JP2020536123A - クロファジミンの吸入可能な組成物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

クロファジミンの吸入可能な組成物が本明細書で提供される。前記吸入可能なクロファジミン組成物をジェットミリングによって生成する方法がさらに本明細書で提供される。また、前記吸入可能なクロファジミン組成物を投与することにより肺疾患を治療する方法も提供される。

Description

本出願は、２０１７年１０月２日に出願された米国仮出願番号第６２／５６６，６３３号の優先権の利益を請求し、両出願の内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる。

１．分野
本発明は、一般的に、免疫学および医学の分野に関する。より具体的には、それは、吸入可能なクロファジミン組成物およびそれらの使用方法に関する。

２．関連技術の説明
結核に対して使用する新薬の必要が高まっており、またその必要に迫られている。２０１５年には、世界中で１，０４０万人の新しい結核患者が報告され、そのうち５８万人が多剤耐性結核（ＭＤＲ−ＴＢ）であると考えられる。多剤耐性結核は、リファンピシン、またはリファンピシンとイソニアジドに対して耐性を示す結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による結核と定義されている（世界保健機関、２０１６）。さらに、世界中のあらゆる地域で、広範囲薬物耐性結核（ＸＤＲ−ＴＢ）の症例が見られる。広範囲薬物耐性結核は、イソニアジドとリファンピシン、フルオロキノロン、または３つの注射可能な第２選択薬（アミカシン、カナマイシン、またはカプレオマイシン）中の少なくとも１つに対して耐性を示す結核菌による結核と定義されている（世界保健機関、２０１６年）。グローバル化と高負荷地域からの大量移動により、これらの耐性株は広がると予想されている。治療の選択肢が減るにつれ、特に感染部位を標的とすることができる場合、耐性が低く、活性の高い抗感染剤であるクロファジミン（ＣＦＺ）などの改質は、耐性結核を克服する可能性のある方法である。このような製剤の開発にはいくつかの課題がある。結核が圧倒的に多い低資源国で効果的に実施されるためには、いかなる可能性のある治療も、費用効果が高くなければならず、かつ輸送と管理が容易でなければならない。さらに、可能性のある治療は、結核菌感染が開始および伝播する肺胞マクロファージに対して高い特異性を示さなければならない（Ｂｌｏｏｍ、１９９４）。感染性桿菌は小滴として吸入そして肺胞マクロファージによって貪食され、マクロファージの酸性化を制限し、リソソーム融合を制限することにより、不適な細胞内環境を生き残る。慢性感染症では、このメカニズムが細胞内マイコバクテリウムの安定した個体群をもたらす（Ｒｕｓｓｅｌ、２００７）。

クロファジミンは、弱塩基性のイミノフェナジン系抗生物質で、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・アビウムコンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＡＣ）、結核菌などのマイコバクテリウムに対し、最小抑制濃度（ＭＩＣ）が０．１２５〜２ μｇ／ｍＬの範囲で作用する。（Ａｒｂｒｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇａｎｇａｄｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｌｉｎｄｈｏｌｍ−Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｓｈａｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔｗｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９５７；Ｓｃｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｄｉａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｃａｖａｎａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７） 重要なことに、クロファジミンは薬物耐性結核に対する活性を示し、現在、ＭＤＲ−ＴＢの治療における世界保健機関による二次治療薬として推奨されている。（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１６；Ｃａｖａｎａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｒａｓｔｏｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，１９９６） クロファジミンは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）および炎症性肺疾患の治療にも使用できる。クロファジミンはまた、治療期間の短縮、ピラジナミド、リファンピン、フルオロキノロン、アミカシンなどの他の抗菌剤との相乗効果、そして抗炎症作用など、結核の治療に非常に有益な他の多くの特性を示している。（Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｃｈｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７） 特に、クロファジミンは、マクロファージの取り込みと隔離に特有の親和性を示す。薬物の摂取により、マクロファージはクロファジミンを二分子膜で囲まれた液晶構造に変換する（Ｂａｉｋ ａｎｄ Ｒｏｓａｎｉａ，２０１２；Ｂａｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらのユニークな細胞内クロファジミン構造は、細胞毒性に対する保護メカニズムとして機能し、治療効果を最大化するために感染部位での薬物の動員および蓄積を可能にする可能性がある（Ｂａｉｋ ａｎｄ Ｒｏｓａｎｉａ，２０１２；Ｂａｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

既存の市販のクロファジミン経口製剤（Ｌａｍｐｒｅｎｅ（登録商標）、ノバルティス）はマイコバクテリウムに対しては非常に活性が高いが、治療効果は、その低い水溶性（１０ｍｇ／Ｌ）、作用の開始の遅れ、および重大な副作用プロファイルによって制限されている。経口バイオアベイラビリティは、４５〜６２％の範囲であり、高い患者間変動と食物効果を示している（Ｂｏｌｌａ ａｎｄ Ｎａｎｇｉａ，２０１２；Ｃｌｏｆａｚｉｍｉｎｅ，２００８；Ｎｉｘ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｈｏｌｄｉｎｅｓｓ，１９８９）。さらに、クロファジミンはｐＨ依存性の溶解度を示し、ｐＫａ値は２．３１および９．２９である（Ｋｅｓｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。胃から腸環境への移行に伴うｐＨの変化は、クロファジミンの再結晶と沈殿を引き起こし、全身吸収を低下させる可能性がある。定常状態の濃度に達するには少なくとも３０日間の投与が必要であり、大量の負荷量を使用する必要があり、投与量に関係なく、経口投与後２週間まで殺菌活性の遅延が発生する（Ｈｏｌｄｉｎｅｓｓ，１９８９；Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。必要な高全身用量は、赤褐色皮膚と結膜変色（７５〜１００％）、腹痛、吐き気、下痢、嘔吐を含む胃腸の苦しみ（４０〜５０％）、および重度の合併症（脾臓梗塞、腸閉塞、および結晶性堆積物の蓄積による致命的な出血）などを含む（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，２００６）。さらに、経口製剤の入手可能性は限られている。米国では、Ｌａｍｐｒｅｎｅ（登録商標）は、米国食品医薬品管理局（ＦＤＡ）が管理する単一患者新薬申請（ＩＮＤ）によるＭＤＲ−ＴＢの治療にのみ利用できる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，２００４；Ｃｌｏｆａｚｉｍｉｎｅ，２００９）。明らかに、望ましくない全身性の副作用を低減し、治療効果を改善する必要性、ならびにクロファジミンのより対象を絞った製剤の必要性がある。

概要
第１の実施形態では、本開示は、０．５から１０μｍの中央粒径を有する微粉化クロファジミン粒子を含む医薬組成物を提供し、組成物は１０％未満のアモルファス材料を含む。一部の態様では、組成物は乾燥粉末である。特定の態様では、乾燥粉末は吸入用に製剤化される。特定の態様では、組成物は単一の活性成分を含み、単一の活性剤はクロファジミンである。

特定の態様では、組成物は賦形剤を実質的に含まない。一部の態様では、組成物は賦形剤を本質的に含まない。特定の態様では、組成物は、添加剤を含まない。特定の態様では、組成物は賦形剤を含まない。一部の態様では、組成物は、賦形剤、添加剤、希釈剤、担体、およびアジュバントを含まない。特定の態様では、組成物は、糖、滑剤、帯電防止剤、付着防止剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、アミノ酸、ペプチド、界面活性剤、脂質（例えば、ロイシン、イソロイシン、リジン、バリン、および／またはメチオニン）、ならびにリン脂質を含まない。特定の態様では、組成物は、ＤＭＳＯ、シクロデキストリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、およびコロイダルシリカを含まないかまたは本質的に含まない。組成物は、ＤＭＳＯ、シクロデキストリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ステアリン酸マグネシウム、およびコロイダルシリカを含まなくてもよいかまたは本質的に含まなくてもよい。組成物は、例えば、１０重量％までの濃度、例えば、重量あたり０．１〜１０％、例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０重量％のラクトースを含み得る。

一部の態様では、微粉化クロファジミン粒子は実質的に結晶性である。特定の態様では、微粉化クロファジミン粒子は本質的に結晶性である。特定の態様では、微粉化クロファジミン粒子は結晶性である。

特定の態様では、組成物は、少なくとも９０重量％、少なくとも９１重量％、少なくとも９２重量％、少なくとも９３重量％、少なくとも９４重量％、または少なくとも９５重量％、例えば少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％、または少なくとも１００重量％の微粉化クロファジミン粒子を含み得る。

特定の態様では、微粉化クロファジミン粒子は、０．５〜５μｍ、例えば０．７５〜４μｍ、特に１〜３μｍの中央粒径を含み得る。一部の態様では、微粉化クロファジミン粒子の少なくとも８０％は、１〜３μｍの体積相当直径を含む。一部の態様では、微粉化クロファジミン粒子は凝集体を形成する。組成物は、１．９〜２．３ｍ^２／ｇ、例えば２．１〜２．２ｍ^２／ｇ、例えば、２．１１、２．１２、２．１３、２．１４、２．１５、２．１６、２．１７、２．１８、２．１９、または２．２ｍ^２／ｇの比表面積を有し得る。組成物は、３２〜３７、特に３３．９〜３４．０、例えば、３３．９１、３３．９２、３３．９３、３３．９４、３３．９４、３３．９５、３３．９６、３３．９７、３３．９８、３３．９９、または３４．０の圧縮性指数を有し得る。組成物は、１０〜２０、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のハウスナー比を有し得る。組成物は、１５°〜３０°、特に２１〜２３°、例えば、２２．１、２２．２、２２．３、２２．４、２２．５、２２．６、２２．７、２２．８、２２．９、または２３．０°の応答角を有し得る。

一部の態様では、組成物は、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％などの微粒子画分（ＦＰＦ）を含む。特定の態様では、組成物は、０．２％のポリソルベート８０溶解媒体を含むリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４中２４時間で３０％未満の溶解速度を含み得る。一部の態様では、組成物はリポソームに封入されていない。

特定の態様では、組成物は５％未満のアモルファス材料を含む。特定の態様では、組成物はアモルファス材料を実質的に含まない。一部の態様では、組成物は、Ｘ線回折または示差走査熱量測定によって測定された場合にアモルファス粒子を本質的に含まない。

一部の態様では、組成物は、エアジェットミリングなどのジェットミリングによって生成される。特定の態様では、組成物は、噴霧乾燥によっても超音波均質化によっても生成されない。

さらなる態様では、組成物は、単位剤形として包装される。例えば、単位剤形は、カートリッジ、ブリスター、またはカプセルとしてのパッケージであり得る。特定の態様では、単位パッケージ用量では、賦形剤を含まない。一部の態様では、単位剤形は、５〜３０ｍｇ（例えば、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍｇ）の微粉化クロファジミン粒子を含む。一部の態様では、単位剤形は、少なくとも１０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む。特定の態様では、単位剤形は、少なくとも２０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む。

さらなる態様では、乾燥粉末は、単純な乾燥粉末吸入器などの乾燥粉末吸入器に装填される。一部の態様では、乾燥粉末吸入器は能動吸入器である。他の態様では、乾燥粉末吸入器は受動的吸入器である。一部の態様では、単純な乾燥粉末吸入器は１０個未満の部品を含む。１つの特定の態様では、単純な乾燥粉末吸入器は、ＲＳＯ１単回投与乾燥粉末吸入器である。いくつかの態様では、乾燥粉末吸入器は、００１ｋＰａ^０．５分／Ｌおよび０．０６ｋＰａ^０．５分／Ｌ、例えば、０．０２ｋＰａ^０．５分／Ｌおよび０．０４ｋＰａ^０．５分／Ｌの気流抵抗を含む。

本明細書では、乾燥粉末吸入器で使用するための粉末がさらに提供され、この粉末は、賦形剤を含まない吸入可能なクロファジミン組成物のような、実施形態の微粉化クロファジミン粒子組成物を含む。

別の実施形態では、微粉化クロファジミン粒子の単位剤形を含む組成物が提供され、粒子は、０．５〜１０μｍの中央粒径を含み、組成物は、実質的に賦形剤を含まない。いくつかの態様では、単位剤形は、実施形態の微粉化クロファジミン粒子の組成物を含む。いくつかの態様では、単位剤形は、カートリッジ、ブリスター、またはカプセルに含まれる。特定の態様では、単位剤形は、少なくとも１０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む。特定の態様では、単位剤形は、少なくとも２０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む。

