JP2021038194A - ウルシオール含量低減組成物の製造方法、その製造方法により製造される組成物、肥満防止剤、脂肪蓄積抑制剤および血中レプチン量増加抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ウルシの有効成分を確保しつつ、ウルシオールを簡単な工程で除去できるウルシ由来組成物の製造方法を提供する。【解決手段】水とアルコールの混合溶媒と、前記混合溶媒中に抽出されたウルシの成分を含有する溶液を濃縮して、溶液の容量を２分の１以下にした濃縮溶液を得る工程を用いて、ウルシオール含量が低減された組成物を製造する。【選択図】なし

Description

本発明は、ウルシオールの含量を低減できるウルシ由来組成物の製造方法、並びに、肥満防止剤、脂肪蓄積抑制剤および血中レプチン量増加抑制剤として有用な組成物に関する。

自然界に生育している植物から得られる成分を利用して健康飲料や医薬組成物を開発する研究が従来から活発に行われている。その中には、ウルシに含まれる成分を抽出して薬効を評価する研究も見受けられ、こうした研究が進められた結果、ウルシには種々の有効成分が含まれていることが報告されるに至っている（非特許文献１〜４）。
ここで、ウルシは種々の有効成分を含むものであり、医薬の原料として大いに期待される。しかし、ウルシに含まれているウルシオールには、アレルギー性接触性皮膚炎などの強いアレルギー症状を誘発する等の問題があることも知られている（非特許文献５）。そのため、ウルシに含まれる有効成分を安全に利用するためには、ウルシから有効成分を抽出して、なおかつ、ウルシオールを除去することが必要とされる。こうしたことから、従来は、ウルシからウルシオールを除去する工程と、有効成分を抽出する工程の２つの工程を実施することにより、ウルシから有効成分を取得することが行われている。

Open Journal of Immunology 2015; 5: 39-49 Drug Research 2017; 65: 127-130 Journal of Cancer Therapy 2016; 7: 464-470 Journal of Natural Medicines 2015; 69: 148-153 Progress in pacific polymer science, vol 3, Springer, Berlin, 1994; p.423-432

しかし、２段階の工程でウルシの有効成分を取得する方法では、それぞれの工程で薬品や器具が必要になり、また、工程の数だけ手間も倍になることから、コストと時間を要して生産効率が低くなることが課題とされている。また、工程毎に成分のロスがあることから、得られる有効成分の収率も低くなるという課題もある。
そこで本発明者らは、このような従来技術の課題を解決するために、ウルシの有効成分を確保しつつ、ウルシオールを簡単な工程で除去できる、ウルシ由来組成物の製造方法を提供することを目的として検討を進めた。

本発明者らは、このような従来技術の課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ウルシの成分を含む溶液にワンステップの処理を行うことにより、ウルシオールを大幅に除去しながら、ウルシの有効成分を濃縮できる方法があることを見いだした。本発明は、こうした知見に基づいて提案されたものであり、具体的に以下の構成を有する。

［１］ 水とアルコールの混合溶媒と、前記混合溶媒中に抽出されたウルシの成分を含有する溶液を濃縮して、溶液の容量を２分の１以下にした濃縮溶液を得る工程を含む、ウルシオール含量低減組成物の製造方法。
［２］ 前記ウルシが、ウルシの葉部である、［１］に記載の製造方法。
［３］ 濃縮前のアルコール濃度をａ容量％とし、濃縮後のアルコール濃度をｂ容量％としたとき、ａ−ｂが１０容量％以上である、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記濃縮により、前記溶液のアルコール濃度を５０容量％未満に低下させる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の製造方法。
［５］ 前記濃縮を減圧下で行う、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の製造方法。
［６］ 前記濃縮を２０〜５０℃で行う、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の製造方法。
［７］ 前記濃縮により、前記溶液に含まれるウルシオールを析出させる、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の製造方法。
［８］ 前記濃縮により、前記溶液に含まれるウルシオールの濃度を１０分の１未満に低下させる、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の製造方法。
［９］ 前記濃縮溶液のウルシオール濃度が０．１重量％未満である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１０］ 前記濃縮前の溶液に含まれるケルシトリンの８０重量％以上が、前記濃縮後の濃縮溶液に残存している、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１１］ 前記濃縮溶液を乾燥して粉末状にする工程をさらに含む、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１２］ ［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の製造方法により製造される組成物。
［１３］ ニレ、オウセイ、クコシ、レイシおよびケニンジンからなる群より選択される１以上をさらに含有する、［１２］に記載の組成物。
［１４］ ［１２］または［１３］に記載の組成物を含む肥満防止剤。
［１５］ ［１２］または［１３］に記載の組成物を含む脂肪蓄積抑制剤。
［１６］ ［１２］または［１３］に記載の組成物を含む血中レプチン量増加抑制剤。

