃ除去は、迅速（数秒以内）であり、反応時間増加により改善しなかったことが判明した。本実施例における流動に基づくＦｍｏｃシステムを使用して、１営業日で３個のアフィボディセグメントを合成および開裂することができた。対照的に、１５分間のサイクル時間による最適化されたＢｏｃ ｉｎ−ｓｉｔｕ中和方法を使用した同様のペプチドの産生は、３日間超を必要とした。加えて、精製ペプチドをライゲーションして、合成タンパク質を作製した。このアプローチは、容易にライゲーションされてより大型の断片を生じる、高度に純粋な中程度の大きさのペプチドの急速産生を可能にした。
（実施例２）
本実施例は、脱保護ステップ時間の決定について記載する。インラインＵＶ−Ｖｉｓ検出器による流出液のリアルタイムモニタリングは、脱保護ステップの長さが低減されることを可能にした。３０４ｎｍにおけるリアクタ流出液のＵＶ吸光度をモニターすることにより、Ｆｍｏｃ除去の速度を調査した。頑強なＦｍｏｃ除去のための最小処理時間を決定するために、脱保護溶液を１０ｍＬ／分で６０秒間、３０秒間、１５秒間または６秒間流した。１０ｍＬ／分における２０秒間は、完全Ｆｍｏｃ除去に十分であることが判明した。効果的なＦｍｏｃ除去は、６秒間ステップにおいても達成された。
Ｎα脱保護プロトコールの開発において、ＤＭＦに溶解したピペリジンを標準ブロッキング解除試薬として選択した。カラムに進入する際に脱保護溶液が希釈されるため、より一般的なＤＭＦにおける２０％（ｖ／ｖ）を上回る、ＤＭＦにおける５０％（ｖ／ｖ）の濃度を選択した。したがって、より高濃度が望ましかった。最小時間で有効濃度に達するよう、流量を１０ｍＬ／分（最大）に設定した。脱保護ステップの長さを決定するために、全残基の二重脱保護によりＡＬＦペプチドを合成し、３０４ｎｍにおける流出液のＵＶ吸光度をモニターした。ピペリジンおよびＤＭＦは、この波長において十分に吸収しなかったが、脱保護生成物であるピペリジン−ＤＢＦは吸収した。したがって、第２の脱保護後の第２のピークの存在は、初期脱保護が不適切であったことを示した。６０秒間、３０秒間および１５秒間の脱保護の後に第２のピークは観察されず、６秒間の初期脱保護の後に非常に小さいピークのみが観察された。あらゆる事例において、第１の脱保護は１０ｍＬ／分であり、第２は１０ｍＬ／分を１分間であった。Ｆｍｏｃ除去は、配列依存性であることが報告されたため、２０秒間の最終脱保護時間を選択した。しかし、６秒間の脱保護ステップ（およびさらにより迅速な脱保護ステップ）が、多くのペプチド合成プロセスに適すると考えられる。その上、脱保護剤の流量および／または脱保護剤を含む流れの温度を増加させることにより、頑強なＦｍｏｃ除去を１秒間またはそれ未満で達成することができることが考えられる。
樹脂からピペリジン−ＤＢＦ付加物を洗い流すために、Ｎα Ｆｍｏｃ基の除去よりも有意に長い時間を要するため、二重脱保護プロトコールを使用して、脱保護時間を決定する必要があった。吸光度がベースライン付近に戻るまで流出液を単純にモニターした場合、「脱保護」時間の大部分は、脱保護が完了した後に脱保護試薬による樹脂の洗浄に費やされた。
図１０は、コノトキシン合成における最後の８残基の取り込みのＵＶ記録を示す。マイナスのマークは、手動動作を表す。スキャンされたトレースの色を増強し、タイムラインを加え、ゼロをトレースの初めにした。１サイクルのマークは、以前の洗浄の終わりを示す１、カップリングの初めを示す２、カップリングの終わりを示す３、第１の洗浄の初めを示す４、第１の洗浄の終わりおよび脱保護の初めを示す５、ならびに脱保護の終わりおよび第２の洗浄の初めを示す６でアノテートした。１および２の間ならびに３および４の間で急速継ぎ手を動かした。サイクル時間における矛盾および見逃したマークは、ヒューマンエラーによるものであった。
（実施例３）
本実施例は、洗浄ステップ時間の決定について記載する。インラインＵＶ−Ｖｉｓ検出器による流出液のリアルタイムモニタリングは、洗浄ステップの時間が低減することを可能にした。３０４ｎｍにおけるリアクタ流出液のＵＶ吸光度をモニターすることにより、洗浄ステップの効率を体系的に調査した。次に、流量の関数として、リアクタからアミノ酸を洗い流すために必要とされる時間を調査した。使用される溶媒の総容積により洗浄効率が主に決定され、約１６ｍＬのＤＭＦが、アミノ酸前駆体の９９％の除去に必要とされることが決定された。しかし、約６ｍＬ／分を超える流量において、僅かに少ない溶媒が必要とされた。１０ｍＬ／分における２分間のＤＭＦ洗浄が十分であることが結論付けられた。ＤＭＦ洗浄がアミノ酸または脱保護溶液を完全に除去しなかった場合に理論上生じ得るアミノ酸の二重取り込みは、２分間の洗浄時間には観察されなかった。洗浄容積の増加は、粗ペプチド品質を改善しなかった。例えば、流量を増加させる、入口の幾何学を変化させて再循環を低減させる、および／またはリアクタのアスペクト比を低減させることにより、さらにより迅速な洗浄時間が観察され得ることが考えられる。理論に制約されることは望まないが、一部の事例において、洗浄が低減または排除される場合、粗ペプチド品質に容認できない減少が存在しないことがさらに考えられる。一部のこのような事例において、脱保護ステップに先立ち実質的にあらゆる活性化されたアミノ酸を除去しない、および／またはアミノ酸カップリングステップに先立ち実質的にあらゆる脱保護試薬を除去しない、アミノ酸付加サイクルを用いることができる。
洗浄サイクルにおけるリアクタの目視観察は、ＤＭＦ洗浄溶媒およびカップリング溶液の再循環および混合を示した。他の溶媒交換は、同じ挙動を示した。色および屈折率の差は、あらゆる交換の直接的観察を可能にした。これらの観察に基づき、連続的希釈モデルによって予測される通り、洗浄効率が、使用した溶媒の容積に主に依存したことが予想された。この理論を検査するために、ＡＣＰ（６５−７４）の３連の合成において、リアクタ流出液のＵＶ吸光度を３０４ｎｍでモニターした。各合成において、２個の連続した残基を１０ｍＬ／分で、２個を７ｍＬ／分で、２個を４ｍＬ／分で、２個を２ｍＬ／分で、最後の２個をｌｍＬ／分で洗浄した。洗浄速度をアミノ酸のブロックにランダムに割り当て、ブロックが同じ速度で２回洗浄されなかったことを確実にした。検出器が不飽和化するために必要とされる時間を残基毎に測定した。不飽和化は、アミノ酸濃度のおよそ９９％低減を表す。洗浄が基本的に完全であるが、検出器における空気および粒子状混入の有意性が、より低いシグナルレベルのものよりも低いため、この洗浄効率を選択した。データを図１１に示す。指数部（パラメータｂ）は、有意にマイナス１を下回った。指数部の値は、より高い流量における検出器の不飽和化により少ない溶媒が必要とされることを意味した。不飽和化および流量の間の関係性は、提案される連続的希釈モデルと一貫しなかった。
これらの結果に基づき、洗浄のために最大流量（１０ｍＬ／分）を選択した。洗浄時間を２分間に設定し、これは、カップリング溶液の最終濃度を初期濃度の０．２％に確実に低減させた。この傾向は、１０秒間で観察される効果的洗浄をもたらす、最大少なくとも１００ｍｌ／分の洗浄速度により妥当である。例えば、洗浄液体流量を増加させることにより、さらにより迅速な洗浄時間を達成することができることが考えられる。不適切洗浄の可能な成果である二重取り込みは観察されなかった。使用した装置は、ピペリジン（ＵＶ吸光度は、利用できる波長がＤＭＦと同様）の除去をモニターする直接的な仕方を提供しなかったため、同じ洗浄サイクルを第２の洗浄に使用した。ピペリジン−ＤＶＢと同じ速度でピペリジンが除去されることが想定された場合、図１０におけるＵＶトレースによって示される通り、２分間洗浄は、必要な洗浄時間の過大評価であった。アミノ酸付加サイクルの合計時間は、洗浄ステップを実質的に低減させることにより低減され得る。
（実施例４）
本実施例は、最小カップリング時間の決定について記載する。２種のモデルペプチド：ＬＹＲＡＧ−ＣＯＮＨ２およびＦｍｏｃ−ＡＬＦ−ＣＯＮＨ２を合成することにより、カップリング時間の効果を調査した。５種のアミノ酸付加サイクルのそれぞれのため、図３に示す通り、６０℃において９０秒間、４５秒間、３０秒間、１５秒間または７秒間の名目上の時間で全アミノ酸をカップリングした。ＬＹＲＡＧ−ＣＯＮＨ２のため、全残基が７秒間でカップリングされた場合、Ａｒｇ欠失ペプチドの有意な増加を観察した。Ｆｍｏｃ−ＡＬＦ−ＣＯＮＨ２のため、カップリング時間の関数としての粗生成物の品質における有意な差は見出されなかった。これらの結果に基づき、３０秒間のカップリング時間が十分であると結論付けられた。
文献から、室温において、カップリング剤としてＨＢＴＵを使用して、１００秒間未満でアミド結合形成が９９％完全であることが一般に公知である。温度１０℃上昇毎にこのプロセスの反応速度が倍加することが想定された場合、６０℃におけるアミド結合形成は約６秒間で完了し、これは、アミノ酸付加サイクル時間を有意に減少させた。よって、あらゆるその後のカップリング試験を６０℃で行って、副生物の形成を有意に増加させることなくサイクル時間を最小化した。このプラットフォームの重要な特色は、温度制御されたウォーターバスにリアクタおよび予熱ループを単純に配置する能力であった。予熱ループは、試薬が室温で貯蔵され、次にリアクタに進入する前に直ちに加熱されることを可能にし、試薬の熱分解が最小化されることを可能にした。
アルギニン欠失をモニターすることができるため、モデルペプチドとしてＬＹＲＡＧを選択して、最小カップリング時間を決定した。９０秒間、４５秒間および３０秒間の名目上のカップリング時間で、それぞれ４、８および１２ｍＬ／分においてカップリング溶液を送達した。この流量は、２ｍｍｏｌのアミノ酸の送達を可能にした。このシステム（より高い流量を含むよう他のシステムを設計することができるが）において１２ｍＬ／分を上回る流量を確実に得ることはできなかったため、１５秒間の試行のために、カップリング溶液の半分を使用した（０．５ｍＬ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含有するＤＭＦに溶解した２．５ｍＬの０．４Ｍ ＨＢＴＵにおけるｌｍｍｏｌアミノ酸）。７秒間のカップリング時間において、急速継ぎ手を手動で動かすために費やされた時間（５〜６秒間）は非常に顕著であるため、１．２ｍＬのカップリング溶液を送達した。この容積は、予熱ループの容積であったため、カップリング溶液は、ＤＭＦ洗浄によってこのラインから排除されるまでリアクタに達しなかった。１０ｍＬ／分における洗浄は、１．２ｍＬを排除するために７．２秒間を要し、７秒間のカップリング時間が得られた。他の実行において、カップリング溶液の名目上の容積を上回る約１０％増加の送達に必要とされる時間と同様に、急速継ぎ手を動かすための５秒間を名目上のカップリング時間に加えた。入口ラインからＤＭＦ洗浄溶媒およびカップリング溶液が排除されるのに要する時間における差を減算した。より的確なカップリング時間は、９３秒間、５３秒間、３９秒間、２３秒間および７秒間であった。これは、リアクタからカップリング溶液を洗い流すのに必要とされる時間を含まない。７秒間のカップリングは、アルギニン欠失増加を示したため、保存的見積として３０秒間のプロトコールを選択した。Ｆｍｏｃ−ＡＬＦを同じ手順で産生し、カップリング時間における低減によるペプチド品質の変化を示さなかった。データを図３に示す。