さらに別の実施形態では、実施形態の単位剤形を含む乾燥粉末吸入器が提供される。一部の態様では、乾燥粉末吸入器は、単純な乾燥粉末吸入器である。特定の態様では、単純な乾燥粉末吸入器は１０個未満の部品を含む。例えば、単純な乾燥粉末吸入器は、ＲＳＯ１単回投与乾燥粉末吸入器である。特定の態様では、乾燥粉末吸入器は、０．０２ｋＰａ^０．５分／Ｌおよび０．０４ｋＰａ^０．５分／Ｌの気流抵抗を含み得る。一部の態様では、乾燥粉末吸入器は、装置の１回の作動で１０〜２０ｍｇの放出用量を送達する。特定の態様では、乾燥粉末吸入器は、装置の１回の作動で５〜１５ｍｇの微粒子用量を送達する。一部の態様では、微粒子用量は、装置の１回の作動での前記放出用量の少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％または７０％である。特定の態様では、装置全体にわたる圧力降下のｋＰａから１ｋＰａへの変化が、放出用量の２５％を超える減少をもたらさない。特定の態様では、装置全体にわたる４ｋＰａから１ｋＰａへの圧力降下の変化が、微粒子の用量の１５％を超える減少をもたらさない。

さらなる実施形態では、クロファジミンを得ること、クロファジミンをジェットミルに供すること、および０．５〜１０μｍの中央粒径を有する微粉化クロファジミン粒子を収集することを含み、賦形剤の添加を含まない、実施形態の組成物（例えば、微粉化クロファジミン粒子を含む組成物）を調製する方法が提供される。一部の態様では、ジェットミルはさらにエアジェットミルとして規定される。特定の態様では、この方法は溶媒の添加を含まない。さらなる態様では、この方法はさらに、微粉化クロファジミン粒子を乾燥粉末吸入器に装填することを含む。特定の態様では、乾燥粉末吸入器は、単純な乾燥粉末吸入器である。

別の実施形態は、実施形態の微粉化クロファジミン粒子組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者の肺感染症を治療または予防するための方法を提供する。

一部の態様では、投与することは、微粉化クロファジミン粒子を患者の肺に吸入することを含む。特定の態様では、吸入することは、吸入器の使用を含む。一部の態様では、吸入器は、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、またはネブライザーである。

特定の態様では、肺感染症は細菌感染症である。特定の態様では、肺感染症はマイコバクテリア感染症である。一部の態様では、マイコバクテリア感染症は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染症、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｅｓ）感染症、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）感染症、またはマイコバクテリウム・アビウムコンプレックス感染症である。一部の態様では、結核菌は多剤耐性である。一部の態様では、結核菌は広範囲薬物耐性である。一部の態様では、肺感染症は潜伏感染症である。特定の態様では、結核菌感染症は潜伏性である。一部の態様では、肺感染症は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌関連感染症または嚢胞性線維症関連感染症などの肺炎である。

さらなる態様では、この方法は、少なくとも１つの第２の治療薬剤を投与することをさらに含む。一部の態様では、少なくとも１つの第２の薬剤は、ベダキリン、ピラジナミド、核酸阻害物質、タンパク質合成阻害物質、および細胞エンベロープ阻害物質からなる群から選択される。特定の態様では、タンパク質合成阻害物質は、リネゾリド、クラリスロマイシン、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、またはストレプトマイシンである。一部の態様では、細胞エンベロープ阻害物質は、エタンブトール、エチオナミド、チオアセチゾン、イソニアジド、イミペネム、クラブラネート、シクロセリン、テリジドン、アモキシシリン、またはプロチオナミドである。一部の態様では、核酸阻害物質は、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、４−アミノサリチル酸、モキシフロキサシン、オフロキサシン、またはレボフロキサシンである。第２の治療剤は、クロファジミン粒子組成物とは別に、直腸、経鼻、口腔、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内、または頭蓋内経路を介して、または埋め込まれた貯蔵所を介して投与することができる。第２の治療剤は、クロファジミン粒子組成物の前または後に投与することができる。

特定の態様では、微粉化クロファジミン粒子組成物は、２回以上、例えば、１日１回、隔日、３日ごと、または毎週投与される。

別の実施形態では、実施形態の微粉化クロファジミン粒子組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者のがんを治療するための方法が提供される。一部の態様では、がんは肺がんである。

さらなる態様では、この方法はさらに、抗がん剤を投与することを含む。一部の態様では、抗がん剤は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である。

特定の態様では、投与することは、微粉化クロファジミン粒子を患者の肺に吸入することを含む。特定の態様では、吸入することは、吸入器の使用を含む。一部の態様では、吸入器は、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、またはネブライザーである。特定の態様では、微粉化クロファジミン粒子組成物は複数回投与される。

さらに別の実施形態では、実施形態の微粉化クロファジミン粒子組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者の肺炎症を軽減するための方法が提供される。一部の態様では、肺炎症は、喘息、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、または嚢胞性線維症に関連している。特定の態様では、投与することは、微粉化クロファジミン粒子を患者の肺に吸入することを含む。一部の態様では、吸入することは、吸入器の使用を含む。一部の態様では、吸入器は、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、またはネブライザーである。特定の態様では、微粉化クロファジミン粒子組成物は複数回投与される。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれている。本発明は、本明細書に提示する具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら１つ以上の図面を参照することによって、よりよく理解され得る。
有機溶媒中で噴霧乾燥され賦形剤を含まないクロファジミンのＳＥＭ画像。 有機溶媒中で噴霧乾燥されたクロファジミンのＸ線結晶学回折データ。 クロファジミンの微粉化に使用されるＡｌｊｅｔミルの概略図。 Ａｌｊｅｔジェットミルのさまざまな領域から収集された粒子サイズ分布。 クロファジミン結晶の走査型電子顕微鏡画像。図５Ａは、未処理のクロファジミンである。図５Ｂは、Ａｌｊｅｔミルの収集容器領域から収集された微粉化クロファジミン粒子である。図５Ｃは、Ｓｙｍｐａｔｅｃ ＲＯＤＯＳ分散ユニットから３ ｂａｒの空気圧を適用して分散させたＡｌｊｅｔミルの収集容器領域から収集された微粉化クロファジミン粒子である。図５Ｄは、Ａｌｊｅｔミルのサイクロン領域から収集された微粉化クロファジミン粒子である。図５Ｅは、Ｓｙｍｐａｔｅｃ ＲＯＤＯＳ分散機ユニットから３ ｂａｒの空気圧を適用して分散させたＡｌｊｅｔミルのサイクロン領域から収集された微粉化クロファジミン粒子である。 粉砕および未処理クロファジミンのＸ線結晶学回折および示差走査熱量測定データ。 回収された質量の一部として回収された粒子画分および質量中央空気力学的直径（ＭＭＡＤ）測定。図７Ａは、放出フラクション（ＥＦ％）、空気力学的直径５μｍ未満の微粒子フラクション（ＦＰＦ＜５μｍ）、空気力学的直径３μｍ未満のフラクション（ＦＰＦ＜３μｍ）、および幾何学的体積中央径 ２．６９μｍおよび１．８１μｍの粉砕クロファジミン粒子のＭＭＡＤである。図７Ｂは、低抵抗ＲＳ０１ ＤＰＩによる４ｋＰａの圧力降下と低抵抗ＲＳ０１ ＤＰＩによる１ｋＰａの圧力降下の条件下でエアロゾル化された幾何学的な体積中央径１．８１μｍの粉砕クロファジミン粒子のＥＦ％、ＦＰＦ＜５μｍ、ＦＰＦ＜３μｍ、およびＭＭＡＤである。図７Ｃは、粉砕クロファジミンの次世代インパクター（ＮＧＩ）ステージ堆積パターンである。 賦形剤を含まない粉砕クロファジミンの安息角分析。 粉砕されたクロファジミンのマクロファージ食作用は対数速度で起こる。 粉砕されたクロファジミンに２４時間曝露されたＪ７７４．Ａ１マクロファージは、６６０ｎｍの発光で蛍光を発する細胞の有意な集団を示し、これはクロファジミンの細胞内生体内変化を示している。 示された量の粉砕または非粉砕クロファジミンでの処理後の対照と比較した細胞増殖。 粉砕されたクロファジミンの溶解。

例示的な実施形態の説明
ＣＦＺの副作用は用量に関連し、ＧＩに関連することが多いため、代替ルートによるＣＦＺの投与は、その副作用を軽減または少なくとも制限する可能性がある。特に、ＴＢ感染とＮＴＭ感染の開始と伝播が肺胞肺マクロファージの細胞内環境内で発生することを考えると、吸入経路を介したＣＦＺの送達は非常に有益である。経口投与とは対照的に、吸入によるＣＦＺの肺への直接ターゲティングは、肺の自然なクリアランスメカニズム（肺胞マクロファージ食作用）を利用して薬物粒子を細菌細胞内に標的化することにより、感染部位で治療薬物濃度を迅速に達成するために使用できる。ＣＦＺの配送に乾燥粉末吸入器を使用すると、製品がコールドチェーンでの供給を必要としないため、資源の乏しい地域での投与に適しているため、特に有利である。

溶解性は、ＣＦＺの薬学的に許容される製剤の開発に対する主要な制限要因である。ＣＦＺは水にほとんど溶けない。さらに、この非常に有益な抗生物質は、他のさまざまな溶媒への溶解度が限られている。メルクインデックスによれば、クロファジミンは、ＤＭＦとベンゼンに可溶であり、１５部のクロロホルム、７００部のエタノール、１０００部のエーテルに可溶であり、アセトンと酢酸エチルにやや溶けにくく、水にほとんど溶けない。メタノール中の０．１％クロファジミン溶液が形成される可能性があることも報告されている（Ｓａｂｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。産業用Ｑ３Ｃ不純物に関するヒト用医薬品の技術要件の調和に関する国際理事会（ＩＣＨ）ガイダンス：残留溶媒はベンゼンをクラス１の溶媒として認識する（薬物製品の製造に使用してはいけない。２ｐｐｍの濃度制限）；クロロホルム、メタノール、アセトニトリルであり、クラス２の溶媒である（固有の毒性のため、薬物製品では制限されている；それぞれ６０ｐｐｍ、３０００ｐｐｍ、４１０ｐｐｍ）；そして希酢酸とエタノールは、クラス３の溶剤として認識されている。完全溶解に必要な大量とこれらの溶媒の使用の安全性の制限の両方を考慮すると、噴霧乾燥などの乾燥粉末製剤に一般的に使用される建設的（ボトムアップ）粒子工学技術による呼吸可能なＣＦＺ粒子の製造は非常に困難である。呼吸に適したＣＦＺ粒子の噴霧乾燥を成功させるには、肺堆積に適した製品を製剤化するために、ロイシンまたはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）などの賦形剤を製剤に追加する必要があると報告されている。（Ｇｅｒｍｉｓｈｕｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｓａｂｎｉｓ，２０１５）。エタノールまたはメタノールなどの有機溶媒中で純粋なＣＦＺを噴霧乾燥すると、分散性の悪い針状結晶が形成される（図１）。ＣＦＺの過飽和溶液が液体フィード用に配合されている場合、液滴が完全に乾燥する前に薬物が液体フィードから沈殿するために、マルチモデルサイズ分布が生じる。溶媒へのＣＦＺの完全な溶解として定義される飽和溶液が有機溶媒供給用に製剤化される場合、ＣＦＺの部分的にアモルファス製剤をもたらし、これは物理化学的不安定性になりやすい（図２）。したがって、これらの制限を克服するための方法が必要である。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、吸入用の賦形剤を含まないクロファジミン乾燥粉末組成物を提供する。本吸入可能なクロファジミン組成物は、０．５〜１０μｍ、特に０．７５〜４μｍの範囲の中央粒径範囲内の粒子を有し得、これにより、肺送達のための効率的なエアロゾル化が可能になる。特に、本組成物は、単純な受動的乾燥粉末吸入装置などからの患者の吸入流量に関係なく、高用量を提供することができる。さらに、クロファジミン粒子は肺胞マクロファージに迅速かつ効率的に取り込まれ、細胞内感染の標的化を可能にし、徐放性および抗感染性の活動のための薬物リザーバーを提供する。本研究は、微粉化されたクロファジミンが肺胞マクロファージに取り込まれると、低毒性で抗炎症性の結晶様の形態に急速に変換されることを発見した。この結晶様形態は、治療効果の作用の迅速な開始に有益であり、現在利用可能な剤形で最長２週間遅延され得る。

