JP2011513375A - リン脂質結晶、その製造方法、及び損傷組織の治療におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、結晶状態のリン脂質、その製造方法、それを含む組成物、及び損傷組織の治療におけるその使用を提供する。
Description
本発明は、改善されたリン脂質、その治療的使用、及びその製造方法を提供する。
リン脂質を製剤化する際の問題は、リン脂質を投与することを困難にし、かつ、リン脂質の治療活性を無効にする大きな凝集又は塊が形成することなしに、リン脂質の水性分散物を形成することが困難である可能性があることである。したがって、大きな凝集を形成することなしに、水性分散物として投与し得るリン脂質を提供する必要が依然として存在する。その活性を低減せず、かつ/又は、有機溶媒を使用せずに、リン脂質を滅菌する方法を見出す必要も存在する。
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これらの問題を解決する方法が探索されている。
本発明によれば、初めての結晶状態のリン脂質が提供される。
本発明の利点は、本発明に係るリン脂質は、塊又は凝集を形成せずに水性溶媒に分散され得ることを含む。本発明に係るリン脂質のさらなる利点は、改善された治療活性を有すること、及び有機溶媒を実質的に含有しないことを含む。前記改善された治療活性は、本願の実施例2から6のデータから明らかである。当該データは、創傷治癒の促進における本発明に係るリン脂質の有効性を示す。
ある態様では、本発明に係るリン脂質は凍結乾燥されてよい。ある態様では、本発明に係るリン脂質は滅菌されてよい。ある態様では、前記リン脂質は粒子状であってよい。ある実施態様では、前記リン脂質は、呼吸域粒子の状態であってよい。呼吸域粒子は、肺投与に適切な空気動力学的中央粒子径を有してよく、例えば、呼吸域粒子の空気動力学的中央粒子径は10μm未満であってよい。ある実施態様では、呼吸域粒子は微粒子である。本発明に係るリン脂質は、一般的には、糖の微結晶の外観のような結晶の外観を有する。本発明に係るリン脂質は、室温で極性溶媒(例えば、水)、特に等張極性溶媒(例えば、M199)に分散される際に、形成される分散物が、離散した結晶又は粒子を含むような状態であってよい。前記離散した結晶又は粒子は、少なくとも5倍、特に50倍の倍率で観察した際に可視的な離散した結晶又は粒子であってよい。本発明に係るリン脂質は、37℃で極性溶媒(例えば、水)、特に等張極性溶媒(例えば、M199)に分散される際に、形成される分散物が、可視のミセルの凝集を実質的に有しない、本発明に係るリン脂質の微細なミセル分散物を含むような状態であってよい。前記微細なミセル分散物は、実質的に一様な粒子径分布を有してよい。前記微細なミセル分散物は、少なくとも5倍、特に50倍の倍率で観察した際に可視であってよい。
ある態様では、本発明に係るリン脂質は、以下の一般式を有してよい。
式中、R1及びR2は、各々独立に、水素原子又は脂肪酸アシル基を表わし(ある態様では、R1及びR2は、各々独立に、直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和の14から、好ましくは16から22まで、好ましくは20までの炭素原子を有するアシル基を表わす)、R3は、水素原子若しくはコリン、グリセロール、エタノールアミン、セリン、又はイノシトール基を表わし、R1及びR2の双方が水素原子とはなり得ない。
ある態様では、R1又はR2によって独立に表わされる脂肪酸アシル基は、パルミトイルC16:0及びステアロイルC18:0などの飽和基、並びに/又はオレオイルC18:1及びC18:2などの不飽和基であってよい。ある実施態様では、R1及びR2は、前記リン脂質がジアシルを示すような水素原子を表わさなくてよい。ある実施態様では、R1及びR2は、同一の飽和又は不飽和アシル基、特にジパルミトイル及びジステアロイルを表わしてよい。ある実施態様では、前記リン脂質は、その様なリン脂質の混合物、特にジパルミトイルが主要なジアシル成分である混合物であってよい。
前記リン脂質は、場合によって、動物由来若しくは植物由来であってよく、又は合成によって製造されてよい。人工のリン脂質は、天然には生じないリン脂質であると一般的に解されており、好ましくは、動物由来のタンパク質を含むリスクの無い合成リン脂質である。前記リン脂質は、動物由来のリン脂質であってよく、又は上述のような合成リン脂質であってよい。
前記リン脂質は、好ましくは、単独の有効成分として治療方法において使用される。したがって、本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、治療剤としてリン脂質のみを含む。前記リン脂質は、好ましくは、コレステロール又はトリグリセリドを実質的に含まない。前記リン脂質は、好ましくは、抗凍結剤も実質的に含まない。
前記リン脂質は、好ましくは、ジアシルホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールの混合物である。前記ホスファチジルグリセロールは、有利には、ジアシルホスファチジルグリセロールである。前記ホスファチジルグリセロールのアシル基は、同一又は異なるものであってよく、有利には、各々、14から22の炭素原子を有してよい脂肪酸アシル基である。実施には、前記ホスファチジルグリセロール成分は、異なるアシル基を含有するホスファチジルグリセロールの混合物であってよい。前記ホスファチジルグリセロールの脂肪酸アシル基の少なくとも一部が不飽和脂肪酸アシル基、例えば、モノ又はジ不飽和C18又はC20脂肪酸アシル基であることが好ましい。