自動システムの使用、より高い流量の使用およびより高い温度の使用が、カップリング時間を実質的に低減させると考えられる。
（実施例５）
本実施例は、システインラセミ化の最小化（ｍｉｎｉｚａｔｉｏｎ）について記載する。ペプチドＰｎｌＡ（Ａ１０Ｌ）コノトキシン、ＨＩＶ−ｌ ＰＲ（８１−９９）およびＧＣＦを使用して、システインラセミ化を最小化するための技法を探索した。
ＰｎｌＡ（Ａ１０Ｌ）コノトキシンおよびＨＩＶ−ｌ ＰＲ（８１−９９）の初期合成において、他のあらゆるアミノ酸と同様にシステインを活性化させ（１当量のＨＢＴＵ、２．９当量のＤＩＥＡ）、有意なジアステレオトピック不純物が生成物に観察された。これらは、システインラセミ化の結果であると決定された。ラセミ化により形成されたジアステレオマー（ｄｉａｓｔｅｒｏｍｅｒ）は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分解能を有したため、ラセミ化を低減させる条件を調査するために、モデルシステム、ＧＣＦを選択した。６０℃の実行は１分間に、室温（ＲＴ）の実行は６分間にカップリング時間を増加させたことを除いて、標準合成手順を使用した。１当量のＨＢＴＵ（５ｍＬ、０．４Ｍ）および２．９当量のＤＩＥＡ（ｌｍＬ）により、標準手順に従ってＲｉｎｋ、ＧｌｙおよびＰｈｅを全て活性化させた。システインのために、下に要約される通りに様々な活性化手順を使用した。１ｍＬ未満のＤＩＥＡを使用した手順のために、ＤＭＦを使用して、この容積を置き換えた。後述する活性化方法に加えて、５のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよび活性化手順を使用して確証済みのジアステレオマーを産生した。４、５、６、７および確証済みのジアステレオマーのＴＩＣトレースを図６に示す。図示されていない実行は、４から視覚的に識別不能であった。あらゆる事例において、活性化因子、添加物および２ｍｍｏｌのアミノ酸を５ｍＬのＤＭＦに溶解し、必要に応じて追加のＤＭＦを添加した。使用直前に塩基を添加した。反応８は、追加の活性化因子、添加物または塩基なしで、単離されたＣ末端ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）エステル（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＰｆｐ）を用いた。表１は、抽出されたイオン電流の統合により定量化されたラセミ化による結果を要約する。これは、ＴＩＣベースラインを下回るラセミ化の定量化を可能にする。得られた結果は、以前の報告と一貫した。
Figure 2021119204
図６Ａ〜図６Ｅは、様々なシステイン活性化スキームにより産生されたＧＣＦを示す。ＡおよびＢにおける所望の生成物およびジアステレオマーの間で溶出するピークは、Ｃ末端カルボキサミドの加水分解であった。ジアステレオマーは、かろうじて目に見えた。条件を表１に収載する。図６Ａ〜図６Ｄにおける条件は、反応（ａ）５、（ｂ）７、（ｃ）８、（ｄ）４および（ｅ）確証済みのＧｌｙ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｌ−Ｐｈｅのクロマトグラムを示す。全イオン電流を各クロマトグラムに表示する。
（実施例６）
本実施例は、アフィボディの合成について記載する。本セクションを通して、ライゲーションバッファーは、指定のｐＨの６Ｍ ＧｎＨＣｌ、０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーを指す；バッファーＰは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液、ｐＨ＝７．５である。
酸化化学を使用して、３個の断片をライゲーションして、合成５８残基のタンパク質にした。チアゾリジン（Ｔｈｉｏｚｏｌｉｄｉｎｅ）は、使用した条件において不安定であることが判明したため、５ｍＬのライゲーションバッファー、ｐＨ＝４に溶解した８３ｍｇのメトキシアミン塩酸塩で一晩処理することにより、９．６ｍｇの断片Ｔｈｚ−［２８−３９］−ＣＯＮＨＮＨ２を遊離Ｎ末端システインへと変換した。定量的変換が観察された。チオエステルが直接的にアクセスされる場合に使用されるＣからＮへの合成の代わりに、図５Ａに示すＮからＣへの組み立てを用いた。１ｍＬライゲーションバッファー、ｐＨ＝３に溶解した１１ｍｇの精製断片［１−２７］ＣＯＮＨＮＨ２の溶液に０．１ｍＬの２００ｍＭ水性ＮａＮＯ２を０℃で滴下添加することにより、断片［１−２７］−ＣＯＮＨＮＨ２を酸化させてＣ末端アジドとした。反応は２０分間０℃で進行させ、続いて４．４ｍＬのライゲーションバッファー（ｐＨ＝７、室温（ＲＴ））に溶解した１７２ｍｇの４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）および３４ｍｇのｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン・ＨＣｌ（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ）の添加によりクエンチした。得られたチオエステルに、３．４ｍＬの粗メトキシアミン処理した断片Ｔｈｚ−［２８−３９］−ＣＯＮＨＮＨ２を添加した。２時間ＲＴライゲーションの後に、粗反応混合物の半分をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、２ｍｇの高純粋の材料を回収した。このうち０．６ｍｇを、０．１ｍＬのライゲーションバッファーに溶解し、０．０ｌｍＬの２００ｍＭ水性ＮａＮＯ２を０℃で滴下添加ことにより酸化させた。反応を２６分間進行させ、続いて０．１ｍＬのライゲーションバッファー（ｐＨ＝７、ＲＴ）に溶解した３．１ｍｇのＭＰＡＡおよび０．７８ｍｇのＴＣＥＰ・ＨＣｌの添加によりクエンチした。ｐＨを７に調整し、０．３ｍｇの断片Ｃｙｓ−［４０−５８］−ＣＯＮＨ２を反応混合物に添加した。２時間のＲＴのライゲーションの後に、混合物を０．２１ｍＬのバッファーＰで希釈し、次にさらに０．６３ｍＬのバッファーＰを加えて、得られたアフィボディをフォールディングさせた。３ｋＤａ膜上で粗混合物を濃縮して、最終容積０．０７５ｍＬとした。粗製のフォールディングしたタンパク質を３ｍＬのバッファーＰに溶解した３６ｍｇのＴＣＥＰ・ＨＣｌで希釈し、均一になるよう精製した（図９）。
図９Ａ〜図９Ｅは、精製アフィボディ合成中間体および最終生成物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図９Ａ〜図９Ｅは、（ａ）断片［１−２７］ＣＯＮＨＮＨ２、（ｂ）断片Ｔｈｚ−［２８−３９］−ＣＯＮＨＮＨ２、（ｃ）断片Ｃｙｓ−［４０−５８］−ＣＯＮＨ２、（ｄ）ライゲーション断片［１−３９］−ＣＯＮＨＮＨ２および（ｅ）最終アフィボディのクロマトグラムである。
（比較実施例６）
本実施例は、従来の手動Ｂｏｃ ｉｎ−ｓｉｔｕ中和方法を使用したアフィボディの合成について記載する。
手動Ｂｏｃ ｉｎ−ｓｉｔｕ中和方法を使用して、匹敵するアフィボディ断片を合成した。流動に基づくＳＰＰＳプラットフォームにおいて合成された粗ペプチドの隣に、これらの粗ペプチドのＬＣ−ＭＳデータを図８Ａ〜図８Ｆに示す。あらゆる事例において、品質は匹敵した。保持時間シフトは、クロマトグラフィー条件の変化ならびにＢｏｃおよびＦｍｏｃ戦略によるライゲーションのために調製された僅かに異なるペプチドによるものである。
（実施例７）
本実施例は、流動に基づくＳＰＰＳのために使用されたシステムの設計について記載する。本実施例を通じて、システムは合成機と称される。合成機の模式図を図２Ａに示す。ＨＰＬＣポンプを使用して、使用後にポンプヘッド、リアクタおよびＵＶ検出器を洗浄するためのメタノールパージ溶媒；合成において試薬および副産物を除去するためのＤＭＦ洗浄溶媒；またはＮ末端を脱保護するためのＤＭＦに溶解した５０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのいずれかを送達した。バルブ１および２の位置は、いずれの流体が送達されるか決定した。シリンジポンプを使用して、カップリング溶液を送達した。シリンジポンプおよびＨＰＬＣポンプ間を切り換えるため、ＨＰＬＣポンプの出口からシリンジポンプにおけるシリンジへと急速継ぎ手を手動で動かした。シリンジポンプおよびバルブ間のラインが、カップリング溶液を保持するため、バルブは、一般に無効であり、次のサイクルにおける不正確な取り込みをもたらす。カラムおよび１．２ｍＬ予熱ループ（図示せず）をウォーターバスに浸して、一定の６０℃を維持した。バルブ３および４は、システインラセミ化試験において遭遇されるＤＣＣ活性化の尿素副産物等、沈殿物で詰まった場合に、ＵＶ検出器からの排除に使用される高圧バイパスループを選択した。ループは、ラインにおけるカラムなしでの検出器のパージにも使用された。
Ｖａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２１０ ＨＰＬＣポンプ、ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＫＤＳ２００シリンジポンプ、３０４ｎｍに設定されたＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ３２０ ＵＶ検出器、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈチャート記録計およびＶＷＲ ３９０３２−２１４ウォーターバスを合成機において使用した。ＨＰＬＣポンプは、名目上の流量の約９５％を送達した。使い捨て１０ｍＬシリンジ（ＢＤ３０９６０４）を使用して、カップリング溶液を送達した。バルブ１は、Ｓｗａｇｅｌｏｋ １／８”三方弁（Ｓ５−４１ＧＸＳ２）であった。システムにおける他のバルブは、Ｓｗａｇｅｌｏｋ １／１６”三方弁（ＳＳ−４１ＧＸＳ１）であった。バルブ１からバルブ２までのメタノール、ＤＭＦおよび５０％（ｖ／ｖ）ピペリジンラインは、１／８”ＯＤ、１／１６”ＩＤ ＦＥＰ（Ｉｄｅｘ １５２１）であった。バルブ３および４の間のラインは、１／１６”ＯＤ、０．０１０”ＩＤ ｐｅｅｋ（Ｉｄｅｘ １５３１）であった。他のあらゆるラインは、１／１６”ＯＤ、０．０３０”ＩＤ ＰＦＡ（Ｉｄｅｘ １５１４Ｌ）であった。バルブ２の１／１６”入口へと１／８”洗浄および脱保護ラインを取り付けるため、Ｓｗａｇｅｌｏｋ １／８”から１／１６”への（ＳＳ−２００−６−１）異型ユニオンを使用し、続いて１／１６”チューブの短いセクションを使用した。急速継ぎ手およびリアクタ間のチューブを除いて、全ての長さは最小であった。これは、リアクタと共に浸された、リアクタに達する前に反応物が６０℃であることを確実にするための予熱ループとして機能する、２．６ｍ（１．２ｍＬ）のコイルを含んだ。チューブが連結される必要がある場合は常に、Ｓｗａｇｅｌｏｋ １／１６”ユニオンを使用した（ＳＳ−１００−６）。これらを使用して、予熱ループを取り付け、バルブ４からラインへとカラムの出口を連結し、切断されたバイパスループを修復した。手動で交換した急速継ぎ手は、１０−３２メスＨＰＬＣフィッティング（Ｉｄｅｘ Ｐ−６５９）へのメスルアーであった。これは、シリンジポンプにおけるシリンジ、またはバルブ３（Ｉｄｅｘ Ｐ−６５６）からのラインにおける１０−３２メスフィッティングへと嵌合するオスルアーへと直接的に接続した。ＵＶ検出器およびチャート記録計間の接続はデータリンクである（３本の１８ｇａ絶縁銅線）。