さらに、本発明の組成物の低い水溶性は、肺溶解および全身吸収を制限し、それにより全身副作用を低減する。マクロファージに送達されると、結晶は生体内変化および隔離の結果を受け、これは抗炎症作用および作用部位での蓄積に関連している。薬物の可溶化形態と比較して、本組成物はマクロファージ毒性を低減している。さらに、本発明の組成物は、噴霧乾燥などの方法から生じる可能性があり、あまりに急速な溶解および薬物沈殿をもたらす可能性があるアモルファス粒子を実質的に含まない。実際、本組成物は溶解度を低下させ、粒子のマクロファージ取り込みを可能にする。

本開示はさらに、市販の生のクロファジミン結晶をエアジェットミリングなどのジェットミリングに供し、０．５〜１０μｍなどの、特に５μｍよりも大きい特定の中央粒径範囲内のクロファジミンの画分を収集することにより、吸入可能クロファジミン組成物を生成するための方法を提供する。いくつかの態様では、微粒子画分を増大させるために、出力クロファジミンをミルに再適用することができる。したがって、本方法は、クロファジミン乾燥粉末組成物を生成するための、機械的に単純で、環境に優しく、費用効果の高い微粉化方法である。

さらなる実施形態は、本明細書で提供される吸入可能なクロファジミン組成物を投与することによって疾患を治療または予防する方法を提供する。例えば、治療は、肺感染、例えば、潜伏感染症を含む結核肺感染症、肺炎（例えば、ＭＲＳＡ）、嚢胞性線維症肺感染、炎症性肺感染症、および肺がんを治療するために使用することができる。特に、吸入可能なクロファジミンは、マイコバクテリウム感染症の治療に使用できる。

ＩＩ．定義
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、組成物が、活性剤（例えば、クロファジミン）以外の成分（例えば、賦形剤）を１％未満含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、具体的な構成要素に関して「本質的に含まない」は、具体的な構成要素が、組成物に意図的に配合されていないか、および／または混入物質として、または痕跡量のみが存在することを意味するために本明細書で使用される。組成物の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、具体的な構成要素が標準的な分析方法を用いて分析不可能である組成物である。

本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲では、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味し得る。本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「含む」という単語と併せて使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は、１つまたは複数を意味し得る。本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲では、「別の」または「さらなる」は、少なくとも１つの第２以上のを意味する場合がある。

用語「約（ａｂｏｕｔ）」、「実質的に」、および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、一般的に、示された値のプラスまたはマイナス５％を意味する。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、用語「微粉化」は、物質が、非常に細かい粒子に、通常は１０μｍ未満、好ましくは０．５〜５ｕｍ、より好ましくは１〜３ｕｍに分解されるまたは分解されたことを示すために使用される。物質は、粉砕、粉砕、または粉砕によって微粉化することができる。粉砕は、エアジェットミル、ボールミル、湿式ミル、高圧均質化、または低温ミルなどの、当技術分野で知られている任意の方法によって実施することができる。

本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲では、「エアジェットミル」という用語は、粒子を互いにまたはミルの壁に衝突させるために圧縮ガスのジェットを使用することによって粒子サイズを減少させる（それにより粒子を粉砕する）装置または方法を指す。エアジェットミルを使用して粒子を微粉化することができる。Ａｌｊｅｔ Ｍｏｄｅｌ ００ Ｊｅｔ−Ｏ−Ｍｉｚｅｒ（商標）（Ｆｌｕｉｄ Ｅｎｅｒｇｙ、Ｔｅｌｆｏｒｄ、ＰＡ）などのエアジェットミルは市販されている。

本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲では、「ボールミル」という用語は、対象となる粒子および粉砕媒体をシリンダーの内部に加え、シリンダーを回転させることによって粒子サイズを小さくする装置または方法を指す。対象となる粒子は、粉砕媒体が回転するときにシリンダーの外部に沿って上昇および下降するときに分解される。

本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲では、「湿式粉砕機」または「媒体粉砕機」という用語は、液体および粉砕媒体を含む媒体を含む、攪拌機を備えた装置に対象となる粒子を加えることによって粒径を減少させる装置または方法を指す。対象となる粒子を加えると、攪拌機が回転すると、分散剤のエネルギーによって粉砕媒体と対象となる粒子が接触し、対象となる粒子が分解される。

本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲では、「高圧均質化」という用語は、対象の粒子を破壊するために圧力と機械力の両方を組み合わせる装置に対象の粒子を加えることによって粒径を低減する方法を指す。高圧均質化で使用される機械力には、特に衝撃、せん断、キャビテーションなどがある。

本明細書で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲では、用語「極低温ミル」は、最初に対象の粒子をドライアイス、液体窒素、または他の極低温液体で冷却し、続いて対象の粒子を粉砕してサイズを小さくすることにより、粒子サイズを小さくする装置または方法を指す。

「組成物」、「医薬組成物」、「製剤」、および「調製物」という用語は、本明細書では同義的かつ互換的に使用される。

「クロファジミン」という用語は、非塩および塩の形態（例えば、クロファジミンメシレート）、エステル、非塩および塩の形態の無水物および水和物の形態、非塩および塩の形態の溶媒和物、そのエナンチオマー（ＲおよびＳ形態、ｄおよびｌ形態としても識別される場合がある）、およびこれらの エナンチオマーの混合物（例えば、ラセミ混合物、またはエナンチオマーの一方が他方に比べて濃縮されている混合物）を含む、その形態のいずれかのＮ，５−ビス（４−クロロフェニル）−３−（１−メチルエチルイミノ）−５Ｈ−フェナジン−２−アミンを指す。

ある疾患または状態を「治療する」または治療は、その疾患の徴候または症状を軽減するための努力において、１つ以上の薬物を患者に投与することを含んでいてもよいプロトコールを実施することを指す。治療の望ましい効果としては、疾患の進行速度を下げること、疾患状態を軽減するか、またはやわらげること、寛解および予後の向上が挙げられる。緩和は、疾患または状態の徴候または症状が現れる前に起こってもよく、または現れた後に起こってもよい。したがって、「治療する」または「治療」は、疾患または望ましくない状態を「予防する」または「予防」を含んでいてもよい。これに加え、「治療する」または「治療」は、徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には、患者に対する限界効果のみを有するプロトコールを含む。

「治療上の利益」または「治療上有効な」との用語は、本明細書全体で使用される場合、この状態の医学的治療に関し、被験体の良好な状態を促進するか、または向上させる何かを指す。限定されないが、疾患の徴候または症状の頻度または重篤度の減少が含まれる。例えば、がんの治療は、例えば、腫瘍の大きさの減少、腫瘍の侵襲性の減少、がんの成長速度の減少、または転移の予防を含んでいてもよい。がんの治療は、がんを有する被験体の生存を長引かせることも指す。

「対象」および「患者」は、霊長類、哺乳動物、および脊椎動物などのヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。

本明細書で一般的に使用される「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題、または合理的な利益／リスク比に見合った合併症なしにヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液との接触での使用に適している化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。

「薬学的に許容される塩」は、上記で定義されるように薬学的に許容され、所望の薬理学的活性を有する、本明細書に開示される化合物の塩を意味する。そのような塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、または、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、３−フェニルプロピオン酸、４，４’−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクタ−２−エン−１−カルボン酸、酢酸、脂肪族モノ−およびジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、フェニル置換アルカン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、ターシャリーブチルアセテート酸、トリメチル酢酸などの有機酸で形成された酸付加塩が含まれる。薬学的に許容される塩には、存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応することができる場合に形成され得る塩基付加塩も含まれる。許容される無機塩基には、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム、および水酸化カルシウムが含まれる。許容される有機塩基には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどが含まれる。本発明の任意の塩の一部を形成する特定のアニオンまたはカチオンは、塩が全体として薬理学的に許容される限り、重要ではないことを認識すべきである。医薬的に許容される塩およびその調製方法および使用方法のさらなる例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ｕｓｅ。（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ＆Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ ｅｄｓ．，Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００２）

「薬学的に許容される担体」、「薬物担体」、または単に「担体」は、化学剤の運搬、送達、および／または輸送に関与する有効成分医薬と共に製剤化された薬学的に許容される物質である。薬物担体は、薬物の送達および有効性を改善するために使用され得、例えば、薬物の生物学的利用能を調節し、薬物代謝を減少させ、そして／または薬物毒性を低減するための制御放出技術を含む。一部の薬物担体は、特定の標的部位への薬物送達の有効性を高める可能性がある。担体の例には、リポソーム、ミクロスフェア（例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）でできている）、アルブミンミクロスフェア、合成ポリマー、ナノファイバー、タンパク質−ＤＮＡ複合体、タンパク質複合体、赤血球、ウイロソーム、およびデンドリマーが含まれる。

「その誘導体」という用語は、化学的に修飾された多糖を指し、モノマー糖単位の少なくとも１つは、原子または分子基または結合の置換によって修飾されている。ある１つの実施形態では、その誘導体はその塩である。塩は、例として、適切な鉱酸、例えば、ハロゲン化水素酸、硫酸またはリン酸、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩またはリン酸塩、適切なカルボン酸、例えば、場合によりヒドロキシル化された低級アルカン酸との塩、例えば、酢酸、グリコール酸、プロピオン酸、乳酸またはピバル酸、任意にヒドロキシル化および／またはオキソ置換低級アルカンジカルボン酸、例えばシュウ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、ピルビン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、および芳香族、ヘテロ芳香族または芳香脂肪族カルボン酸、例えば安息香酸、ニコチン酸またはマンデル酸、および適切な脂肪族または芳香族スルホン酸またはＮ−置換スルファミン酸、例えばメタンスルホン酸塩との塩、ベンゼンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネートまたはＮ−シクロヘキシルスルファメート（シクラメート）などである。

本明細書で使用される「溶解」という用語は、固体物質、ここでは活性成分が媒体中に分子形態で分散されるプロセスを指す。本発明の医薬用量の活性成分の溶解速度は、液体／固体界面、温度および溶媒組成の標準化された条件下で単位時間あたり溶液になる薬物物質の量によって規定される。

「活性成分」（ＡＩ）（活性化合物、活性物質、活性剤、医薬剤、薬剤、生物学的活性分子、または治療用化合物とも呼ばれる）は、生物学的に活性な医薬薬物中の成分である。医薬有効成分（ＡＰＩ）およびバルク有効成分と同様の用語は、医学でも使用される。

本明細書で使用される場合、「賦形剤」とは、投与を容易にするため、または対象へのＡＰＩの送達のため、またはＡＰＩの対象の作用部位への送達のために薬学的に使用できる薬物製剤への処理を容易にするために使用される比較的不活性な物質である薬学的に許容される担体を指す。賦形剤の非限定的な例には、安定剤、界面活性剤、表面修飾剤、溶解促進剤、緩衝剤、カプセル化剤、抗酸化剤、保存剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、増粘剤、および吸収促進剤が含まれる。

本明細書で使用する場合、「エアロゾル」という用語は、固体または液体粒子の空気中の分散を指し、そのサイズは、十分に細かく、その結果、沈降速度が低く、空気中の安定性が比較的高い。（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｖ．，Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ．１９７３，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａ．Ｐａ．，ｐｐ．２）．「クロファジミンエアロゾル」は、人または動物の気道への送達を目的とした、賦形剤を本質的に含まない微粉化クロファジミンからなる。

本明細書で使用される場合、「吸入」または「肺吸入」は、それらが肺、特定の実施形態では肺の肺胞領域に到達するように吸入による医薬調製物の投与を指すために使用される。通常、吸入は口を介して行われるが、別の実施形態では、鼻からの吸入を伴う場合がある。

本明細書で使用される場合、「乾燥粉末」は、水性液体に懸濁または溶解されていない微粒子組成物を指す。

「単純な乾燥粉末吸入器」とは、医薬を気道に送達するための装置を指し、ここで、医薬は、乾燥粉末として、単回使用の単回用量で送達される。特定の態様では、単純な乾燥粉末吸入器は、１０個未満の作動部品を有する。いくつかの態様では、単純な乾燥粉末吸入器は受動的吸入器であり、分散エネルギーは、外部エネルギー源の適用を介するのではなく、患者の吸入力によって提供される。

「中央粒径」とは、レーザー回折または画像分析によって測定される幾何学的直径を指す。一部の態様では、粒子の少なくとも８０％は、中央粒径範囲にある。

「質量中央空気力学直径（ＭＭＡＤ）」は、空気力学的直径（幾何学的直径とは異なる）を指し、カスケード衝突または飛行時間によって測定される。

「アモルファス」という用語は、分子が明確な格子パターンで組織化されていない非結晶性固体を指す。一部の態様では、組成物の１０％未満が、クロファジミンのアモルファス固体形態であり得る。

