JP2021078500A - 変異体ポア - Google Patents

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Abstract

【課題】細菌アミロイド分泌チャネルＣｓｇＧの構造を同定し、及びこれを利用したＣｓｇＧナノポアの構築、並びに該ＣｓｇＧナノポアのタンパク質センシング用途、特に、核酸センシングにおける使用に関する。【解決手段】位置Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６のうちの１つまたは複数に修飾を含む、少なくとも１つの修飾ＣｓｇＧモノマー、これを含む修飾生体ポアであって、これを使用する、分析物の検出および特徴づけも提供する。【選択図】なし

Description

本発明は新規タンパク質ポアおよびそれらの使用に関する。詳細には、本発明は、核酸
シークエンシング用途および分子センシングにおける生体ナノポアに関する。
本発明は、ＣｓｇＧの変異型に関する。本発明は、ＣｓｇＧを使用する分析物の検出お
よび特徴づけにも関する。
タンパク質ポアは、膜貫通ポリペプチドであり、その膜内でイオンおよびある特定の分
子が通過しうるチャネルを形成している複合体である。このチャネルの最小直径は、通常
はナノメートル（１０−９メートル）範囲であり、したがって、これらのポリペプチドの
一部は「ナノポア」と名づけられている。
ナノポアには、生体センサーとしての大きな可能性がある。膜結合ナノポアを介して電
気的電位を印加すると、イオンがチャネルを通って流れる。イオンのこの流れを電流とし
て測定することができる。単一チャネル記録機器を使用する好適な電気的測定技術は、例
えば、国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットおよびD. Stoddart et al., Proc
. Natl. Acad. Sci., 2010, 106, 7702-7に記載されている。多チャネル記録技術は、例
えば、国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットに記載されている。
ポアによって翻訳するまたはポア内もしくは付近に結合する分子は、チャネルを通るイ
オン流を妨げることによってそのイオン流を低減させるように作用する。電流の低減によ
って測定されるイオン流の低減の程度は、ポア内のまたはポアの付近の妨害の大きさを示
す。したがって、測定される電流をチャネルに対する妨害の大きさおよび程度の測度とし
て使用することができる。電流の変化は、分子または分子の一部がポアにもしくは付近に
結合したことの同定（分子センシング）に使用することができ、またはある特定のシステ
ムでは、ポア内に存在する分子の正体のそのサイズに基づく判定（核酸シークエンシング
）に使用することができる。
生体ナノポアを使用して核酸をシークエンシングする「鎖シークエンシング」法は公知
である。１本のポリヌクレオチド鎖をナノポアに通過させることで、個々のヌクレオチド
上の塩基を、それらがナノポアのチャネルを一時的に通過するときに測定される電流の変
化によって判定する。この方法は、核酸シークエンシングの旧来の方法に比べて有意な時
間およびコスト節約をもたらす。
以前に報告されたタンパク質ナノポア、例えば、変異体ＭｓｐＡ（Manrao et al., Nat
ure Biotechnology, 2012, 30(4), 349-353）およびアルファ溶血素ナノポア（Nat. Nano
technol., 2009, 4(4), 265-70）は、「鎖シークエンシング」アプローチを使用する核酸
シークエンシングに使用されている。同様に、タンパク質センシングに他のポア、例えば
、アルファ溶血素（J Am Chem Soc, 2012, 134(5), 2781-7）およびＣｌｙＡ（Am. Chem.
Soc. Nano. 2014, 8(12), 12826-35）（J. Am. Chem. Soc, 2013, 135(36), 13456-63）
も適応されている。
先行技術の不足、特に、分子センシング用途および例えば核酸シークエンシング用途の
ためのポアの寸法および特徴の最適化の点での先行技術の不足を克服する新規ナノポアが
依然として必要とされている。
ナノポアセンシングは、分析物分子と受容体との個々の結合または相互作用事象の観察
に依存するセンシングへのアプローチである。ナノポアセンサーは、ナノメートル寸法の
単一ポアを絶縁膜内に配置し、そのポアを通る電圧依存性イオン輸送を分析物分子の存在
下で測定することによって、作り出すことができる。分析物の正体は、その特有の電流兆
候、特に、電流遮断の継続時間および程度ならびに電流レベルの変動によって明らかにさ
れる。
迅速で安価な核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）シークエンシング技術が、現今、幅広
い用途にわたって必要とされている。既存の技術は、時間がかかり、費用がかかり、その
主な理由は、それらの技術が、大量の核酸の産生を増幅技術に頼り、シグナル検出に多量
の専門蛍光化学物質を必要とすることにある。ナノポアセンシングには、要求ヌクレオチ
ドおよび試薬量を低減させることによって迅速で安価な核酸シークエンシングを提供する
可能性がある。
ナノポアセンシングを使用する核酸のシークエンシングの必須要素のうちの２つは、（
１）ポアを通る核酸の移動の制御および（２）ポアを通って核酸ポリマーを移動させなが
らのヌクレオチドの識別である。従来、ヌクレオチド識別を果たすために、核酸を溶血素
の変異体に通してきた。これによって電流兆候が得られており、そのような電流兆候は、
配列依存性であることが証明されている。溶血素ポアを使用すると多数のヌクレオチドが
観測電流に寄与して、観測電流とポリヌクレオチドとの直接的関連を困難にすることも証
明されている。
ヌクレオチド識別のための電流範囲は、溶血素ポアの変異によって改善されたが、ヌク
レオチド間の電流の違いをさらに改善することができればシークエンシングシステムはよ
り高い性能を有することになる。加えて、ポアを通って核酸を移動させたとき、一部の電
流状態はより大きな変動を示すことが観測されている。一部の変異体溶血素ポアが他のも
のより大きい変動を示すことも証明されている。これらの状態の変動は配列特異的情報を
有することもあるが、システムを単純にするために変動が小さいポアを生じさせることが
望ましい。観測電流に寄与するヌクレオチドの数を低減させることも望ましい。
本発明者らは、細菌アミロイド分泌チャネルＣｓｇＧの構造を同定した。ＣｓｇＧチャ
ネルは、おおよそ０．９ｎｍの最小直径を有するチャネルを形成する膜貫通オリゴマータ
ンパク質である。ＣｓｇＧナノポアのこの構造のため、ＣｓｇＧナノポアは、タンパク質
センシング用途、特に、核酸センシングにおける使用に好適である。ＣｓｇＧポリペプチ
ドの修飾バージョンは、そのような特定の用途に対するそのチャネルの適合性をさらに向
上させるのに役立つことができる。
ＣｓｇＧポアは、その構造がＤＮＡセンシング用途に好都合である点でＣｌｙＡまたは
アルファ溶血素などの既存のタンパク質ポアより有利である。ＣｓｇＧポアは、ＣｌｙＡ
より有利なアスペクト比を有し、その結果、ＣｌｙＡより短い膜貫通チャネルを含む。Ｃ
ｓｇＧポアは、アルファ溶血素ポアと比較して広いチャネル開口部も有する。これは、あ
る特定の用途、例えば、核酸シークエンシング用途のための酵素の結合を助長することが
できる。これらの実施形態では、それは、酵素と読み取りヘッド（最も狭いポア部分と定
義する）の間に位置する核酸鎖部分の長さを最小化し、その結果、読み出しシグナルを向
上させることもできる。ＣｓｇＧポアのチャネルの狭い内部狭窄は、核酸シークエンシン
グを含む本発明の実施形態では、一本鎖ＤＮＡの移行も助長する。この狭窄は、隣接タン
パク質モノマーにおける５１位のチロシン残基（Ｔｙｒ５１）の並置ならびにまた５６お
よび５５位のそれぞれフェニルアラニンおよびアスパラギン残基（Ｐｈｅ５６およびＡｓ
ｎ５５）によって形成される２つの輪状の環で作られる。この狭窄の寸法を変更すること
ができる。ＣｌｙＡは、現在はシークエンシングに使用されない二本鎖ＤＮＡの通過を可
能にする、はるかに広い内部狭窄を有する。アルファ溶血素ポアは、１つの１．３ｎｍ幅
内部狭窄を有するが、さらなる読み取りヘッドを特徴とする２ｎｍ幅ベータバレルも有す
る。
第１の態様では、本発明は、分子センシングのための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設
けるステップ、
ｂ）絶縁層を介して電気的電位を印加し、それによって生体ポアを通る電流の流れを確
立するステップ、
ｃ）ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と接触させるステップ、および
ｄ）生体ポアを通る電流の流れを測定するステップ
を含む方法に関する。
通常、絶縁層は、脂質二重層などの膜である。実施形態では、ポアを通る電流は、絶縁
層の第１の側面から絶縁層の第２の側面への可溶性イオンの流れによって搬送される。
本発明の実施形態では、分子センシングは、分析物検出である。特定の実施形態では、
分析物を検出するための方法は、ステップ（ｄ）の後に、試験基質が不在であるときに生
体ポアを通る電流と比較して生体ポアを通る電流を低減させることによって試験基質の存
在を判定するさらなるステップを含む。
本発明の代替実施形態では、分子センシングは、核酸シークエンシングである。通常は
、前記方法によってシークエンシングされる核酸のタイプは、ＤＮＡまたはＲＮＡである
。本発明の特異的実施形態では、ＣｓｇＧ生体ポアは、さらなるアクセサリータンパク質
に順応するように適合される。通常は、さらなるアクセサリータンパク質は、ＤＮＡまた
はＲＮＡポリメラーゼ、イソメラーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、テロメラーゼ
、エキソヌクレアーゼ、およびヘリカーゼからなる群から選択される、核酸プロセシング
酵素である。
本発明の実施形態では、ＣｓｇＧ生体ポアは、修飾ＣｓｇＧポアであり、修飾ＣｓｇＧ
ポアは、ＣｓｇＧポアを形成するＣｓｇＧモノマーの少なくとも１つにおけるモノマー野
生型大腸菌（E-coli）ＣｓｇＧポリペプチド配列に少なくとも１つの修飾を有する。通常
は、ＣｓｇＧポアを形成するＣｓｇＧモノマーすべてに同じ修飾が施される。本発明の特
定の実施形態では、修飾ＣｓｇＧモノマーは、配列番号４〜３８８による３８〜６３位の
ポリペプチド配列を有する。
第２の態様では、本発明は、少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾ＣｓｇＧ生
体ポアであって、０．５ｎｍ〜１．５ｎｍの範囲の直径を有するチャネル狭窄を１つしか
有さない修飾ＣｓｇＧ生体ポアに関する。通常は、ＣｓｇＧモノマーのポリペプチド配列
の３８〜６３位に修飾がある。好適には、Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６から
選択される位置に修飾がある。特定の実施形態では、位置Ｔｙｒ５１に修飾があるか、位
置Ａｓｎ５５とＰｈｅ５６の両方に修飾がある。
本発明の実施形態では、ＣｓｇＧモノマーへの修飾は、天然に存在するアミノ酸の置換
、天然に存在するアミノ酸の欠失、および天然に存在するアミノ酸側鎖の修飾からなる群
から選択される。好適には、修飾によって未修飾アミノ酸の立体障害が低減または除去さ
れる。特異的実施形態では、ポアの少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーは、配列番号４〜
３８８による３８〜６３位のポリペプチド配列を有する。
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の修飾ＣｓｇＧ生体ポアの少なくとも
１つのＣｓｇＧモノマーをコードする単離されたポリペプチドに関する。
第４の態様では、本発明は、本発明の第３の態様の単離されたポリペプチドをコードす
る単離された核酸に関する。
第５の態様では、本発明は、
ａ）絶縁層と、
ｂ）絶縁層内のＣｓｇＧ生体ポアと、
ｃ）生体ポアを通る電流を測定するための装置と
を含むバイオセンサーに関する。
特定の実施形態では、バイオセンサー内のＣｓｇＧ生体ポアは、本発明の第２の態様に
よる修飾ＣｓｇＧ生体ポアである。
第６の態様では、本発明は、生体センシング用途のためのＣｓｇＧ生体ポアの使用に関
し、生体センシング用途は、分析物検出または核酸シークエンシングである。本発明の第
６の態様の実施形態では、核酸シークエンシングは、ＤＮＡシークエンシングまたはＲＮ
Ａシークエンシングである。
本発明者らは、驚くべきことに、ＣｓｇＧおよびその新規変異体をポリヌクレオチドな
どの分析物の特徴づけに使用することができる可能性があることを立証した。本発明は、
変異体ＣｓｇＧモノマーであって、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用するそのモ
ノマーの能力を向上させるために１つまたは複数の修飾が施された変異体ＣｓｇＧモノマ
ーに関する。本発明者らは、驚くべきことに、新規変異体モノマーを含むポアは、ポリヌ
クレオチドなどの分析物との相互作用能力が向上されており、したがって、ポリヌクレオ
チドの配列などの分析物の特徴を推定する特性の向上を示すことも立証した。変異体ポア
は、ヌクレオチド識別の向上を驚くほど示した。詳細には、変異体ポアは、異なるヌクレ
オチド間の識別をより容易にする電流範囲の増加、およびシグナル対ノイズ比を増加させ
る状態変動の低減を、驚くほど示した。加えて、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動し
ているときに電流に寄与するヌクレオチドの数が減少される。これは、ポアを通ってポリ
ヌクレオチドが移動しているときに観測される電流とポリヌクレオチドとの直接的関連の
同定をより容易にする。加えて、変異体ポアは、スループット増加を示すこともあり、す
なわち、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用する可能性がより高い。これは、ポア
を使用する分析物の特徴づけをより容易にする。変異体ポアは、より容易に膜に入ること
ができる。
したがって、本発明は、配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体Ｃｓ
ｇＧモノマーであって、バリアントが位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの１つもし
くは複数に修飾を含む、変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。
したがって、本発明は、配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体Ｃｓ
ｇＧモノマーであって、バリアントが以下の１つまたは複数を含む、変異体ＣｓｇＧモノ
マーを提供する：（ｉ）次の位置における１つもしくは複数の変異（すなわち、次の位置
の１つもしくは複数における変異）：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２
、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２、（ｉｉ
）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６もしくはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６に
おける変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲもしくはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２
Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹもしくはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９Ｑもし
くはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱもしくはＥ１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）
Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱもしくはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１Ｑもしくは
Ｅ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱもしくはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ）位置
Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５
７の１つもしくは複数の欠失。
本発明は、
− 共有結合している２つ以上のＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、モノマーの少
なくとも１つが本発明の変異体モノマーである、構築物、
− 本発明の変異体モノマーまたは本発明の構築物をコードするポリヌクレオチド、
− 本発明の同一の変異体モノマーまたは本発明の同一の構築物を含むＣｓｇＧに由来す
るホモオリゴマーポア、
− 本発明の少なくとも１つの変異体モノマーまたは本発明の少なくとも１つの構築物を
含むＣｓｇＧに由来するヘテロオリゴマーポア、
− 標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法であって、
ａ）標的分析物をＣｓｇＧポアまたはその変異体と、標的分析物がポアに対して移動す
るように接触させるステップ、および
ｂ）分析物がポアに対して移動しているときに１回または複数回測定を行い、それによ
って分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステップ
を含む方法、
− 標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成する方法であって、Ｃｓｇ
Ｇポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それに
よって、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成するステップを含む方
法、
− 標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーであって、ＣｓｇＧポアまたはそ
の変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含むセンサー、
− 標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するためのＣｓｇＧポ
アまたはその変異体の使用、
− 標的分析物を特徴づけるためのキットであって、（ａ）ＣｓｇＧポアまたはその変異
体と（ｂ）膜の成分とを含むキット、
− 試料中の標的分析物を特徴づけるための装置であって、（ａ）複数のＣｓｇＧポアま
たはそれらの変異体と（ｂ）複数の膜とを含む装置、
− 標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、
ａ）ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、ポリメラーゼおよび標識ヌク
レオチドと、リン酸塩標識化学種がポリメラーゼによって標的ポリヌクレオチドに逐次的
に付加されるように接触させ、リン酸塩化学種が各ヌクレオチドに特異的な標的を含有す
るものであるステップ、および
ｂ）ポアを使用してリン酸塩標識化学種を検出し、それによってポリヌクレオチドを特
徴づけるステップ
を含む方法、ならびに
− 本発明の変異体モノマーまたは本発明の構築物を産生する方法であって、好適な宿主
細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させ、それによって本発明の変異体モノマ
ーまたは構築物を産生するステップを含む方法
も提供する。
リボン表示および表面表示でのＣｓｇＧノナマーのそのチャネルコンフォメーションの構造を示す側面断面図である。 ＣｓｇＧチャネル狭窄（すなわち、ナノポアセンシング用途の状況でのポアの読み取りヘッド）および関連する直径の測定を示す断面図である。 スタックされた３つの同心円の側鎖層：Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５、およびＰｈｅ５６を含む、ポア狭窄に寄与する構造モチーフ図である。 ＣｓｇＧ様タンパク質（配列番号４４２〜配列番号４４８）の多重配列アライメントを含む、ＣｓｇＧホモログの配列相同性を示す図である。選択された配列は、ＣｓｇＧ様配列の系統樹（示していない）全体の単系統クレードから選択され、配列多様性の代表的な図を示す。β−ストランドまたはα−ヘリックスの二次構造エレメントをそれぞれ、矢印またはバーとして示し、これらは大腸菌（E.coli）ＣｓｇＧの結晶構造に基づく。重要であることから、大腸菌（E.coli）のＴｈｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６と同等の残基を矢印で強調する。これらの残基は、ポアの内部狭窄、すなわち、ナノポアセンシング用途の状況でのポアの読み取りヘッドを形成する。 平面リン脂質二重層に再構成され、＋５０ｍＶ（ｎ＝３３）または−５０ｍＶ（ｎ＝１３）の電場で測定したＣｓｇＧの代表的な単一チャネル電流記録（ａ）およびコンダクタンスのヒストグラム（ｂ）を示すグラフ図である。 ＰＰＢ再構成ＣｓｇＧの＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶでの、ならびにＣｓｇＥの増加濃度を補充した場合の単一チャネル電流記録を示すグラフ図である。水平方向のスケールバーは０ｐＡに存在する。 ａ、Ｃ８Ｅ４／ＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧの未加工のネガティブ染色ＥＭ画像を示す図である。矢印は、ｇに示されるサイズ排除プロファイルに表示される異なる粒子集団を示し、（Ｉ）ＣｓｇＧノナマーの凝集体、（ＩＩ）ＣｓｇＧオクタデカマー、および（ＩＩＩ）ＣｓｇＧノナマーである。スケールバー、２０ｎｍ。ｂ、表記のオリゴマー化状態の上面図および側面図の代表的なクラス平均画像。ｃ、９回の対称性を示す、上面図のＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧの回転方向の自己相関関数グラフ。ｄ、ＣｓｇＧＣ１Ｓの未加工のネガティブ染色ＥＭ画像。矢印は、ｇのサイズ排除クロマトグラフィーで観察されたヘキサデカマー（ＩＶ）およびオクタマー（Ｖ）粒子を示す。ｅ、ＣｓｇＧＣ１Ｓオリゴマーの側面図の代表的なクラス平均画像。この構築物に関して上面図は観察されなかった。ｆ、ｇで示されるサイズ排除クロマトグラフィーで観察されたＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧ粒子の溶出体積（ＥＶ）、計算分子量（ＭＷｃａｌｃ）、ＣｓｇＧのオリゴマー化状態（ＣｓｇＧｎ）に対応する予想分子量（ＭＷＣｓｇＧ）、ならびにネガティブ染色ＥＭおよびＸ線結晶学で観察された粒子の対称性の表。ｇ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行したＣｓｇＧＣ１Ｓ（黒色）およびＣ８Ｅ４／ＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧ（灰色）のサイズ排除クロマトグラム。ｈ、ｉ、結晶化オリゴマーのリボン表示の上面図および側面図であり、ＣｓｇＧＣ１ＳのＤ８ヘキサデカマー（ｈ）、および膜抽出ＣｓｇＧのＤ９オクタデカマー（ｉ）を示す。１つのプロトマーをＮ末端（青色）からＣ末端（赤色）にかけて虹色で示す。結晶に捕捉されるテール−テールダイマーを形成する２つのＣ８オクタマー（ＣｇＧＣ１Ｓ）またはＣ９ノナマー（ＣｓｇＧ）を青色と黄褐色で示す。ｒおよびθはそれぞれ、半径およびプロトマー間回転を示す。 ＮＣＳにより平均化して密度を修正した実験的ＳＡＤ相を使用して計算し、１．５σの等高線で表示するＣｓｇＧＣ１Ｓの２．８Åでの電子密度マップを示す図である。マップは、チャネル構築領域（ＣＬ：単一のプロトマーを表示する）を示し、最終の精密化モデルに重ね合わせている。ＣｓｇＧＣ１Ｓは、成熟ＣｓｇＧ配列のＮ−末端Ｃｙｓ、すなわちＣｙｓ１がＳｅｒに置換され、それによって大腸菌（E.coli）ＬＯＬ経路による脂質修飾が欠如している変異体ＣｓｇＧである。これによって、ネイティブの脂質修飾ＣｓｇＧによって形成される膜標的化ホモノナマーポアとは反対のプレポアコンフォメーションで存在する（図４２を参照されたい）可溶性のホモオクタマーオリゴマーが得られる（図４３）。 Ｃ−末端からＮ−末端方向に示す、細長いコンフォメーションのチャネルの中を貫通するポリアラニン鎖によるＣｓｇＧ狭窄モデルの上面図（図９ａ）および側面図（図９ｂ）を示す図である。図９ｂに存在するポリアラニン鎖のモデル溶媒和を、明確にするためにＣ−ループを除去して図９ｃに示す（ポリアラニン鎖全体の１０Å以内の溶媒分子を示す）。 大腸菌（E.coli）からのＣｓｇＧを示す図である。 ＣｓｇＧの寸法を示す図である。 １０Å／ナノ秒での１Ｇ転位を示す図である。グアニンがＣｓｇＧ−ＥｃｏのＦ５６環に入るためには大きい障壁が存在する。＊＝ＧはＦ５６環に入る。Ａ＝Ｇは５６環との相互作用を中止する。Ｂ＝Ｇは、５５環との相互作用を中止する。Ｃ＝Ｇは５１環との相互作用を中止する。 １００Å／ナノ秒でのｓｓＤＮＡ転位を示す図である。ＤＮＡをＣｓｇＧ−Ｅｃｏの狭窄の中に引っ張るにはより大きい力が必要である。 １０Å／ナノ秒でのｓｓＤＮＡ転位を示す図である。ＣｓｇＧ−Ｆ５６Ａ−Ｎ５５ＳおよびＣｓＧ−Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｙ５１Ａ変異体はいずれも、ｓｓＤＮＡ転位の障壁がより低い。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較してスループットの増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較してスループットの増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して挿入の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して挿入の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 実施例１８で使用したＤＮＡ構築物Ｘを示す図である。１と表示される領域は、３０個のＳｐＣ３スペーサーに対応した。２と表示される領域は配列番号４１５に対応した。３と表示される領域は、４個のｉＳｐ１８スペーサーに対応した。４と表示される領域は、配列番号４１６に対応した。５と表示される部分は、４個の５−ニトロインドールに対応した。６と表示される領域は、配列番号４１７に対応した。７と表示される領域は配列番号４１８に対応した。８と表示される領域は、４個のｉＳｐ１８スペーサー（９と表示される領域）が配列番号４１９の３‘末端に結合している配列番号４１９に対応した。ｉＳｐ１８スペーサーの反対側の末端は、３’コレステロールテザーであった（１０と表示される）。１１と表示される領域は４個のＳｐＣ３スペーサーに対応した。 ＣｓｇＧタンパク質のＳｔｒｅｐ ｔｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）精製の一例としてのクロマトグラフィートレースを示すグラフ図である（ｘ軸の表示＝溶出体積（ｍＬ）、Ｙ軸の表示＝吸光度（ｍＡｕ））。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ＤＤＭ中の試料をロードして、１０ｍＭデスチオビオチンによって溶出させた。ＣｓｇＧタンパク質が溶出する溶出ピークをＥ１と表示する。 最初のＳｔｒｅｐ精製後のＣｓｇＧタンパク質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ可視化の例を示す写真である。４〜２０％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を１×ＴＧＳ緩衝液中、３００Ｖで２２分間泳動（run）させた。ゲルをＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染色で染色した。レーン１〜３は、矢印で示されるＣｓｇＧタンパク質を含有する主な溶出ピーク（図２３においてＥ１と表示）を示す。レーン４〜６は混入物質を含有する主要な溶出ピーク（図２３においてＥ１と表示）のテールの溶出分画に対応した。Ｍは、使用した分子量マーカーを示し、これはＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ（単位＝ｋＤ）であった。 ＣｓｇＧタンパク質のサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）の一例を示すグラフ図である（１２０ｍＬ Ｓ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｘ軸の表示＝溶出体積（ｍＬ）、ｙ軸の表示＝吸光度（ｍＡｕ））。ＳＥＣは、Ｓｔｒｅｐ精製後でタンパク質試料の加熱後に実施した。ＳＥＣのランニング緩衝液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ＤＤＭ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．０であり、カラムを１ｍＬ／分の速度で溶出させた。Ｘと表示されるトレースは、２２０ｎｍでの吸光度を示し、Ｙと表示されるトレースは、２８０ｎｍでの吸光度を示す。星印で表示されるピークを収集した。 ＳＥＣ後のＣｓｇＧタンパク質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ可視化の一例を示す写真である。４〜２０％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を、１×ＴＧＳ緩衝液中、３００Ｖで２２分間泳動させた後、ゲルをＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染色で染色した。レーン１は、Ｓｔｒｅｐ精製後で加熱後であるがＳＥＣの前のＣｓｇＧタンパク質試料を示す。レーン２〜８は、図２５において星で表示される、図２５のおおよそ４８ｍＬ〜６０ｍＬ（ピークの中心＝５５ｍＬ）に溶出するピーク全体を収集した分画を示す。Ｍは、使用した分子量マーカーを示し、これはＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ（単位＝ｋＤ）であった。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏポアに対応するバーを矢印で示す。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。 シミュレーション（実験１から３）において０および２０ナノ秒で撮影したポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端ポア変異体番号２０に結合する配列番号３９０）上の酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次に（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号４１２）を示すスナップショット写真である。 シミュレーション（実験１から３）において３０および４０ナノ秒で撮影したポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端ポア変異体番号２０に結合する配列番号３９０）上の酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次に（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号４１２）を示すスナップショット写真である。 プレポアコンフォメーションのＣｓｇＧＣ１ＳのＸ線構造を示す図である。ａ、Ｎ−末端からＣ−末端にかけて青色から赤色への虹色で表示するＣｓｇＧＣ１Ｓモノマーのリボン図。二次構造エレメントをＡＢＤ様の折り畳みに従って表示し、さらなるＮ−末端およびＣ−末端α−ヘリックス、ならびにβ１とα１とを接続する細長いループをそれぞれ、αＮ、αＣ、およびＣ−ループ（ＣＬ）と表示する。ｂ、ＣｓｇＧＣ１ＳＣ８オクタマーの側面図であり、複数のサブユニットを色で識別するが、１つのサブユニットの方向および色はａと同じである。 ＣｓｇＧのそのチャネルコンフォメーションの構造を示す図である。ａ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ（青色）および膜抽出ＣｓｇＧ（赤色）のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルのアミドＩ領域（１，７００〜１，６００ｃｍ−１）。ｂ、ＴＭ１およびＴＭ２配列（配列番号４４９および配列番号４５０）（青色で示される二重層に面する残基）、ならびに野生型ｃｓｇＧ（ＷＴ）で補完される大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１ΔｃｓｇＧ、空のベクター、またはＴＭ１もしくはＴＭ２の下線の断片を欠如するｃｓｇＧのコンゴーレッド結合。データは、３回の生物学的反復実験の代表である。ｃ、プレポア（水色；ＴＭ１はピンク色、ＴＭ２は紫色）とチャネルコンフォメーション（黄褐色；ＴＭ１は緑色、ＴＭ２はオレンジ色）のＣｓｇＧモノマーとの重ね合わせ。ＣＬ、Ｃ−ループ。ｄ、ｅ、リボン表示および表面表示でのＣｓｇＧノナマーの側面図（ｄ）および断面図（ｅ）；ヘリックス２、コアドメイン、およびＴＭヘアピンをそれぞれ、青色、水色、および黄褐色で示す。単一のプロトマーを図４２ａと同じ色で表示する。マゼンタ色の球は、Ｌｅｕ２の位置を示す。ＯＭ、外膜。 ＣｓｇＧチャネル狭窄を示す図である。ａ、ＣｓｇＧチャネル狭窄の断面図およびその溶媒を除いた直径。ｂ、狭窄は、スタックされた３個の同心円の側鎖層で構成される：周辺質側からＰｈｅ４８の後にＴｙｒ５１、Ａｓｎ５５、およびＰｈｅ５６。ｃ、ＣｓｇＧチャネルの位相学。ｄ、ｃｓｇＧ（ＷＴ）で補完される大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１ΔｃｓｇＧ、空のベクター、または表記の狭窄変異体を有するｃｓｇＧのコンゴーレッド結合。データは、６回の生物学的反復実験の代表である。ｅ、ｆ、平面リン脂質二重層に再構成され、＋５０ｍＶ（ｎ＝３３）または−５０ｍＶ（ｎ＝１３）の電場で測定したＣｓｇＧの代表的な単一チャネル電流記録（ｅ）およびコンダクタンスヒストグラム（ｆ）。 ＣｓｇＧ輸送メカニズムのモデル図である。ａ、ＣｓｇＥ（Ｅ）、ＣｓｇＧ（Ｇ）、および過剰のＣｓｇＥを補充したＣｓｇＧ（Ｅ＋Ｇ）のネイティブＰＡＧＥは、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体（Ｅ−Ｇ＊）の形成を示す。データは、４つのタンパク質バッチを含む７回の実験の代表である。ｂ、ネイティブＰＡＧＥから回収したＣｓｇＥ（Ｅ）、ＣｓｇＧ（Ｇ）、およびＥ−Ｇ＊複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。データは、２回の繰り返し実験の代表である。Ｍ、分子量マーカー、ｃ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ粒子の選択されたクラス平均画像。左から右に：クライオ−ＥＭによって可視化された上面図および側面図、ならびにネガティブ染色側面図とＣｓｇＧノナマーとの比較。ｄ、上面図および斜め側面図のＣｓｇＥ粒子のクライオ−ＥＭ平均画像。回転方向の自己相関は、９回の対称性を示す。ｅ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥの三次元再構築（分解能２４Å、１，２２１個の単粒子）は、ＣｓｇＧを含むノナマー粒子（青色）およびＣｓｇＥノナマーとして割付されるさらなる密度（オレンジ色）を示す。ｆ、＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶで、ＣｓｇＥの増加濃度を補充したＰＰＢ再構成ＣｓｇＧの単一チャネル電流記録。水平尺度のバーは０ｐＡに存在する。ｇ、推定されるＣｓｇＧ媒介タンパク質分泌モデル。ＣｓｇＧおよびＣｓｇＥは、ＣｓｇＡを捕捉する分泌複合体を形成すると提唱されており（図５４に考察）、チャネルの上にエントロピー電位を生成する。チャネル狭窄でのＣｓｇＡの捕捉後、ＤＳ調整ブラウン拡散は、外膜を超えてのポリペプチドの進行性の転位を促進する。 大腸菌（E.coli）におけるＣｕｒｌｉ生合成経路を示す図である。ｃｕｒｌｉ大サブユニットＣｓｇＡ（明るい緑色）は、可溶性のモノマータンパク質として細胞から分泌される。ｃｕｒｌｉ小サブユニットＣｓｇＢ（暗い緑色）は、外膜（ＯＭ）に会合し、ＣｓｇＡを可溶性タンパク質からアミロイド沈着物に変換するための核剤として作用する。ＣｓｇＧ（オレンジ色）は外膜におけるオリゴマーｃｕｒｌｉ特異的転位チャネルにアセンブルする。ＣｓｇＥ（紫色）およびＣｓｇＦ（水色）は、生産的なＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの輸送ならびに沈着にとって必要な可溶性のアクセサリタンパク質を形成する。ＣｓｇＣは、機能不明の推定オキシドレダクターゼを形成する。全てのｃｕｒｌｉタンパク質は、細胞質（内）膜（ＩＭ）を超えて輸送するために、推定Ｓｅｃシグナル配列を有する。 サイズ排除クロマトグラフィーおよびネガティブ染色電子顕微鏡によって分析したＣｓｇＧおよびＣｓｇＧＣ１Ｓの溶液中のオリゴマー化状態を示す図である。ａ、Ｃ８Ｅ４／ＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧの未加工のネガティブ染色ＥＭ画像。矢印は、ｇに示されるサイズ排除プロファイルに表示される異なる粒子集団を示し、（Ｉ）ＣｓｇＧノナマーの凝集体、（ＩＩ）ＣｓｇＧオクタデカマー、および（ＩＩＩ）ＣｓｇＧノナマーである。スケールバー、２０ｎｍ。ｂ、表記のオリゴマー化状態の上面図および側面図の代表的なクラス平均画像。ｃ、９回の対称性を示す、上面図のＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧの回転方向の自己相関関数グラフ。ｄ、ＣｓｇＧＣ１Ｓの未加工のネガティブ染色ＥＭ画像。矢印は、ｇに示されるサイズ排除クロマトグラフィーで観察されたヘキサデカマー（ＩＶ）およびオクタマー（Ｖ）粒子を示す。ｅ、ＣｓｇＧＣ１Ｓオリゴマーの側面図の代表的なクラス平均画像。上面図はこの構築物に関して観察されなかった。ｆ、ｇに示されるサイズ排除クロマトグラフィーで観察されたＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧ粒子の溶出体積（ＥＶ）、計算分子量（ＭＷｃａｌｃ）、ＣｓｇＧオリゴマー化状態（ＣｓｇＧｎ）に対応する予想分子量（ＭＷＣｓｇＧ）、ならびにネガティブ染色ＥＭおよびＸ線結晶学で観察された粒子の対称性の表。ｇ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行したＣｓｇＧＣ１Ｓ（黒色）およびＣ８Ｅ４／ＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧ（灰色）のサイズ排除クロマトグラム。ｈ、ｉ、結晶化オリゴマーのリボン表示の上面図および側面図であり、ＣｓｇＧＣ１ＳのＤ８ヘキサデカマー（ｈ）および膜抽出ＣｓｇＧのＤ９オクタデカマー（ｉ）を示す。１つのプロトマーをＮ末端（青色）からＣ末端（赤色）にかけて虹色で示す。結晶に捕捉されるテール−テールダイマーを形成する２つのＣ８オクタマー（ＣｇＧＣ１Ｓ）またはＣ９ノナマー（ＣｓｇＧ）を青色と黄褐色で示す。ｒおよびｈはそれぞれ、半径およびプロトマー間回転を示す。 ＣｓｇＧと構造ホモログの比較およびＣｓｇＧにおけるプロトマー間接触を示す図である。ａ、ｂ、いずれもＮ−末端（青色）からＣ末端（赤色）にかけて虹色を示す、ＣｓｇＧＣ１Ｓモノマー（例えば、プレポアコンフォメーションのＣｓｇＧ）（ａ）およびＴｏｌＢのヌクレオチド結合ドメイン様ドメイン（ｂ）（ＰＤＢ２ｈｑｓ）のリボン図。共通の二次構造エレメントを同等に表示する。ｃ、左から右に、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）のまれなリポタンパク質Ｂ（ＰＤＢ ２ｒ７６、ピンク色)、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）仮想リポタンパク質ＤＵＦ３３０（ＰＤＢ ２ｉｑｉ、ピンク色)、大腸菌（Escherichia coli）ＴｏｌＢ（ＰＤＢ ２ｈｑｓ、Ｎ末端およびｂ−プロペラドメインに関してそれぞれ、ピンク色および黄色で表示)と重ね合わせたＣｓｇＧＣ１Ｓ（灰色）。ＣｓｇＧ特異的構造エレメントを、左上のパネルのように表示して色付けした。ｄ、ｅ、オリゴマーの外部（ｃ）または内部（ｄ）のいずれかから二重層平面に沿って見たＣｓｇＧ構造において見出される２つの隣接するプロトマーのリボン図。１つのプロトマーをＮ末端からＣ末端にかけて虹色（暗い青色から赤色）で示す。第二のプロトマーを水色（コアドメイン）、青色（ヘリックス２）、および黄褐色（ＴＭドメイン）で示す。４つの主なオリゴマー化境界面が明白である：ｂ−バレル内のｂ６−ｂ３９の主鎖相互作用、狭窄ループ（ＣＬ）、ｂ１−ｂ３−ｂ４−ｂ５に対するヘリックス１（α１）の側鎖パッキング、およびヘリックス２（α２）のヘリックス−ヘリックスパッキング。脂質アンカー（マゼンタの球はＬｅｕ２におけるＣａの位置を示す）とＮ−末端ヘリックス（αＮ）とを接続する１８残基のＮ末端ループも同様に、隣接する２つのプロトマーの上を包むように見える。脂質アンカーの突出した位置は、＋２プロトマーのＴＭ１およびＴＭ２ヘアピンに反して存在すると予想される（明確にするために示していない）。 ＣｓｇＧオリゴマーにおける選択された表面残基のＣｙｓのアクセス可能性アッセイを示す。ａ〜ｃ、周辺質（ａ）、側面（ｂ）、および細胞外の図で示すＣｓｇＧノナマーのリボン表示。１つのプロトマーをＮ末端（青色）からＣ末端（赤色）にかけて虹色で示す。システイン置換を表示して、Ｓ原子の同等の位置を球として示し、大腸菌（E.coli）外膜におけるＭＡＬ−ＰＥＧ（５，０００Ｄａ）標識に対するアクセス可能性に従って色付けした。ｄ、導入されたシステインのＭＡＬＰＥＧ結合により５ｋＤａの増加を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したＭＡＬ−ＰＥＧ反応試料のウェスタンブロット。アクセス可能（１１および１１１）、中等度にアクセス可能（１）、およびアクセス不能（２）部位をそれぞれ、ａ〜ｅにおいて緑色、オレンジ色、および赤色で表示する。Ａｒｇ９７およびＡｒｇ１１０では、４４ｋＤａで第二の化学種が存在し、これは、導入されたシステインとネイティブシステインの両方が標識されるようになるタンパク質の分画に対応する。データは、生物学的反復実験からの４回の独立した実験の代表である。ｅ、Ｘ線構造に存在するＤ９オクタデカマーにおけるダイマー形成境界面の側面図。ダイマー形成界面またはＤ９粒子の管腔内部に導入されたシステインを標識する。膜結合ＣｓｇＧにおいて、これらの残基は、ＭＡＬ−ＰＥＧにアクセス可能であり、Ｄ９粒子が、膜抽出ＣｓｇＧの濃縮溶液のアーチファクトであること、およびＣ９複合体が生理的に関連する化学種を形成することを証明している。Ｃ−末端ヘリックスの残基（ａＣ；Ｌｙｓ２４２、Ａｓｐ２４８、およびＨｉｓ２５５）は、アクセス不能であるかまたはアクセス不良であることが見出され、ａＣが大腸菌（E.coli）細胞エンベロープ、おそらくペプチドグリカン層とのさらなる接触を形成しうることを示している。 モデルポリアラニン鎖によるＣｓｇＧ狭窄の分子動力学シミュレーションを示す図である。ａ、ｂ、Ｃ−末端からＮ−末端方向に示す、細長いコンフォメーションのチャネルの中を貫通するポリアラニン鎖によってモデル化したＣｓｇＧ狭窄の上面図（ａ）および側面図（ｂ）。ＣｓｇＧトランスポーター内の基質の通過は、それ自身配列特異的ではない参考文献１６、２３。明確にするために、ポリアラニン鎖を、通過するポリペプチド鎖の推定の相互作用をモデル化するために使用した。モデル領域は、それぞれが４７〜５８残基を含む９個の同心円ＣｓｇＧ Ｃ−ループで構成される。狭窄の内側に並ぶ側鎖をスティック表示で示し、それぞれ、Ｐｈｅ５１をくすんだ青色、Ａｓｎ５５（アミドクランプ）をシアン、ならびにＰｈｅ４８およびＰｈｅ５６（Φ−クランプ）を明るいおよび暗いオレンジ色で示す。Ｎ、Ｏ、およびＨ原子（ヒドロキシルまたは側鎖アミドＨ原子のみを示す）をそれぞれ、青色、赤色、および白色で示す。ポリアラニン鎖のＣ、Ｎ、Ｏ、およびＨ原子をそれぞれ、緑色、青色、赤色、および白色で示す。狭窄（１１〜１５と表示される残基）内のポリアラニン残基の１０Å内の溶媒分子（水）を赤色の点で示す。ｃ、ｂと同様に位置する、明確にするためにＣ−ループを除去した、ポリアラニン鎖のモデル溶媒和（ポリアラニン鎖全体の１０Å以内の溶媒分子を示す）。アミド−クランプおよびΦ−クランプの最高点では、ポリアラニン鎖の溶媒和は、ペプチド骨格とアミド−クランプ側鎖とをつなぐ単一の水シェルに低減される。Ｔｙｒ５１環におけるほとんどの側鎖は、ＣｓｇＧ（およびＣｓｇＧＣ１Ｓ）Ｘ線構造で観察されるその内向きの中心を向く位置と比較して溶媒に向かって回転している。モデルは、ＡＭＢＥＲ９９ＳＢ−ＩＬＤＮ５４力場を使用し、Ｃ−ループの末端残基（Ｇｌｎ４７およびＴｈｒ５８）のＣα原子の位置を制限した、ＧＲＯＭＡＣＳ参考文献５３による４０ナノ秒の全ての原子の明白な溶媒分子動力学シミュレーションの結果である。 ＣｓｇＧホモログにおける配列の保存を示す図である。ａ、配列類似性に従って色付けし（保存スコアの低から高へ、黄色から青色に色付け）、周辺質（一番左側）、側面（左中央）、細胞外環境（右中央）、または断面側面（一番右）から見たＣｓｇＧノナマーの表面表示を示す。図は、最高の配列保存領域が、周辺質前庭の入口、狭窄ループの前庭側面、およびＴＭドメインの管腔表面にマップされることを示している。ｂ、ＣｓｇＧ様リポタンパク質の多重配列アライメント。選択される配列は、配列多様性の代表的な図を提供するために、ＣｓｇＧ様配列の系統発生樹（示していない）全体の単系統クレードから選択した。大腸菌（E.coli）のＣｓｇＧ結晶構造に基づいて、二次構造エレメントをβ−ストランドまたはα−ヘリックスに関してそれぞれ、矢印またはバーとして示す。ｃ、ｄ、二次構造表示のＣｓｇＧプロトマー（ｃ）および表面表示でのＣｓｇＧノナマーの断面側面図（ｄ）をいずれも灰色で示し、高い配列保存を有する３つの連続ブロックを赤色（ＨＣＲ１）、青色（ＨＣＲ２）および黄色（ＨＣＲ３）で示した。ＨＣＲ１およびＨＣＲ２は、狭窄ループの前庭側面を形成する。ＨＣＲ３は、周辺質前庭の入口に存在するヘリックス２に対応する。狭窄内で、Ｐｈｅ５６は１００％保存されるが、Ａｓｎ５５はＳｅｒまたはＴｈｒに、例えば水素結合ドナー／アクセプターとして作用することができる小さい極性側鎖に保存的に置換することができる。狭窄の出口での同心円の側鎖環（Ｔｙｒ５１）は、保存されない。狭窄の入口でのＰｈｅ環の存在は、ポリペプチドの捕捉および通過を触媒することが示されている炭疽菌保護抗原ＰＡ６３参考文献２０のＰｈｅ４２７環（Φ−クランプと呼ばれる）と位相的に類似である。ｔｏｘＢスーパーファミリータンパク質のＭＳＴにより、Ｐｈｅ環の最高点での保存されたモチーフＤ（Ｄ／Ｑ）（Ｆ）（Ｓ／Ｎ）Ｓが明らかとなる。これは、ｃｕｒｌｉ様トランスポーターで見られるＳ（Ｑ／Ｎ／Ｔ）（Ｆ）ＳＴモチーフと類似である。ポアコンフォメーションのＰＡ６３の原子分解構造は、まだ利用可能ではないが、利用可能な構造から、Ｐｈｅ環の後に同様に、保存された水素結合ドナー／アクセプター（Ｓｅｒ／Ａｓｎ４２８）が転位チャネルにおけるその後の同心円の環として続きうることが示唆されている（エレメントの方向は両方のトランスポーターで逆であることに注意されたい）。 ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧ：ＣｓｇＥポアの単一チャネル電流分析を示すグラフ図である。ａ、陰性電場電位の下では、ＣｓｇＧポアは２つのコンダクタンス状態を示す。左上および右上のパネルはそれぞれ、正常（＋５０、０、および−５０ｍＶで測定）および低コンダクタンス型（０、＋５０、および−５０ｍＶで測定）の代表的な単一チャネル電流トレースを示す。全観察時間（ｎ＝２２）の間に２つの状態の間での変換は観察されず、コンダクタンス状態が、長い寿命（数秒から数分の時間尺度）を有することを示している。左下のパネルは、＋５０および−５０ｍＶ（ｎ＝３３）で獲得したＣｓｇＧポアの正常および低コンダクタンス型の電流ヒストグラムを示す。通常および低コンダクタンスを有するＣｓｇＧポアのＩ−Ｖ曲線を右下のパネルに示す。データは、少なくとも４回の独立した記録からの平均値および標準偏差を表す。低コンダクタンス型の性質または生理的存在は不明である。ｂ、アクセサリ因子ＣｓｇＥで滴定したＣｓｇＧチャネルの電気生理学。プロットは、ＣｓｇＥ濃度の関数としての開状態、中間状態、および閉状態のチャネルの分画を示す。ＣｓｇＧの開状態および閉状態を図４５ｆに図示する。ＣｓｇＥ濃度を１０ｎＭ超に増加させると、ＣｓｇＧポアは閉鎖する。この効果は、＋５０ｍＶ（左）および−５０ｍＶ（右）で起こり、ポアの遮断がＣｓｇＥ（計算ｐＩ４．７）のＣｓｇＧポアへの電気泳動によって引き起こされる可能性を除外する。頻度の低い（，５％）中間状態は、開状態のチャネルのコンダクタンスのほぼ半分を有する。これは、ＣｓｇＥによって誘導されるＣｓｇＧチャネルの不完全な閉鎖を表しうる。あるいは、これは電解質溶液の残留ＣｓｇＧモノマーが膜に埋もれたポアに結合することによって引き起こされるＣｓｇＧダイマーの一時的な形成を表しうる。３つの状態の分画は、単一チャネル電流トレースの全ての時点のヒストグラム分析から得られた。ヒストグラムから、最大３つの状態のピーク面積が得られ、所定の状態の分画は、対応するピーク面積を、記録における他の全ての状態の合計で除することによって得られた。陰性電場電位の下では、２つの開コンダクタンス状態は、ＣｓｇＧに関する知見と同様に識別される（ａを参照されたい）。開状態のチャネルの変化形はいずれも、より高いＣｓｇＥ濃度によって遮断されることから、ｂの「開状態の」トレースは、両方のコンダクタンス型を合わせたものである。プロットのデータは、３回の独立した記録からの平均値および標準偏差を表す。ｃ、結晶構造、サイズ排除クロマトグラフィー、およびＥＭは、洗浄剤抽出ＣｓｇＧポアが、より高いタンパク質濃度で非ネイティブのテール−テールスタックダイマー（例えば、Ｄ９粒子としての２つのノナマー、図４７）を形成することを示している。これらのダイマーはまた、単一チャネル記録でも観察することができる。上のパネルは、＋５０、０および−５０ｍＶ（左から右）でスタックされたＣｓｇＧポアの単一チャネル電流トレースを示す。左下のパネルは、＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶで記録されたダイマーＣｓｇＧポアの電流ヒストグラムを示す。＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶでの実験的コンダクタンス＋１６．２±１．８および−１６．０±３．０ｐＡ（ｎ＝１５）はそれぞれ、理論的計算値２３ｐＡに近い。右下のパネルは、スタックされたＣｓｇＧポアのＩ−Ｖ曲線を示す。データは、６回の独立した記録からの平均値および標準偏差を表す。ｄ、ＣｓｇＥがスタックされたＣｓｇＧポアに結合して遮断する能力を電気生理学によって試験した。＋５０ｍＶ（上）および−５０ｍＶ（下）で１０または１００ｎＭ ＣｓｇＥの存在下でスタックされたＣｓｇＧポアの単一チャネル電流トレースを示す。電流トレースは、そうでなければ飽和濃度のＣｓｇＥによってスタックされたＣｓｇＧダイマーのポア閉鎖が起こらないことを示している。これらの知見は、ＥＭおよび部位特異的変異誘発によって識別されるように、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ接触域がヘリックス２およびＣｓｇＧ周辺質キャビティの口部分にマッピングされることと良好に一致する（図４５および図５２）。 ＣｓｇＥオリゴマーおよびＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体を示す図である。ａ、ＣｓｇＥのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６、１６／６００；ランニング緩衝液２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％グリセロール）は、２つのオリゴマー状態１および２の平衡を示し、見かけの分子質量比は９．１６：１である。ピーク１のネガティブ染色ＥＭを調べたところ、ＣｓｇＥの９コピーとサイズが適合する別個のＣｓｇＥ粒子（５つの代表的なクラス平均画像を、傾斜角の増加順に挿入図に示す）が示される。ｂ、クライオ−ＥＭの上面図で観察されたＣｓｇＥオリゴマーの選択されたクラス平均画像およびその回転方向の自己相関は、Ｃ９対称性の存在を示す。ｃ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥクライオ−ＥＭモデルのＦＳＣ分析。三次元再構築により、１，２２１個の粒子に対応する１２５のクラスを使用して、ＦＳＣによって０．５の相関の閾値で決定した場合に２４Åの分解能が達成された。ｄ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥクライオ−ＥＭ密度とＸ線構造で観察されたＣｓｇＧノナマーの重ね合わせ。半透明密度として（左）または断面図として側面から見た重ね合わせを示す。ｅ、野生型ｃｓｇＧ（ＷＴ）で補完された大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１ΔｃｓｇＧ、空のベクター（ΔｃｓｇＧ）、またはｃｓｇＧヘリックス２変異体（一文字コードで表示される１アミノ酸置換）のコンゴーレッド結合。データは、４回の生物学的反復実験の代表である。ｆ、ｃｓｇＧ（ＷＴ）で補完された大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２に及ぼす、または（１）ｃｓｇＥで補完されたもしくは補完されない（２）異なるヘリックス２変異を有するｃｓｇＧに及ぼす胆汁酸塩毒性の効果。細菌１０７個から開始する連続１０倍希釈液をＭｃＣｏｎｋｅｙアガープレートにスポットした。外膜におけるＣｓｇＧポアの発現によって、胆汁酸塩感受性の増加が起こるが、これはＣｓｇＥの同時発現によって遮断することができる（ｎ＝６、３回の生物学的反復実験、各２回の反復）。ｇ、分子表面表示でのＣｓｇＧのＸ線構造の断面図。コンゴーレッド結合または毒性に対して効果を示さないＣｓｇＧ変異体を青色で示し、胆汁酸塩感受性のＣｓｇＥによる救出を妨害する変異体を赤色で示す。 ＣｓｇＧ分泌複合体の集合および基質動員を示す図である。ｃｕｒｌｉトランスポーターＣｓｇＧおよび可溶性の分泌補因子ＣｓｇＥは、２４，０００Å３の小室を格納する９：９の化学量論を有する分泌複合体を形成し、これはＣｓｇＡ基質を捕捉して、外膜（ＯＭ；本文および図４５を参照されたい）を超えてのそのエントロピー駆動性の拡散を促進すると提唱されている。理論的見地から、分泌複合体の基質動員および集合に関して３つの推定の経路（ａ〜ｃ）を想像することができる。ａ、「キャッチアンドキャップ」メカニズムは、ＣｓｇＡのａｐｏＣｓｇＧ転位チャネルに対する結合（１）を伴い、ａｐｏＣｓｇＧ転位チャネルのコンフォメーションの変化により、ＣｓｇＥ結合のための高親和性結合プラットフォームを露出する（２）。ＣｓｇＥの結合によって基質ケージのキャッピングが起こる。ＣｓｇＡが分泌されると、ＣｓｇＧは、その低親和性コンフォメーションへと戻り、新たな分泌サイクルのために分泌チャネルのＣｓｇＥの解離および放出が起こる。ｂ、「ドックアンドトラップ」メカニズムにおいて、周辺質ＣｓｇＡは、ＣｓｇＥによって最初に捕捉されて（１）、ＣｓｇＥは、ＣｓｇＧ転位ポアにドックする高親和性複合体となり（２）、分泌複合体の中にＣｓｇＡを閉じ込める。ＣｓｇＡの結合は、ＣｓｇＥオリゴマーまたはＣｓｇＥモノマーに対して直接でありえて、ＣｓｇＥモノマーはその後オリゴマー化されてＣｓｇＧに結合する。ＣｓｇＡが分泌されると、ＣｓｇＥは、その低親和性コンフォメーションへと戻り、分泌チャネルから解離する。ｃ、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＥは、構成的複合体を形成し、ＣｓｇＥコンフォメーション動力学は、ＣｓｇＡの動員および分泌の際に開形態と閉形態との間でサイクルする。現在公表されているまたは利用可能なデータでは、これらの推定の動員モードもしくはその派生モードを識別することができないか、またはそれらの１つを提唱することができない。 ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧのデータ収集統計値および電子密度マップを示す図である。ａ、ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧのＸ線構造のデータ収集統計値。ｂ、ＮＣＳ平均および密度修正実験的ＳＡＤ位相を使用して計算し、１．５σの等高線で表示したＣｓｇＧＣ１Ｓに関する２．８Åでの電子密度マップ。マップは、チャネル構築領域（ＣＬ；単一プロトマーを表示する）を示し、最終的な精密化モデルに重ね合わせる。ｃ、ＮＣＳ平均および密度修正分子置換位相から計算した（ＴＭループはインプットモデルに存在しなかった）ＣｓｇＧ ＴＭドメイン領域における電子密度マップ（逆格子ベクトルａ＊、ｂ＊、およびｃ＊に沿ってそれぞれ、分解能３．６、３．７、および３．８Å）；Ｂ因子を−２０Å２で鮮明化して１．０σの等高線で表示した。図は、最終の精密化モデルと重ね合わせた１つのＣｓｇＧプロトマーのＴＭ１（Ｌｙｓ１３５〜Ｌｅｕ１５４）およびＴＭ２（Ｌｅｕ１８２〜Ａｓｎ２０９）領域を示す。 一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有するＤＮＡヘアピンと相互作用するＣｓｇＧ ＷＴタンパク質の単一チャネル電流トレース（左）とその拡大領域（右）を示すグラフ図である。トレースは、＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶの間隔（矢印で示す）で測定した電位に応答して変化する電流を示す。最後の＋５０ｍＶセグメントでの下向き電流の遮断は、ポア管腔内のヘアピン二重鎖のロッジングと、内部ポア構築への一本鎖ヘアピン末端の貫通が同時に起こり、ほぼ完全な電流の遮断が起こることを表している。電場を−５０ｍＶに反転させると、ポアの電気泳動の遮断解除が起こる。新たな＋５０ｍＶエピソードにより、再度ＤＮＡヘアピンロッジング／貫通およびポア遮断が起こる。＋５０ｍＶセグメント上では、ヘアピン構造のアンフォールディングによって、電流遮断の逆転によって示される電流遮断の終了が起こりうる。配列３’ ＧＣＧＧＧＧＡ ＧＣＧＴＡＴＴ ＡＧＡＧＴＴＧ ＧＡＴＣＧＧＡＴＧＣＡ ＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡ ＴＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＣ−５’を有するヘアピンを、最終濃度１０ｎＭで小室のシス側に添加した。 ＰＹＰＡ配列（残基５０〜５３）の狭窄残基Ｙ５１がＧＧに変異している変異体ＣｓｇＧポアであるＣｓｇＧ−ΔＰＹＰＡの精製およびチャネル特性を示す図である。
配列表の説明
配列番号１は、シグナル配列を含む野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧのアミノ酸配列
（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ０ＡＥＡ２）を示す。
配列番号２は、シグナル配列を含む野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧのポリヌクレオ
チド配列（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３２５３８）を示す。
配列番号３は、配列番号２の５３〜７７位の野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧのアミ
ノ酸配列を示す。これは、成熟野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧモノマー（すなわち、
シグナル配列を欠いている）の３８〜６３位のアミノ酸配列に対応する。
配列番号４〜３８８は、シグナル配列を欠いているＣｓｇＧの修飾モノマーの３８〜６
３位のアミノ酸配列を示す。
配列番号３８９は、大腸菌Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜株（Escherchia coli Str. K-12
substr. MC4100）からの野生型ＣｓｇＧモノマーをコードする、コドン最適化ポリヌクレ
オチド配列を示す。このモノマーは、シグナル配列を欠いている。
配列番号３９０は、大腸菌Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜株（Escherchia coli Str. K-12
substr. MC4100）からの野生型ＣｓｇＧモノマーの成熟形態のアミノ酸配列を示す。この
モノマーは、シグナル配列を欠いている。このＣｓｇＧに使用される略語＝ＣｓｇＧ−Ｅ
ｃｏ。
配列番号３９１は、ＹＰ＿００１４５３５９４．１：仮想タンパク質ＣＫＯ＿０２０３
２［シトロバクター・コセリ（[Citrobacter koseri）ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８９５］の１
〜２４８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９９％同一である。
配列番号３９２は、ＷＰ＿００１７８７１２８．１：部分的、ｃｕｒｌｉ産生集合体（
curli production assembly）／輸送成分ＣｓｇＧ［サルモネラ菌（Salmonella enterica
）］の１６〜２３８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９８％同一である。
配列番号３９３は、ＫＥＹ４４９７８．１｜：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質
ＣｓｇＧ［シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）］の１６〜
２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９８％同一である。
配列番号３９４は、ＹＰ＿００３３６４６９９．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分
［シトロバクター・ローデンチウム（Citrobacter rodentium）ＩＣＣ１６８］の１６〜
２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９７％同一である。
配列番号３９５は、ＹＰ＿００４８２８０９９．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分
［エンテロバクター・アズブリア（Enterobacter asburiae）ＬＦ７ａ］の１６〜２７７
のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９４％同一である。
配列番号３９６は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配
列を示す。
配列番号３９７は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９８は、大腸菌（E. coli）からのｓｂｃＢ遺伝子に由来するコドン最適化
ポリヌクレオチド配列を示す。これは、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ
酵素（ＥｃｏＥｘｏ Ｉ）をコードする。
配列番号３９９は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘ
ｏ Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号４００は、大腸菌（E. coli）からのｘｔｈＡ遺伝子に由来するコドン最適化
ポリヌクレオチド配列を示す。これは、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ
ＩＩ酵素をコードする。
配列番号４０１は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ
酸配列を示す。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の一方の鎖からの５’一リン酸
ヌクレオシドの３’−５’方向での分配性消化を行う。鎖上の酵素開始は、おおよそ４ヌ
クレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
配列番号４０２は、高度好熱菌（T. thermophilus）からのｒｅｃＪ遺伝子に由来する
コドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、高度好熱菌（T. thermophilus）か
らのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードする。
配列番号４０３は、高度好熱菌（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅ
ｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ｓｓＤＮＡからの５’一リン酸ヌクレ
オシドの５’−３’方向での前進性消化を行う。鎖上の酵素開始は、少なくとも４ヌクレ
オチドを必要とする。
配列番号４０４は、バクテリオファージラムダエキソ（ｒｅｄＸ）遺伝子に由来するコ
ドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、バクテリオファージラムダエキソヌク
レアーゼをコードする。
配列番号４０５は、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示
す。この配列は、集合してトリマーを構築する３つの同一のサブユニットの１つである。
この酵素は、ｄｓＤＮＡの一方の鎖からのヌクレオチドの５’−３’方向での高前進性消
化を行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＭ０２６２．ａｓｐ）。鎖上の酵素開始は、５’リン酸を有するおお
よそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを優先的に必要とする。
配列番号４０６は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
配列番号４０７は、Ｈｅｌ３０８ Ｃｓｙのアミノ酸配列を示す。
配列番号４０８は、Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。
配列番号４０９は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１０は、Ｔｒａｌ Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１１は、ＸＰＤ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１２は、Ｄｄａ １９９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号４１３は、Ｔｒｗｃ Ｃｂａのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１４は、ＷＰ＿００６８１９４１８．１：輸送体［ヨケネラ・レンゲスブル
ゲイ（Yokenella regensburgei）］の１９〜２８０のアミノ酸配列を示し、これは配列番
号３９０と９１％同一である。
配列番号４１５は、ＷＰ＿０２４５５６６５４．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タン
パク質ＣｓｇＧ［クロノバクター・プルベリス（Cronobacter pulveris）］の１６〜２７
７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と８９％同一である。
配列番号４１６は、ＹＰ＿００５４００９１６．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タン
パク質ＣｓｇＧ［ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）ＨＸ２］の１６〜２
７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と８４％同一である。
配列番号４１７は、ＫＦＣ９９２９７．１：ＣｓｇＧファミリーｃｕｒｌｉ産生集合体
／輸送成分［クライベラ・アスコルバータ（Kluyvera ascorbata）ＡＴＣＣ３３４３３］
の２０〜２７８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と８２％同一である。
配列番号４１８は、ＫＦＣ８６７１６．１｜：ＣｓｇＧファミリーｃｕｒｌｉ産生集合
体／輸送成分［ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）ＡＴＣＣ１３３３７］の１６〜２７
４のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と８１％同一である。
配列番号４１９は、ＹＰ＿００７３４０８４５．１｜：ｃｕｒｌｉポリマーの形成に関
与する特徴づけされていないタンパク質［腸内細菌科（Enterobacteriaceae）細菌株ＦＧ
Ｉ ５７］の１６〜２７０のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と７６％同一で
ある。
配列番号４２０は、ＷＰ＿０１０８６１７４０．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タン
パク質ＣｓｇＧ［プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）］の１７
〜２７４のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と７０％同一である。
配列番号４２１は、ＹＰ＿２０５７８８．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送外膜リポタ
ンパク質成分ＣｓｇＧ［ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）ＥＳ１１４］の２３
〜２７０のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と６０％同一である。
配列番号４２２は、ＷＰ＿０１７０２３４７９．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質
ＣｓｇＧ［アリイビブリオ・ロゲイ（Aliivibrio logei）］の２３〜２７０のアミノ酸配
列を示し、これは、配列番号３９０と５９％同一である。
配列番号４２３は、ＷＰ＿００７４７０３９８．１：Ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分
ＣｓｇＧ［フォトバクテリウム属種（Photobacterium sp.）ＡＫ１５］の２２〜２７５の
アミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５７％同一である。
配列番号４２４は、ＷＰ＿０２１２３１６３８．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質
ＣｓｇＧ［エロモナス・ベロニ（Aeromonas veronii）］の１７〜２７７のアミノ酸配列
を示し、これは、配列番号３９０と５６％同一である。
配列番号４２５は、ＷＰ＿０３３５３８２６７．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タン
パク質ＣｓｇＧ［シュワネラ属種（Shewanella sp.）ＥＣＳＭＢ１４１０１］の２７〜２
６５のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５６％同一である。
配列番号４２６は、ＷＰ＿００３２４７９７２．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質
ＣｓｇＧ［プチダ菌（Pseudomonas putida）］の３０〜２６２のアミノ酸配列を示し、こ
れは、配列番号３９０と５４％同一である。
配列番号４２７は、ＹＰ＿００３５５７４３８．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分
ＣｓｇＧ［シュワネラ・ビオラセア（Shewanella violacea）ＤＳＳ１２］の１〜２３４
のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５３％同一である。
配列番号４２８は、ＷＰ＿０２７８５９０６６．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タン
パク質ＣｓｇＧ［マリノバクテリウム・ジャナスキイ（Marinobacterium jannaschii）］
の３６〜２８０のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５３％同一である。
配列番号４２９は、ＣＥＪ７０２２２．１：Ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分ＣｓｇＧ
［クリセオバクテリウム・オラニメンセ（Chryseobacterium oranimense）Ｇ３１１］の
２９〜２６２のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５０％同一である。
配列番号４３０は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４３１は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４３２は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４３３は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４３４は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。配列番号４３
４の３’末端に結合されているのは、６つのｉＳｐ１８スペーサー（反対側の末端が２つ
のチミンに結合されている）および３’コレステロールＴＥＧである。
配列番号４３５は、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号４３６は、Ｐｒｏのアミノ酸配列を示す。
配列番号４３７〜４４０は、実施例１からのプライマーを示す。
配列番号４４１は、実施例２１からのヘアピンを示す。
配列番号４４２〜４４８は、図４からの配列を示す。
配列番号４４９および４５０は、図４３からの配列を示す。
発明の詳細な説明
別段の指示がない限り、本発明の実施は、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物
学、微生物学、組換えＤＮＡ技術および化学的方法の従来の技法を利用する。そのような
技法は、文献、例えば、M. R. Green, J. Sambrook, 2012, Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, Fourth Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co
ld Spring Harbor, NY；Ausubel, F. M. et al., (1995 and periodic supplements、Cur
rent Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New Y
ork, N. Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencin
g: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J. M. Polak and James O'D. McGee, 19
90, In Situ Hybridisation: Principles and Practice, Oxford University Press；M.