図２Ｂは、リアクタ組み立てを示す。リアクタは、各末端に標準圧縮フィッティング（３／８”から１／１６”への異型ユニオン）を備えるチューブからなった。下流末端において、フリットも存在した。これは、リアクタの内部に適合するよう設計された支持体により配置され、該末端におけるフィッティングの底に対して据え付ける。様々なフリット多孔度を使用した。後述する品番は、最も一般的に使用される２０ミクロンフリットのためのものであった。本体は、外径３／８”および内径１／４”を有するＰＦＡチューブの３．５インチセグメントであった。フリットは、１／４”焼結ステンレス鋼ディスク１／１６”厚であった。フリット支持体は、１／４”ＯＤ ＰＴＦＥチューブの０．５”長さであった。フィッティングが締められると、ナットは、フィッティング本体に対しフェルールを圧縮し、リアクタ本体をフィッティング本体へと密封した。これは、フリットに対しリアクタ本体も圧縮し、フリットに対する内部密封を形成した。それぞれ品番Ｓ１８０５Ｋ７３および９４４６１３１４として、ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒからリアクタ本体およびフリットを購入した。ナット、フェルールおよびフィッティング本体は、セットとして入手することができ、１／１６”ナットおよびフェルールは、品番ＳＳ−６００−６−１としてＳｗａｇｅｌｏｋから得られる。置き換えフェルールは、ＳＳ−６００−ＳＥＴとして入手することができる。長さに本体およびフリット支持体を先ずカットし、末端が四角となることを確実にすることにより、リアクタを組み立てた。これらの操作のために鋭いかみそりの刃および震えない手を使用した。次に、出口（下流）末端を組み立てた。固体の清潔な表面上にフリットを置き、これにリアクタ本体を押圧した。フリットが四角であり、リアクタの終わりで洗い流したことを検証した後に、フリット支持体を僅かに押し、その最終位置までフリットを押す。フィッティング本体にリアクタ本体をしっかりと据え付けることにより、フリットをその最終位置に押した。フリットが四角であり、フェルール下に適宜配置されたことが検証されると、メーカーの説明書に従ってフィッティングを設置した。ひとたび密封すると、フリットを除去して再度据え付けることができない。最後に、メーカーの説明書に従って入口フィッティングを設置した。ステンレス鋼本体を備える高圧リアクタも構築した。この場合、フリットによる密封に影響を与えるために、下流フィッティングは、規格を越えて堅く締める必要がある。リアクタは典型的に、３〜８合成毎に交換した。リアクタを交換する際に、フェルール、フリットおよびリアクタ本体を再利用しない。他のあらゆる部品は再利用する。リアクタ本体を半分にカットすることにより、ナットを回収した。
リアクタを充填するために、上流フィッティング本体を除去し、メタノール中の樹脂のスラリーをピペットで入れた。リアクタを完全にメタノールで満たし、フィッティング本体を再度設置した。急速継ぎ手に取り付け、リアクタに取り付ける前にＨＰＬＣポンプを実行することにより、入口ラインおよび予熱ループを溶媒で満たした。次に、あらゆる小泡が上に移動し、樹脂湿潤に干渉しないように、リアクタをウォーターバスにおいて正立に維持した。第１のカップリングの前に、１０ｍｌ／分におけるＤＭＦで樹脂を２分間洗浄した。
（実施例８）
本実施例は、より迅速なサイクル時間および合成スケール増加を可能にする、実施例１０〜１１および１３〜１７における流動に基づくＳＰＰＳのために使用される大規模リアクタの設計について記載する。実施例７に記載されている「第一世代」リアクタとは対照的に、実施例を通して、このリアクタは、「第二世代」リアクタと称される。
図１２は、より大型のリアクタを示す。実施例１〜７における全合成に使用される小規模リアクタ（即ち、第一世代リアクタ）の設計原理を、より大規模なものに直接的に置き換えた。しかし、匹敵するサイクルを保存するために、リアクタの容積は一定となる必要があった。５／８”ＯＤ、１／２”ＩＤチューブへとスケールアップする際に、２つの問題に遭遇した。第一に、標準５／８”から１／１６”への圧縮フィッティングが存在しないことであった。第二に、５／８”フィッティング間の最小距離が極めて大きく、大きい最小容積が存在することを意味する。第１の問題を克服するために、５／８”から３／８”へのフィッティングと、続く３／８”から１／１６”へのフィッティングを使用したが、これは、既に大容積であるリアクタを大幅に増加させる３／８”チューブの連結長さを必要とした。
リアクタ容積を低減させるために、名目上の１／２”ＯＤセグメントと、続く１／４”貫通穴を有する３／８”ＯＤセグメントからなる３１６ＳＳインサートを機械加工した。５／８”から３／８”への異型ユニオンに穴を開けて、３／８”貫通穴を得て、インサートを据え付ける、３／８”フェルールをスエージ加工した。その後、インサートをフィッティングから分離することはできない。設置されると、このインサート−フィッティングの１／２”部分がリアクタの上部に置かれ、容積を限定した。
これは効果的であったが、依然として、１／４”貫通穴由来の大容積が存在する。この容積は、１／４”ＯＤ、１／８”ＩＤ ＰＦＡチューブを挿入し、これをカットして洗い流すことにより低減された。容積をさらに低減させるために、加熱して、チューブのセクションを引っ張ってより細い直径にし、これに通し、インサートにおける全チューブが適切な直径のものとなるまで引くことにより、１／８”ＯＤ、１／１６”ＩＤ ＰＦＡチューブを挿入した。チューブの両側をカットして洗い流し、引っ張られたセクションを廃棄した。３／８”から１／１６”への異型ユニオンを３／８”セグメントの開口端に設置して、システムの残りと連動させた。このインサート−フィッティングは、図１２Ａ（左）に写真撮影されている。上流インサートフィッティングが、フリットの様にチューブ内に永続的に密封されるようになることを防止するために、名目上の１／２”セグメントを機械加工して０．４９６”とし、磨いた。
出口側のために同様の小片を機械加工し、適切な長さの１／２”セクションをフェルール下のフリットに据え付けた。全溶媒がフリットの小さい中央セクションを通されることを防止するために、３／８”直径ステップ０．０５”の深さをカットした。このステップの底は、水平から３１度で１／８”貫通穴へと先細になった（標準ドリルビットで先細にする）。１／８”ＯＤ、１／１６”ＩＤ ＰＦＡチューブを挿入して、容積をさらに限定した。出口インサートの１／２”セクションは、フリットを配置し、フェルールの下に大部分は置いたため、標準完了は適切であった。図１２Ａに写真撮影されているものは、ＰＴＦＥであり、上流インサートと正確に同じ仕方で、穴を開けた５／８”から３／８”への異型ユニオンに設置した。図１２Ｆに写真撮影された切り取り断面図におけるリアクタを含むその後のリアクタは、ステンレス鋼出口インサートを使用した。３／８”から１／１６”への異型ユニオンを３／８”セグメントの開口端に設置して、システムの残りと連動させた。
製作を単純化するために、小穴を有するインサートを直接的に作製するのではなく、チューブを使用して、インサートの内部容積を限定した。
リアクタを組み立てるために、フリットを押圧し、下流インサート−フィッティングを規則的なフィッティングとして設置した。次に、上流インサート−フィッティングを規則的なフィッティングとして設置した。これを普通より小さくカットし磨いたにもかかわらず、上流インサート（ｉｎｓｅｔ）−フィッティングは非常に密着し、除去が困難であった。その後のリアクタのため、図１２Ｂに示すアルミニウムスペーサーを使用して、リアクタが一貫した容積を有することを可能にした。スペーサーは、内部容積を２ｍＬに設定し、リアクタの再現性のある組み立てを可能にした。さらに、スペーサーは、合成後の入口インサート−フィッティングの除去に役立った。スペーサーは、ナットが下に移動することを防止し、代わりに、ナットが回転した場合にインサート−フィッティングを駆出した。垂直ウィンドウをスペーサーに加えて、適切な光学的アクセスを維持した。組み立てた大型のリアクタの写真を図１２Ｄに示す。
リアクタを充填するために、入口インサート−フィッティングを除去し、樹脂を添加して乾かし、リアクタをメタノールで満たした。次に、入口インサート−フィッティングを熱交換器に取り付け、メタノールでパージした。熱交換器からこれを除去することなく、パージした入口インサート−フィッティングを設置し、出口インサート−フィッティングを通してリアクタから過剰なメタノールを出した。大きな泡がある場合、リアクタを逆さまに回転し（入口を出口より下にする）、パージした。これにより泡を追い出せなかった場合、リアクタを解体し、充填手順を反復した。合成後に樹脂を除去するために、１０ｍＬの空気で満たしたシリンジを、熱交換器入口（試薬シリンジが取り付けられている）におけるルアーロック急速継ぎ手に取り付け、空気の送達に使用した。これは、熱交換器、リアクタおよび廃棄物ラインから溶媒を除去した。次に、熱交換器および廃棄物ラインをリアクタから接続切断し、入口インサート−フィッティングを除去した。樹脂をＤＣＭに懸濁し、フリット付きシリンジ（Ｔｏｖｉｑ）へとデカントし、ＤＣＭで４回洗浄し、直ちに開裂させた、あるいは貯蔵のために減圧下で乾燥させた。
（実施例９）
本実施例は、第一世代リアクタにおける圧力の低減に使用される技法について記載する。圧力降下は、本質的に、樹脂が原因で生じた。高圧流動後に静止期間を用いることにより、あるいは大型のリアクタを使用することにより、圧力降下を克服した。
低圧ポリマーリアクタを使用したため、ＨＰＬＣポンプにおける過圧アラームを、２４０ｐｓｉでポンプを止めるよう設定し、これは時折始動した。アラームが始動すると、システムは３０秒間静止し、さらなる出来事なしでポンプを再始動させた。この静止期において、樹脂は目に見えて拡大した。ＨＰＬＣポンプ圧力を観察することにより、ビーズに高すぎる圧力が加えられる場合、圧縮し始めることが結論付けられた。これは、床にわたる圧力降下および圧縮の速度を増加させ、これは過圧アラームを速く始動させる。Ｂｉｏ−Ｒａｄ製のゲル浸透クロマトグラフィーに利用できる同様の１％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂は、ひとたび膨張すると非常に柔らかいため、重力駆動分離のみのために推奨された。