ＩＩＩ．吸入用のクロファジミン組成物
特定の実施形態では、本開示は、吸入可能なクロファジミン（またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩）組成物を提供する。クロファジミン組成物は、ネイティブのクロファジミンをジェットミリングして吸入用の結晶性クロファジミン粒子を生成することにより生成でき、これは、０．５〜１２μｍ、例えば約０．５μｍ〜１０μｍ、好ましくは１μｍ〜６μｍなど、より好ましくは約２〜４μｍの中央粒径を有することができる。サイズの範囲が比較的狭い吸入粒子を作製することにより、薬物送達システムの効率をさらに向上させ、投薬の再現性を改善することが可能である。したがって、粒子は、０．５μｍ〜１２μｍまたは２μｍ〜６μｍまたは約０．７５〜４μｍの範囲のサイズを有するだけでなく、中央粒径が８０％以上になるように狭い範囲内にあることが好ましい。製剤中のより多くの粒子は、中央粒径の±２０％、好ましくは±１０％、より好ましくは中央粒径の±５％以内の粒径を有する。粒子径の中央値は、０．５〜８μｍ、０．７５〜５μｍ、０．５〜４μｍ、０．７５〜４μｍ、０．７５〜３μｍ、１〜３μｍ、または１．５〜３μｍの範囲である。一部の態様では、２〜４μｍなどのこれらのサイズ範囲の結晶性粒子（すなわち、ナノ粒子）は、サイズがより大きい凝集物を形成し得るが、上記の範囲内の粒子を含むようレーザー回折を使用して測定され得る。

一部の態様では、粒子は貧溶媒中に存在し、穏やかな撹拌下でレーザー回折を使用して測定して、中央粒径を決定することができる。他の態様では、粒子の中央値は、最大剪断力を使用する分散システム（例えば、Ｓｙｍｐａｔｅｃ Ｒｏｄｏｓ）を使用して、粒子が乾燥粉末として分散された状態で測定することができる。

クロファジミン組成物は結晶形態であってよい。結晶性クロファジミン分子は、あらゆる方向に伸びる高度に組織化された規則的で反復的な構造に配置されている。結晶性クロファジミンは、１０％未満のアモルファス粒子を含む場合がある。特定の実施形態では、結晶性クロファジミンはアモルファス粒子を有さない場合がある。一部の実施形態では、結晶性クロファジミン中のアモルファスクロファジミンの量は、０〜１０％、０．１〜１０％、０．１〜５％、１〜１０％、または１〜５％であってよい。結晶性組成物は、それらの高度に秩序だった性質のため、溶解が遅い場合がある。

吸入可能なクロファジミン組成物は、単一の活性成分（すなわち、クロファジミン）を含んでもよく、したがって、他の活性成分を含まなくてもよい。組成は、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１、少なくとも９２、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、少なくとも９９、または少なくとも１００％のクロファジミンであってよい。

特定の実施形態では、本明細書で提供される吸入可能なクロファジミン組成物は、賦形剤および添加剤を本質的に含まない。特定の態様では、本組成物はいずれの賦形剤の追加がない。本クロファジミン組成物は、１０％未満、例えば５％未満、具体的には１％未満、特に０．１％未満、例えば０．０１％未満のサイコデキストリン、無水グルコース、無水ラクトース、ラクトース一水和物、マンニトール、単糖、二糖、オリゴ糖、臭化アクリジニウム、フマリルジケトピペラジン、ステアリン酸マグネシウム、酢酸セルビオース、水、エタノール、イソプロピルアルコール、Ｌ−ロイシン、デキストラン、キトサン、脱アセチル化キトサン、アスコルビン酸、ステアリン酸、プルロニックＦ−６８、プルロニックＦ−１２７、デオキシコール酸、モノステアリン酸グリセリル、大豆ホスファチジルコリン、ポロキサマー１８８、プレシロールＡＴＯ５、カプリオール９０、ラウリン酸、カルシウム二ナトリウムＥＤＴＡ、ポリ（ビニルアルコール）、デオキシコール酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、レシチン、セチルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリカプロラクトンジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、Ｌａｃｔｏｈａｌｅ ３００Ｍ、Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ １５０Ｍ、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、デオキシコール酸ナトリウム、ポリ（ε−カプロラクトン）、コレステロール、ジクロロメットハネ、ステアリルアミングラフト化デキストラン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、アルギン酸ナトリウム、コンプリトール８８８、トリステアリン、シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、シリカ、ポビドン、デンプン、ポリエチレングリコール、カルボマー、ポリ（乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリメチルメタクリレート、アクロレイン、グリシジルメタクリレート、ラクチド、ポリ（シアノアクリル酸アルキル）、ポリ無水物、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（アクリル）デキストラン、ポリ（アクリル）デンプン、カラギーナン、ゼラチンを含み得る。

さらなる実施形態は、本明細書で提供される吸入可能なクロファジミン組成物を生成する方法を提供する。天然のクロファジミン（すなわち、市販のクロファジミン）は、ジェットミリング、特にエアジェットミリングなどのミリングに供されて、本明細書に提供される賦形剤を含まない吸入可能なクロファジミン組成物を生成し得る。本方法で使用することができる例示的なエアジェットミルには、Ａｌｊｅｔ流体エネルギーミル、Ｊｅｔ Ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ Ｍｉｃｒｏｎ−Ｍａｓｔｅｒミル、およびＳｔｕｒｔｅｖａｎｔ Ｍｉｃｒｏｎｉｚｅｒ Ｊｅｔミルが含まれるが、これらに限定されない。

１つの例示的な方法において、天然のクロファジミンは、実験室規模のＡｌｊｅｔエアジェットミル（Ｍｏｄｅｌ ００ Ｊｅｔ−Ｏ−Ｍｉｚｅｒ（商標）、Ｆｌｕｉｄ Ｅｎｅｒｇｙ、Ｔｅｌｆｏｒｄ、ＰＡ）を使用して、呼吸可能な範囲０．５〜５μｍ内の粒径分布に微粉化され得る。エアジェットミルは、約７０〜８０ ＰＳＩ、例えば約７５ ＰＳＩの粉砕圧力、約６０〜７０ ＰＳＩ、例えば約６５ ＰＳＩの供給圧力、および約０．５〜２グラム／分、例えば約１グラム／分の供給速度に設定できる。約１〜２０、例えば約５〜１０、特に約３〜４．５グラムのＣＦＺをバッチごとに粉砕できる。粉砕された各バッチの幾何学的粒径分布は、ＲＯＤＯＳ分散を３〜４ ｂａｒで使用するレーザー回折装置、例えば、ＨＥＬＯＳレーザー回折装置（Ｓｙｍｐａｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ）で評価できる。粉末分散後、１０ミリ秒ごとに測定を行うことができる。５〜２５％の光学濃度の測定値を平均して、粒子サイズの分布を決定できる。

ＩＶ．使用方法
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される吸入可能なクロファジミン組成物を投与することを含む、肺感染症の治療または予防のための方法を提供する。感染症は、結核菌、多剤耐性結核菌、広範囲薬物耐性結核菌、マイコバクテリウム・アビウムコンプレックス、マイコバクテリウム・アブセサス、マイコバクテリウム・カンサシ、黄色ブドウ球菌、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療は、肺感染症と診断された家族の一員を有する対象、肺感染率の高い地域に旅行する対象、または医療従事者など、肺感染症を発症するリスクのある対象に対して予防的であり得る。

本開示は、本明細書で提供される吸入可能なクロファジミン組成物を投与することにより、肺炎症を治療、軽減、または防止する方法をさらに提供する。例えば、方法は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症などの呼吸器疾患を有する対象に適用されてもよい。本発明の文脈における呼吸障害には、喘息、気腫、気管支炎、ＣＯＰＤ、副鼻腔炎、呼吸抑制、反応性気道機能不全症候群（ＲＡＤＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、刺激性誘発喘息、職業性喘息、知覚過敏症、気道（または肺）炎症、複数の化学物質過敏症、および禁煙療法の支援が含まれるが、これらに限定されない。「喘息」という用語は、急性喘息、慢性喘息、間欠性喘息、軽度の持続型喘息、中程度の持続型喘息、重度の持続型喘息、軽度から中程度の喘息、軽度から中程度の持続型喘息、軽度から中程度の慢性持続型喘息、アレルギー性（外因性）喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、夜間喘息、気管支喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息、季節性喘息、無症候性喘息、胃食道喘息、特発性喘息、咳喘息などを指す場合がある。

さらなる実施形態では、本明細書で提供される吸入可能なクロファジミン組成物を投与することによる、肺炎症の軽減などの肺がんの治療のための方法が提供される。別の実施形態では、吸入可能なクロファジミン組成物は、造影剤として機能するように投与される。

一部の実施形態では、微粉化クロファジミンによる患者の治療は、調節された薬物放出を含み得る。一部の実施形態において、微粉化クロファジミンは、徐放または遅延放出のために製剤化され得る。一部の実施形態において、微粉化クロファジミンは、迅速放出のために製剤化され得る。さらなる実施形態において、微粉化クロファジミンは、遅い放出および速い放出の両方のために製剤化され得る（すなわち、二重放出プロファイル）。

一部の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される吸入可能なクロファジミン組成物の投与のための方法を提供する。投与は、吸入器を使用する微粉化クロファジミンの吸入に限定されないが、あり得る。一部の実施形態では、吸入器は、Ｐｌａｓｔｉａｐｅ ＲＳＯ１単回投与ＤＰＩなどの単純な受動的乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）である。単純な乾燥粉末吸入器では、乾燥粉末はカプセルまたはリザーバーに保管され、推進剤を使用せずに吸入により肺に送達される。

一部の態様では、吸入器の使用に必要な、必要な吸気流量は、９５Ｌ未満／分、例えば約９０Ｌ／分、例えば約１５〜９０Ｌ／分、好ましくは約３０Ｌ／分であってよい。一部の実施形態では、微粉化クロファジミンの効率的なエアロゾル化は、吸気力とは無関係である。

一部の実施形態では、吸入器は、ＤｏｓｅＯｎｅ（商標）、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ、Ｒｏｔｏｈａｌｅｒ（登録商標）、Ａｅｒｏｌｉｚｅｒ（登録商標）、またはＨａｎｄｉｈａｌｅｒなどの単回投与ＤＰＩである。一部の実施形態では、吸入器は、Ｐｌａｓｔｉａｐｅ ＲＳ０２、Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（登録商標）、Ｔｗｉｓｔｈａｌｅｒ（商標）、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（登録商標）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）、またはＥｌｌｉｐｔａ（商標）などの複数回投与ＤＰＩである。一部の実施形態では、吸入器は、Ｔｗｉｎｃｅｒ（登録商標）、Ｏｒｂｉｔａｌ（登録商標）、ＴｗｉｎＣａｐｓ（登録商標）、Ｐｏｗｄａｉｒ、Ｃｉｐｌａ Ｒｏｔａｈａｌｅｒ、ＤＰ Ｈａｌｅｒ、Ｒｅｖｏｌｉｚｅｒ、Ｍｕｌｔｉ−ｈａｌｅｒ、Ｔｗｉｓｔｅｒ、Ｓｔａｒｈａｌｅｒ、またはＦｌｅｘｈａｌｅｒ（登録商標）である。一部の実施形態では、吸入器は、Ｐｌａｓｔｉａｐｅ ＲＳ０４ ｐｌｕｒｉｍｏｎｏｄｏｓｅ ＤＰＩなどの複数の医薬の単回用量の同時送達のためのｐｌｕｒｉｍｏｎｏｄｏｓｅ ＤＰＩである。乾燥粉末吸入器は内部リザーバーに医薬を保管しており、医薬は推進剤の使用の有無にかかわらず吸入により送達される。乾燥粉末吸入器は、約３０〜１２０Ｌ／分のような、効果的な送達のために３０Ｌ／分を超える吸気流速を必要とする場合がある。一部の実施形態では、微粉化クロファジミンの効率的なエアロゾル化は、吸気力とは無関係である。一部の実施形態では、乾燥粉末吸入器は、０．０２ｋＰａ^０．５分／Ｌ〜０．０４ｋＰａ^０．５分／Ｌなど、０．０１ｋＰａ^０．１分／Ｌ〜０．０６ｋＰａ^０．５分／Ｌの流動抵抗を有する。