J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Pre
ss；およびD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA S
tructure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, A
cademic Pressでも説明されている。これらの一般テキストの各々が参照により本明細書
に組み入れられている。
本発明を説明する前に、本発明の理解を助けることになる多数の定義を提供する。本明
細書において言及するすべての参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み入れ
られている。別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての専門および科学用語は、
本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
本明細書で使用する場合、用語「〜を含む（comprising）」は、言及する要素のいずれ
かを必ず含み（include）、場合により、他の要素も含む（include）ことがあることを意
味する。「〜から本質的になる」は、言及するあらゆる要素を必ず含み、列挙する要素の
基本的および新規の特徴に実質的な影響を及ぼすことになる要素を除外し、場合により、
他の要素を含むことがあることを意味する。「〜からなる」は、列挙するもの以外のすべ
ての要素を除外することを意味する。これらの用語の各々によって定義される実施形態は
、本発明の範囲内である。
本明細書で使用する場合の用語「核酸」は、各ヌクレオチドの３’および５’末端がホ
スホジエステル結合によって連結されている、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖共有結
合配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基で構成されているこ
ともあり、またはリボヌクレオチド塩基で構成されていることもある。核酸としてはＤＮ
ＡおよびＲＮＡを挙げることができる。核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成的に製造される
こともあり、または天然源から単離されることもある。核酸としては、修飾ＤＮＡまたは
ＲＮＡ、例えば、メチル化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または翻訳後修飾、例えば、７
−メチルグアノシンでの５’キャッピング、切断およびポリアデニル化などの３’プロセ
シング、ならびにスプライシングに付されたＲＮＡをさらに挙げることができる。核酸と
しては、合成核酸（ＸＮＡ）、例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核
酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核
酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）も挙げることができる。本明細書では「ポリ
ヌクレオチド」とも呼ばれる核酸のサイズは、通常は、二本鎖ポリヌクレオチドについて
は塩基対（ｂｐ）の数として、または一本鎖ポリヌクレオチドの場合はヌクレオチド（ｎ
ｔ）の数として表される。１０００ｂｐまたはｎｔは、キロベース（ｋｂ）に等しい。長
さ約４０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドは、通常は「オリゴヌクレオチド」と呼ば
れ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものなどのＤＮＡの操作に使用するためのプ
ライマーを含むこともある。
本発明に関して、用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で使用しており、天然に存在
するＬ α−アミノ鎖または残基を含むことを意図したものである。天然に存在するアミ
ノ酸について一般に使用される１および３文字略号を本明細書でも使用する：Ａ＝Ａｌａ
、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、ｌ＝ｌ
ｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ
＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、およびＹ＝Ｔｙｒ（Lehn
inger, A. L, (1975) Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, Worth Publishers, New York
）。一般用語「アミノ酸」は、さらに、Ｄ−アミノ酸、レトロ−インベルソアミノ酸はも
ちろん、化学的に修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸類似体、タンパク質に通常は組み
込まれていない天然に存在するアミノ酸、例えばノルロイシン、およびアミノ酸に特有で
あることが当技術分野において公知の特性を有する化学的に合成された化合物、例えばβ
−アミノ酸も含む。例えば、ペプチド化合物に対する天然ＰｈｅまたはＰｒｏと同じ配座
制限を可能にする、フェニルアラニンまたはプロリンの類似体または模倣物は、アミノ酸
の定義に含まれる。そのような類似体および模倣物を本明細書ではそれぞれのアミノ酸の
「機能的等価物」と呼ぶ。アミノ酸の他の例は、Roberts and Vellaccio, The Peptides:
Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, eds., Vol. 5 p. 341, Academi
c Press, Inc., N. Y. 1983に収載されており、この参考文献は、参照により本明細書に
組み入れられている。
「ポリペプチド」は、天然に産生されるか、合成手段によってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生
されるかを問わず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーである。長
さ約１２アミノ酸残基未満のポリペプチドは、通常は「ペプチド」と呼ばれ、長さ約１２
〜約３０アミノ酸残基のものは、「オリゴペプチド」と呼ばれることがある。用語「ポリ
ペプチド」は、本明細書で使用する場合、天然に存在するポリペプチド、前駆形態または
プロタンパク質の生成物を示す。ポリペプチドは、変異または翻訳後修飾プロセスを経る
こともでき、そのようなプロセスとしては、これらに限定されるものではないが、グリコ
シル化、タンパク質切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化
などを挙げることができる。用語「タンパク質」は、１本または複数のポリペプチド鎖を
含む高分子を指すために本明細書では使用する。
「生体ポア」は、膜の一方の側から他方への分子およびイオンの移行を可能にするチャ
ネルまたは穴を規定する膜貫通タンパク質構造である。このポアを通るイオン化学種の移
行は、そのポアの両側に印加される電気的電位の差によって駆動されうる。「ナノポア」
は、分子またはイオンが通過するチャネルの最小直径がナノメートル（１０−９メートル
）程度である生体ポアである。
本発明のすべての態様および実施形態について、ポリヌクレオチドは、配列番号２で示
される野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧとの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、９５％または９９％完全配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことが
できる。同様に、ポリペプチドは、配列番号１で示される野生型大腸菌（E. coli）Ｃｓ
ｇＧとの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％完全
配列同一性を有するポリペプチドを含むことができる。ポリペプチドは、ＣｓｇＧ様タン
パク質の特徴であるＰＦＡＭドメインＰＦ０３７８３を含有するポリペプチドを含むこと
ができる。現在公知のＣｓｇＧ相同体およびＣｓｇＧ構造のリストは、ｈｔｔｐ：／／ｐ
ｆａｍ．ｘｆａｍ．Ｏｒｇ／／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ０３７８３で見つけることができる。
例えば、配列同一性は、完全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの断片または一部分
との配列同一性であることもある。したがって、配列は、本発明の配列との５０％全配列
同一性しか有さないことがあっても、特定の領域、ドメインまたはサブユニットは、本発
明の配列と８０％、９０％、または９９％ほどもの配列同一性を共有することがありうる
。本発明によると、配列番号２の核酸配列との相同性は、単に配列同一性に限定されない
。多くの核酸配列は、一見低い配列同一性を有するにもかかわらず互いに生物学的に有意
な相同性を示すことができる。本発明では、相同核酸配列は、低ストリンジェンシー条件
下で互いにハイブリダイズすることになるものであると考える（M. R. Green, J. Sambro
ok, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Books 1-3, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
用語「ベクター」は、適切なサイズの別の核酸（通常はＤＮＡ）配列断片を組み込むこ
とができる、直鎖状または環状であるＤＮＡ分子を示すように使用される。そのようなＤ
ＮＡ断片は、そのＤＮＡ配列断片によってコードされた遺伝子の転写をもたらす、さらな
るセグメントを含むことができる。さらなるセグメントは、プロモーター、転写ターミネ
ーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位、非翻訳領域、ポリアデニル化シグナ
ル、選択マーカー、複製起点などを含むことができるが、これらに限定されない。原核生
物宿主のための様々な好適なプロモーター（例えば、大腸菌（E. coli）のための、［ベ
ータ］−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）およ
び真核生物宿主のための様々な好適なプロモーター（例えば、シミアンウイルス４０初期
または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、サイトメガロ
ウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ＥＧ−１ａプロモーター）が
利用可能である。発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターおよび酵母
人工染色体に由来することが多く、ベクターは、いくつかの源からのＤＮＡ配列を含有す
る組換え分子であることが多い。本発明の特異的実施形態は、本明細書に記載の野生型ま
たは修飾ＣｓｇＧポリペプチドをコードする発現ベクターを提供する。用語「作動可能に
連結された」は、ＤＮＡ配列、例えば、上述のものなどの核酸ベクターにおけるＤＮＡ配
列に適用される場合、該配列が、それらの所期の目的を果たす（すなわち、プロモーター
配列が、関連コード配列を通って終結配列のところまで進む転写を開始させる）ために、
協同的に機能するように配置されていることを示す。
生体ポアの膜貫通タンパク質構造は、実際はモノマー状またはオリゴマー状でありうる
。通常は、ポアは、複数のポリペプチドサブユニットであって、中心軸の周りに配置され
ており、その結果、ナノポア残基が存在する膜に略垂直に伸びる、タンパク質で裏打ちさ
れたチャネルを形成している、ポリペプチドサブユニットを含む。ポリペプチドサブユニ
ットの数は限定されない。通常は、サブユニットの数は５から３０まであり、好適には、
サブユニットの数は６〜１０である。あるいは、サブユニットの数は、パーフリンゴリジ
ンまたは関連大型膜ポアの場合のように、定義されない。タンパク質で裏打ちさたチャネ
ルを形成する、ナノポア内のタンパク質サブユニットの部分は、１つまたは複数の膜貫通
β−バレル、および／またはα−ヘリックス部分を含むことがある、二次構造を通常は含
む。
開示する生成物および方法の様々な適用が当技術分野における具体的な要求に合わせて
調整されうることは、理解されるはずである。本明細書において使用する用語法が本発明
の特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、限定を意図したものでないことも、
理解されるはずである。
加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの
（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈による別段の明白な指図がな
い限り、複数の言及対象も含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（a polynucl
eotide）」への言及は、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「ポリヌクレオチド結合タ
ンパク質（a polynucleotide binding protein）」への言及は、２つ以上のそのようなタ
ンパク質を含み、「ヘリカーゼ（a helicase）」への言及は、２つ以上のヘリカーゼを含
み、「モノマー（a monomer）」への言及は、２つ以上のモノマーを含み、「ポア（a por
e）」への言及は、２つ以上のポアを含むなど。
上文または下文を問わず、本明細書の中で引用するすべての出版物、特許および特許出
願は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本発明は、一部は、細菌アミロイド分泌チャネル（ＣｓｇＧ）、その製造方法、および
核酸シークエンシング用途および分子センシングにおけるその使用に関する。
ＣｓｇＧは、大腸菌（E. coli）の外膜に存在する膜リポタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ
寄託番号Ｐ０ＡＥＡ２；Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３２５３８）である。この外側脂質膜の
中で、ＣｓｇＧは、９つのＣｓｇＧモノマーサブユニットのオリゴマー複合体を含むナノ
ポアを形成する。ＩＩ型（リポタンパク質）シグナル配列のために、ＣｓｇＧタンパク質
前駆体は、ＳＥＣトランスロコンを介して移行され、その後、成熟ＣｓｇＧ（すなわち、
ＩＩ型シグナル配列が切断されたＣｓｇＧ）のＮ末端Ｃｙｓ残基においてトリアセチル化
される。トリアセチル化された、または「脂質化された」ＣｓｇＧは、グラム陰性宿主の
外膜に輸送され、そこでノナマーポアとしてその二重層に入る。脂質化されていない形態
のＣｓｇＧ、例えばＣｓｇＧＣ１Ｓ、は、プレポア立体構造で可溶性タンパク質としてペ
リプラズムに存在する（図４２）。
野生型ＣｓｇＧナノポアのＸ線構造（Goyal et al., Nature, 2014, 516(7530), 250-3
）は、それが１２０Åの幅および８５Åの高さを有することを示す（本明細書では以降、
ナノポアの「幅」という用語は、膜表面と平行のその寸法に関するものとし、ナノポアの
「高さ」という用語は、膜に対して垂直なその寸法に関するものとする）。ＣｓｇＧポア
複合体は、３６本鎖β−バレルによって膜を貫通して内径４０Åのチャネルをもたらす（
図１）。ＣｓｇＧチャネルの集合モノマー各々が、保存された１２残基ループ（Ｃループ
、「ＣＬ」、図２）を有し、このループが協同してチャネル内におおよそ９．０Åの直径
への狭窄を作り出す（図１および２）。野生型ＣｓｇＧナノポアの狭窄は、ＣｓｇＧオリ
ゴマー中に存在する各々のＣｓｇＧモノマーのアミノ酸残基Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およ
びＰｈｅ５６の側鎖によって形成される３つの積み重なった同心環で作られる（図３）。
残基のこのナンバリングは、Ｎ末端のネイティブ１５アミノの酸シグナル配列を欠いてい
る成熟タンパク質に基づく。したがって、成熟タンパク質は、配列番号１の残基１６〜２
７７に対応する。Ｔｙｒ５１は、配列番号１の６６位にあり、Ａｓｎは、配列番号１の７
０位にあり、Ｐｈｅ５６は、配列番号１の７１位にある。
狭窄は、イオンおよび他の分子のＣｓｇＧチャネル通過を制限するように作用する。平
面リン脂質二重層内に再構成されたＣｓｇＧの単一チャネル電流記録は、標準電解質条件
および＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶの電位を使用して、それぞれ、４３．１±４．５ｐＡ
（ｎ＝３３）または−４５．１±４．０ｐＡ（ｎ＝１３）の定常電流となった（図５）。
ＣｓｇＧチャネルを通る電流の流れは、化学量論量のペリプラズム因子ＣｓｇＥ（Ｕｎ
ｉｐｒｏｔ受託番号ＰＯＡＥ９５）の付加によって有効に遮断することができる（実施例
１０〜１２）。理論によって拘束されることを望むものではないが、電流の痕跡は、Ｃｓ
ｇＥがＣｓｇＧポアと複合体を形成してチャネルの一方の末端をキャップするように作用
する機序を強く示唆する。ＣｓｇＧチャネルを通るイオンの流れの有意な低減を、標準単
一チャネル記録技術を使用して測定することができる（実施例１２および１３、図６）。
本発明者らは、電流の流れについての測定パラメータ（最大電流、および電流変動をモニ
ターする能力）が、ナノポアを本発明の一実施形態による核酸シークエンシングおよび分
子センシングでの使用に好適なものにすることを見出した。
したがって、本発明は、一部は、ナノポアを通って流れる電流の電気的測定値の変動に
基づく核酸シークエンシングの方法およびそのような核酸シークエンシングにおけるＣｓ
ｇＧナノポアタンパク質複合体の使用に関する。
核酸は、ナノポアシークエンシングに特に好適である。ＤＮＡおよびＲＮＡ中に天然に
存在する核酸塩基を、それらの物理的サイズによって区別することができる。核酸分子ま
たは個々の塩基がナノポアのチャネルを通過すると、それらの塩基間のサイズ差に起因し
て、チャネルを通るイオン流の直接相関する低減が生ずる。イオン流の変動を記録するこ
とができる。イオン流変動を記録する好適な電気的測定技術は、例えば、国際公開第２０
００／２８３１２号パンフレットおよびD. Stoddart et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
2010, 106, pp 7702-7（単一チャネル記録機器）に、ならびに例えば国際公開第２００９
／０７７７３４号パンフレット（多チャネル記録技術）に記載されている。適切な較正に
より、イオン流の特徴的低減を使用して、チャネルを横断する特定のヌクレオチドおよび
関連塩基をリアルタイムで同定することができる。
膜貫通チャネルの最も狭い狭窄のサイズは、概して、核酸シークエンシング用途に対す
るナノポアの適合性を判定する上で重要な因子である。狭窄が小さすぎると、シークエン
シングされる分子は通過できないことになる。しかし、チャネルを通るイオン流に対する
最大効果を達成するには、その最も狭い位置で（すなわち、狭窄箇所で）チャネルが大き
すぎてはならない。理想的には、いずれの狭窄も直径が通過する塩基のサイズに可能な限
り近くあるべきである。核酸および核酸塩基のシークエンシングに好適な狭窄の直径は、
ナノメートル範囲（１０−９メートル範囲）である。好適には、直径は、ほぼ０．５〜１
．５ｎｍであるべきであり、通常は、直径は、ほぼ０．７〜１．２ｎｍである。野生型大
腸菌（E. coli）ＣｓｇＧ内の狭窄は、おおよそ９Å（０．９ｎｍ）の直径を有する。本
発明者らは、ＣｓｇＧチャネル内の狭窄のサイズおよび立体配置が核酸シークエンシング
に好適であると演繹した。
核酸シークエンシングに関する用途のためのＣｓｇＧナノポアは、野生型形態で使用さ
れることもあり、または使用中のナノポアの所望の特性をさらに向上させるように、例え
ば特定のアミノ酸残基の定方向突然変異誘発によって、さらに修飾されることもある。例
えば、本発明の実施形態では、変異は、チャネル内の狭窄の数、サイズ、形状、配置また
は配向を変更することを企図したものである。修飾変異体ＣｓｇＧナノポア複合体は、ポ
リペプチド配列内の特異的標的アミノ酸残基の挿入、置換および／または欠失をもたらす
公知遺伝子工学技術によって調製することができる。オリゴマーＣｓｇＧナノポアの場合
、変異をモノマーのポリペプチドサブユニット各々において生じさることもあり、または
モノマーのいずれか１つにおいて生じさせることもあり、またはモノマーのすべてにおい
て生じさせることもある。好適には、本発明の一実施形態では、記載の変異をオリゴマー
タンパク質構造内のモノマーのポリペプチドすべてに生じさせる。
本発明の実施形態によると、ポア内のチャネル狭窄数が低減されている修飾変異体Ｃｓ
ｇＧナノポアを提供する。
野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧポアは、２カ所のチャネル狭窄を含む（図１を参照
されたい）。これらは、５４位からの５３位への追加のアミノ酸を含むより広い構造の一
部としての（ｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ５６およびＡｓｎ５５と（ｉｉ）アミノ酸残基Ｔｙ
ｒ５１、ならびにＣループモチーフによって形成される（図２および３）。
典型的ナノポア核酸シークエンシングでは、目的の核酸配列の個々のヌクレオチドがナ
ノポアのチャネルを逐次的に通過すると、ヌクレオチドによるチャネルの部分的閉塞のた
め、開口チャネルイオン流が低減される。上に記載した好適な記録技術を使用してイオン
流のこの低減が測定される。イオン流の低減を、チャネルを通る既知ヌクレオチドについ
て測定されるイオン流の低減に対応させてもよく、これは、結果的に、どのヌクレオチド
がチャネルを通過しているのかを判定する手段、したがって、逐次的に行った場合にはナ
ノポアを通過する核酸のヌクレオチド配列を判定する方法となる。個々のヌクレオチドの
正確な判定のために、チャネルを通るイオン流の低減を、単一の狭窄（すなわち「読み取
りヘッド」）を通過する個々のヌクレオチドのサイズに直接相関させる必要があることが
一般的になっている。ポアを例えば関連ポリメラーゼの作用によって「通り抜け」させる
インタクト核酸ポリマーに関してシークエンシングを行うことができるということは理解
されるであろう。あるいは、ポアに近接している標的核酸から逐次的に除去されたヌクレ
オチド三リン酸塩基の通過によって配列を判定することができる（例えば国際公開２０１
４／１８７９２４パンフレットを参照されたい）。
２カ所以上の狭窄が存在し、相互に隔たっている場合、各狭窄は相互作用することがあ
り、または核酸鎖内の別々のヌクレオチドを同時に「読み取る」ことがある。この状況で
、チャネルを通るイオン流の低減は、ヌクレオチドを含有するすべての狭窄箇所の流れの
総合制限の結果である。したがって、場合によっては、二重狭窄が１つの複合電流シグナ
ルをもたらすこともある。ある特定の状況では、１カ所の狭窄、すなわち１つの「読み取
りヘッド」、の電流読み出しを、２つのそのような読み取りヘッドが存在する場合、個別
に判定することができないことがある。
ＣｓｇＧの野生型ポア構造は、組換え遺伝子技術によって２カ所の狭窄の一方を広げる
ように、変更するように、または除去するように再操作して、チャネル内に単一箇所の狭
窄を残し、かくして単一の読み取りヘッドを規定することができる。ＣｓｇＧオリゴマー
ポア内の狭窄モチーフは、モノマー野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧのポリペプチド内
の３８〜６３位のアミノ酸残基に位置する。この領域の野生型アミノ酸配列を配列番号３
として提供する。この領域を考慮する上で、アミノ酸残基位置５０〜５３、５４〜５６お
よび５８〜５９のいずれかにおける変異が本発明の権限の範囲内に企図されると考えられ
る。ＣｓｇＧ相同体との配列類似性（図４）に基づいて、アミノ酸残基位置３８〜４９、
５３、５７、および６１〜６３は、高度に保存されると考えられ、したがって、置換また
は他の修飾にあまり適していない。野生型ＣｓｇＧ構造のチャネル内のＴｙｒ５１、Ａｓ
ｎ５５およびＰｈｅ５６の側鎖の重要な位置設定のため、これらの位置における変異は、
読み取りヘッドの特徴を修飾または変更するのに有利でありうる。
ＣｓｇＧタンパク質モノマーの所与の位置における変異は、その位置の野生型アミノ酸
の他のいずれかの天然または非天然アミノ酸での置換をもたらすことがある。本発明の一
実施形態では、狭窄を広げるまたは除去することが望ましく、好適には、修飾ＣｓｇＧタ
ンパク質中のアミノ酸側鎖は、それが置換する野生型構造内のアミノ酸側鎖より立体的妨
害が少なくなるように選択されることになる。所与の位置の置換アミノ酸残基は、同様の
静電特性を有することもあり、または異なる静電特性を有することもある。好適には、置
換アミノ酸側鎖は、チャネルの二次構造または特性に対する破壊を最小にするために、そ
れが置換する野生型構造内のアミノ酸側鎖と同様の静電電荷を有することになる。
置換アミノ酸の選択は、大規模多重配列アラインメントに基づいてアミノ酸が別のアミ
ノ酸を置換する尤度を算出するための標準方法論を提供する、ＢＬＯＳＵＭ６２行列に基
づくこともある。ＢＬＯＳＵＭ６２行列の例を当業者はインターネット上で自由に入手で
きる。例えば、米国国立生物学情報センター（National Center for Biotechnology Info
rmation）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
／Ｃｌａｓｓ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ａａ／ａａ＿ｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｃｇｉ）を参照さ
れたい。
ＣｓｇＧチャネル内の第１の狭窄を形成するように作用する野生型ＣｓｇＧ構造内のＴ
ｙｒ５１に対して、任意のアミノ酸での置換が施される。特に、本発明のある特定の実施
形態では、Ｔｙｒ５１は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アス
パラギン、グルタミンおよびフェニルアラニンで置換されることがある（配列番号３９〜
３１８）。本発明の実施形態では、アラニンまたはグリシンでのＴｙｒ５１の置換が特に
好適である（配列番号３９〜１０８）。実施形態では、残基５０〜５３（野生型配列中の
ＰＹＰＡ）は、グリシン−グリシン（ＧＧ）で置換されることがある（配列番号３５４〜
３８８）。
ＣｓｇＧチャネル内の第２の狭窄に寄与するＡｓｎ５５に対して、任意のアミノ酸での
置換が施される。特に、本発明のある特定の実施形態では、Ａｓｎ５５は、アラニン、グ
リシン、バリン、セリンまたはトレオニンで置換されることがある（配列番号９〜３３、
４４〜６８、７９〜１０３、１１４〜１３８、１４９〜１７３、１８４〜２０８、２１９
〜２４３、２５４〜２７８、２８９〜３１３および３２４〜３４８）。
ＣｓｇＧチャネル内の第２の狭窄の一部を形成するＰｈｅ５６に対して、任意のアミノ
酸での置換が施される。特に、本発明のある特定の実施形態では、Ｐｈｅ５６は、アラニ
ン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギンおよびグルタミンで置換
されることがある（配列番号５〜１３、１５〜１８、２０〜２３、２５〜２８、３０〜３
３、４０〜４３、４５〜４８、５０〜５３、５５〜５８、６０〜６３、６５〜６８、７５
〜７８、８０〜８３、８５〜８８、９０〜９３、９５〜９８、１００〜１０３、１１０〜
１１３、１１５〜１１８、１２０〜１２３、１２５〜１２８、１３０〜１３３、１３５〜
１３８、１４５〜１４８、１５０〜１５３、１５５〜１５８、１６０〜１６３、１６５〜
１６８、１７０〜１７３、１８０〜１８３、１８５〜１８８、１９０〜１９３、１９５〜
１９８、２００〜２０３、２０５〜２０８、２１５〜２１８、２２０〜２２３、２２５〜
２２８、２３０〜２３３、２３５〜２３８、２４０〜２４３、２５０〜２５３、２５５〜
２５８、２６０〜２６３、２６５〜２６８、２７０〜２７３、２７５〜５７８、２８５〜
２８８、２９０〜２９３、２９５〜２９８、３００〜３０３、３０５〜３０８、３１０〜
３１３、３２０〜３２３、３２５〜３２８、３３０〜３３３、３３５〜３３８、３４０〜
３４３および３４５〜３４８）。本発明の実施形態では、アラニンおよびグリシンでのＰ
ｈｅ５６の置換が特に好適である（配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、
４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、
１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、
１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、
２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、
２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、
３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、
３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、６、１１、１６、２１、２
６、３１、３６、４１、４６、５１、５６、６１、６６、７１、７６、８１、８６、９１
、９６、１０１、１０６、１１１、１１６、１２１、１２６、１３１、１３６、１４１、
１４６、１５１、１５６、１６１、１６６、１７１、１７６、１８１、１８６、１９１、
１９６、２０１、２０６、２１１、２１６、２２１、２２６、２３１、２３６、２４１、
２４６、２５１、２５６、２６１、２６６、２７１、２７６、２８１、２８６、２９１、
２９６、３０１、３０６、３１１、３１６、３２１、３２６、３３１、３３６、３４１
３４６、３５１、３５６、３６１、３６６、３７１、３７６、３８１および３８６）。
所与の変異体ＣｓｇＧタンパク質において、Ｔｙｒ５１の置換は、５５および５６位の
どちらか一方と同時に行われることもあり（配列番号４４、４９、５４、５９、６４、７
９、８４、８９、９４、９９、１１４、１１９、１２４、１２９、１３４、１４９、１５
４、１５９、１６４、１６９、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２１９、２２
４、２２９、２３４、２３９、２５４、２５９、２６４、２６９、２７４、２８９、２９
４、２９９、３０４、３０９、３５９、３６４、３６９、３７４、３７９、４０、４１、
４２、７５、７６ ７７、１１０、１１１、１１２、１４５、１４６、１４７、１８０、
１８１、１８２、２１５、２１６、２１７、２５０、２５１、２５２、２８５、２８６お
よび２８７）、この場合、チャネル内の好適な寸法の少なくとも１カ所の狭窄が維持され
る。あるいは、Ｔｙｒ５１の置換は、位置Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の両方における置
換に対して相互排他的である（配列番号３９、７４、１０９、１４４、１７９、２１４、
２４９、２８４、３５４、１０、１１、１２、１５、１６、１７、２０、２１、２２、２
５、２６、２７、３０、３１および３２）。
あるいは、野生型ＣｓｇＧタンパク質中のＴｙｒ５１、Ａｓｎ５５またはＰｈｅ５６の
１つまたは複数が欠失されることもある（配列番号３１９〜３５３、３４〜３８、６９〜
７３、１０４〜１０８、１３９〜１４３、１７４〜１７８、２０９〜２１３、２４４〜２
４８、２７９〜２８３、３１４〜３１８、３８４〜３８８、８、１３、１８、２３、２８
、３３、４３、４８、５３、５８、６３、６８、７８、８３、８８、９３、９８、１０３
、１１３、１１８、１２３、１２８、１３３、１３８、１４８、１５３、１５８、１６３
、１６８、１７３、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１８、２２３
、２２８、２３３、２３８、２４３、２５３、２５８、２６３、２６８、２７３、２７８
、２８８、２９３、２９８、３０３、３０８および３１３）。チャネル内の少なくとも１
カ所の狭窄を維持するために、所与の実施形態では、アミノ酸残基Ｔｙｒ５１の欠失は、
アミノ酸残基Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６両方の欠失に対して相互排他的である（配列番
号３１９〜３２２、３２４〜３２７、３２９〜３３２、３３４〜３３７、３３９〜３４２
、３４４〜３４７、３８、７３、１０８、１４３、１７８、２１３、２４８、２８３およ
び３１８）。５３位と５４位および４８位と４９位におけるある特定の隣接アミノ酸残基
も欠失されることがある。
本発明は、上記修飾が孤立して行われることもあり、あらゆる組合せで行われることも
ある実施形態を提供するものであることは、理解されるはずである。
Ｔｙｒ５１における狭窄またはＡｓｎ５５／Ｔｙｒ５６における狭窄のどちらか一方の
除去の結果、ＣｓｇＧチャネル内の狭窄は単一箇所になる。理論によって拘束されること
を望むものではないが、Ａｓｎ５５／Ｔｙｒ５６における狭窄は、望ましいこともあるＴ
ｙｒ５１における狭窄より高い配座安定性を有することになると想定される。しかし、Ａ
ｓｎ５５／Ｔｙｒ５６狭窄がヌクレオチドと比較して（中心ポア軸に沿って測定して）高
すぎることもある。これは、移行中のＤＮＡ鎖内の個々の塩基対の分解能不良につながる
ことがある。
反対のことがＴｙｒ５１狭窄について言える可能性が高い。Ａｓｎ５５／Ｔｙｒ５６狭
窄の除去後、そのオリゴマー中のＴｙｒ５１残基の残存する環は、ネイティブ構造の場合
より配座安定性が低いことがある。しかし、Ｔｙｒ５１狭窄のほうが、（中心ポア軸に沿
って測定して）短く、個々の塩基を区別しうる狭窄をチャネル内に設けることができる可
能性が高い。
どちらの実施形態においても、（中心軸に沿って測定して）単一箇所の狭い狭窄の存在
は、ポアを核酸シークエンシング用途に利用するときに電流読み取りの複雑さを低減させ
る可能性が高い。したがって、ポアを通って核酸が移行している間に発生する観測電流の
変調は、別個のヌクレオチドの単一の狭窄、すなわち「読み取りヘッド」、の通過をもっ
ぱら反映することになる。
１カ所の狭窄の有効な除去は、そのポアバリアントの開口チャネル電流も増加させるこ
とができる。開口チャネル電流の増加は、より高いバックグラウンドコンダクタンスとし
て有利であり、異なる核酸塩基対シグナルについての電流遮断レベルのより良好な分解に
つながる。このように、読み取りヘッドに対する修飾は、核酸シークエンシングおよび他
の分子センシング用途の両方に対する生体ポアの適合性を向上させることができる。
代替実施形態として、または上記の配列修飾に加えて、Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６狭窄が
（中心ポア軸に沿って測定したときの）その高さの調整にさらに適応されうることも条件
とする。Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６狭窄のそのようなさらなる適応形態は、ＣｓｇＧチャネ
ル内のＴｙｒ５１もしくは他の位置の変異を伴うこともあり、または伴わないこともある
。好適には、Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６狭窄のさらなる適応形態は、Ｔｙｒ５１残基によっ
て形成される狭窄を広げるまたは除去する変異の一部として企図される。
野生型形態の場合、Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６チャネル狭窄は、互いに垂直に方向に隣接
して位置する２つのアミノ酸環で作られる。結果として、狭窄は、１ｎｍより長い長さを
有する。１ｎｍ長の狭窄は、イオン流から発生する電気シグナルを移行中の核酸鎖内の別
個の塩基に分解することを可能とすることができない。通常は、核酸シークエンシングに
使用される公知ナノポアの狭窄は、１ｎｍ未満の長さを概して有する。例えば、ＤＮＡシ
ークエンシングに使用されるＭｓｐＡナノポアは、（中心ポア軸に沿って測定して）０．
６ｎｍの狭窄高を有する（Manrao et al., Nature Biotechnology, 2012, 30(4), 349-35
3）。
Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６狭窄の（中心ポア軸に沿って測定したときの）高さを低減させ
るために、２つの残基のどちらか一方を置換してまたは欠失させて狭窄の頂部または底部
を広げてもよい。
ＣｓｇＧチャネル内の第２の狭窄の一部を形成するＡｓｎ５５に対して、任意のアミノ
酸での置換が企図される。特に、アラニン、グリシン、バリン、セリンまたはトレオニン
での置換（配列番号９〜３３、４４〜６８、７９〜１０３、１１４〜１３８、１４９〜１
７３、１８４〜２０８、２１９〜２４３、２５４〜２７８、２８９〜３１３および３２４
〜３４８）。
ＣｓｇＧチャネル内の第２の狭窄の一部を形成するＰｈｅ５６に対して、任意のアミノ
酸での置換が企図される。特に、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン
、アスパラギンおよびグルタミンでの置換（配列番号５〜１３、１５〜１８、２０〜２３
、２５〜２８、３０〜３３、４０〜４３、４５〜４８、５０〜５３、５５〜５８、６０〜
６３、６５〜６８、７５〜７８、８０〜８３、８５〜８８、９０〜９３、９５〜９８、１
００〜１０３、１１０〜１１３、１１５〜１１８、１２０〜１２３、１２５〜１２８、１
３０〜１３３、１３５〜１３８、１４５〜１４８、１５０〜１５３、１５５〜１５８、１
６０〜１６３、１６５〜１６８、１７０〜１７３、１８０〜１８３、１８５〜１８８、１
９０〜１９３、１９５〜１９８、２００〜２０３、２０５〜２０８、２１５〜２１８、２
２０〜２２３、２２５〜２２８、２３０〜２３３、２３５〜２３８、２４０〜２４３、２
５０〜２５３、２５５〜２５８、２６０〜２６３、２６５〜２６８、２７０〜２７３、２
７５〜５７８、２８５〜２８８、２９０〜２９３、２９５〜２９８、３００〜３０３、３
０５〜３０８、３１０〜３１３、３２０〜３２３、３２５〜３２８、３３０〜３３３、３
３５〜３３８、３４０〜３４３および３４５〜３４８）。本発明の実施形態では、アラニ
ンおよびグリシンでのＰｈｅ５６の置換が特に好適である（配列番号５、１０、１５、２
０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５
、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１
４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１
９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２
４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２
９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３
４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、６
、１１、１６、２１、２６、３１、３６、４１、４６、５１、５６、６１、６６、７１、
７６、８１、８６、９１、９６、１０１、１０６、１１１、１１６、１２１、１２６、１
３１、１３６、１４１、１４６、１５１、１５６、１６１、１６６、１７１、１７６、１
８１、１８６、１９１、１９６、２０１、２０６、２１１、２１６、２２１、２２６、２
３１、２３６、２４１、２４６、２５１、２５６、２６１、２６６、２７１、２７６、２
８１、２８６、２９１、２９６、３０１、３０６、３１１、３１６、３２１、３２６、３
３１、３３６、３４１ ３４６、３５１、３５６、３６１、３６６、３７１、３７６、３
８１および３８６）。
野生型ＣｓｇＧポアの狭窄の最小直径を調整するための修飾も企図される。ＣｓｇＧポ
ア内の両方の狭窄の最小直径は、おおよそ０．９ｎｍ（９Å）であり、これは、ＤＮＡシ
ークエンシングに対する有用性を示す公知ＭｓｐＡナノポア内の狭窄についての直径１．
２ｎｍ（Manrao et al., Nature Biotechnology, 2012, 30(4), 349-353）より小さい。
０．５〜１．５ｎｍの最小直径を有する修飾ＣｓｇＧポア内の残存狭窄をもたらす上記の
いずれかの変異が好適であるであろう。
上に列挙した修飾のいずれかは、狭窄箇所のアミノ酸の親水性および電荷分布を有益に
変更して、移行中の核酸鎖に関して通過および非共有結合性相互作用を向上させて電流読
み出しを向上させることができる。上に列挙した変異のいずれかは、チャネル狭窄近くの
親水性および電荷分布を有益に変更して、その狭窄を通る電解質イオンの流れを最適化す
ること、および移行中の核酸鎖の通過中のヌクレオチド間のより良好な識別を果たすこと
もできる。
チャネル内腔内の表面電荷分布を変化させる結果となりうるＣｓｇＧタンパク質のさら
なる修飾が企図される。本発明の一実施形態では、これらの修飾は、移行中の核酸のチャ
ネル壁への望ましくない静電吸着を回避するために施される。核酸は負電荷を有し、Ｃｓ
ｇＧチャネル内腔は多少の正電荷を有する（図１）ので、静電相互作用が核酸シークエン
シング中に通り抜けまたは移行に干渉しうると想定される。好適には、正電荷を有するア
ミノ酸残基、例えばリシン、ヒスチジンおよびアルギニンを中性または負電荷を有する側
鎖で置換して、ポアを通る核酸移行の効率およびしたがって電流読み出しの明確さをさら
に向上させることができる。
核酸鎖（または個々のヌクレオチド）のポア狭窄内の移行または通り抜けを助長するた
めの、野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧまたは変異体ＣｓｇＧのチャネル内腔の修飾も
、本発明の実施形態によって提供する。内部狭窄を有するＣｓｇＧの膜貫通部分は、中心
の穴を特徴とする蓋を伴うバレルに似ている。バレルと蓋に最も近いポア内腔に追加のル
ープを加えることによって通り抜けを助長することができる。
本発明の特異的実施形態は、ＣｓｇＧポアが、共有結合している１つまたは複数のモノ
マー、ダイマーまたはオリゴマーからなりうることを条件とする。非限定的な例として、
モノマーは、任意の立体配置で、例えばそれらの末端アミノ酸によって、遺伝子的に融合
されていることがある。この場合、１つのモノマーのアミノ末端が別のモノマーのカルボ
キシ末端に融合されていることもある。
本発明の実施形態によると、ＣｓｇＧポアが、分子のそのポアの通過に有益な特性を有
しうるさらなるアクセサリータンパク質に順応するように適合されうることも条件とする
。ポアへの適合は、核酸プロセシング酵素の固定化を助長することができる。核酸プロセ
シング酵素としては、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、イソメラーゼ、トポイソメラー
ゼ、ジャイレース、テロメラーゼ、およびヘリカーゼを挙げることができる。これらの酵
素の１つまたは複数をナノポアと会合させることで、核酸によるポアの通り抜け増進に関
して、および核酸鎖がポアによって翻訳される速度を制御する点で恩恵にあずかることが
できる（Manrao et al., Nature Biotechnology, 2012, 30(4), 349-353）。ポアを通る
核酸鎖の移行速度の制御には、イオン流の電流測定に関して、読み出しにより好適であり
、より均一である、向上した応答をもたらすという利点がある。
本発明の実施形態では、ナノポアの膜外領域における修飾は、１つまたは複数の結合／
固定化部位を設けることによってチャネルの内腔の内部にまたは内腔に隣接してＤＮＡポ
リメラーゼなどの好適な核酸プロセシング酵素をドッキングさせることを助長するのに役
立つことができると予想される。好適な固定化部位は、酵素の静電結合のための静電パッ
チ、共有結合性カップリングを可能にするための１つもしくは複数のシステイン残基、お
よび／または立体アンカーを設けるための膜貫通チャネル部分の内部幅変更を含むことが
ある。
下でより詳細に述べる特異的実施形態では、本発明は、核酸シークエンシングで使用す
るためのＣｓｇＧ野生型ポアのさらなる適応形態を提供する。
本発明の実施形態では、ＣｓｇＧポアの膜外領域（図１に示す下の部分）は、チャネル
内腔の反対側に核酸鎖の退出を助長するために短縮または除去されることがある。膜外領
域の短縮または除去は、チャネルのイオン流からの電気シグナルの電流分解能を向上させ
ることもできる。後者の利点は、膜外領域によるイオン流に対して生じた抵抗を低下する
ことによってもたらされる。本ＣｓｇＧポアの場合、膜貫通チャネル、内部狭窄およびキ
ャップ領域が、直列に存在する３つの抵抗領域に相当する。これらのうちの１つの寄与を
除去することまたは低下させることは、開口チャネル電流を増加させることになり、した
がって、電流分解能を向上させることになる。そのような変更は、α−ヘリックス２（α
２）、Ｃ末端ａ−ヘリックス（αＣ）（図１）および／またはこれらの組合せの欠失を含
むことができる。
本発明のさらなる実施形態では、野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧポアの外面の膜対
向アミノ酸は、その膜へのポアの挿入を助長するように修飾することができる。ある特定
の実施形態では、単一アミノ酸置換によって野生型残基がより疎水性の高い好適な類似体
で置換されうることを条件とする。例えば、残基Ｓｅｒ１３６、Ｇｌｙ１３８、Ｇｌｙ１
４０、Ａｌａ１４８、Ａｌａ１８８またはＧｌｙ２０２の１つまたは複数をＡｌａ、Ｖａ
ｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに変化させることができる。加えて、チロシンまたはトリプトフ
ァンなどの芳香族残基は、疎水性膜と親水性溶媒の界面に位置するように適切な野生型ア
ミノ酸を置換することができる。例えば、残基Ｌｅｕ１５４またはＬｅｕ１８２の１つま
たは複数をＴｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐによって置換することができる。
本発明の実施形態では、タンパク質ポアの熱安定性を増加させることができる。この結
果、シークエンシングデバイス内でのナノポアの有効期限が有利に増されることになる。
実施形態では、タンパク質ポアの熱安定性の増加は、ベータ・ターン配列の修飾によって
またはタンパク質表面での静電相互作用の向上によって達成される。一実施形態では、膜
貫通領域のβ−ヘアピンを、隣接β−ヘアピン内または間の２本の隣接β鎖にわたる共有
結合性ジスルフィドの形成によって安定させることができる。そのような交差鎖システイ
ン対の例は、Ｖａｌ１３９−Ａｓｐ２０３、Ｇｌｙ１３９−Ｇｌｙ２０５、Ｌｙｓ１３５
−Ｔｈｒ２０７、Ｇｌｕ２０１−Ａｌａ１４１、Ｇｌｙ１４７−Ｇｌｙ１８９、Ａｓｐ１
４９−Ｇｌｎ１８７、Ｇｌｎ１５１−Ｇｌｕ１８５、Ｔｈｒ２０７−Ｇｌｕ１８５、Ｇｌ
ｙ２０５−Ｇｌｎ１８７、Ａｓｐ２０３−Ｇｌｙ１８９、Ａｌａ１５３−Ｌｙｓ１３５、
Ｇｌｙ１３７−Ｇｌｎ１５１、Ｖａｌ１３９−Ａｓｐ１４９またはＡｌａ１４１−Ｇｌｙ
１４７でありうる。
本発明のさらなる実施形態では、ポリペプチド配列のコドン使用頻度を、Biotechnol.
J., 2011, 6(6), 650-659に記載されている方法に従って、ＣｓｇＧタンパク質の高レベ
ルかつ低エラー率での発現を可能にするように修飾することができる。この修飾は、ｍＲ
ＮＡのあらゆる二次構造も標的にすることができる。
本発明は、タンパク質配列の、そのプロテアーゼ安定性を向上させるための変更も、提
供する。これは、可撓性ループ領域の除去、例えば、α−ヘリックス２（α２）、Ｃ末端
ａ−ヘリックス（αＣ）（図１）および／またはこれらの組合せの欠失によって果たすこ
とができる。
本発明の実施形態では、ＣｓｇＧポリペプチド配列／発現系は、起こりうるタンパク質
凝集を回避するように変更される。
本発明は、タンパク質のフォールディング効率を向上させるためのポリペプチド配列の
変更も提供する。好適な技術は、Biotechnol. J., 2011, 6(6), 650-659に提供されてい
る。
本発明の一実施形態は、ＣｓｇＧタンパク質の精製を助長するためのバイオアフィニテ
ィータグの置換または付加をさらに提供する。発表されているＣｓｇＧポア構造は、Ｓｔ
ｒｅｐＩＩタグを含有する（Goyal et al., Nature, 2014, 516(7530), 250-3）。本発明
の実施形態は、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製を助長するた
めのヒスチジンタグなどの、他のバイオアフィニティータグを含む。本発明の代替実施形
態では、タグは、ＦＬＡＧタグまたはエピトープタグ、例えばＭｙｃタグもしくはＨＡタ
グを含むことがある。本発明のさらなる実施形態では、ナノポアをビオチンまたはその類
似体（例えばデスチオビオチン）でのビオチン化によって修飾することにより、ストレプ
トアビジンとの相互作用によって精製を助長することもある。
本発明の実施形態では、ポリペプチドの正味電荷を増加させ、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の際のタンパク質の泳動を助長するために、タンパク質末端に負電荷を付加させ
ることがある。これは、ＣｓｇＧのヘテロオリゴマーの、これらの化学種が目的の化学種
である場合、分離向上をもたらすことができる（Howorka et al., Proc. Nat. Acad. Sci
., 2001, 98(23), 12996-13001を参照されたい）。ヘテロオリゴマーは、ポア１つにつき
１つだけのシステイン残基の導入に有用でありえ、この導入は、上記のＤＮＡ−ポリメラ
ーゼなどの好適な核酸プロセシング酵素の結合を助長するのに有利でありうる。
本発明は、一部は、ナノポアを通って流れる電流の電気的測定値の変動に基づく分子セ
ンシング用途における野生型または修飾ＣｓｇＧナノポアの使用に関する。
ＣｓｇＧポアのチャネル内でのまたはチャネルのどちらか一方の開口部付近での分子の
結合は、ポアを通る開口チャネルイオン流に対して影響を及ぼすことになる。上に記載し
た核酸シークエンシング用途と同様に、好適な測定技術を使用して電流の変化によって開
口チャネルイオン流の変動を測定することができる（例えば、国際公開第２０００／２８
３１２号パンフレットおよびD. Stoddart et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2010, 106,
7702-7、または国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレット）。電流の低減によ
って測定されるようなイオン流の低減の程度は、ポア内のまたはポアの付近の妨害の大き
さに関係づけられる。したがって、ポア内のまたはポア付近の目的の分子（分析物とも呼
ぶ）の結合は、検出可能かつ測定可能な事象をもたらすことによって、生体センサーの基
礎を成す。ナノポアセンシングに好適な分子としては、核酸、タンパク質、ペプチド、お
よび小分子、例えば医薬、毒素またはサイトカインが挙げられる。
生体分子の存在の検出は、個別化創薬、医学、診断学、生命科学研究、環境モニタリン
グに、ならびに警備および／または防衛産業に応用される。
本発明の実施形態では、本明細書において開示する野生型もしくは修飾大腸菌（E. col
i）ＣｓｇＧナノポアまたはその相同体は、分子センサーとして役立つことができる。分
析物検出の手順は、Howorka et al., Nature Biotechnology (2012) Jun 7; 30(6):506-7
に記載されている。検出されることになる分析物分子は、チャネルのどちらかの面に結合
することもあり、チャネル自体の内腔内に結合することもある。結合位置は、センシング
される分子のサイズによって決まりうる。野生型ＣｓｇＧポアは、センサーとして作用す
ることがあり、または本発明の実施形態では、ＣｓｇＧポアは、組換え法もしくは化学的
方法によって、センシングされる分子の結合の強度、結合の位置もしくは結合特異性を増
加させるように修飾される。典型的な修飾としては、センシングされる分子の構造に相補
的な特異的結合部分の付加が挙げられる。分析物分子が核酸を含む場合、この結合部分は
、シクロデキストリンまたはオリゴヌクレオチドを含むことがあり；小分子については、
これは、公知相補性結合領域、例えば、抗体のもしくは非抗体分子の抗原結合部分（一本
鎖可変断片（ｓｃＦｖ）領域、もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）からの抗原認識ドメイン
を含む）であることがあり；またはタンパク質については、それは、標的タンパク質の公
知リガンドであることがある。このように、野生型または修飾大腸菌（E. coli）Ｃｓｇ
Ｇナノポアまたはその相同体を試料中の好適な抗原（エピトープを含む）の存在を検出す
る分子センサーとして作用できるようすることができ、そのような好適な抗原としては、
細胞表面抗原（受容体、固形腫瘍または血液がん細胞（例えばリンパ腫または白血病）の
マーカーを含む）、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、アレルゲン、アレルギー関
連分子、アルブミン（例えば、ヒト、齧歯動物またはウシ）、蛍光分子（フルオレセイン
を含む）、血液型抗原、小分子、薬物、酵素、酵素または酵素基質の触媒部位、および酵
素基質の遷移状態類似体を挙げることができる。
修飾は、公知の遺伝子工学および組換えＤＮＡ技術を使用して果たすことができる。い
ずれの適応形態の位置設定も、センシングされる分子の性質、例えば、サイズ、三次元構
造およびその生化学的性質に依存することになる。適応させる構造の選択にはコンピュー
タ構造設計を使用することができる。各々が予定されるセンシング用途に特に適応してい
る一連の特注ＣｓｇＧナノポアが構想される。タンパク質−タンパク質相互作用またはタ
ンパク質−小分子相互作用の判定および最適化は、表面プラズモン共鳴を使用して分子相
互作用を検出するＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（BIAcore, Inc.、Piscataway、NJ；ｗｗ
ｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏｍも参照されたい）などの技術を使用して調査することができ
る。
実施形態では、ＣｓｇＧポアは、タンパク質Ｎ末端の脂質化を防止するためにＮ末端Ｃ
ｙｓ残基が代替アミノ酸によって置換されている水溶性オクタマー形態のものであること
ができる。代替実施形態では、細菌脂質化経路によるプロセシングを回避するためにＮ末
端リーダー配列を除去することによってタンパク質を細胞質において発現させることがで
きる。
ＣｓｇＧモノマー可溶性タンパク質、オクタマー可溶性タンパク質およびオリゴマー脂
質化ＣｓｇＧポアの製造方法は、参照によって本明細書に組み入れられているGoyal ef a
l.（Nature, 2014; 516(7530): 250-3）に記載されており、ならびにそのような製造方法
を実施例１および２に記載する。
変異体ＣｓｇＧモノマー
本発明は、変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。それらの変異体ＣｓｇＧモノマーを使
用して、本発明のポアを形成することができる。変異体ＣｓｇＧモノマーは、配列が野生
型ＣｓｇＧモノマーのものとは異なるモノマーであって、ポアを形成する能力を保持する
モノマーである。ポアを形成する変異体モノマーの能力を確認する方法は当技術分野にお
いて周知であり、そのような方法を下でより詳細に論じる。
変異体モノマーは、ポリヌクレオチド読み出し特性が向上している、すなわち、ポリヌ
クレオチド捕捉およびヌクレオチド識別の向上を示す。詳細には、変異体モノマーから構
築されるポアは、野生型より容易にヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを捕捉する。加
えて、変異体モノマーから構築されるポアは、異なるヌクレオチド間の識別をより容易に
する電流範囲の増加、およびシグナル対ノイズ比を増加させる状態変動の低減を示す。加
えて、ポリヌクレオチドが変異体から構築されるポアを通って移動するときの電流に寄与
するヌクレオチドの数が減少される。これは、ポリヌクレオチドがポアを通って移動して
いるときに観測される電流とポリヌクレオチド配列との直接的関連の同定をより容易にす
る。加えて、変異体モノマーから構築されるポアは、スループット増加を示すこともあり
、すなわち、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用する可能性がより高い。これは、
ポアを使用する分析物の特徴づけをより容易にする。変異体モノマーから構築されるポア
は、より容易に膜に入ることができる。
本発明の変異体モノマーは、配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む。配列
番号３９０は、大腸菌Ｋ１２株ＭＣ４１００亜株（Escherichia coli Str. K-12 substr.