本発明の製造方法によれば、ウルシの有効成分を確実に残しつつ、ウルシ抽出液から簡単な工程でウルシオールを除去することができる。そのため、本発明の製造方法によれば、ウルシオール含量が低減されたウルシ由来組成物を、低い製造コストで効率よく取得することができる。
本発明の製造方法で製造された組成物は、ウルシオール含量が低減されているため、肥満防止剤、脂肪蓄積抑制剤、血中レプチン量増加抑制剤として安全に用いることができる。

ウルシ抽出液の濃縮過程における溶液容量、エタノール濃度、ウルシオール残存率およびケルシトリン残存率の変化を示すグラフである。 高脂肪飼料を与えたマウス群（グループI）、ウルシ葉エキス乾燥粉末を１重量％含有する高脂肪飼料を与えたマウス群（グループII）、およびウルシ葉エキス乾燥粉末を２重量％含有する高脂肪飼料を与えたマウス群（グループIII）の体重変化を示すグラフである。 高脂肪飼料を与えたマウス群（グループI）、ウルシ葉エキス乾燥粉末を１重量％含有する高脂肪飼料を与えたマウス群（グループII）、およびウルシ葉エキス乾燥粉末を２重量％含有する高脂肪飼料を与えたマウス群（グループIII）の５６日間給餌後の腹腔内脂肪量を示すグラフである。 高脂肪飼料を与えたマウス群（グループI）、ウルシ葉エキス乾燥粉末を１重量％含有する高脂肪飼料を与えたマウス群（グループII）、およびウルシ葉エキス乾燥粉末を２重量％含有する高脂肪飼料を与えたマウス群（グループIII）の給餌直前（０日目）の血中レプチン量と５６日間給餌後の血中レプチン量を示すグラフである。

以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。

＜ウルシオール含量低減組成物の製造方法＞
本発明のウルシオール含量低減組成物の製造方法は、水とアルコールの混合溶媒と、この混合溶媒中に抽出されたウルシの成分を含有する溶液を濃縮して、溶液の容量を２分の１以下にした濃縮溶液を得る工程（濃縮工程）を含むことを特徴とする。

本発明の製造方法で用いるウルシは、ウルシ科に属するものの中から選択することができ、特に好ましいのは、ウルシ科ウルシ属に属する植物種である。例えば、ウルシ（Ｒｈｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕａ）、ヤマウルシ（Ｒｈｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ツタウルシ（Ｒｈｕｓ ａｍｂｉｇｕａ）、ヌルデ（Ｒｈｕｓ ｊａｖａｎｉｃａ）、ヤマハゼ（Ｒｈｕｓ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
ウルシは、葉、根、幹、枝などにより構成され、製造方法に供するのはいずれの部分であってもよいが、葉部や、幹および枝の樹皮や木部が採取し易く、中でも葉部を用いることが好ましい。樹皮や木部については盛んに研究されているものの、ウルシの葉部については研究例があまりなく、本発明の製造方法によりウルシオール含量を低減させることで、その有効成分の研究開発を大きく進展させることができる。

ウルシの葉部は、抽出しやすい状態にして利用することができる。例えば、細片状または粉末状にしたうえで抽出してもよい。
葉部を細片状または粉末状にするときには、採取した葉部をそのままカッター、細断機、コロイドミルなどを用いて処理してもよいが、いったん乾燥してから細断、粉末化処理を行うのが好ましい。葉部の乾燥は、水分含量が１０重量％未満、好ましくは５重量％未満、より好ましくは３重量％未満になるまで行うのが一般的である。乾燥は、自然乾燥でも機械乾燥でもよい。また、乾燥を行う場合は、葉部採取から３０分以内に行うのが好ましい。