一部の実施形態では、吸入可能なクロファジミンは、ＨＦＡ噴射剤またはＱＮａｓｌなどの噴射剤製剤として送達される。

一部の実施形態では、吸入器は、定量吸入器であり得る。定量吸入器は、噴射剤の使用によって補助されたエアロゾル化された薬の短いバーストで、規定量の医薬を肺に送達する。定量吸入器は、キャニスター、計量バルブ、アクチュエーターの３つの主要部分を含む。噴射剤および必要な賦形剤を含む医薬製剤は、キャニスターに保管される。計量弁は、規定された量の医薬製剤が分配されることを可能にする。定量吸入器またはマウスピースのアクチュエーターには、対応する吐出ノズルが含まれており、通常、汚染を防ぐためにダストキャップが含まれている。

一部の実施形態では、吸入器はネブライザーである。ネブライザーは、肺に吸入されるエアロゾル化されたミストの形で医薬を送達するために使用される。医薬製剤は、圧縮ガスまたは超音波によってエアロゾル化される。ジェットネブライザはコンプレッサに接続されている。コンプレッサは、液体の医薬製剤を通じて高速で圧縮ガスを放出し、医薬製剤をエアロゾル化させる。その後、エアロゾル化された医薬製剤が患者に吸入される。超音波ネブライザーは高周波超音波を発生させ、医薬製剤の液体リザーバーと接触する内部要素の振動を引き起こし、医薬製剤をエアロゾル化させる。その後、エアロゾル化された医薬が患者に吸入される。ネブライザーは、約３Ｌ〜１２Ｌ／分の間の流量、例えば約６Ｌ／分の流量を利用することができる。一部の実施形態では、ネブライザーは乾燥粉末ネブライザーである。

一部の実施形態では、組成物は、日常的なスケジュールで投与されてもよい。本明細書で使用される場合、定期的なスケジュールは、所定の指定された期間を指す。定期的なスケジュールは、スケジュールが事前に決定されている限り、同一であるか、または長さが異なる期間を包含し得る。例えば、定期的なスケジュールは、１日２回、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、毎週、毎月または任意の設定された日数またはその間の週。あるいは、所定の定期的スケジュールは、第１週に１日２回の投与、その後数ヶ月間毎日の投与などを含み得る。いくつかの実施形態では、クロファジミンは１日１回投与される。好ましい実施形態では、クロファジミンは、１日おき、１日おき、１日おき、または週１回など、１日１回未満で投与される。一部の実施形態では、クロファジミンの完全用量は、１〜１００ｍｇ、例えば、２０〜１００、５０〜１００、１０〜２０、２０〜４０、５０〜７０、または８０〜９０ｍｇである。

一部の実施形態では、クロファジミンは、カプセル、ブリスター、またはカートリッジなどの単位剤形で提供されてもよく、単位用量は、用量あたり少なくとも１５ｍｇまたは少なくとも２０ｍｇのクロファジミンなどの少なくとも１０ｍｇのクロファジンを含む。特定の態様では、単位剤形は、いずれの賦形剤の投与も添加も含まず、吸入のために粉末を保持するためにのみ使用される（すなわち、カプセル、ブリスター、またはカートリッジは投与されない）。一部の実施形態では、クロファジミンは、少なくとも１０ｍｇ、好ましくは少なくとも１５ｍｇ、さらにより好ましくは２０ｍｇなどの高放出用量で投与することができる。一部の実施形態では、微粉化クロファジミンの投与は、深部肺への５ｍｇを超えるような高微粒子用量をもたらす。好ましくは、肺深部への微粒子投与量は少なくとも１０ｍｇ、さらにより好ましくは少なくとも１５ｍｇである。一部の態様では、微粒子用量は、放出用量の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、または少なくとも８０％である。

一部の実施形態では、装置全体にわたる圧力降下の変化は、放出用量の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、装置全体にわたる圧力降下の３ｋＰａの変化、例えば４ｋＰａから１ｋＰａへの変化は、放出用量の２５％未満、例えば、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、またはそれ未満の減少をもたらす。一部の実施形態では、装置全体にわたる吸入圧力降下の変化は、微粒子用量の変化をもたらす。一部の実施形態では、装置全体にわたる吸入圧力降下の３ｋＰａの変化、例えば４ｋＰａから１ｋＰａの変化は、微粒子用量の１５％未満、例えば、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、またはそれ未満の減少をもたらす。

一部の実施形態では、クロファジミンの溶解速度が測定される。一部の実施形態では、結晶性クロファジミンは溶解速度が遅い。一部の実施形態では、クロファジミンの溶解速度は、クロファジミンの質量で２５、２０、１５、または１０％未満などの３０％以下が、添加から１５分以内に溶解媒体に溶解するようなものである。一部の実施形態では、溶解媒体は、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４＋０．２％ポリソルベート８０である。

一部の実施形態では、クロファジミンは、Ｊ７７４．Ａ１マクロファージ培養物によって内部移行される。一部の実施形態では、クロファジミンは結晶性である。一部の実施形態では、クロファジミンは微粉化されている。一部の実施形態では、微粉化結晶性クロファジミン粒子は、Ｊ７７４．Ａ１マクロファージ培養物によって内部移行される。さらなる実施形態において、マクロファージによる粒子の内部移行の速度は高く、例えば、８時間のインキュベーション後に８０％を超える内部移行である。一部の実施形態では、マクロファージは、クロファジミンを異なる結晶様形態に変換する。一部の実施形態では、クロファジミンの結晶形の変化は、蛍光シフトによって検出される。一部の実施形態では、蛍光シフトは、約５９０ｎｍから約６６０ｎｍである。一部の実施形態では、蛍光シフトは短時間で起こる。一部の実施形態では、蛍光シフトは、７日、６日、５日、４日、３日、２日などの１週間以内、または２４時間以内に発生する。

一部の実施形態では、本明細書で提供される治療方法は、少なくとも１つの第２の治療薬を投与することをさらに有し得る。第二の薬剤は、ベダキリン、ピラジナミド、核酸阻害物質、タンパク質合成阻害物質、および細胞エンベロープ阻害物質であり得るが、これらに限定されない。タンパク質合成阻害物質のグループには、リネゾリド、クラリスロマイシン、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、およびストレプトマイシンが含まれるが、これらに限定されない。細胞エンベロープ阻害物質群には、エタンブトール、エチオナミド、チオアセチゾン、イソニアジド、イミペネム、クラブラネート、シクロセリン、テリジドン、アモキシシリン、およびプロチオナミドが含まれ得るが、これらに限定されない。核酸阻害物質の群は、限定されないが、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、４−アミノサリチル酸、モキシフロキサシン、オフロキサシン、およびレボフロキサシンを含み得る。一部の実施形態では、第２の治療剤はクロファジミンであってよい。他の例示的な薬剤には、バンコマイシン、トブラマイシン、シプロフロキサシン、ホスホマイシン、およびリファキシミンが含まれるが、これらに限定されない。併用療法は、同時に、逐次的に、または別々に投与することができる。

本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる具体例として与えられていることが理解されるべきである。本発明の精神および範囲内の種々の変更および改変が、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。

ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように本願発明者によって開発された技術を表し、そのため、その実施のための好ましい態様を構成すると考えることができることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示の観点で、開示される具体的な実施形態において、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同じまたは同様の結果が依然として得られる多くの変更をなし得ることを理解するべきである。

実施例１ - 材料と方法
クロファジミンの微粉化：ラボスケールのＡｌｊｅｔエアジェットミル（Ｍｏｄｅｌ ００ Ｊｅｔ−Ｏ−Ｍｉｚｅｒ（商標）、Ｆｌｕｉｄ Ｅｎｅｒｇｙ、Ｔｅｌｆｏｒｄ、ＰＡとも知られている）を使用して、呼吸可能な範囲０．５〜５μｍ内の粒子サイズ分布にクロファジミンを微粉化した。（Ｓｉｇｍａ；Ｌｏｔ：ＳＬＢＬ８９４５Ｖ）７５ ＰＳＩの粉砕圧力と６５ ＰＳＩの供給圧力の窒素ガスを、１グラム／分の固体材料供給速度と組み合わせて使用した。粉砕された各バッチの幾何学的粒径分布は、ＨＥＬＯＳレーザー回折装置（Ｓｙｍｐａｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ）で、ＲＯＤＯＳ分散を３ ｂａｒで使用して評価された。粉末分散後、１０ミリ秒ごとに測定を行った。粒径分布を決定するために、５〜２５％の光学密度の測定値を平均した。

微粉化クロファジミンの走査型電子顕微鏡：粉砕されたクロファジミンの形態を分析するために、サンプルをアルミニウムＳＥＭスタブにマウントし、Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎスパッタコーター２０８ ＨＲ（Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、Ｗａｔｆｏｒｄ、ＵＫ）を使用して１２ｎｍのプラチナ／パラジウム（Ｐｔ／Ｐｄ）でスパッタコーティングした。イメージングは、Ｚｅｉｓｓ Ｓｕｐｒａ ４０ＶＰ ＳＥＭ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ、イェーナ、ドイツ）を使用して行った。未分散粒子とＲＯＤＯＳ分散機を３ ｂａｒで使用して分散した粒子を調べた。

Ｘ線回折結晶学および示差走査熱量測定：粉砕されたクロファジミンにおける結晶化度および多形変換の存在は、Ｘ線粉末回折（ＸＲＤ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して測定された。粉砕されていないおよび粉砕されたクロファジミン粉末の１次元回折図は、Ｒｉｇａｋｕ ＭｉｎｉＦｌｅｘ ６００ ＩＩ（Ｒｉｇａｋｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して取得し、Ｒｉｇａｋｕ Ｇｕｉｄａｎｃｅソフトウェアで制御し、４０ＫＶ電圧および４０ｍＡ電流で銅のターゲット放射線に設定した。回折図は、ジェイド（Ｒａｇａｋｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して分析した。粉砕されていないおよび粉砕されたクロファジミンのサーモグラムは、ＴＡ Ａｄｖａｎｔａｇｅソフトウェアによって制御されかつ５０ｍＬ／分の窒素パージによるＲＣＳ４０（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ−Ｗａｔｅｒｓ ＬＬＣ、Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ、ＵＳＡ）冷蔵冷却システムを備えたＡｕｔｏ Ｑ２０ ＤＳＣを使用して、取得した。各サンプル約４ｍｇを標準のＤＳＣパン（ＤＳＣ Ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ Ｉｎｃ．、ミネソタ州オースティン、米国）にロードし、Ｔｚｅｒｏサンプルプレス（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ−Ｗａｔｅｒｓ ＬＬＣ、ニューキャッスル、デラウェア州、米国）を使用して圧着した。サンプルを５℃／分の速度で３０℃から３００℃に加熱した。

賦形剤を含まない粉砕クロファジミンの比表面積分析：粉砕されたクロファジミンの比表面積は、Ｍｏｎｏｓｏｒｂガス吸着ユニット（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して評価した。３つのサンプルをガラス測定セルにロードし、ヘリウム下で８０℃で１８時間脱ガスした。シングルポイントブラウナーエメットテラー（ＢＥＴ）法と、吸着物としてヘリウム中の窒素３０ｍｏｌフラクションを使用して、各サンプルの表面積を計算した。比表面積を測定するために、ガス放出後の表面積をサンプルの重量で割った。

賦形剤を含まない粉砕クロファジミンの密度分析：賦形剤を含まない粉砕クロファジミンのバルクおよびタップ密度を評価するために、ガラス製試験管をピペットを使用して０．２５ｍＬに調整した。管を２〜３ｍＬの校正マークに対応する容量まで満たし、次に秤量してかさ密度を得た。次に、チューブを１０回たたき、容量を再測定して、タップ密度を得た。

賦形剤を含まない粉砕クロファジミンの安息角分析：賦形剤を含まない粉砕クロファジミンの安息角を評価するために、半径１．２５ｃｍ、高さ１．２ｃｍの中空の開いたシリンダーの上約４．５ｃｍに設置した漏斗から約５００〜８００ｍｇの粉砕クロファジミンを注いだ。注がれた粉末から生じるコーンの高さは、画像分析ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊを使用して決定された。３つのコーンの高さが取られ、最終的な安息角の決定のために平均された。安息角は、以下の式に従って計算された。