MC4100）からの野生型ＣｓｇＧモノマーである。配列番号３９０のバリアントは、配列
番号３９０のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ポアを形成す
るその能力を保持するポリペプチドである。ポアを形成するバリアントの能力は、当技術
分野において公知の任意の方法を使用してアッセイすることができる。例えば、バリアン
トを両親媒性層に他の適切なサブユニットとともに挿入してもよく、オリゴマー化してポ
アを形成するその能力を判定してもよい。両親媒性層などの膜にサブユニットを挿入する
方法は、当技術分野において公知である。例えば、サブユニットを精製形態でトリブロッ
クコポリマー膜を含有する溶液に懸濁させてもよく、その結果、サブユニットは膜に分散
し、膜と結合することによって膜に挿入され、集合して機能性状態になる。
本明細書での論述のすべてにおいて、アミノ酸の標準１文字表記を使用する。これらは
、次の通りである：アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラ
ギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（
Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオ
ニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ
）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびバリン（Ｖ）。標準置換表記法も使用
する。すなわちＱ４２Ｒは、４２位のＱがＲで置換されていることを意味する。
一実施形態では、本発明の変異体モノマーは、次のうちの１つまたは複数を含む配列３
９０のバリアントを含む：（ｉ）次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次
の位置の１つもしくは複数における変異）：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、
Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２、
例えば、次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複
数における変異）：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｅ１
３１およびＴ１５０、またはＮ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｅ１０１およびＥ１３１、（ｉｉ
）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６にお
ける変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、
Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１
４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ
、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ、（
ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ）次の位置の１つもしく
は複数の欠失：Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ
５６およびＳ５７。バリアントは、（ｉ）〜（ｘｉ）の任意の組合せを含むことがある。
特に、バリアントは、
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
 を含むことがある。
バリアントは、（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）のいずれか１つを含む場合、Ｙ５１
、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／
Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を
さらに含むことがある。
（ｉ）において、バリアントは、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、
Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２のあらゆる
数および組合せでの変異を含むことがある。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは
、次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数にお
ける変異）を含む：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｅ１
３１およびＴ１５０。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、次の位置における１
つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）を含む：Ｎ
４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｅ１０１およびＥ１３１。（ｉ）において、バリアントは、好ま
しくは、Ｓ５４および／またはＳ５７における変異を含む。（ｉ）において、バリアント
は、より好ましくは、（ａ）Ｓ５４および／またはＳ５７ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５
およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、
Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。（
ｘｉ）でＳ５４および／またはＳ５７が欠失されている場合、それ／それらは（ｉ）にお
ける変異を受けることができず、逆もまた同様である。（ｉ）において、バリアントは、
好ましくは、Ｔ１５０における変異、例えばＴ１５０Ｉを含む。あるいは、バリアントは
、好ましくは、（ａ）Ｔ１５０ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしく
は複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／
Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。（ｉ）において、バリアント
は、好ましくは、Ｑ６２における変異、例えばＱ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含む。あるいは
、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｑ６２ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６
の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５
６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。バリアントは、
Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２またはこれらの任意の組合せ、例えば、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２
、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２にお
ける変異を含むことがある。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｄ４３、Ｅ４
４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２またはＤ４３／Ｅ４４／
Ｑ６２ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１
、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ
５５／Ｆ５６における変異を含む。
本出願における（ｉｉ）および他の箇所での／という記号は「および」を意味し、した
がってＹ５１／Ｎ５５は、Ｙ５１およびＮ５５である。（ｉｉ）において、バリアントは
、好ましくは、Ｙ５１／Ｎ５５における変異を含む。ＣｓｇＧ内の狭窄は、残基Ｙ５１、
Ｎ５５およびＦ５６の側鎖によって形成される３つの積み重なった同心環で作られると提
唱されている（Goyal et al., 2014, Nature, 516, 250-253）。したがって、（ｉｉ）に
おいてのこれらの残基の変異は、ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときに電
流に寄与するヌクレオチドの数を減少させることによって、（ポリヌクレオチドがポアを
通って移動しているときの）観測電流とポリヌクレオチドとの直接的関連の同定をより容
易にすることができる。本発明の方法に有用なバリアントおよびポアに関して下で論じる
方法のいずれかでＹ５６を変異させてもよい。
（ｖ）において、バリアントは、Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２
Ｗを含むことがある。バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１
０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複
数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５
６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
（ｘｉ）において、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５
６およびＳ５７のあらゆる数および組合せが、欠失されていることがある。好ましくは、
Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５およびＳ５７の１つもしくは
複数が、欠失されていることがある。（ｘｉ）でＹ５１、Ｎ５５およびＦ５６のいずれか
が欠失されている場合、それ／それらは（ｉｉ）における変異を受けることができず、逆
もまた同様である。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、次の置換：Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３
Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４
Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１
０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、
Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１
Ｄ、Ｒ１４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎの１つまたは複
数、例えば、Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ
、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｅ１０１
Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１
３１ＤおよびＴ１５０Ｉの１つもしくは複数、またはＮ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ
４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、
Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１ＷおよびＥ１
３１Ｄの１つもしくは複数を含む。バリアントは、これらの置換のあらゆる数および組合
せを含むことがある。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｓ５４Ｐおよび／ま
たはＳ５７Ｐを含む。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｓ５４Ｐおよ
び／またはＳ５７Ｐ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、
例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６ま
たはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つも
しくは複数における変異は、下で論じるもののいずれであってもよい。（ｉ）において、
バリアントは、好ましくは、Ｆ５６Ａ／Ｓ５７ＰまたはＳ５４Ｐ／Ｆ５６Ａを含む。バリ
アントは、好ましくは、Ｔ１５０Ｉを含む。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ
）Ｔ１５０Ｉならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、
Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５
１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含む。あるい
は、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋ、ならびに（ｂ）Ｙ５１
、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／
Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を
含む。バリアントは、Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２ＲもしくはＱ６２Ｋまたはこれらのあ
らゆる組合せ、例えば、Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ
、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ
、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２ＲまたはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋを含むことがある
。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２
Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２
Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２ＲまたはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ
６２Ｋ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５
１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／
Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｄ４３Ｎを含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｓ、Ｅ１０１Ｆま
たはＥ１０１Ｎを含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、
Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４ＷまたはＥ１２４Ｄ、例えばＥ１２４Ｎ
を含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ１４２ＥおよびＲ１４２Ｎを含む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７ＧまたはＲ９７Ｌを含
む。
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
 を含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｒ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５
６Ｎ、Ｙ５１Ｍ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｖ／Ｆ５
６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｇ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５
６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５
６Ｑ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６ＱまたはＹ５１Ｈ／Ｆ５６Ｑを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５
６ＱまたはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５
６Ｍ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５
６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５
６Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５
６Ｅ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６ＨまたはＹ５１Ｔ／
Ｆ５６Ｒを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５
５ＳまたはＹ５１Ｔ／Ｎ５５Ａを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５
６Ｌ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５
６Ｐ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５
６Ｎ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５
６Ｄ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６ＨまたはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｒを含む。
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５
６Ａ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｈ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５
６Ａ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６ＡまたはＹ５１Ｖ／
Ｆ５６Ａを含む。
（ｘｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５
２／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠
失、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失および単一のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失
および単一のＰでの置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５
６の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換、Ｎ５
５／Ｆ５６の欠失および単一のグリシン（Ｇ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単
一のアラニン（Ａ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５
１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の
欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの
置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ
５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失およ
び単一のＡでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換／Ｙ
５１Ｑ、もしくはＮ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｓを含む。
バリアントは、より好ましくは、
Figure 2021078500
Figure 2021078500
 を含む。
ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときの電流により少ないヌクレオチドが
寄与するポアを形成する本発明の好ましいバリアントは、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ
／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｉ
／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、またはより好ましくはＹ
５１Ｉ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６ＡもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ａを含む。上で論じた
ように、これは、（ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときに）観測される電
流とポリヌクレオチドとの直接的関連の同定をより容易にする。
範囲増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、次の位置における変異を含む：
Ｙ５１、Ｆ５６、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３、
Ｎ５５およびＦ５６、
Ｙ５１およびＦ５６、
Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６、または
Ｆ５６およびＮ１０２。
範囲増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、以下を含む：
Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｑ、
Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ｑ、
Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１Ｔ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｑ、または
Ｆ５６ＱおよびＮ１０２Ｒ。
ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときの電流により少ないヌクレオチドが
寄与するポアを形成する好ましいバリアントは、
位置Ｎ５５およびＦ５６における変異、例えば、Ｎ５５ＸおよびＦ５６Ｑ（ここでＸは
任意のアミノ酸である）、または
位置Ｙ５１およびＦ５６における変異、例えば、Ｙ５１ＸおよびＦ５６Ｑ（ここでＸは
任意のアミノ酸である）
を含む。
スループット増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、次の位置における変異
を含む：
Ｄ１４９、Ｅ１８５およびＥ２０３、
Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３、または
Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３。
スループット増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、以下を含む：
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、または
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＲおよびＥ２０３Ｎ。
ポリヌクレオチドの捕捉が増加されるポアを形成する好ましいバリアントは、次の変異
を含む：
Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、
Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、
Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、または
Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ。
好ましいバリアントは、次の変異を含む：
Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１
４９Ｒ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１
４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、
Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｅ２０３ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、
Ｅ２０１ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｒ、
Ｅ２０１ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、
Ｅ１８５ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１８５Ｒ、
Ｅ１８５ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１８５Ｎ、
Ｄ１４９ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｒ、
Ｄ１４９ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｎ、
Ｒ１４２ＥもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１４２Ｅ、
Ｒ１４２ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１４２Ｎ、
Ｒ１９２ＥもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｅ、または
Ｒ１９２ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｎ。
好ましいバリアントは、次の変異を含む：
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｌ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｆ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｆ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｎ、または
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｇ。
本発明は、配列３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであ
って、バリアントがＴ１５０における変異を含む、変異体ＣｓｇＧモノマーも提供する。
挿入増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、Ｔ１５０Ｉを含む。Ｔ１５０にお
ける変異、例えばＴ１５０Ｉは、上で論じた変異または変異の組合せのいずれかと、組み
合わせることができる。
本発明は、実施例において開示するバリアント中に存在する変異の組合せを含む配列３
９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーも提供する。
天然に存在するアミノ酸を導入または置換する方法は、当技術分野において周知である
。例えば、メチオニン（Ｍ）は、変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド中の適切
な位置のメチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＣＧＴ）で置き換えるこ
とによって、アルギニン（Ｒ）で置換することができる。その後、そのポリヌクレオチド
を下で論じるように発現させることができる。
天然に存在しないアミノ酸を導入または置換する方法も当技術分野において周知である
。例えば、変異体モノマーを発現させるために使用されるＩＶＴＴ系に合成アミノアシル
−ｔＲＮＡを含めることによって、天然に存在しないアミノ酸を導入することができる。
あるいは、特異的アミノ酸に対して栄養要求性である大腸菌（E. coli）においてそれら
の特異的アミノ酸の合成（すなわち天然に存在しない）類似体の存在下で変異体モノマー
を発現させることによって、天然に存在しないアミノ酸を導入することができる。部分ペ
プチド合成を使用して変異体モノマーを導入する場合、ネイキッドライゲーション（nake
d ligation）によって、天然に存在しないアミノ酸を導入することもできる。
本発明の他のモノマー
別の実施形態では、本発明は、配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異
体ＣｓｇＧモノマーであって、バリアントが位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもし
くは複数における変異を含む、変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。バリアントは、Ｙ５
１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１
／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含むことがある。バリアントは、好ましくは、Ｙ５１、
Ｎ５５またはＦ５６における変異を含む。バリアントは、上で論じた位置Ｙ５１、Ｎ５５
およびＦ５６の１つもしくは複数における、およびあらゆる組合せでの、特異的変異のい
ずれかを含むことがある。Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数がいずれのア
ミノ酸で置換されていることもある。Ｙ５１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、
Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱで置換され
ていることがある。Ｎ５５は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、
Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、ＴまたはＱで置換されていることがある。Ｆ５６
は、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例え
ば、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱで置換されていることがある。
バリアントは、以下の１つまたは複数をさらに含むことがある：（ｉ）次の位置におけ
る１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）（ｉ）
Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１
３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２；（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ；（ｉｖ
）Ｋ４９Ｒ；（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ；（ｖｉ）Ｄ
１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ；（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１
８５Ｒ；（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ；（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、
Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ；（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ；ならび
に（ｘｉ）次の位置の１つもしくは複数の欠失：Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５
２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７。バリアントは、上で論じた（ｉ）お
よび（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）の組合せのいずれかを含むことがある。バリアントは、（ｉ）
および（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）について上で論じた実施形態のいずれかを含むことがある。
バリアント
上で論じた特異的変異に加えて、バリアントは、他の変異を含むことがある。配列番号
３９０のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸同一性に
基づいてその配列と少なくとも５０％相同であることになる。より好ましくは、バリアン
トは、アミノ酸同一性に基づいて、配列全体にわたって配列番号３９０のアミノ酸配列と
少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくと
も７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましく
は少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがある。連続する１００以上、
例えば１２５、１５０、１７５または２００以上、のアミノ酸のストレッチにわたって、
少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％アミノ酸同一性（「堅
い相同性（hard homology）」）があることもある。
当技術分野における標準的方法を使用して相同性を判定することができる。例えば、Ｕ
ＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅは、相同性を算出するために使用することができ、例えばその
デフォルト設定で使用される、ＢＥＳＴＦＩＴプラグラムを提供している（Devereux et
al., (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えば、Altschul S. F. (1993)
J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S. F et al., (1990) J Mol Biol 215:403-10に記
載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を
算出し、配列を並べる（例えば、等価の残基または対応する配列を（通常はそれらのデフ
ォルト設定で）同定する）ことができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、
米国国立生物学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ
ｖ／）で公的に入手できる。
配列番号３９０は、大腸菌Ｋ１２株ＭＣ４１００亜株（Escherichia coli Str. K-12 s
ubstr. MC4100）からの野生型ＣｓｇＧモノマーである。配列番号３９０のバリアントは
、別のＣｓｇＧ相同体中に存在する置換のいずれかを含むことがある。好ましいＣｓｇＧ
相同体は、配列番号３９１〜３９５および４１４〜４２９で示される。バリアントは、配
列番号３９０と比較して配列番号３９１〜３９５および４１４〜４２９に存在する置換の
１つまたは複数についての組合せを含むことがある。
上で論じたものに加えて、アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、１０、２０また
は３０以下の置換が、配列番号３９０のアミノ酸配列に施されることもある。保存的置換
は、アミノ酸を類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸
で置換する。導入されるアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸と同様の極性、親水性、
疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有することができる。あるいは、保存的置換は
、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ
酸を導入することもある。保存的アミノ酸変化は当技術分野において周知であり、下の表
１において定義するような２０の主要アミノ酸の特性に従ってそのような変化を選択する
ことができる。アミノ酸が同様の極性を有する場合、このことも、表２中のアミノ酸側鎖
についてのハイドロパシースケールを参照することによって判定することができる。
Figure 2021078500
Figure 2021078500
配列番号３９０のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基が、上記のポリペプチ
ドからさらに欠失されることもある。１、２、３、４、５、１０、２０または３０以上ま
での残基が欠失されることがある。
バリアントは、配列番号３９０の断片を含むこともある。そのような断片は、ポア形成
活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、
少なくとも２００または少なくとも２５０アミノ酸であることがある。そのような断片を
、ポアを生成するために使用してもよい。断片は、好ましくは、配列番号３９０の膜貫通
ドメイン、すなわち、Ｋ１３５〜Ｑ１５３およびＳ１８３〜Ｓ２０８を含む。
１つまたは複数のアミノ酸が上記のポリペプチドに代替的にまたはさらに付加されるこ
ともある。配列番号３９０のアミノ酸配列またはそのポリペプチドバリアントもしくは断
片のアミノ末端またはカルボキシ末端に伸長部が設けられることもある。伸長部は、かな
り短いことがあり、例えば、長さ１〜１０アミノ酸であることがある。あるいは、伸長部
は、より長いこともあり、例えば、５０または１００アミノ酸以下であることもある。担
体タンパク質が本発明によるアミノ酸配列に融合されることもある。他の融合タンパク質
は、下でより詳細に論じる。
上で論じたように、バリアントは、配列番号３９０のものとは異なるアミノ酸配列を有
するポリペプチドであって、ポアを形成するその能力を保持するポリペプチドである。バ
リアントは、ポア形成に関与している配列番号３９０の領域を通常は含有する。β−バレ
ルを含有するＣｓｇＧのポア形成能力は、各サブユニット内のβ−シートによってもたら
される。配列番号３９０のバリアントは、β−シートを形成する配列番号３９０内の領域
、すなわち、Ｋ１３５〜Ｑ１５３およびＳ１８３〜Ｓ２０８を通常は含む。結果として生
じるバリアントが、ポアを形成するその能力を保持するのであれば、β−シートを形成す
る配列番号３９０の領域に１つまたは複数の修飾を施すことができる。配列番号３９０の
バリアントは、好ましくは、１つまたは複数の修飾、例えば置換、付加または欠失、をそ
のα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に含む。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、それらの同定または精製を支援するように、例えば、
ストレプトアビジンタグの付加によって、または細胞からのそれらの分泌を促進するため
のシグナル配列の付加（モノマーがそのような配列を天然に含有しない場合）によって、
修飾されることがある。他の好適なタグは、下でより詳細に論じる。モノマーは、顕現標
識で標識されることがある。顕現標識は、モノマーを検出できるようにするいずれの好適
な標識であってもよい。好適な標識は、下で説明する。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、Ｄ−アミノ酸を使用して産生されることもある。例え
ば、ＣｓｇＧに由来するモノマーは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含むことが
ある。これは、そのようなタンパク質またはペプチドの産生に関する技術分野では当たり
前のことである。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、ヌクレオチド識別を助長するために１つまたは複数の
特異的修飾を有する。ＣｓｇＧに由来するモノマーは、他の非特異的修飾も、そのような
修飾がポア形成に干渉しないのであれば、有することができる。多数の非特異的側鎖修飾
が当技術分野において公知であり、そのような修飾をＣｓｇＧに由来するモノマーの側鎖
に施すことができる。そのような修飾としては、例えば、アルデヒドとの反応、その後の
ＮａＢＨ４での還元による、還元アルキル化、アセトイミド酸メチルでのアミド化、また
は無水酢酸でのアシル化が挙げられる。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、当技術分野において公知の標準的方法を使用して産生
することができる。ＣｓｇＧに由来するモノマーは、合成的に作製されることもあり、ま
たは組換え手段によって作製されることもある。例えば、モノマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ翻
訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成してもよい。ポアおよびモノマーの好適な産生方
法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号明細書（国際公開第２０１０／００
４２７３号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号明細書（
国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）または同第ＰＣＴ／ＧＢ
１０／０００１３３号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして
公開）において論じられている。膜へのポアの挿入方法が論じられている。
一部の実施形態では、変異体モノマーは、化学的に修飾される。変異体モノマーを任意
の方法で、任意の部位で、化学的に修飾することができる。変異体モノマーは、好ましく
は、１つもしくは複数のシステインへの分子の結合（システイン結合）、１つもしくは複
数のリシンへの分子の結合、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の結合、エピト
ープの酵素修飾、または末端の修飾によって化学的に修飾される。そのような修飾の好適
な実施方法は、当技術分野において周知である。いずれの分子の結合によって変異体モノ
マーを化学的に修飾してもよい。例えば、変異体モノマーを色素またはフルオロフォアの
結合によって化学的に修飾してもよい。
一部の実施形態では、変異体モノマーは、該モノマーを含むポアと標的ヌクレオチドま
たは標的ポリヌクレオチド配列との相互作用を助長する分子アダプターで化学的に修飾さ
れる。アダプターの存在は、ポアとヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列とのホスト
・ゲストケミストリーを向上させることによって、変異体モノマーから形成されるポアの
シークエンシング能力を向上させる。ホスト・ゲストケミストリーの原理は当技術分野に
おいて周知である。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列とのその相
互作用を向上させるポアの物理的または化学的特性に対して影響を及ぼす。アダプターは
、ポアのバレルもしくはチャネルの電荷を変更することによって、またはヌクレオチドも
しくはポリヌクレオチド配列と特異的に相互作用もしくは結合することによって、ポアと
のその相互作用を助長することができる。
分子アダプターは、好ましくは、環状分子、シクロデキストリン、ハイブリダイゼーシ
ョンできる化学種、ＤＮＡ結合剤もしくは挿入剤、ペプチドもしくはペプチド類似体、合
成ポリマー、芳香族平面分子、正電荷を有する小分子、または水素結合できる小分子であ
る。
アダプターは、環状であることがある。環状アダプターは、好ましくは、ポアと同じ対
称性を有する。ＣｓｇＧは中心軸の周囲に８または９個のサブユニットを通常は有するの
で、アダプターは好ましくは８回または９回対称性である。このことは、下でより詳細に
論じる。
アダプターは、通常は、ホスト・ゲストケミストリーによってヌクレオチドまたはポリ
ヌクレオチド配列と相互作用する。アダプターは、通常は、ヌクレオチドまたはポリヌク
レオチド配列と相互作用することができる。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌク
レオチド配列と相互作用することができる１つまたは複数の化学基を含む。１つまたは複
数の化学基は、好ましくは、非共有結合性相互作用、例えば、疎水性相互作用、水素結合
、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力によって、ヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用する。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ド配列と相互作用することができる１つまたは複数の化学基は、好ましくは、正電荷を有
する。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる１つまたは
複数の化学基は、より好ましくは、アミノ基を含む。アミノ基を第１級、第２級または第
３級炭素原子に結合させることができる。アダプターは、よりいっそう好ましくは、アミ
ノ基の環、例えば、アミノ基６、７または８個の環を含む。アダプターは、最も好ましく
は、アミノ基８個の環を含む。プロトン化アミノ基の環は、ヌクレオチドまたはポリヌク
レオチド配列中の負電荷を有するリン酸基と相互作用することができる。
ポア内のアダプターの正しい位置設定を、アダプターと変異体モノマーを含むポアとの
ホスト・ゲストケミストリーによって助長することができる。アダプターは、好ましくは
、ポア内の１つまたは複数のアミノ酸と相互作用することができる１つまたは複数の化学
基を含む。アダプターは、好ましくは、非共有結合性相互作用、例えば、疎水性相互作用
、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力によっ
てポア内の１つまたは複数のアミノ酸と相互作用することができる１つまたは複数の化学
基を含む。ポア内の１つまたは複数のアミノ酸と相互作用することができる化学基は、通
常はヒドロキシルまたはアミンである。ヒドロキシル基を第１級、第２級または第３級炭
素原子に結合させることができる。ヒドロキシル基は、ポア内の非荷電アミノ酸と水素結
合を形成することができる。ポアとヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列との相互作
用を助長するあらゆるアダプターを使用することができる。
好適なアダプターとしては、シクロデキストリン、環状ペプチドおよびククルビツリル
が挙げられるが、これらに限定されない。アダプターは、好ましくは、シクロデキストリ
ンまたはその誘導体である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V.,
and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088に開示されているもの
のいずれかであってもよい。アダプターは、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−
β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−
シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニ
ジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。ｇｕ７−βＣＤ中のグアニジノ
基は、ａｍ７−βＣＤ中の第１級アミンよりはるかに高いｐＫａを有し、そのためより大
きい正電荷を有する。このｇｕ７−βＣＤアダプターは、ポア内のヌクレオチドの滞留時
間を増加させるために、測定される残留電流の精度を増すために、ならびに高温および低
いデータ収集率で塩基検出率を増加させるために使用することができる。
下でより詳細に論じるように３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジ
ル（ＳＰＤＰ）架橋剤を使用する場合、アダプターは、好ましくは、ヘプタキス（６−デ
オキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロ
デキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）である。
より好適なアダプターとしては、９糖単位を含む（したがって９回対称性を有する）γ
−シクロデキストリンが挙げられる。γ−シクロデキストリンは、リンカー分子を含有す
ることがあり、または上で論じたβ−シクロデキストリンの例に使用される修飾糖単位の
すべて乃至はそれより多くを含むように修飾されることもある。
分子アダプターは、好ましくは、変異体モノマーに共有結合される。当技術分野におい
て公知の任意の方法を使用してアダプターをポアに共有結合させることができる。アダプ
ターは、通常は化学結合によって結合される。分子アダプターが、システイン結合によっ
て結合される場合、１つまたは複数のシステインが変異体に、例えばバレル内に、置換に
よって導入されているほうが好ましい。変異体モノマーは、該変異体モノマー中の１つま
たは複数のシステインへの分子アダプターの結合によって、化学的に修飾されることがあ
る。１つまたは複数のシステインは、天然に存在することがあり、すなわち、配列番号３
９０の１位および／または２１５位にあることがある。あるいは、変異体モノマーは、他
の位置に導入された１つまたは複数のシステインへの分子の結合によって、化学的に修飾
されることもある。２１５位のシステインは、分子アダプターが１位のシステインまたは
別の位置に導入されたシステインではなくその位置に結合しないことを確実にするために
、例えば置換によって除去されることがある。
システイン残基の反応性が隣接残基の修飾によって向上されることもある。例えば、隣
接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインのチオール基
のｐＫａをより反応性の高いＳ−基のｐＫａへと変化させることになる。システイン残基
の反応性がｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護されることもある。リンカーを結
合させる前に変異体モノマーの１つまたは複数のシステイン残基とこれらの保護基を反応
させることができる。分子が変異体モノマーに直接結合されることもある。分子は、好ま
しくは、化学的架橋剤またはペプチドリンカーなどのリンカーを使用して変異体分子に結
合される。
好適な化学的架橋剤は、当技術分野において周知である。好ましい架橋剤としては、３
−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−
イル、４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン酸２，５−ジオキソピロリジン
−１−イル、および８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタン酸２，５−ジオ
キソピロリジン−１−イルが挙げられる。最も好ましい架橋剤は、３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）である。通常は、分子を二官能性架橋
剤に共有結合させた後、その分子／架橋剤複合体を変異体モノマーに共有結合させるが、
二官能性架橋剤をモノマーに共有結合させた後、その二官能性架橋剤／モノマー複合体を
分子に結合させることも可能である。
リンカーは、好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）に耐性である。好適なリンカ
ーとしては、ヨードアセトアミド系およびマレイミド系リンカーが挙げられるが、これら
に限定されない。
他の実施形態では、モノマーは、ポリヌクレオチド結合タンパク質に結合されることが
ある。これによって、本発明のシークエンシング方法で使用されうるモジュラーシークエ
ンシングシステムが形成される。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、下で論じる。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、変異体モノマーに共有結合される。
当技術分野において公知の任意の方法を使用してタンパク質をモノマーに共有結合させる
ことができる。モノマーおよびタンパク質は、化学的に融合されることもあり、または遺
伝子的に融合されることもある。構築物全体を単一のポリヌクレオチド配列から発現され
る場合、モノマーおよびタンパク質を遺伝子的に融合させる。モノマーのポリヌクレオチ
ド結合タンパク質への遺伝子的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号明
細書（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）において論じられ
ている。
ポリヌクレオチド結合タンパク質がシステイン結合によって結合される場合、１つまた
は複数のシステインが置換によって変異体に導入されているほうが好ましい。１つまたは
複数のシステインは、好ましくは、相同体の中で保存が低度である（これは変異または挿
入が許容されうることを示す）ループ領域に導入される。したがって、それらの領域は、
ポリヌクレオチド結合タンパク質の結合に好適である。そのような実施形態では、２５１
位に天然に存在するシステインが除去されることがある。システイン残基の反応性は、上
記の修飾によって向上させることができる。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、変異体モノマーに直接結合されることもあり、ま
たは１つもしくは複数のリンカーを介して結合されることもある。国際出願第ＰＣＴ／Ｇ
Ｂ１０／０００１３２号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとし
て公開）に記載されているハイブリダイゼーションリンカーを使用して分子を変異体モノ
マーに結合させてもよい。あるいは、ペプチドリンカーを使用してもよい。ペプチドリン
カーは、アミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、可撓性、および親水性は、通常
は、そのペプチドリンカーがモノマーおよび分子の機能を妨げないように設計される。好
ましい可撓性リンカーは、セリンおよび／またはグリシンアミノ酸２〜２０個、例えば４
、６、８、１０または１６個のストレッチである。より好ましい可撓性リンカーとしては
、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５および（ＳＧ）８が挙
げられ、この場合のＳはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛性リンカーは、
プロリンアミノ酸２〜３０個、例えば４、６、８、１６または２４個のストレッチである
。より好ましい剛性リンカーとしては、（Ｐ）１２が挙げられ、この場合のＰはプロリン
である。
変異体モノマーは、分子アダプターおよびポリヌクレオチド結合タンパク質で化学的に
修飾されることがある。
分子（モノマーを化学的に修飾する分子）は、モノマーに直接結合されることもあり、
または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号明細書（国際公開第２０１０／００
４２７３号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号明細書（
国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）もしくは同第ＰＣＴ／Ｇ
Ｂ１０／０００１３３号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとし
て公開）に開示されているようなリンカーを介して結合されることもある。
本発明の変異体モノマーおよびポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれか
は、それらの同定または精製を支援するように、例えば、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）
、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、ｆｌａｇタグ、ＳＵＭ
Ｏタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または細胞からのそれらの分泌
を促進するためのシグナル配列の付加（ポリペプチドがそのような配列を天然に含有しな
い場合）によって、修飾されることがある。遺伝子タグを導入するための代替法は、タグ
をタンパク質上のネイティブ位置または工学的に操作された位置に化学反応させる方法で
ある。この方法の例は、タンパク質の外側の工学的に操作されたシステインにゲルシフト
試薬を反応させる方法であろう。この方法は、溶血素ヘテロオリゴマーを分離する方法と
して立証されている（Chem Biol. 1997 Jul;4(7):497-505）。
本発明の変異体モノマーおよびポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれか
は、顕現標識で標識されることがある。顕現標識は、タンパク質を検出できるようにする
いずれの好適な標識であってもよい。好適な標識としては、蛍光分子、放射性同位元素、
例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド、例え
ばビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のモノマーまたはポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれかは、合
成的に作製されることがあり、または組換え手段によって作製されることもある。例えば
、タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成されること
がある。タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように修飾され
ることもあり、またはタンパク質の安定性を増すように修飾されることもある。タンパク
質が合成手段によって産生される場合、そのようなアミノ酸を産生中に導入することがで
きる。タンパク質は、合成的産生または組み換え産生のどちらか一方の後に改変されるこ
ともある。
タンパク質は、Ｄ−アミノ酸を使用して産生されることもある。例えば、タンパク質は
、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含むことがある。これは、そのようなタンパク
質またはペプチドの産生に関する技術分野では当たり前のことである。
タンパク質は、他の非特異的修飾も、それらのタンパク質の機能に干渉しないのであれ
ば、有することができる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、そ
のような修飾をタンパク質の側鎖に施すことができる。そのような修飾としては、例えば
、アルデヒドとの反応、その後のＮａＢＨ４での還元による、アミノ酸の還元アルキル化
、アセトイミド酸メチルでのアミド化、または無水酢酸でのアシル化が挙げられる。
本発明のモノマーおよびポアを含む、本明細書に記載するタンパク質のいずれかは、当
技術分野において公知の標準的方法を使用して産生することができる。タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して誘導および複
製することができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野にお
ける標準技術を使用して細菌宿主細胞において発現させることができる。タンパク質は、
組換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイチュ発現によって細胞において産生さ
れることもある。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するための誘導性プロモー
ターを場合により有する。これらの方法は、Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。
タンパク質は、任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによるタンパク質産
生生物からの精製後、または組換え発現後、大規模に産生することができる。典型的なタ
ンパク質液体クロマトグラフィーシステムとしては、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉ
ｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ
ＨＰＬＣシステムが挙げられる。
構築物
本発明は、共有結合している２つ以上のＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、モノ
マーの少なくとも１つが本発明の変異体モノマーである、構築物も提供する。本発明の構
築物は、ポアを形成するその能力を保持する。このことは、上で論じたようにして判定す
ることができる。本発明の１つまたは複数の構築物を使用して、ポリヌクレオチドを特徴
づける、例えばシークエンシングするためのポアを形成することができる。構築物は、少
なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少
なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマーを含む
ことがある。構築物は、好ましくは２つのモノマーを含む。２つ以上のモノマーは、同じ
であることもあり、または異なることもある。
構築物中の少なくとも１つのモノマーは、本発明の変異体モノマーである。構築物中の
２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上ま
たは１０以上のモノマーが本発明の変異体モノマーであることもある。好ましくは、構築
物中のすべてのモノマーが、本発明の変異体モノマーである。変異体モノマーは、同じで
あることもあり、または異なることもある。好ましい実施形態では、構築物は、本発明の
２つの変異体モノマーを含む。
構築物中の本発明の変異体モノマーは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長
さである。構築物中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくはほぼ同じ長さであ
る、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数および／または長さの単位で測定する
ことができる。
構築物は、本発明の変異体モノマーでない１つまたは複数のモノマーを含むことがある
。本発明の非変異体モノマーでないＣｓｇＧ変異体モノマーとしては、上で論じたいずれ
のアミノ酸／位置も変異されていない配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４
、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２
、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９または配列番号３９
０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１
８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２
８もしくは４２９の比較バリアントを含むモノマーが挙げられる。構築物中の少なくとも
１つのモノマーは、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４
、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４
、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９を含むことがあり、または配列番号３
９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４
１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４
２８もしくは４２９で示される配列の比較バリアントを含むことがある。配列番号３９０
、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８
、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８
または４２９の比較バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、その全配列にわたって３
９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４
１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４
２８または４２９、４０または４１と少なくとも５０％相同である。より好ましくは、比
較バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、配列全体にわたって配列番号３９０、３９
１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１
９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または
４２９のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがあ
る。
構築物中のモノマーは、好ましくは遺伝子的に融合されている。モノマーは、構築物全
体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、遺伝子的に融合されている。構築
物をコードする単一のポリヌクレオチド配列を形成するためにモノマーのコード配列をい
かなる形で組み合わせてもよい。
モノマーは、いかなる立体配置で遺伝子的に融合されていてもよい。モノマーは、それ
らの末端アミノ酸によって融合されていることもある。例えば、１つのモノマーのアミノ
末端が別のモノマーのカルボキシ末端に融合されていることもある。構築物中の（アミノ
からカルボキシ方向に）第２のおよび後続のモノマーは、それらのアミノ末端にメチオニ
ンを含むことがある（末端の各々が前のモノマーのカルボキシ末端に融合されている）。
例えば、Ｍが（アミノ末端メチオニンを伴わない）モノマーであり、ｍＭが、アミノ末端
メチオニンを伴うモノマーである場合、構築物は、配列Ｍ−ｍＭ、Ｍ−ｍＭ−ｍＭ、また
はＭ−ｍＭ−ｍＭ−ｍＭを含むことがある。これらのメチオニンの存在は、通常は、全構
築物をコードするポリヌクレオチド中の第２のまたは後続のモノマーをコードするポリヌ
クレオチドの５’末端の開始コドン（すなわちＡＴＧ）の発現の結果として生ずる。構築
物中の（アミノからカルボキシ方向に）第１のモノマーもメチオニンを含むことがある（
例えば、ｍＭ−ｍＭ、ｍＭ−ｍＭ−ｍＭ、またはｍＭ−ｍＭ−ｍＭ−ｍＭ）。
２つ以上のモノマーが、互いに、直接、遺伝子的に融合されていることもある。モノマ
ーは、好ましくは、リンカーを使用して遺伝子的に融合されている。モノマーの移動性を
制限するようにリンカーを設計してもよい。好ましいリンカーは、アミノ酸配列（すなわ
ち、ペプチドリンカー）である。上で論じたペプチドリンカーのいずれかを使用してもよ
い。
別の好ましい実施形態では、モノマーは、化学的に融合されている。２つのモノマーは
、２つの部分が化学的に結合されている、例えば化学的架橋剤によって結合されている場
合、化学的に融合されている。上で論じた化学的架橋剤のいずれかを使用してもよい。リ
ンカーは、本発明の変異体モノマーに導入された１つまたは複数のシステイン残基に結合
されることもある。あるいは、リンカーは、構築物中のモノマーのうちの１つの末端に結
合されることもある。
構築物が様々なモノマーを含有する場合、大過剰のモノマー中のリンカーの濃度を保持
することによってモノマー同士の架橋を防止することができる。あるいは、２つのリンカ
ーが使用される「鍵と鍵穴」配置を使用してもよい。各リンカーの一方の末端のみが互い
に反応してより長いリンカーを形成することができる。そのリンカーの他方の末端は、各
々が様々なモノマーと反応する。そのようなリンカーは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／
０００１３２号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開）
に記載されている。
ポリヌクレオチド
本発明は、本発明の変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。変
異体モノマーは、上で論じたもののいずれかであってもよい。ポリヌクレオチド配列は、
ヌクレオチド同一性に基づいて、全配列にわたって配列番号３８９と少なくとも５０％、
６０％、７０％、８０％、９０％または９５％相同の配列を好ましくは含む。連続する３
００以上、例えば３７５、４５０、５２５または６００以上のヌクレオチドのストレッチ
にわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％ヌクレオ
チド同一性（「堅い相同性」）があることもある。相同性は、上で説明したように算出す
ることができる。ポリヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重に基づいて配列番号３８９
とは異なる配列を含むことがある。
本発明は、本発明の遺伝子融合構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列も
提供する。ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３８９で示される配列の２つ以上
のバリアントを含む。ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド同一性に基づいて、全配列
にわたって配列番号３８９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または
９５％の相同性を有する２つ以上の配列を好ましくは含む。連続する６００以上、例えば
７５０、９００、１０５０または１２００以上のヌクレオチドのストレッチにわたって、
少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％ヌクレオチド同一性（
「堅い相同性」）があることもある。相同性は、上で説明したように算出することができ
る。
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して誘導および複製す
ることができる。野生型ＣｓｇＧをコードする染色体ＤＮＡを大腸菌（Escherichia coli
）などのポア産生生物から抽出することができる。特異的プライマーを伴うＰＣＲを使用
して、ポアサブユニットをコードする遺伝子を増幅することもできる。その後、その増幅
された配列は定方向突然変異誘発されることがある。好適な定方向突然変異誘発方法は当
技術分野において公知であり、連鎖反応を含む、例えば併用する。本発明の構築物をコー
ドするポリヌクレオチドは、周知の技術、例えば、Sambrook, J. and Russell, D. (2001
). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Labor
atory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている技術を使用して、作製すること
ができる。
その後、その得られたポリヌクレオチド配列をクローニングベクターなどの複製可能な
組換えベクターに組み込むことができる。そのベクターを使用して、適合性宿主細胞にお
いてポリヌクレオチドを複製することができる。このように、ポリヌクレオチド配列は、
ポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入すること、適合性宿主にベクターを導入す
ること、およびベクターの複製を起こさせる条件下で宿主細胞を増殖させることによって
作製することができる。ベクターを宿主細胞から回収することができる。ポリヌクレオチ
ドのクローニングに好適な宿主細胞は当技術分野において公知であり、そのような宿主細
胞は、下でより詳細に説明する。
ポリヌクレオチド配列を好適な発現ベクターにクローニングすることができる。発現ベ
クター中のポリヌクレオチド配列は、通常は、宿主細胞によるコード配列の発現をもたら
すことができる制御配列に作動可能に連結されている。そのような発現ベクターを使用し
てポアサブユニットを発現させることができる。
用語「作動可能に連結された」は、記載する成分がそれらの所期の様式で機能すること
を可能にする関係にある、並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列
は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるようにライゲーションさ
れている。同じまたは異なるポリヌクレオチド配列の複数のコピーがベクターに導入され
ることもある。
その後、その発現ベクターを好適な宿主細胞に導入することができる。このように、本
発明の変異体モノマーまたは構築物は、ポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入する
こと、ベクターを適合性細菌宿主細胞に導入すること、およびポリヌクレオチド配列の発
現を起こさせる条件下で宿主細胞を増殖させることによって産生することができる。これ
らの組換え発現モノマーまたは構築物は、宿主細胞膜内で自己集合してポアを構築するこ
とができる。あるいは、このようにして産生された組換えポアを宿主細胞から除去し、別
の膜に挿入することができる。少なくとも２つの異なるモノマーまたは構築物を含むポア
を産生する場合、それらの異なるモノマーまたは構築物を、上記の異なる宿主細胞で別々
に発現させ、宿主細胞から除去し、別の膜、例えばウサギ細胞膜または合成膜の中でポア
に組立てることができる。
ベクターは、例えば、複製起点、場合によっては前記ポリヌクレオチド配列の発現のた
めのプロモーター、および場合によってはプロモーターの制御因子を備えている、プラス
ミド、ウイルスまたはファージベクターでありうる。ベクターは、１つまたは複数の選択
マーカー遺伝子、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子を含有することがある。プロモー
ターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞と適合するよう
に選択することができる。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターが通常
は使用される。
宿主細胞は、通常は、モノマーまたは構築物を高レベルで発現する。ポリヌクレオチド
配列で形質転換された宿主細胞は、その細胞を形質転換するために使用された発現ベクタ
ーと適合するように選択されることになる。宿主細胞は、通常は細菌細胞、好ましくは大
腸菌（Escherichia coli）細胞である。λＤＥ３溶原菌、例えば、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、Ｏｒｉｇ
ａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ Ｂを有するあらゆる細胞が、Ｔ７プロモーターを含むベク
ターを発現することができる。上に列挙した条件に加えて、Cao et al., 2014, PNAS, St
ructure of the nonameric bacterial amyloid secretion channel, doi - 1411942111お
よびGoyal et al., 2014, Nature, 516, 250-253 structural and mechanistic insights
into the bacterial amyloid secretion channel CsgGにおいて言及されている方法のい
ずれかを使用してＣｓｇＧタンパク質を発現させることができる。
本発明は、本発明の変異体モノマーまたは本発明の構築物を産生する方法も含む。この
方法は、好適な宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるステップを含む
。ポリヌクレオチドは、好ましくはベクターの一部であり、好ましくはプロモーターに作
動可能に連結されている。
ポア
本発明は、様々なポアも提供する。本発明のポアは、高い感度で異なるヌクレオチドを
識別することができるため、ポリヌクレオチド配列の特徴づけ、例えばシークエンシング
に理想的である。ポアは、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の４ヌクレオチドを驚くほど区別するこ
とができる。本発明のポアは、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを区別す
ることさえできる。本発明のポアの塩基分解能は、驚くほど高い。ポアは、４つすべての
ＤＮＡヌクレオチドのほぼ完全な分離を示す。さらに、ポアは、ポア内での滞留時間およ
びポアを通って流れる電流に基づいて、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）とメチル
−ｄＣＭＰとを識別する。
本発明のポアは、広範な条件下で異なるヌクレオチド間の識別をすることもできる。特
に、ポアは、核酸の特徴づけ、例えばシークエンシングに好都合である条件下で、ヌクレ
オチド間の識別をすることになる。本発明のポアが異なるヌクレオチド間の識別をするこ
とができる程度は、印加する電位、塩濃度、緩衝液、温度、ならびに添加剤、例えば尿素
、ベタインおよびＤＴＴ、の存在を変更することによって制御することができる。このこ
とによって、特にシークエンシングの際、ポアの機能を微調整することが可能になる。こ
のことは、下でより詳細に論じる。本発明のポアを使用して、ヌクレオチドごとにではな
く、１つまたは複数のモノマーとの相互作用からポリヌクレオチドポリマーを同定するこ
ともできる。
本発明のポアは、単離されていることもあり、実質的に単離されていることもあり、精
製されていることもあり、または実質的に精製されていることもある。本発明のポアは、
脂質または他のポアなどのいずれの他の成分も完全にない場合、単離または精製されてい
る。ポアは、その所期の使用に干渉しないであろう担体または希釈剤と混合されている場
合、実質的に単離されている。例えば、ポアは、１０％未満、５％未満、２％未満または
１％未満の他の成分、例えばトリブロックコポリマー、脂質または他のポア、を含む形態
で存在する場合、実質的に単離または実質的に精製されている。あるいは、本発明のポア
は、膜内に存在することもある。好適な膜は、下で論じる。
本発明のポアは、個別のまたは単一のポアとして存在することがある。あるいは、本発
明のポアは、２つ以上のポアの均質なまたは不均質な集団で存在することもある。
ホモオリゴマーポア
本発明は、本発明の同一の変異体モノマーを含むＣｓｇＧに由来するホモオリゴマーポ
アも提供する。ホモオリゴマーポアは、本発明の変異体のいずれかを含むことがある。本
発明のホモオリゴマーポアは、ポリヌクレオチドの特徴づけ、例えばシークエンシングに
理想的である。本発明のホモオリゴマーポアは、上で論じた利点のいずれかを有すること
ができる。
ホモオリゴマーポアは、あらゆる数の変異体モノマーを含有することがある。ポアは、
通常は、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の同一
の変異体モノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０の変異体モノマーを含む。ポア
は、好ましくは、８つまたは９つの同一の変異体モノマーを含む。１つまたは複数、例え
ば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の変異体モノマーは、
好ましくは、上で論じたように化学的に修飾される。
ポアを作製する方法は、下でより詳細に論じる。
ヘテロオリゴマーポア
本発明は、本発明の少なくとも１つの変異体モノマーを含むＣｓｇＧに由来するヘテロ
オリゴマーポアも提供する。本発明のヘテロオリゴマーポアは、ポリヌクレオチドの特徴
づけ、例えばシークエンシングに理想的である。ヘテロオリゴマーポアは、当技術分野に
おいて公知の方法（例えば、Protein Sci. 2002 Jul; 11 (7): 1813-24）を使用して作製
することができる。
ヘテロオリゴマーポアは、そのポアを形成するために十分なモノマーを含有する。それ
らのモノマーは、いかなるタイプのものであってもよい。ポアは、通常は、少なくとも７
つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、
８つ、９つまたは１０のモノマーを含む。ポアは、好ましくは、８つまたは９つのモノマ
ーを含む。
好ましい実施形態では、モノマーのすべて（例えば、モノマーのうちの１０、９、８ま