葉部の乾燥温度は特に制限されない。このため、加圧式ドラム加熱装置や電磁波などを用いて急速加熱乾燥してもよい。加圧式ドラム加熱装置を用いる場合は、８０〜１４０℃の範囲内で加熱乾燥するのが好ましい。乾燥時間は、通常２分以内にし、好ましくは１分以内、より好ましくは４０〜５０秒程度にする。また、電子レンジなどの電磁波を使用する場合には、例えば６００Ｗで２０〜５０秒程度加熱乾燥することができる。このような条件下で加熱乾燥することによって、葉部原料中に含まれている望ましくない酵素の活性を抑制または失活させ、生理活性成分の分解をある程度防ぐことができる。

急速加熱乾燥したものは、そのまま使用してもよいし、さらに低温乾燥させてから使用してもよい。低温乾燥を行う場合には、−５℃〜１０℃の範囲内で行うのが好ましい。低温乾燥は、遠赤外線乾燥装置などの熱風乾燥装置、通風乾燥装置、氷温乾燥装置などを単独または組み合わせて用いることによって行うことができる。例えば、遠赤外線乾燥を行った後に氷温乾燥することができる。このような低温乾燥を行えば、生理活性成分の分解を防止することができる。

葉部の細断や粉末化は、目的にあった装置や道具を用いて行うことができる。例えば、コロイドミルを用いて５０〜１００μｍの粉末にすることができる。このような細断や粉末化は、乾燥前、高温乾燥後、低温乾燥後のいずれであってもよい。

抽出対象となる葉部は、このようにして細片状または粉末状にした葉部だけでなく、採取した葉部そのもの、高温乾燥したもの、低温乾燥したものなどのいずれであってもよい。抽出効率を上げるために、葉部はある程度細片化しておくのが好ましい。

抽出溶媒は、アルコールと水の混合溶媒である。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ペンタノール、イソペンタノール、ヘキサノール、イソヘキサノールなどを例示することができ、メタノール、エタノール、プロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。アルコールはいずれか１種だけを使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。抽出溶媒のアルコール濃度は、６０容量％以上であることが好ましく、６５容量％以上であることがより好ましく、７０容量％以上であることがさらに好ましい。また、抽出溶媒のアルコール濃度は、８５容量％以下であることが好ましく、８０容量％以下であることがより好ましく、７５容量％以下であることがさらに好ましい。

ウルシの成分の抽出は、アルコールと水の混合溶媒をウルシに接触させ、ウルシの成分を混合溶媒中に溶出させることで行う。これにより、アルコールと水の混合溶媒と、この混合溶媒中に抽出されたウルシの成分を含有する溶液が得られる。以下の説明では、この溶液を「ウルシ抽出液」という。抽出は、具体的にはアルコールと水の混合溶媒中にウルシを浸漬して、一定時間放置することにより行うことができる。この抽出は、常温で行っても還流下で行ってもよい。また、溶液を撹拌しながら行うことが好ましい。また、ソックスレー抽出器などの抽出装置を使用して抽出を行ってもよい。
得られたウルシ抽出液は、そのまま濃縮工程に供してもよいが、濾過等により不溶物を除去してから濃縮工程に供することが好ましい。

本発明の濃縮工程では、上記のように調製されたウルシ抽出液である溶液を濃縮して、濃縮前の容量の２分の１以下にした濃縮溶液を得る。この濃縮工程における「濃縮」とは、アルコールと水の混合溶媒と、この混合溶媒中に抽出されたウルシの成分を含有する溶液（ウルシ抽出液）から、混合溶媒の一部を取り除くことを意味する。
この濃縮過程で、ウルシオールが析出等して溶液におけるウルシオール含量が低減する。この析出したウルシオールを濾過等で濃縮溶液から除去することにより、ウルシオール含量が低減した組成物が得られる。これにより、本発明の製造方法では、溶液の濃縮という簡単な工程で、ウルシの有効成分を溶液中に確実に残しつつ、溶液のウルシオール含量を大幅に低減することができる。

溶液の濃縮は、例えば溶液に含まれる混合溶媒の一部を蒸発させることにより行うことができる。この場合、少なくともアルコールの一部を蒸発させることが好ましく、水の蒸発分の割合よりもアルコールの蒸発分の割合の方が大きいことが好ましい。ここで蒸発分の割合とは、蒸発により失われた容量の濃縮前の容量に対する割合を意味する。濃縮は、常圧下で行っても減圧下で行ってもよいが、減圧下で行うことが好ましい。これにより、低温で混合溶媒を蒸発させることができるため、生理活性成分の熱変性や熱分解を抑えることができる。濃縮を行う温度は、圧力条件によっても異なるが、２０〜５０℃であることが好ましく、２５〜４５℃であることがより好ましい。