賦形剤を含まない粉砕クロファジミンのエアロゾル化性能の判定：Ｐｌａｓｔｉａｐｅ Ｓ．ｐ．ａ（イタリア、オスナゴ）のモデル７低抵抗単回投与ＲＳ０１ ＤＰＩと高抵抗単回投与ＲＳ０１ ＤＰＩを使用して、インビトロ空気力学的性能試験を実施した。サイズ３のヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセルは、Ｃａｐｓｕｇｅｌ Ｉｎｃ．（Ｍｏｒｒｉｓｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から提供された。カスケードインパクション研究で使用された低抵抗ＲＳ０１単回投与ＤＰＩの抵抗は、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ ６０１の装置Ｂに基づく投与量サンプリングユニットを使用して測定され、０．０２１ｋＰａ^０．５分／Ｌと計算された。カスケード衝突試験で使用された高抵抗ＲＳ０１単回投与ＤＰＩの抵抗は、０．０３６ｋＰａ^０．５分／Ｌであると報告されている。（Ｅｌｋｉｎｓ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）粉砕されたクロファジミンのカスケードインパクション研究は、次世代インパクター（ＮＧＩ）（ＭＳＰ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＮ、ＵＳＡ）で行われた。ステージ１〜７のカットオフ直径は式１を使用して決定され、ＭＯＣカットオフ直径は式２を使用して決定された。

式中、Ｄ_５０，Ｑは流量Ｑでのカットオフ直径であり、下付き文字ｎはＱ_ｎ＝６０Ｌ／分のアーカイブ参照値を指しており、かつ、指数ｘの値は、Ｍａｒｐｌｅらによって決定された、アーカイブＮＧＩステージのカットサイズ−フローレート計算によって決定された。粒子の跳ね返りと再飛散を減らすために、ＮＧＩプレートをヘキサン中の１％（ｖ／ｖ）シリコンオイルでコーティングし、乾燥させた。粉砕されたクロファジミンの空気力学的性能に対する粒子サイズの影響を判定するために、低抵抗ＲＳ０１ ＤＰＩを使用して行われた分析は、特に２番目の粉砕バッチから得られた粉砕粒子に対して行われた。粒子の２つの異なる母集団をテストした：ジェットミルのサイクロンユニットから派生した中央径（Ｄ_５０）が２．６９μｍ（ＣＦＺ２．６９μｍ）の粒子（図１）と、ジェットミルの収集容器ユニットから派生したＤ_５０が１．８１μｍの粉砕された粒子（ＣＦＺ１．８１μｍ）（図１）。装置に４リットルの空気を引き込むのに十分な時間（低抵抗ＲＳ０１装置では２．６秒、高抵抗ＲＳ０１装置では４．３秒に相当）、４ｋＰａの圧力降下（低抵抗ＲＳ０１装置では９３Ｌ／分に、高抵抗ＲＳ０１装置では５５．６Ｌ／分に相当）でこれらのサンプルにカスケード衝突を行った。粉砕されたクロファジミンの分散液の流量依存性を判定するために、装置を通して１ｋＰａの圧力降下（４７Ｌ／分に相当）でＣＦＺ１．８１μｍ粒子にカスケードインパクションを５．１秒間実行した。低抵抗ＲＳ０１装置と高抵抗ＲＳ０１装置からエアロゾル化された粉砕クロファジミンの性能を比較するために、体積中央粒径が２．４４μｍの粉砕バッチからのクロファジミンサンプル（ＲＯＤＯＳ乾燥分散を用いるＳｙｍｐａｔｅｃレーザー回折ユニットを使用して４ｂａｒ圧力で測定し、ＨＲＬＤモデルでＨＥＬＯＳソフトウェアバージョン５．６．０．０を使用して分析して、粒子サイズ分布を決定した場合）を使用した。得られた分散粉末を、エタノールまたはイソプロピルアルコールで洗浄することにより、カプセル、吸入器、アダプター、誘導ポート、ステージ１〜７、およびマイクロオリフィスコレクター（ＭＯＣ）から収集した。Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、波長４８０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより、各サンプルの薬物量を定量化した。放出画分（ＥＦ）は、収集された薬物の総質量のパーセンテージとして、装置からの放出総薬物として計算された。微粒子（＜５μｍ）画分（ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}）および微粒子（＜３μｍ）画分（ＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}）は、空気力学的直径が５μｍ未満および３μｍ未満であると予測される放出用量のパーセンテージに対応した。ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}およびＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}の値は、縦軸にＮＧＩステージの下流に堆積した放出用量の累積パーセンテージ、横軸にそのステージの粒子カットオフサイズを使用してグラフから補間された。各サンプルについて、空気力学的粒子サイズ分布（ＡＰＳＤ）の質量ベースの中央値を表す質量中央空気力学的直径（ＭＭＡＤ）、およびＡＰＳＤの広がりを表す幾何標準偏差（ＧＳＤ）は、空気力学的直径（ログスケール）に対して、指定された空気力学的サイズカット（プロビットとして表している）未満の質量の累積パーセンテージをプロットする。分布は対数正規であった。線形回帰を実行して、ＭＭＡＤを決定するために５０％パーセンタイル（プロビット５）に対応する空気力学的直径を決定し、ＧＳＤを計算するために１５．８７％パーセンタイル（プロビット４）および８４．１３％パーセンタイル（プロビット６）に対応する空気力学的直径を決定した。

ラクトースとブレンドした粉砕クロファジミンのエアロゾル化性能の判定：４バールの圧力でＲＯＤＯＳ分散を用いるＳｙｍｐａｔｅｃレーザー回折装置を使用して測定した、２．４４μｍの中央粒径を含む粉砕されたクロファジミンは、７０〜１１０μｍの中央粒径を持つと報告されているＩｎｈａｌａｃ ２３０ラクトース（Ｍｅｇｇｌｅ Ｐｈａｒｍａ）とブレンドされた。粉砕されたクロファジミン１３５ｍｇを、ガラスシンチレーションバイアル内のスパチュレーションプロセスを介して、ラクトース１５ｍｇと混合した。乳糖が最初に加えられ、ＣＦＺは幾何学的希釈のプロセスを介して組み込まれた。ブレンドの均一性を評価するために５つのサンプルが取られ、ブレンド中のクロファジミンの平均効力は８６．５％ｗ／ｗであった。Ｐｌａｓｔｉａｐｅ Ｓ．ｐ．ａ（イタリア、オスナゴ）のモデル７低抵抗単回投与ＲＳ０１ ＤＰＩを使用して、インビトロ空気力学性能試験を実施した。サイズ３のヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセルは、Ｃａｐｓｕｇｅｌ Ｉｎｃ．（Ｍｏｒｒｉｓｔｗｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から提供された。カスケードインパクション研究で使用されたＲＳ０１単回投与ＤＰＩの抵抗は、ＵＳＰ Ｃｈａｐｔｅｒ ６０１の装置Ｂに従って、投与量サンプリングユニットを使用して測定され、０．０２１ｋＰａ^０．５分／Ｌと計算された。粉砕されたクロファジミンのカスケードインパクション研究は、次世代インパクター（ＮＧＩ）（ＭＳＰ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＮ、ＵＳＡ）で行われた。ステージ１〜７のカットオフ直径は式１を使用して決定され、ＭＯＣカットオフ直径は式２を使用して決定された。

式中、Ｄ_５０，Ｑは流量Ｑでのカットオフ直径であり、下付き文字ｎはＱ_ｎ＝６０Ｌ／分のアーカイブ参照値を指しており、かつ、指数ｘの値は、Ｍａｒｐｌｅらによって決定された、アーカイブＮＧＩステージのカットサイズ−フローレート計算によって決定された。粒子の跳ね返りと再飛散を減らすために、ＮＧＩプレートをヘキサン中の１％（ｖ／ｖ）シリコンオイルでコーティングし、乾燥させた。粉砕されたクロファジミンの空気力学的性能に対する粒子サイズの影響を判定するために、特に第２の粉砕されたバッチから得られた粉砕された粒子に対して分析が行われた。粒子の２つの異なる集団をテストした：ジェットミルのサイクロンユニットから派生した中央径（Ｄ_５０）が２．６９μｍ（ＣＦＺ２．６９μｍ）の粒子（図１）と、ジェットミルの収集容器ユニットから派生したＤ_５０が１．８１μｍの粉砕された粒子（ＣＦＺ１．８１μｍ）（図１）。カスケードインパクションは、４ｋＰａの圧力降下（低抵抗ＲＳ０１装置の９３Ｌ／分に相当）で、４リットルの空気を装置に引き込むのに十分な時間（２．６秒）でこれらのサンプルに対して実行された。得られた分散粉末を、イソプロピルアルコールで洗浄することにより、カプセル、吸入器、アダプター、誘導ポート、プレセパレーター、ステージ１〜７およびマイクロオリフィスコレクター（ＭＯＣ）から収集した。Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、波長４８０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより、各サンプルの薬物量を定量化した。放出画分（ＥＦ）は、収集された薬物の総質量のパーセンテージとして、装置からの放出総薬物として計算された。微粒子（＜５μｍ）画分（ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}）および微粒子（＜３μｍ）画分（ＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}）は、空気力学的直径が５μｍ未満および３μｍ未満であると予測される放出用量のパーセンテージに対応した。ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}およびＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}の値は、縦軸にＮＧＩステージの下流に堆積した放出用量の累積パーセンテージ、横軸にそのステージの粒子カットオフサイズを使用してグラフから補間された。各サンプルについて、空気力学的粒子サイズ分布（ＡＰＳＤ）の質量ベースの中央値を表す質量中央空気力学的直径（ＭＭＡＤ）、およびＡＰＳＤの広がりを表す幾何標準偏差（ＧＳＤ）は、空気力学的直径（ログスケール）に対して、指定された空気力学的サイズカット（プロビットとして表している）未満の質量の累積パーセンテージをプロットする。分布は対数正規であった。線形回帰を実行して、ＭＭＡＤを決定するために５０％パーセンタイル（プロビット５）に対応する空気力学的直径を決定し、ＧＳＤを計算するために１５．８７％パーセンタイル（プロビット４）および８４．１３％パーセンタイル（プロビット６）に対応する空気力学的直径を決定した。

粉砕されたクロファジミンのマクロファージ取り込み：Ｊ７７４．Ａ１マウスマクロファージを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン、および１％ストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２に維持した。継代は、細胞が８０％の集密度に達する前に実行した。

可溶化されたクロファジミンと比較して粉砕されたクロファジミンの毒性を判定するために、ＭＴＴアッセイを行った。Ｊ７７４．Ａ１細胞を９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで６回繰り返して播種し、２４時間増殖させた。可溶化または粉砕された粒子のさまざまな濃度（５μｍ、１０μｍ、２０μｍ）を細胞に加え、細胞を２４時間インキュベートした。可溶化クロファジミン処理は、クロファジミンをＤＭＳＯに溶解し、ストック濃度から適宜希釈することで行った。細胞へのＤＭＳＯの毒性作用を低減するために、０．４％以下のＤＭＳＯが細胞に添加された。粉砕されたクロファジミン処理は、粉砕された粒子をＰＢＳに懸濁し、５分間超音波処理して確実に分散させ、それに応じて希釈することにより行われた。２４時間曝露した後、薬物処理を取り除き、細胞をＭＴＴ試薬溶液（フェノールを含まない培地で０．５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。次に、２５μＬを除くすべてのＭＴＴ試薬を吸引し、５０μｌのＤＭＳＯを添加して細胞を可溶化した。プレートを５４０ｎｍで分光光度計（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ）を用いて読み取った。処理された細胞の吸光度は、ＰＢＳまたはＤＭＳＯのみで処理された細胞の正の対照で正規化された。

粉砕されたクロファジミンの食作用率を評価するために、薬物曝露後のさまざまな時点でＪ７７４．Ａ１マクロファージを画像化した。細胞を３ｘ１０^５細胞の３５ｍｍガラス底の皿に播種し、２４時間増殖させた。その時点で、Ｄ_５０１．９０μｍクロファジミン粒子（Ａｌｊｅｔミルの収集容器領域から得られた）およびＤ_５０２．８３μｍクロファジミン粒子（Ａｌｊｅｔミルのサイクロン領域から得られた）が加えられた。薬物治療は、ＭＴＴアッセイについて説明したように準備した。すべての処理グループは、２０μｇ／ｍＬの濃度でマクロファージに加えられた。明視野画像は、ＥＶＯＳ ＸＬ Ｃｏｒｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で４０倍の倍率で撮影された。時点画像は、薬物曝露の０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、および２４時間で撮影された。各時点で少なくとも６つの画像が取得された。細胞内および細胞外のクロファジミン粒子を手動でカウントして粒子取り込み率を測定し、各時点で少なくとも５４０個の細胞をカウントした。Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、データに曲線をフィットさせた。