たは７つ）が本発明の変異体モノマーであり、それらのうちの少なくとも１つは、他と異
なる。より好ましい実施形態では、ポアは、本発明の８つまたは９つの変異体モノマーを
含み、それらのうちの少なくとも１つは、他と異なる。それらは、すべてが互いに異なる
こともある。
ポア中の本発明の変異体モノマーは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長さ
である。ポア中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくはほぼ同じ長さである、
または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数および／または長さの単位で測定すること
ができる。
別の好ましい実施形態では、変異体モノマーの少なくとも１つは、本発明の変異体モノ
マーではない。この実施形態での残りのモノマーは、好ましくは、本発明の変異体モノマ
ーである。したがって、ポアは、本発明の９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、
２つまたは１つの変異体モノマーを含むことがある。ポア内のいかなる数のモノマーが本
発明の変異体モノマーでなくてもよい。ポアは、好ましくは、本発明の７つまたは８つの
変異体モノマーと、本発明のモノマーでないモノマーとを含む。本発明の変異体モノマー
は、同じであることもあり、または異なることもある。
構築物中の本発明の変異体モノマーは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長
さである。構築物中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくはほぼ同じ長さであ
る、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数および／または長さの単位で測定する
ことができる。
ポアは、本発明の変異体モノマーでない１つまたは複数のモノマーを含むことがある。
本発明の変異体モノマーでないＣｓｇＧモノマーとしては、上で論じたいずれのアミノ酸
／位置も変異／置換されていない配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３
９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４
２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９または配列番号３９０、
３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、
４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８も
しくは４２９の比較バリアントを含むモノマーが挙げられる。配列番号３９０、３９１、
３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、
４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２
９の比較バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、その全配列にわたって配列番号３９
０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１
８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２
８または４２９と通常は少なくとも５０％相同である。より好ましくは、比較バリアント
は、アミノ酸同一性に基づいて、配列全体にわたって配列番号３９０、３９１、３９２、
３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、
４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９のアミ
ノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％
、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および
より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがある。
上で論じたすべての実施形態では、変異体モノマーの１つまたは複数、例えば、２つ、
３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０が、好ましくは、上で論じたよう
に化学的に修飾される。
ポアを作製する方法は、下でより詳細に論じる。
構築物含有ポア
本発明は、本発明の少なくとも１つの構築物を含むポアも提供する。本発明の構築物は
、ＣｓｇＧに由来する共有結合している２つ以上のモノマーを含み、モノマーの少なくと
も１つは本発明の変異体モノマーである。言い換えると、構築物は、１つより多くのモノ
マーを含有しなければならない。ポアは、そのポアを形成するために十分な構築物および
、必要に応じて、モノマーを含有する。例えば、オクタマーポアは、（ａ）各々が２つの
構築物を含む４つの構築物を含むこともあり、（ｂ）各々が４つのモノマーを含む２つの
構築物を含むこともあり、または（ｂ）２つのモノマーを含む１つの構築物と、構築物の
一部を形成しない６つのモノマーとを含むこともある。例えば、ナノマーポアは、（ａ）
各々が２つの構築物を含む４つの構築物と、構築物の一部を形成しない１つのモノマーと
を含むこともあり、（ｂ）各々が４つのモノマーを含む２つの構築物と、構築物の一部を
形成しないモノマーとを含むこともあり、または（ｂ）２つのモノマーを含む１つの構築
物と、構築物の一部を形成しない７つのモノマーとを含むこともある。構築物とモノマー
の他の組合せを当業者は予想することができる。
ポア中のモノマーの少なくとも２つは、本発明の構築物の形態のものである。構築物お
よびしたがってポアは、本発明の少なくとも１つの変異体モノマーを含む。ポアは、合計
で、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー
、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを通常は含む（モノマーの少なくとも
２つは、構築物中になければならない）。ポアは、好ましくは、８つまたは９つのモノマ
ーを含む（モノマーの少なくとも２つは、構築物中になければならない）。
構築物含有ポアは、ホモオリゴマーである（すなわち、同一の構築物を含む）こともあ
り、またはヘテロオリゴマー（すなわち、少なくとも１つの構築物が他と異なる場合）で
あることもある。
ポアは、通常は、（ａ）２つのモノマーを含む１つの構築物および（ｂ）５つ、６つ、
７つまたは８つのモノマーを含有する。構築物は、上で論じたもののいずれかであっても
よい。モノマーは、本発明の変異体モノマー、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３
、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１
、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９を含むモノマ
ー、および上で論じた通りの配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５
、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３
、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９の比較バリアントを含む変異体
モノマーを含む、上で論じたもののいずれかであってもよい。
別の典型的なポアは、本発明の１つより多くの構築物、例えば、本発明の２つ、３つま
たは４つの構築物を含む。必要に応じて、そのようなポアは、そのポアを形成するために
十分なさらなるモノマーまたは構築物をさらに含む。さらなるモノマーは、本発明の変異
体モノマー、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１
５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２
５、４２６、４２７、４２８または４２９を含むモノマー、および上で論じた通りの配列
番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１
７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２
７、４２８または４２９の比較バリアントを含む変異体モノマーを含む、上で論じたもの
のいずれかであってもよい。さらなる構築物は、上で論じたもののいずれであってもよく
、あるいは上で論じた配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１
４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２
４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９を含むモノマーまたは配列番号３９
０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１
８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２
８または４２９の比較バリアントを各々が含む、共有結合している２つ以上のＣｓｇＧモ
ノマーを含む構築物であってもよい。
本発明のさらなるポアは、２つのモノマーを含む構築物のみを含み、例えば、ポアは、
２つのモノマーを含む４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの構築物を含むことがある。少
なくとも１つの構築物は、本発明の構築物であり、すなわち、少なくとも１つの構築物中
の少なくとも１つのモノマー、好ましくは、少なくとも１つの構築物中の各モノマーは、
本発明の変異体モノマーである。２つのモノマーを含む構築物のすべてが本発明の構築物
であることもある。
本発明による特異的ポアは、２つのモノマーを各々が含む本発明の４つの構築物であっ
て、各構築物中の少なくとも１つのモノマー、好ましくは各構築物中の各モノマーが本発
明の変異体モノマーである、４つの構築物を含む。構築物はオリゴマー化して、各構築物
の１つだけのモノマーがポアのチャネルに寄与するような構造を有するポアにすることも
できる。通常は、構築物の他のモノマーは、ポアのチャネルの外側にあることになる。例
えば、本発明のポアは、２つのモノマーを含む７つ、８つ、９つまたは１０の構築物であ
って、チャネルが７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含む、構築物を含むことがあ
る。
上記の構築物に変異を導入することができる。変異は、交互であることもある。すなわ
ち、２つのモノマー構築物内の各モノマーの変異が異なり、構築物がホモオリゴマーとし
て組立てられ、その結果、交互修飾となる。言い換えると、ＭｕｔＡおよびＭｕｔＢを含
むモノマーが融合され、Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂポアを形成するように組立てら
れる。あるいは、変異は、隣接していることもある。すなわち、同一の変異が構築物中の
２つのモノマーに導入され、ついでこの構築物が、異なる変異体モノマーまたは構築物を
用いてオリゴマー化される。言い換えると、ＭｕｔＡを含むモノマーが融合され、その後
、ＭｕｔＢ含有モノマーを用いてＡ−Ａ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ；Ｂを形成するようにオリ
ゴマー化される。
構築物含有ポア中の本発明のモノマーの１つまたは複数が、上で論じたように化学的に
修飾されることもある。
分析物特徴づけ
本発明は、標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法を提
供する。この方法は、標的分析物とＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポア
とを、標的分析物がポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させるステ
ップ、および分析物がポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行うこ
とによって分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステップを含む
。標的分析物をテンプレート分析物または目的の分析物と呼ぶこともある。
方法は、標的分析物とＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアとを、標的
分析物がポアを通って移動するように接触させるステップを含む。ポアは、通常は、少な
くとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば
、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含む。ポアは、好ましくは、８つまたは９つ
の同一のモノマーを含む。好ましくは、１つまたは複数、例えば２、３、４、５、６、７
、８、９または１０、のモノマーが、上で論じたように化学的に修飾される。
ＣｓｇＧポアは、いずれの生物に由来してもよい。ＣｓｇＧポアは、配列番号３９０、
３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、
４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８ま
たは４２９で示される配列を含むモノマーを含むことがある。ＣｓｇＧポアは、配列番号
３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、
４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、
４２８または４２９で示される配列を各々が含む、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少
なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０の
モノマーを含むことがある（すなわち、ポアは、同じ生物からの同一のモノマーを含むホ
モオリゴマーである）。ＣｓｇＧは、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４
、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２
、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９で示される配列を各々
が含む、モノマーの任意の組合せを含むこともある。例えば、ポアは、配列番号３９０で
示される配列を含む７つのモノマーと、配列番号３９１で示される配列を含む２つのモノ
マーとを含むことがある。
ＣｓｇＧ変異体は、あらゆる数の変異体モノマー、例えば、少なくとも７つ、少なくと
も８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つま
たは１０のモノマーを含むことがある。変異体モノマーは、配列番号３９０、３９１、３
９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４
２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９
で示される配列の比較バリアントを含むこともある。比較バリアントは、上で論じている
。比較バリアントは、ポアを形成することができなければならず、本発明のポアに関して
上で論じた相同性％のいずれかを有することがある。
ＣｓｇＧ変異体は、好ましくは９つのモノマーを含み、それらのモノマーの少なくとも
１つは、配列番号３９０で示される配列のバリアントであって、（ａ）次の位置の１つも
しくは複数における変異：Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、
Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２
、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３、例え
ば、次の位置の１つもしくは複数における変異：Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４
９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｅ１３１
、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３、または次の位置
の１つもしくは複数における１つもしくは複数の変異：Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４
、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｅ１３１、Ｄ１４９、Ｔ１５
０、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３、ならびに／あるいは（ｂ）次の位置
の１つもしくは複数の欠失：Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４
、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７、を含むバリアントである。バリアントは、（ａ）を含む
こともあり、（ｂ）を含むこともあり、または（ａ）と（ｂ）を含むこともある。（ａ）
において、位置Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ
５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｒ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｄ１４９
、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３のあらゆる数および組合せが
、変異されていることがある。上で論じたように、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つま
たは複数の変異は、ポリヌクレオチドがポアを通って移動するときの電流に寄与するヌク
レオチドの数を減少させることによって、ポリヌクレオチドがポアを通って移動している
ときの観測電流とポリヌクレオチドとの直接的関連の同定をより容易にすることができる
。
（ｂ）において、Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５
、Ｆ５６およびＳ５７のあらゆる数および組合せが、欠失されていることがある。バリア
ントは、本発明の変異体モノマーに関して上で論じた特異的変異／置換またはそれらの組
合せのいずれかを含むことがある。
本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、次の置換の１つまたは複数を含む：（
ａ）Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｇ、Ｆ５６ＡまたはＦ５６Ｋまた
はＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ
、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｂ）Ｎ５５Ｑ、Ｎ５５Ｒ、Ｎ５５Ｋ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ５５Ｇ
、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｃ）Ｙ５１Ｌ、Ｙ５１Ｖ、Ｙ５１Ａ、Ｙ５１Ｎ、Ｙ５１Ｑ
、Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｄ）Ｔ１５０Ｉ、（ｅ）Ｓ５４Ｐ、および（ｆ）Ｓ５７Ｐ
。バリアントは、（ａ）〜（ｆ）のあらゆる数および組合せを含むことがある。
本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含む。
本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２またはこれら
の任意の組合せ、例えば、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、
Ｅ４４／Ｑ６２またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２における変異を含む。
バリアントは、
位置Ｙ５１、Ｆ５６、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３における変異、例
えば、Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
位置Ｎ５５における変異、例えば、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｓ、
位置Ｙ５１における変異、例えば、Ｙ５１ＮまたはＹ５１Ｔ、
位置Ｓ５４における変異、例えば、Ｓ５４Ｐ、
位置Ｓ５７における変異、例えば、Ｓ５７Ｐ、
位置Ｆ５６における変異、例えば、Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６
Ｇ、Ｆ５６ＡもしくはＦ５６ＫもしくはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５
６Ｓ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴもしくはＦ５６Ｇ、
位置Ｙ５１およびＦ５６における変異、例えば、Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１Ａお
よびＦ５６Ｎ、Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１ＴおよびＦ５
６Ａ、Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ｑ、Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ｎ、Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ｎ、も
しくはＹ５１ＴおよびＦ５６Ｎ、好ましくはＹ５１ＩおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１ＬおよびＦ
５６Ａ、もしくはＹ５１ＴおよびＦ５６Ａ、より好ましくはＹ５１ＴおよびＦ５６Ｑ、も
しくはより好ましくはＹ５１ＸおよびＦ５６Ｑ（ここでＸは任意のアミノ酸である）、
位置Ｎ５５およびＦ５６における変異、例えば、Ｎ５５ＸおよびＦ５６Ｑ（ここでＸは
任意のアミノ酸である）、
位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６における変異、例えば、Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ
５６Ａ、Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｎ、もしくはＹ５１Ｔ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６
Ｑ、
位置Ｓ５４およびＦ５６における変異、例えば、Ｓ５４ＰおよびＦ５６Ａ、もしくはＳ
５４ＰおよびＦ５６Ｎ、
位置Ｆ５６およびＳ５７における変異、例えば、Ｆ５６ＡおよびＳ５７Ｐ、もしくはＦ
５６ＮおよびＳ５７Ｐ、
位置Ｄ１４９、Ｅ１８５およびＥ２０３における変異、例えば、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５
ＮおよびＥ２０３Ｎ、
位置Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３における変異、例えば、Ｄ１４９Ｎ
、Ｅ１８５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
位置Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３における変異、例えば、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、もしくはＤ１４９
Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＲおよびＥ２０３Ｎ、
位置Ｆ５６およびＮ１０２における変異、例えば、Ｆ５６ＱおよびＮ１０２Ｒ、
（ａ）位置Ｑ６２における変異、例えば、Ｑ６２ＲもしくはＱ６２Ｋ、および（ｂ）位
置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、位置Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５
６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６もしくはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６
における変異、例えば、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、
（ｉ）位置Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２もしくはこれらの任意の組合せ、例えば、位置Ｄ４
３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２もしくはＤ４３
／Ｅ４４／Ｑ６２における変異、および（ｉｉ）位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つ
もしくは複数、例えば、位置Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６
、Ｎ５５／Ｆ５６もしくはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、例えば、Ｄ４３Ｎ／Ｙ
５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ
５６Ｑ、Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ
６２Ｒ、もしくはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、または
位置Ｔ１５０における変異、例えば、Ｔ１５０Ｉ
を含むことがある。
本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくと
も９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマ
ーを含み、モノマーの各々が、次の置換（ａ）Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ
、Ｆ５６Ｇ、Ｆ５６ＡまたはＦ５６ＫまたはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、
Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｂ）Ｎ５５Ｑ、
Ｎ５５Ｒ、Ｎ５５Ｋ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ５５Ｇ、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｃ）Ｙ５１Ｌ、
Ｙ５１Ｖ、Ｙ５１Ａ、Ｙ５１Ｎ、Ｙ５１Ｑ、Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｄ）Ｔ１５０Ｉ
、（ｅ）Ｓ５４Ｐ、および（ｆ）Ｓ５７Ｐのうちの１つまたは複数を含む、配列番号３９
０のバリアントを含む。バリアントは、（ａ）〜（ｆ）のあらゆる数および組合せを含む
ことがある。これらの好ましいポア中のモノマーは、好ましくは同一である。
本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくと
も９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマ
ーを含み、モノマーの各々が、
Figure 2021078500
 を含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
本発明で使用するためのＣｓｇＧ変異体は、好ましくは９つのモノマーを含み、それら
のモノマーの少なくとも１つは、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数に
変異を含む、配列番号３９０で示される配列のバリアントである。本発明の方法での使用
に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも
１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各
々が、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数に変異を含む、配列番号３９
０のバリアントを含む。これらの好ましいポア中のモノマーは、好ましくは同一である。
バリアントは、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ
５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含むことがある。バリアントは、上
で論じた位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数における、およびあらゆる
組合せでの、特異的変異のいずれかを含むことがある。Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１
つもしくは複数がいかなるアミノ酸で置換されていてもよい。Ｙ５１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ
、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、Ｔ
、ＮまたはＱで置換されていることがある。Ｎ５５は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ
、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、ＴまたはＱで置換されて
いることがある。Ｆ５６は、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ
、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱで置換されていることがある。バリ
アントは、以下の１つまたは複数をさらに含むことがある：（ｉ）次の位置における１つ
または複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）（ｉ）Ｎ４０
、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、
Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２；（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ；（ｉｖ）Ｋ４
９Ｒ；（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ；（ｖｉ）Ｄ１４９
Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ；（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ
；（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ；（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０
１ＱまたはＥ２０１Ｒ；（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ；ならびに（ｘ
ｉ）次の位置の１つもしくは複数の欠失：Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ
５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７。バリアントは、上で論じた（ｉ）および（
ｉｉｉ）〜（ｘｉ）の組合せのいずれかを含むことがある。バリアントは、（ｉ）および
（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）について上で論じた実施形態のいずれかを含むことがある。
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での
使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なく
とも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマー
の各々が、Ｙ５１Ｒ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｍ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｌ／
Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｖ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｐ／
Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｇ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／
Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｋ／
Ｆ５６Ｑ、またはＹ５１Ｈ／Ｆ５６Ｑを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での
使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なく
とも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマー
の各々が、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、またはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む
、配列番号３９０のバリアントを含む。
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での
使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なく
とも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマー
の各々が、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｍ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ｔ／
Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ｔ／
Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｔ／
Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ｔ／
Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｈ、またはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｒを含む、配列番号３９０のバ
リアントを含む。
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での
使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なく
とも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマー
の各々が、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ、またはＹ５１Ｔ／Ｎ５５Ａを含む
、配列番号３９０のバリアントを含む。
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での
使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なく
とも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマー
の各々が、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ａ／
Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ａ／
Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ａ／
Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ａ／
Ｆ５６Ｈ、またはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｒを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での
使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なく
とも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマー
の各々が、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｋ／
Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｈ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｓ／
Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６Ａ、またはＹ５１Ｖ／Ｆ５６Ａを含む、配列番号３９０のバ
リアントを含む。
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での
使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なく
とも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマー
の各々が、
Figure 2021078500
 を含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での
使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なく
とも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマー
の各々が、
Figure 2021078500
 を含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
これらの好ましいポア中のモノマーは、好ましくは同一である。
本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくと
も９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマ
ーを含み、モノマーの各々が、Ｆ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ
５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇを含む、配列番号３９０のバリア
ントを含む。これらの好ましいポア中のモノマーは、好ましくは同一である。
ＣｓｇＧ変異体は、本実施例において開示する配列番号３９０のバリアントのいずれか
を含むことがあり、または本実施例において開示するポアのいずれかを含むことがある。
ＣｓｇＧ変異体は、最も好ましくは本発明のポアである。
ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくは、膜を介して印加される電位を用いて行わ
れる。下でより詳細に論じるように、印加される電位によって、通常は、ポアとポリヌク
レオチド結合タンパク質との複合体が形成される結果となる。印加される電位は、電圧電
位であることがある。あるいは、印加される電位は、化学的電位であることもある。これ
についての一例は、両親媒性層を横断する塩勾配の使用である。塩勾配は、Holden et al
., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。
方法は、標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法である
。方法は、少なくとも１つの標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判
定する方法であることがある。方法は、２つ以上の標的分析物の存在、不在または１つも
しくは複数の特徴の判定に関することがある。方法は、あらゆる数の分析物、例えば、２
、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００以上の分析物の存在、不在または１
つもしくは複数の特徴の判定を含むことができる。１つまたは複数の分析物のあらゆる数
の特徴、例えば、１、２、３、４、５、１０以上の特徴を判定することができる。
標的分析物は、好ましくは、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポ
リペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素
、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物または環境汚染物質で
ある。方法は、同じタイプの２つ以上の分析物、例えば、２つ以上のタンパク質、２つ以
上のヌクレオチドまたは２つ以上の医薬品の存在、不在または１つもしくは複数の特徴の
判定に関することもある。あるいは、方法は、異なるタイプの２つ以上の分析物、例えば
、１つもしくは複数のタンパク質、１つもしくは複数のヌクレオチドおよび１つもしくは
複数の医薬品の存在、不在または１つもしくは複数の特徴の判定に関することもある。
標的分析物を細胞から分泌することができる。あるいは、標的分析物は、細胞内に存在
する分析物であることもあり、したがって、本発明を行う前に該分析物を細胞から抽出し
なければならない。
分析物は、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質
である。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在することも
あり、または天然に存在しないこともある。ポリペプチドまたはタンパク質は、合成また
は修飾アミノ酸を含有することができる。アミノ酸に対する多数の異なるタイプの修飾が
当技術分野において公知である。好適なアミノ酸およびそれらの修飾は、上記である。本
発明の目的について、標的分析物を当技術分野において利用できる任意の方法によって修
飾することができると解されたい。
タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、増殖因子または増殖調節タンパク質、例えばサ
イトカインであることができる。サイトカインは、インターロイキン、好ましくはＩＦＮ
−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２お
よびＩＬ−１３、インターフェロン、好ましくはＩＬ−γ、ならびに他のサイトカイン、
例えばＴＮＦ−αから選択することができる。タンパク質は、細菌タンパク質、真菌タン
パク質、ウイルスタンパク質または寄生虫由来タンパク質であってもよい。
標的分析物は、好ましくは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ドである。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、下で論じる。オリゴヌクレオチドは
、通常は５０以下のヌクレオチド、例えば、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下ま
たは５以下のヌクレオチドを有する、短いヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオ
チドは、脱塩基および修飾ヌクレオチドを含む、下で論じるヌクレオチドのいずれかを含
むことがある。
標的ポリヌクレオチドなどの標的分析物は、下で論じる好適な試料のいずれかの中に存
在することがある。
ポアは、通常は、下で論じるような膜内に存在する。下で論じる方法を使用して標的分
析物をその膜とカップリングすることまたはその膜に送達することができる。
下で論じる測定のいずれかを使用して、標的分析物の存在、不在または１つもしくは複
数の特徴を判定することができる。方法は、好ましくは、標的分析物とポアとを、分析物
がポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させるステップ、および分析
物がポアに対して移動しているときにポアを通過する電流を測定することによって分析物
の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステップを含む。
標的分析物は、電流が分析物に特異的な様式でポアを通って流れた場合（すなわち、ポ
アを通って流れる、分析物と関連づけられる特有の電流が検出された場合）、存在する。
分析物は、電流がヌクレオチドに特異的な様式でポアを通って流れなかった場合、不在で
ある。対照実験を分析物の存在下で行って、ポアを通って流れる電流に対するその分析物
の影響の与え方を判定することができる。
本発明を使用して、類似した構造の分析物をそれらがポアを通過する電流に与える異な
る影響に基づいて区別することができる。個々の分析物を、単一分子レベルで、それらが
ポアと相互作用するときのそれらの電流振幅から同定することができる。本発明を使用し
て、特定の分析物が試料中に存在するか否かを判定することもできる。本発明を使用して
、試料中の特定の分析物の濃度を測定することもできる。ＣｓｇＧ以外のポアを使用する
分析物特徴づけは、当技術分野において公知である。
ポリヌクレオチド特徴づけ
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴づける、例えば、ポリヌクレオチドをシークエ
ンシングする方法を提供する。ナノポアを使用してポリヌクレオチドを特徴づけるまたは
シークエンシングするための２つの主要戦略、すなわち、鎖特徴づけ／シークエンシング
およびエキソヌクレアーゼ特徴づけ／シークエンシングがある。本発明の方法は、両方の
方法に関しうる。
鎖シークエンシングの場合、ＤＮＡは、印加電位に伴ってまたは反発してナノポアを通
って移行される。二本鎖ＤＮＡに対して漸進的にまたは前進的に作用するエキソヌクレア
ーゼを、印加電位のもとで残りの一本鎖を送り込むためにポアのシス側で使用することが
でき、または逆転電位のもとでトランス側で使用することができる。同様に、二本鎖ＤＮ
Ａを巻き戻すヘリカーゼも、同じように使用することができる。ポリメラーゼも使用する
ことができる。シークエンシング用途のために印加電位に逆らって鎖移行を要する可能性
もあるが、逆転電位のもとではまたは電位のない状態ではＤＮＡが酵素によって最初に「
捕らえられる」はずである。その後、結合後に電位が切り替わると、鎖は、シスからトラ
ンスへとポアを通過し、伸長された高次構造で電流によって保持される。一本鎖ＤＮＡエ
キソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、分子モーターとして作用し
て、ポアを通って移行されたばかりの一本鎖を印加電位に反発してトランスからシスへ、
制御された段階的様式で引き戻すことができる。
一実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法は、標的配列とポアおよびヘ
リカーゼ酵素とを接触させるステップを含む。あらゆるヘリカーゼを方法において使用す
ることができる。好適なヘリカーゼは、下で論じる。ヘリカーゼは、ポアに対して２つの
モードで作用することができる。第一に、方法は、好ましくは、ヘリカーゼが印加された
電圧の結果として生ずる場に伴ってポアを通る標的配列の移動を制御するように、ヘリカ
ーゼを使用して行われる。このモードでは、ＤＮＡの５’末端が先ずポア内に捕捉され、
酵素は、標的配列が最終的に二重層のトランス側に移行するまで場に伴って標的配列をポ
アに通すように、ＤＮＡのポア内への移動を制御する。あるいは、方法は、好ましくは、
印加電圧の結果として生ずる場に反発してポアを通る標的配列の移動をヘリカーゼ酵素が
制御するように行われる。このモードでは、ＤＮＡの３’末端が先ずポア内に捕捉され、
酵素は、標的配列が最終的に二重層のシス側に押し戻されるまで印加された場に反発して
ポアから引き出されるように、ポアを通るＤＮＡの移動を制御する。
エキソヌクレアーゼシークエンシングの場合、エキソヌクレアーゼは、標的ポリヌクレ
オチドの一方の末端から個々のヌクレオチドを遊離させ、これらの個々のヌクレオチドが
下で論じるように同定される。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方
法は、標的配列とポアおよびエキソヌクレアーゼ酵素とを接触させるステップを含む。下
で論じるエキソヌクレアーゼのいずれかを方法において使用することができる。酵素を下
で論じるようにポアに共有結合させることができる。
エキソヌクレアーゼは、通常は、ポリヌクレオチドの一方の末端にしっかりつかまって
いてその配列をその末端から１ヌクレオチドずつ消化する酵素である。エキソヌクレアー
ゼは、ポリヌクレオチドを５’から３’方向にまたは３’から５’方向に消化することが
できる。エキソヌクレアーゼが結合するポリヌクレオチドの末端は、通常は、使用する酵
素の選択によっておよび／または当技術分野において公知の方法を使用して判定される。
ポリヌクレオチドのいずれかの末端でヒドロキシル基またはキャップ構造を使用して、ポ
リヌクレオチドの特定の末端とのエキソヌクレアーゼの結合を防止または助長することが
通常はできる。
方法は、ポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼと、ヌクレオチドがポリヌクレオチド
の末端から上で論じたような割合のヌクレオチドの特徴づけまたは同定を可能にする速度
で消化されるように接触させるステップを含む。これを行う方法は、当技術分野において
周知である。例えば、エドマン分解を使用してポリペプチドの末端から単一のアミノ酸を
順次消化し、その結果、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してそれらを同
定することができる。類似の方法を本発明において使用することができる。
エキソヌクレアーゼが機能する速度は、通常は野生型エキソヌクレアーゼの最適速度よ
り遅い。本発明の方法でのエキソヌクレアーゼの活性に好適な速度は、毎秒０．５〜１０
００ヌクレオチド、毎秒０．６〜５００ヌクレオチド、毎秒０．７〜２００ヌクレオチド
、毎秒０．８〜１００ヌクレオチド、毎秒０．９〜５０ヌクレオチド、または毎秒１〜２
０もしくは１０ヌクレオチドの消化を含む。この速度は、好ましくは、毎秒１、１０、１
００、５００または１０００ヌクレオチドである。エキソヌクレアーゼ活性の好適な速度
を様々な方法で達成することができる。例えば、活性の最適速度が低下されたバリアント
エキソヌクレアーゼを本発明に従って使用することができる。
鎖特徴づけ実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体
、例えば本発明のポアと、ポリヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って、移動
するように接触させるステップ、およびポリヌクレオチドがポアに対して移動していると
きに１回または複数回の測定を行い、測定がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を
示し、それによって標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップを含む。
エキソヌクレオチド特徴づけ実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポ
アまたはその変異体、例えば本発明のポア、およびエキソヌクレアーゼと、エキソヌクレ
アーゼが標的ポリヌクレオチドの一方の末端から個々のヌクレオチドを消化し、個々のヌ
クレオチドがポアに対して、例えばポアを通って移動するように、接触させるステップ、
および個々のヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を
行い、測定が個々のヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって標的ポリ
ヌクレオチドを特徴づけるステップを含む。
個々のヌクレオチドは、単一のヌクレオチドである。個々のヌクレオチドは、ヌクレオ
チド結合によって別のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと結合されていないヌクレオ
チドである。ヌクレオチド結合は、別のヌクレオチドの糖基と結合しているヌクレオチド
のリン酸基の１つを含む。個々のヌクレオチドは、通常は、少なくとも５、少なくとも１
０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくと
も５００、少なくとも１０００または少なくとも５０００ヌクレオチドの別のポリヌクレ
オチドと結合しているヌクレオチドによって結合されていないものである。例えば、個々
のヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖などの標的ポリヌクレオチド配列から消化され
たものである。ヌクレオチドは、下で論じるもののいずれかであってもよい。
個々のヌクレオチドは、あらゆる様式で、あらゆる部位で、ポアと相互作用することが
できる。ヌクレオチドは、好ましくは、上で論じたようなアダプターによってまたはその
ようなアダプターとともにポアと可逆的に結合する。ヌクレオチドは、最も好ましくは、
それらがポアを通って膜を通過しているときにアダプターによってまたはアダプターとと
もにポアと可逆的に結合する。ヌクレオチドは、それらがポアを通って膜を通過している
ときにアダプターによってまたはアダプターとともにポアのバレルまたはチャネルと可逆
的に結合することもできる。
個々のヌクレオチドとポアとの相互作用中、ヌクレオチドは、そのヌクレオチドに特異
的な様式でポアを通って流れる電流に作用するのが一般的である。例えば、特定のヌクレ
オチドは、ポアを通って流れる電流を特定の平均時間にわたって、特定の程度に低減させ
ることになる。言い換えると、ポアを通って流れる電流は、特定のヌクレオチドに特有の
ものである。対照実験を行って、特定のヌクレオチドがポアを通って流れる電流に与える
影響を判定することができる。その後、試験試料に対する本発明の方法の実施の結果を、
そのような対照実験から導出されたものと比較して、試料中の特定のヌクレオチドを同定
することができ、または特定のヌクレオチドが試料中に存在するかどうかを判定すること
ができる。ポアを通って流れる電流に特定のヌクレオチドを示す形で影響を与える周波数
を使用して、試料中のそのヌクレオチドの濃度を判定することができる。試料中の異なる
ヌクレオチドの比も算出することができる。例えば、ｄＣＭＰのメチル−ｄＣＭＰに対す
る比を算出することができる。
方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を測定するステップを含む。標
的ポリヌクレオチドをテンプレートポリヌクレオチドまたは目的のポリヌクレオチドと呼
ぶこともある。
この実施形態は、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアも使用する。標
的分析物に関して上で論じたポアおよび実施形態のいずれかを使用することができる。
ポリヌクレオチド
核酸などのポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含む高分子である。ポリヌ
クレオチドまたは核酸は、あらゆるヌクレオチドのあらゆる組合せを含むことがある。ヌ
クレオチドは、天然に存在することもあり、または人工的なものであることもある。ポリ
ヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されることもあ
る。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷されることもある。例
えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジンダイマーを含むことがある。そのようなダイマー
は、概して紫外線によって損傷され、皮膚黒色腫の主原因である。ポリヌクレオチド中の
１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾されることもある。好
適な標識は、下で説明する。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含むこ
ともある。
ヌクレオチドは、通常は、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。
核酸塩基と糖がヌクレオシドを形成する。
核酸塩基は、通常は複素環式のものである。核酸塩基としては、プリンおよびピリミジ
ン、より具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）
およびシトシン（Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
糖は、通常はペントース糖である。ヌクレオチド糖としては、リボースおよびデキスト
ロースが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、好ましくはデオキシリボースであ
る。
ポリヌクレオチドは、好ましくは次のヌクレオシドを含む：デオキシアデノシン（ｄＡ
）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（
ｄＧ）ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）。
ヌクレオチドは、通常は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。
ヌクレオチドは、通常は、一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。ヌクレオチド
は、３つより多くのリン酸、例えば、４つまたは５つのリン酸を含むこともある。リン酸
は、ヌクレオチドの５’側に結合されることもあり、または３’側に結合されることもあ
る。ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭ
Ｐ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５−メチルシチジン
一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状
アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデ
ノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミ
ジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン
一リン酸（ｄＣＭＰ）およびデオキシメチルシチジン一リン酸が挙げられるが、これらに
限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ
、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
ヌクレオチドは、脱塩基性である（すなわち、核酸塩基を欠いている）ことがある。ヌ
クレオチドは、核酸塩基および糖も欠いていることがある（すなわち、Ｃ３スペーサーで
ある）。
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、いかなる様式で互いに結合されていてもよい。
ヌクレオチドは、通常は、それらの糖およびリン酸基によって核酸の場合と同様に結合さ
れている。ヌクレオチドは、それらの核酸塩基によってピリミジンダイマーの場合のよう
に接続されていることもある。
ポリヌクレオチドは、一本鎖状であることもあり、または二本鎖状であることもある。
ポリヌクレオチドの少なくとも一部分は、好ましくは二本鎖状である。
ポリヌクレオチドは、核酸、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（Ｒ
ＮＡ）であることができる。ポリヌクレオチドは、１本のＤＮＡ鎖にハイブリダイズして
いる１本のＲＮＡ鎖を含むことができる。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）
、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、
またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの、当技術分野において公知のい
かなる合成核酸であってもよい。ＰＮＡ主鎖は、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ
−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されている。ＧＮＡ主鎖は、ホスホジエス
テル結合によって連結された反復グリコール単位で構成されている。ＴＮＡ主鎖は、ホス
ホジエステル結合によって互いに連結された反復トレオース糖で構成されている。ＬＮＡ
は、リボース部分の２’酸素と４’炭素を接続する余分な架橋を有する、上で論じたよう
なリボヌクレオチドから形成される。架橋核酸（ＢＮＡ）は、修飾ＲＮＡヌクレオチドで
ある。ＢＮＡは、束縛または隔絶ＲＮＡと呼ばれることもある。ＢＮＡモノマーは、「固
定された」Ｃ３’−ｅｎｄｏ糖パッカリングを有する５員、６員またはさらには７員の架
橋構造を含有することができる。架橋をリボースの２’，４’位に合成的に組み込んで、
２’，４’−ＢＮＡモノマーを生成する。
ポリヌクレオチドは、最も好ましくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（Ｄ
ＮＡ）である。
ポリヌクレオチドは、あらゆる長さであることができる。例えば、ポリヌクレオチドは
、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なく
とも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも
５００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対であることができる。ポリヌクレオチドは、長
さ１０００ヌクレオチドもしくはヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチドもしく
はヌクレオチド対以上、または長さ１０００００ヌクレオチドもしくはヌクレオチド対以
上であることができる。
あらゆる数のポリヌクレオチドを調査することができる。例えば、本発明の方法は、２
、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００以上のポリヌクレオチ
ドの特徴づけに関することがある。２つ以上のポリヌクレオチドを特徴づける場合、それ
らは、異なるポリヌクレオチドであることもあり、同じポリヌクレオチドの２つの実例で
あることもある。
ポリヌクレオチドは、天然に存在することもあり、または人工的なものであることもあ
る。例えば、方法を使用して、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を検証することがで
きる。方法は、通常はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
試料
ポリヌクレオチドは、通常は、あらゆる好適な試料中に存在する。本発明は、通常は、
ポリヌクレオチドを含有することが分かっているまたは含有すると推測される試料を用い
て行われる。あるいは、本発明は、試料を用いて、その試料中に存在することが分かって
いるまたは予想されるポリヌクレオチドの同一性を確認するため行われることもある。
試料は、生体試料であってもよい。本発明は、あらゆる生物または微生物から得られた
または抽出された試料を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。生物または微生
物は、通常は、古細菌性、原核性または真核性であり、通常は、五界、すなわち植物界、
動物界、菌界、原核生物界および原生生物界、の１つに属する。本発明は、あらゆるウイ
ルスから得られたまたは抽出された試料を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。
試料は、好ましくは流体試料である。試料は、通常は患者の体液を含む。試料は、尿、リ
ンパ液、唾液、粘液または羊水であってもよいが、好ましくは血液、血漿または血清であ
る。
試料は、通常は、起源がヒトであるが、代替的に、別の哺乳類動物からのもの、例えば
、商業飼育動物、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、魚、ニワトリもしくはブタからのものであ
ってもよく、または代替的にペット、例えばネコもしくはイヌであってもよい。あるいは
、試料は、植物起源のもの、例えば、商品作物、例えば、穀類、マメ科植物、果実または
野菜、例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ、イ
ネ、ダイオウ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマ
メ、サトウキビ、カカオノキ、ワタから得られた試料であってもよい。
試料は、非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは流体試料である。非生
体試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲用水、海水または河川水、および検査室
検査用の試薬が挙げられる。
試料は、通常は、本発明で使用される前に、例えば、遠心分離によって、または望まし
くない分子もしくは細胞、例えば赤血球を濾過して取り除く膜を通過させることによって
処理される。試料は、採取され次第、測定されることもある。試料がアッセイ前に、好ま
しくは−７０℃で保存されることがあることも一般的である。
特徴づけ
方法は、ポリヌクレオチドの２、３、４または５以上の特徴を測定するステップを含む
ことがある。１つまたは複数の特徴は、好ましくは、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（
ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌ
クレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択
される。｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉ
ｉ｝、｛ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｖ｝、
｛ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉ
，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｖ
，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ．ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ
ｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ
，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝または｛ｉ，ｉ
ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝などの、（ｉ）〜（ｖ）のいずれの組合せを、本発明に従って測
定してもよい。上に列挙した組合せのいずれかを含む（ｉ）〜（ｖ）の異なる組合せを、
第２のポリヌクレオチドと比較して、第１のポリヌクレオチドについて測定することがで
きる。
（ｉ）については、ポリヌクレオチドの長さを、例えば、ポリヌクレオチドとポアとの
相互作用の数、またはポリヌクレオチドとポアとの相互作用の継続時間を判定することに
よって測定することができる。
（ｉｉ）については、ポリヌクレオチドの同一性を、多数の方法で測定することができ
る。ポリヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列の測定とともに測定されるこ
ともあり、またはポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定されることもある。先に
述べた測定は容易であり、ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって同定す
る。後で述べた測定は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド
内の特定のモチーフの存在を（ポリヌクレオチドの残存配列を測定せずに）測定してもよ
い。あるいは、その方法の中で特定の電気および／または光シグナルを測定することによ
って、ポリヌクレオチドが特定の源に由来すると同定されることもある。
（ｉｉｉ）については、ポリヌクレオチドの配列を、以前に記載されたように判定する
ことができる。好適なシークエンシング方法、特に電気的測定を用いるものは、Stoddart
D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al., J Am Chem
Soc. 2010;132(50):17961-72、および国際出願国際公開第２０００／２８３１２号パン
フレットに記載されている。
（ｉｖ）については、二次構造を様々な方法で測定することができる。例えば、その方
法が電気的測定を含む場合、滞留時間の変化、またはポアを通って流れる電流の変化を使
用して、二次構造を測定してもよい。これによって、一本鎖ポリヌクレオチド領域と二本
鎖ポリヌクレオチド領域を区別することが可能になる。
（ｖ）については、あらゆる修飾の存在または不在を測定することができる。この方法
は、ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは
複数のタンパク質でまたは１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾され
ているか否かを判定することを好ましくは含む。特異的修飾は、ポアとの特異的相互作用
をもたらすことになり、下で説明する方法を用いてそのような特異的相互作用を測定する
ことができる。例えば、メチルシトシンを、各ヌクレオチドとのその相互作用中にポアを
通って、流れる電流に基づいて、シトシンと区別してもよい。
標的ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと接触さ
せる。ポアは、通常は膜内に存在する。好適な膜は、下で論じる。ポアが膜内に存在する
膜／ポア系の調査に適しているあらゆる装置を使用して方法を行うことができる。膜貫通
ポアセンシングに適しているあらゆる装置を使用して方法を行うことができる。例えば、
装置は、水溶液を含むチャンバーと、そのチャンバーを２区画に分ける遮断壁とを含む。
遮断壁は、通常は、ポアを含有する膜が形成される開口部を有する。あるいは、遮断壁は
、ポアが存在する膜を形成する。
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号明細書（国際公開２００８／１０２１２
０号パンフレット）に記載されている装置を使用して方法を行ってもよい。
様々な異なるタイプの測定を行うことができる。この測定は、限定ではないが、電気的
測定および光学的測定を含む。可能な電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測
定、トンネル効果測定（Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12; 11(1):279-85）、
およびＦＥＴ測定（国際公開出願第２００５／１２４８８８号パンフレット）が挙げられ
る。光学的測定を電気的測定と併用してもよい（Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 201
0 Jan; 81(1):014301）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通って流れるイオン
電流の測定であることもある。
Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12; 106(19):7702-7、Lieberman KR et al.
, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72、および国際出願国際公開第２０００／２８３
１２号パンフレットに記載されているような標準的単一チャネル記録機器を使用して、電
気的測定を行ってもよい。あるいは、例えば国際出願国際公開第２００９／０７７７３４
号パンフレットおよび国際出願国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットに記載
されているような多チャネルシステムを使用して、電気的測定を行ってもよい。
方法は、好ましくは、膜を介して印加される電位を用いて行われる。印加される電位は
、電圧電位であることがある。あるいは印加される電位は、化学的電位であることもある
。この方法の例は、両親媒性層などの膜を横断する塩勾配の使用である。塩勾配は、Hold
en et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。場合によ
っては、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流を使用して
、ポリヌクレオチドの配列を推定または判定する。これが鎖シークエンシングである。
方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流を測定す
るステップを含むことがある。したがって、方法で使用される装置は、電位を印加するこ
とができる電気回路であって、膜およびポアを横断する電気シグナルを測定することがで
きる電気回路も含むことがある。方法は、パッチクランプまたは電圧固定を使用して行わ
れることもある。方法は、好ましくは電圧固定の使用を含む。
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときポアを通過する電流を
測定するステップを含むことがある。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流の測定に好
適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例において開示する。方法は、通常は
、膜とポアを介して印加される電圧を用いて行われる。使用される電圧は、通常は、＋５
Ｖ〜−５Ｖ、例えば、＋４Ｖ〜−４Ｖ、＋３Ｖ〜−３Ｖ、または＋２Ｖ〜−２Ｖである。
使用される電圧は、通常は、−６００ｍＶ〜＋６００ｍＶ、または−４００ｍＶ〜＋４０
０ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００
ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択され
る下限と＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００
ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲であ
る。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、および最も好
ましくは１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲である。増加された印加電位の使用により、ポア
による異なるヌクレオチド間の識別を増すことが可能である。
方法は、通常は、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン化物塩、例えば塩化物塩、
例えばアルカリ金属塩化物塩などの、任意の電荷担体の存在下で行われる。電荷担体とし
ては、イオン性液体または有機塩、例えば塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチ
ルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウムもしくは塩化１−エチル
−３−メチルイミダゾリウムを挙げることができる。上で論じた例示的装置では、塩は、
チャンバー内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣ
ｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリ
ウムの混合物が通常は使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびフェロシアン化カリウムと
フェリシアン化カリウムの混合物が好ましい。電荷担体は、膜に対して非対称であること
がある。例えば、電荷担体のタイプおよび／または濃度が膜の両側で異なることがある。
塩濃度は、飽和時のものでありうる。塩濃度は、３Ｍ以下であることができるが、通常
は０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９
〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍで
ある。方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば、少なくとも０．４Ｍ、少なく
とも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なく
とも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍの塩
濃度を使用して行われる。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、正常電流
変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流を同定することを可能に
する。
方法は、通常は緩衝液の存在下で行われる。上で論じた例示的装置では、緩衝液は、チ
ャンバー内の水溶液中に存在する。いかなる緩衝液を本発明の方法において使用してもよ
い。通常は、緩衝液はリン酸緩衝液である。他の好適な緩衝液は、ＨＥＰＥＳおよびＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。方法は、通常は、４．０〜１２．０，４．５〜１０．０、５
．０〜９．０．５．５〜８．８、６．０〜８．７、または７．０〜８．８、または７．５
〜８．５のｐＨで行われる。使用されるｐＨは、好ましくは約７．５である。
方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃
〜８０℃、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０℃で行われることがある。方法は、通常
は室温で行われる。方法は、場合により、酵素機能を支援する温度、例えば、約３７℃で
行われる。
ポリヌクレオチド結合タンパク質
鎖特徴づけ方法は、ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と、タンパク
質がポリヌクレオチドのポアに対する、例えばポアを通る、移動を制御するように接触さ
せるステップを好ましくは含む。
より好ましくは、方法は、（ａ）ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、
例えば本発明のポア、およびポリヌクレオチド結合タンパク質と、タンパク質がポリヌク
レオチドのポアに対する、例えばポアを通る、移動を制御するように接触させるステップ
、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回
の測定を行い、測定がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによってポ
リヌクレオチドを特徴づけるステップを含む。
より好ましくは、方法は、（ａ）ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、
例えば本発明のポア、およびポリヌクレオチド結合タンパク質と、タンパク質がポリヌク
レオチドのポアに対する、例えばポアを通る、移動を制御するように接触させるステップ
、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときにポアを通る電流を
測定し、電流がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによってポリヌク
レオチドを特徴づけるステップを含む。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドと結合することおよびポアを通
るその移動を制御することができる、あらゆるタンパク質であることができる。当技術分
野ではタンパク質がポリヌクレオチドと結合するか否かを判定することは容易である。タ
ンパク質は、通常は、ポリヌクレオチドと相互作用し、ポリヌクレオチドの少なくとも１
つの特性を修飾する。タンパク質は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオチドま
たはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチド、にすることによって
、ポリヌクレオチドを修飾することがある。タンパク質は、ポリヌクレオチドを特異的位
置に配向または移動させること、すなわちその移動を制御することによって、ポリヌクレ
オチドを修飾することもある。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素
（polynucleotide handling enzyme）に由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は
、ポリヌクレオチドと相互作用してポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を修飾する