この濃縮工程では、溶液の濃縮により溶液のアルコール濃度を低下させる。濃縮前のアルコール濃度をａ容量％とし、濃縮後のアルコール濃度をｂ容量％としたとき、ａ−ｂは１０容量％以上であることが好ましく、２０容量％以上であることがより好ましく、３０容量％以上であることがさらに好ましい。
また、溶液の濃縮により、溶液のアルコール濃度を５０容量％未満に低下させることが好ましく、４５容量％未満に低下させることがより好ましく、４０容量％未満に低下させることがさらに好ましい。
また、溶液の濃縮により、溶液に含まれるウルシオールの濃度を、濃縮前のウルシオールの濃度の１０分の１未満に低下させることが好ましく、２０分の１未満低下させることがより好ましく、３０分の１未満低下させることがさらに好ましい。

本発明において、濃縮工程で得る濃縮溶液の容量は、濃縮前の溶液の容量の１／２以下であり、１／３以下であってもよく、１／５以下、１／７以下、１／９以下であってもよい。また、濃縮溶液の容量の下限は、濾過操作によるウルシオールの除去を容易に行う点から１／２０である。

濃縮工程で得られる濃縮溶液のウルシオール濃度は、０．１重量％未満であることが好ましく、０．０５重量％未満であることがより好ましく、０．０１重量％未満であることがさらに好ましく、０．００５重量％未満であることがさらにより好ましい。
また、濃縮前の溶液に含まれるケルシトリンの８０重量％以上が、濃縮後の濃縮溶液に残存していることが好ましく、濃縮前の溶液に含まれるケルシトリンの８５重量％以上が、濃縮後の濃縮溶液に残存していることがより好ましい。
ウルシ抽出液や濃縮溶液に含まれる各成分の含量は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により測定することができる。その具体的な測定条件については、実施例の欄の記載を参照することができる。

得られた濃縮溶液は、そのまま組成物として使用に供してもよいが、効果を高めるために、濃縮溶液を乾燥して粉末状にする工程を行うことも好ましい。濃縮溶液の乾燥は、自然乾燥で行ってもよいし、凍結乾燥で行ってもよい。また、粉末にした後にさらに生理食塩水などに溶解して濃度調整を行ってもよい。また、粉末とする前に加熱殺菌を行ってもよい。

＜組成物＞
本発明の製造方法により製造されるウルシオール含量低減組成物（本発明の組成物）は、ウルシに由来する、ケルシトリンやポリフェノールなどの生理活性物質（有効成分）を含有するとともに、アレルギーを誘発するウルシオールの含量が大幅に低減されていることから、医薬組成物や健康飲料として有用である。このため、本発明の組成物の予防または治療有効量を、ヒトを含む哺乳動物に投与することによって疾患を予防または治療するために使用することができる。

本発明の組成物は、肥満防止剤および脂肪蓄積抑制剤として用いることができる。このため、本発明の肥満防止剤、脂肪蓄積抑制剤の有効量を、生体に投与することにより、その腹腔内脂肪等の体脂肪の蓄積を抑制して肥満症になるのを効果的に防止することができる。
また、本発明の組成物は血中レプチン量増加抑制剤として用いることができる。レプチンは、脂肪組織由来ホルモンであり、視床下部ニューロンのレプチン受容体を活性化して摂食抑制とエネルギー消費増加をもたらす一方で、肥満度が高い程、血中レプチン量が高値になることが知られている。そのため、血中レプチン量は、一般に肥満度の指標とされており、血中レプチン量が低い値である程、肥満が抑制されていることを意味する。本発明の血中レプチン量増加抑制剤の有効量を生体に投与すると、脂肪蓄積が抑制され肥満が防止される結果、血中レプチン量の増加が抑制されると推測される。なお、本発明の血中レプチン量増加抑制作用がレプチンの作用不足をもたらすものでないことは、後掲の実施例において、本発明のウルシオール含量低減組成物を適用した系で、血中レプチン量の増加が抑制されると同時に、体重増加や脂肪蓄積も抑制されていることから確認することができる。