このような事象の直後にリアクタを解体すると、樹脂は、固体ブロックのように見え、ピペットチップで探ると、硬い塊のように感じた。これを直ちにピペットで除去することは困難であった。数十秒後に、樹脂は弛緩し、ピペットで除去することができた。高圧ステンレス鋼リアクタを構築し、検査したが、圧縮された床を通る速い流れの維持に必要な非常な高圧（＞１０００ｐｓｉ）は、フリットからの樹脂の押し出しに奮闘した以前の連続的流動ＳＰＰＳを連想させた。
相対的に殆ど変形させることなくコースフリットの孔を樹脂が機械的に塞ぐことができるように、フリットおよび樹脂の境界で初期圧縮が行われたことが考えられた。この理論を検査するために、本来の４０ミクロンフリットを、２０ミクロンフリットに、また、より限定された試行においては、１０ミクロンフリットおよび２ミクロンフリットに置き換えた。より小さい孔は、この問題を排除しないが、その重大性を定性的に低減するように思われた。このことから、この問題が樹脂に固有であり、より低い流量で実行すること、または床の高さを低減させること（より小さいスケールおよび／またはより大きいリアクタを使用）によってのみ排除することができると結論付けられた。
より硬い、より高度に架橋された樹脂の使用が報告されたが、得られたペプチドは劣った品質のものであった。ここで使用した解法は、高圧事象後に３０秒間待機することであった。これは効果的かつ好都合であり、リアクタの寸法をさらに最適化させることなく、合理的スケールでの進行を可能にした。１／２”ＩＤリアクタ（実施例８に記載）による試行は、同じサイクルで操作する、最大２００ｍｇの樹脂による過圧を示さなかった。
これらの問題を克服し、合成を加速させ、合成スケールを増加させるために、実施例８に記載されている大規模リアクタを構築した。
（実施例１０）
本実施例は、６分間におけるＡＬＦＡＬＦＡ−ＣＯＮＨＮＨ２の調製について記載する。以前の実施例において使用したＨＰＬＣポンプのための大容量ポンプヘッドを使用して、洗浄ステップにおいて１００ｍｌ／分のＤＭＦ、脱保護ステップにおいて１００ｍｌ／分のＤＭＦに溶解した５０％ピペリジンおよびカップリングステップにおいて１２ｍｌ／分の活性化されたアミノ酸を送達した。ウォーターバスに浸漬することにより、リアクタおよび予熱ループを６０℃に維持した。
図１３に示す装置を構築した。リザーバ１は、活性化されたアラニンを含有し、リザーバ２は、活性化されたロイシンを含有し、リザーバ３は、活性化されたフェニルアラニンを含有し、リザーバ４は、ＤＭＦに溶解した５０％ピペリジンを含有し、リザーバ５は、ＤＭＦを含有した。各活性化されたアミノ酸は、５０ｍｌのＤＭＦに溶解した０．４Ｍ ＨＢＴＵを２０ｍｍｏｌのＦｍｏｃ保護アミノ酸と組み合わせることにより調製した。実行を始める直前に、１０ｍＬのＤＩＥＡをアミノ酸リザーバのそれぞれに添加した。所望の流量を得るために、１．５バールの窒素上部圧力を各リザーバに加えた。ポンプ上流の全チューブは、１／８”ＯＤ、１／１６”ＩＤ ＰＦＡであった。三方弁は、Ｓｗａｇｅｌｏｋ １／８”三方弁であった。三方弁の共通ラインは、試薬間で選択される切り換えバルブ（Ｖａｌｃｏ Ｃ２５−６１８０）を通った。全バルブを手動で制御した。ポンプは、１００ｍｌ／分ポンプヘッドを備えるＶａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２１０であった。予熱ループは、１．８ｍの１／１６”ＯＤ、０．０３０”ＩＤ ＰＦＡチューブであった。使用したリアクタは、図１２に示す、実施例８に記載されている、より大型のリアクタであった。リアクタは、当業者に公知の標準方法を使用して市販のクロロトリチルクロライド樹脂から調製した、１２０ｍｇのクロロトリチルヒドラジド官能化ポリスチレン樹脂を含有した。より大型のリアクタの使用は、１００ｍｌ／分における管理し易い圧力降下の維持に役立った。
１回の合成サイクルは、次の通りに行った。先ず、２０秒間カップリングを１２ｍｌ／分で行った。マルチポートバルブを所望のアミノ酸に設定し、三方弁をアミノ酸に設定した。他の全三方弁をＤＭＦに設定した。２０秒後に、選択された三方弁をアミノ酸からＤＭＦに切り換え、ポンプ流量を１００ｍｌ／分に設定した。５秒後に、マルチポートバルブをピペリジンに切り換えた。さらに５秒後に、選択された三方弁をＤＭＦからピペリジンに切り換えた。１０秒後に、選択された三方弁をＤＭＦに戻すよう切り換えた。５秒後に、マルチポートバルブを次の所望のアミノ酸に動かした。さらに５秒後に、流量を１２ｍｌ／分に低減させ、選択された三方弁をＤＭＦから次の所望のアミノ酸に切り換え、次のサイクルを開始した。ステップ毎の合計時間を次に示す：２０秒間のカップリング、１０秒間の洗浄、１０秒間の脱保護および１０秒間の洗浄。サイクル毎の合計時間は５０秒間であった。粗材料のＬＣ−ＭＳ分析から得た全イオンクロマトグラムを図１４に示す。
上に挙げた時間は全て、９９％＋収率の達成に必要とされる時間の保存的見積であると考えられる。現在、２０ｍｌ／分の流量において、脱保護が５秒間で完了することが公知であり、１００ｍｌ／分において、脱保護が実質的に５秒間未満を必要とすることが予想される。例えば、追加の三方弁を統合することにより、共通モデルペプチドＡＣＰ（６５−７４）等、より長いペプチドを調製することができる。本実施例に記載されている総合戦略は、実施例１に記載されているサイクルを使用して産生されるものを含むいずれかのペプチドの産生のために実行可能であると予想される。
（実施例１１）
本実施例は、合成時間が（実施例１と比べて）実質的に低減される、改善された合成スキームについて記載する。本実施例における合成のためのサイクル時間は、３分間未満であった。実施例１と比べてサイクル時間を低減させるために、洗浄ステップを調整した。ポンプ上流の全チューブを、１／８”ＯＤ １／１６”ＩＤ ＰＦＡに置き換え、ポンプ上流の２個のバルブを、１／８”Ｓｗａｇｅｌｏｋ三方弁に置き換えた。予熱ループを除くチューブの長さは全て最小であり、実施例８に記載されているリアクタを使用した。他の全システム構成要素は、実施例１と比べて実質的に変化させなかった。明確に後述されていなければ、あらゆる手順は、実施例１と比べて同じままであった。
より大型のチューブおよび大容量ポンプヘッド（最大５０ｍｌ／分）を使用して、２０ｍｌ／分でＤＭＦおよび脱保護試薬を送達した。図１１に基づき予想される通り、あらゆる事例において、２０ｍｌ／分における１分間の洗浄が適切であると証明した。さらに、５秒間の脱保護ステップが、これらの流量において適切であると判明した。カップリングステップは変化させなかった。これは、手動ステップが行われるスピードに応じて、２分間３５秒間から約２分間５０秒間の総サイクル時間を生じた。大部分の使用者は、より高い流量におけるシステムを手動で操作することが困難であるため、最大５０ｍｌ／分の代わりに２０ｍｌ／分に洗浄を設定した。自動化を使用して、このような人力の限界を克服し、十分に大型のポンプにより、１残基当たり約１０秒間のサイクルの実行を可能にすることができることが予想される。
このサイクルを使用して作製したペプチドの２種のクロマトグラムを図１５に示す。各事例において、主ピークが所望の生成物である。これらは、この長さのペプチドの典型的な結果である。
（実施例１２）
本実施例は、実施例１〜１１および１３〜１８において使用した材料ならびに実施例１〜１１において使用した方法について、より詳細に記載する。
２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＢＴＵ）、２−（７−アザ−１Ｈベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）およびＮα−Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸は、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＩＬ、ＮｏｖａＢｉｏＣｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツおよびＰｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、日本から得た。４−メチルベンズヒドリルアミン官能化架橋ポリスチレン（ＭＢＨＡ樹脂）およびｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール官能化架橋ポリスチレン（Ｗａｎｇ樹脂）は、Ａｎａｓｐｅｃ、ＣＡから得た。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジエチルエーテル、メタノール（ＭｅＯＨ）およびＨＰＬＣ等級アセトニトリルは、ＶＷＲ、ＰＡから得た。トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）および１，２エタンジチオールは、Ａｌｆａ Ａｅｓｅｒ、ＭＡから得た。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、ＮｕＧｅｎＴｅｃ、ＣＡ、Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ、ＮＪおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯから購入した。ＬＣ−ＭＳのための溶媒は、ＴＪ ＢａｋｅｒおよびＦｌｕｋａから購入した。他の全試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯから購入した。
これらの実験を通して使用した共通溶媒混合物を次に示す：水に溶解した０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（Ａ）、水に溶解した０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（Ａ’）、アセトニトリルに溶解した０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（Ｂ）およびアセトニトリルに溶解した０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（Ｂ’）。
図４ＤにおけるＡＣＰ（６５−７４）バッチを除く全ペプチドを、流動に基づくＳＰＰＳシステムにおいて合成した。図４Ｄおよび４ＣにおけるＡＣＰ（６５−７４）バッチおよびＡＣＰ（６５−７４）流動ＲＴを除く全ペプチドを、予熱ループ（合成機設計を参照）による使用直前に予熱した試薬により６０℃で合成した。１回の合成サイクルは、アミノ酸曝露ステップ（例えば、アミド結合形成、実施例においてカップリングとも称される）、アミノ酸除去ステップ（例えば、カップリング試薬の除去、実施例において洗浄ステップとも称される）、脱保護剤曝露ステップ（例えば、Ｎα Ｆｍｏｃ除去、実施例において脱保護とも称される）および脱保護剤除去ステップ（例えば、脱保護試薬および反応生成物、ピペリジン−ジベンゾフルベン（ピペリジン−ＤＢＦ）の除去、実施例において洗浄とも称される）からなった。