ことができるポリペプチドである。酵素は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオ
チドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチド、にすることに
よって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。酵素は、ポリヌクレオチドを特異的位
置に配向または移動させることによって、ポリヌクレオチドを修飾することもある。ポリ
ヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドに結合することができ、かつポアを
通るその移動を制御することができるのであれば、酵素活性を示す必要がない。例えば、
酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されることもあり、または酵素として作用す
ることを妨げる条件下で使用されることもある。そのような条件は、下でより詳細に論じ
る。
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは、核酸分解酵素に由来する。酵素の
構築物に使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは、酵素分類（
ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３
．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０
および３．１．３１のいずれかのメンバーに由来する。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ
１０／０００１３３号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして
公開）に開示されているもののいずれかであってもよい。
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびトポイソメラ
ーゼ、例えばジャイレースである。好適な酵素としては、大腸菌（E. coli）からのエキ
ソヌクレアーゼ（配列番号３９９）、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉ酵素（配列番号４０１）、高度好熱菌（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ（配列番号
４０３）、およびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号４０５）、Ｔ
ａｔＤエキソヌクレアーゼ、ならびにこれらのバリアントが挙げられるが、それらに限定
されない。配列番号４０３で示される配列またはそのバリアントを構成する３つのサブユ
ニットは相互作用してトリマーエキソヌクレアーゼを形成する。これらのエキソヌクレア
ーゼを本発明のエキソヌクレアーゼ方法において使用することもできる。ポリメラーゼは
、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登
録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏ
ｎ（登録商標）から市販されている）、またはそのバリアントであってもよい。酵素は、
好ましくは、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３９７）またはそのバリアント
である。トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および
５．９９．１．３のいずれかについてのメンバーである。
酵素は、最も好ましくは、ヘリカーゼ、例えば、Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ（配列番号４０
６）、Ｈｅｌ３０８ Ｃｓｙ（配列番号４０７）、Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａ（配列番号４０
８）、Ｈｅｌ３０８ Ｍｈｕ（配列番号４０９）、Ｔｒａｌ Ｅｃｏ（配列番号４１０）
、ＸＰＤ Ｍｂｕ（配列番号４１１）またはそのバリアントに由来する。いかなるヘリカ
ーゼを本発明で使用してもよい。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリ
カーゼ、例えばＴｒａｌヘリカーゼもしくはＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまた
はＤｄａヘリカーゼであることがあり、またはこれらに由来することもある。ヘリカーゼ
は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号明細書（国際公開第２０１３／０
５７４９５号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号明
細書（国際公開第２０１３／０９８５６２号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／Ｇ
Ｂ２０１２／０５３２７３号明細書（国際公開第２０１３／０９８５６１号パンフレット
として公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号明細書（国際公開第２０１４
／０１３２６０号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４
号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ
／ＧＢ２０１３／０５１９２８号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレ
ットとして公開）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号明細書に開示されて
いる、ヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたはヘリカーゼ構築物のいずれかであってもよい。
ヘリカーゼは、好ましくは、配列番号４１３（Ｔｒｗｃ Ｃｂａ）で示される配列もし
くはそのバリアント、配列番号４０６（Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ）で示される配列もしくは
そのバリアント、または配列番号４１２（Ｄｄａ）で示される配列もしくはそのバリアン
トを含む。バリアントは、膜貫通ポアについて下で論じる点のいずれかでネイティブ配列
と異なることがある。配列番号４１２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｅ９４ＣおよびＡ
３６０Ｃまたは（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｃ１０９ＡおよびＣ１３６Ａ、次いで場合
により（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわち、Ｍ１の欠失、次いで追加のＧ１およびＧ２）を含
む。
あらゆる数のヘリカーゼを本発明に従って使用することができる。例えば、１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０以上のヘリカーゼが使用されることもある。一部の実施
形態では、異なる数のヘリカーゼが使用されることもある。
本発明の方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドと２つ以上のヘリカーゼを接触させる
ステップを含む。２つ以上のヘリカーゼは、通常は同じヘリカーゼである。２つ以上のヘ
リカーゼは、異なるヘリカーゼであることもある。
２つ以上のヘリカーゼは、上で言及したヘリカーゼのいかなる組合せであってもよい。
２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであることもある。２つ以上のヘ
リカーゼは、１つまたは複数のＤｄａヘリカーゼと１つまたは複数のＴｒｗＣヘリカーゼ
であることもある。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なるバリアントである
こともある。
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに結合される。２つ以上のヘリカーゼは、
より好ましくは、互いに共有結合される。いかなる順序で、およびいかなる方法を使用し
て、ヘリカーゼを結合させてもよい。本発明での使用に好ましいヘリカーゼ構築物は、国
際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号明細書（国際公開第２０１４／０１３２
６０号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号明細書（
国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０
１３／０５１９２８号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして
公開）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号明細書に記載されている。
配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９
、４１０、４１１、４１２または４１３のバリアントは、配列番号３９７、３９９、４０
１、４０３、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２または
４１３のものとは異なるアミノ酸配列を有する酵素であって、ポリヌクレオチド結合能力
を保持する酵素である。この能力を、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測
定することができる。例えば、バリアントをポリヌクレオチドと接触させることができ、
ポリヌクレオチドと結合するおよびポリヌクレオチドに沿って移動するその能力を測定す
ることができる。バリアントは、ポリヌクレオチドの結合を助長する修飾ならびに／また
は高い塩濃度および／もしくは室温でその活性を助長する修飾を含むことがある。バリア
ントは、ポリヌクレオチドに結合する（すなわち、ポリヌクレオチド結合活性を保持する
）がヘリカーゼとして機能しない（すなわち、移動を助長するためのすべての必要成分、
例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋、が備わっているときポリヌクレオチドに沿って移動しない
）ように修飾されることもある。そのような修飾は、当技術分野において公知である。例
えば、ヘリカーゼ中のＭｇ２＋結合ドメインの修飾は、通常は、ヘリカーゼとして機能し
ないバリアントをもたらす。これらのタイプのバリアントは、分子ブレーキとして作用（
下記参照）することができる。
配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９
、４１０、４１１、４１２または４１３のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは
、好ましくは、アミノ酸同一性に基づいてその配列と少なくとも５０％相同であることに
なる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて、配列全
体にわたって配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０６、４０７、４０
８、４０９、４１０、４１１、４１２または４１３のアミノ酸配列と少なくとも５５％、
少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくと
も８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９５
％、９７％または９９％相同でありうる。連続する２００以上、例えば２３０、２５０、
２７０、２８０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０
００以上のアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５
％、９０％または９５％アミノ酸同一性（「堅い相同性」）があることもある。相同性は
、上で論じたように判定される。バリアントは、上記配列番号３９０に関して上で論じた
点のいずれかで野生型配列と異なることがある。酵素をポアに共有結合されることもある
。いかなる方法を使用して酵素をポアに共有結合させてもよい。
好ましい分子ブレーキは、ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ５９４Ａ（変異Ｑ５９４Ａを有する配
列番号４１３）である。このバリアントは、ヘリカーゼとして機能しない（すなわち、ポ
リヌクレオチドに結合するが、移動を助長するためのすべての必要な成分、例えばＡＴＰ
およびＭｇ２＋、が備わっているときにポリヌクレオチドに沿って移動しない）。
鎖シークエンシングの場合、ポリヌクレオチドは、印加電位に伴ってまたは反発してポ
アを通って移行される。二本鎖ポリヌクレオチドに対して漸進的にまたは前進的に作用す
るエキソヌクレアーゼを、印加電位のもとで残りの一本鎖を送り込むためにポアのシス側
で使用することができ、または逆転電位のもとでトランス側で使用することができる。同
様に、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも、同じように使用することができる。ポリメ
ラーゼも使用することができる。シークエンシング用途のために印加電位に逆らって鎖移
行を要する可能性もあるが、逆転電位のもとではまたは電位のない状態ではＤＮＡが酵素
によって最初に「捕らえられる」はずである。その後、結合後に電位が切り替わると、鎖
は、シスからトランスへとポアを通過し、伸長された高次構造で電流によって保持される
。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、分子モー
ターとして作用して、ポアを通って移行されたばかりの一本鎖を印加電位に反発してトラ
ンスからシスへ、制御された段階的様式で引き戻すことができる。
あらゆるヘリカーゼを方法において使用することができる。ヘリカーゼは、ポアに対し
て２つのモードで作用することができる。第一に、方法は、好ましくは、ヘリカーゼによ
ってポリヌクレオチドが印加電圧の結果として生ずる場に伴ってポアを通って移動するよ
うに、ヘリカーゼを使用して行われる。このモードでは、ポリヌクレオチドの５’末端が
先ずポア内に捕捉され、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドは、最終的に膜のトランス
側に移行するまで場に伴ってポアに通されるように、ポア内に移動する。あるいは、方法
は、好ましくは、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドが印加された電圧の結果として生
ずる場に反発してポアを通って移動するように行われる。このモードでは、ポリヌクレオ
チドの３’末端が先ずポア内に捕捉され、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドは、最終
的に膜のシス側に押し戻されるまで印加された場に反発してポアから引き出されるように
、ポアを通って移動する。
方法は、反対方向で行われることもある。ポリヌクレオチドの３’末端が先ずポア内に
捕捉されることがあり、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドは、最終的に膜のトランス
側に移行するまで場に伴ってポアを通されるようにポア内に移動することもある。
ヘリカーゼに移動を助長するために必要な成分が備わっていない場合、またはヘリカー
ゼがその移動を妨げるもしくは防止するように修飾されている場合、ヘリカーゼはポリヌ
クレオチドに結合し、印加された場によってポリヌクレオチドがポアの中に引き入れられ
たときにポリヌクレオチドの移動を遅速させるブレーキとして作用することができる。こ
の不活性モードでは、ポリヌクレオチドが３’から下って捕捉されるのか５’から下って
捕捉されるのかは問題にならず、問題になるのは、酵素がブレーキとして作用してポリヌ
クレオチドをポア内のトランス側の方に引き入れる、印加される場である。不活性モード
での場合のヘリカーゼによるポリヌクレオチドの移動制御は、漸減、スライドおよび制動
はじめとする多数の方法で説明することができる。ヘリカーゼ活性を欠いているヘリカー
ゼバリアントもこのようにして使用することができる。
ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質およびポアといかなる順番で接触
させてもよい。ポリヌクレオチドをヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質お
よびポアと接触させる場合、ポリヌクレオチドは、先ず第一に、タンパク質と複合体を形
成することが好ましい。ポアを介して電圧を印加すると、ポリヌクレオチド／タンパク質
複合体はポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用する方法におけるあらゆるステップが、通常は
、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体とポリヌクレオチド結合タンパク質の
作用を助長する酵素補因子との存在下で行われる。遊離ヌクレオチドは、上で論じた個々
のヌクレオチドのいずれかの１つまたは複数でありうる。遊離ヌクレオチドとしては、ア
デノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（Ａ
ＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三
リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジ
ン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウ
リジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）
、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン
一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン
二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン
一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン
三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リ
ン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸
（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄ
ＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤ
Ｐ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されな
い。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡ
ＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好まし
くはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、構築物が機能することを可能
にする因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオ
ンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。酵素補因子は
、最も好ましくはＭｇ２＋である。
ヘリカーゼおよび分子ブレーキ
好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキが結合された
ポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｂ）ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと接触
させ、１つまたは複数のヘリカーゼおよび分子ブレーキが一緒にされ、両方がポアに対す
る、例えばポアを通る、ポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポアにわたって電位
を印加するステップ、ならびに
（ｃ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回測定を行
い、測定がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによってポリヌクレオ
チドを特徴づけるステップ
を含む。
このタイプの方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３７号パンフレット
において詳細に論じられている。
１つまたは複数のヘリカーゼは、上で論じたもののいずれかであってもよい。１つまた
は複数の分子ブレーキは、ポリヌクレオチドと結合してそのポリヌクレオチドのポアを通
る移動を遅速させる、あらゆる化合物または分子であることができる。１つまたは複数の
分子ブレーキは、ポリヌクレオチドと結合する１つまたは複数の化合物を好ましくは含む
。１つまたは複数の化合物は、好ましくは、１つまたは複数の大環状分子である。好適な
大環状分子としては、シクロデキストリン、カリックスアレーン、環状ペプチド、クラウ
ンエーテル、ククルビツリル、ピラーアレーン、これらの誘導体またはそれら組合せが挙
げられるが、それらに限定されない。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev,
A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088に開示されて
いるもののいずれかであってもよい。この作用物質は、より好ましくは、ヘプタキス−６
−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノア
ミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−
６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。
１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、１つまたは複数の一本鎖結合タンパク
質（ＳＳＢ）である。１つまたは複数の分子ブレーキは、正味負電荷を有さないカルボキ
シ末端（Ｃ末端）領域を含む一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、または（ｉｉ）そのＣ末
端領域にそのＣ末端領域の正味負電荷を減少させる１つもしくは複数の修飾を含む修飾Ｓ
ＳＢである。１つまたは複数の分子ブレーキは、最も好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／Ｇ
Ｂ２０１３／０５１９２４号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレット
として公開）に開示されているＳＳＢの１つである。
１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、１つまたは複数のポリヌクレオチド結
合タンパク質である。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドと結合する
ことおよびポアを通るその移動を制御することができる、あらゆるタンパク質であること
ができる。当技術分野ではタンパク質がポリヌクレオチドと結合するか否かを判定するこ
とは容易である。タンパク質は、通常は、ポリヌクレオチドと相互作用し、ポリヌクレオ
チドの少なくとも１つの特性を修飾する。タンパク質は、ポリヌクレオチドを切断して個
々のヌクレオチドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチド、
にすることによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。その部分は、ポリヌクレ
オチドを特定の位置に配向または移動させること、すなわち、その移動を制御することに
よって修飾することもある。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素
に由来する。１つまたは複数の分子ブレーキは、上で論じたポリヌクレオチドハンドリン
グ酵素のいずれかに由来するものであってもよい。分子ブレーキとして作用するＰｈｉ２
９ポリメラーゼ（配列番号３９６）の修飾バージョンは、米国特許第５，５７６，２０４
号明細書に開示されている。１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくはヘリカーゼに
由来する。
ヘリカーゼに由来するあらゆる数の分子ブレーキを使用することができる。例えば、１
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヘリカーゼが、分子ブレーキとして使用
されることがある。２つ以上のヘリカーゼが分子ブレーキとして使用される場合、その２
つ以上のヘリカーゼは、通常は同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、異なる
ヘリカーゼであることもある。
２つ以上のヘリカーゼは、上で言及したヘリカーゼのいかなる組合せであってもよい。
２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであることがある。２つ以上のヘ
リカーゼは、１つまたは複数のＤｄａヘリカーゼと１つまたは複数のＴｒｗＣヘリカーゼ
であることもある。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なるバリアントである
こともある。
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに結合される。２つ以上のヘリカーゼは、
より好ましくは、互いに共有結合される。いかなる順序で、いかなる方法を使用して、ヘ
リカーゼを結合させてもよい。ヘリカーゼに由来する１つまたは複数の分子ブレーキは、
少なくとも１つの配座状態でポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離することができるポ
リヌクレオチド結合ドメイン内の開口のサイズを低減させるように、好ましくは修飾され
る。これは、国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットに開示されている。
本発明での使用に好ましいヘリカーゼ構築物は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０
５１９２５号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開）、
同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９
号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号明細書（国際
公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０
１４／０５２７３６号明細書に記載されている。
１つまたは複数のヘリカーゼが活性モードで使用される場合（すなわち、１つまたは複
数のヘリカーゼに移動を助長するためのすべての必要成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋
が備わっているとき）、１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、（ａ）不活性モ
ードで使用される（すなわち、移動を助長するための必要成分の不在下で使用される、も
しくは能動移動ができない）、（ｂ）その１つもしくは複数の分子ブレーキが１つもしく
は複数のヘリカーゼとは反対方向に移動する活性モードで使用される、または（ｃ）その
１つもしくは複数の分子ブレーキが１つもしくは複数のヘリカーゼと同じ方向に、１つも
しくは複数のヘリカーゼより遅く移動する活性モードで使用される。
１つまたは複数のヘリカーゼが不活性モードで使用される場合（すなわち、１つまたは
複数のヘリカーゼに移動を助長するためのすべての必要成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２
＋が備わっていないとき、もしくは能動移動ができない）、１つまたは複数の分子ブレー
キは、好ましくは、（ａ）不活性モードで使用される（すなわち、移動を助長するための
必要成分の不在下で使用される、もしくは能動移動ができない）、または（ｂ）その１つ
もしくは複数の分子ブレーキがポリヌクレオチドに沿って、ポリヌクレオチドと同じ方向
にポアを通って移動する、活性モードで使用される。
１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキを、ポリヌクレオチ
ドのいかなる位置に結合させてもよく、その結果、それらは一緒になり、両方がポリヌク
レオチドのポアを通る移動を制御する。１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複
数の分子ブレーキは、少なくとも１ヌクレオチド離れており、例えば、少なくとも５、少
なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０
００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００ヌクレオ
チド以上離れている。方法が、一方の末端にＹアダプターおよび他方の末端にヘアピンル
ープアダプターが備わっている二本鎖ポリヌクレオチドの特徴づけに関する場合、好まし
くはＹアダプターに１つまたは複数のヘリカーゼが結合され、好ましくはヘアピンループ
アダプターに１つまたは複数の分子ブレーキが結合される。この実施形態では、１つまた
は複数の分子ブレーキは、好ましくは、ポリヌクレオチドに結合するがヘリカーゼとして
機能しないように修飾されている１つまたは複数のヘリカーゼである。Ｙアダプターに結
合された１つまたは複数のヘリカーゼは、好ましくは、下でより詳細に論じるようにスペ
ーサーで停止される。ヘアピンループアダプターに結合された１つまたは複数の分子ブレ
ーキは、好ましくはスペーサーで停止されない。１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つ
または複数の分子ブレーキは、好ましくは、１つまたは複数のヘリカーゼがヘアピンルー
プに達したとき一緒になる。１つまたは複数のヘリカーゼは、Ｙアダプターをポリヌクレ
オチドに結合させる前にＹアダプターに結合させてもよく、またはＹアダプターをポリヌ
クレオチドに結合させた後にＹアダプターに結合させてもよい。１つまたは複数の分子ブ
レーキは、ヘアピンループアダプターをポリヌクレオチドに結合させる前にヘアピンルー
プアダプターに結合させてもよく、またはヘアピンループアダプターをポリヌクレオチド
に結合させた後にヘアピンループアダプターに結合させてもよい。
１つまたは複数のヘリカーゼと１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、互いに
結合されない。１つまたは複数のヘリカーゼと１つまたは複数の分子ブレーキは、より好
ましくは、互いに共有結合されない。１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数
の分子ブレーキは、好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号明細
書（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ
２０１３／０５１９２４号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットと
して公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号明細書（国際公開第２０１４／
０１３２６２号パンフレットとして公開）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３
６号明細書に記載されているように結合されない。
スペーサー
１つまたは複数のヘリカーゼを、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５０１７５号パ
ンフレットにおいて論じられているように１つまたは複数のスペーサーで停止させてもよ
い。国際出願に開示されている１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数のスペ
ーサーのいずれの立体配置を本発明において使用してもよい。
ポリヌクレオチドの一部がポアに侵入し、印加された電位の結果として生じる場に沿っ
てポアを通って移動する場合、１つまたは複数のヘリカーゼは、ポリヌクレオチドがポア
を通って移動するとそのポアによってスペーサーを超えて移動する。これは、（１つまた
は複数のスペーサーを含む）ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、１つまたは複数の
ヘリカーゼがそのポアの上部に残存するためである。
１つまたは複数のスペーサーは、好ましくはポリヌクレオチドの一部であり、例えば、
スペーサーはポリヌクレオチド配列に割り込んでいる。１つまたは複数のスペーサーは、
好ましくは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた１つまたは複数の遮断分子、例え
ばスピードバンプ、の一部ではない。
ポリヌクレオチド内にあらゆる数のスペーサーがあることがあり、例えば、１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０以上のスペーサーがあることがある。好ましくは、ポリ
ヌクレオチド内に２つ、４つまたは６つのスペーサーがある。ポリヌクレオチドの異なる
領域内に１つまたは複数のスペーサーがあることもあり、例えば、Ｙアダプターおよび／
またはヘアピンループアダプター内に１つまたは複数のスペーサーがあることもある。
１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼが活性モードであっても
克服することができないエネルギー障壁を、各々がもたらす。１つまたは複数のスペーサ
ーは、（例えばポリヌクレオチド中のヌクレオチドから塩基を除去することにより）ヘリ
カーゼの牽引力を低減させることによって、または（例えば嵩高い化学基を使用して）１
つもしくは複数のヘリカーゼの移動を物理的に遮断することによって、１つまたは複数の
ヘリカーゼを停止させることができる。
１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼを停止させるあらゆる分
子または分子の組合せを含むことができる。１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは
複数のヘリカーゼがポリヌクレオチドに沿って移動しないように防止する、あらゆる分子
または分子の組合せを含むことができる。１つまたは複数のヘリカーゼが、膜貫通ポアお
よび印加電位の不在下で１つまたは複数のスペーサーで停止されるか否かを判定すること
は容易である。例えば、スペーサーを超えて移動し、ＤＮＡの相補鎖を置換するヘリカー
ゼの能力を、ＰＡＧＥによって測定することができる。
１つまたは複数のスペーサーは、通常は、ポリマーなどの直鎖状分子を含む。１つまた
は複数のスペーサーは、通常は、ポリヌクレオチドとは異なる構造を有する。例えば、ポ
リヌクレオチドがＤＮＡである場合、１つまたは複数のスペーサーは通常はＤＮＡではな
い。詳細には、ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮ
Ａ）である場合、１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）
、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、
またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含む。１つまたは複数のスペーサーは、
１つまたは複数のヌクレオチドをポリヌクレオチドと反対方向で含むことがある。例えば
、ポリヌクレオチドが５’から３’への方向である場合、１つまたは複数のスペーサーは
、１つまたは複数のヌクレオチドを３’から５’への方向で含むことがある。ヌクレオチ
ドは、上で論じたもののいずれかであってもよい。
１つまたは複数のスペーサーは、１つもしくは複数のニトロインドール、例えば１つも
しくは複数の５−ニトロインドール、１つもしくは複数のイノシン、１つもしくは複数の
アクリジン、１つもしくは複数の２−アミノプリン、１つもしくは複数の２，６−ジアミ
ノプリン、１つもしくは複数の５−ブロモ−デオキシウリジン、１つもしくは複数の逆位
チミジン（逆位ｄＴ）、１つもしくは複数の逆位ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、１つも
しくは複数のジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、１つもしくは複数の５−メチルシチジン、
１つもしくは複数の５−ヒドロキシメチルシチジン、１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチ
ルＲＮＡ塩基、１つもしくは複数のイソデオキシシチジン（イソｄＣ）、１つもしくは複
数のイソデオキシグアノシン（イソｄＧ）、１つもしくは複数のｉＳｐＣ３基（すなわち
、糖および塩基を欠いているヌクレオチド）、１つもしくは複数の光切断性（ＰＣ）基、
１つもしくは複数のヘキサンジオール基、１つもしくは複数のスペーサー９（ｉＳｐ９）
基、１つもしくは複数のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマーまたは１つもしくは
複数のチオール結合を好ましくは含む。１つまたは複数のスペーサーは、これらの基のあ
らゆる組合せを含むことがある。これらの基の多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇ
ｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から市販されている。
１つまたは複数のスペーサーは、あらゆる数のこれらの基を含有することがある。例え
ば、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、逆位
ｄＴ、ｄｄＴ、ｄｄＣ、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、２’−Ｏ
−メチルＲＮＡ塩基、イソｄＣ、イソｄＧ、ｉＳｐＣ３基、ＰＣ基、ヘキサンジオール基
およびチオール結合については、１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上含む。１つまたは複数のスペーサーは、
好ましくは、２、３、４、５、６、７、８以上のｉＳｐ９基を含む。１つまたは複数のス
ペーサーは、好ましくは、２、３、４、５または６以上のｉＳｐ１８基を含む。最も好ま
しいスペーサーは、４つのｉＳｐ１８基である。
ポリマーは、好ましくは、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であ
る。ポリペプチドは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
以上のアミノ酸を含む。ＰＥＧは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２以上のモノマーユニットを含む。
１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、１つまたは複数の脱塩基ヌクレオチド（
すなわち、核酸塩基を欠いているヌクレオチド）、例えば、２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、１１、１２以上の脱塩基ヌクレオチドを含む。核酸塩基は、脱塩基ヌクレオ
チドでは、−Ｈ（ｉｄＳｐ）または−ＯＨによって置換されていることがある。１つまた
は複数の隣接ヌクレオチドから核酸塩基を除去することによって、脱塩基スペーサーをポ
リヌクレオチドに挿入することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、３−メチルアデ
ニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニンイノシンまたはヒポキサンチンを
含むように修飾されることがあり、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラ
ーゼ（ｈＡＡＧ）を使用してこれらのヌクレオチドから除去されることがある。あるいは
、ポリヌクレオチドは、ウラシルを含むように修飾されることがあり、核酸塩基は、ウラ
シル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で除去されることもがる。一実施形態では、１つ
または複数のスペーサーは、いかなる脱塩基ヌクレオチドも含まない。
１つまたは複数のヘリカーゼは、各々の直鎖状分子スペーサーによって（すなわちそれ
らの前で）停止されることもあり、または各々の直鎖状分子スペーサーで停止されること
もある。直鎖状分子スペーサーが使用される場合、ポリヌクレオチドには、１つまたは複
数のヘリカーゼが超えて移動することになる各スペーサーの末端に隣接してポリヌクレオ
チドの二本鎖領域が好ましくは備えられている。この二本鎖領域は、通常は、隣接スペー
サーで１つまたは複数のヘリカーゼを停止させるのに役立つ。二本鎖領域の存在は、方法
が約１００ｍＭ以下の塩濃度で行われる場合、特に好ましい。各二本鎖領域は、通常は、
長さ少なくとも１０、例えば少なくとも１２ヌクレオチドである。本発明において使用さ
れるポリヌクレオチドが一本鎖状である場合、二本鎖領域は、より短いポリヌクレオチド
をスペーサーに隣接する領域にハイブリダイズすることによって形成することができる。
このより短いポリヌクレオチドは、通常は、ポリヌクレオチドと同じヌクレオチドから形
成されるが、異なるヌクレオチドから形成されることもある。例えば、より短いポリヌク
レオチドは、ＬＮＡから形成されることがある。
直鎖状分子スペーサーが使用される場合、ポリヌクレオチドには、好ましくは、１つま
たは複数のヘリカーゼが超えて移動することになる末端とは反対側の各スペーサーの末端
に遮断分子が備えられている。この遮断分子は、１つまたは複数のヘリカーゼが各スペー
サーで停止した状態を確実に維持するのに役立つことができる。その遮断分子は、１つま
たは複数のヘリカーゼを、該ヘリカーゼが溶液に拡散する場合、ポリヌクレオチド上に保
持するのにも役立つことができる。遮断分子は、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に
停止させる、下で論じる化学基のいずれかであることができる。遮断分子は、ポリヌクレ
オチドの二本鎖領域であることもある。
１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる１
つまたは複数の化学基を好ましくは含む。１つまたは複数の化学基は、好ましくは、１つ
または複数のペンダント化学基である。１つまたは複数の化学基は、ポリヌクレオチド中
の１つまたは複数の核酸塩基に結合されていることもある。１つまたは複数の化学基は、
ポリヌクレオチド主鎖に結合されていることもある。２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２以上などのあらゆる数の化学基が存在することがある。好適な基として
は、フルオロフォア、ストレプトアビジンおよび／またはビオチン、コレステロール、メ
チレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニンおよび／または抗ジゴキ
シゲニンならびにジベンジルシクロオクチン基が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチド中の異なるスペーサーは、異なる停止分子を含むことがある。例えば
、あるスペーサーは、上で論じた直鎖状分子の１つを含むことがあり、別のスペーサーは
、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる１つまたは複数の化学基を含むこと
がある。スペーサーは、上で論じた直鎖状分子のいずれか、ならびに１つまたは複数のヘ
リカーゼを物理的に停止させる１つまたは複数の化学基、例えば１つ以上の脱塩基および
フルオロフォアを含むことがある。
ポリヌクレオチドのタイプおよび本発明の方法が行われる条件に依存して、好適なスペ
ーサーを設計することができる。大部分のヘリカーゼは、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡに沿っ
て移動するため、ＤＮＡではない何かを使用してそれらを停止させることができる。好適
な分子は、上で論じている。
本発明の方法は、好ましくは、遊離ヌクレオチドの存在下、および／またはヘリカーゼ
補因子の存在下で行われる。このことは、下でより詳細に論じる。膜貫通ポアおよび印加
電位の不在下では、１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、遊離ヌクレオチドの存
在下および／またはヘリカーゼ補因子の存在下で１つまたは複数のヘリカーゼを停止させ
ることができる。
本発明の方法が、遊離ヌクレオチドおよび（１つまたは複数のヘリカーゼが活性モード
であるように）下で論じるようなヘリカーゼ補因子の存在下で行われる場合、通常は、１
つまたは複数のより長いスペーサーを使用して、１つまたは複数のヘリカーゼをポリヌク
レオチド上で確実に停止させた後、それらを膜貫通ポアと接触させ、電位を印加する。遊
離ヌクレオチドおよび（１つまたは複数のヘリカーゼが不活性モードであるように）ヘリ
カーゼの不在下では、１つまたは複数のより短いスペーサーを使用することができる。
塩濃度も、１つまたは複数のヘリカーゼを停止させる１つまたは複数のスペーサーの能
力に影響を及ぼす。膜貫通ポアおよび印加電位の不在下では、１つまたは複数のスペーサ
ーは、好ましくは、約１００ｍＭ以下の塩濃度で１つまたは複数のヘリカーゼを停止させ
ることができる。本発明の方法で使用される塩濃度が高いほど、概して使用される１つま
たは複数のスペーサーは短く、逆もまた同様である。
特徴の好ましい組合せを下の表３に示す。
Figure 2021078500
方法は、２つ以上のヘリカーゼをスペーサーを超えて移動させることに関することもあ
る。そのような場合、スペーサーの長さを通常は増加させて、ポアおよび印加電位の不在
下で後従ヘリカーゼがスペーサーを超えて先導ヘリカーゼを押さないようにする。方法が
、１つまたは複数のスペーサーを超えて２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関する
場合、上で論じたスペーサー長は、少なくとも１．５倍、例えば２倍、２．５倍または３
倍増加されることがある。例えば、方法が、１つまたは複数のスペーサーを超えて２つ以
上のヘリカーゼを移動させることに関する場合、上の表３の第３列におけるスペーサー長
は、１．５倍、２倍、２．５倍または３倍増加されることがある。
膜
本発明のポアは、膜内に存在することがある。本発明の方法では、ポリヌクレオチドを
膜内のＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと通常は接触させる。あらゆ
る膜を本発明に従って使用することができる。好適な膜は、当技術分野において周知であ
る。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、親水性部分と親油性部分両方を
有する両親媒性分子、例えばリン脂質、から形成される層である。両親媒性分子は、合成
のものであることもあり、または天然に存在することもある。天然に存在しない両親媒性
物質、および単層を形成する両親媒性物質は、当技術分野において周知であり、例えば、
ブロックコポリマーを含む（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450
）。ブロックコポリマーは、２つ以上のモノマーサブユニットが互いに重合して単一ポリ
マー鎖を生成する高分子材料である。ブロックコポリマーは、通常は、各モノマーサブユ
ニットが一因となる特性を有する。しかし、ブロックコポリマーは、個々のサブユニット
から形成されたポリマーが有さない固有の特性を有することもある。ブロックコポリマー
は、モノマーサブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）であるが他のサブユニット
は水性媒体中にあるとき親水性であるように、工学的に操作することができる。この場合
、ブロックコポリマーは、両親媒特性を有することおよび生体膜を模倣する構造を形成す
ることができる。ブロックコポリマーは、（２つのモノマーサブユニットからなる）ジブ
ロックであることがあるが、両親媒性物質として挙動する、より複雑な配置を形成するよ
うに、２つより多くのモノマーサブユニットから構築されることもある。コポリマーは、
トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロックコポリマーであることがある。膜は
、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
古細菌双極性テトラエーテル脂質は、脂質が単層膜を形成するように構築される、天然
に存在する脂質である。これらの脂質は、厳しい生物環境で生き残る好極限性細菌、好熱
菌、好塩菌および好酸菌において一般に見出される。それらの安定性は、最終二重層の融
合された性質に由来すると考えられている。親水性−疎水性−親水性の一般モチーフを有
するトリブロックポリマーを生成することによってこれらの生物学的エンティティーを模
倣するブロックコポリマー材料を構築することは容易である。この材料は、脂質二重層と
同様に挙動し、かつ小胞から層状の膜までの範囲の相挙動を包含する、モノマー膜を形成
することができる。これらのトリブロックコポリマーから形成される膜は、生体脂質膜に
勝るいくつかの利点を保持する。トリブロックコポリマーを合成するので、まさにその構
築を注意深く制御して、膜を形成するためにならびにポアおよび他のタンパク質と相互作
用するために必要な正確な鎖長および特性を得ることができる。
ブロックコポリマーは、脂質複素材として分類されないサブユニットから構築されるこ
ともある。例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから
製造されることもある。ブロックコポリマーの親水性小部分は、低いタンパク質結合特性
を有することもでき、この低いタンパク質結合特性によって、未加工の生体試料に曝露さ
れたときに高度に耐性である膜の生成が可能になる。このヘッド基ユニットは、非古典的
脂質ヘッド基に由来することもある。
トリブロックコポリマー膜は、生体脂質膜と比較して増加された機械的および環境安定
性、例えば、より高い動作温度またはｐＨ範囲も有する。ブロックコポリマーの合成性は
、ポリマーに基づく膜を広範な用途に合わせてカスタマイズするためのプラットホームを
もたらす。
膜は、最も好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６６号または同第
ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７号パンフレットに開示されている膜の１つである。
両親媒性分子は、ポリヌクレオチドのカップリングを助長するように化学的に修飾され
るまたは官能化されることがある。
両親媒性層は、単層であることもあり、または二重層であることもある。両親媒性層は
、通常は平面状である。両親媒性層は、湾曲していることもある。両親媒性層は、支持さ
れていることもある。
両親媒性膜は、通常は自然移動性であり、本質的に二次元流体としておおよそ１０８ｃ
ｍ・ｓ−１の脂質拡散速度で作用する。これは、ポアおよびカップリングされたポリヌク
レオチドが通常は両親媒性膜内で移動することができることを意味する。
膜は、脂質二重層であることがある。脂質二重層は、細胞膜のモデルであり、ある範囲
の実験研究用の優れたプラットホームとして役立つ。例えば、脂質二重層を単一チャネル
記録による膜タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に使用することができる。あるいは、脂
質二重層をバイオセンサーとして使用して、ある範囲の物質の存在を検出することができ
る。脂質二重層は、あらゆる脂質二重層であることができる。好適な脂質二重層としては
、平面状脂質二重層、支持二重層またはリポソームが挙げられるが、これらに限定されな
い。脂質二重層は、好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願
第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号明細書（国際公開２００８／１０２１２１号パンフ
レットとして公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号明細書（国際公開第
２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０
０６／００１０５７号明細書（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして
公開）に開示されている。
脂質二重層を形成する方法は、当技術分野において公知である。脂質二重層は、脂質単
層が水溶液／空気界面に、その界面に対して垂直である開口部の両側を超えて担持される
、モンタル（Montal）およびミューラー（Mueller）の方法（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 1972; 69: 3561-3566）によって、一般に形成される。通常、脂質を電解質水溶液の
表面に、先ず脂質を有機溶媒に溶解し、次いで溶媒の液滴を開口部の両側の水性溶液の表
面で蒸発させることによって、加える。有機溶媒を蒸発させたら、二重層が形成されるま
で、開口部の両側の溶液／空気界面を開口部を超えて物理的に上下に移動させる。平面状
脂質二重層は、膜の開口部を横断して形成されることもあり、または開口を横断して凹所
の中に形成されることもある。
モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入に適している良質脂質二重層
を形成する対費用効果の高い比較的容易な方法であるため、評判がよい。他の一般的な二
重層形成方法としては、先端部浸漬、二重層の塗装、および脂質二重層のパッチクランプ
が挙げられる。
先端部浸漬二重層形成は、脂質の単層を担持している試験溶液の表面に開口部表面（例
えばピペット先端部）を触れさせることを必要とする。この場合もやはり、有機溶媒に溶
解された脂質の液滴を溶液表面で蒸発させることによって先ず脂質単層が溶液／空気界面
で生成される。次いで、二重層がラングミュア（Langumur）・シェーファー（Schaefer）
法によって形成され、溶液表面に対して開口部を移動させる機械的自動化を必要とする。
塗装される二重層については、有機溶媒に溶解された脂質の液滴が開口部に直接塗布さ
れ、その開口部が試験水溶液に沈められる。脂質溶液は、塗装用刷毛または同等物を使用
して開口部全面に薄く塗られる。溶媒が薄くなることで、脂質二重層が形成される結果と
なる。しかし、二重層からの溶媒の完全除去は困難であり、したがって、この方法によっ
て形成される二重層は、安定性がより低く、電気化学的測定中にノイズをより生じやすい
。
パッチクランプは、生体細胞膜の研究に一般に使用される。細胞膜が吸引によってピペ
ットの末端部にクランプされ、膜のパッチがその開口部全体に付着される。この方法は、
リポソームをクランプする（その後、リポソームが破裂してピペットの開口部全面を封止
する脂質二重層を残す）ことによる脂質二重層の生成に適している。この方法は、安定し
た巨大な単層状のリポソームと、ガラス表面を有する材料への小開口部の作製とを必要と
する。
リポソームは、超音波処理、抽出またはモザファリ（Mozafari）法（Colas et al., (2
007) Micron 38:841-847）によって形成することができる。
好ましい実施形態において、脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２
７号明細書（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）に記載され
ているように形成される。有利には、この方法では脂質二重層が乾燥脂質から形成される
。最も好ましい実施形態では、脂質二重層は、国際公開第２００９／０７７７３４号パン
フレット（ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７）に記載されているように開口を横断して形
成される。
脂質二重層は、２つの対向する脂質層から形成される。２つの脂質層は、それらの疎水
性テール基が互いに向き合って疎水性の内部を形成するように配置される。脂質の親水性
ヘッド基は、その二重層の両側の水性環境に向かって外側に向いている。二重層は、これ
らに限定されるものではないが脂質無秩序相（流体層状）、液体無秩序相、固体無秩序相
（層状ゲル相、インターデジティテッドゲル相）および平面状二重層結晶（層状サブゲル
相、層状結晶相）を含む、多数の脂質相に存在することがある。
脂質二重層を形成するあらゆる脂質組成物を使用することができる。脂質組成物は、必
要な特性、例えば、表面電荷、膜タンパク質を支持する能力、充填密度または機械的特性
を有する脂質二重層が形成されるように選択される。脂質組成物は、１つまたは複数の異
なる脂質を含むことができる。例えば、脂質組成物は、１００以下の脂質を含有すること
ができる。脂質組成物は、好ましくは、１〜１０の脂質を含有する。脂質組成物は、天然
に存在する脂質および／または人工脂質を含むことがある。
脂質は、通常は、ヘッド基と、界面部分と、同じであってもまたは異なってもよい２つ
の疎水性テール基とを含む。好適なヘッド基としては、中性ヘッド基、例えばジアシルグ
リセリド（ＤＧ）およびセラミド（ＣＭ）、双性イオン性ヘッド基、例えばホスファチジ
ルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびスフィンゴミエリン
（ＳＭ）、負電荷を有するヘッド基、例えばホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホス
ファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リン酸（ＰＡ）およ
びカルジオリピン（ＣＡ）、ならびに正電荷を有するヘッド基、例えばトリメチルアンモ
ニウム−プロパン（ＴＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。好適な界面部分と
しては、天然に存在する界面部分、例えば、グリセロール系またはセラミド系部分が挙げ
られるが、これらに限定されない。好適な疎水性テール基としては、飽和炭化水素鎖、例
えばラウリン酸（ｎ−ドデカン酸）、ミリスチン酸（ｎ−テトラデカン酸）、パルミチン
酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン酸）およびアラキドン酸（
ｎ−エイコサン酸）、不飽和炭化水素鎖、例えばオレイン酸（シス−９−オクタデカン酸
）、ならびに分岐炭化水素鎖、例えばフィタノイルが挙げられるが、これらに限定されな
い。不飽和炭化水素鎖の鎖長ならびに不飽和炭化水素鎖中の二重結合の位置および数は、
様々でありうる。分岐炭化水素鎖の鎖長ならびに分岐炭化水素鎖中のメチル基などの分枝
の位置および数は、様々でありうる。疎水性テール基を界面部分にエーテルまたはエステ
ルとして連結することができる。脂質は、ミコール酸であってもよい。
脂質を化学的に修飾することもできる。脂質のヘッド基またはテール基は、化学的に修
飾されることがある。ヘッド基が化学的に修飾されている好適な脂質としては、ＰＥＧ修
飾脂質、例えば１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−
［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、官能化ＰＥＧ脂質、例えば１，２
−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（
ポリエチレングリコール）２０００］、ならびに結合用に修飾された脂質、例えば１，２
−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）およ
び１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオ
チニル）が挙げられるが、これらに限定されない。テール基が化学的に修飾されている好
適な脂質としては、重合性脂質、例えば１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル
）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、フッ素化脂質、例えば１−パルミトイル−２−
（１６−フルオロパルミトイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、変性脂質、例え
ば１，２−ジパルミトイル−Ｄ６２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ならびにエー
テル連結脂質、例えば１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
が挙げられるが、これらに限定されない。脂質は、ポリヌクレオチドのカップリングを助
長するように化学的に修飾されるまたは官能化されることもある。
両親媒性層、例えば脂質組成物は、通常は、層の特性に影響を及ぼす１つまたは複数の
添加剤を含む。好適な添加剤としては、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ミリスチン酸およ
びオレイン酸、脂肪アルコール、例えばパルミチン酸アルコール、ミリスチン酸アルコー
ルおよびオレイン酸アルコール、ステロール、例えばコレステロール、エルゴステロール
、ラノステロール、シトステロールおよびスチグマステロール、リゾリン脂質、例えば１
−アシル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ならびにセラミドが挙
げられるが、これらに限定されない。
別の好ましい実施形態では、膜は固体層を含む。固体層は、これらに限定されるもので
はないがマイクロエレクトロニクス材料、絶縁材料、例えばＳｉ３Ｎ４、Ａｌ２Ｏ３およ
びＳｉＯ、有機および無機ポリマー、例えば、ポリアミド、プラスチック、例えばＴｅｆ
ｌｏｎ（登録商標）またはエラストマー、例えば二成分付加硬化シリコーンゴム、および
ガラスを含む、有機材料と無機材料両方から形成することができる。固体層は、グラフェ
ンから形成されることもある。好適なグラフェン層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８
／０１０６３７号明細書（国際公開第２００９／０３５６４７号パンフレットとして公開
）に開示されている。膜が固体層を含む場合、ポアは、通常は、固体層の中に、例えば、
固体層の穴、壁、間隙、チャネル、トレンチ、細隙の中に含まれている両親媒性膜または
層中に存在する。当業者は、好適な固体／両親媒性ハイブリッド系を調製することができ
る。好適な系は、国際公開第２００９／０２０６８２号パンフレットおよび国際公開第２
０１２／００５８５７号パンフレットに開示されている。上で論じた両親媒性膜または層
のいずれかを使用することができる。
方法は、通常は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された自
然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）中にポアが挿入された細胞を使用して行われ
る。方法は、通常は、人工トリブロックコポリマー層などの人工両親媒性層を使用して行
われる。層は、他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびに他の分子をポアに加え
て含むことがある。好適な装置および条件は、下で論じる。本発明の方法は、通常はｉｎ
ｖｉｔｒｏで行われる。
カップリング
ポリヌクレオチドは、好ましくは、ポアを含む膜とカップリングされる。方法は、ポア
を含む膜とポリヌクレオチドをカップリングするステップを含むことがある。ポリヌクレ
オチドは、好ましくは、１つまたは複数のアンカーを使用して膜とカップリングされる。
いかなる公知の方法を使用してポリヌクレオチドを膜とカップリングしてもよい。
各アンカーは、ポリヌクレオチドとカップリング（結合）する基、および膜とカップリ
ング（結合）する基を含む。各アンカーは、ポリヌクレオチドおよび／または膜と共有結
合でカップリング（結合）することができる。Ｙアダプターおよび／またはヘパリンルー
プアダプターが使用される場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、アダプターを使用し
て膜とカップリングされる。
あらゆる数のアンカー、例えば、２、３、４以上のアンカーを使用して、ポリヌクレオ
チドを膜とカップリングすることができる。例えば、各々がポリヌクレオチドと膜の両方
と別々にカップリング（結合）する２つのアンカーを使用して、ポリヌクレオチドを膜に
カップリングしてもよい。
１つまたは複数のアンカーは、１つもしくは複数のヘリカーゼおよび／または１つもし
くは複数の分子ブレーキを含むことがある。
膜が両親媒性層、例えば、コポリマー膜または脂質二重層である場合、１つまたは複数
のアンカーは、好ましくは、膜中に存在するポリペプチドアンカー、および／または膜中
に存在する疎水性アンカーを含む。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステ
ロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸、例えばコレ
ステロール、パルミチン酸またはトコフェロールである。好ましい実施形態では、１つま
たは複数のアンカーはポアではない。
膜の成分、例えば、両親媒性分子、コポリマーまたは脂質は、１つまたは複数のアンカ
ーを形成するように化学的に修飾されるまたは官能化されることがある。好適な化学的修
飾および膜の成分を官能化する好適な方法の例は、下でより詳細に論じる。膜成分のあら
ゆる割合、例えば、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少な
くとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％を、官能化すること
ができる。
ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされることもある。膜にポリヌクレオチドを
カップリングするために使用される１つまたは複数のアンカーは、好ましくはリンカーを
含む。１つまたは複数のアンカーが１つまたは複数、例えば２、３、４以上、のリンカー
を含むこともある。１つのリンカーが、１つより多く、例えば２、３、４以上、のポリヌ
クレオチドを膜とカップリングするために使用されることもある。
好ましいリンカーとしては、ポリマー、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、多糖類およびポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。こ
れらのリンカーは、直鎖状であってもよく、分岐していてもよく、または環状であっても
よい。例えば、リンカーは、環状ポリヌクレオチドであることがある。ポリヌクレオチド
は、環状ポリヌクレオチドリンカーを用いて相補配列にハイブリダイズすることもある。
１つもしくは複数のアンカーまたは１つもしくは複数のリンカーは、切断して破壊する
ことができる成分、例えば、制限部位または光解離性基を含むこともある。
官能化されたリンカー、およびそれらが分子をカップリングできる方法は、当技術分野
において公知である。例えば、マレイミド基で官能化されたリンカーは、タンパク質中の
システイン残基と反応して、該システイン残基に結合することになる。本発明に関連して
、タンパク質は、膜中に存在することもあり、またはポリヌクレオチドとカップリング（
もしくは結合）するために使用されることもある。このことは、下でより詳細に論じる。
ポリヌクレオチドの架橋は、「鍵と鍵穴」配置を使用して回避することができる。各リ
ンカーの一方の末端のみが互いに反応してより長いリンカーを形成することがあり、リン
カーの他方の末端は、各々がポリヌクレオチドまたは膜とそれぞれ反応する。そのような
リンカーは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号明細書（国際公開第２０１０
／０８６６０２号パンフレットとして公開）に記載されている。
下で論じるシークエンシング実施形態ではリンカーの使用が好ましい。ポリヌクレオチ
ドが、ポアと相互作用しているときにはアンカップリングしない（すなわち、ステップ（
ｂ）でもステップ（ｅ）でもアンカップリングしない）という意味で膜に直接、永続的に
カップリングされている場合には、膜とポアとの距離のためシークエンシング実験をポリ
ヌクレオチドの末端まで継続することができないので、一部の配列データが失われること
になる。リンカーを使用すればポリヌクレオチドを完了まで処理することができる。
カップリングは、永続的または安定性であることがある。言い換えれば、カップリング
は、ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用しているときに膜とカップリングされたままで
あるようなカップリングであることがある。
カップリングは、一時的であることもある。言い換えれば、カップリングは、ポリヌク
レオチドが、ポアと相互作用しているとき、膜からアンカップリングされうるカップリン
グであることもある。
アプタマー検出などの、ある特定の実施形態については、一時的な性質のカップリング
が好ましい。永続的または安定性リンカーがポリヌクレオチドの５’または３’末端のど
ちらか一方に直接結合されており、リンカーが膜と膜貫通ポアのチャネル間の距離より短
い場合には、シークエンシング実験をポリヌクレオチドの末端まで継続することができな
いので、一部の配列データが失われることになる。カップリングが一時的である場合には
、カップリングされた末端から無作為に膜がなくなると、ポリヌクレオチドを完了まで処
理することができる。永続的／安定性連結または一時的連結を形成する化学基は、下でよ
り詳細に論じる。コレステロールまたは脂肪アシル鎖を使用して、ポリヌクレオチドを両
親媒性層またはトリブロックコポリマー膜と一時的にカップリングすることもできる。６
〜３０炭素原子の長さを有するあらゆる脂肪酸、例えば、ヘキサデカン酸を使用すること
ができる。
好ましい実施形態では、核酸などのポリヌクレオチドは、トリブロックコポリマーまた
は脂質二重層などの両親媒性層とカップリングされる。核酸の合成脂質二重層へのカップ
リングは、様々な異なる繋留戦略を用いて以前に行われている。これらのことを下の表４
に要約する。
Figure 2021078500
合成ポリヌクレオチドおよび／またはリンカーは、コレステロール、トコフェロール、
パルミチン酸、チオール、脂質およびビオチン基などの好適なアンカー基の直接付加に容
易に適合する修飾ホスホロアミダイトを合成反応中に使用して、官能化することができる
。これらの様々な結合用化学物質は、ポリヌクレオチドへの結合の一連の選択肢をもたら
す。異なる修飾基各々がポリヌクレオチドにわずかに異なる方法でカップリングし、カッ
プリングは必ずしも永続的であるとは限らないため、膜へのポリヌクレオチドの滞留に異
なる時間が費やされる。一時的カップリングの利点は、上で論じている。
リンカーへのまたは官能化膜へのポリヌクレオチドのカップリングは、相補的反応性基
またはアンカー基をそのポリヌクレオチドに付加させることができることを条件に、多数
の他の手段によって果たすこともできる。ポリヌクレオチドのどちらか一方の末端への反
応性基の付加は、以前に報告されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγ
Ｓを使用して、チオール基をｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’に付加させることができ
る（Grant, G. P. and P. Z. Qin (2007). "A facile method for attaching nitroxide
spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10): e77
）。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−［２−アジドエチル］−ＡＴＰまたはγ−
［６−アジドヘキシル］−ＡＴＰを使用して、アジド基をｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの
５’リン酸に付加させることができる。チオールまたはクリックケミストリーを使用して
、チオール、ヨードアセトアミドＯＰＳＳもしくはマレイミド基（チオールに対して反応
性）またはＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオクチン）もしくはアルキン基（アジドに対して反
応性）のどちらか一方を含有するテザーをポリヌクレオチドに共有結合させることができ
る。末端トランスフェラーゼを使用して、ビオチン、チオールおよびフルオロフォアなど
の化学基のより多様な選択物を付加させて、ｓｓＤＮＡの３’に修飾オリゴヌクレオチド
を組み込むことができる（Kumar, A., P. Tchen, et al., (1988). "Nonradioactive lab
eling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transfe
rase." Anal Biochem 169(2): 376-82）。ストレプトアビジン／ビオチンおよび／または
ストレプトアビジン／デスチオビオチンカップリングをあらゆる他のポリヌクレオチドに
使用することができる。下の実施例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびストレプト
アビジン／デスチオビオチンを使用してポリヌクレオチドを膜とカップリングすることが
できる方法を説明する。末端トランスフェラーゼと好適に修飾されたヌクレオチド（例え
ばコレステロールまたはパルミチン酸）を使用してアンカーがポリヌクレオチドに直接付
加されうる可能性もありうる。
１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーショ
ンによって膜とカップリングする。１つまたは複数のアンカーのハイブリダイゼーション
によって、上で論じたような一時的な様式でのカップリングが可能になる。ハイブリダイ
ゼーションは、１つまたは複数のアンカーのいかなる部分に存在してもよく、例えば、１
つまたは複数のアンカーとポリペプチドの間に、１つまたは複数のアンカー内に、または
１つまたは複数のアンカーと膜の間に存在してもよい。例えば、リンカーは、互いにハイ
ブリダイズされている２つ以上のポリヌクレオチド、例えば、３、４または５つのポリヌ
クレオチドを含むことがある。１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドにハイブ
リダイズすることがある。１つまたは複数のアンカーは、（下で論じるように）ポリヌク
レオチドに直接ハイブリダイズすることもあり、またはポリヌクレオチドに結合されたＹ
アダプターおよび／もしくはリーダー配列に直接ハイブリダイズすることもあり、または
ポリヌクレオチドに結合されたヘアピンループアダプターに直接ハイブリダイズすること
もある。あるいは、１つまたは複数のアンカーが１つまたは複数、例えば２つまたは３つ
、の中間ポリヌクレオチド（または「スプリント」）にハイブリダイズされることがあり
、中間ポリヌクレオチドは、（下で論じるように）ポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチ
ドに結合されたＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列に、またはポリヌクレオチド
に結合されたヘアピンループアダプターにハイブリダイズされる。
１つまたは複数のアンカーは、一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともあり、または二本
鎖ポリヌクレオチドを含むこともある。アンカーの一部分が一本鎖または二本鎖ポリヌク
レオチドにライゲーションされていることもある。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩを使用する短
いｓｓＤＮＡ片のライゲーションが報告されている（Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Wi
lliams, et al., (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique
with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5）。ある
いは、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドいずれかを二本鎖ポリヌクレオチドにライゲ
ーションし、その後、２本の鎖を熱または化学変性によって分離することができる。二本
鎖ポリヌクレオチドに対しては、その二重鎖の末端の一方もしくは両方に１本の一本鎖ポ
リヌクレオチドを付加させること、または一方もしくは両方の末端に二本鎖ポリヌクレオ
チドを付加させることが可能である。一本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチド
への付加については、この付加を、一本鎖ポリヌクレオチドの他の領域へのライゲーショ
ンの場合と同様にＴ４ ＲＮＡリガーゼＩを使用して果たすことができる。次に、二本鎖
ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加については、ライゲーションは、ポ
リヌクレオチドおよび付加されたポリヌクレオチドそれぞれの相補的３’ｄＡ／ｄＴテー
ルを用いる（多くの試料調製用途について鎖状体またはダイマー形成を防止するために常
例的に行われているような）「平滑末端型」であることもあり、またはポリヌクレオチド
の制限消化および適合性アダプターのライゲーションによって生成された「突出末端」の
使用であることもある。次に、二重鎖が融解されると、各々の一本鎖は、一本鎖ポリヌク
レオチドが５’末端、３’末端でのライゲーションもしくは修飾に使用された場合には５
’もしくは３’修飾のいずれか一方、または二本鎖ポリヌクレオチドがライゲーションに
使用された場合には両方の修飾を有することになる。
ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、そのポリヌクレオチドの化学合成中に１つまた
は複数のアンカーを組み込むことができる。例えば、反応性基が結合されたプライマーを
使用してポリヌクレオチドを合成することができる。
アデニル化ポリヌクレオチドは、アデノシン一リン酸をポリヌクレオチドの５’リン酸
に結合させるライゲーション反応における中間体である。この中間体の生成には、ＮＥＢ
からの５’ＤＮＡアデニル化キットなどの様々なキットが利用可能である。さらにまた、
反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、ポリヌクレオチド
の５’に反応性基（例えばチオール、アミン、ビオチン、アジドなど）の付加が可能であ
りうる。５’ＤＮＡアデニル化キットと好適に修飾されたヌクレオチド（例えばコレステ
ロールまたはパルミチン酸）を使用してアンカーがポリヌクレオチドに直接付加されうる
可能性もありうる。
ゲノムＤＮＡ部分の一般的な増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用である
。ここで、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡの同じ部分の多
数のコピーを生成することができ、この場合、各コピーの二重鎖における各鎖の５’が合
成ポリヌクレオチドとなる。ポリメラーゼを利用することによって、単一または複数のヌ
クレオチドを一本鎖または二本鎖ＤＮＡの３’末端に付加させることができる。使用する
ことができるポリメラーゼの例としては、ターミナルトランスフェラーゼ、クレノウおよ
び大腸菌（E. coli）ポリ（Ａ）ポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
さらにまた、反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、コレ
ステロール、チオール、アミン、アジド、ビオチンまたは脂質などのアンカーを二本鎖ポ
リヌクレオチドに組み込むことができる。したがって、増幅されたポリヌクレオチドの各
コピーは、アンカーを含有することになる。
理想的には、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドを官能化する必要なく、膜と
カップリングされる。これは、１つもしくは複数のアンカー、例えばポリヌクレオチド結
合タンパク質または化学基、を膜とカップリングし、１つもしくは複数のアンカーをポリ
ヌクレオチドと相互作用させることによって、または膜を官能化することによって、果た
すことができる。１つまたは複数のアンカーを本明細書に記載する方法のいずれかによっ
て膜とカップリングしてもよい。特に、１つまたは複数のアンカーは、１つまたは複数の
リンカー、例えばマレイミド官能化リンカーを含むことがある。
この実施形態では、ポリヌクレオチドは、通常ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡまたは
ＬＮＡであり、二本鎖状であってもよく、または一本鎖状であってもよい。この実施形態
は、ゲノムＤＮＡポリヌクレオチドに特に適している。
１つまたは複数のアンカーは、一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチドと、ポリヌクレ
オチド内の特異的ヌクレオチド配列と、またはポリヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドの
パターンと、またはポリヌクレオチド上に存在する任意の他のリガンドとカップリング、
結合または相互作用する、あらゆる基を含むことができる。
アンカーに使用するために好適な結合タンパク質としては、下に列挙するものを含めて
、大腸菌（E. coli）一本鎖結合タンパク質、Ｐ５一本鎖結合タンパク質、Ｔ４ ｇｐ３
２一本鎖結合タンパク質、ＴＯＰＯ Ｖ ｄｓＤＮＡ結合領域、ヒトヒストンタンパク質
、大腸菌（E. coli）ＨＵ ＤＮＡ結合タンパク質、および他の古細菌性、原核性または
真核性一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（または核酸）結合タンパク質が挙げられる
が、これらに限定されない。
特異的ヌクレオチド配列は、転写因子、リボソーム、エンドヌクレアーゼ、トポイソメ