本発明の組成物は、その使用目的に応じて様々な形態で使用することができる。
たとえば、本発明の組成物を医薬品として使用する場合には、その投与経路によって様々な剤型を選択することができる。本発明の組成物は、経口的または非経口的に投与することができる。例えば、直腸投与、鼻内投与、頬側投与、舌下投与、膣内投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与を行なうことが可能である。中でも、本発明の組成物は、経口投与、皮下投与または経皮投与するのが好ましく、経口投与することが特に好ましい。

経口投与に適した製剤として、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適した製剤として、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤などを挙げることができる。注射剤は、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、点滴などのいずれに用いるものであってもよい。本発明の組成物は、特に経口用製剤、注射剤、貼付剤のいずれかであるのが好ましい。

本発明の組成物には、必要に応じて薬理学的および製剤学的に許容しうる添加物を添加することができる。例えば、賦形剤、崩壊剤または崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤または溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤、湿潤剤などを使用することができる。また、他の生理活性成分（例えば、ニレ、オウセイ、クコシ（クコ）、レイシおよびケニンジン（ニンジン）からなる群より選択される１以上など）を添加してもよい。これらの添加剤を適宜組み合わせて使用することによって、本発明の組成物にさまざまな付加的機能を持たせることができる。

上記賦形剤としては、デンプン、コーンスターチ、白糖、乳糖、マンニット、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、無機塩類等が具体例として挙げられる。

上記崩壊剤または崩壊補助剤としては、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガント、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウムが具体例として挙げられる。

上記結合剤としては、寒天、ゼラチン、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、白色セラック、トラガント、精製白糖、マクロゴールが具体例として挙げられる。

上記滑沢剤としては、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、タルク、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ロウ類、水素添加油、ポリエチレングリコールが具体例として挙げられる。

上記界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、大豆レシチン、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールが具体例として挙げられる。

また、本発明の組成物は、必要に応じて活性成分が徐放されるように設計することができる。また、体内の必要な個所において活性成分が集中的に放出されるように設計することもできる。このような徐放性製剤やドラッグデリバリーシステムは、製剤業界において周知の方法にしたがって設計のうえ製造することができる。

また、本発明の組成物には、有機物または無機物の担体を使用することができる。そのような担体として、乳糖、でんぷん、植物性および動物性脂肪や油脂を例示することができる。

投与対象は、犬などのヒト以外の哺乳類やヒトとすることができる。本発明の組成物の投与量は、治療または予防の目的、患者の性別、体重、年齢、疾患の種類や程度、剤型、投与経路、投与回数などの種々の条件に応じて適宜決定する。例えば、経口投与する場合には、０．１μｇ〜１００ｍｇ（ウルシ葉エキス乾燥重量）／ｋｇ体重／日で、一日一回から数回に分けて投与することができるが、投与量はこの範囲に限定されるものではない。

本発明の組成物は、必ずしも医薬品の形態をとる必要はない。例えば、本発明の組成物は各種食品や飲料に含ませることによって、機能性食品や機能性飲料としても安全かつ有効に使用することができる。特に、抗癌作用を有する旨を表示した食品や飲料として有効に使用することができる。
具体的には、紅茶、清涼飲料水、ジュース、あめ、澱粉質食品、各種加工食品等に使用することができるが、使用形態はこれらの具体例に限定されるものではない。また、必要に応じて、ゲル化剤などを添加して食感を改良してもよい。

以下に実施例と比較例を挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。なお、以下の説明において、混合溶媒の配合割合を表す「％」は「容量％」を意味する。