注記されていなければ、カップリングは、実施例１〜７において１２ｍｌ／分で（およそ３０秒間）次のカップリング溶液を送達することにより行った。活性化されたカップリング溶液は、５ｍｌのＤＭＦにおける０．４Ｍ ＨＢＴＵおよび１ｍＬのＤＩＥＡに溶解した２ｍｍｏｌのＮα−Ｆｍｏｃおよび側鎖保護されたアミノ酸からなった。ＤＭＦにおける５ｍＬの０．４Ｍ ＨＢＴＵ、０．６８７ｍＬの純ＤＭＦおよび０．３１３ｍＬのＤＩＥＡにシステインを溶解した。両方の事例において、使用前に最大数時間ＨＢＴＵ溶液にアミノ酸を溶解し、使用の２分以内にＤＩＥＡを添加した。容積測定をＲＴ（２０℃）で行った。図４Ａに示すＡＣＰ（６５−７４）は、上述の溶液においてＨＡＴＵをＨＢＴＵの代わりにして合成した。
次に、１０ｍＬ／分で２分間にわたり送達した２０ｍＬのＤＭＦによりカップリング溶液を除去し、次に、ｌ０ｍＬ／分で２０秒間にわたり送達したＤＭＦに溶解した３．３ｍＬの５０％（ｖ／ｖ）ピペリジンによりＮα−Ｆｍｏｃ保護基を除去した。１０ｍｌ／分で２分間にわたり送達した２０ｍＬのＤＭＦにより、過剰なピペリジンおよびピペリジン−ＤＢＦを除去して、１サイクルを完了した。
１００ｍｇの１％ジビニルベンゼン架橋したポリスチレン樹脂において全ペプチドを合成した。Ｃ末端カルボキサミドペプチドを産生するために、１グラム当たり１ｍｍｏｌの充填によるＭＢＨＡ官能化樹脂を使用し、カップリングした第１の残基は、ＴＦＡに不安定なＲｉｎｋリンカーであった。ライゲーションのためのＣ末端ヒドラジドペプチドを産生するために、後述の通りに官能化したＷａｎｇ樹脂を使用した。充填は０．６ｍｍｏｌ／ｇ（０．０６ｍｍｏｌスケール）であった。
ＴＦＡにおける２．５％（ｖ／ｖ）水および２．５％（ｖ／ｖ）ＴＩＰＳで２時間処理することにより、非システイン含有カルボキサミドペプチドを樹脂から開裂させ、側鎖を脱保護した。ＴＦＡにおける２．５％（ｖ／ｖ）ＥＤＴ、２．５％（ｖ／ｖ）ＴＩＰＳおよび１％（ｖ／ｖ）水で２時間処理することにより、システイン含有カルボキサミドペプチドを樹脂から開裂させ、側鎖を脱保護した。ＴＦＡにおける５％（ｖ／ｖ）ＥＤＴ、５％（ｖ／ｖ）ＴＩＰＳおよび２．５％（ｖ／ｖ）水で２時間処理することにより、ヒドラジドペプチドを開裂させた。あらゆる事例において、樹脂を除去し、圧縮空気を使用して、ＲＴで開裂溶液を蒸発乾固させた。得られた固体を冷ジエチルエーテルで３回洗浄し、５０％Ａ／５０％Ｂ（ｖ／ｖ）に溶解し、凍結乾燥した。側鎖保護を次に示す：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）。
Ｗａｎｇ樹脂を次の通りに官能化した：５００ｍｌ丸底フラスコに５．４７ｇのＷａｎｇ樹脂を添加し、９８ｍＬのＤＣＭおよび１．１２ｍＬのＮ−メチルモルホリンに懸濁した。これを氷浴中で５分間撹拌し、２．０３ｇのｐ−クロロギ酸ニトロフェノールを粉末として添加した。この混合物を８．５時間撹拌した。槽における氷は補充せず、これにより、反応物はゆっくりとＲＴに達した。混合物を濾過し、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨおよびＤＣＭで固体を洗浄して、白色の樹脂を得た。得られた樹脂を氷浴中の清潔な５００ｍｌ丸底フラスコ内に置き、０℃に予冷した２１０ｍＬのＤＭＦ、５４ｍＬのＤＣＭおよび１．１ｍＬのヒドラジン一水和物の調製した混合物に懸濁した。これにより、鮮黄色の溶液が得られた。融解している氷浴において１８時間反応を進行させた。次に、混合物を濾過し、前述通りに固体を洗浄して、ヒドラジン官能化Ｗａｎｇ樹脂を得た。
下に示す４条件のうち１条件下で、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ Ｑ−ＴＯＦ ＬＣ−ＭＳにおいて全ペプチドを分析した。条件１：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃ３ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ充填）を使用した（条件１）。流量は、次の勾配で流量０．４ｍＬ／分であった：１％Ｂ’を有するＡ’で３分間、１５分間にわたる直線的に傾斜をつけた１〜６１％Ｂ’および６１％Ｂ’で４分間。条件２：ＧＣＦおよびＬＹＲＡＧならびに他のペプチドのため、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃ１８ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢカラム（２．１ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ充填）を使用した。流量は、次の勾配で流量０．４ｍＬ／分であった：１％Ｂ’を有するＡ’で５分間、１５分間にわたる直線的に傾斜をつけた１〜６１％Ｂ’および６１％Ｂ’で４分間。条件３：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃ３ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ充填）を、次の勾配で流量０．８ｍＬ／分と共に使用した：５％Ｂ’を有するＡ’で３分間、９分間にわたる直線的に傾斜をつけた５〜６５％Ｂ’および６５％Ｂ’で１分間。条件４：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃ３ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢカラム（２．１×１５０ｍｍ、５μｍ充填）を、次の勾配で流量０．４ｍＬ／分と共に使用した：５％Ｂ’を有するＡ’で３分間、１５分間にわたる直線的に傾斜をつけた５〜９５％Ｂ’および９５％Ｂ’で４分間。注記されていなければ、ペプチドは条件１で分析した。カップリング時間試験において使用したＬＹＲＡＧおよびシステイン活性化試験において使用したＧＣＦは、条件２で分析した。図２３Ｃ、図２１Ａ〜図２１Ｂ、図２０および図１７におけるペプチドは、条件３で分析した。図２３Ｅ、図２２および図２１Ｃにおけるペプチドは、条件４で分析した。全イオン電流を全クロマトグラムに表示する。
ペプチドを次の通りに精製した。粗ペプチドを９５％Ａ／５％Ｂ（ｖ／ｖ）に溶解し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ１８カラム（２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、７μｍ充填）を備えるＷａｔｅｒｓ調製用ＨＰＬＣにおいて、Ａにおける５％〜４５％Ｂの直線的勾配で８０分間にわたり、流量１０ｍＬ／分で精製した。Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８カラム（９．４ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ充填）を備えるＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ半調製用ＨＰＬＣにおいて、Ａにおける１０％〜５５％Ｂの直線的勾配で９０分間にわたり、流量５ｍＬ／分で粗アフィボディ断片１−３９ライゲーション生成物を精製した。同じシステムにおいて同じ勾配で、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ充填）および流量２．３ｍＬ／分を使用して、最終アフィボディを精製した。
全精製のため、ＰｅｒＳｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおいて、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸マトリックスで飽和させた２μＬの５０％Ａ’／５０％Ｂ’（ｖ／ｖ）と共結晶化させた２μＬの画分を使用して、１分間の画分を収集し、正確な質量をスクリーニングした。プールした画分の純度を、上述通りＬＣ−ＭＳにより確認した。
ＵＶ検出器応答を次の通りに定量化した。作成されたＵＶトレースおよびこれが表す洗浄効率を理解するために、ＵＶ検出器の応答を定量化した。ＵＶトレースにおけるアミノ酸の近似濃度を決定するために、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨカップリング溶液の系列希釈を調製した。アミノ酸の初期濃度は約０．３Ｍ（６．５ｍＬ総容積における２ｍｍｏｌ）であり、ｌ０×、１００×、１０００×、１０，０００および１００，０００×希釈標準を調製し、ＵＶ検出器へと直接的に注入した。１００×希釈（３×１０−３Ｍ）は、飽和の直前であった。１０，０００×希釈（３×１０−５Ｍ）標準は、ベースラインのすぐ上、予想される通りスケールの約１％であった。１００，０００×希釈は、検出限界を下回った。高度に再現性のある洗い流しトレース（図１０）は、これが全アミノ酸を表すことを示す（吸光度が大いに異なる場合、サイクル間で定性的に異なるトレースが予想された）。
（実施例１３）
本実施例は、第二世代リアクタによるペプチド合成のための一般条件について記載する。この方法は、十分に頑強であったため、これらのペプチドは全て、リアクタ流出液のＵＶモニタリングなしで合成された。
リアクタの直径の増加は、背圧を低減させ、匹敵する容積の維持は、第一世代リアクタと同じ容積の溶媒および試薬の使用を可能にした。第二世代リアクタは、最大２００ｍｇの樹脂を収容し、最大１００ｍＬ／分の流量を可能にした。ペプチドが長くなるにつれて選択された樹脂が膨張し、容積限定インサートが樹脂の膨張容積を２ｍＬに制限したため、より多くの樹脂は使用しなかった。より高い流量は検査しなかったが、観察される背圧は、より高い流量を達成し得ることを示した。
第二世代リアクタにより、より高い流量で洗浄することにより、サイクル時間が低減された。予想される通り、必要とされる洗浄時間は、流量増加と共に減少し続け、アミノ酸の９９％が、２０ｍＬ／分における３６秒間および４０ｍＬ／分における２０秒間で除去された。しかし、手動操作を適応させ、操作者がその後のアミノ酸のそれぞれを調製する適切な時間を可能にするため、２０ｍＬ／分における１分間の洗浄または４０ｍＬ／分における３０秒間の洗浄を使用した。