ラーゼまたは複製開始因子によって認識される配列でありうる。修飾ヌクレオチドのパタ
ーンは、メチル化または損傷のパターンでありうる。
１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドとカップリングする、ポリヌクレオチ
ドと結合する、ポリヌクレオチドにインターカレートする、またはポリヌクレオチドと相
互作用する、あらゆる基を含むことができる。この基は、静電相互作用、水素結合相互作
用、またはファンデルワールス相互作用によって、ポリヌクレオチドにインターカレート
するまたはポリヌクレオチドと相互作用することがある。そのような基としては、リシン
モノマー、ポリリシン（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡと相互作用することになる）、臭化
エチジウム（ｄｓＤＮＡにインターカレートすることになる）、ユニバーサル塩基または
ユニバーサルヌクレオチド（任意のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる
）、およびオスミウム錯体（メチル化塩基と反応することができる）が挙げられる。した
がって、ポリヌクレオチドと膜を、その膜に結合された１つまたは複数のユニバーサル塩
基を使用してカップリングすることができる。各ユニバーサルヌクレオチドは、１つまた
は複数のリンカーを使用して膜とカップリングすることができる。ユニバーサルヌクレオ
チドは、好ましくは、次の核酸塩基のうちの１つを含む：ヒポキサンチン、４−ニトロイ
ンドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、ホルミルインドール、３−ニ
トロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾ
ール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾールまたはフェニル（Ｃ６−
芳香族環）。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、次のヌクレオシドのうちの
１つを含む：２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン
、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、２−Ｏ’
−メチルイノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロ
インドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’デオキシリボヌクレオシド、５
−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレ
オシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’−デオキシリ
ボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似
体、ニトロイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌク
レオシド、４−ニトロピラゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾー
ルリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、
４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’−デオキ
シリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミ
ダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオ
シド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、フェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシ
ド、２’−デオキシネブラリン、２’−デオキシイソグアノシン、Ｋ−２’−デオキシリ
ボース、Ｐ−２’−デオキシリボースおよびピロリジン。ユニバーサルヌクレオチドは、
より好ましくは、２’−デオキシイノシンを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好
ましくは、ＩＭＰまたはｄＩＭＰである。ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは
、ｄＰＭＰ（２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド一リン酸）またはｄＫＭＰ（Ｎ６−メト
キシ−２，６−ジアミノプリン一リン酸）である。
１つまたは複数のアンカーは、フーグスティーン（Hoogsteen）水素結合（２つの核酸
塩基が水素結合によって一緒に保持される）または逆フーグスティーン水素結合（一方の
核酸塩基が他方の核酸塩基に対して１８０°回転される）によってポリヌクレオチドとカ
ップリング（または結合）されることもある。例えば、１つまたは複数のアンカーは、ポ
リヌクレオチドとフーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合を形成す
る、１つもしくは複数のヌクレオチド、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは１
つもしくは複数のポリヌクレオチドを含むことがある。これらのタイプの水素結合は、第
３のポリヌクレオチド鎖を二本鎖らせんの周りに巻きつかせ、三重鎖を形成させる。１つ
または複数のアンカーは、二本鎖ポリヌクレオチドと、その二本鎖二重鎖と三重鎖を形成
することによって、カップリング（または結合）することもある。
この実施形態では、膜成分の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、
少なくとも５０％または１００％が官能化されることもある。
１つまたは複数のアンカーがタンパク質を含む場合、それらのアンカーは、例えば、そ
のタンパク質が膜と適合性である外部疎水性領域を既に有する場合、さらなる官能化なし
に直接膜内に係留することができる。そのようなタンパク質の例としては、膜貫通タンパ
ク質、膜内タンパク質および膜タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ある
いは、タンパク質は、膜と適合性である遺伝子的に融合された疎水性領域を伴って発現さ
れることもある。そのような疎水性タンパク質領域は、当技術分野において公知である。
１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、膜との接触前にポリヌクレオチドと混合さ
れるが、１つまたは複数のアンカーを膜と接触させ、その後、ポリヌクレオチドと接触さ
せてもよい。
別の態様では、ポリヌクレオチドは、上記の方法を使用して特異的結合基によって認識
されうるように官能化されることがある。具体的には、ポリヌクレオチドは、リガンド、
例えば、ビオチン（ストレプトアビジンと結合させるため）、アミロース（マルトース結
合タンパク質もしくは融合タンパク質と結合させるため）、Ｎｉ−ＮＴＡ（ポリヒスチジ
ンと、もしくはポリヒスチジンタグ付きタンパク質と結合させるため）、またはペプチド
（例えば抗原）で官能化されることがある。
好ましい実施形態によると、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列にポリヌクレオチ
ドを結合させる場合、１つまたは複数のアンカーを使用してポリヌクレオチドを膜とカッ
プリングすることができる。リーダー配列は、下でより詳細に論じる。好ましくは、ポリ
ヌクレオチドは、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列に結合（例えばライゲーション
）される。そのようなリーダー配列は、ホモポリマー型ポリヌクレオチドまたは脱塩基領
域を含むことがある。リーダー配列は、１つまたは複数のアンカーに直接、または１つも
しくは複数の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）を介して、ハイブリダイズす
るように設計されるのが一般的である。そのような場合、１つまたは複数のアンカーは、
通常は、リーダー配列内の配列に相補的であるまたは１つもしくは複数の中間ポリヌクレ
オチド（もしくはスプリント）内の配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む。そ
のような場合、１つまたは複数のスプリントは、通常は、リーダー配列内の配列に相補的
であるポリヌクレオチド配列を含む。
化学結合に使用される分子の例は、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプ
ロピル］カルボジイミド塩酸塩）である。市販のキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ、
部品番号２２９８０）を使用して反応性基をポリヌクレオチドの５’に付加させることも
できる。好適な方法には、ヒスチジン残基およびＮｉ−ＮＴＡを使用する一時的親和性結
合はもちろん、反応性システイン、リシンまたは非天然アミノ酸による、より頑強な共有
結合も含まれるが、これらに限定されない。
二本鎖ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、二本鎖状であることがある。ポリヌクレオチドが二本鎖状である
場合、方法は、接触ステップの前に、ヘアピンループなどの架橋部分をポリヌクレオチド
の一方の末端にライゲーションするステップを好ましくはさらに含む。その場合、ポリヌ
クレオチドを本発明に従ってポアと接触させながらまたは接触させる前に、ポリヌクレオ
チドの２本の鎖を分離することができる。ポアを通るポリヌクレオチドの移動がポリヌク
レオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼ、または分子ブレーキによって制御されるの
で、２本の鎖を分離することができる。
このようにして二本鎖構築物の両方の鎖を連結させ、調べることによって、特徴づけの
効率および精度が増す。
架橋部分は、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を連結させることができる。架橋部分は
、通常は、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を共有結合で連結する。架橋部分は、その架
橋部分が一本鎖ポリヌクレオチドの膜貫通ポアを通る移動に干渉しないことを条件に、標
的ポリヌクレオチドの２本の鎖を連結させることができるあらゆるものであることができ
る。
当技術分野において公知のあらゆる好適な手段によって架橋部分を標的ポリヌクレオチ
ドに連結させることができる。架橋部が別途合成され、標的ポリヌクレオチドに化学的に
結合または酵素的にライゲーションされることもある。あるいは、架橋部分が標的ポリヌ
クレオチドのプロセシング中に生成されることもある。
架橋部分は、標的ポリヌクレオチドに、その標的ポリヌクレオチドの一方の末端にまた
は末端付近に連結される。架橋部分は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドに、その標的
ポリヌクレオチドの末端の１０ヌクレオチド以内に連結される。
好適な架橋部分としては、高分子リンカー、化学的リンカー、ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、架橋部分は、ＤＮＡ
、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（例えば脱塩基ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＰＥＧを
含む。架橋部分は、より好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。
架橋部分は、最も好ましくは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターである
。好適なヘアピンアダプターは、当技術分野において公知の方法を使用して設計すること
ができる。ヘアピンループは、いかなる長さであってもよい。ヘアピンループは、通常は
、長さ１１０ヌクレオチド以下、例えば、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以
下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレ
オチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、ま
たは１０ヌクレオチド以下である。ヘアピンループは、好ましくは、長さ約１〜１１０、
２〜１００、５〜８０、または６〜５０ヌクレオチドである。ヘアピンループがアダプタ
ーの分別選択可能性に関与する場合、５０〜１１０ヌクレオチドなどの、より長いヘアピ
ンループ長が好ましい。同様に、ヘアピンループが、下で論じるような選択可能結合に関
与しない場合、１〜５ヌクレオチドなどの、より短いヘアピンループ長が好ましい。
ヘアピンアダプターは、第１および／または第２のポリヌクレオチドのどちらか一方の
末端、すなわち５’または３’末端にライゲーションされることがある。当技術分野にお
いて公知のいかなる方法を使用して、ヘアピンアダプターを第１および／または第２のポ
リヌクレオチドにライゲーションしてもよい。リガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡリガー
ゼおよび９ＯＮ ＤＮＡリガーゼを使用して、ヘアピンアダプターをライゲーションする
ことができる。
当技術分野において公知のいかなる方法を使用してポリヌクレオチドの２本の鎖を分離
してもよい。例えば、ポリヌクレオチド結合タンパク質によって、または脱ハイブリダイ
ゼーションに有利に働く条件を使用して、それらの鎖を分離することができる（脱ハイブ
リダイゼーションに有利に働く条件の例としては、高温、高ｐＨ、ならびに水素結合また
は塩基対合を破壊することができる作用物質、例えばホルムアミドおよび尿素、の添加が
挙げられるが、これらに限定されない）。
ヘアピンアダプターは、選択可能結合部分を好ましくは含む。これによって、第１およ
び／または第２のポリヌクレオチドを精製または単離することが可能になる。選択可能結
合部分は、その結合特性に基づいて選択することができる部分である。したがって、選択
可能結合部分は、好ましくは、表面と特異的に結合する部分である。選択可能結合部分は
、本発明に使用される他の部分よりはるかに大きい程度に表面と結合する場合、その表面
に特異的に結合する。好ましい実施形態において、部分は、本発明に使用されるいかなる
他の部分も結合しない表面と結合する。
好適な選択的結合部分は、当技術分野において公知である。好ましい選択的結合部分と
しては、ビオチン、ポリヌクレオチド表面、抗体、抗体断片、例えばＦａｂおよびＳｃＳ
ｖ、抗原、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヒスチジンテールおよびＧＳＴタグが
挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい選択的結合部分は、ビオチンおよび
選択可能ポリヌクレオチド配列である。ビオチンは、アビジンで被覆された表面と特異的
に結合する。選択可能ポリヌクレオチド配列は、相同配列で被覆された表面と特異的に結
合（すなわちハイブリダイズ）する。あるいは、選択可能ポリヌクレオチド配列は、ポリ
ヌクレオチド結合タンパク質で被覆された表面と特異的に結合する。
ヘアピンアダプターおよび／または選択可能結合部分は、切る、切り目を入れる、切断
するまたは加水分解することができる領域を含むことができる。そのような領域は、第１
および／または第２のポリヌクレオチドを、そのポリヌクレオチドが結合されている表面
から精製または単離後に除去することを可能にするように設計することができる。好適な
領域は、当技術分野において周知である。好適な領域としては、ＲＮＡ領域、デスチオビ
オチンおよびストレプトアビジンを含む領域、ジスルフィド結合、および光切断性領域が
挙げられるが、これらに限定されない。
二本鎖標的ポリヌクレオチドは、好ましくは、ヘアピンループまたはヘアピンループア
ダプターなどの架橋部分の反対側の末端にリーダー配列を含む。リーダー配列は、下でよ
り詳細に論じる。
ラウンドザコーナーシークエンシング（Round the corner sequencing）
好ましい実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドには一方の末端に架橋部分、例え
ば、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターが備えられており、方法は、ポリヌ
クレオチドをポアと、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアを通って移動するように接触さ
せるステップと、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアに対して移動しているときに１回ま
たは複数回の測定を行い、測定がポリヌクレオチドの鎖の１つまたは複数の特徴を示し、
それによって標的二本鎖ポリヌクレオチドを特徴づけるステップとを含む。別の好ましい
実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドには一方の末端に架橋部分、例えば、ヘアピ
ンループまたはヘアピンループアダプターが備えられており、方法は、ポリヌクレオチド
をポアおよびエキソヌクレアーゼと、ポリヌクレオチドの両方の鎖が消化されて個々のヌ
クレオチドになるように接触させるステップを含む。上で論じた実施形態のいずれかがこ
の方法に同等に適用される。
リーダー配列
鎖特徴づけ／シークエンシング方法における接触ステップの前に、方法は、ポアを優先
的に通り抜けるリーダー配列をポリヌクレオチドに結合させるステップを好ましくは含む
。リーダー配列は、本発明の方法を助長する。リーダー配列は、ポアを優先的に通り抜け
るように、およびそれによってポリヌクレオチドのポアを通る移動を助長するように、設
計される。リーダー配列を使用して、ポリヌクレオチドを上で論じたような１つまたは複
数のアンカーに連結させることもできる。
リーダー配列は、通常はポリマーを含む。ポリマーは、好ましくは負電荷を有する。ポ
リマーは、好ましくは、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、修飾ポリヌク
レオチド（例えば脱塩基ＤＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
またはポリペプチドである。リーダーは、好ましくはポリヌクレオチドを含み、より好ま
しくは一本鎖ポリヌクレオチドを含む。リーダー配列は、上で論じたポリヌクレオチドの
いずれかを含むことができる。一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ＤＮＡの１本の
鎖、例えば、ポリｄＴ部分を含む。リーダー配列は、好ましくは１つまたは複数のスペー
サーを含む。
リーダー配列は、あらゆる長さであることができるが、通常は、長さ１０〜１５０ヌク
レオチド、例えば、長さ２０〜１５０ヌクレオチドである。リーダーの長さは、方法に使
用される膜貫通ポアに通常は依存する。
リーダー配列は、好ましくは、下で定義するようなＹアダプターの一部である。
二重カップリング
本発明の方法は、二本鎖ポリヌクレオチドの二重カップリングを含むことがある。好ま
しい実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）一方の末端にＹアダプターを有し、他方の末端にヘアピンループアダプターなど
の架橋部分アダプターを有する、二本鎖ポリヌクレオチドを用意するステップであって、
Ｙアダプターがポリヌクレオチドを膜とカップリングするための１つまたは複数の第１の
アンカーを含み、架橋部分アダプターがポリヌクレオチドを膜とカップリングするための
１つまたは複数の第２のアンカーを含み、架橋部分アダプターの膜へのカップリング強度
がＹアダプターの膜へのカップリング強度より大きい、ステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で用意されたポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異
体、例えば本発明のポアと、ポリヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って、移
動するように接触させるステップ、および
（ｃ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を
行い、測定が、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それによって標的ポリ
ヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む。
このタイプの方法は、英国特許出願公開第１４０６１４７号（1406147.7）明細書にお
いて詳細に論じられている。
二本鎖ポリヌクレオチドには一方の末端にＹアダプターがおよび他方の末端に架橋部分
アダプターが備えられている。Ｙアダプターおよび／または架橋部分アダプターは、通常
はポリヌクレオチドアダプターである。それらのアダプターは、上で論じたポリヌクレオ
チドのいずれかから形成することができる。
Ｙアダプターは、通常は、（ａ）二本鎖領域、および（ｂ）一本鎖領域または他方の末
端に相補的でない領域を含む。Ｙアダプターは、一本鎖領域を含む場合、オーバーハング
を有すると記述されることがある。Ｙアダプター内の非相補領域の存在がこのアダプター
をＹ形にする。二本鎖部分とは異なり２本の鎖が通常は互いにハイブリダイズしないから
である。Ｙアダプターは、１つまたは複数の第１のアンカーを含む。アンカーは、上でよ
り詳細に論じている。
Ｙアダプターは、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列を好ましくは含む。このこと
は、上で論じている。
架橋部分アダプターは、上で論じたような選択可能結合部分を好ましくは含む。架橋部
分アダプターおよび／または選択可能結合部分は、上で論じたように切る、切り目を入れ
る、切断するまたは加水分解することができる領域を含むことができる。
１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキが上で論じたように
使用される場合、Ｙアダプターが好ましくは１つまたは複数のヘリカーゼを含み、架橋部
分アダプターが好ましくは１つまたは複数の分子ブレーキを含む。
当技術分野において公知のいかなる方法を用いてＹアダプターおよび／または架橋部分
アダプターをポリヌクレオチドにライゲーションしてもよい。リガーゼ、例えば、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ
ＤＮＡリガーゼおよび９ＯＮ ＤＮＡリガーゼを使用して、一方または両方のアダプタ
ーをライゲーションすることができる。あるいは、下で論じる本発明の方法を使用してア
ダプターをポリヌクレオチドに付加させることができる。
好ましい実施形態では、方法のステップａ）は、二本鎖ポリヌクレオチドを、該二本鎖
ポリヌクレオチドが一方の末端にＹアダプターをおよび他方の末端に架橋部分アダプター
を含むように修飾することを含む。あらゆる修飾様式を使用することができる。方法は、
好ましくは、本発明に従って二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することを含む。このことは
、下でより詳細に論じる。修飾方法と特徴づけ方法をいかなる形で組み合わせてもよい。
架橋部分アダプターの膜とのカップリング（または結合）強度は、Ｙアダプターの膜と
のカップリング（または結合）強度より大きい。この強度を任意の方法で測定することが
できる。カップリング（または結合）強度の好適な測定方法は、英国特許出願公開第１４
０６１４７号（1406147.7）明細書の実施例に開示されている。
架橋部分アダプターのカップリング（または結合）強度は、好ましくは、Ｙアダプター
のカップリング（または結合）強度の少なくとも１．５倍、例えば、アンカーアダプター
のカップリング（または結合）強度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍
、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍である。架橋部分アダプターの膜に対する親
和定数（Ｋｄ）は、好ましくは、Ｙアダプターの親和定数の少なくとも１．５倍、例えば
、Ｙアダプターのカップリング強度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍
、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍である。
架橋部分アダプターがＹアダプターより強く膜とカップリング（または結合）する方法
はいくつかある。例えば、架橋部分アダプターは、Ｙアダプターより多くのアンカーを含
むことがある。例えば、架橋部分アダプターは、２つ、３つ以上の第２のアンカーを含む
ことがあり、これに対してＹアダプターは、１つの第１のアダプターを含むことがある。
１つまたは複数の第２のアンカーの膜とのカップリング（または結合）強度は、１つま
たは複数の第１のアンカーの膜とのカップリング（または結合）強度より大きいことがあ
る。１つまたは複数の第２のアンカーの架橋部分アダプターとのカップリング（または結
合）強度は、１つまたは複数の第１のアンカーのＹアダプターとのカップリング（または
結合）強度より大きいことがある。１つまたは複数の第１のアンカーおよび１つまたは複
数の第２のアンカーは、それらのそれぞれのアダプターにハイブリダイゼーションによっ
て結合されていることがあり、このハイブリダイゼーション強度は、１つまたは複数の第
１のアンカーにおけるより１つまたは複数の第２のアンカーにおけるほうが大きい。これ
らの実施形態のあらゆる組合せも本発明に使用することができる。カップリング（または
結合）強度は、当技術分野において公知の技術を使用して測定することができる。
１つまたは複数の第２のアンカーは、膜とカップリング（または結合）する１つまたは
複数の第１のアンカー中の１つまたは複数の基より大きい強度でその膜とカップリング（
または結合）する１つまたは複数の基を好ましくは含む。好ましい実施形態では、架橋部
分アダプター／１つまたは複数の第２のアンカーは、コレステロールを使用して膜とカッ
プリング（または結合）し、Ｙアダプター／１つまたは複数の第１のアンカーは、パルミ
チン酸を使用して膜とカプリング（または結合）する。コレステロールは、パルミチン酸
より強くトリブロックコポリマー膜および脂質膜と結合する。代替実施形態では、架橋部
分アダプター／１つまたは複数の第２のアンカーは、パルミチン酸などのモノアシル化学
種を使用して膜とカップリング（または結合）し、Ｙアダプター／１つまたは複数の第１
のアンカーは、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどのジアシル化学種を使用して膜
とカップリング（または結合）する。
ヘアピンループおよびリーダー配列の付加
用意する前に、二本鎖ポリヌクレオチドをＭｕＡトランスポサーゼ、および二本鎖Ｍｕ
Ａ基質の集団と接触させてもよく、この場合、集団中の基質の一部は、リーダー配列を含
むＹアダプターであり、また集団中の基質の一部はヘアピンループアダプターである。ト
ランスポサーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド分析物を断片化し、それらの断片の一方また
は両方の末端にＭｕＡ基質をライゲーションする。これは、一方の末端にリーダー配列を
および他方にヘアピンループを含む、複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。そ
の場合、本発明の方法を使用して修飾二本鎖ポリヌクレオチドを調査することができる。
集団中の各基質は、好ましくは、ユニバーサルヌクレオチドの少なくとも１つのオーバ
ーハングを含み、したがって、トランスポサーゼがテンプレートポリヌクレオチドを断片
化し、基質を二本鎖断片の一方または両方の末端にライゲーションし、その結果、複数の
断片／基質構築物を生成する。この場合、方法は、オーバーハングを構築物中の断片にラ
イゲーションすることによって複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成するステップを
さらに含む。好適なユニバーサルヌクレオチドは、上で論じている。オーバーハングは、
好ましくは、長さ５ヌクレオチドである。
あるいは、集団中の各基質は、好ましくは、（ｉ）少なくとも１つのオーバーハングと
、（ｉｉ）少なくとも１つのオーバーハングと同じ鎖内に、テンプレートポリヌクレオチ
ド中に存在しないヌクレオシドを含む少なくとも１つのヌクレオチドとを含み、したがっ
て、トランスポサーゼがテンプレートポリヌクレオチドを断片化し、二本鎖断片の一方ま
たは両方の末端に基質をライゲーションし、その結果、複数の断片／基質構築物を生成す
る。この場合、方法は、（ａ）少なくとも１つのヌクレオチドを選択的に除去することに
より構築物からオーバーハングを除去することによって一本鎖ギャップを含む複数の二本
鎖構築物を生成するステップ、および（ｂ）構築物中の一本鎖ギャップを修復することに
よって複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む。ポリヌクレ
オチドは、通常は、ヌクレオシド：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄ
Ｕ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）ならびにデオキシシ
チジン（ｄＣ）を含む。ポリヌクレオチド中に存在しないヌクレオシドは、好ましくは、
脱塩基性、アデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、シチジ
ン（Ｃ）もしくはグアノシン（Ｇ）であるか、または尿素、５，６−ジヒドロキシチミン
、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン（5-hydroxy-5 methylhy
danton）、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン（6-hyroxy-5
,6-dihdrothimine）、メチルタルトロニル尿素、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン
（８−オキソグアニン）、８−オキソアデニン、ｆａｐｙ−グアニン、メチル−ｆａｐｙ
−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシンＢ１−ｆａｐｙ−グアニン、５−ヒド
ロキシ−シトシン、５−ヒドロキシ−ウラシル、３−メチルアデニン、７−メチルグアニ
ン、１、Ｎ６−エタノアデニン、ヒポキサンチン、５−ヒドロキシウラシル、５−ヒドロ
キシメチルウラシル、５−ホルミルウラシルもしくはシス−ｓｙｎ−シクロブタンピリミ
ジンダイマーを含む。少なくとも１つのヌクレオチドは、好ましくは、オーバーハングか
らの１０ヌクレオチド以下である。少なくとも１つのヌクレオチドは、オーバーハング中
の第１のヌクレオチドである。オーバーハング中のヌクレオチドのすべてが、テンプレー
トポリヌクレオチド中に存在しないヌクレオシドを好ましくは含む。
これらのＭｕＡベースの方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２５０５号パ
ンフレットに開示されている。それらは、英国特許出願公開第１４０６１４７号（140614
7.7）明細書においても詳細に論じられている。
１つまたは複数のヘリカーゼを、二本鎖ポリヌクレオチドおよびＭｕＡトランスポサー
ゼと接触させる前に、ＭｕＡ基質Ｙアダプターに結合させてもよい。あるいは、１つまた
は複数のヘリカーゼを、二本鎖ポリヌクレオチドおよびＭｕＡトランスポサーゼと接触さ
せる前に、ＭｕＡ基質Ｙアダプターに結合させてもよい。
１つまたは複数の分子ブレーキを、二本鎖ポリヌクレオチドおよびＭｕＡトランスポサ
ーゼと接触させる前に、ＭｕＡ基質ヘアピンループアダプターに結合させてもよい。ある
いは、１つまたは複数の分子ブレーキを、二本鎖ポリヌクレオチドおよびＭｕＡトランス
ポサーゼと接触させる前に、ＭｕＡ基質ヘアピンループアダプターに結合させてもよい。
アンカップリング
本発明の方法は、複数の標的ポリヌクレオチドの特徴づけおよび少なくとも第１の標的
ポリヌクレオチドのアンカップリングを含むことがある。
好ましい実施形態では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドの特徴づけを含む
。方法は、
（ａ）第１の試料中の第１のポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｂ）第２の試料中の第２のポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｃ）１つまたは複数のアンカーを使用して第１の試料中の第１のポリヌクレオチドを
膜とカップリングするステップ、
（ｄ）第１のポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポ
アと、ポリヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させ
るステップ、
（ｅ）第１ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測
定を行い、測定が第１のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって
第１のポリヌクレオチドを特徴づけるステップ、
（ｆ）第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングするステップ、
（ｇ）１つまたは複数のアンカーを使用して第２の試料中の第２のポリヌクレオチドを
膜とカップリングするステップ、
（ｈ）第２のポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポ
アと、第２ポリヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触
させるステップ、および
（ｉ）第２のポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の
測定を行い、測定が第２のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによっ
て第２のポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む。
このタイプの方法は、英国特許出願公開第１４０６１５５号（1406155.0）明細書にお
いて詳細に論じられている。
ステップ（ｆ）（すなわち、第１のポリヌクレオチドのアンカップリング）をステップ
（ｇ）の前に（すなわち、第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングする前に）行って
もよい。ステップ（ｇ）をステップ（ｆ）の前に行ってもよい。第１のポリヌクレオチド
をアンカップリングする前に第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングする場合、ステ
ップ（ｆ）は、好ましくは、膜からの第１のポリヌクレオチドの選択的アンカップリング
（すなわち、膜からの第２のポリヌクレオチドではなく第１のポリヌクレオチドのアンカ
ップリング）を含む。当業者は、選択的アンカップリングを果たす系を設計することがで
きる。ステップ（ｆ）および（ｇ）を同時に行ってもよい。このことは、下でより詳細に
論じる。
ステップ（ｆ）では、第１のポリヌクレオチドの少なくとも１０％が好ましくは膜から
アンカップリングされる。例えば、第１のポリヌクレオチドの少なくとも２０％、少なく
とも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０
％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が膜からアンカップリ
ングされることもある。好ましくは、第１のポリヌクレオチドのすべてが膜からアンカッ
プリングされる。膜からアンカップリングされる第１のポリヌクレオチドの量は、ポアを
使用して判定することができる。このことは、実施例において開示する。
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、互いに異なることがある。
あるいは、第１および第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドであることが
ある。そのような場合、第２のポリヌクレオチドを添加する前に第１の試料の少なくとも
一部を除去する必要がないこともある。このことは、下でより詳細に論じる。方法が３つ
以上のポリヌクレオチドの調査に関する場合、それらのポリヌクレオチドは、すべてが互
いに異なることもあり、またはそれらの一部が互いに異なることもある。
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドの２
つの実例であることもある。第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドと同一
であることもある。これは、較正を可能にする。方法が、３つ以上のポリヌクレオチドの
調査に関する場合、それらのポリヌクレオチドは、すべてが同じポリヌクレオチドの３つ
以上の実例であることもあり、またはそれらの一部が同じポリヌクレオチドの別個の実例
であることもある。
第１の試料および第２の試料は、互いに異なることがある。例えば、第１の試料はヒト
に由来することがあり、第２の試料はウイルスに由来することがある。第１および第２試
料が互いに異なる場合、それらの試料は、同じ第１および第２のポリヌクレオチドを含有
することもあり、または含有することが疑われることもある。方法が３つ以上の試料の調
査に関する場合、それらの試料は、すべてが互いに異なることもあり、またはそれらの一
部が互いに異なることもある。
第１の試料および第２の試料は、好ましくは、同じ試料の２つの実例である。第１の試
料は、好ましくは、第２の試料と同一である。これは、較正を可能にする。方法が、３つ
以上の試料の調査に関する場合、それらの試料は、すべてが同じ試料の３つ以上の実例で
あることもあり、またはそれらの一部が同じ試料の別個の実例であることもある。
あらゆる数のポリヌクレオチドを調査することができる。例えば、本発明の方法は、３
、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００以上のポリヌクレオチドの
特徴づけに関することがある。本発明の方法を使用して３つ以上のポリヌクレオチドを調
査する場合、第２のポリヌクレオチドも膜からアンカップリングされ、必要数のステップ
が第３のポリヌクレオチドに加えられる。同じことが４つ以上のポリヌクレオチドについ
ても言える。
本発明の方法は、第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングするステップを含
む。本発明の方法は、３つ以上のポリヌクレオチドを調査することになる場合、第２のポ
リヌクレオチドを膜からアンカップリングするステップを含むことがある。
公知のいかなる方法を使用して第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングして
もよい。第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、ステップ（ｆ）では膜貫通ポアを使用
して膜からアンカップリングされない。第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、電圧ま
たは印加電位を使用して膜からアンカップリングされない。
ステップ（ｆ）は、好ましくは、膜から１つまたは複数のアンカーを除去することによ
ってその膜から第１のポリヌクレオチドをアンカップリングすることを含む。アンカーを
除去したら、他の（または別の）アンカーを使用して第２のポリヌクレオチドをその膜と
カップリングする。第２のポリヌクレオチドのカップリングに使用するアンカーは、第１
のポリヌクレオチドをカップリングするために使用した同じタイプのアンカーであっても
よく、または異なるタイプのアンカーであってもよい。
ステップ（ｆ）は、１つまたは複数のアンカーを、その１つまたは複数のアンカーに対
して、そのアンカーが膜に対して有する親和性より高い親和性を有する作用物質と接触さ
せることを好ましくは含む。分子の特異的結合能力を判定するための競合結合または免疫
放射定量測定アッセイの様々なプロトコルが当技術分野において周知である（例えば、Ma
ddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993を参照されたい）。作用物質は、アン
カーを膜から除去することによって第１のポリヌクレオチドをアンカップリングする。作
用物質は、好ましくは糖である。１つまたは複数のアンカーが膜に対して有する親和性よ
り高い親和性で１つまたは複数のアンカーと結合するいずれの糖を使用してもよい。糖は
、シクロデキストリンまたは下で論じるようなその誘導体であることもある。
１つまたは複数のアンカーがコレステロールなどの疎水性アンカーを含む場合、作用物
質は、好ましくは、シクロデキストリンもしくはその誘導体または脂質である。シクロデ
キストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am.
Chem. Soc. 116, 6081-6088に開示されているもののいずれかであってもよい。この作用
物質は、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−
βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣ
Ｄ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ
７−βＣＤ）である。本明細書において開示する脂質のいずれかを使用することができる
。
アンカーがストレプトアビジン、ビオチンまたはデスチオビオチンを含む場合、作用物
質は、好ましくは、ビオチン、デスチオビオチンまたはストレプトアビジンである。ビオ
チンとデスチオビオチンの両方は、ストレプトアビジンが膜と結合するより高い親和性で
ストレプトアビジンと結合し、逆もまた同様である。ビオチンは、ストレプトアビジンに
対してデスチオビオチンより強い親和性を有する。したがって、ストレプトアビジンを含
むアンカーは、ビオチンまたはストレプトアビジンを使用して膜から除去することができ
るし、逆もまた同様である。
アンカーがタンパク質を含む場合、作用物質は、好ましくは、タンパク質と特異的に結
合する抗体またはその断片である。抗体は、あるタンパク質と優先的なまたは高い親和性
で結合するが、他のまたは異なるタンパク質とは結合しないまたは低い親和性でしか結合
しない場合、そのタンパク質と特異的に結合する。抗体は、１１０−６Ｍ以下、より好ま
しくは１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは×１０−８Ｍ以下、ま
たはより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫｄで結合する場合、優先的なまたは高い親和
性で結合する。抗体は、１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より
好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、よりいっそう好ま
しくは１×１０−２Ｍ以上のＫｄで結合する場合、低い親和性で結合する。いずれの方法
を使用して結合または特異的結合を検出してもよい。抗体のタンパク質との結合を定量的
に測定する方法は、当技術分野において周知である。抗体は、モノクローナル抗体であっ
てもよいし、またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体の好適な断片には、Ｆｖ、
Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片はもちろん、一本鎖抗体も含まれるが、これらに
限定されない。さらに、抗体またはその断片は、キメラ抗体もしくはその断片、ＣＤＲグ
ラフト抗体もしくはその断片、またはヒト化抗体もしくはその断片であってもよい。
ステップ（ｆ）は、１つまたは複数のアンカーの膜とカップリングする能力を低減させ
る作用物質と１つまたは複数のアンカーを接触させることを好ましくは含む。例えば、作
用物質は、１つまたは複数のアンカーの構造および／または疎水性に干渉することによっ
て膜とカップリングするそれらの能力を低減させることができる。アンカーがコレステロ
ールを含む場合、作用物質は、好ましくはコレステロールデヒドロゲナーゼである。アン
カーが脂質を含む場合、作用物質は、好ましくはホスホリパーゼである。アンカーがタン
パク質を含む場合、作用物質は、好ましくはプロテイナーゼまたは尿素である。好適なア
ンカーと作用物質の他の組合せは、当業者には明らかである。
ステップ（ｆ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから１つまたは複数のアンカ
ーを分離することによって、第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングすること
を含む。これを任意の手法で行うことができる。例えば、リンカーを含むアンカーの場合
、そのリンカーを切断することができる。この実施形態は、ハイブリダイゼーションによ
る連結に関わるアンカーに特に適用できる。そのようなアンカーは、上で論じている。
ステップ（ｆ）は、第１のポリヌクレオチドおよび１つまたは複数のアンカーを、その
１つまたは複数のアンカーとの結合について第１のポリヌクレオチドと競合する作用物質
と接触させることによって、第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングすること
を好ましくは含む。競合的結合を判定および測定する方法は、当技術分野において公知で
ある。作用物質は、好ましくは、１つまたは複数のアンカーとのハイブリダイゼーション
について第１のポリヌクレオチドと競合するポリヌクレオチドである。例えば、ハイブリ
ダイゼーションに関わる１つまたは複数のアンカーを使用して第１のポリヌクレオチドを
膜とカップリングする場合、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアンカーをハイブリ
ダイゼーション部位に同じくハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させることによ
ってアンカップリングすることができる。ポリヌクレオチド作用物質は、通常は、第１の
ポリヌクレオチドおよび１つまたは複数のアンカーの濃度より高い濃度で添加される。あ
るいは、ポリヌクレオチド作用物質は、１つまたは複数のアンカーに第１のポリヌクレオ
チドより強くハイブリダイズすることができる。
ステップ（ｆ）は、より好ましくは、（ｉ）第１のポリヌクレオチドおよび１つまたは
複数のアンカーを、尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）、ストレプトアビジンもしくはビオチン、ＵＶ線、酵素また
は結合剤と接触させるステップ、（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび１つまたは複数
のアンカーを加熱するステップ、または（ｉｉｉ）ｐＨを変更するステップを含む。尿素
、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオトレイトール（
ＤＴＴ）は、アンカーを分解することができ、第１のポリヌクレオチドを膜から分離する
ことができる。アンカーがストレプトアビジン−ビオチン連結を含む場合には、ストレプ
トアビジン作用物質は、ビオチンとの結合について競合することになる。アンカーがスト
レプトアビジン−デスチオビオチン連結を含む場合には、ビオチン作用物質は、ストレプ
トアビジンとの結合について競合することになる。ＵＶ線は、光解離性基を分解するため
に使用することができる。酵素および結合剤は、アンカーを切断、破壊または分解するた
めに使用することができる。好ましい酵素としては、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレ
アーゼまたはヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい結合剤として
は、酵素、抗体もしくはその断片、または一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）が挙げられる
が、これらに限定されない。下で論じる酵素または上で論じた抗体のいずれかを使用して
もよい。熱およびｐＨは、ハイブリダイゼーションおよび他の連結を破壊するために使用
することができる。
第１のポリヌクレオチドを１つまたは複数のアンカーから分離することによって第１の
ポリヌクレオチドを膜からアンカップリングした場合、１つまたは複数のアンカーは、膜
内に残存することになる。ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから
分離された１つまたは複数のアンカーを使用して第２のポリヌクレオチドを膜とカップリ
ングすることを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドに、膜内に残存する１つまたは複
数のアンカーにハイブリダイズする１つまたは複数のポリヌクレオチドを備えさせること
もできる。あるいは、ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから分離
されたものからの１つまたは複数の別個のアンカー（すなわち、１つまたは複数の他のア
ンカー）を使用して第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングすることを含む。１つま
たは複数の別個のアンカーは、第１のポリヌクレオチドを膜とカップリングするために使
用した同じタイプのアンカーであってもよく、または異なるタイプのアンカーであっても
よい。ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから分離された１つまた
は複数のアンカーとは異なる１つまたは複数のアンカーを使用して第２のポリヌクレオチ
ドを膜とカップリングすることを含む。
好ましい実施形態では、ステップ（ｆ）および（ｇ）は、膜を第２のポリヌクレオチド
と、第２のポリヌクレオチドが１つまたは複数のアンカーとの結合について第１のポリヌ
クレオチドと競合し、その第１のポリヌクレオチドを置換するように接触させることによ
って、膜から第１のポリヌクレオチドをアンカップリングすることを含む。例えば、ハイ
ブリダイゼーションに関わる１つまたは複数のアンカーを使用して第１のポリヌクレオチ
ドを膜とカップリングする場合、第１のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアンカー
中のハイブリダイゼーション部位に同じくハイブリダイズするポリヌクレオチドと結合さ
れた第２のポリヌクレオチドとアンカーを接触させることによって、アンカップリングす
ることができる。第２のポリヌクレオチドは、通常は、第１のポリヌクレオチドおよび１
つまたは複数のアンカーの濃度より高い濃度で添加される。あるいは、第２のポリヌクレ
オチドは、１つまたは複数のアンカーに第１のポリヌクレオチドより強くハイブリダイズ
することができる。
除去および洗浄
第１のポリヌクレオチドをステップ（ｆ）で膜からアンカップリングするが、それを必
ずしも除去するまたは洗い流すとは限らない。第２のポリヌクレオチドを第１のポリヌク
レオチドと容易に区別することができる場合、第１のポリヌクレオチドを除去する必要は
ない。
ステップ（ｆ）と（ｇ）の間に、方法は、好ましくは、第１の試料の少なくとも一部を
膜から除去するステップをさらに含む。第１の試料の少なくとも１０％、例えば、第１の
試料の２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６
０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が除去されることが
ある。
方法は、好ましくは、膜から第１の試料のすべてを除去するステップをさらに含む。こ
れを任意の方法で行うことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドをアンカップリン
グした後、膜を緩衝液で洗浄することができる。好適な緩衝液は、下で論じる。
修飾ポリヌクレオチド
特徴づけの前に、標的ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドとポリメラーゼ、お
よび遊離ヌクレオチドの集団とを、そのポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドをテンプレ
ートとして使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する（ポリメラーゼは、修飾ポリヌクレ
オチドを形成するときに標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチド化学種の１つまたは複数
を、異なるヌクレオチド化学種で置換する）条件下で接触させることによって修飾される
ことがある。その場合、１つまたは複数のヘリカーゼがポリヌクレオチドに結合され１つ
または複数の分子ブレーキがポリヌクレオチドに結合された修飾ポリヌクレオチドを得る
ことができる。このタイプの修飾は、英国特許出願公開第１４０３０９６号（1403096.9
）明細書に記載されている。上で論じたポリメラーゼのいずれかを使用してもよい。ポリ
メラーゼは、好ましくは、クレノウまたは９ｏ Ｎｏｒｔｈである。
テンプレートポリヌクレオチドをポリメラーゼと、ポリメラーゼがテンプレートポリヌ
クレオチドをテンプレートとして使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下で接触
させる。そのような条件は、当技術分野において公知である。例えば、ポリヌクレオチド
を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）からの緩衝液などの市販ポリ
メラーゼ緩衝液中でポリメラーゼと接触させるのが一般的である。温度は、好ましくは、
クレノウについては好ましくは２０〜３７℃、９ｏ Ｎｏｒｔｈについては６０〜７５℃
である。プライマーまたは３’ヘアピンをポリメラーゼ伸長の核形成点として使用するの
が一般的である。
膜貫通ポアを使用するポリヌクレオチドの特徴づけ、例えばシークエンシングは、通常
は、ｋ個のヌクレオチド（ｋは正の整数である）で構成されているポリマーユニット（す
なわち「ｋ−ｍｅｒ」）の分析を含む。このことは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／
０５２３４３号明細書（国際公開第２０１３／０４１８７８号パンフレットとして公開）
において論じられている。異なるｋ−ｍｅｒについての電流測定値間に明白な差があるこ
とが望ましいが、これらの測定値の一部が重複することはよくあることである。特に、ｋ
−ｍｅｒ中のポリマーユニットの数が多いと、すなわちｋの値が大きいと、ポリヌクレオ
チドについての情報、例えばポリヌクレオチドの基礎配列の推定値、の導出が害されて、
異なるｋ−ｍｅｒによって生じた測定値を分離することが困難になりうる。
標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチド化学種を修飾ポリヌクレオチ
ド中の異なるヌクレオチド化学種で置換することによって、修飾ポリヌクレオチドは、標
的ポリヌクレオチド中のものとは異なるｋ−ｍｅｒを含有する。修飾ポリヌクレオチド中
の異なるｋ−ｍｅｒは、標的ポリヌクレオチド中のｋ−ｅｍｒとは異なる電流測定値を生
じさせることができるため、修飾ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとは異なる
情報を与える。修飾ポリヌクレオチドからのこの追加情報は、標的ポリヌクレオチドの特
徴づけを容易にすることができる。場合によっては、修飾ポリヌクレオチド自体を特徴づ
けるほうが容易であることもある。例えば、電流測定値間の離隔が増したもしくは明白な
離隔を有するｋ−ｍｅｒ、またはノイズ低下を有するｋ−ｍｅｒを含むように、修飾ポリ
ヌクレオチドを設計することができる。
ポリメラーゼは、好ましくは、修飾ポリヌクレオチドを形成するときに標的ポリヌクレ
オチド中の２つ以上のヌクレオチド化学種を異なるヌクレオチド化学種で置換する。ポリ
メラーゼは、標的ポリヌクレオチド中の２つ以上のヌクレオチド化学種の各々を異質のヌ
クレオチド化学種で置換することもある。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチド中の２
つ以上のヌクレオチド化学種の各々を同じヌクレオチド化学種で置換することもある。
標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、その修飾されたものの中の異なるヌクレオ
チド化学種は、通常は、アデニン、グアニン、チミン、シトシンもしくはメチルシトシン
とは異なる核酸塩基を含む、および／またはデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、
チミジン、デオキシシチジンもしくはデオキシメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを
含む。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、修飾ポリヌクレオチド中の異なるヌク
レオチド化学種は、通常は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンもしくはメチルシ
トシンとは異なる核酸塩基を含む、および／またはアデノシン、グアノシン、ウリジン、
シチジンもしくはメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを含む。異なるヌクレオチド化
学種は、上で論じたユニバーサルヌクレオチドのいずれかであることができる。
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド化学種を、その１つまたは複数のヌク
レオチド化学種に不在の化学基または原子を含む異なるヌクレオチド化学種で置換するこ
ともある。化学基は、プロピニル基、チオ基、オキソ基、メチル基、ヒドロキシメチル基
、ホルミル基、カルボキシ基、カルボニル基、ベンジル基、プロパルギル基、またはプロ
パルギルアミン基であることがある。
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド化学種を、その１つまたは複数のヌク
レオチド化学種中に存在する化学基または原子を欠いているヌクレオチド化学種で置換す
ることもある。ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド化学種を、電気陰性度が
変更された異なるヌクレオチド化学種で置換することもある。電気陰性度が変更された異
なるヌクレオチド化学種は、好ましくはハロゲン原子を含む。
方法は、好ましくは、修飾ポリヌクレオチド中の１つまたは複数の異なるヌクレオチド
化学種から核酸塩基を選択的に除去するステップをさらに含む。
分析物送達
標的分析物を、好ましくは、その分析物を膜の方に送達する微粒子に結合させる。この
タイプの送達は、英国特許出願公開第１４１８４６９号（1418469.1）明細書に記載され
ている。あらゆるタイプの微粒子および結合方法を使用することができる。
他の特徴づけ方法
別の実施形態では、ポリメラーゼによって標的ポリヌクレオチドに付加され、その後、
遊離される標識化学種を検出することによって、ポリヌクレオチドを特徴づける。ポリメ
ラーゼは、ポリヌクレオチドをテンプレートとして使用する。各々の標識化学種が各々の
ヌクレオチドに特異的である。ポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例
えば本発明のポア、ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと、各ヌクレオチドに特異的な
標識を含有するリン酸塩標識化学種がポリメラーゼによってポリヌクレオチドに逐次的に
付加されるように接触させる。標識化学種を、それらがヌクレオチドから遊離される前に
（すなわち、それらが標的ポリヌクレオチドに付加されているときに）、またはヌクレオ
チドから遊離された後に、ポアを使用して検出することができる。
ポリメラーゼは、上で論じたもののいずれかであってもよい。ポアを使用してリン酸塩
標識化学種を検出することによってポリヌクレオチドを特徴づける。このタイプの方法は
、欧州特許出願第１３１８７１４９号明細書（13187149.3）（欧州特許出願公開第２６８
２４６０号明細書として公開）明細書に開示されている。上で論じた実施形態のいずれか
がこの方法に同等に適用される。
標識化学種の例としては、ポリマー、ポリエチレングリコール、糖、シクロデキストリ
ン、フルオロフォア、薬物、代謝物、ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
そのようなタグの非限定的な例は、Kumar et al., Sci Rep. 2012; 2:684. Epub 2012 Se
p 21の著述の中で見つけることができる。
センサーを形成する方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成する方法も提供す
る。この方法は、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、ポリヌクレオ
チド結合タンパク質、例えばヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼとの複合体を形成する
ステップを含む。標的ポリヌクレオチドの存在下でポアをタンパク質と接触させ、次いで
ポアを介して電位を印加することによって、複合体を形成することができる。印加される
電位は、上に記載したように、化学的電位であってもよく、または電圧電位であってもよ
い。あるいは、ポアをタンパク質に共有結合させることによって複合体を形成することが
できる。共有結合の方法は当技術分野において公知であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／
ＧＢ０９／００１６７９号明細書（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレット）
および同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０
３号パンフレット）に開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるた
めのセンサーである。方法は、好ましくは、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発
明のポアと、ヘリカーゼとの複合体を形成するステップを含む。上で論じた実施形態のい
ずれかがこの方法に同等に適用される。
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーも提供する。このセンサ
ーは、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポア、とポリヌクレオチド結合タ
ンパク質との複合体を含む。上で論じた実施形態のいずれかが本発明のセンサーに同等に
適用される。
キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのキットも提供する。このキットは
、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、膜の成分とを含む。膜は、好
ましくは、成分から形成される。ポアは、好ましくは、膜内に存在する。キットは、上で
開示した膜のいずれか、例えば両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜、の成分を含
むことができる。
キットは、ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含むことがある。上で論じたポリ
ヌクレオチド結合タンパク質のいずれかを使用することができる。
キットは、ポリヌクレオチドを膜とカップリングさせるための１つまたは複数のアンカ
ーをさらに含むことがある。
キットは、好ましくは、二本鎖ポリヌクレオチドを特徴づけるためのキットであり、好
ましくは、Ｙアダプターおよびヘアピンループアダプターを含む。Ｙアダプターには、好
ましくは、１つまたは複数のヘリカーゼが結合されており、ヘアピンループアダプターに
は、好ましくは、１つまたは複数の分子ブレーキが結合されている。Ｙアダプターは、ポ
リヌクレオチドを膜とカップリングするための１つまたは複数の第１のアンカーを好まし
くは含み、ヘアピンループアダプターは、ポリヌクレオチドを膜にカップリングするため
の１つまたは複数の第２のアンカーを好ましくは含み、ヘアピンループアダプターの膜と
のカップリング強度は、好ましくは、Ｙアダプターのその膜とのカップリング強度より大
きい。
本発明のキットは、上述の実施形態のいずれかを行うことを可能にする１つまたは複数
の他の試薬または器具をさらに含むことがある。そのような試薬または器具は、次のもの
の１つまたは複数を含む：好適な緩衝液（水溶液）、対象から試料を得るための手段（例
えば、容器、もしくは針を備えている器具）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは
発現させるための手段、または電圧固定もしくはパッチクランプ装置。試薬は、流体試料
によってそれらの試薬が再懸濁されるように、乾燥状態でキット内に存在することがある
。キットは、場合により、キットを本発明の方法で使用することを可能にする説明書、ま
たはその方法をどの生物に使用してもよいのかに関する詳説も含むことがある。
装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドなどの標的分析物を特徴づけるための装置も提供する
。この装置は、複数のＣｓｇＧポアまたはそれらの変異体、および複数の膜を含む。複数
のポアは、好ましくは、複数の膜内に存在する。ポアおよび膜の数は、好ましくは等しい
。好ましくは、単一のポアが各膜内に存在する。
装置は、好ましくは、本発明の方法を行うための説明書をさらに含む。装置は、分析物
分析のための従来の装置のいずれか、例えば、アレイまたはチップであることができる。
本発明の方法に関して上で論じた実施形態のいずれかが本発明の装置に同等に適用できる
。装置は、本発明のキット中に存在する機構のいずれかをさらに含むことができる。
装置は、好ましくは、本発明の方法を行うために組立てられる。
装置は、好ましくは、
複数のポアおよび膜を支持することができ、かつポアおよび膜を使用して分析物の特徴
づけを行うために操作可能である、センサーデバイスと、
特徴づけを行うための材料を送達するための少なくとも１つのポートと
を含む。
あるいは、装置は、好ましくは、
複数のポアおよび膜を支持することができ、かつポアおよび膜を使用して分析物の特徴
づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
特徴づけを行うための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと
を含む。
装置は、より好ましくは、
膜ならびに複数のポアおよび膜を支持することができ、かつポアおよび膜を使用して分
析物の特徴づけを行うために操作可能である、センサーデバイスと、
特徴づけを行うための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと、
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに制御可能に材料を供給するように
構成されている流体工学システムと、
それぞれの試料を受けるための１つまたは複数の容器と
を含み、流体工学システムは、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスに試料を選択
的に供給するように構成されている。
装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号明細書（国際公開第２００９／
０７７７３４号パンフレットとして公開）、ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号明細書（
国際公開第２０１０／１２２２９３号パンフレットとして公開）、国際出願第ＰＣＴ／Ｇ
Ｂ１０／００２２０６号明細書（国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットとし
て公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号明細書（国際公開第００／２
８３１２号パンフレットとして公開）に記載されているもののいずれかであってもよい。
以下の実施例は、本発明を例証するものである。
実施例
ＣｓｇＧのクローニングおよび株
外膜に局在するＣ−末端ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧ（ｐＰＧ１）および周辺質のＣ−
末端ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧＣ１Ｓ（ｐＰＧ２）を産生するための発現構築物は記述
されている（Goyal, P. et al., Acta Crystallogr. F. Struct. Biol. Cryst. Commun.
2013, 69, 1349-1353）。セレノメチオニン標識の場合、収量を増加させるためにＳｔｒ
ｅｐＩＩタグＣｓｇＧＣ１Ｓを細胞質で発現させた。したがって、プライマー５’−ＴＣ
Ｔ ＴＴＡ ＡＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＧＣＣ ＴＡＡ ＡＧ−３’（フォワード）（配列
番号４３７）、および５’−ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＣＣ ＴＣＧ ＴＴＡ ＴＣ−
３’（リバース） （ｐＰＧ３）（配列番号４３８）によるインバースＰＣＲを使用して
、Ｎ−末端シグナルペプチドを除去するようにｐＰＧ２を変化させた。表現型アッセイの
場合、大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（大腸菌（E.coli）ＮＶＧ２）のｃｓｇＧ欠失変
異体を、[Datsenko, K. A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 6640-6645 (2000)]
に記述される方法によって（プライマー５’−ＡＡＴ ＡＡＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＧＡ
Ｔ ＴＴＴ ＴＡＡ ＧＣＣ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＡ
Ａ ＴＣＧ ＴＧＴ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＴＴ Ｃ−３’（配列番号４
３９）および５’−ＣＧＣ ＴＴＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＡＡＡ ＡＴＧ ＣＣＧ ＧＡＴ
ＧＡＴ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＴＡ ＴＧＡ
ＡＴＡ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＴＡ Ｇ−３’（配列番号４４０）を使用して）構築した
。Ｃｙｓアクセス可能性アッセイのためおよびチャネル狭窄の表現型プロービングのため
に使用する様々なＣｓｇＧ置換変異体を、ｔｒｃプロモーターの制御下でｃｓｇＧを含有
するｐＴＲＣ９９ａベクターであるｐＭＣ２（Robinson, L. S., et al., Mol. Microbio
l., 2006, 59, 870-881）から開始する部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅプロ
トコール；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって構築した。
タンパク質の発現および精製
ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧＣ１Ｓを、記述されるように発現および精製した（Robinson,
L. S., et al., Mol. Microbiol., 2006, 59, 870-881）。簡単に説明すると、ＣｓｇＧ
を、ｐＰＧ１で形質転換した大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）において組換えにより
産生させ、単離された外膜から緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５
００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中の１
％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を使用して抽出した。ＳｔｒｅｐＩＩタ
グＣｓｇＧを５ｍｌ Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｉｂａ，
ＧｍＢＨ）にロードして、０．５％テトラエチレングリコールモノオクチルエーテル（
Ｃ８Ｅ４；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）および４ｍＭラウリルジメチルアミン−Ｎ−オキシド
（ＬＤＡＯ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を補充した緩衝液Ａの２０カラム容積で洗浄するこ
とによって洗浄剤を交換した。２．５ｍＭ Ｄ−デスチオビオチンを添加してタンパク質
を溶出させて、結晶化実験のために５ｍｇ・ｍｌ−１に濃縮した。セレノメチオニン標識
の場合、ＣｓｇＧＣ１Ｓを、ｐＰＧ３で形質転換したメチオニン栄養素要求株Ｂ８３４（
ＤＥ３）において産生させて、４０ｍｇ・Ｌ−１Ｌ−セレノメチオニンを補充したＭ９最
少培地で増殖させた。細胞ペレットを、ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を補充した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴに再懸濁させて
、２０×１０３ｌｂ ｉｎ−２で作動するＴＳシリーズ細胞破砕装置（Ｃｏｎｓｔａｎｔ
Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ）の中に通過させることによって破砕した。標識したＣｓｇＧ
Ｃ１Ｓを記述されるように精製した（Robinson, L. S., et al., Mol. Microbiol., 2006
, 59, 870-881）。セレノメチオニンの酸化を防止するために精製手順を通してＤＴＴ（
５ｍＭ）を添加した。
ＣｓｇＥを、ｐＮＨ２７を有する大腸菌（E.coli）ＮＥＢＣ２５６６細胞において産生
させた（Nenninger, A. A. et al., Mol. Microbiol. 2011, 81, 486-499)。２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、５％（
容量／容量）グリセロール中の細胞溶解物をＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ
ｃａｒｅ）にロードした。ＣｓｇＥ−ｈｉｓを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．
０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリセロール緩衝液中で５００ｍＭイミ
ダゾールへの直線勾配で溶出させた。ＣｓｇＥを含有する分画に２５０ｍＭ（ＮＨ４）２
ＳＯ４を補充して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％（容量／容量）グリセロールで平衡にした５ｍｌ
ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グ
リセロールへの直線勾配を溶出のために適用した。ＣｓｇＥ含有分画を、２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリセロールに
平衡にしたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅ １０／６００（ＧＥ Ｈｅａ
ｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードした。
溶液中のオリゴマー化状態の評価
洗浄剤可溶化ＣｓｇＧ（０．５％Ｃ８Ｅ４、４ｍＭ ＬＤＡＯ）およびＣｓｇＧＣ１Ｓ
のそれぞれ約０．５ｍｇを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ８．０、５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭ ＬＤＡＯ、および０．５％Ｃ８Ｅ４（ＣｓｇＧ）、ま
たは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ（ＣｓｇＧＣ１Ｓ
）で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ分析的ゲルろ過カラム（
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用して０．７ｍｌ 分−１で実験を行った。カラムの
溶出体積をウシサイログロブリン、ウシγ−グロブリン、ニワトリ卵アルブミン、ウマミ
オグロビン、およびビタミンＢ１２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって較正した（図７）。洗浄
剤可溶化タンパク質である膜抽出ＣｓｇＧの２０μｇも同様に３〜１０％ブルーネイティ
ブＰＡＧＥで、Swamy, M., et al., Sci. STKE 2006, p14, [http://dx.doi.Org/10.1126
/stke.3452006pl4(2006)]に記述される手順を使用して実験した（図７）。Ｎａｔｉｖｅ
Ｍａｒｋ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）非染色タンパク質標準物質（７μｌ）
を分子量推定のために使用した。成熟ＣｓｇＧは、Ｃ９対称性を有する別個のノナマーポ
ア形成粒子として、ならびにノナマーポアのテール−テールダイマー（すなわち、Ｄ９対
称性を有するオクタデカマー）として主に見出された。ナノポアセンシング用途の目的の
ために、タンパク質の好ましい状態は、単一ノナマーポアである。Ｄ９オクタデカマーポ
アに対してノナマーポアの集団を、サイズ排除クロマトグラフィーの前に試料を加熱する
ことによって、および／またはナノポアセンシング用途のために脂質二重層に挿入するこ
とによって、増加させることができる。
結晶化、データ収集、および構造の決定
セレノメチオニン標識ＣｓｇＣ１Ｓを３．８ｍｇ・ｍｌ−１となるように濃縮して、１
００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２、８％ ＰＥＧ ４０００、および１００ｍＭマロ
ン酸ナトリウムｐＨ７．０を含有する溶液に対して、シッティングドロップ蒸気拡散によ
って結晶化した。結晶を、１５％グリセロールを補充した結晶化緩衝液中でインキュベー
トして、液体窒素中で急速凍結した。洗浄剤可溶化ＣｓｇＧを５ｍｇ・ｍｌ−１となるよ
うに濃縮して、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、８％ ＰＥＧ ４０００、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、および５００ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する溶液に対してハンギン
グドロップ蒸気拡散によって結晶化させた。結晶を液体窒素中で急速凍結して、結晶化溶
液中に存在する洗浄剤によって凍結保護した。結晶条件を最適にするためおよび良好な回
折品質を有する結晶に関してスクリーニングするために、結晶を、ｂｅａｍｌｉｎｅｓ
Ｐｒｏｘｉｍａ−１およびＰｒｏｘｉｍａ−２ａ（Ｓｏｌｅｉｌ， Ｆｒａｎｃｅ）、Ｐ
Ｘ−Ｉ（Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉ０２
、Ｉ０３、Ｉ０４、およびＩ２４（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ， ＵＫ
）およびＩＤ１４ｅｈ２、ＩＤ２３ｅｈ１、およびＩＤ２３ｅｈ２（ＥＳＲＦ， Ｆｒａ
ｎｃｅ）において分析した。ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧの構造決定のために使用した
最終回折データをそれぞれｂｅａｍｌｉｎｅｓ Ｉ０４およびＩ０３で収集した（表５）
。
Figure 2021078500
ＣｓｇＧＣ１Ｓの回折データをＸｉａ２およびＸＤＳパッケージを使用して処理した（
Winter, G., J. Appl. Cryst., 2010, 43, 186-190; Kabsch, W., Acta Crystallogr. D
Biol. Crystallogr. 2010, 66, 125-132）。ＣｓｇＧＣ１Ｓの結晶は、ａ＝１０１．３Å
、ｂ＝１０３．６Å、ｃ＝１４１．７Å、α＝１１１．３°、β＝９０．５°、γ＝１１
８．２°の単位格子寸法を有する空間群Ｐ１に属し、非対称単位にタンパク質１６コピー
を含有する。構造決定および精密化のために、波長０．９７９５Åで収集したデータを、
最高分解能シェルでの｜／σ｜カットオフ２に基づいて２．８Åで切り捨てした。単波長
異常分散（ＳＡＤ）実験から計算した実験的位相を使用して、構造を解析した。全体で９
２個のセレン部位が、ＳｈｅｌｘＣおよびＳｈｅｌｘＤ（Sheldrick, G. M., Acta Cryst
allogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 479-485）を使用して非対称単位に位置づけら
れ、これらを精密化して、Ｓｈａｒｐ（Bricogne, G., Acta Crystallogr. D Biol. Crys
tallogr. 2003, 59, 2023-2030）による位相計算のために使用した（フェージングパワー
（phasing power）０．７９、性能指数（ＦＯＭ）０．２５）。実験的位相を密度修正し
てＰａｒｒｏｔ（Cowtan, K., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 470
-478）を使用して非結晶学的対称性（ＮＣＳ）によって平均化した（図７、ＦＯＭ ０．
８５）。最初のモデルを、Ｂｕｃｃａｎｅｅｒ（Cowtan, K., Acta Crystallogr. D Biol
. Crystallogr. 2006, 62, 1002-1011）によって作製して、Ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅ
（Adams, P. D. et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 213-221）
による最尤推定精密化の繰り返しラウンド、ならびにＣｏｏｔ（Emsley, P. et al., Act
a Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 486-501）の手動での検分およびモデ
ル（再）構築によって精密化した。最終的な構造は１６個のＣｓｇＧＣ１Ｓ鎖に属する３
，７００個の残基中に２８，８５３原子を含有し（図７）、ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Davi
s, I. W. et al., Nucleic Acids Res. 35 (Suppl 2), W375-W383）スコアは１．３４で
あり；残基の９８％がＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの好ましい領域（許容領域の９
９．７％）に存在する。電子密度マップは、可能性がある溶媒分子に対応する明白な密度
を示さず、したがって、水分子またはイオンはその中に組み込まれなかった。精密化の初
期および後期で厳密なローカルＮＣＳ制限をそれぞれ使用して、精密化を通して１６回の
ＮＣＳ平均を維持した。
ＣｓｇＧの回折データを波長０．９７６３Åで単結晶から収集し、ＸＤＳパッケージ（
Winter, G., J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190; Kabsch, W., Acta Crystallogr. D B
iol. Crystallogr. 2010, 66, 125-132）を使用して、非対称単位にＣｓｇＧ１８コピー
および７２％溶媒含有量を包含する、単位格子寸法ａ＝１６１．７Å、ｂ＝３７２．３Å
、ｃ＝１６１．８Å、およびβ＝９２．９°の空間群Ｃ２に指数化してスケーリングした
。構造決定および精密化のための回折データを、逆格子方向ａ＊、ｂ＊、およびｃ＊に沿
って３．６Å、３．７Å、および３．８Åの分解限界となるように、楕円形に切り捨てし
、Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ Ｓｅｒｖｅｒ（Strong, M. et al.,
Proc. Natl Acad. Sci. USA 2006, 103, 8060-8065）によって異方性にスケーリングし
た。ＣｓｇＧＣ１Ｓモノマーを使用する分子置換は、成功しなかった。自己回転関数の分
析により、非対称単位におけるＤ９対称性が明らかとなった（示していない）。ＣｓｇＧ
Ｃ１Ｓの構造に基づいて、Ｃ８からＣ９オリゴマーに移行すると、粒子周囲のプロトマー
間アークは、４５°から４０°に変化するプロトマー間角度とほぼ同じままであり、計算
される半径の増加は約４Åであるという仮定に基づいてノナマー検索モデルを作成した。
検索モデルとしての計算されたノナマーを使用して、２コピーを含有するという分子置換
の解がPhaser（McCoy, A. J. et al., J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674）によって見
出された。密度修正およびＮＣＳ平均電子密度マップ（Parrot [Cowtan, K., Acta Cryst
allogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 470-478]；図８）の精査によって、ＴＭ１お
よびＴＭ２の手動での構築、タンパク質コアにおける隣接残基のリモデリングを行い、な
らびにＣｓｇＧＣ１Ｓモデルで欠失しており、Ｎ−末端脂質アンカーにα１ヘリックスを
連結させる残基２〜１８の構築を行った。ＣｓｇＧモデルの精密化は、初回および最終精
密化ラウンドに関してそれぞれ、Ｂｕｓｔｅｒ−ＴＮＴ（Smart, O. S. et al., Acta Cr
ystallogr. D Biol. Crystallogr. 2012, 68, 368-380）およびＲｅｆｍａｃ５（Murshud
ov, G. N. et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2011, 67, 355-367）に
よって実施した。１８回のローカルＮＣＳ制限を、精密化を通して適用し、σ０．０１の
ｊｅｌｌｙ−ｂｏｄｙ精密化およびＰｒｏｓｍａｒｔ（Nicholls, R. A., Long, F. & Mu
rshudov, G. N., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2011, 68, 404-417）によっ
て作成された水素結合の制限を用いて、Ｒｅｆｍａｃ５を実行した。最終構造は、１８Ｃ
ｓｇＧ鎖に属する４，４５１個の残基中に３４，１６５個の原子を含有し（図７）、ｍｏ
ｌｐｒｏｂｉｔｙスコアは２．７９であった。残基の９３．０％がＲａｍａｃｈａｎｄｒ
ａｎプロットの好ましい領域（許容領域の９９．３％）に存在する。Ｎ−末端脂質アンカ
ーに対応する明白な電子密度は識別できなかった。
コンゴーレッドアッセイ
コンゴーレッド結合の分析に関して、Ｌｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中、３７
℃で増殖させた細菌の一晩培養物をＬＢ培地でＤ６００が０．５に達するまで希釈した。
試料５μｌを、アンピシリン（１００ｍｇ・ｌ−１）、コンゴーレッド（１００ｍｇ・ｌ
−１）、および０．１％（重量／容量）イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）を補充したＬＢアガープレートにスポットした。プレートを室温（２０〜２２℃）で
４８時間インキュベートして、ｃｕｒｌｉ発現を誘導した。コロニーの形態の発達および
色素の結合を４８時間目に観察した。
システインアクセス可能性アッセイ
システイン変異体を、部位特異的変異誘発を使用してｐＭＣ２において作製して、大腸
菌（E.coli）ＬＳＲ１２（Chapman, M. R. et al., Science, 2002, 295, 851-855）にお
いて発現させた。一晩増殖させた細菌培養物を、１ｍＭ ＩＰＴＧおよび１００ｍｇ・ｌ
−１アンピシリンを含有するＬＢアガープレートにスポットした。プレートを室温でイン
キュベートして、細胞を４８時間後に擦り取り、ＰＢＳ １ｍＬに再懸濁させ、Ｄ６００
を使用して標準化した。超音波処理によって細胞を溶解して、４℃、３，０００ｇで２０
秒間遠心分離して、細胞溶解物および懸濁させた膜から非破砕細胞を除去した。上清中の
タンパク質を１５ｍＭメトキシポリエチレングリコール−マレイミド（ＭＡＬ−ＰＥＧ
５ｋＤａ）によって室温で１時間標識した。１００ｍＭ ＤＴＴによって反応を停止させ
て、５０．４ Ｔｉローターにおいて４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．（約１００，０００ｇ）
で４℃で２０分間遠心分離して、全ての膜をペレットにした。ペレットを１％ラウロイル
サルコシン酸ナトリウムによって洗浄して、細胞膜を可溶化させて再度遠心分離した。得
られた外膜を、１％ＤＤＭを含有するＰＢＳを使用して懸濁し、可溶化した。ニッケルビ
ーズによる金属親和性プルダウンをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓウェスタンブロット
に使用した。空のｐＭＣ２ベクターを有する大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２細胞を陰性対照
として使用した。
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光法
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ測定を、液体窒素冷蔵テルル化カドミウム水銀検出器およびＧｏｌｄ
ｅｎ Ｇａｔｅ反射測定用アクセサリ（Ｓｐｅｃａｃ）を備えたＥｑｕｉｎｏｘ ５５赤
外線分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ）において乾燥空気で絶えずパージしながら実施した。内
部反射測定用元素はダイヤモンド結晶（２ｍｍ×２ｍｍ）であり、ビーム入射角は４５°
であった。それぞれの精製タンパク質試料（１μｌ）を結晶の表面に広げて、気体窒素流
で乾燥させて被膜を形成させた。分解能２ｃｍ−１で記録された各スペクトルは、シグナ
ル対ノイズ比を改善するための積算処理が平均で１２８回であった。スペクトルは全て水
蒸気の関与を差し引いて処理し、アポダイゼーションによって最終分解能４ｃｍ−１で平
滑化して、アミドＩ結合（１，７００〜１，６００ｃｍ−１）の領域で標準化して、その
比較を可能にした（Goormaghtigh, E. ; Ruysschaert, J. M., Spectrochim. Acta, 1994
, 50A, 2137-2144）。
ネガティブ染色ＥＭおよび対称性の決定
ネガティブ染色ＥＭを使用して、ＣｓｇＧ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびＣｓｇＥの溶液中
のオリゴマー化状態をモニターした。ＣｓｇＥ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびａｍｐｈｉｐｏ
ｌ結合ＣｓｇＧを０．０５ｍｇ・ｍｌ−１の濃度に調節して、グロー放電カーボンコーテ
ィング銅グリッド（ＣＦ−４００； Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）に適用した。１分間インキュベートした後、試料をブロットし、次いで洗浄
して２％酢酸ウラニルで染色した。画像を、電圧１２０ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ Ｔ
１２ ＢｉｏＴＷＩＮ ＬａＢ６顕微鏡で、倍率４９，０００倍で８００〜２，０００ｎ
ｍのデフォーカスにより収集した。コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）、位相フリッピング
、および粒子選択は、クライオ−ＥＭに関して記述されたように実施した。膜抽出Ｃｓｇ
Ｇに関して、オクタデカマー粒子（全体で１，７８０個）を、ノナマーおよび上面図から
個別に分析した。精製ＣｓｇＥに関して、全体で２，４５２個の粒子を分析した。三次元
モデルを、以下のＣｓｇＧ−ＣｓｇＥのクライオ−ＥＭ分析に関して記述されたように得
て、数ラウンドの多重参照配列アライメント（ＭＲＡ）、多重統計分析（ＭＳＡ）、およ
びアンカーセット精密化によって精密化した。全ての場合において、標準化および中心化
後、クライオ−ＥＭの章で記述したようにＩＭＡＧＩＣ−４Ｄを使用して画像を分類した
。特徴的な図に対応する最善のクラスを各組の粒子に関して選択した。ＣｓｇＧ上面図の
対称性の決定は、クラスあたりおおよそ２０個の画像の最善のクラス平均を使用して行っ
た。回転方向の自己相関関数はＩＭＡＧＩＣを使用して計算してプロットした。
ネガティブ染色ＥＭおよび対称性の決定
ネガティブ染色ＥＭを使用して、ＣｓｇＧ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびＣｓｇＥの溶液中
のオリゴマー化状態をモニターした。ＣｓｇＥ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびａｍｐｈｉｐｏ
ｌ結合ＣｓｇＧを０．０５ｍｇ・ｍｌ−１の濃度に調節して、グロー放電カーボンコーテ
ィング銅グリッド（ＣＦ−４００； Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）に適用した。１分間インキュベートした後、試料をブロットし、次いで洗浄
して２％酢酸ウラニルで染色した。画像を、電圧１２０ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ Ｔ
１２ ＢｉｏＴＷＩＮ ＬａＢ６顕微鏡で、倍率４９，０００倍で８００〜２，０００ｎ
ｍのデフォーカスにより収集した。コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）、位相フリッピング
、および粒子選択は、クライオ−ＥＭに関して記述されたように実施した。膜抽出Ｃｓｇ
Ｇに関して、オクタデカマー粒子（全体で１，７８０個）を、ノナマーおよび上面図から
個別に分析した。精製ＣｓｇＥに関して、全体で２，４５２個の粒子を分析した。三次元
モデルを、以下のＣｓｇＧ−ＣｓｇＥのクライオ−ＥＭ分析に関して記述されたように得
て、数ラウンドの多重参照配列アライメント（ＭＲＡ）、多重統計分析（ＭＳＡ）、およ
びアンカーセット精密化によって精密化した。全ての場合において、標準化および中心化
後、クライオ−ＥＭの章で記述したようにＩＭＡＧＩＣ−４Ｄを使用して画像を分類した
。特徴的な図に対応する最善のクラスを各組の粒子に関して選択した。ＣｓｇＧ上面図の
対称性の決定は、クラスあたりおおよそ２０個の画像の最善のクラス平均を使用して行っ
た。回転方向の自己相関関数はＩＭＡＧＩＣを使用して計算してプロットした。
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の形成
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体形成に関して、ＣｓｇＧ（０．５％Ｃ８Ｅ４、４ｍＭ ＬＤ
ＡＯ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ中で２４ｍｇ・ｍｌ−１タンパク質）１２０ｍｌを洗浄剤脱安定化リポソーム（１ｍｇ
・ｍｌ−１ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）
および０．４％ＬＤＡＯ）３００ｍｌに添加して氷中で５分間インキュベートした後、Ａ
８−３５ ａｍｐｈｉｐｏｌｓの１００ｍｇ・ｍｌ−１保存液９０ｍｌを添加することに
よって、精製ＣｓｇＧ中の可溶化洗浄剤を、Ａｍｐｈｉｐｏｌｓ Ａ８−３５（Ａｎａｔ
ｒａｃｅ）に交換した。氷中でさらに１５分間インキュベートした後、試料をＳｕｐｅｒ
ｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードして、
２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％キシリトール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、
０．２ｍＭ ＤＴＴ中でゲルろ過を実施した。２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％キシリト
ール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．２ｍＭ ＤＴＴ中の精製モノマーＣｓ
ｇＥの等量を、ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧに関してそれぞれ１５および５ｍＭのタンパク質
最終濃度でａｍｐｈｉｐｏｌ可溶化ＣｓｇＧに添加して、試料を０．５×ＴＢＥ緩衝液中
で４．５％ネイティブＰＡＧＥにおいて１８℃、１２５Ｖで泳動させた。第二の変性寸法
に関して、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体に対応するバンドを、同じゲル上で同時に泳動させ
た未染色レーンから切り出して、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％ ２−メルカプトエタノール、０．
０１％ブロモフェノールブルー）中で５分間沸騰させて、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
おいて泳動させた。精製ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧを対照試料としての複合体と共に泳動さ
せた。ゲルを、肉眼による可視化のためにＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてＣｓｇＥおよびＣｓｇＧバンドの蛍光検出（Ｔｙｐｈ
ｏｏｎ ＦＬＡ ９０００）によるＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の化学量論的評価のために
ＳＹＰＲＯオレンジによって染色し、ＣｓｇＧ／ＣｓｇＥ比０．９７を生じた。
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥのクライオ−ＥＭ
クライオ電子顕微鏡を使用して、Ｃ９ ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の溶液中の構造を決
定した。上記のように調製したＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体は、ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させて溶出させ、非結合ＣｓｇＧを除去して、これを
溶出させ、２０ｍＡで３０秒間グロー放電させたＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ２／２カーボ
ンコーティンググリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｏｌｓ ＧｍｂＨ）
に直ちに適用した。試料を、自動システム（Ｌｅｉｃａ）を使用して液体窒素中で急速凍
結して、電圧２００ｋＶで作動するＦＥＩ Ｆ２０顕微鏡下で、低用量条件で５０，００
０倍の名目上の倍率、および１．４〜３ｍｍのデフォーカス範囲で観察した。画像フレー
ムをＦａｌｃｏｎ ＩＩ検出器で記録した。標本レベルのピクセルサイズは、１．９Å／
ピクセルであった。ＣＴＦパラメータを、ＣＴＦＦＩＮＤ３（Mindell, J. A. & Grigori
eff, N., J. Struct. Biol. 2003, 142, 334-347）を使用して評価し、位相フリッピング
をＳＰＩＤＥＲ（Shaikh, T. R. et al., Nature Protocols, 2008, 3, 1941-1974）で行
った。粒子を、ＢＯＸＥＲ（EMAN2; Tang, G. et al., J. Struct. Biol., 2007, 157, 3
8-46）を使用してＣＴＦ補正顕微鏡写真から自動的に選択した。１０％を超える非点収差
を有する画像を破棄した。全体で１，２２１個の粒子を７５個の顕微鏡写真から選択して
１２８ピクセル×１２８ピクセルのボックスにウィンドウ化した。画像を同じ平均値およ
び標準偏差に標準化して、約２００Åの低分解能カットオフでハイパスフィルターを通過
させた。それらを中心化した後ＭＳＡの第一ラウンドに供した。ＩＭＡＧＩＣ−４Ｄ（Ｉ
ｍａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の参照画像を使用しない分類を使用して
、最初の参照セットを得た。Ｃ９円柱状粒子の特徴的な側面図に対応する最善のクラスを
ＭＲＡの参照として使用した。ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体に関して、最初の三次元モデル
を、角度の再構成（Ｉｍａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって決定した
方向を有する複合体の１，２２１個の粒子を包含する最善の１２５個の特徴的な図（良好
なコントラストおよび明確な特徴を有する）から計算した。三次元マップをＭＲＡ、ＭＳ
Ａ、およびアンカーセット精密化の繰り返しラウンドによって精密化した。分解能は、０
．５の基準レベルに従ってフーリエシェル相関（ＦＳＣ）によって２４Åであると推定さ
れた（図５）。
マップおよび図面の可視化は、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ（Pettersen, E. F. et al.,
J. Comput. Chem., 2004, 25, 1605-1612）で実施した。
ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧ＋ＣｓｇＥポアの単一チャネル電流分析
陰性電場電位において、ＣｓｇＧポアは２つのコンダクタンス状態を示す。図５は、通
常（＋５０、０、および−５０ｍＶで測定）、および低コンダクタンス型（０、＋５０、
および−５０ｍＶで測定）それぞれの代表的な単一チャネル電流トレースを示す。全観察
時間（ｎ＝２２）の間に、２つの状態の間での変換は観察されず、コンダクタンス状態が
、長い寿命（数秒から数分の時間尺度）を有することを示している。左下のパネルは、＋
５０ｍＶおよび−５０ｍＶで獲得したＣｓｇＧポアの通常および低コンダクタンス型の電
流ヒストグラムを示す（ｎ＝３３）。通常および低コンダクタンス型を有するＣｓｇＧポ
アのＩ−Ｖ曲線を右下のパネルに示す。データは、少なくとも４回の独立した記録からの
平均値および標準偏差を表す。低コンダクタンス型の性質または生理的存在は不明である
。
図６は、アクセサリ因子ＣｓｇＥで滴定したＣｓｇＧチャネルの電気生理学の結果を示
す。プロットは、ＣｓｇＥ濃度の関数として、開、中間、および閉状態のチャネルの分画
を示す。ＣｓｇＧの開状態および閉状態を図６に図示する（それぞれ、０ｎＭおよび１０
０ｎＭ ＣｓｇＥ）。ＣｓｇＥの濃度を１０ｎＭ超に増加させると、ＣｓｇＧポアは閉鎖
する。この効果は＋５０ｍＶ（左）および−５０ｍＶ（右）で起こり、ポアの遮断がＣｓ
ｇＧポアへのＣｓｇＥ（計算ｐＩ ４．７）の電気泳動によって引き起こされる可能性を
除外する。頻度の低い（＜５％）中間状態は、開状態のチャネルコンダクタンスのほぼ半
分を有する。これはＣｓｇＥによって誘導されるＣｓｇＧチャネルの不完全な閉鎖を表し
うる；あるいは、これは電解質溶液の残留ＣｓｇＧモノマーが膜に埋もれたポアに結合す
ることによって引き起こされるＣｓｇＧダイマーの一時的な形成を表しうる。３つの状態
の分画を、単一チャネル電流トレースの全ての時点のヒストグラム分析から得た。ヒスト
グラムは、最大３つの状態のピーク面積を生じ、所定の状態の分画は、対応するピーク面
積を記録における他の全ての状態の合計で除することによって得た。陰性電場電位では、
２つの開コンダクタンス状態が識別され、これはＣｓｇＧに関する知見と類似である（ａ
を参照されたい）。開状態のチャネルの変化形はいずれもより高濃度のＣｓｇＥで遮断さ
れたことから、図６における「開状態」トレース（０ｎＭ）は、両方のコンダクタンス型
を組み合わせている。プロットにおけるデータは、３回の独立した記録の平均値および標
準偏差を表す。
結晶構造、サイズ排除クロマトグラフィー、およびＥＭは、洗浄剤抽出ＣｓｇＧポアが
、より高いタンパク質濃度で非ネイティブのテール−テールスタックダイマーを形成する
ことを示している（例えば、Ｄ９粒子としての２つのノナマー、図７）。これらのダイマ
ーはまた、単一チャネル記録でも観察することができる。上のパネルは、＋５０、０、お
よび−５０ｍＶ（左から右に）でのスタックされたＣｓｇＧポアの単一チャネル電流トレ
ースを示す。左下のパネルは、＋５０および−５０ｍＶで記録されたダイマーＣｓｇＧポ
アの電流ヒストグラムを示す。＋５０および−５０ｍＶでの実験的コンダクタンス、それ
ぞれ、＋１６．２±１．８および−１６．０±３．０ｐＡ（ｎ＝１５）は、２３ｐＡとい
う理論的計算値に近い。右下のパネルは、スタックされたＣｓｇＧポアのＩ−Ｖ曲線を示
す。データは、６回の独立した記録の平均値および標準偏差を表す。
ＣｓｇＥがスタックされたＣｓｇＧポアに結合して遮断する能力を、電気生理学によっ
て試験した。１０または１００ｎＭ ＣｓｇＥの存在下で＋５０ｍＶ（上）または−５０
ｍＶ（下）でのスタックされたＣｓｇＧポアの単一チャネル電流トレースを示す。電流ト
レースは、そうでなければ飽和濃度のＣｓｇＥがスタックされたＣｓｇＧダイマーに関し
てポア閉鎖を引き起こさないことを示している。これらの知見は、ＥＭおよび部位特異的
変異誘発によって識別されるように、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ接触域がヘリックス２およびＣ
ｓｇＧ周辺質キャビティの口部分にマッピングされることと良好に一致する（図５および
６）。
胆汁酸塩毒性アッセイ
外膜の透過性を、胆汁酸塩を含有するアガープレートでの増殖の減少によって調べた。
ｐＬＲ４２（Nenninger, A. A. et al., Mol. Microbiol., 2011, 81, 486-499）および
ｐＭＣ２（Robinson, L. S. et al., Mol. Microbiol., 2006, 59, 870-881）の両方を有
する大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２（Chapman, M. R. et al., Science, 2002, 295, 851-8
55）細胞（または誘導されたヘリックス２変異体）の１０倍連続希釈液（５ｍｌ）を、０
．２％（重量／容量）Ｌ−アラビノースを含むまたは含まない、１００ｍｇ・ｌ−１アン
ピシリン、２５ｍｇ・ｌ−１クロラムフェニコール、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＭｃＣ
ｏｎｋｅｙアガープレートにスポットした。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニ
ーの増殖を調べた。
単一チャネル電流記録
単一チャネル電流記録は、ＮａｎｉｏｎのＯｒｂｉｔ １６キットによって同時の高分
解能電気的記録を使用して実施した。簡単に説明すると、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の水平二重
層を、１６チャネルのマルチ電極キャビティアレイ（ＭＥＣＡ）チップ（ｌｏｎｅｒａ）
（del Rio Martinez, J. M., ACS NanoSmall, 2014, 5, 8080-8088）において（ピコリッ
トル容積以下の）マイクロキャビティの上に形成した。二重層の上または下のシスおよび
トランスキャビティはいずれも１．０Ｍ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８
．０を含有した。チャネルを膜に挿入するために、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８
．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５％Ｃ８Ｅ４、５ｍＭ ＬＤＡＯに
溶解したＣｓｇＧを、最終濃度９０〜３００ｎＭとなるようにシス区画に添加した。Ｃｓ
ｇＧチャネルとＣｓｇＥとの相互作用を試験するために、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に溶解した後者のタンパク質溶液を最終濃度０．１
、１、１０および１００ｎＭとなるようにシス区画に添加した。＋５０ｍＶおよび−５０
ｍＶの保持電圧で（シス側を接地）、Ｔｅｃｅｌｌａ Ｔｒｉｔｏｎ １６−チャネル増
幅器を使用してロウパスフィルタリング周波数３ｋＨｚおよびサンプリング周波数１０ｋ
Ｈｚで膜通過電流を記録した。電流のトレースをｐＣｌａｍｐスイートのＣｌａｍｐｆｉ
ｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。Ｏｒｉｇｉｎ ８．６
（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）（Movileanu, L, Nature Biotechnol., 2000, 18, 1091-1095）を
使用してプロットを作製した。
測定された電流を、３つのセグメント、すなわち膜貫通区画、周辺質前庭、および両者
を接続する内部チャネル狭窄で構成されるようにモデル化したＣｓｇＧのＸ線構造のポア
寸法に基づいて計算された電流と比較した。最初の２つのセグメントは、円錐形状のセグ
メントとなるようにモデル化されたが、狭窄は円柱状として表された。対応する抵抗Ｒ１
、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ、以下のように計算された：
Ｒ１＝Ｌ１／（πＤ１ｄ１κ）
Ｒ２＝Ｌ２／（πＤ２ｄ２κ）
Ｒ３＝Ｌ３／（πＤ１ｄ２κ）
式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３はセグメントの軸方向の長さであり、それぞれ、３．５、
４．０、および２．０ｎｍであると測定され、Ｄ１、ｄ１、Ｄ２、およびｄ２は、セグメ
ント１および２の最大および最小直径であり、それぞれ４．０、０．８、３．４、および
０．８ｎｍであると測定された。導電率κは、１０．６Ｓ・ｍ−１の値を有する。電流は
、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３ならびに電圧Ｖ＝５０ｍＶを
Ｉ＝Ｖ／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）
に代入することによって計算した。
アクセス抵抗は、予想される電流を有意に変化させないことが見出された。
上記の記録のような単一チャネル電流記録を、分析物の存在下で行ってもよく、それに
よってチャネルはバイオセンサーの役割を引き受けることができる。
モデルポリアラニン鎖によるＣｓｇＧ狭窄の分子動力学シミュレーション
ＣｓｇＧ狭窄は、図９に示されるようにＣ末端からＮ末端方向に細長いコンフォメーシ
ョンでチャネルの中を貫通するポリアラニン鎖によってモデル化されている。ＣｓｇＧト
ランスポーターの中の基質の通過はそれ自身、配列特異的ではない（Nenninger, A. A. e
t al., Mol. Microbiol., 2011, 81, 486-499; Van Gerven, N. et al, Mol. Microbiol.
2014, 91, 1022-1035 2014）。明確にするために、通過するポリペプチド鎖の推定の相
互作用をモデル化するためにポリアラニン鎖を使用した。モデル領域は、それぞれが残基
４７〜５８個を含む９個の同心円のＣｓｇＧ Ｃ−ループで構成される。狭窄内部の側鎖
を、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６と表示するスティック表示で示す。狭窄内部のポリアラ
ニン残基（＋１から＋５と表示される残基）の１０Å以内の溶媒分子（水）を点で示す。
図９ｃは、図９ｂに示されるように位置するポリアラニン鎖のモデル化溶媒和を示し、明
確にするためにＣ−ループを除去している（ポリアラニン鎖全体の１０Å以内の溶媒分子
を示す）。Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の環の最高点では、ポリアラニン鎖の溶媒和は、
ペプチド骨格とアミドクランプ側鎖とをつなぐ単一の水シェルに低減される。Ｔｙｒ５１
環におけるほとんどの側鎖は、ＣｓｇＧ（およびＣｓｇＧＣ１Ｓ）Ｘ線構造で観察された
その内向きの中心を向く位置と比較して溶媒に向かって回転している。モデルは、ＡＭＢ
ＥＲ９９ＳＢ−ＩＬＤＮ（Lindorff-Larsen, K. et al., Proteins 2010, 78, 1950-1958
）力場を使用し、Ｃ−ループ末端の残基（Ｇｌｎ４７およびＴｈｒ５８）のＣａ原子の位
置が制限されている、ＧＲＯＭＡＣＳ（Pronk, S. et al., Bioinformatics, 2013, 29,
845-854）による４０ナノ秒の全原子の明白な溶媒分子動力学シミュレーションの結果で
ある。
核酸シークエンシングのためのＣｓｇＧナノポアの使用
Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）は、膜内に位置する変異体または野生型
ＣｓｇＧナノポアがポアの中でのオリゴマープローブＤＮＡ鎖の制御された運動を可能に
するために分子モーターとして使用されうる。ポアに電圧を印加すると、ナノポアのいず
れかの側の塩溶液中のイオンの運動により電流が生じうる。プローブＤＮＡがポアの中を
移動すると、ポアの中のイオン流はＤＮＡによって変化する。この情報は、配列依存的で
あることが示されており、実施例１４における上記の測定などの電流測定から正確にプロ
ーブの配列を読み取ることができる。
本実施例は、ＣｓｇＧ内のＤＮＡの挙動を調べるために実行されるシミュレーションを
記述する。
材料および方法
ＤＮＡ転位に対するＣｓｇＧ−Ｅｃｏおよび様々な変異体のエネルギー障壁の程度を調
べるために操舵分子動力学シミュレーションを実施した。シミュレーションは、ＧＲＯＭ
ＡＣＳパッケージバージョン４．０．５を使用して、ＧＲＯＭＯＳ ５３ａ６力場および
ＳＰＣ水モデルによって実施した。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（配列番号３９０）の構造を、タン
パク質データバンクから受託コード４ＵＶ３として得た。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ変異体のモデ
ルを作成するために、野生型のタンパク質構造をＰｙＭＯＬを使用して変異させた。調べ
た変異体は、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ）（変異Ｆ５６Ａを有する配列番号３９０）
、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ）（変異Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓを有する配列番
号３９０）、およびＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｙ５１Ａ）（変異Ｆ５６
Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａを有する配列番号３９０）であった。
次に、ＤＮＡをポアに入れた。異なる２つの系を設定した：
ｉ．ポアに、狭窄領域の真上（残基５６環の上おおよそ５〜１０Å）に１つのグアニンヌ
クレオチドを入れた。
ｉｉ．ＤＮＡの一本鎖（ｓｓＤＮＡ）を、５‘末端がポアのベータ−バレル側に向かうよ
うにポアの軸に沿って入れた。この設定において、ｓｓＤＮＡは、ポアの全長にわたって
予めその中を貫通していた。
次に、シミュレーションボックスを溶媒和して、最急降下アルゴリズムを使用してエネ
ルギーを最小限にした。
それぞれのシステムを、ＢｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタットおよびＢｅｒｅｎｄｓｅｎ
バロスタットを３００Ｋとなるように使用してＮＰＴアンサンブルにおいてシミュレート
した。シミュレーションを通して、ポアの骨格に制限を適用した。
ＤＮＡをポアの中から引き抜くために、１グアニンシミュレーションにおいてリン原子
に引き抜き力を適用した。ｓｓＤＮＡシミュレーションでは、引き抜き力を鎖の５‘末端
のリン原子に適用した。引き抜き力は、上記のＤＮＡリン原子と、ポア軸に対して平行に
定速で移動する想像上の点との間にばねをつなぐことによって、定速で適用した。ばねは
いかなる形状も有しないか、またはいかなる流体力学的抗力も受けないことに注意された
い。ばね定数は５ｋＪｍｏｌ−１Å−２に等しかった。
結果
１Ｇ転位
図１２に示すように、引き抜き力の時間に対するプロットは、ヌクレオチドが、野生型
ＣｓｇＥ−Ｅｃｏポアにおけるフェニルアラニン残基Ｆ５６の環の中に入るには大きい障
壁が存在することを示している。調べたＣｓｇＧ−Ｅｃｏ変異体に関してグアニン転位に
対する有意な障壁は観察されなかった。
ｓｓＤＮＡ転位
ｓｓＤＮＡ転位に関して、それぞれの実行が異なる引き抜き速度（１００Å／ナノ秒お
よび１０Å／ナノ秒）を適用する２つのシミュレーションをポア毎に実行した。より速い
引き抜き速度シミュレーションを図示する図１３に示すように、野生型ＣｓｇＧポアは、
ｓｓＤＮＡの転位を可能にするために最大の引き抜き力を必要とした。より遅い引き抜き
速度シミュレーションを図示する図１４に示すように、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（野生型、配列
番号３９０）およびＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ）ポアはいずれも、ｓｓＤＮＡ転位を
可能にするためには最大の力を適用する必要があった。ｓｓＤＮＡ転位にとって必要な引
き抜き力をＣｓｇＧとＭｓｐＡベースラインポアの間で比較すると、類似のレベルのｓｓ
ＤＮＡ転位を許容するためにはＣｓｇＧポアの変異が必要であることを示唆している。
本実施例は、いくつかのＣｓｇＧ変異体の特徴づけを記述する。
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ構築物Ｘ（最終濃度０．１ｎＭ、構築物Ｘの概略図および
説明に関しては図２２を参照されたい）を、Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１
３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有する配列
番号４１２、緩衝液（１５１．５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、５％グリセロ
ール、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で提供されるナノポア系に最終濃度１０ｎＭで
添加）で、室温で５分間プレインキュベートした。５分後、ＴＭＡＤ（１００μＭ）をプ
レミクスに添加して、混合物をさらに５分間インキュベートした。最後に、ＭｇＣｌ２（
ナノポア系に添加して最終濃度１．５ｍＭ）、ＡＴＰ（ナノポア系に添加して最終濃度１
．５ｍＭ）、ＫＣｌ（ナノポア系に添加して最終濃度５００ｍＭ）、およびリン酸カリウ
ム緩衝液（ナノポア系に添加して最終濃度２５ｍＭ）をプレミクスに添加した。
緩衝液（２５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ
）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロックコポリマ
ーに挿入した多種のＣｓｇＧナノポア１つから、電気的測定を得た。ブロックコポリマー
に挿入した１つのポアが得られた後、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（Ｉ
ＩＩ）、ｐＨ８．０）を系の中に流して過剰量のいかなるＣｓｇＧナノポアも除去した。
５００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ リン酸カリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ
ＡＴＰ、ｐＨ８．０の１５０μｌを系に流した。１０分後、５００ｍＭ ＫＣｌ、２５
ｍＭリン酸カリウム、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ８．０の１５
０μｌを系に流して、次いで、酵素（Ｔ４ Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ
／Ａ３６０Ｃ、最終濃度１０ｎＭ）、ＤＮＡ構築物Ｘ（最終濃度０．１ｎＭ）、燃料（Ｍ
ｇＣｌ２、最終濃度１．５ｍＭ、ＡＴＰ、最終濃度１．５ｍＭ）プレミックス（全体で１
５０μｌ）をナノポア１つの実験系に流した。実験を−１２０ｍＶで実行して、ヘリカー
ゼ制御ＤＮＡ運動をモニターした。
結果
範囲の増加を示すポア（図１５〜１７、および２７〜３９）
ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３
５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０)は、約１０ｐＡの範囲を有する（図
１５（ａ）を参照されたい）が、以下のＣｓｇＧ−Ｅｃｏポア変異体は、電流範囲の増加
を示した−
１− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｎ−Ｆ５６Ａ−Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｅ２０１Ｎ
−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ／Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１
８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり
、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図１５（ｂ）
を参照されたい）。
２− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ５５Ａを有し
、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９
０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図１５（ｃ）を参照されたい）。
３− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ｓ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ５５Ｓを有し
、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９
０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図１６（ａ）を参照されたい）。
４− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｎを有し
、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９
０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図１６（ｂ）を参照されたい）。
５− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５
１Ａ／Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合
している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図１６（ｃ）を参照されたい）
。
６− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｆ５６Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５
１Ａ／Ｆ５６Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合
している配列番号３９０）は約２０ｐＡの範囲を示した（図１７（ａ）を参照されたい）
。
７− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９
（変異Ｙ５１Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５で
あり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図１７（
ｂ）を参照されたい）。
８− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｆ５６Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９
（変異Ｙ５１Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５で
あり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図１７（
ｃ）を参照されたい）。
１３− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｈ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｈを有
し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３
９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図２７を参照されたい）。
１４− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｑを有
し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３
９０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図２８を参照されたい）。
１５− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｔ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｔを有
し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３
９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図２９を参照されたい）。
１６− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｓ５４Ｐ／Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｓ
５４Ｐ／Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結
合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図３０を参照されたい）。
１７− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ
５１Ｔ／Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結
合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図３１を参照されたい）。
１８− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｐ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｐを有
し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３
９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図３２を参照されたい）。
１９− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ａを有
し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３
９０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図３３を参照されたい）。
２０− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ
５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結
合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図３４を参照されたい）。
２１− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ
５５Ｓ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結
合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図３５を参照されたい）。
２２− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））
９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５
であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図３６
を参照されたい）。
２３− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異
Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端
に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図３７を参照されたい）
。
２４− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ
５１Ｑ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結
合している配列番号３９０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図３８を参照されたい）。
２５− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ
５１Ａ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結
合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図３９を参照されたい）。
スループットの増加を示すポア（図１８および１９）
図１８および１９から認められうるように、以下の変異体ポア（以下の９〜１２）は、
４時間でチャネルあたり多数のヘリカーゼ制御ＤＮＡ運動（図１８および１９においてＸ
と表示）を示したのに対し、図１８（ａ）に示すＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（
Ｃ））９（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列
番号３９０）は、４時間でチャネルあたりわずか１または２のヘリカーゼ制御ＤＮＡ運動
（図１８（ａ）においてＸと表示）をしばしば示し、その代わりに延長したブロック領域
（図１８（ａ）においてＹと表示）を示した。
９− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ
））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列
番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）（図１８（ｂ））。
１０− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｎ−Ｅ２０１Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−Ｓｔ
ｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを有し、
ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０
）（図１８（ｃ））。
１１− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｄ１９５Ｎ−Ｅ２０１Ｎ−Ｅ２
０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０
１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結
合している配列番号３９０）（図１９（ａ））。
１２− ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｄ１９５Ｎ−Ｅ２０１Ｒ−Ｅ２
０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０
１Ｒ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結
合している配列番号３９０）（図１９（ｂ））。
挿入の増加を示すポア（図２０および２１）
図２０および２１の比較によってわかるように、図２１に示される変異体ポアＣｓｇＧ
−Ｅｃｏ−（Ｔ１５０Ｉ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｔ１５０Ｉを有し、Ｓｔｒｅ
ｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は、Ｃ
ｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５で
あり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）ポア（図２０を参照されたい）と比較し
て増加したポア数（約４〜５倍）で膜に存在した。図２０および２１の矢印は、４時間の
実験でブロックコポリマーに挿入されたＣｓｇＧ−Ｅｃｏナノポアの数を図示した（図２
０の１３０〜１４０個、および図２１の１〜１１個は、それぞれ個別のナノポア実験に対
応した）。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列
番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している、配列番号３９０）に関して、３つの実験は
、１つのナノポアの挿入を示したが、変異体ポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｔ１５９Ｉ−Ｓ
ｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９）に関して、それぞれの実験は、少なくとも１つのナノポアの挿
入を示し、いくつかの実験は多数のポア挿入を示した。
本実施例は、ＣｓｇＧポアを精製するために開発された大腸菌（E.coli）精製法を記述
する。
材料および方法
ポリペプチドＰｒｏ−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ
（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合しており、Ｐｒｏが配列番号４３６であ
り、Ｎ−末端に結合している配列番号３９０）をコードするＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ
ＵＳＡ Ｉｎｃ．が合成し、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＴ７ベクターにクローニ
ングした。ｐＴ７ベクターのタンパク質発現を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクト
ピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。ＤＮＡ溶液の濃度を４００ｎｇ／μｌに調節
した。ＤＮＡ（１μｌ）を使用してＬｅｍｏ２１（ＤＥ３）コンピテント大腸菌（E.coli
）細胞（５０μｌ、ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２５２８Ｈ）を形質転換した。形質転換の前
に、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）細胞（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）からＣｓｇＧ遺伝子をノックアウトした。次に、細胞を、アンピシリン（０．１ｍｇ
／ｍｌ）を含むＬＢ寒天に播種して、３７℃で約１６時間インキュベートした。
アンピシリンを含有するＬＢプレート上で増殖させた細菌コロニーは、ＣｓｇＧプラス
ミドを取り込んだ。そのような１つのコロニーを使用して、カルベニシリン（０．１ｍｇ
／ｍｌ）を含有するＬＢ培地（１００ｍｌ）の開始培養物に接種した。開始培養物を、Ｏ
Ｄ６００が１．０〜１．２に達するまで撹拌しながら３７℃で増殖させた。開始培養物を
使用して、カルベニシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびラムノース（５００μＭ）を含有
する新しいＬＢ培地５００ｍＬにＯ．Ｄ．６００が０．１となるように接種した。培養物
を、ＯＤ６００が０．６に達するまで、３７℃で撹拌しながら増殖させた。次に、培養物
の温度を１８℃に調節して、ＩＰＴＧ（最終濃度０．２ｍＭ）を添加して誘導を開始した
。誘導は、撹拌しながら１８℃で約１８時間行った。
誘導後、培養物を６，０００ｇで３０分間の遠心分離によりペレットにした。ペレット
を、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５３９１３８）、ベンゾナ
ーゼヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ１０１４）、および１×バグバスター（Ｍｅｒｃｋ
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、７０９２１）ｐＨ８．０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ
ＮａＣｌに懸濁させた（ペレット１グラムあたり緩衝液約１０ｍｌ）。懸濁液を、完全に
均一になるまで十分に混合した後、試料を４℃のローラーミキサーに約５時間移した。溶
解物を２０，０００ｇで４５分間の遠心分離によりペレットにして、上清を０．２２μｍ
のＰＥＳシリンジフィルターを通してろ過した。ＣｓｇＧを含有する上清（試料１として
知られる）を、カラムクロマトグラフィーによる精製のために残した。
試料１を５ｍｌ Ｓｔｒｅｐ Ｔｒｅｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用
した。カラムを、１０カラム容積の安定なベースラインが維持されるまで２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ＤＤＭ、ｐＨ８によって洗
浄した。次いで、カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０
．０１％ＤＤＭ、ｐＨ８によって洗浄後、１５０ｎＭ緩衝液に戻した。１０ｍＭデスチオ
ビオチンによって溶出を行った。ＣｓｇＧタンパク質のＳｔｒｅｐ ｔｒａｐ（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）精製のクロマトグラフィートレースの一例を図２３に示す。溶出ピ
ーク１をＥ１と表示する。図２４は、初回Ｓｔｒｅｐ精製後のＣｓｇＧ−Ｅｃｏタンパク
質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ可視化の例を示す。レーン１〜３は、矢印で示されるよう
にＣｓｇＧタンパク質を含有する主要な溶出ピーク（図２３においてＥ１と表示）を示す
。レーン４〜６は、混入物を含有する主要な溶出ピーク（図２３においてＥ１と表示）の
テール部の溶出分画に対応した。
溶出ピークをプールして、６５℃で１５分間加熱し、熱に不安定な混入タンパク質を除
去した。加熱した溶液を２０，０００ｇで１０分間の遠心分離に供して、ペレットを破棄
した。上清を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０
１％ＤＤＭ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８中で１２０ｍｌ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ２００カラ
ム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるゲルろ過に供した。タンパク質のトリプトファ
ン成分が少ないために２２０ｎｍでモニタリングを行った。試料は約５５ｍＬの容積で溶
出した（図２５は、サイズ排除カラムトレースを示し、５５ｍＬの試料ピークを星印で表
示する）。溶出ピークを４〜２０％ＴＧＸ（図２６、Ｂｉｏ Ｒａｄ）で泳動させて、目
的のポアＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番
号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）の存在を確認した。同定され
た分画をプールして５０ｋＤ Ａｍｉｃｏｎスピンカラムによって濃縮した。
本実施例は、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））
９（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ変異を有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ
−末端ポア変異体２０に結合している配列番号３９０）とＴ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ
１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６
０Ｃを有し、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２である配列番号４１２）との相互作用を調べるた
めに実行するシミュレーションを記述する。
シミュレーション方法
ＧＲＯＭＡＣＳパッケージバージョン４．０．５を使用して、ＧＲＯＭＯＳ ５３ａ６
力場およびＳＰＣ水モデルによってシミュレーションを実施した。
ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（Ｙ５１Ｔ／
Ｆ５６Ｑ変異を有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端ポア変異
体２０に結合している配列番号３９０）モデルは、タンパク質データバンクの受託コード
４ＵＶ３および４Ｑ７９で見出されるＣｓｇＧの結晶構造に基づいた。関連する変異を、
ＰｙＭＯＬを使用して作製した。得られたポアモデルを、次に最急降下アルゴリズムを使
用してエネルギーを最小限にした。Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ
／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有し、（ΔＭ１
）Ｇ１Ｇ２である配列番号４１２）モデルは、タンパク質データバンクの受託コード３Ｕ
ＰＵに見出されるＤｄａ１９９３構造に基づいた。この場合も、関連する変異を、ＰｙＭ
ＯＬを使用して作製し、モデルを最急降下アルゴリズムを使用してエネルギーを最小限に
した。
Ｔ４ Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ
１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有し、（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２である配列番号４１２）
モデルを次に、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９
（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−
末端ポア変異体２０に結合している配列番号３９０）の上に置いた。異なる初回酵素コン
フォメーション（実行１〜３（０ｎｓ）、図４０を参照されたい）について、３つのシミ
ュレーションを実施した。
全ての酵素コンフォメーションにおいて、ＤＮＡの５‘末端がポアの方向を向くように
酵素を配置したところ、酵素はシミュレーションを通して制限を受けなかった。ポアの骨
格は制限され、シミュレーションボックスは溶媒和された。系を、Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎサ
ーモスタットおよびＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタットを３００Ｋで使用してＮＰＴアンサ
ンブルにおいて４０ナノ秒間シミュレートした。
酵素とポアとの間の接触を、ＧＲＯＭＡＣＳ分析ソフトウェアとローカルな手書きコー
ド（locally written code）の両方を使用して分析した。以下の表は、ポアおよび酵素ア
ミノ酸の両方について観察された接触数を示す。表６〜８は、酵素上のアミノ酸接点と相
互作用するポア上のアミノ酸接点を示す。３つのシミュレーションのうち２つにおいて、
酵素はポアの上部で傾斜する（実行２および３（２０、３０、および４０ナノ秒）、図４
０および４１を参照されたい）。実行１は、酵素が傾斜せずそのため、表６において高い
相互作用を有することが示された点を、ポアキャップ上の酵素安定性を増加させるために
最適化できることを示している。
Figure 2021078500
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チャネル狭窄においてＣｓｇＧナノポアが核酸を捕捉する能力
核酸シークエンシングのためのナノポアの使用は、ナノポアによる一本鎖ＤＮＡの捕捉
および貫通を必要とする。本実施例において、ＣｓｇＧ ＷＴタンパク質の単一チャネル
電流トレースを、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有するＤＮＡヘアピンの存在下で追跡し
た。図５６に示す本実施例のトレースは、＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶの間隔（矢印で示
す）で測定される電位に応答して変化する電流を示す。最後の＋５０ｍＶセグメントにお
ける下向き電流の遮断は、内部ポア構築の中への一本鎖ヘアピンの末端が貫通しているこ
とを表し、ほぼ完全な電流の遮断が起こる。電場を−５０ｍＶに逆転させると、ポアの電
気泳動の遮断解除が起こる。新たな＋５０ｍＶエピソードによって、再度ＤＮＡヘアピン
結合およびポア遮断が起こる。＋５０ｍＶセグメントにおいて、ヘアピン構造のアンフォ
ールディングによって、電流遮断の逆転によって示される電流遮断の終了が起こりうる。
配列３’ ＧＣＧＧＧＧＡＧＣＧＴＡＴＴＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＣＡＧＣＴ
ＧＧＣＴＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣ Ｃ
ＧＡＴＣ−５’（配列番号４４１）を有するヘアピンを最終濃度１０ｎＭで小室のシス側
に添加した。
本実施例は、変化した内部狭窄を有する変異体ＣｓｇＧポアの生成を記述する。
本実施例において、狭窄ループにおける配列ＰＹＰＡ（残基５０〜５３）がＧＧに置換
されている変異体ＣｓｇＧポアであるＣｓｇＧ−ΔＰＹＰＡに関して、安定性およびチャ
ネル特性を証明する。この変異体に関して３８〜６３位の狭窄モチーフは、配列番号３５
４に対応する。この変異は、ポアの読み取りヘッド、すなわちセンシング用途の際に測定
される導電率が基質の結合またはポアの貫通の性質に対して最も感受性があるポアの最も
狭い部分、の複雑さを低減するために、ポア狭窄からＹ５１の除去および狭窄ループの短
縮を予見している。ＰＹＰＡ配列の置換は、ＣｓｇＧノナマーの安定性を保持し、図５７
に示されるように導電率の増加を有するポアが得られる。
ＣｓｇＧ−ΔＰＹＰＡポア変異体を、Ｎａｎｉｏｎ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
のＯｒｂｉｔ １６キットによる同時の高分解能電気的記録を使用する単一チャネル電流
記録によって分析した。簡単に説明すると、１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３
−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の水平二重層を、１６−チ
ャネルマルチ電極キャビティアレイ（ＭＥＣＡ）チップ（ｌｏｎｅｒａ、Ｆｒｅｉｂｕｒ
ｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）５１においてマイクロキャビティ（ピコリットル容積以下の）の上
に形成した。二重層の上および下のシスおよびトランスキャビティの両方が、１．０Ｍ
ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含有した。チャネルを膜に挿入する
ために、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０
．５％Ｃ８Ｅ４、５ｍＭ ＬＤＡＯに溶解したＣｓｇＧを、最終濃度１００ｎＭでシス区
画に添加した。Ｈ膜通過電流を、Ｔｅｃｅｌｌａ Ｔｒｉｔｏｎ １６チャネル増幅器を
使用して、ロウパスフィルタリング周波数３ｋＨｚおよびサンプリング周波数１０ｋＨｚ
で＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶ（シス側を接地）の保持電位で記録した。電流のトレース
をｐＣｌａｍｐスイート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）のＣｌａｍｐ
ｆｉｔを使用して分析した。
本実施例は、細菌アミロイド分泌チャネルＣｓｇＧに対する構造的および力学的洞察を
記述する。
Ｃｕｒｌｉは、バクテロイデス属（Bacteroidetes）およびプロテオバクテリア（Prote
obacteria）（主にａおよびｃ綱）１〜３によって形成される菌膜バイオフィルムにおけ
る細胞外マトリクスの主要なタンパク質成分を構成する機能的アミロイド線維である。こ
れらは、病原性の株において適応度の利点をもたらし、細菌血症の際に強い炎症促進性応
答を誘導する１，４，５。Ｃｕｒｌｉの形成は、外膜リポタンパク質ＣｓｇＧおよび２つ
の可溶性アクセサリタンパク質であるＣｓｇＥおよびＣｓｇＦ６，７を含む専用のタンパ
ク質分泌機構を必要とする。本明細書において、本発明者らは、非脂質化可溶性型ならび
にそのネイティブな膜抽出コンフォメーションの大腸菌（Escherichia coli）ＣｓｇＧの
Ｘ線構造を報告する。ＣｓｇＧは、二重層を横切る３６ストランドのβ−バレルを生じて
、周辺質のケージ様の前庭に接続される９個のアンチコドン結合ドメイン様単位で構成さ
れるオリゴマー輸送複合体を形成する。膜貫通ドメインと周辺質ドメインとは、分泌ポア
の中に細長いポリペプチド基質を誘導しうる、３つのスタックされた同心円のフェニルア
ラニン、アスパラギン、およびチロシン環で構成される０．９ｎｍのチャネル狭窄によっ
て隔てられている。特異性因子ＣｓｇＥは、分泌チャネルの周辺質面に結合して閉じるノ
ナマーアダプターを形成し、２４，０００Å３の狭窄前小室を作製する。本発明者らの構
造、機能、および電気生理学分析は、ＣｓｇＧが、拡散に基づくエントロピー駆動性の輸
送機構を用いると予想される無ゲートの非選択的タンパク質分泌チャネルであることを暗
示している。
Ｃｕｒｌｉは、アミロイド原線維の構造および物理的特徴を有する細菌表面付属器であ
り、ヒトの変性性疾患７〜９由来のものが最もよく知られている。しかし、ｃｕｒｌｉな
どの細菌アミロイドの役割は、バイオフィルム形成を促進することである４、１０。タン
パク質ミスフォールディングの産物である病原性のアミロイドとは異なり、ｃｕｒｌｉの
形成は、２つの専用のオペロン、大腸菌（Escherichia coli）におけるｃｓｇＢＡＣ（ｃ
ｕｒｌｉ特異的遺伝子ＢＡＣ）およびｃｓｇＤＥＦＧ（図４６)6,7においてコードされる
タンパク質によって調整されている。分泌後、ＣｓｇＢは、ＣｓｇＡサブユニットの核を
形成してｃｕｒｌｉ線維となる７，１１，１２。ＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの分泌および細
胞外沈着はそれぞれ、２つの可溶性アクセサリ因子であるＣｓｇＥおよびＣｓｇＦ、なら
びに外膜に位置する２６２残基のリポタンパク質であるＣｓｇＧに依存する１３〜１６。
加水分解可能なエネルギー源または外膜でのイオン勾配がないために、ＣｓｇＧは、代替
のエネルギー賦活輸送機構を通して作動しなければならないタンパク質転位因子の特殊な
クラスに分類される。構造モデルが不在であるため、ＣｓｇＧが生体膜を超えて調節され
た様式で非常に安定なアミロイド様の線維の分泌および集合をどのように促進するのかに
関する動力学的研究はこれまで、不可解なままであった。
外膜に挿入する前に、リポタンパク質は、リポタンパク質局在（Ｌｏｌ）経路１７によ
って周辺質を超えて誘導される。本発明者らは、ポア形成タンパク質および毒素で観察さ
れるプレポア形態１８と類似の、可溶性の周辺質中間体として、非脂質化ＣｓｇＧ（Ｃｓ
ｇＧＣ１Ｓ）を単離できることを観察した。ＣｓｇＧＣ１Ｓは、別個のオリゴマー複合体
の小さい分画に加えて、モノマーとして主に見出された（図４７）１９。可溶性のＣｓｇ
ＧＣ１Ｓオリゴマーは、結晶化され、その構造は２．８Åであると決定され、テール−テ
ール相互作用で結合した２つの環状オクタマー複合体（Ｃ８）からなる８回二平面対称性
（Ｄ８）を有するヘキサデカマー粒子であることが判明した（図４７および図４６）。Ｃ
ｓｇＧＣ１Ｓプロトマーは、アミノおよびカルボキシ末端（それぞれ、αＮおよびαＣ、
図４２および図４８ａ〜ｃ）で２つのα−ヘリックスと共に伸長するアンチコドン結合ド
メイン（ＡＢＤ）様の折り畳みを示す。さらなるＣｓｇＧ特異的エレメントは、β１とα
１とを連結する細長いループであり、ループにおける２つの挿入は、β３−β４およびβ
５−α３と、隣接するモノマー間でのパッキングによってＣｓｇＧオリゴマー化に関係す
る細長いα２ヘリックスを接続する（図４２ｂ）。さらに、β３−β５シートの背部と細
長いβ１−α１ループの間にプロトマー間の接点が形成される（図４８ｄ、ｅ）。
ＣｓｇＧＣ１Ｓの構造において、α１をＮ−末端脂質アンカーに連結させる残基１〜１
７は、無秩序であり、明白な膜貫通（ＴＭ）ドメインを識別することができない（図４２
）。ＣｓｇＧＣ１Ｓおよびネイティブの膜抽出ＣｓｇＧの全反射測定フーリエ変換赤外分
光法（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）は、膜抽出ＣｓｇＧがβシート領域（１，６２５〜１，６３０
ｃｍ−１）においてより高い吸収を有すること、ならびにランダムコイルおよびα−ヘリ
カル領域（それぞれ、１，６４５〜１，６５０ｃｍ−１および１，６５６ｃｍ−１、図４
３ａ）で同時に低減することを明らかにし、膜会合ＣｓｇＧがβ−バレルドメインを含有
することを示唆している。β鎖形成の候補となる一連の配列は、β３−β４（残基１３４
〜１５４）とβ５−α３（残基１８４〜２０４）とを接続する秩序化が不良な細長いルー
プに見出された；これらが欠失すると、ｃｕｒｌｉ形成が失われた（図４３ｂ）。洗浄剤
抽出ＣｓｇＧの結晶構造は、両方の領域のコンフォメーションの再配列により２つの隣接
するβ−ヘアピンが形成され、β３−β４（ＴＭ１）およびβ５−α３（ＴＭ２）によっ
て形成されるβシートを伸長させることを確認した（図４３ｃ）。ＣｓｇＧオリゴマーに
おいてそれらが近接位置にあることにより、複雑な３６ストランドのβ−バレルを生じた
（図４３ｄ）。結晶化されたＣｓｇＧＣ１ＳオリゴマーはＤ８対称性を示したが、Ｃｓｇ
Ｇ構造はＤ９対称性を示し、ＣｓｇＧプロトマーは、中心軸に対して５°回転し、放射軸
に沿って４Åの並進を除き、同等のプロトマー間接触を保持した（図４７）。この知見は
、膜抽出ＣｓｇＧに関してＣ９およびＤ９対称性のみを見出した単粒子電子顕微鏡によっ
て明らかとなった溶液中のオリゴマー状態と一致する（図４７）。非脂質化試料中にモノ
マーが主に存在すること、および膜結合タンパク質との対称性のミスマッチは、膜挿入の
前に、ＣｓｇＧがモノマーのＬｏｌＡ−結合型で外膜を標的とすること、ならびにＣ８お
よびＤ８粒子がＣｓｇＧＣ１Ｓの高濃度溶液のアーチファクトであることを主張する。さ
らに、本発明者らは、単離された大腸菌（E.coli）外膜において、観察されたテール−テ
ールダイマー形成に閉じ込められる残基をシステインに置換すると、マレイミドポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ、５ｋＤａ；図４９）による標識に対してアクセス可能であるこ
とから、Ｄ９複合体ではなくてＣ９ノナマーが生理的に重要な粒子を形成することを示し
ている。
このため、ＣｓｇＧは、幅１２０Åで高さ８５Åのノナマー輸送複合体を形成する。複
合体は、内径４０Åの３６ストランドのβバレルを通して外膜を横切る（図４３ｅ）。Ｎ
−末端脂質アンカーは、隣接するプロトマーを包む１８残基のリンカーによってコアドメ
インから隔てられている（図４８ｄ）。Ｎ−末端Ｃｙｓにおけるジアシルグリセロールお
よびアミド連結アシル鎖は、電子密度マップでは分解されていないが、Ｌｅｕ２の位置に
基づいて、脂質アンカーは、β−バレルの外壁に隣接すると予想される。周辺質側では、
トランスポーターは、ヘリックス２によって形成された５０Åの開口部を周辺質に開く、
内径３５Åで高さ４０Åの溶媒アクセス可能な大きいキャビティを形成する（図４３ｅ）
。その頂点において、この周辺質前庭は、β１とα１とを接続する保存された１２残基の
ループ（Ｃ−ループ；図４３ｅおよび４４ａ、ｂ）によってＴＭチャネルから隔てられて
おり、これは分泌導管を９．０Åの溶媒除外直径へと狭窄する（図４４ａ、ｃ）。これら
のポアの寸法は、残基５個が狭窄の高さに及ぶ１または２個の（例えば、ループ構造の）
細長いポリペプチドセグメントの存在と適合する（図５０）。狭窄の管腔内層は、残基Ｔ
ｙｒ５１、Ａｓｎ５５、およびＰｈｅ５６の側鎖によって形成された３つのスタックされ
た同心円の環で構成される（図４４ａ、ｂ）。炭疽菌ＰＡ６３毒素において、位相学的に
同等の同心円のＰｈｅ環（Φ−クランプと呼ばれる）は、転位チャネルの入口に存在し、
ポリペプチドの捕捉および通過を触媒する２０〜２２。ＣｓｇＧ様転位因子の多重配列ア
ライメントは、Ｐｈｅ５６の絶対的な保存およびＡｓｎ５５のＳｅｒまたはＴｈｒへの保
存的変化を示す（図５１）。Ｐｈｅ５６またはＡｓｎ５５からＡｌａへの変異によって、
ｃｕｒｌｉ産生がほぼ失われるが（図４４ｄ）、Ａｓｎ５５からＳｅｒへの置換は、野生
型の分泌レベルを保持し、Φ−クランプのスタックされた立体配置の後に、ＣｓｇＧ狭窄
に水素結合ドナー／アクセプターが続く必要性を共に暗に示す（図４４ｂおよび図５１）
。
平面リン脂質二重層に再構成されたＣｓｇＧの単一チャネル電流記録によって、標準的
な電解質条件および＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶの電位を使用して、それぞれ４３．１±
４．５ｐＡ（ｎ＝３３）または−４５．１±４．０ｐＡ（ｎ＝１３）の定常電流が得られ
た（図４４ｅ、ｆおよび図５２）。観察された電流は、単純な３セグメントポアモデルお
よびＸ線構造で見られる中心狭窄の寸法に基づいて計算された４６．６ｐＡという予想さ
れる値と良好に一致した（図４４ｃ）。第二の低コンダクタンスコンフォメーションもま
た、陰性電場電位で観察することができた（−２６．２±３．６ｐＡ（ｎ＝１３）；図５
２）。しかし、この化学種が生理的条件で存在するか否かは不明である。
本発明者らの構造データおよび単一チャネル記録は、ＣｓｇＧが無ゲートのペプチド拡
散チャネルを形成することを暗示している。モデルペプチド拡散チャネルであるＰＡ６３
において、ポリペプチドの通過は、転位チャネルにおける拡散ステップを調整するΔｐＨ
駆動性のブラウンラチェットに依存する２０〜２２。しかし、そのようなプロトン勾配は
、外膜には存在せず、代替の駆動力を必要とする。高濃度のＣｓｇＧは周辺質ポリペプチ
ドの非選択的拡散的漏出を促進するが、分泌はネイティブ条件ではＣｓｇＡに特異的であ
り、周辺質因子ＣｓｇＥを必要とする１６，２３。過剰量のＣｓｇＥの存在下では、精製
ＣｓｇＧは、ネイティブＰＡＧＥにおいてより遅く移動する化学種を形成する（図４５ａ
）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、この新しい化学種が、１：１の化学量論で存在するＣｓｇ
Ｇ−ＣｓｇＥ複合体からなることを示している（図４５ｂ）。プルダウンアフィニティ精
製により単離されたＣｓｇＧ−ＣｓｇＥのクライオ電子顕微鏡（クライオ−ＥＭ）による
可視化により、ＣｓｇＧノナマーに対応する９回対称粒子、ならびに単粒子ＥＭおよびサ
イズ排除クロマトグラフィーによっても同様に観察されたＣ９ ＣｓｇＥオリゴマーとサ
イズおよび形状が類似の、周辺質前庭の入口部でさらなるキャッピング密度が明らかとな
った（図４５ｃ〜ｅ、および図５３）。観察されたＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ接触界面の位置は
、ＣｓｇＧヘリックス２における点突然変異を遮断することによって裏付けられた（図５
３）。キャッピング機能と一致して、単一チャネル記録により、転位因子に対するＣｓｇ
Ｅの結合がそのイオンコンダクタンスの特異的サイレンシングを引き起こすことが示され
た（図４５ｆおよび図５２）。このＣｓｇＥによるチャネルのキャッピングは、ＣｓｇＥ
ノナマー結合の関数において全か無かの応答であるように思われた。飽和すると、Ｃｓｇ
Ｅ結合はチャネルの完全な遮断を誘導したが、約１０ｎＭでは、ＣｓｇＥ結合と解離事象
との間の平衡によって、転位因子は、間欠的に遮断されるかまたは完全に開状態となった
。１ｎＭまたはそれ未満では、モノマーＣｓｇＥとの短時間の遭遇により、一過性の（＜
１ミリ秒）部分的遮断事象が起こりうる。
このため、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＥは、ＧｒｏＥＬシャペロニンおよびＧｒｏＥＳコシ
ャペロニン２４で見出される、見たところ基質結合キャビティおよびカプセル化蓋構造を
想起させる、約２４，０００Ａ３の中心キャビティを閉じ込めるケージ化複合体を形成す
るように思われる。ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥの閉じ込めは、１２９残基のＣｓｇＡの完全なま
たは部分的捕捉と適合性であろう。転位基質のケージ化は、最近、ＡＢＣ毒素で観察され
ている２５。アンフォールドされたポリペプチドの空間的拘束によって、そのコンフォメ
ーション空間の減少が起こり、シャペロニンの場合のポリペプチドフォールディングにと
って都合がよいことが示されているエントロピー電位を生じる２４，２６。同様に、本発
明者らは、ｃｕｒｌｉの輸送において、ＣｓｇＧ前庭におけるｃｕｒｌｉサブユニットの
局所的高濃度およびコンフォメーションの拘束によって、転位チャネルの上でエントロピ
ー自由エネルギー勾配が生成されるであろうと推測する（図４５ｇ）。狭窄の中に捕捉さ
れると、ポリペプチド鎖は、ＣｓｇＥ媒介拘束および／または分泌チャネル近傍の基質捕
捉により生成されるエントロピー電位によって調整されるブラウン拡散によって、次第に
外側へと移動すると予想される。プレ狭窄キャビティ内で完全に拘束されるためには、ア
ンフォールドされた１２９残基のポリペプチドのバルク溶媒への逃避は、最大約８０ｋｃ
ａｌ・ｍｏｌ−１（約３４０ｋＪ・ｍｏｌ−１；参考文献２７）のエントロピー自由エネ
ルギー放出に対応するであろう。基質のドッキングおよび拘束に関する初回のエントロピ
ーコストは、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ−ＣｓｇＡ複合体の集合の際に放出される結合エネルギ
ー、および周辺質でのすでに低下したＣｓｇＡエントロピーによって少なくとも部分的に
代償される可能性がある。理論的見地から、ＣｓｇＡの分泌複合体への動員に関して可能
性がある３つの経路を想定することができる（図５４）。
Ｃｕｒｌｉ誘導バイオフィルムは、病原性の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）におい
て適応度およびビルレンス因子を形成する４，５。その独自の分泌および集合特性はまた
、（生物）工学応用に関する関心が急速に得つつある２３，２８，２９。２つの重要な分
泌成分に関する本発明者らの構造の特徴づけおよび生化学試験は、加水分解可能なエネル
ギー源、膜電位またはイオン勾配の不在下でのアンフォールドされたタンパク質基質の膜
転位のための反復機構の暫定モデルを提供する（図４５ｅおよび図５４）。提唱される分
泌モデルに関与する要因の完全なバリデーションおよび脱構築は、輸送の動力学を正確に
１分子レベルで追跡するために転位因子のインビトロ再構成を必要とするであろう。
方法
クローニングおよび株。外膜局在Ｃ−末端ＳｔｒｅｐＩＩ−タグＣｓｇＧ（ｐＰＧ１）
および周辺質のＣ−末端ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧＣ１Ｓ（ｐＰＧ２）を産生するため