本実施例で調製した組成物の成分分析、抗酸化活性およびα−グルコシダーゼ阻害活性の測定は以下の方法にて行った。
（ａ）高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による成分分析
ケルシトリン、ケルセチン、スルフレチン、フィセチン、フスチン等については、ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製：アジレント１１００シリーズ）にて成分分析を行った。具体的には、逆相カラム（東ソー社製：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ-８０Ｔｓ(内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ)）を用い、１０ｍＭのリン酸−アセトニトリル混合溶媒を移動相とするリニアグラジエント溶出（９５：５→５：９５、６０分間）を行い、各成分の検出、含有量の測定を行った。
ウルシオールについては、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製：ＬＣ６Ａシステム）と逆相カラム（野村化学社製：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ-５(内径１０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ)）を用い、９０％アセトニトリルを移動相として溶出させ、２７２ｎｍの検出波長で検出、含有量の測定を行った。
（ｂ）総ポリフェノール含有量の測定
総ポリフェノール量は、フォーリン・チオカルト法を用いて測定した。
（ｃ）アルコール濃度の測定
アルコール濃度は、アルコール濃度計（アズワン社製：ＤＡＡＬ−２５）を使用して測定した。
（ｄ）抗酸化活性の測定
ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定：
９６穴マイクロプレートに、測定用試料溶液６０μＬに、０．２ＭのＭＥＳ（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ） 緩衝液（ｐＨ６．０）６０μＬ、２０％エタノール溶液６０μＬ、エタノールに溶解した４００μＭのＤＰＰＨ(２，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ)溶液６０μＬを加え室温で正確に２０分間反応を行った。マイクロプレートリーダーを用いて５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。Ｔｒｏｌｏｘを用いて回帰直線を作成し、試料添加量（μＬ/ａｓｓａｙ）に相当するＴｒｏｌｏｘ量（μｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ／ｇ）として算出した。
酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）の測定：
９６穴マイクロプレートに、測定用試料溶液２５μＬ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ溶液（７５ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．４)に溶解）１５０μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベーションした。ＡＡＰＨ（２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液２５μＬを添加して振盪撹拌後直ちに、３７℃に保ったプレートリーダーを用いて蛍光強度を測定した（Ｅｍ：４８５ｎｍ, Ｅｘ：５２８ｎｍ）。その後、５分間隔で６０分間蛍光強度の経時変化を測定した。蛍光強度を記録したグラフの曲線下面積を算出し、試料１ｇ 重量あたりのＴｒｏｌｏｘ相当量（μｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ/ｇ）としてＯＲＡＣ値を表示した。
（ｅ）α−グルコシダーゼ阻害活性の測定
９６穴マイクロプレートに、測定用試料溶液１０μＬと６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解した酵母由来α-グルコシダーゼ（０．１ｍＵ/ｍＬ）４０μＬを加え、３７℃ で１５分間予備加温した。続いて、６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解したｐ-ニトロフェニルα-Ｄ-グルコピラノシド（１ｍＭ）５０μＬを添加し、反応を開始させた。３７℃ で正確に３０分間反応させた後、０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液１００μＬを加えて混合し反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。α-グルコシダーゼ阻害率は、次の式を用いて計算した。
阻害率（％）=｛（Ｃ-Ｓ）/（Ｃ-Ｂ）｝ｘ １００
Ｃ：コントロールの４００ｎｍにおける吸光度
Ｓ：サンプルの４００ｎｍにおける吸光度
Ｂ：ブランクの４００ｎｍにおける吸光度
なお、阻害率が５０％を示したときの酵素反応時における試料終濃度をＩＣ５０値と定義し、これをα-グルコシダーゼ阻害活性の尺度とした。

（実施例１）ウルシ葉エキス乾燥粉末（ウルシオール含量低減組成物）の製造と評価
韓国ウォンジュ市にて採取したウルシ葉（Ｒｈｕｓ ｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕａの葉部）の乾燥粉末８００ｇに対し、７０％エタノール・３０％水混合溶媒（１０倍量、８Ｌ）を加え、室温（２５℃）にて１６時間撹拌することによりウルシ葉抽出液を得た。ここで得られたウルシ葉抽出液は、７０％エタノール・３０％水混合溶媒と、混合溶媒中に抽出されたウルシの成分を含む溶液に相当する。得られたウルシ葉抽出液を、濾紙（Ｎｏ．１３１）を装着したブフナーロートを用いて吸引濾過した。この濾液を、ロータリーエバポレーターを使用して４０℃の湯浴中で約１０分の１量（約８００ｍＬ）まで減圧濃縮した。濃縮の工程でウルシオールを含む黒色の沈殿物が生じた。続いて濃縮溶液とウルシオールを含む黒色沈殿物とを分離するため、再度、濾紙（Ｎｏ．１３１）を装着したブフナーロートを用いて濃縮物の吸引濾過を行い、濾液（濃縮溶液）を回収した。
得られた濃縮溶液の成分分析を行ったところ、ウルシオールは検出されず、ケルシトリンやポリフェノールを含有していることが確認された。
その後、濃縮溶液に９０℃で５分間の加熱殺菌を行い、十分に放冷した後、−８０℃で予備凍結を行い、さらに、凍結乾燥機で約６日間凍結乾燥することでウルシ葉エキス乾燥粉末（組成物１）を得た。