図１６Ａ〜図１６Ｂ、図１７、図１８Ａ〜図１８Ｂ、図１９Ａ〜図１９Ｃ、図２０、図２１、図２２Ａおよび図２４Ａにおけるペプチドは、実施例８に記載されている第二世代リアクタおよび実施例１に記載されている合成機を使用して、６０℃で、本実施例に記載されている条件下、ウォーターバスにおけるチューブのコイルにより使用直前に加熱した試薬により合成した。図１６Ｃに示すＡＣＰ（６５−７４）は、後述の通り、但し室温で合成し、図１６Ｄに示すＡＣＰ（６５−７４）は、標準ガラスリアクタにおいて合成した。あらゆる事例において、１回の合成サイクルは、アミド結合形成（カップリング）、カップリング試薬の除去（洗浄）、Ｎα Ｆｍｏｃ除去（脱保護）ならびに脱保護試薬および反応生成物、ピペリジン−ジベンゾフルベン（ピペリジン−ＤＢＦ）の除去（洗浄）からなった。
注記されていなければ、カップリングは、次のカップリング溶液を６ｍＬ／分で（およそ３０秒間）送達することにより行われた。カップリング溶液は、２．５ｍＬのＤＭＦにおける０．４Ｍ ＨＢＴＵおよび０．５ｍＬのＤＩＥＡに溶解した１ｍｍｏｌのＮα−Ｆｍｏｃおよび側鎖保護されたアミノ酸からなった。システインは、２．５ｍＬのＤＭＦにおける０．４Ｍ ＨＢＴＵおよび０．１５７ｍＬのＤＩＥＡに溶解した。両方の事例において、アミノ酸は、使用前に最大数時間ＨＢＴＵ溶液に溶解し、使用２分以内にＤＩＥＡを添加した。容積測定をＲＴ（１８〜２０℃）で行った。上述の溶液におけるＨＡＴＵをＨＢＴＵの代わりにして、図１６Ａに示すＡＣＰ（６５−７４）および図１７におけるプロテアーゼ部位を合成した。次に、２０ｍＬ／分で１分間にわたり送達した２０ｍＬのＤＭＦにより、カップリング溶液を除去し、次に、２０ｍＬ／分で２０秒間にわたり送達した６．６ｍＬのＤＭＦに溶解した５０％（ｖ／ｖ）ピペリジンにより、Ｎα−Ｆｍｏｃ保護基を除去した。２０ｍＬ／分で１分間にわたり送達した２０ｍＬのＤＭＦにより、過剰なピペリジンおよびピペリジン−ＤＢＦを除去して、１サイクルを完了した。１％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂においてペプチドを合成した。Ｃ末端カルボキサミドペプチドを産生するために、１グラム当たり１ｍｍｏｌの所定の充填による１７５ｍｇのＭＢＨＡ官能化樹脂を使用し、ＴＦＡに不安定なＲｉｎｋリンカーを第１のアミノ酸としてカップリングした。Ｃ末端ヒドラジドペプチドを産生するために、後述の通りに調製した２００ｍｇのクロロトリチルヒドラジド（ヒドラジド）樹脂を使用した。
ＴＦＡにおける２．５％（ｖ／ｖ）水および２．５％（ｖ／ｖ）ＴＩＰＳで２時間ＲＴにて処理することにより、非システイン含有ペプチドを樹脂から開裂させ、側鎖を脱保護した。ＴＦＡにおける２．５％（ｖ／ｖ）ＥＤＴ、２．５％（ｖ／ｖ）水および１％（ｖ／ｖ）ＴＩＰＳで２時間ＲＴにて処理することにより、システイン含有ペプチドを樹脂から開裂させ、側鎖を脱保護した。あらゆる事例において、樹脂を除去し、窒素を使用して、開裂溶液をＲＴで蒸発乾固させた。得られた固体を冷ジエチルエーテルで３回洗浄し、５０％Ａ／５０％Ｂ（ｖ／ｖ）に溶解し、凍結乾燥した。側鎖保護を次に示す：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）。
上で使用したＷａｎｇ樹脂は、グリシンの有意な二重取り込みを促進することが判明したため、第二世代リアクタにより行われる試験のために、異なる樹脂を使用してＣ末端ヒドラジドを作製した。本発明者らは、この問題を解決することができなかったため、樹脂を変えた。ヒドラジド樹脂を次の通りに産生した：１．２ｍｍｏｌ／グラムの所定の充填による１６グラムのクロロトリチルクロライド樹脂を、１５０ｍＬの乾燥アミンフリーＤＭＦに懸濁し、１５分間撹拌した。これに、２５ｍＬのＤＩＥＡ、５０ｍＬのＤＭＦおよび１０ｍＬの無水ヒドラジンの懸濁液を滴下添加した。添加の際に２層が形成され、底の方を先ず添加した。添加が完了した後に、混合物を１時間撹拌させ、続いて５０ｍＬのメタノールでクエンチした。樹脂を除去し、それぞれ５回の１００ｍＬ分量のＤＭＦ、水、ＤＭＦ、メタノールおよびジエチルエーテル（総洗浄容積２．５Ｌ）で洗浄した。次に、３時間減圧下で（ほぼ５トール）樹脂を乾燥させ、自由に流動する粉末を塊と共に得た。リアクタのフリットを詰まらせ得る微粒子を生じないよう注意しつつ、使用前にこの塊を穏やかに破砕した。
図１６Ａ〜図１６Ｄは、（Ａ）活性化因子としてＨＡＴＵを使用した６０℃における、（Ｂ）活性化因子としてＨＢＴＵを使用した６０℃における、（Ｃ）活性化因子としてＨＢＴＵを使用した室温におけるおよびＤ）匹敵する手動バッチ方法を使用した室温合成における、第二世代プロトコールにより合成したＡＣＰ（６５−７４）の粗ＬＣＭＳクロマトグラムを示す。比較のため、図１６Ｅ〜図１６Ｈは、第一世代リアクタおよびプロトコールによる匹敵する条件下で合成したＡＣＰ（６５−７４）を示す：（Ｅ）活性化因子としてＨＡＴＵを使用した６０℃、（Ｆ）活性化因子としてＨＢＴＵを使用した６０℃、（Ｇ）活性化因子としてＨＢＴＵを使用した室温および（Ｈ）匹敵する手動バッチ方法を使用した室温。全イオン電流を各クロマトグラムに表示する。
（実施例１４）
本実施例は、図１２Ｇにおける合成タイムラインを使用した第二世代リアクタにおけるＡＣＰ（６５−７４）、コノトキシン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ断片およびアフィボディ断片の合成を、実施例１、５および６に記載されている第一世代リアクタにおけるＡＣＰ（６５−７４）、コノトキシン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ断片およびアフィボディ断片の合成と比較する。第二世代リアクタにおいて形成されたペプチドは、第一世代リアクタにおいて合成されたペプチドに匹敵する品質であった。
第一および第二世代合成プロトコールおよびリアクタの性能を比較するために、第二世代リアクタならびにＨＡＴＵ活性化、ＨＢＴＵ活性化および室温におけるＨＢＴＵ活性化によるサイクルを用いてＡＣＰ（６５−７４）を合成した。比較のため、図４におけるデータを再現し、加速された室温バッチ実験を反復した。ＨＢＴＵおよびＨＡＴＵによる標準第二世代合成は、第一世代合成よりも僅かに悪いが、第二世代ＲＴ対照は、共溶出するＧｌｎ欠失生成物を有意に低減させた。２種のプロトコールの性能は異なるが匹敵する。全体的に見て、第二世代システムは、そのサイクル時間の低減および機械的信頼性の大幅な改善のため好まれる。本文章執筆の時点で、本発明者らの研究室は、ペプチド合成のために第二世代プロトコールおよびリアクタを専ら使用している。
第一および第二世代合成プロトコールおよびリアクタの性能をさらに比較するために、ＨＩＶ−１プロテアーゼ断片およびＰｎＩ（Ａ１０Ｌ）コノトキシンの合成を反復した。比較のための図５由来のデータと共に、図１８にデータを示す。２種のプロトコールの性能は匹敵する。
クロロトリチルヒドラジド樹脂の性能を検証し、第二世代リアクタおよびサイクルによる合成をさらに探索するために、アフィボディ断片の合成を反復した。比較のための図７由来のデータと共に、図１９にデータを示す。グリシンなしの断片を合成する場合、２種のリンカーの性能は匹敵する。修飾Ｗａｎｇ樹脂は、グリシンの有意な二重取り込みを促進し、このことは、本発明者らによるヒドラジド樹脂への移行を動機づけた。両方の事例において、調製用クロマトグラフィー後にライゲーションに適した純粋材料を得た。
第二世代合成機の有用性をさらに強調するために、１０種のグルタチオン類似体（図２０を参照）、数種のシステインリッチペプチド（図２１を参照）および２種のビオチン化プロテアーゼ認識部位（図１７を参照）のライブラリを合成した。１日間でグルタチオン類似体を全て産生した。図２１において、全システインがアセトアミドメチル（Ａｃｍ）保護されて、開裂および側鎖脱保護における副反応を防止した。これらのペプチドにおけるシステインを０．１５７ｍＬではなく０．１９０ｍＬのＤＩＥＡで活性化させた。あらゆる事例において、ペプチドは０．２ｍｍｏｌスケールで産生され、主要ピークは所望の生成物であり、１回の調製用ＲＰ−ＨＰＬＣステップにおいて粗材料の精製が成功した（精製された材料は図示せず）。
図１７は、合成されたビオチン化プロテアーゼ認識部位のクロマトグラムを示す。Ｂはβ−アラニン、Ｋ＊はビオチン化リシン、Ｋ’はａｌｌｏｃ保護されたリシンである。ａｌｌｏｃ保護されたペプチドをバッチにおける樹脂上で水素化して、遊離リシンを得て、ビオチンをバッチにおいてカップリングした。８分後に溶出する材料は非ペプチド性である。
図１８は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ断片およびＰｎＩ（Ａ１０Ｌ）コノトキシンの再合成のクロマトグラムを示す。具体的には、図１８Ａ〜図１８Ｄは、（Ａ）第二世代リアクタおよび条件により合成されたコノトキシン、（Ｂ）第二世代リアクタおよび条件により合成されたＨＩＶ−１ ＰＲ（８１−９９）、（Ｃ）第一世代リアクタおよび条件により合成されたコノトキシンならびに（Ｄ）第一世代リアクタおよび条件により合成されたＨＩＶ−１ ＰＲ（８１−９９）を示す。遅く溶出する材料は、側鎖保護された生成物であった。第一および第二世代リアクタ試験の間でＬＣ／ＭＳカラムを置き換えたため、保持時間は僅かに異なる。１５分後に溶出する材料は非ペプチド性であった。
図１９は、アフィボディ断片のクロマトグラムを示す。図１９Ａ〜図１９Ｃは、第二世代プロトコールによるクロロトリチルヒドラジド官能化ポリスチレンにおいて合成された断片を示し、図１９Ｄ〜図１９Ｆは、第一世代プロトコールによる修飾Ｗａｎｇ樹脂において合成された断片を示す。
図２０は、それぞれ１８分間で合成されたグルタチオン類似体のライブラリのクロマトグラムを示す。Ｅ＊は、側鎖カルボン酸塩を介してポリペプチドにカップリングしたグルタミン酸表す。全ペプチドを条件３により分析し、主ピークは、所望の質量を有する。
図２１は、数種のシステインリッチペプチドのクロマトグラムを示す。全システインをＡｃｍ保護した。図２１Ａおよび図２１Ｂにおける材料を条件３により分析し、図２１Ｃにおける材料を条件４により分析した。
（実施例１５）
本実施例は、自動フロープラットフォームの設計および構築について記載する。
自動プラットフォームを設計して、人間である操作者によって課されるサイクル時間に制限なく、手動システムと同じ標準を行った。これらの目標を達成するために、本発明者らは、図２３Ａに示すシステムを組み立てた。自動の流動に基づくプラットフォームは、他の構成要素の中でもとりわけ、２個のＨＰＬＣポンプ、静的ミキサー、マイクロコントローラ（図示せず）、熱交換器、第二世代リアクタおよびＵＶ検出器を含有した。２個のＨＰＬＣポンプは、試薬を送達した。一方のＨＰＬＣポンプは、ＤＭＦに溶解したアミノ酸およびＨＢＴＵの溶液を送達し、他方のポンプは、ＤＩＥＡを送達して、活性化を完了した。０．４Ｍ溶液としてアミノ酸を等モルのＨＢＴＵと共にＤＭＦにおいて貯蔵し、密封されたリアクタ内で貯蔵される場合は活性化塩基なしで、数週間安定であった。