の発現構築物は、参考文献１９に記述されている。セレノメチオニン標識の場合、収量を
増加させるために、ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＣ１Ｓを細胞質で発現させた。したがって
、プライマー５’−ＴＣＴＴＴＡＡＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＴＡＡＡＧ−３’（フォワード
）および５’−ＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＣ−３’（リバース）（ｐＰＧ
３）による逆転写ＰＣＲを使用してＮ−末端シグナルペプチドを除去するようにｐＰＧ２
を変化させた。表現型アッセイの場合、大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（大腸菌（E.co
li）ＮＶＧ２）のｃｓｇＧ欠失変異体を、参考文献３０に記載される方法によって構築し
た（プライマー５’−ＡＡＴＡＡＣＴＣＡＡＣＣ ＧＡＴ ＴＴＴ ＴＡＡ ＧＣＣ Ｃ
ＣＡ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＴＡＡ ＴＣＧ ＴＧＴ ＡＧＧ Ｃ
ＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＴＴ Ｃ−３’および５’−ＣＧＣ ＴＴＡ ＡＡＣ ＡＧＴ
ＡＡＡ ＡＴＧ ＣＣＧ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＴＴ
ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＴＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＴＡ Ｇ−３’によっ
て）。Ｃｙｓアクセス可能性アッセイおよびチャネル狭窄の表現型プロービングのために
使用する様々なＣｓｇＧ置換変異体を、ｔｒｃプロモーターの制御下でｃｓｇＧを含有す
るｐＴＲＣ９９ａベクター１４であるｐＭＣ２から開始する部位特異的変異誘発（Ｑｕｉ
ｋＣｈａｎｇｅプロトコール；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって構築した。
タンパク質発現および精製。ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧＣ１Ｓを、記述のように発現させ
て精製した１９。簡単に説明すると、ＣｓｇＧを、ｐＰＧ１で形質転換した大腸菌（E.co
li）ＢＬ２１（ＤＥ３）において組み換えにより産生させ、単離された外膜から、緩衝液
Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中で１％ｎ−ドデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド
（ＤＤＭ）を使用して抽出した。ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧを５ｍｌ Ｓｔｒｅｐ−Ｔ
ａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｉｂａ ＧｍｂＨ）にロードして、０．５％テ
トラエチレングリコールモノオクチルエーテル（Ｃ８Ｅ４；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）およ
び４ｍＭラウリルジメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＬＤＡＯ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を
補充した緩衝液Ａの２０カラム容積で洗浄することによって洗浄剤を交換した。２．５ｍ
Ｍ Ｄ−デスチオビオチンを添加してタンパク質を溶出させて、結晶化実験のために５ｍ
ｇ・ｍｌ−１に濃縮した。セレノメチオニン標識に関して、ＣｓｇＧＣ１Ｓを、ｐＰＧ３
で形質転換したＭｅｔ栄養素要求株Ｂ８３４（ＤＥ３）において産生させて、４０ｍｇ・
ｌ−１Ｌ−セレノメチオニンを補充したＭ９最少培地で増殖させた。細胞ペレットを、ｃ
Ｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充した５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴに
懸濁させて、２０×１０３ｌｂ・ｉｎ−２で作動するＴＳシリーズ細胞破砕装置（Ｃｏｎ
ｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ）の中を通過させて破砕した。標識されたＣｓｇＧ
Ｃ１Ｓを、記述されるように精製した１９。セレノメチオニンの酸化を防止するために、
精製手順を通してＤＴＴ（５ｍＭ）を添加した。
ＣｓｇＥを、ｐＮＨ２７を有する大腸菌（E.coli）ＮＥＢ２５６６細胞において産生さ
せた（参考文献１６）。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２５ｍＭイミダゾール、５％（容量／容量）グリセロール中の細胞溶解物をＨｉｓＴ
ｒａｐ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＣｓｇＥ−ｈｉｓを、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリ
セロール緩衝液中で５００ｍＭイミダゾールへの直線勾配によって溶出した。ＣｓｇＥを
含有する分画に２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を補充して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％（容量／容
量）グリセロールで平衡にした５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰカラム（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０
ｍＭ ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリセロールへの直線勾配を、溶出のために適用し
た。ＣｓｇＥ含有分画を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、５容量％グリセロールで平衡にしたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅ
１０／６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードした。
溶液中のオリゴマー化状態の評価。洗浄剤可溶化ＣｓｇＧ（０．５％Ｃ８Ｅ４、４ｍＭ
ＬＤＡＯ）およびＣｓｇＧＣ１Ｓのそれぞれ約０．５ｍｇを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭ ＬＤＡＯ、および
０．５％Ｃ８Ｅ４（ＣｓｇＧ）または２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００
ｍＭ ＮａＣｌ（ＣｓｇＧＣ１Ｓ）によって平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０
／ ３００ ＧＬ分析的ゲルろ過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用して、０
．７ｍｌ・分−１で実験した。カラムの溶出体積をウシサイログロブリン、ウシγ−グロ
ブリン、ニワトリ卵アルブミン、ウマミオグロビンおよびビタミンＢ１２（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）によって較正した（図４７）。膜抽出ＣｓｇＧ、洗浄剤可溶化タンパク質２０ｍｇも
同様に、参考文献３１に記述される手順を使用して３〜１０％ブルーネイティブＰＡＧＥ
で泳動させた（図４７）。ＮａｔｉｖｅＭａｒｋ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）未染色タンパク質標準物質（７ｍｌ）を分子量推定のために使用した。
結晶化、データ収集、および構造の決定。セレノメチオニン標識ＣｓｇＧＣ１Ｓを３．
８ｍｇ・ｍｌ−１に濃縮して、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２、８％ＰＥＧ４０
００、および１００ｍＭマロン酸ナトリウムｐＨ７．０を含有する溶液に対して、シッテ
ィングドロップ蒸気拡散によって結晶化した。結晶を、１５％グリセロールを補充した結
晶化緩衝液中でインキュベートして、液体窒素中で急速凍結した。洗浄剤可溶化ＣｓｇＧ
を５ｍｇ・ｍｌ−１に濃縮して、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、８％ＰＥ
Ｇ４０００、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび５００ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する溶液に対し
てハンギングドロップ蒸気拡散によって結晶化した。結晶を液体窒素中で急速凍結して、
結晶化溶液中に存在する洗浄剤によって凍結保護した。結晶条件の最適化および良好な回
折品質を有する結晶に関するスクリーニングのために、結晶をｂｅａｍｌｉｎｅｓ Ｐｒ
ｏｘｉｍａ−１およびＰｒｏｘｉｍａ−２ａ（Ｓｏｌｅｉｌ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＰＸ−Ｉ
（Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉ０２、Ｉ０３
、Ｉ０４、およびＩ２４（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ、ＵＫ）、ならび
にＩＤ１４ｅｈ２、ＩＤ２３ｅｈ１、およびＩＤ２３ｅｈ２（ＥＳＲＦ、Ｆｒａｎｃｅ）
で分析した。ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧの構造決定のために使用する最終的な回折デ
ータをそれぞれ、ｂｅａｍｌｉｎｅｓ Ｉ０４およびＩ０３で収集した（データ収集およ
び精密化統計値に関しては図５５ａを参照されたい）。ＣｓｇＧＣ１Ｓの回折データをＸ
ｉａ２およびＸＤＳパッケージを使用して処理した３２，３３。ＣｓｇＧＣ１Ｓの結晶は
、非対称単位にタンパク質１６コピーを含有する、単位格子寸法ａ＝１０１．３Å、ｂ＝
１０３．６Å、ｃ＝１４１．７Å、α＝１１１．３°、β＝９０．５°、γ＝１１８．２
°の空間群Ｐ１に属した。構造の決定および精密化のために、波長０．９７９５Åで収集
したデータを、最高分解能シェルにおいて２の｜／δ｜カットオフに基づいて２．８Åで
切り捨てた。単波長異常分散（ＳＡＤ）実験から計算した実験的位相を使用して構造を分
解した。全体で９２個のセレン部位が、ＳｈｅｌｘＣおよびＳｈｅｌｘＤ３４を使用して
非対称単位に位置づけられ、これを精密化して、Ｓｈａｒｐ３５による位相計算（フェー
ジングパワー０．７９、性能指数（ＦＯＭ）０．２５）のために使用した。実験的位相を
密度修正して、Ｐａｒｒｏｔ３６（図５５；ＦＯＭ０．８５）を使用して非結晶学的対称
性（ＮＣＳ）によって平均した。最初のモデルは、Ｂｕｃｃａｎｅｅｒ３７が構築して、
Ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅ３８による最尤推定精密化の数ラウンドおよび手動精査、な
らびにＣｏｏｔ３９におけるモデル（再）構築によって精密化した。最終構造は、１６Ｃ
ｓｇＧＣ１Ｓ鎖に属する３，７００個の残基中に原子２８，８５３個を含有し（図４７）
、ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ４０スコアは１．３４であった；残基の９８％がＲａｍａｃｈａ
ｎｄｒａｎプロットの好ましい領域（許容領域の９９．７％）に存在する。電子密度マッ
プは、可能な溶媒分子に対応する明白な密度を示さず、したがって水分子またはイオンは
含まれなかった。精密化の初期および後期ステージでそれぞれ、厳密およびローカルＮＣ
Ｓ制限を使用して、精密化を通して１６回のＮＣＳ平均化を維持した。
ＣｓｇＧの回折データを、波長０．９７６３Åで単結晶から収集して、ＸＤＳパッケー
ジ３２，３３を使用して、非対称単位にＣｓｇＧ１８コピーおよび７２％溶媒含有量を包
含する、単位格子寸法ａ＝１６１．７Å、ｂ＝３７２．３Å、ｃ＝１６１．８Å、および
β＝９２．９°の空間群Ｃ２に指数化およびスケーリングした。構造決定および精密化の
ための回折データを、逆格子方向ａ＊、ｂ＊、およびｃ＊に沿って３．６Å、３．７Å、
および３．８Åの分解能限界となるように楕円形に切り捨てて、Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ
Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ Ｓｅｒｖｅｒ４１によって異方性にスケーリングした。Ｃｓｇ
ＧＣ１Ｓモノマーを使用する分子置換は成功しなかった。自己回転関数の分析により、非
対称単位におけるＤ９対称性が明らかとなった（示していない）。ＣｓｇＧＣ１Ｓの構造
に基づいて、Ｃ８からＣ９オリゴマーに移行した後、粒子周囲でのプロトマー間アークは
、４５°から４０°まで変化したプロトマー間角とほぼ同じままであり、半径が計算上約
４Å増加すると仮定して、ノナマー検索モデルを作成した。検索モデルとして計算された
ノナマーを使用して、２コピーを含有する分子置換の解が、Ｐｈａｓｅｒ４２によって見
出された。密度修正およびＮＣＳ平均電子密度マップの精査（Ｐａｒｒｏｔ３６、図５５
）により、ＴＭ１およびＴＭ２の手動での構築ならびにタンパク質コアにおける隣接残基
のリモデリング、ならびにＣｓｇＧＣ１Ｓモデルでは失われており、Ｎ−末端脂質アンカ
ーにα１ヘリックスを結合させる残基２〜１８の構築が可能となった。ＣｓｇＧモデルの
精密化を、初回および最終精密化ラウンドにおいてそれぞれ、Ｂｕｓｔｅｒ−ＴＮＴ４３
およびＲｅｆｍａｃ５（参考文献４４）によって行った。精密化を通して１８回のローカ
ルＮＣＳ制限を適用し、Ｒｅｆｍａｃ５を、シグマ０．０１によるゼリーボディ精密化お
よびＰｒｏｓｍａｒｔ４５によって生成された水素結合制限を用いて実行した。最終構造
は、１８ＣｓｇＧ鎖に属する４，４５１個の残基中に３４，１６５個の原子を含有し（図
４７）、ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙスコアは２．７９であり、残基の９３．０％がＲａｍａｃ
ｈａｎｄｒａｎプロットの好ましい領域（許容領域の９９．３％）に存在する。Ｎ−末端
脂質アンカーに対応する明白な電子密度は識別できなかった。
コンゴーレッドアッセイ。コンゴーレッド結合の分析に関して、Ｌｙｓｏｇｅｎｙブロ
ス（ＬＢ）中、３７℃で増殖させた細菌の一晩培養物を、Ｄ６００が０．５に達するまで
ＬＢ培地で希釈した。試料５μｌを、アンピシリン（１００ｍｇ・ｌ−１）、コンゴーレ
ッド（１００ｍｇ・ｌ−１）、および０．１％（重量／容量）イソプロピルβ−Ｄ−チオ
ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を補充したＬＢアガープレートにスポットした。プレートを室
温（２０〜２２℃）で４８時間インキュベートして、ｃｕｒｌｉ発現を誘導した。コロニ
ー形態の発生および色素結合を４８時間観察した。
システインアクセス可能性アッセイ。システイン変異体を、部位特異的変異誘発を使用
してｐＭＣ２において作製し、大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２において発現させた（参考文
献７）。一晩増殖させた細菌培養物を、１ｍＭ ＩＰＴＧおよび１００ｍｇ・ｌ−１アン
ピシリンを含有するＬＢアガープレートにスポットした。プレートを室温でインキュベー
トして、細胞を４８時間後に擦り取り、ＰＢＳ １ｍｌに懸濁させて、Ｄ６００を使用し
て標準化した。細胞を超音波処理によって溶解して、４℃、３，０００ｇで２０秒間遠心
分離して、非破砕細胞を細胞溶解物から除去して、膜を懸濁させた。上清中のタンパク質
を１５ｍＭメトキシポリエチレングリコール−マレイミド（ＭＡＬ−ＰＥＧ、５ｋＤａ）
によって室温で１時間標識した。１００ｍＭ ＤＴＴによって反応を停止させて、５０．
４ Ｔｉローターにおいて４℃、４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．（約１００，０００ｇ）で２
０分間遠心分離して、全ての膜をペレットにした。ペレットを１％ラウロイルサルコシン
酸ナトリウムで洗浄して、細胞膜を可溶化し、再度遠心分離した。得られた外膜を、１％
ＤＤＭを含有するＰＢＳを使用して再懸濁させて可溶化した。ニッケルビーズによる金属
親和性プルダウンをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓウェスタンブロットのために使用し
た。空のｐＭＣ２ベクターを有する大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２細胞を、陰性対照として
使用した。
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光法。ＡＴＲ−ＦＴＩＲ測定を、液体窒素冷蔵テルル化カドミウム
水銀検出器およびＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反射測定用アクセサリ（Ｓｐｅｃａｃ）を備え
たＥｑｕｉｎｏｘ ５５赤外線分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ）において、乾燥空気で絶えず
パージながら実施した。内部反射測定用元素はダイヤモンド結晶（２ｍｍ×２ｍｍ）であ
り、ビーム入射角は４５°であった。各精製タンパク質試料（１μｌ）を結晶表面に広げ
て気体窒素流下で乾燥させて被膜を形成させた。分解能２ｃｍ−１で記録された各スペク
トルは、シグナル対ノイズ比を改善するための積算処理が平均で１２８回であった。スペ
クトルは全て水蒸気の関与を差し引いて処理し、アポダイゼーションによって最終分解能
４ｃｍ−１で平滑化して、アミドＩバンド（１，７００〜１，６００ｃｍ−１）の領域で
標準化して、その比較を行った４６。
ネガティブ染色ＥＭおよび対称性の決定。ネガティブ染色ＥＭを使用して、ＣｓｇＧ、
ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＥの溶液中のオリゴマー化状態をモニターした。ＣｓｇＥ、
ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびａｍｐｈｉｐｏｌ結合ＣｓｇＧを０．０５ｍｇ・ｍｌ−１の濃度
に調節して、グロー放電カーボンコーティング銅グリッド（ＣＦ−４００；Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。１分間インキュベートし
た後、試料をブロットして、次いで洗浄および２％酢酸ウラニルで染色した。画像を、電
圧１２０ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ Ｔ１２ ＢｉｏＴＷＩＮ ＬａＢ６顕微鏡で、倍
率４９，０００倍および８００〜２，０００ｎｍの間のデフォーカスにより収集した。コ
ントラスト伝達関数（ＣＴＦ）、位相フリッピングおよび粒子選択を、クライオ−ＥＭに
関して記述したように実施した。膜抽出ＣｓｇＧに関して、オクタデカマー粒子（全体で
１，７８０個）を、ノナマーおよび上面図から個別に分析した。精製ＣｓｇＥに関して、
全体で２，４５２個の粒子を分析した。以下のＣｓｇＧ−ＣｓｇＥクライオ−ＥＭ分析に
記述されるように三次元モデルを得て、数ラウンドの多重参照配列アライメント（ＭＲＡ
）、多重統計分析（ＭＳＡ）、およびアンカーセット精密化によって精密化した。全ての
場合において、標準化および中心化後、クライオ−ＥＭ選択に記述されるようにＩＭＡＧ
ＩＣ−４Ｄを使用して画像を分類した。特徴的な図面に対応する最善のクラスを各セット
の粒子に関して選択した。ＣｓｇＧ上面図の対称性の決定は、クラスあたりほぼ２０個の
画像を使用して最善のクラス平均を使用して実施した。回転方向の自己相関関数を、ＩＭ
ＡＧＩＣを使用して計算し、プロットした。
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の形成。ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体形成に関して、精製Ｃｓ
ｇＧ中の可溶化洗浄剤を、ＣｓｇＧ（０．５％Ｃ８Ｅ４、４ｍＭ ＬＤＡＯ、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ中に２４ｍｇ・
ｍｌ−１タンパク質）１２０μｌを洗浄剤脱安定化リポソーム（１ｍｇ・ｍｌ−１の１，
２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）および０．４％Ｌ
ＤＡＯ）３００μｌに添加し、氷上で５分間インキュベートした後、１００ｍｇ・ｍｌ−
１保存液にＡ８−３５ ａｍｉｐｈｉｐｏｌｓ ９０ｍｌを添加することによって、Ａｍ
ｐｈｉｐｏｌｓ Ａ８−３５（Ａｎａｔｒａｃｅ）に交換した。氷上でさらに１５分間イ
ンキュベートした後、試料をＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａ
ｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードして、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％キシリトール、
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、０．２ｍＭ ＤＴＴ中でゲルろ過を行った。２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％キシリトール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、０．
２ｍＭ ＤＴＴ中での精製モノマーＣｓｇＥの等量を、ａｍｐｈｉｐｏｌ可溶化ＣｓｇＧ
に、ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧに関してそれぞれ最終タンパク質濃度１５および５μＭで添
加して、試料を４．５％ネイティブＰＡＧＥにおいて０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１２５Ｖ
、１８℃で泳動させた。二次元変性の場合、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体に対応するバンド
を、同じゲルで同時に泳動させた未染色レーンから切り出して、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２−
メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）中で５分間沸騰させて、４
〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させた。精製ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧを対照試料として
複合体と共に泳動させた。ゲルを視覚的に調べるためにＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅによって、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＣｓｇＥおよびＣｓｇＧバンドの蛍
光検出（Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９０００）によるＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の化学量
論的評価のためにＳＹＰＲＯオレンジによって染色し、ＣｓｇＧ／ＣｓｇＥ比０．９７を
得た。
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥクライオ−ＥＭ。クライオ電子顕微鏡を使用して、Ｃ９ ＣｓｇＧ
−ＣｓｇＥ複合体の溶液中の構造を決定した。上記のように調製したＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ
複合体を、ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させて溶出し、
未結合ＣｓｇＧを除去して、溶出後直ちに、２０ｍＡで３０秒間グロー放電されているＱ
ｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ２／２カーボンコーティンググリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ
Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｏｌｓ ＧｍｂＨ）に適用した。試料を、自動システム（Ｌｅｉｃａ）
を使用して液体窒素中で瞬間凍結し、電圧２００ｋＶで作動するＦＥＩ Ｆ２０顕微鏡下
で、低用量条件下で名目上の倍率５０，０００倍、および１．４〜３μｍのデフォーカス
範囲で観察した。画像フレームをＦａｌｃｏｎ ＩＩ検出器で記録した。標本レベルのピ
クセルサイズはピクセルあたり１．９Åであった。ＣＴＦパラメータを、ＣＴＦＦＩＮＤ
３（参考文献４７）を使用して評価して、位相フリッピングをＳＰＩＤＥＲ４８で実施し
た。粒子を、ＢＯＸＥＲ（ＥＭＡＮ２、参考文献４９）を使用してＣＴＦ補正顕微鏡写真
から自動的に選択した。１０％を超える非点収差を有する画像を破棄した。全体で１，２
２１個の粒子を７５個の顕微鏡写真から選択して、１２８ピクセル×１２８ピクセルのボ
ックスにウィンドウ化した。画像を同じ平均値および標準偏差に標準化して、約２００Å
の低分解能カットオフでハイパスフィルターを通過させた。これらを中心化した後、第一
ラウンドのＭＳＡに供した。最初の参照物質の組を、ＩＭＡＧＩＣ−４Ｄ（Ｉｍａｇｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における参照物質なしの分類を使用して得た。Ｃ９
円柱粒子の特徴的な側面図に対応する最善のクラスをＭＲＡの参照物質として使用した。
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体に関して、最初の三次元モデルを、複合体粒子１，２２１個を
包含する最善の１２５個の特徴的な図面（良好なコントラストおよび良好に定義された特
徴を有する）から計算して、角度の再構成によって方向を決定した（Ｉｍａｇｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。ＭＲＡ、ＭＳＡ、およびアンカーセット精密化の繰り返
しラウンドによって三次元マップを精密化した。分解能は、０．５基準レベルに従ってフ
ーリエシェル相関（ＦＳＣ）によって２４Åであると推定された（図５２）。マップおよ
び図面の可視化は、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ５０において実施した。
胆汁酸塩毒性アッセイ。胆汁酸塩を含有するアガープレートでの増殖の減少によって外
膜透過性を調べた。ｐＬＲ４２（参考文献１６）およびｐＭＣ２（参考文献１４）（また
は誘導されたヘリックス２変異体）の両方を有する大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２（参考文
献７）細胞の１０倍連続希釈液（５μｌ）を、１００μｇ・ｌ−１アンピシリン、２５μ
ｇ・ｌ−１クロラムフェニコール、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有し、０．２％（重量／容量）
Ｌ−アラビノースを含むまたは含まないＭｃＣｏｎｋｅｙアガープレートにスポットした
。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーの増殖を調べた。
単一チャネル電流記録。単一チャネル電流記録を、ＮａｎｉｏｎのＯｒｂｉｔ １６キ
ットによる平行高解像電気的記録を使用して行った。簡単に説明すると、１，２−ジフィ
タノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ
ｓ）の水平二重層を、１６チャネルマルチ電極キャビティアレイ（ＭＥＣＡ）チップ（ｌ
ｏｎｅｒａ）５１の（ピコリットル容積以下の）マイクロキャビティ上に形成した。二重
層の上および下のシスおよびトランスキャビティはいずれも、１．０Ｍ ＫＣｌ、２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を含有した。チャネルを膜に挿入するために、２５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５％
Ｃ８Ｅ４、５ｍＭ ＬＤＡＯに溶解したＣｓｇＧをシス区画に最終濃度９０〜３００ｎＭ
となるように添加した。ＣｓｇＧチャネルとＣｓｇＥとの相互作用を試験するために、２
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌに溶解したＣｓｇＥタン
パク質溶液をシス区画に最終濃度０．１、１、１０、および１００ｎＭで添加した。膜通
過電流を、Ｔｅｃｅｌｌａ Ｔｒｉｔｏｎ １６−チャネル増幅器を使用して、ロウパス
フィルタリング周波数３ｋＨｚおよびサンプリング周波数１０ｋＨｚで＋５０ｍＶおよび
−５０ｍＶ（シス側を接地した）の保持電位で記録した。電流のトレースをｐＣｌａｍｐ
スイートのＣｌａｍｐｆｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析し
た。プロットをＯｒｉｇｉｎ ８．６（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）５２を使用して作製した。
測定された電流を、３つのセグメント、膜貫通区分、周辺質前庭、および両者を接続す
る内部チャネル狭窄で構成されるようにモデル化したＣｓｇＧのＸ線構造のポア寸法に基
づいて計算された電流と比較した。最初の２つのセグメントは円錐形状のセグメントとな
るようにモデル化された。狭窄を円柱として表した。対応する抵抗Ｒ１、Ｒ２、およびＲ
３をそれぞれ、以下のように計算した：
Ｒ１＝Ｌ１／（πＤ１ｄ１κ）
Ｒ２＝Ｌ２／（πＤ２ｄ２κ）
Ｒ３＝Ｌ３／（πＤ１ｄ２κ）
式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３はセグメントの軸方向の長さであり、それぞれ、３．５、
４．０、および２．０ｎｍであると測定され、Ｄ１、ｄ１、Ｄ２、およびｄ３は、セグメ
ント１および２の最大および最小直径であり、それぞれ４．０、０．８、３．４、および
０．８ｎｍであると測定された。導電率κは、１０．６Ｓｍ−１の値を有する。電流は、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３ならびに電圧Ｖ＝５０ｍＶを
Ｉ＝Ｖ／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）
に代入することによって計算された。
アクセス抵抗性は予想電流を有意に変化させないことが見出された。
参考文献
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
本発明は、以下の態様も包含する。
［１］
位置Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６のうちの１つまたは複数に修飾を含む、
少なくとも１つの修飾ＣｓｇＧモノマー。
［２］
［１］に記載の少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾生体ポア。
［３］
少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾ＣｓｇＧ生体ポアであって、０．５ｎｍ
〜１．５ｎｍの範囲の直径を有するチャネル狭窄を１つしか有さない修飾ＣｓｇＧ生体ポ
ア。
［４］
前記修飾が、前記ＣｓｇＧモノマーのポリペプチド配列の３８〜６３位にある、［
３］に記載の修飾ポア。
［５］
前記修飾が、Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６から選択される位置にある、［
４］に記載の修飾ポア。
［６］
前記修飾が、位置Ｔｙｒ５１に、または位置Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の両方にある
、［５］に記載の修飾ポア。
［７］
前記ＣｓｇＧモノマーに対する修飾が、天然に存在するアミノ酸の置換、天然に存在す
るアミノ酸の欠失、および天然に存在するアミノ酸側鎖の修飾からなる群から選択される
、［３］から［６］のいずれかに記載の修飾ポア。
［８］
前記修飾が、未修飾アミノ酸の立体障害を低減または除去する、［３］から［７］に記
載
の修飾ポア。
［９］
前記修飾ポアの前記少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーが、配列番号４〜３８８による
３８〜６３位のポリペプチド配列を有する、［３］から［８］のいずれかに記載の修飾ポ
ア
。
［１０］
［３］から［９］のいずれかに記載の修飾ＣｓｇＧ生体ポアの少なくとも１つのＣｓｇ
Ｇ
モノマーをコードする単離されたポリペプチド。
［１１］
［１０］に記載の単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸。
［１２］
ａ）絶縁層と、
ｂ）前記絶縁層内のＣｓｇＧ生体ポアと、
ｃ）前記生体ポアを通る電流を測定するための装置と
を含むバイオセンサー。
［１３］
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、［３］から［９］のいずれかに記載の修飾ＣｓｇＧ生体ポア
で
ある、［１２］に記載のバイオセンサー。
［１４］
分析物検出または核酸シークエンシングである生体センシング用途のための、ＣｓｇＧ
生体ポアの使用。
［１５］
前記核酸シークエンシングが、ＤＮＡシークエンシングまたはＲＮＡシークエンシング
である、［１４］に記載の使用。
［１６］
分子センシングのための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設
けるステップ、
ｂ）前記ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と相互作用させるステップ、および
ｃ）前記相互作用中に１回または複数回の測定を行うステップ
を含む方法。
［１７］
ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設
けるステップ、
ｂ）前記絶縁層を介して電気的電位を印加し、それによって前記生体ポアを通る電流の
流れを確立するステップ、
ｃ）前記ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と接触させるステップ、および
ｄ）前記生体ポアを通る電流の流れを測定するステップ
を含む、［１６］に記載の方法。
［１８］
前記絶縁層が膜である、［１６］または［１７］に記載の方法。
［１９］
前記膜が、脂質二重層である、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記ポアを通る電流が、前記絶縁層の第１の側面から前記絶縁層の第２の側面への可溶
性イオンの流れによって搬送される、［１７］から［１９］のいずれか一項に記載の方法
。
［２１］
前記分子センシングが、分析物検出である、［１６］から［２０］に記載の方法。
［２２］
ステップ（ｄ）の後に、前記試験基質が不在である場合の前記生体ポアを通る電流と比
較して前記生体ポアを通る電流が低減することによって前記試験基質の存在を判定するさ
らなるステップを含む、［１７］から［２１］に記載の方法。
［２３］
前記分子センシングが、核酸シークエンシングである、［１６］から［２２］に記載の
方
法。
［２４］
前記方法によってシークエンシングされる核酸のタイプがＤＮＡまたはＲＮＡである、
［２３］に記載の方法。
［２５］
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、さらなるアクセサリータンパク質に順応するように適合され
る、［２３］または［２４］に記載の方法。
［２６］
前記さらなるアクセサリータンパク質が、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、イソメラ
ーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、テロメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびヘ
リカーゼからなる群から選択される核酸プロセシング酵素である、［２５］に記載の方
法。
［２７］
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、修飾ＣｓｇＧポアであり、前記修飾ＣｓｇＧポアが、前記Ｃ
ｓｇＧポアを形成する前記ＣｓｇＧモノマーの少なくとも１つにおいてモノマー野生型大
腸菌（E-coli）ＣｓｇＧポリペプチド配列に少なくとも１つの修飾を有する、［１６］
から［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］
同じ修飾が、前記ＣｓｇＧポアを形成する前記ＣｓｇＧモノマーすべてに施される、［
２７］に記載の方法。
［２９］
前記修飾ＣｓｇＧモノマーが、配列番号４〜３８８による３８〜６３位のポリペプチド
配列を有する、［２７］または［２８］に記載の方法。
［３０］
配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、
前記バリアントが、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの１つまたは複数に変異を含
む、変異体ＣｓｇＧモノマー。
［３１］
配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、
前記バリアントが、（ｉ）位置Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９
７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２における１つま
たは複数の変異、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５
１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９
Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ
、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ、
（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１
ＱまたはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ
）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およ
びＳ５７のうちの１つまたは複数の欠失のうちの１つまたは複数を含む、変異体ＣｓｇＧ
モノマー。
［３２］
（ａ）前記バリアントが、（ｉ）において、置換Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４
３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５
７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、
Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４
Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１
４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎのうちの１つもしくは複
数を含む、
（ｂ）前記バリアントが、（ｉｉ）において、
Figure 2021078500
Figure 2021078500
Figure 2021078500
を含む、ならびに／または
（ｃ）前記バリアントが、（ｘｉ）において、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５２
／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠失
、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失および単一のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失お
よび単一のＰでの置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６
の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換、Ｎ５５
／Ｆ５６の欠失および単一のグリシン（Ｇ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一
のアラニン（Ａ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１
Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠
失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置
換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５
５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および
単一のＡでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換／Ｙ５
１Ｑ、もしくはＮ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｓを含む、
［３１］に記載の変異体モノマー。
［３３］
前記バリアントが、
Figure 2021078500
Figure 2021078500
を含む、［３１］または［３２］に記載の変異体。
［３４］
前記バリアントが、Ｔ１５０に変異を含む、［３１］に記載の変異体モノマー。
［３５］
２つ以上の共有結合ＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、前記モノマーの少なくと
も１つが、前記のいずれか一項に記載の変異体モノマーである、構築物。
［３６］
前記２つ以上の変異体モノマーが同じである、または異なる、［３５］に記載の構築
物。
［３７］
前記２つ以上の変異体モノマーが、遺伝子的に融合されている、［３５］または［３６
］に記載の構築物。
［３８］
前記２つ以上の変異体モノマーが、１つまたは複数のリンカーによって結合されている
、［３５］から［３７］のいずれか一項に記載の構築物。
［３９］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の２つの変異体モノマーを含む、［３５］
から［３８］のいずれか一項に記載の構築物。
［４０］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは［３７］に記載の
構築物をコードするポリヌクレオチド。
［４１］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の同一の変異体モノマーまたは［３５］か
ら［３９］のいずれか一項に記載の同一の構築物を含む、ＣｓｇＧに由来するホモオリゴ
マー
ポア。
［４２］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の９つの同一の変異体モノマーを含む、［
４１］に記載のホモオリゴマーポア。
［４３］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の少なくとも１つの変異体モノマーまたは
［
３５］から［３９］のいずれか一項に記載の少なくとも１つの構築物を含む、ＣｓｇＧに
由
来するヘテロオリゴマーポア。
［４４］
（ａ）［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の９つの変異体モノマーを含み、そ
れ
らの少なくとも１つが他と異なる、または（ｂ）［３１］から［３４］のいずれか一項に
記
載の１つもしくは複数の変異体モノマーと配列番号３９０を含む十分なさらなるモノマー
とを含む、［４３］に記載のヘテロオリゴマーポア。
［４５］
標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法であって、
ａ．前記標的分析物をＣｓｇＧポアまたはその変異体と、前記標的分析物が前記ポアに
対して移動するように接触させるステップ、および
ｂ．前記分析物が前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い
、それによって前記分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステッ
プ
を含む方法。
［４６］
前記ＣｓｇＧ変異体が９つのモノマーを含み、前記モノマーの少なくとも１つが配列番
号３９０のバリアントであり、前記バリアントが、（ａ）位置Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、
Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０
２、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９
５、Ｅ２０１およびＥ２０３のうちの１つもしくは複数における変異、ならびに／または
（ｂ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６
およびＳ５７のうちの１つもしくは複数の欠失を含む、［４５］に記載の方法。
［４７］
前記バリアントが、置換（ａ）Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｇ、
Ｆ５６ＡまたはＦ５６ＫまたはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ
５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｂ）Ｎ５５Ｑ、Ｎ５５Ｒ、Ｎ
５５Ｋ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ５５Ｇ、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｃ）Ｙ５１Ｌ、Ｙ５１Ｖ、Ｙ
５１Ａ、Ｙ５１Ｎ、Ｙ５１Ｑ、Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｄ）Ｔ１５０Ｉ、（ｅ）Ｓ５
４Ｐ、および（ｆ）Ｓ５７Ｐのうちの１つまたは複数を含む、［４６］に記載の方法。
［４８］
前記バリアントが、［３１］から［３４］に記載の変異／置換の組合せのいずれかを含
む
、［４６］または［４７］に記載の方法。
［４９］
前記ポアが、［３１］から［３４］のいずれか一項に記載のポアである、［４８］に記
載の方法。
［５０］
前記標的分析物が、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチ
ド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤
、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物または環境汚染物質である、［
４５］から［４９］のいずれか一項に記載の方法。
［５１］
前記標的分析物が、標的ポリヌクレオチドである、［５０］に記載の方法。
［５２］
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるための方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドを前記ポアと、前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移
動するように接触させるステップ、および
ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の
測定を行い、前記測定が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによ
って前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、［５１］に記載の方法。
［５３］
前記１つまたは複数の特徴が、（ｉ）前記ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリ
ヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ポリヌク
レオチドの二次構造、および（ｖ）前記ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選
択される、［５２］に記載の方法。
［５４］
前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴が、電気的測定および／または光学的測
定によって測定される、［５２］または［５３］に記載の方法。
［５５］
前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定または電界効果
トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、［５４］に記載の方法。
［５６］
ステップａ）が、前記ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記タ
ンパク質が前記ポアを通る前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させること
をさらに含む、［５２］から［５５］のいずれか一項に記載の方法。
［５７］
ａ）前記ポリヌクレオチドを前記ポアおよび前記ポリヌクレオチド結合タンパク質と、
前記タンパク質が前記ポアに対する前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触さ
せるステップ、ならびに
ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに前記ポアを通過する
電流を測定し、前記電流が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それに
よって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、［５６］に記載の方法。
［５８］
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質がヘリカーゼである、またはヘリカーゼに由来す
る、［５６］または［５７］に記載の方法。
［５９］
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるための方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体およびエキソヌクレアーゼ
と、前記エキソヌクレアーゼが前記標的ポリヌクレオチドの一方の末端から個々のヌクレ
オチドを消化し、前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動するように接触させる
ステップ、ならびに
ｂ）前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回
の測定を行い、前記測定が前記個々のヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それ
によって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、［５１］に記載の方法。
［６０］
前記ポアが、膜内にある、［４５］から［４９］のいずれか一項に記載の方法。
［６１］
前記膜が、両親媒性層である、または固体層を含む、［６０］に記載の方法。
［６２］
前記標的分析物を、前記ポアと接触させる前に前記膜とカップリングさせる、［６
０］または［６１］に記載の方法。
［６３］
前記標的分析物を、前記分析物を前記膜の方に送達する微粒子に結合させる、［６
０］から［６２］のいずれか一項に記載の方法。
［６４］
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成する方法であって、ＣｓｇＧ
ポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それによ
って前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成するステップを含む方
法。
［６５］
前記複合体が、（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記ポアを前記ポリヌクレ
オチド結合タンパク質と接触させること、および（ａ）前記ポアを介して電位を印加する
ことによって形成される、［６４］に記載の方法。
［６６］
前記電位が、電圧電位または化学的電位である、［６５］に記載の方法。
［６７］
前記複合体が、前記ポアを前記タンパク質に共有結合させることによって形成される、
［６４］に記載の方法。
［６８］
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーであって、ＣｓｇＧポアまたはその
変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含むセンサー。
［６９］
標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するための、ＣｓｇＧポ
アまたはその変異体の使用。
［７０］
標的分析物を特徴づけるためのキットであって、（ａ）ＣｓｇＧポアまたはその変異体
と（ｂ）膜の成分とを含むキット。
［７１］
試料中の標的分析物を特徴づけるための装置であって、（ａ）複数のＣｓｇＧポアまた
はそれらの変異体と（ｂ）複数の膜とを含む装置。
［７２］
前記複数のポアおよび膜を支持することができるセンサーデバイスであって、前記ポア
および膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
前記特徴づけを行うための材料を送達するための少なくとも１つのポートと
を含む、［７１］に記載の装置。
［７３］
前記複数のポアおよび膜を支持することができるセンサーデバイスであって、前記ポア
および膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
前記特徴づけを行うための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと
を含む、［７２］に記載の装置。
［７４］
材料を前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに制御可能に供給す
るように構成されている流体工学システムと、
それぞれの試料を受けるための複数の容器と
をさらに含み、前記流体工学システムが、前記試料を前記容器から前記センサーデバイス
に選択的に供給するように構成されている、［７２］または［７３］に記載の装置。
［７５］
標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、ポリメラーゼおよび標識
ヌクレオチドと、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有するリン酸標識分子種が前記ポリ
メラーゼによって前記標的ポリヌクレオチドに逐次的に付加されるように接触させるステ
ップ、ならびに
ｂ）前記ポアを使用して前記リン酸標識分子種を検出し、それによって前記ポリヌクレ
オチドを特徴づけるステップ
を含む方法。
［７６］
［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは［３７］に記載の
構築物を産生する方法であって、好適な宿主細胞において［４０］に記載のポリヌクレ
オチドを発現させ、それによって［３１］から［３４］のいずれか一項に記載の変異体モ
ノマーまたは［３７］に記載の構築物を産生するステップを含む方法。
参考文献

Claims (76)

  1. 位置Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６のうちの１つまたは複数に修飾を含む、
    少なくとも１つの修飾ＣｓｇＧモノマー。
  2. 請求項１に記載の少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾生体ポア。
  3. 少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾ＣｓｇＧ生体ポアであって、０．５ｎｍ
    〜１．５ｎｍの範囲の直径を有するチャネル狭窄を１つしか有さない修飾ＣｓｇＧ生体ポ
    ア。
  4. 前記修飾が、前記ＣｓｇＧモノマーのポリペプチド配列の３８〜６３位にある、請求項
    ３に記載の修飾ポア。
  5. 前記修飾が、Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６から選択される位置にある、請
    求項４に記載の修飾ポア。
  6. 前記修飾が、位置Ｔｙｒ５１に、または位置Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の両方にある
    、請求項５に記載の修飾ポア。
  7. 前記ＣｓｇＧモノマーに対する修飾が、天然に存在するアミノ酸の置換、天然に存在す
    るアミノ酸の欠失、および天然に存在するアミノ酸側鎖の修飾からなる群から選択される
    、請求項３から６のいずれかに記載の修飾ポア。
  8. 前記修飾が、未修飾アミノ酸の立体障害を低減または除去する、請求項３から７に記載
    の修飾ポア。
  9. 前記修飾ポアの前記少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーが、配列番号４〜３８８による
    ３８〜６３位のポリペプチド配列を有する、請求項３から８のいずれかに記載の修飾ポア
    。
  10. 請求項３から９のいずれかに記載の修飾ＣｓｇＧ生体ポアの少なくとも１つのＣｓｇＧ
    モノマーをコードする単離されたポリペプチド。
  11. 請求項１０に記載の単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸。
  12. ａ）絶縁層と、
    ｂ）前記絶縁層内のＣｓｇＧ生体ポアと、
    ｃ）前記生体ポアを通る電流を測定するための装置と
    を含むバイオセンサー。
  13. 前記ＣｓｇＧ生体ポアが、請求項３から９のいずれかに記載の修飾ＣｓｇＧ生体ポアで
    ある、請求項１２に記載のバイオセンサー。
  14. 分析物検出または核酸シークエンシングである生体センシング用途のための、ＣｓｇＧ
    生体ポアの使用。
  15. 前記核酸シークエンシングが、ＤＮＡシークエンシングまたはＲＮＡシークエンシング
    である、請求項１４に記載の使用。
  16. 分子センシングのための方法であって、
    ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設
    けるステップ、
    ｂ）前記ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と相互作用させるステップ、および
    ｃ）前記相互作用中に１回または複数回の測定を行うステップ
    を含む方法。
  17. ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設
    けるステップ、
    ｂ）前記絶縁層を介して電気的電位を印加し、それによって前記生体ポアを通る電流の
    流れを確立するステップ、
    ｃ）前記ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と接触させるステップ、および
    ｄ）前記生体ポアを通る電流の流れを測定するステップ
    を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記絶縁層が膜である、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記膜が、脂質二重層である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ポアを通る電流が、前記絶縁層の第１の側面から前記絶縁層の第２の側面への可溶
    性イオンの流れによって搬送される、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記分子センシングが、分析物検出である、請求項１６から２０に記載の方法。
  22. ステップ（ｄ）の後に、前記試験基質が不在である場合の前記生体ポアを通る電流と比
    較して前記生体ポアを通る電流が低減することによって前記試験基質の存在を判定するさ
    らなるステップを含む、請求項１７から２１に記載の方法。
  23. 前記分子センシングが、核酸シークエンシングである、請求項１６から２２に記載の方
    法。
  24. 前記方法によってシークエンシングされる核酸のタイプがＤＮＡまたはＲＮＡである、
    請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＣｓｇＧ生体ポアが、さらなるアクセサリータンパク質に順応するように適合され
    る、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
  26. 前記さらなるアクセサリータンパク質が、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、イソメラ
    ーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、テロメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびヘ
    リカーゼからなる群から選択される核酸プロセシング酵素である、請求項２５に記載の方
    法。
  27. 前記ＣｓｇＧ生体ポアが、修飾ＣｓｇＧポアであり、前記修飾ＣｓｇＧポアが、前記Ｃ
    ｓｇＧポアを形成する前記ＣｓｇＧモノマーの少なくとも１つにおいてモノマー野生型大
    腸菌（E-coli）ＣｓｇＧポリペプチド配列に少なくとも１つの修飾を有する、請求項１６
    から２６のいずれかに記載の方法。
  28. 同じ修飾が、前記ＣｓｇＧポアを形成する前記ＣｓｇＧモノマーすべてに施される、請
    求項２７に記載の方法。
  29. 前記修飾ＣｓｇＧモノマーが、配列番号４〜３８８による３８〜６３位のポリペプチド
    配列を有する、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
  30. 配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、
    前記バリアントが、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの１つまたは複数に変異を含
    む、変異体ＣｓｇＧモノマー。
  31. 配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、
    前記バリアントが、（ｉ）位置Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９
    ７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２における１つま
    たは複数の変異、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５
    １／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９
    Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ
    、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ、
    （ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１
    ＱまたはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ
    ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およ
    びＳ５７のうちの１つまたは複数の欠失のうちの１つまたは複数を含む、変異体ＣｓｇＧ
    モノマー。
  32. （ａ）前記バリアントが、（ｉ）において、置換Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４
    ３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５
    ７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、
    Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４
    Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１
    ４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎのうちの１つもしくは複
    数を含む、
    （ｂ）前記バリアントが、（ｉｉ）において、
    Figure 2021078500
    Figure 2021078500
    Figure 2021078500
     を含む、ならびに／または
    （ｃ）前記バリアントが、（ｘｉ）において、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５２
    ／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠失
    、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失および単一のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失お
    よび単一のＰでの置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６
    の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換、Ｎ５５
    ／Ｆ５６の欠失および単一のグリシン（Ｇ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一
    のアラニン（Ａ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１
    Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠
    失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置
    換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５
    ５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および
    単一のＡでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換／Ｙ５
    １Ｑ、もしくはＮ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｓを含む、
    請求項３１に記載の変異体モノマー。
  33. 前記バリアントが、
    Figure 2021078500
    Figure 2021078500
     を含む、請求項３１または３２に記載の変異体。
  34. 前記バリアントが、Ｔ１５０に変異を含む、請求項３１に記載の変異体モノマー。
  35. ２つ以上の共有結合ＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、前記モノマーの少なくと
    も１つが、前記請求項のいずれか一項に記載の変異体モノマーである、構築物。
  36. 前記２つ以上の変異体モノマーが同じである、または異なる、請求項３５に記載の構築
    物。
  37. 前記２つ以上の変異体モノマーが、遺伝子的に融合されている、請求項３５または３６
    に記載の構築物。
  38. 前記２つ以上の変異体モノマーが、１つまたは複数のリンカーによって結合されている
    、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の構築物。
  39. 請求項３１から３４のいずれか一項に記載の２つの変異体モノマーを含む、請求項３５
    から３８のいずれか一項に記載の構築物。
  40. 請求項３１から３４のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは請求項３７に記載の
    構築物をコードするポリヌクレオチド。
  41. 請求項３１から３４のいずれか一項に記載の同一の変異体モノマーまたは請求項３５か
    ら３９のいずれか一項に記載の同一の構築物を含む、ＣｓｇＧに由来するホモオリゴマー
    ポア。
  42. 請求項３１から３４のいずれか一項に記載の９つの同一の変異体モノマーを含む、請求
    項４１に記載のホモオリゴマーポア。
  43. 請求項３１から３４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの変異体モノマーまたは請
    求項３５から３９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの構築物を含む、ＣｓｇＧに由
    来するヘテロオリゴマーポア。
  44. （ａ）請求項３１から３４のいずれか一項に記載の９つの変異体モノマーを含み、それ
    らの少なくとも１つが他と異なる、または（ｂ）請求項３１から３４のいずれか一項に記
    載の１つもしくは複数の変異体モノマーと配列番号３９０を含む十分なさらなるモノマー
    とを含む、請求項４３に記載のヘテロオリゴマーポア。
  45. 標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法であって、
    ａ．前記標的分析物をＣｓｇＧポアまたはその変異体と、前記標的分析物が前記ポアに
    対して移動するように接触させるステップ、および
    ｂ．前記分析物が前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い
    、それによって前記分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステッ
    プ
    を含む方法。
  46. 前記ＣｓｇＧ変異体が９つのモノマーを含み、前記モノマーの少なくとも１つが配列番
    号３９０のバリアントであり、前記バリアントが、（ａ）位置Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、
    Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０
    ２、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９
    ５、Ｅ２０１およびＥ２０３のうちの１つもしくは複数における変異、ならびに／または
    （ｂ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６
    およびＳ５７のうちの１つもしくは複数の欠失を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記バリアントが、置換（ａ）Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｇ、
    Ｆ５６ＡまたはＦ５６ＫまたはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ
    ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｂ）Ｎ５５Ｑ、Ｎ５５Ｒ、Ｎ
    ５５Ｋ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ５５Ｇ、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｃ）Ｙ５１Ｌ、Ｙ５１Ｖ、Ｙ
    ５１Ａ、Ｙ５１Ｎ、Ｙ５１Ｑ、Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｄ）Ｔ１５０Ｉ、（ｅ）Ｓ５
    ４Ｐ、および（ｆ）Ｓ５７Ｐのうちの１つまたは複数を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記バリアントが、請求項３１から３４に記載の変異／置換の組合せのいずれかを含む
    、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 前記ポアが、請求項３１から３４のいずれか一項に記載のポアである、請求項４８に記
    載の方法。
  50. 前記標的分析物が、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチ
    ド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤
    、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物または環境汚染物質である、請
    求項４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記標的分析物が、標的ポリヌクレオチドである、請求項５０に記載の方法。
  52. 標的ポリヌクレオチドを特徴づけるための方法であって、
    ａ）前記ポリヌクレオチドを前記ポアと、前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移
    動するように接触させるステップ、および
    ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の
    測定を行い、前記測定が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによ
    って前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
    を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記１つまたは複数の特徴が、（ｉ）前記ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリ
    ヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ポリヌク
    レオチドの二次構造、および（ｖ）前記ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選
    択される、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴が、電気的測定および／または光学的測
    定によって測定される、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定または電界効果
    トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、請求項５４に記載の方法。
  56. ステップａ）が、前記ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記タ
    ンパク質が前記ポアを通る前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させること
    をさらに含む、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. ａ）前記ポリヌクレオチドを前記ポアおよび前記ポリヌクレオチド結合タンパク質と、
    前記タンパク質が前記ポアに対する前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触さ
    せるステップ、ならびに
    ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに前記ポアを通過する
    電流を測定し、前記電流が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それに
    よって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
    を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ポリヌクレオチド結合タンパク質がヘリカーゼである、またはヘリカーゼに由来す
    る、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 標的ポリヌクレオチドを特徴づけるための方法であって、
    ａ）前記ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体およびエキソヌクレアーゼ
    と、前記エキソヌクレアーゼが前記標的ポリヌクレオチドの一方の末端から個々のヌクレ
    オチドを消化し、前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動するように接触させる
    ステップ、ならびに
    ｂ）前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回
    の測定を行い、前記測定が前記個々のヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それ
    によって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
    を含む、請求項５１に記載の方法。
  60. 前記ポアが、膜内にある、請求項４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記膜が、両親媒性層である、または固体層を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記標的分析物を、前記ポアと接触させる前に前記膜とカップリングさせる、請求項６
    ０または６１に記載の方法。
  63. 前記標的分析物を、前記分析物を前記膜の方に送達する微粒子に結合させる、請求項６
    ０から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成する方法であって、ＣｓｇＧ
    ポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それによ
    って前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成するステップを含む方
    法。
  65. 前記複合体が、（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記ポアを前記ポリヌクレ
    オチド結合タンパク質と接触させること、および（ａ）前記ポアを介して電位を印加する
    ことによって形成される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記電位が、電圧電位または化学的電位である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記複合体が、前記ポアを前記タンパク質に共有結合させることによって形成される、
    請求項６４に記載の方法。
  68. 標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーであって、ＣｓｇＧポアまたはその
    変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含むセンサー。
  69. 標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するための、ＣｓｇＧポ
    アまたはその変異体の使用。
  70. 標的分析物を特徴づけるためのキットであって、（ａ）ＣｓｇＧポアまたはその変異体
    と（ｂ）膜の成分とを含むキット。
  71. 試料中の標的分析物を特徴づけるための装置であって、（ａ）複数のＣｓｇＧポアまた
    はそれらの変異体と（ｂ）複数の膜とを含む装置。
  72. 前記複数のポアおよび膜を支持することができるセンサーデバイスであって、前記ポア
    および膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
    前記特徴づけを行うための材料を送達するための少なくとも１つのポートと
    を含む、請求項７１に記載の装置。
  73. 前記複数のポアおよび膜を支持することができるセンサーデバイスであって、前記ポア
    および膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
    前記特徴づけを行うための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと
    を含む、請求項７２に記載の装置。
  74. 材料を前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに制御可能に供給す
    るように構成されている流体工学システムと、
    それぞれの試料を受けるための複数の容器と
    をさらに含み、前記流体工学システムが、前記試料を前記容器から前記センサーデバイス
    に選択的に供給するように構成されている、請求項７２または７３に記載の装置。
  75. 標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、
    ａ）前記ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、ポリメラーゼおよび標識
    ヌクレオチドと、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有するリン酸標識分子種が前記ポリ
    メラーゼによって前記標的ポリヌクレオチドに逐次的に付加されるように接触させるステ
    ップ、ならびに
    ｂ）前記ポアを使用して前記リン酸標識分子種を検出し、それによって前記ポリヌクレ
    オチドを特徴づけるステップ
    を含む方法。
  76. 請求項３１から３４のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは請求項３７に記載の
    構築物を産生する方法であって、好適な宿主細胞において請求項４０に記載のポリヌクレ
    オチドを発現させ、それによって請求項３１から３４のいずれか一項に記載の変異体モノ
    マーまたは請求項３７に記載の構築物を産生するステップを含む方法。
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