（Ａ）成分分析
実施例１で得たウルシ葉エキス乾燥粉末について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて成分分析を行ったところ、ケルシトリンの含有が認められたが、樹皮や木部に含有しているケルセチンやスルフレチン、フィセチン、フスチン等は検出されなかった。

（Ｂ）濃縮過程でのウルシオールおよびケルシトリンの含量変化の測定
濃縮過程でのウルシオールおよびケルシトリンの含量変化を調べるため、実施例１と同様の条件で７０％エタノール・３０％水混合溶媒を用いてウルシ葉抽出液を調製し、このウルシ葉抽出液（９００ｍＬ）を約１／１０量（１００ｍＬ）になるまで減圧濃縮した。この濃縮過程で段階的に溶液の一部（溶液サンプル）を採取して、その溶液サンプルのエタノール濃度、ウルシオール含量およびケルシトリン含量を測定し、その測定結果から、溶液サンプルを採取した時点での溶液のエタノール濃度、ウルシオール残存率およびケルシトリン残存率を求めた。その結果を図１に示す。図１において、横軸は、溶液サンプルを採取した時の溶液の容量を示し、左側縦軸は、溶液のエタノール濃度を示し、右側縦軸は、溶液のウルシオール残存率およびケルシトリン残存率を示す。ここで、残存率とは、濃縮前の含量を１００重量％としたときの、各時点での含量の割合を意味する。
図１に示すように、ウルシオール含量は濃縮の進行により顕著に減少する一方で、有用成分であるケルシトリンは濃縮過程で殆ど失われず初期の含有量を維持した。このことから、エタノール・水混合溶媒によるウルシ抽出液を濃縮することにより、ウルシオール含量を選択的に低減できることがわかった。

（比較例１）未濃縮のウルシ葉抽出液の調製と比較評価
ウルシ葉乾燥粉末８００ｇに対し、１０倍量（８Ｌ）のエタノール・水混合溶媒を加え、室温（２５℃）にて１６時間撹拌することによりウルシ葉抽出液を得た。このとき、混合溶媒のエタノール濃度は７０％、４０％、または３５％とした。

得られたウルシ葉抽出液と、上記（Ｂ）の評価のために採取したエタノール濃度３５％の溶液サンプル（ウルシ葉抽出液の濃縮溶液）について、ウルシオール含量、ケルシトリン含量および総ポリフェノール量、並びに、ＤＰＰＨ（２，２-Ｄｉｐｈｅｎｙｌ-１-ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）ラジカル消去活性、α−グルコシダーゼ阻害活性を測定した結果を表１に示す。ここで、各成分含量の目標値は、ケルシトリンで５重量％以上、総ポリフェノールで１５重量％以上に設定した。また、ＤＰＰＨラジカル消去活性は、表１に示した値が高い程、活性が高いことを意味し、α−グルコシダーゼ阻害活性は、表１に示した値が低い程、活性が高いことを意味する。

表１に示すように、７０％エタノールによるウルシ葉抽出液の濃縮溶液（エタノール濃度：３５％）は、ウルシオール含量が０．００１重量％未満と極微量であり、且つ、ケルシトリン含量および総ポリフェノール量が目標の５重量％、１５重量％を上回るものであった。これに対して、濃縮していないウルシ葉抽出液では、エタノール濃度が７０％であると、ケルシトリン含量および総ポリフェノール量は目標値を超えるが、ウルシオール含量が５．９重量％と高く、そのままでは医薬原料に使用できるものではなかった。また、エタノール濃度を３５％や４０％に低くすると、ウルシオール含量はある程度低減するものの、ケルシトリン含量および総ポリフェノール量まで減ってしまい、ＤＰＰＨラジカル消去活性とα−グルコシダーゼ阻害活性も低くなった。特にα−グルコシダーゼ阻害作用は、ウルシ葉抽出液の濃縮溶液に比べて著しく低活性であった。
以上の結果から、水・アルコール混合溶媒のウルシ葉抽出液に濃縮を行う本発明の製造方法は、アレルギー成分であるウルシオールのみを簡便かつ効率良く除去することができ、且つ、有用成分であるケルシトリンやポリフェノールの量を低下させずに維持できる特徴を有し、濃縮工程を用いない方法と比較して極めて優れていることがわかった。