クロファジミンのフローサイトメトリー定量：クロファジミンのマクロファージ取り込みを定量化し、粉砕されたクロファジミンの液晶への細胞内生体内変化を評価するために、フローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリーの実験設定は、顕微鏡実験と同様であった。処理グループは、溶解したクロファジミン、粉砕されていないクロファジミン、Ｄ_５０１．９０μｍクロファジミン粒子（平均サイズ、Ａｌｊｅｔミルの収集容器領域に由来）およびＤ_５０２．８３μｍクロファジミン粒子（平均サイズ、Ａｌｊｅｔミルのサイクロン領域に由来）、およびＰＢＳまたはＤＭＳＯを含む対照グループ。薬物曝露の２４時間後、薬物含有培地を除去し、分析のために細胞を１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。５５１ｎｍレーザーを備えたＡｃｃｕｒｉ ＳＯＲＰフローサイトメーター（ＢＤ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）を使用して、飲み込まれたクロファジミンの存在に基づいて細胞を分析した。ソーティングは、６１０／２０ ｂｐ（三斜晶型のクロファジミンに対応）と６６０／２０ ｂｐ（液晶型のクロファジミンに対応）の両方のバンドパスで実行された。直角光散乱（ＦＳＣ）と直角側方散乱（ＳＳＣ）に基づくサイトグラムを使用して、蛍光が検出される前に、凝集体、破片、死細胞を排除した。すべてのゲーティングと分析は、少なくとも１０，０００個の細胞で３回繰り返して行われた。サンプル取得はＦＡＣＳＤｉｖａ ｖ６．１．３（ＢＤ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）で実行された。サンプル分析はＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、アッシュランド、ＯＲ）で実行された。

粉砕されたクロファジミンの溶解：粉砕されたクロファジミンの溶解研究は、空気力学的に分離された粒子の収集を可能にするために変更されたインパクターステージを備えたＮＧＩを利用し、ＵＳＰ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＩＩ（パドル）溶解バス内に配置された。難水溶性クロファジミンの溶解を定量化するために、０．２％ポリソルベート８０を含むＰＢＳを溶解媒体として使用した。溶解試験の前に、ＰＢＳ＋０．２％ポリソルベート８０中のクロファジミンの飽和溶解度を、粉砕されたクロファジミンの過剰量を培地に入れ、ＭａｘＱ ４４５０シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）に７５ ＲＰＭかつ３７℃で２４時間入れて測定し、その後振盪を停止し、サンプルを３７℃で４８時間静置した。上澄みから一部を取り出し、分光光度計（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、Ｔｅｃａｎ）で評価した。粉砕されたクロファジミンの溶解を評価するために、９ｍｇの薬物をカプセルに入れ、ＮＧＩに作動させた。ステージ５（９３Ｌ／分で０．７５μｍの空気力学的粒子カットオフに対応）は、変更されたＮＧＩ溶解ステージに置き換えられた。ＮＧＩに分散させた後、改造された段階の粉末を直径９０ｍｍ、孔径０．０５μｍにカットされたＷｈａｔｍａｎ（登録商標）ポリカーボネートフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、シカゴ、イリノイ州、米国）でカバーし、対応するＯリングでシールし、およびパドル装置を備えたＶａｒｉａｎ ＶＫ２０００溶解バス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ、米国）に配置した。溶解容器には、あらかじめ温められた溶解液３００ｍＬが入っており、パドルはステージから１０ｍｍ離れた位置に設定されていた。回転は７５ ＲＰＭに設定し、温度は３７℃に設定した。２４時間かけて３ｍＬのサンプルを採取し、新しい培地に交換した。研究の結論の後、変更されたＮＧＩステージに残っている薬物をエタノールで洗浄した。微量の薬物の検出を可能にするために、サンプルを蛍光（４８０ｎｍ励起、５８０ｎｍ発光）を使用して分析した。

（表１）肺送達のためのＣＦＺ ＤＰＩ製剤の目標プロファイル

統計分析：実験結果の統計的有意性は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）を使用し、必要に応じてＴｕｋｅｙ ＨＳＤ事後分析を使用して評価した。アルファレベルは０．０５に設定された。

実施例２ - 微粉化クロファジミンの特性評価
記載された条件に従ったクロファジミンのジェットミリングは、粒子が収集されたジェットミルの面積に応じて粒子サイズが変化する、呼吸可能な範囲内の粒子サイズ分布（ＰＳＤ）をもたらした。（図４および表２）粉砕プロセスの平均収率は４８．３４％±４．８２％であった。ミルのサイクロンと収集容器の部分（図３）は、平均でそれぞれ７１．９６％±４．９３％および１３．３５％±８．３２％と最大の収率を示したため、さらなる研究のために選択された。

（表２）粉砕されたクロファジミンの平均（ｎ＝３）粒子サイズ分布

粉砕されていないクロファジミンが、粉砕時に維持される板状晶癖、および３バールの圧力でＲＯＤＯＳを用いて分散すると一次粒子に分散する高度に凝集した粉砕粒子を示すことをＳＥＭ画像が明らかにした（図５）。

ＸＲＤおよびＤＳＣ分析では、結晶化度に検出可能な変化は見られなかった（図６）。粉砕されていないクロファジミンと粉砕されたクロファジミンの回折図は、同一のピーク位置を示した。粉砕されていないものと粉砕されたものの両方のサーモグラムは、２２２℃で単一の吸熱イベントを示した。

シングルポイントＢＥＴメソッドを使用した表面積分析では、２．１４９ｍ^２／ｇの平均比表面積が示された。賦形剤を含まない粉砕クロファジミンの密度分析では、平均かさ密度が０．０９ ｇ／ｍＬ、平均タップ密度が０．１４ ｇ／ｍＬであった。これにより、３３．９７の圧縮性指数と１．５のハウスナー比が得られた。賦形剤を含まない粉砕クロファジミンの安息角分析は、２２．８２度の安息角を示した。

賦形剤を含まない粉砕クロファジミンのエアロゾル化性能を評価するために、２０ｍｇの純粋な粉砕クロファジミンを、追加の賦形剤も処理ステップも必要とせずに、低抵抗のＲＳ０１単回投与ＤＰＩからエアロゾル化した。Ｄ_５０２２．６９μｍおよびＤ_５０１．８１μｍサンプルの性能を比較した（図７Ａ、７Ｃ）。幾何学的粒子径の中央値が０．８８μｍ減少すると、ＥＦが８％小さくなり（Ｐ＝０．０１４）、ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}が２７％高くなり（Ｐ＝０．０００６）、ＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}が５０％高くなった（Ｐ＝０．０００６）（図７Ａ）。ＭＭＡＤは幾何学的中央値の直径と密接に相関しており（図７Ａ）、Ｄ_５０２．６９μｍおよびＤ_５０１．８１μｍはそれぞれＭＭＡＤが２．５７μｍおよび１．７４μｍであった。サンプルＤ_５０１．８１μｍはまた、低下した圧力降下で試験された（図７Ｂ、７Ｃ）。装置の圧力降下が４ｋＰａ（９３Ｌ／分）から１ｋＰａ（４７Ｌ／分）に減少した結果、ＥＦが１２％減少（Ｐ＝０．００２）、ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}が５％減少（Ｐ＝０．２９０）、ＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}が１１％減少（Ｐ＝０．０５４）したが、統計的に有意ではなかった（図７Ｂ）。サンプルの幾何学的中央径は同じだが、装置の圧力降下が減少すると、ＭＭＡＤは１．７４μｍ±０．０８μｍから２．１９μｍ±０．０８μｍに増加した（Ｐ＝０．００２）（図７Ｂ）。

賦形剤を含まない粉砕クロファジミンのエアロゾル化性能に対する装置抵抗の影響を評価するために、２０ｍｇの純粋な粉砕クロファジミン（中央粒径２．４４μｍ）を低抵抗ＲＳ０１単回投与ＤＰＩまたは高抵抗単回投与ＤＰＩからエアロゾル化した。低抵抗のＲＳ０１を使用すると、このバッチの粉砕されたクロファジミンのサンプルのＥＦは９０．１９％、ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}は６３．４５％、ＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}は４４．５９％でしたが、高抵抗のＲＳ０１装置を使用すると、ＥＦは ８３．５２％、ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}は６８．７５％、ＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}は４８．９０％であった。

吸入グレードのラクトースとブレンドされた粉砕されたクロファジミンのエアロゾル化性能を評価するために、約９０％のクロファジミンを含む２０ｍｇのクロファジミン−ラクトースブレンドが低抵抗ＲＳ０１単回投与ＤＰＩからエアロゾル化された。同じミリングバッチからの、賦形剤を含まない粉砕されたクロファジミンのパフォーマンスと比較した。低抵抗のＲＳ０１を使用して、粉砕されたクロファジミンのこのバッチからの賦形剤を含まない粉砕されたクロファジミンは、ＥＦが９０．１９％、ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}が６３．４５％、ＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}が４４．５９％であることがわかった。約９０：１０の比率でラクトースとブレンドされた同じバッチのクロファジミンは、ＥＦが９２．６９％、ＦＰＦ_{５μｍ／ＥＦ}が６９．４４％、ＦＰＦ_{３μｍ／ＥＦ}が５０．９１％であることがわかった。

粉砕されたクロファジミンのマクロファージ取り込みを評価するために、Ｊ７７４．Ａ１マクロファージをＤ_５０１．９０μｍまたはＤ_５０２．８３μｍクロファジミンとインキュベートした。予備実験は、定性的に、Ｄ_５０１．９０μｍクロファジミン粒子（平均サイズ、Ａｌｊｅｔミルの収集容器領域から得られる）とＤ_５０２．８３μｍクロファジミン粒子（平均サイズ、Ａｌｊｅｔミルのサイクロン領域から派生）のマクロファージ食作用に差がないことを示した。したがって、Ｄ_５０１．９０μｍ ＣＦＺ粒子で実行された手動カウントは、粉砕されたクロファジミンの全体的なマクロファージ食作用率の測定においてのみ考慮された。粉砕されたクロファジミンのマクロファージ取り込みは急速に起こり、薬物曝露後４〜８時間までに粉砕された粒子の大部分（９６〜９７％）が内部移行した（図９）。内在化された粒子の、液晶形成を示す特徴的な針状形態への変換が、最初の曝露の２４時間後に認められた。ＣＦＺを含むマクロファージの最大数は、薬物曝露の６時間後に認められ、その後の時点では、おそらく細胞分裂が継続しているため、薬物を含む細胞の数が減少している。

異なるクロファジミン処理に２４時間曝されたＪ７７４．Ａ１マクロファージのフローサイトメトリー分析により、クロファジミンの取り込みとクロファジミン液晶への細胞内生体内変化は、適用された処理のタイプに依存することが明らかになった。分析された１０，０００細胞の６１０ｎｍ発光（結晶性クロファジミンに特異的）の蛍光に基づいて、溶解したクロファジミン含有薬物に曝露された細胞の２．４８％±０．５５％が薬物を含んでいた（表３および図１０）。粉砕したＤ_５０２．８３μｍクロファジミンに曝された細胞の割合が高く、この波長で蛍光を示し、薬物を含む細胞の４．１１％±０．１１％（Ｐ＝０．００１）だった。可溶化された薬物処理と比較して、粉砕されたＤ_５０１．９０μｍクロファジミンに曝された細胞もより多くの蛍光細胞（３．２４％±０．４２％）を含んでいたが、この違いは有意ではなかった（Ｐ＝０．０６３）。マクロファージによる液晶へのクロファジミン生体内変化を示す、６６０ｎｍの発光での蛍光に基づいて細胞を分析すると、可溶化クロファジミン処理と粉砕クロファジミン処理の間に有意差が明らかになった（図１０）。可溶化クロファジミンに曝露された細胞の０．２１％±０．０６％のみが蛍光を示した（表４）。粉砕したＤ_５０２．８３μｍクロファジミンに曝露した細胞の５．８３％±０．１２％および粉砕したＤ_５０１．９０μｍクロファジミンに曝露した細胞の５．５８％±０．１９％は、可溶化処理群よりも有意に高い蛍光を示した（Ｐ＝０．００１）。２つの粉砕された処理グループ間に有意差はなかった（Ｐ＝０．１５８）。

増殖はＭＴＴアッセイで評価した。対照と比較して、ＭＴＴアッセイは、可溶化クロファジミンの濃度の増加に伴う２４時間後の細胞増殖／生存率の有意な減少を明らかにした（Ｐ＝１．９２×１０−１４）（図１１）。対照と比較して、ＭＴＴアッセイは、可溶化ＣＦＺの濃度の増加に伴う細胞増殖／生存率の減少を明らかにした（図１１）。可溶化および粉砕したＣＦＺ処理グループ間の細胞生存率の有意差は、１０μｍ（Ｐ＝０．０４５）および２０μｍ（Ｐ＝０．００１）の薬物濃度で認められた。