静的ミキサーを使用して、ＤＩＥＡおよびアミノ酸溶液の効果的な混合を確実にし、バルブの位置およびポンプ流量をＡｒｄｕｉｎｏマイクロコントローラにより制御した。静的ミキサーは、これら２種の流体をブレンドし、修正することなく上述の熱交換器、第二世代リアクタおよびＵＶ検出器を使用した。静的ミキサーおよびリアクタの間の滞留時間を増加させるために、追加の６フィートの０．０３０”ＩＤチューブを使用した。滞留時間の増加は、完全な活性化を促進することができ、システムにおいてこの余分な長さのチューブにより産生されたペプチドは、これなしで産生されたペプチドよりも僅かに高い粗純度であると観察された。
図２３Ａに示す全バルブは、２個のマニフォールドに含有され、２４Ｖソレノイドにより始動された。マニフォールドは、最小内部容積を有し、試薬間にゼロクロストークを生じるよう設計された。１個のマニフォールドは、５種の試薬のうち１種を選択するための複数のバルブと、マニフォールドをオンまたはオフにするための１個のバルブからなった。電源を切ると、試薬バルブは、ＤＭＦを選択し、オン／オフバルブは、マニフォールドをオフにした。これらの特色は、アミノ酸のいかなる不正確な取り込みも防止し、マニフォールドの洗浄に必要とされる溶媒の容積を最小化し、溶媒吸い上げを防止した。全体的な流路はＰＴＦＥであった。２ミクロン入口フィルタにより入口ラインを保護した。
ポンプは両者共に５０ｍＬ／分ポンプヘッドを備えるＫｎａｕｅｒ Ｓｍａｒｔｌｉｎｅモデル１００であった。直ぐに利用でき、アナログ電圧により容易に制御されるため、これらのポンプを選択した。しかし、ポンプは、比較的低いポンピング能力を有し、ポンプヘッドを洗浄するために約１０ｍＬの溶媒を必要とした。より高いポンピング能力を有し、ポンプヘッドを洗浄するためにより少ない溶媒容積を必要とするポンプを選択することにより、サイクル時間をさらに減少させることができる。
静的ミキサーは、ＳｔａＭｉｘＣｏにより供給され、その最小要素（６ｍｍ）のうち６種からなる。先に記載された熱交換器をミキサーおよび第二世代リアクタの間に置いた。これらの要素のうち全３種および余分な長さのチューブを６０℃ウォーターバス内に置いた。先に記載されたＵＶ検出器を使用して、廃棄物の流れの吸光度をモニターした。その単純さおよび安定性のため選択されたＡｒｄｕｉｎｏ Ｍｅｇａ２５６０マイクロコントローラにより、この装置を制御した。０〜１０Ｖアナログシグナルを供給してポンプを制御するために、Ａｒｄｕｉｎｏの０〜５Ｖパルス幅変調出力を使用した。シグナルにフィルタをかけ、増幅して、０〜１０Ｖアナログ制御電圧を得た。バルブを制御するために、Ａｒｄｕｉｎｏのデジタル出力を使用して、電力トランジスタを発動させ、続いて外部供給から２４Ｖ ＤＣ電力を供給した。全接地は接地構築で共通であった。
図２３は、自動ペプチド合成プラットフォームおよびこれにより合成された数種のモデルペプチドを示す。図２３Ａ〜図２３Ｅは、（Ａ）装置の模式図、（Ｂ）１０７秒毎にアミノ酸残基を取り込むためにこの装置により使用された合成タイムライン、（Ｃ）１２分間で組み立てたＡＬＦＡＬＦＡを示すクロマトグラム、（Ｄ）１８分間で組み立てたＡＣＰ（６５−７４）を示すクロマトグラム（１、２＝Ｉｌｅ欠失、３＝Ｃ末端の加水分解）および（Ｅ）３７分間で組み立てた（ＡＬＦ）７を示すクロマトグラムである。全イオンクロマトグラムを示す。
（実施例１６）
本実施例は、自動システムを使用したペプチドの合成について記載する。自動サイクル時間は、使用者が手動タスクを完了することができるまたはシリンジポンプが注ぐことができる速度によって限定されなかったため、タイムラインを実質的に加速させた（図２３Ｂを参照）。５０ｍＬ／分（利用できる最大）における２回の４５秒間洗浄、７秒間カップリングおよび１０秒間脱保護は、１０７秒間（１．８分間）毎にアミノ酸残基の取り込みをもたらした。カップリング時間および脱保護時間は、時間が最適化されないほどに僅かな合計時間を表す。しかし、カップリング時間および脱保護時間を最適化することにより、さらにより迅速な時間を達成することができる。１回または複数の洗浄ステップを排除することにより、より迅速な付加サイクルを達成することもできる。これらのサイクルを使用して、ＡＬＦＡＬＦＡを１２．５分間で産生し、ＡＣＰ（６５−７４）を１７．８分間で産生し、システムが機械的に頑強であることを実証するために合成されたモデル２１−ｍｅｒである（ＡＬＦ）７を３７．５分間で産生した。（ＡＬＦ）７の粗品質は、手動第二世代合成プロトコールを使用した合成とほとんど同一であった（図２４を参照）。
次の対照サイクルを使用して、自動システムによりペプチドを合成した。アミノ酸および活性化因子の所望の溶液を選択し、第１のＨＰＬＣポンプにより５０ｍＬ／分で送達した。４秒後に、第２のＨＰＬＣポンプは、９ｍＬ／分でＤＩＥＡを送達し始めた。さらに３秒後（７秒間の合計カップリングのため）、マニフォールドは、ＤＭＦ洗浄溶媒を選択した。１６秒後に、マニフォールドおよびポンプからアミノ酸をほぼ完全に洗い流したら、第２のＨＰＬＣポンプを停止させた。さらに３１秒後（５０ｍＬ／分における合計洗浄時間の４５秒間のため）、ＤＭＦに溶解した５０％ピペリジンを１０秒間５０ｍＬ／分で送達した。最後に、ＤＭＦをさらに４５秒間５０ｍＬ／分で送達して、最終洗浄およびサイクルを完了した。１００ｍＬのＤＭＦにおける０．４Ｍ ＨＢＴＵに４０ｍｍｏｌのＮα−Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を溶解させることにより、アミノ酸および活性化因子の溶液を調製した。側鎖保護を次に示す：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）。アミノ酸の溶解による容積の変化に対する補正は為されなかった。
完全に自動化されたシステムにより３種のペプチド、ＡＬＦＡＬＦＡ、ＡＣＰ（６５−７４）および（ＡＬＦ）７を産生した。ＡＬＦＡＬＦＡは、極めて高い粗純度のものであり、ＡＣＰ（６５−７４）は、手動システムにより多くの条件下で何度も合成された。（ＡＬＦ）７の自動合成を手動システムと比較するために、第二世代リアクタおよびプロトコールにより（ＡＬＦ）７を産生した。クロマトグラムを図２４に示す。２種の粗生成物の品質は非常に同様のものである。図２２は、（Ａ）自動１．８分間サイクルおよび（Ｂ）手動３分間サイクルにより合成された（ＡＬＦ）７のクロマトグラムを示す。
（実施例１７）
本実施例は、１回または複数の試薬除去ステップを欠く付加サイクルを使用したペプチドの合成について記載する。一部の事例において、この図２４に図解されている通り、１回または複数の試薬除去ステップは任意選択であり、除去ステップの非存在は、その後のステップおよび／または付加サイクルの性能にマイナスの影響を与えない。
付加サイクルに含まれるステップのみが異なる２種のペプチドを合成した。ペプチドの配列を次に示す。
Ｈ２Ｎ−ＣＤＩＮＹＴＳＧＦＲＮＳＤＲＩＬＹＳＳＤＷＬＩＹＫＴＴＤＨＹＱＴＦＴＫＩＲ−ＣＯＮＨ２。実施例１３に記載されている通りに一方のペプチドを合成し、対照として用いた。付加サイクルは、アミド結合形成（カップリング）、カップリング試薬の除去（洗浄）、Ｎα Ｆｍｏｃ除去（脱保護）ならびに脱保護試薬および反応生成物、ピペリジン−ジベンゾフルベン（ピペリジン−ＤＢＦ）の除去（洗浄）からなった。合成されたペプチドのクロマトグラムを図２４Ａに示す。追加のサイクルがカップリング剤除去ステップ（即ち、カップリング剤洗浄ステップ）を含まないことを除いて、実施例１３に記載されている通りに別のペプチドを合成した。その後のステップ（例えば、脱保護ステップ）から流入する溶媒は、カップリング試薬および／または反応副産物の少なくとも一部の洗い流しに役立ち、過剰に流入する脱保護試薬により残りのカップリング試薬を破壊した。カップリング試薬洗浄ステップを欠く付加サイクルを使用して合成したペプチドのクロマトグラムを図２４Ｂに示す。任意選択の洗浄ステップを欠くペプチドおよび任意選択の洗浄ステップを含むペプチドの間に有意差は観察されなかった。
（実施例１８）
本実施例は、１３０残基のＤＡＲＰｉｎ ｐＥ５９および１１３残基のバルナーゼの合成について記載する。当業者に公知で、アフィボディのために実施例６に記載されているものと実質的に同様のライゲーション化学を使用して、４個のペプチド断片からこれらのタンパク質のそれぞれを合成した。
図２５Ｂ〜図２５Ｅに示す全イオンクロマトグラムにより、４断片からＤＡＲＰｉｎを合成した：
Ｄ［１］（Ｈ２Ｎ−［１Ｇｌｙ−３１Ｇｌｙ］−ＣＯＮＨＮＨ２）、
Ｄ［２］（Ｈ２Ｎ−［３２Ｃｙｓ−６４Ｇｌｙ］−ＣＯＮＨＮＨ２）、
Ｄ［３］（Ｈ２Ｎ−［６５Ｃｙｓ−９７Ｇｌｙ］−ＣＯＮＨＮＨ２）および
Ｄ［４］（Ｈ２Ｎ−［９８Ｃｙｓ−１３０Ａｓｎ］−ＣＯＮＨ２）。
実施例８に記載されている第二世代リアクタ、実施例１３に記載されている方法および次の例外を有するＨＢＴＵカップリング剤を使用してこれらを合成した。全システインをＡｃｍ保護した。
Ｄ［１］を１残基当たり２分間で合成し、４０ｍｌ／分における２回の３０秒間洗浄を行った。さらに、ポンプ流量を手動で変える際の困難のため、４０ｍｌ／分において２０秒間、脱保護を行った。より短い脱保護および／またはより低い流量の脱保護および／またはより希釈された脱保護試薬（例えば、ＤＭＦにおける２０％ピペリジン）による脱保護が、この加速されたサイクルに効果的となり、脱保護試薬を保存することが考えられる。
実施例８および１３に記載されている通りに、Ｄ［２］およびＤ［３］を合成した。
ＭＢＨＡ−ポリスチレン樹脂ではなくアミノメチル−ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｙｒｅｎｅ）樹脂においてＤ［４］を合成した。実施例２０に記載されている通りに樹脂を調製した。２，２ジメチルシュードプロリンジペプチドとして１１４Ｓｅｒおよび１１３Ｉｌｅを取り込み、カップリング試薬の完全送達後に付加サイクルを休止することにより１０分間カップリングした。この休止が不要であることが考えられる。標準ｔ−ブチルエステル側鎖保護ではなく、３−メチルペンチルエステル側鎖保護を有する１１６Ａｓｐを取り込んだ。最後に、２０ｍｌ／分において２０秒間、２０％ピペリジンおよびＤＭＦにおける０．１Ｍ ＨＯＢｔにより脱保護を行った。
図２６Ｂ〜図２６Ｅに示す全イオンクロマトグラムにより、４断片からバルナーゼを合成した：
Ｂ［１］（Ｈ２Ｎ−［１Ｇｌｙ−１３Ｖａｌ］−ＣＯＮＨＮＨ２）Ｂ［２］（Ｈ２Ｎ−［１４Ｃｙｓ−３９Ｖａｌ］−ＣＯＮＨＮＨ２）Ｂ［３］（Ｈ２Ｎ−［４０Ｃｙｓ−７６Ｇｌｕ］−ＣＯＮＨＮＨ２）およびＢ［４］（Ｈ２Ｎ−［７４Ｃｙｓ−１１３Ａｒｇ］−ＣＯＮＨ２）。
実施例８に記載されているリアクタ、実施例１３に記載されている方法および次の例外を有するＨＡＴＵカップリング剤を使用して、これらを合成した。脱保護試薬としてＤＭＦにおける２０％ピペリジンを使用して、全ペプチドを合成した。全システインをＡｃｍ
保護し、シクロヘキシルエステルとして７６Ｇｌｕを取り込んだ。