［活性の評価］
（Ｃ）抗酸化活性の評価
実施例１で得たウルシ葉エキス乾燥粉末（組成物１）について、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）を測定して抗酸化活性を評価するとともに、総ポリフェノール量をカテキン当量で測定した。その結果を表２に示す。

（Ｄ）体重増加抑制作用、腹腔内脂肪蓄積抑制作用および血中レプチン量増加抑制作用の評価
実施例１で得たウルシ葉エキス乾燥粉末（組成物１）について、体重増加抑制作用、腹腔内脂肪蓄積抑制作用および血中レプチン量増加抑制作用を評価した。試験は、６週齢の雄のＣ57ＢＬ／6Ｊマウスについて行った。具体的には、１８頭のＣ57ＢＬ／6Ｊマウス（日本エスエルシー社から購入）を３つのグループＩ、II、IIIに分け、グループIには高脂肪飼料（オリエンタル酵母工業社製：ＨＦＤ−６０）、グループIIには、組成物１を１重量％添加した高脂肪飼料、グループIIIには、組成物１を２重量％添加した高脂肪飼料をそれぞれ与え、週毎に２回の体重測定を行い、試験開始から５６日目に腹腔内脂肪量の測定と採血を行って血中レプチン量を測定した。統計処理は、Ｄｕｎｎｅｔｔ法にて行い、有意水準は０．０５とした。体重の測定結果を図２に示し、腹腔内脂肪量の測定結果を図３に示し、血中レプチン量の測定結果を図４に示す。図２〜４においてエラーバーは標準誤差を表す。血中レプチン量はＥＬＩＳＡ法にて測定した。
図２〜４に示すように、グループＩと比較して、グループIIに体重増加抑制傾向が認められ、グループIIIには有意な体重増加抑制作用が認められた。また、グループIIIには、グループIと比較して腹腔内脂肪の蓄積抑制傾向が認められ、また、有意な血中レプチン量増加抑制作用が認められた。

本発明の製造方法によれば、簡単な工程で、ウルシ抽出液のウルシオール含量を大幅に低減できるため、ウルシの有効成分を含み、且つ、アレルギーを誘発するウルシオールの含量が低減された組成物を低コストで効率よく製造することができる。このため、本発明は、産業上の利用可能性が高い。

Claims (16)

1. 水とアルコールの混合溶媒に生ウルシを溶解させた溶液を濃縮して、溶液の容量を２分の１以下にした濃縮溶液を得る工程を含む、ウルシオール含量低減組成物の製造方法。
   水とアルコールの混合溶媒と、前記混合溶媒中に抽出されたウルシの成分を含有する溶液を濃縮して、溶液の容量を２分の１以下にした濃縮溶液を得る工程を含む、ウルシオール含量低減組成物の製造方法。
2. 前記ウルシが、ウルシの葉部である、請求項１に記載の製造方法。
3. 濃縮前のアルコール濃度をａ容量％とし、濃縮後のアルコール濃度をｂ容量％としたとき、ａ−ｂが１０容量％以上である、請求項１または２に記載の製造方法。
4. 前記濃縮により、前記溶液のアルコール濃度を５０容量％未満に低下させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 前記濃縮を減圧下で行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. 前記濃縮を２０〜５０℃で行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 前記濃縮により、前記溶液に含まれるウルシオールを析出させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 前記濃縮により、前記溶液に含まれるウルシオールの濃度を１０分の１未満に低下させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
9. 前記濃縮溶液のウルシオール濃度が０．１重量％未満である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 前記濃縮前の溶液に含まれるケルシトリンの８０重量％以上が、前記濃縮後の濃縮溶液に残存している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
11. 前記濃縮溶液を乾燥して粉末状にする工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法により製造される組成物。
13. ニレ、オウセイ、クコシ、レイシおよびケニンジンからなる群より選択される１以上をさらに含有する、請求項１２に記載の組成物。
14. 請求項１２または１３に記載の組成物を含む肥満防止剤。
15. 請求項１２または１３に記載の組成物を含む脂肪蓄積抑制剤。
16. 請求項１２または１３に記載の組成物を含む血中レプチン量増加抑制剤。