粉砕されたクロファジミンの溶解を評価するために、粉砕されたクロファジミンの固有溶解度をＰＢＳ ｐＨ ７．４＋０．２％ポリソルベート８０で測定したところ、１０．９ μｇ／ｍＬだった。粉砕されたクロファジミンは低い溶解度を示し、２時間以内に２３％のＤ_ａｅ０．７５μｍクロファジミン粒子が溶解し、２４時間で４８％の溶解が達成され、２４時間で薬物の最終濃度は１．２５ μｇ／ｍＬ±０．１４ μｇ／ｍＬだった（図１２）。

本明細書に開示され特許請求されるすべての方法は、本開示の観点で過度な実験を行うことなく、なされ、実行されてもよい。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点で記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の方法、工程または工程の順序に変化が加えられてもよいことは当業者には明らかであろう。より特定的には、化学的および生理学的に関連する特定の薬剤を、同じ結果または同様の結果が達成されつつ、本明細書に記載される薬剤に交換されてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかなすべてのこのような同様の代替物および改変は、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。

参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されるものに対して補助的な例示的な手順または他の詳細を与える程度まで、本明細書に参考として組み込まれる。

Claims (110)

1. ０．５〜１０μｍの中央粒径を有する微粉化クロファジミン粒子を含み、１０％未満のアモルファス材料を含む、医薬組成物。
2. 実質的に賦形剤を含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 乾燥粉末である、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記乾燥粉末が吸入用に製剤化されている、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記微粉化クロファジミン粒子が実質的に結晶性である、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前記微粉化クロファジミン粒子が結晶性である、請求項１に記載の医薬組成物。
7. 単一の活性成分を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
8. クロファジミンが単一の活性成分である、請求項６に記載の医薬組成物。
9. 賦形剤を本質的に含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
10. 賦形剤の追加がない、請求項１に記載の医薬組成物。
11. 賦形剤を含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
12. 賦形剤、添加剤、希釈剤、担体、およびアジュバントを含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
13. 糖、滑剤、帯電防止剤、付着防止剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、アミノ酸、ペプチド、界面活性剤、脂質、およびリン脂質の１つまたは複数を含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
14. 前記アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、リジン、バリン、および／またはメチオニンである、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. ＤＭＳＯ、シクロデキストリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、およびコロイダルシリカを含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
16. ＤＭＳＯ、シクロデキストリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ステアリン酸マグネシウム、およびコロイダルシリカを含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
17. ラクトースを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
18. 前記ラクトースが１０重量％までの濃度で存在する、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 少なくとも９５重量％の前記微粉化クロファジミン粒子を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
20. 少なくとも９９重量％の前記微粉化クロファジミン粒子を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
21. １００重量％の前記微粉化クロファジミン粒子を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
22. 前記微粉化クロファジミン粒子が０．５〜５μｍの中央粒径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
23. 前記微粉化クロファジミン粒子が０．７５〜４μｍの中央粒径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
24. 前記微粉化クロファジミン粒子が１〜３μｍの中央粒径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
25. 前記微粉化クロファジミン粒子の少なくとも８０％が、１〜３μｍの体積相当直径を有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. １．９〜２．３ｍ^２／ｇの比表面積を有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
27. ３２〜３７の圧縮性指数を有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
28. １０〜２０のハウスナー比を有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
29. １５°から３０°の応答角を有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
30. 前記微粉化クロファジミン粒子が凝集体を形成する、請求項１に記載の医薬組成物。
31. 少なくとも５０％の微粒子画分（ＦＰＦ）を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
32. 少なくとも６０％の微粒子画分（ＦＰＦ）を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
33. 少なくとも７０％の微粒子画分（ＦＰＦ）を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
34. ０．２％ポリソルベート８０溶解媒体を含むリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４中２４時間で３０％未満の溶解速度を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
35. ５％未満のアモルファス材料を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
36. アモルファス材料を実質的に含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
37. Ｘ線回折または示差走査熱量測定によって測定される場合にアモルファス粒子を本質的に含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
38. リポソームに封入されていない、請求項１に記載の医薬組成物。
39. ジェットミリングにより生成される、請求項１に記載の医薬組成物。
40. ジェットミリングがエアジェットミリングとしてさらに規定される、請求項３９に記載の医薬組成物。
41. 噴霧乾燥によっても超音波均質化によっても生成されない、請求項１に記載の医薬組成物。
42. 単位剤形として包装されている、請求項１に記載の医薬組成物。
43. 前記単位剤形が、カートリッジ、ブリスター、またはカプセルとしてさらに規定される、請求項４２に記載の医薬組成物。
44. 前記単位剤形が５〜３０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
45. 前記単位剤形が、少なくとも１０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
46. 前記単位剤形が、少なくとも２０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
47. 前記乾燥粉末が乾燥粉末吸入器に装填される、請求項３に記載の医薬組成物。
48. 前記乾燥粉末吸入器が単純な乾燥粉末吸入器である、請求項４７に記載の医薬組成物。
49. 前記単純な乾燥粉末吸入器が１０個未満の部品を含む、請求項４８に記載の医薬組成物。
50. 前記単純な乾燥粉末吸入器が、ＲＳＯ１単回投与乾燥粉末吸入器である、請求項４８に記載の医薬組成物。
51. 前記乾燥粉末吸入器が、０．０１ｋＰａ^０．５分／Ｌおよび０．０６ｋＰａ^０．５分／Ｌの気流抵抗を含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
52. 前記乾燥粉末吸入器が、０．０２ｋＰａ^０．５／Ｌおよび０．０４ｋＰａ^０．５分／Ｌの気流抵抗を含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
53. 請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組成物を含む、乾燥粉末吸入器で使用するための粉末。
54. 微粉化クロファジミン粒子の単位剤形を含む組成物であって、前記粒子が０．５〜１０μｍの中央粒径を含み、かつ前記組成物が賦形剤を実質的に含まない、前記組成物。
55. 前記単位剤形が請求項１〜４１のいずれか一項に記載の組成物を含む、請求項５４に記載の組成物。
56. 前記単位剤形がカートリッジ、ブリスター、またはカプセルに含まれる、請求項５４に記載の組成物。
57. 前記単位剤形が、少なくとも１０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む、請求項５４に記載の組成物。
58. 前記単位剤形が、少なくとも２０ｍｇの微粉化クロファジミン粒子を含む、請求項５４に記載の組成物。
59. 請求項５４に記載の単位剤形を含む乾燥粉末吸入器。
60. 単純な乾燥粉末吸入器である、請求項５９に記載の乾燥粉末吸入器。
61. 前記単純な乾燥粉末吸入器が１０個未満の部品を含む、請求項５９に記載の乾燥粉末吸入器。
62. 前記単純な乾燥粉末吸入器が、ＲＳＯ１単回投与乾燥粉末吸入器である、請求項５９に記載の乾燥粉末吸入器。
63. ０．０２ｋＰａ^０．５分／Ｌおよび０．０４ｋＰａ^０．５分／Ｌの気流抵抗を含む、請求項５９に記載の乾燥粉末吸入器。
64. 装置の１回の作動で１０〜２０ｍｇの放出用量を送達する、請求項５９に記載の乾燥粉末吸入器。
65. 装置の１回の作動で５〜１５ｍｇの微粒子用量を送達する、請求項６４に記載の乾燥粉末吸入器。
66. 前記微粒子用量が、装置の１回の作動での前記放出用量の少なくとも５０％である、請求項６５に記載の乾燥粉末吸入器。
67. 前記微粒子用量が、装置の１回の作動での前記放出用量の少なくとも７０％である、請求項６５に記載の乾燥粉末吸入器。
68. 装置全体にわたる圧力降下のｋＰａから１ｋＰａへの変化が、放出用量の２５％を超える減少をもたらさない、請求項６４に記載の乾燥粉末吸入器。
69. 装置全体にわたる圧力降下の４ｋＰａから１ｋＰａへの変化が、微粒子用量の１５％を超える減少をもたらさない、請求項６５に記載の乾燥粉末吸入器。
70. （ａ） 生のクロファジミン結晶を得ること；
    （ｂ） 前記生のクロファジミン結晶をジェットミルに供すること；および
    （ｃ） ０．５〜１０μｍの中央粒径を有する微粉化クロファジミン粒子を収集すること
    を含み、賦形剤の添加を含まない、
    請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
71. 前記ジェットミルがエアジェットミルとしてさらに規定される、請求項７０に記載の方法。
72. 溶媒の添加を含まない、請求項７０に記載の方法。
73. 前記微粉化クロファジミン粒子を乾燥粉末吸入器に装填することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
74. 前記乾燥粉末吸入器が単純な乾燥粉末吸入器である、請求項７０に記載の方法。
75. 請求項１〜５１のいずれか一項に記載の微粉化クロファジミン粒子組成物の有効量を患者に投与することを含む、前記患者の肺感染症を治療または予防するための方法。
76. 投与することが、前記微粉化クロファジミン粒子を前記患者の肺に吸入することを含む、請求項７５に記載の方法。
77. 吸入することが吸入器の使用を含む、請求項７６に記載の方法。
78. 前記吸入器が、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、またはネブライザーである、請求項７７に記載の方法。
79. 前記吸入器が乾燥粉末吸入器である、請求項７８に記載の方法。
80. 前記肺感染症が細菌感染症である、請求項７５に記載の方法。
81. 前記肺感染症がマイコバクテリア感染症である、請求項８０に記載の方法。
82. 前記マイコバクテリア感染症が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染症、マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｅｓ）感染症、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）感染症、またはマイコバクテリウム・アビウムコンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）感染症である、請求項８１に記載の方法。
83. 前記結核菌が多剤耐性である、請求項８２に記載の方法。
84. 前記結核菌が広範囲薬物耐性である、請求項８２に記載の方法。
85. 前記肺感染症が潜伏感染症である、請求項７５に記載の方法。
86. 前記結核菌感染症が潜伏性である、請求項８２に記載の方法。
87. 前記肺感染症が肺炎である、請求項７５に記載の方法。
88. 前記肺炎がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に関連する、請求項８７に記載の方法。
89. 前記肺感染症が嚢胞性線維症関連感染症である、請求項７５に記載の方法。
90. 少なくとも１つの第２の治療薬剤を投与することをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
91. 前記少なくとも１つの第２の薬剤が、ベダキリン、ピラジナミド、核酸阻害物質、タンパク質合成阻害物質、および細胞エンベロープ阻害物質からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
92. 前記タンパク質合成阻害物質が、リネゾリド、クラリスロマイシン、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、またはストレプトマイシンである、請求項９１に記載の方法。
93. 前記細胞エンベロープ阻害物質が、エタンブトール、エチオナミド、チオアセチゾン、イソニアジド、イミペネム、クラブラネート、シクロセリン、テリジドン、アモキシシリン、またはプロチオナミドである、請求項９１に記載の方法。
94. 前記核酸阻害物質が、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、４−アミノサリチル酸、モキシフロキサシン、オフロキサシン、またはレボフロキサシンである、請求項９１に記載の方法。
95. 前記微粉化クロファジミン粒子組成物が２回以上投与される、請求項７５に記載の方法。
96. 前記微粉化クロファジミン粒子組成物が１日１回投与される、請求項７５に記載の方法。
97. 請求項１〜５１のいずれか一項に記載の微粉化クロファジミン粒子組成物の有効量を患者に投与することを含む、前記患者のがんを治療するための方法。
98. 前記がんが肺がんである、請求項９７に記載の方法。
99. 抗がん剤を投与することをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
100. 前記抗がん剤が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、外科手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、またはサイトカイン療法である、請求項９９に記載の方法。
101. 投与することが、前記微粉化クロファジミン粒子を前記患者の肺に吸入することを含む、請求項９７に記載の方法。
102. 吸入することが吸入器の使用を含む、請求項１０１に記載の方法。
103. 前記吸入器が、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、またはネブライザーである、請求項１０１に記載の方法。
104. 前記微粉化クロファジミン粒子組成物が２回以上投与される、請求項９７に記載の方法。
105. 請求項１〜５１のいずれか１項に記載の微粉化クロファジミン粒子組成物の有効量を患者に投与することを含む、前記患者の肺炎症を軽減するための方法。
106. 前記肺炎症が喘息、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症、または嚢胞性線維症に関連する、請求項１０５に記載の方法。
107. 投与することが、前記微粉化クロファジミン粒子を前記患者の肺に吸入することを含む、請求項１０５に記載の方法。
108. 吸入することが吸入器の使用を含む、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記吸入器が、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、またはネブライザーである、請求項１０７に記載の方法。
110. 前記微粉化クロファジミン粒子組成物が２回以上投与される、請求項１０５に記載の方法。

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