Ｂ［１］の合成のため、バリンカップリング試薬の送達後に付加サイクルを休止することにより、ｃ末端バリンを樹脂に１０分間カップリングした。より短いカップリングおよび／またはより高温でのカップリングを使用することができることが考えられるが、実施例１３に記載されている６０℃における３０秒間カップリングが、立体的に妨げられたバリンを立体的に妨げられたトリチルヒドラジド樹脂に定量的に結合させるために適切でないことが判明した。
Ｂ［２］の合成のため、Ｂ［１］と同様に、ｃ末端バリンを樹脂に１０分間カップリングし、ヒドロキシメトキシベンジル（ＨＭＢ）骨格保護を有する３３Ａｌａを取り込んだ。ＨＡＴＵではなくＤＣＣ／ＨＯＢｔによりこの残基を活性化させ、カップリング試薬の完全送達後にアミノ酸付加サイクルを２５分間休止することにより、２５分間カップリングした。カップリング試薬の完全送達後にアミノ酸付加サイクルを３０分間休止することにより、その後のグルタミン酸を３０分間カップリングした。より高温で操作することにより、ＨＭＢ保護されたアミノ酸の取り込みを加速させることができることが考えられる。
上述ならびに実施例８および１３に記載されている通り、Ｂ３を合成した。
ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘにより供給されたＲｉｎｋ−ＰＥＧ樹脂においてＢ４を合成し、
ＨＡＴＵではなくＤＣＣ／ＨＯＢｔにより９０Ａｒｇを活性化した。
粗タンパク質断片の調製後に、当業者に公知であり、実施例１２に記載されている方法と実質的に同様の方法を使用したＲＰ−ＨＰＬＣによりこれらを精製した。次に、図２５Ａおよび図２６Ａにおけるスキームに従って、精製された断片をライゲーションして、それぞれ図２５Ｆおよび図２６Ｆに示す全長タンパク質を得た。若干の修正を入れたＬｉｕ
と共同研究者の手順に従って、当業者に公知の方法によりライゲーションを行った。
（実施例１９）
本実施例は、ヒトインスリンのＡおよびＢ鎖ならびにＥＥＴＩ−ＩＩトリプシン阻害剤に基づく進化したインテグリン結合足場の合成について記載する。粗合成生成物の全イオンクロマトグラムをそれぞれ図２７Ａ〜図２７Ｃに示す。これらのペプチドは全て、ＭＢＨＡ官能化ポリスチレンの代わりにアミノメチル官能化ポリスチレンを使用して合成した。当業者に公知の方法を使用して、下の実施例２０に記載される通りに、アミノメチル官能化ポリスチレンを調製した。
合成が８５℃で行われ、全システインがＡｃｍ保護されたことを除いて、実施例８に記載されている第二世代リアクタおよび実施例１３に記載されている方法を使用して、ヒトインスリンのＡ鎖を合成した。合成が８５℃で行われることを除いて、実施例８に記載されているリアクタおよび実施例１３に記載されている方法を使用して、ヒトインスリンのＢ鎖を合成した。全キラルアミノ酸が、反転したキラリティー（即ち、右旋性（ｄｅｘｔｒｏｒｏｔｏｔｏｒｙ））のものであることを除いて、実施例８に記載されているリアクタおよび実施例１３に記載されている方法を使用して、インテグリン結合足場を合成した。
本発明のいくつかの実施形態を本明細書において記載および図解してきたが、当業者であれば、機能を行うため、ならびに／または結果および／もしくは本明細書に記載されている利点のうち１種もしくは複数を得るための種々の他の手段ならびに／または構造物を容易に想定することができ、このような変更および／または修正のそれぞれは、本発明の範囲内であると考慮される。より一般には、当業者であれば、本明細書に記載されているあらゆるパラメータ、寸法、材料および構成が、例示的なものとして企図され、実際のパラメータ、寸法、材料および／または構成が、本発明の教示するところが使用される特定の適用（単数または複数）に依存することを容易に認めることができる。
（実施例２０）
本実施例は、実施例１８および１９において使用されるアミノメチル樹脂の調製のための手順について記載する。
アミノメチル樹脂を調製するために、２５ｇのＢｉｏ−Ｒａｄ、Ｂｉｏ−ビーズＳ−Ｘ１（スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、１％架橋）および４．９ｇ（２７．６ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシメチルフタルイミドを、１Ｌ丸底フラスコ内の４５０ｍＬのＤＣＭに添加した。これに、５０ｍＬのメタンスルホン酸を添加し、この反応物を５時間室温で穏やかに撹拌した。５時間の撹拌後に、粗いフリット付きガラス漏斗にスラリーを移し、ＤＣＭ（１５００〜２０００ｍＬ）およびエタノール（１５００ｍＬ）で洗浄した。次に、樹脂を真空下で１時間乾燥させた。乾燥後に、フタルイミドメチル樹脂を５００ｍＬ丸底フラスコに移し、無水エタノール中のヒドラジン一水和物（２０％ｖ／ｖ）の２００ｍＬ溶液に懸濁した。還流冷却器を取り付け、溶液を少なくとも８時間穏やかに還流させた。得られたゼラチン状材料を熱い状態でガラスフリット付き漏斗に移し、白色のフタル（ｐｔｈａｌ）ヒドラジド沈殿物を完全に洗い流すために、沸騰エタノール（１０００〜２０００ｍＬ）および続いて熱いメタノール（１０００ｍＬ）で洗浄した。次に、ＤＭＦ（８００ｍＬ）、ＤＣＭ（８００ｍＬ）、ＤＭＦにおける１０％（ｖ／ｖ）ＤＩＥＡ（５００ｍＬ）、ＤＭＦ（６００ｍＬ）およびＤＣＭ（１０００ｍＬ）で樹脂を洗浄した。次に、樹脂を真空下で乾燥させ、１．２ｍｍｏｌ／ｇの充填を有すると決定した。
当業者であれば、ルーチン実験に過ぎないものを使用して、本明細書に記載されている本発明の特異的な実施形態の多くの均等物を認識する、あるいは確認することができる。したがって、前述の実施形態が単なる例として示されており、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内において、特に記載および請求されている以外の仕方で本発明を実施することができることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載されているそれぞれ個々の特色、システム、物品、材料および／または方法を対象とする。加えて、２個またはそれを超えるこのような特色、システム、物品、材料および／または方法のいずれかの組合せは、このような特色、システム、物品、材料および／または方法が相互に一致する場合、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書および特許請求の範囲において使用される単数を表す不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、それとは反対のことが明示されていない限り、「少なくとも１個」を意味するものと理解されたい。
本明細書および特許請求の範囲において使用される語句「および／または」は、このように等位結合した要素、即ち、一部の事例において接続的に存在し、他の事例において離接的に存在する要素の「いずれか一方または両方」を意味するものと理解されたい。それとは反対のことが明示されていない限り、特に同定されている要素に関係するのであれ関係しないのであれ、「および／または」節によって特に同定されている要素以外の他の要素は、任意選択で存在してよい。よって、非限定例として、「Ａおよび／またはＢ」の参照は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等、オープンエンドな言語と併せて使用される場合、一実施形態において、ＢなしのＡ（Ｂ以外の要素を任意選択で含む）；別の実施形態において、ＡなしのＢ（Ａ以外の要素を任意選択で含む）；さらに別の実施形態において、ＡおよびＢの両方（他の要素を任意選択で含む）；等を指すことができる。
本明細書および特許請求の範囲において使用される通り、「または」は、上に定義されている「および／または」と同じ意義を有するものと理解されたい。例えば、リストにおける項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的である、即ち、要素の数またはリストのうち少なくとも１個（但し１個超も含む）と、任意選択で追加的な収載されていない項目の包括として解釈される。「のうち１個のみ」または「のうち正確に１個」、あるいは特許請求の範囲において使用される場合は「からなる」等、それとは反対のことが明らかに示される用語のみが、要素の数またはリストの正確に１個の要素の包括を指す。一般に、用語「または」は、「いずれか」、「のうち１個」、「のうち１個のみ」または「のうち正確に１個」等、排他性の用語が先行する場合、本明細書において、排他的二者択一（即ち、「一方または他方、但し、両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈される。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野において使用されるその通常の意義を有する。
本明細書および特許請求の範囲において使用される通り、１個または複数の要素のリストに関する語句「少なくとも１個」は、要素のリストにおけるいずれか１個または複数の要素から選択される少なくとも１個の要素を意味するが、要素のリスト内に特に収載されているありとあらゆる要素のうち少なくとも１個を必ずしも含む必要はなく、要素のリストにおける要素のいかなる組合せも排除しないと理解されたい。この定義は、特に同定されている要素に関係するのであれ関係しないのであれ、語句「少なくとも１個」が指す要素のリスト内に特に同定されている要素以外の要素が任意選択で存在してよいことも可能にする。よって、非限定例として、「ＡおよびＢのうち少なくとも１個」（または等しく「ＡまたはＢのうち少なくとも１個」または等しく「Ａおよび／またはＢのうち少なくとも１個」）は、一実施形態において、１個超を任意選択で含む少なくとも１個、Ａ、但しＢは存在しない（Ｂ以外の要素を任意選択で含む）；別の実施形態において、１個超を任意選択で含む少なくとも１個、Ｂ、但しＡは存在しない（Ａ以外の要素を任意選択で含む）；さらに別の実施形態において、１個超を任意選択で含む少なくとも１個、Ａおよび１個超を任意選択で含む少なくとも１個、Ｂ（他の要素を任意選択で含む）；等を指すことができる。
特許請求の範囲および上述の本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」その他等、あらゆる移行句は、オープンエンドである、即ち、「等が挙げられるがこれらに限定されない」を意味すると理解されたい。米国特許庁特許審査便覧（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、２１１１．０３条に記されている通り、移行句「からなる」および「から本質的になる」のみが、それぞれクローズド（ｃｌｏｓｅｄ）またはセミクローズドな移行句である。

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  1. 本願図面に記載の発明。
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