前記ホスファチジルグリセロール成分の好ましいアシル置換基は、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、ミリストイル、及びアラキドノイルである。前記リン脂質は、好ましくは、ジパルミトイル、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルグリセロールを含む。
前記リン脂質は、好ましくは、1:9から9:1、好ましくは6:4から8:2、より好ましくは約7:3の重量比のDPPC及びPGの混合物である。DPPCは、Baer & Bachrea,Can.J.of Biochem.Physiol 1959,37,page 953の方法を使用する、グリセリルホスファチジルコリンのアシル化によって合成により製造でき、Sigma(London)Ltd.から購入することが可能である。PGは、Comfrions et al,Biochem.Biophys Acta 1977,488,pages 36 to 42及びDawson,Biochem J.1967,102,pages 205 to 210の方法によって、タマゴのホスファチジルコリンから製造するか、又はダイズレシチンなどの他のホスファチジルコリンから製造し得る。
本発明は、驚くべきことに、界面活性を示す温度が体温よりも高いために生じる、DPPCを完全に治療活性を有するようにする際の課題を解決する。DPPCについての、液体(好ましくは、水)境界における、固体相から液体相への相転移の温度は41℃であり、これは37℃である体温よりも高い。治療活性形態のDPPCを得る2つの主要な方法が存在している。これらは、他のリン脂質、場合によってはタンパク質、脂肪酸、及び/又はコレステロールとの混合物としてDPPCを含有する動物由来のリン脂質を使用するか、又はリン脂質及び他の化合物との非天然混合物である合成リン脂質を使用する。
動物由来のリン脂質は、ブタ又はウシの肺などの哺乳動物の肺をミンチにするか又は前記肺からの洗浄によって、一般的な方法で得られてよい。動物由来のリン脂質の例は、ミンチにしたブタの肺から製造され、99%のリン脂質及び1%のサーファクタントタンパク質からなる、Curosurf(商標)(Chiesi Farmaceutici);ウシの肺の洗浄で得られ、90%のリン脂質、約1%のタンパク質、3%のコレステロール、0.5%の遊離脂肪酸、及びトリグリセリドを含む他の成分を含有する、Alveofact(商標)(Dr.Karl Thomae,Ltd.,Germany);ミンチにしたウシの肺の脂質抽出によって調製され、約84%のリン脂質、1%のタンパク質、及び6%の遊離脂肪酸を含有する、Survanta(商標)(Abbott,Ltd.,Germany);ウシの肺の洗浄によって製造される、BLES(BLES Biochemicals,Canada);又は子牛の肺の洗浄によって製造され、26mg/mlのホスファチジルコリン(PC)、26mg/mlのジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、0.65mg/mlのタンパク質、及び0.26mg/mlの疎水性ペプチドである35mg/mlのリン脂質を含有する、カルファクタントとしても知られるInfasurf(商標)(Forest Labs)を含む。
合成リン脂質は、好ましくは、DPPC、ジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)、若しくはジステアリルホスファチジルコリン(DSPC)などのジアシルホスファチジルコリン(DAPC)、ホスファチジルグリセロール(PG)、PC、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジン酸、及び/又はリゾリン脂質である。
市販の合成リン脂質製品の例は、26モル部のDPPC、8モル部のPOPG、5モル部のPA、及び1部のKL−4を含有する、ルシナクタントとしても知られるSurfaxin(商標)(Discovery Labs);組換えSP−C、DPPC、PG、及びPAを含有する、ルスプルチドとしても知られるLung Surfactant Factor LSF(Altana);DPPC(〜84%)、セチルアルコール、及びチロキサポールからなる、Exosurf(商標)(GSK,Germany);又は7:3の重量比のDPPC及びPGの混合物からなる、プマクタント(pumactant)(Britannia Pharmaceuticals)を含む。
治療活性を有するDPPCを作製する既知の方法の課題は、それらは費用が高いこと、DPPCの濃度が小さいこと、他の効果を有する添加物を含める可能性があることである。本発明は、水に容易に可溶な形態で提供することにより治療活性を有するDPPCを作製することによって、この課題に対する解決方法を提供する。
前記リン脂質は、好ましくは、体温(治療されるヒト又は動物の身体の温度)とほぼ同じ又はそれより低い融点又は転移温度を有するリン脂質又はリン脂質の混合物である。関連する転移温度は、リン脂質が脂質表面に広がり及び/又は界面活性を有する温度である。その様なリン脂質の混合物は、好ましくは、PG、PE、PS、又はPIなどの体温とほぼ同じ又はそれより低い融点を有するスプレッディングリン脂質(spreading phospholipid)を含有する。
本発明によれば、
極性溶媒にリン脂質を分散させる工程;
リン脂質分散物を均質化する工程;
均質化したリン脂質を濾過して滅菌する工程;及び
濾過したリン脂質分散物を凍結乾燥する工程
を含む、本発明に係るリン脂質の製造方法がさらに提供される。
極性溶媒にリン脂質を分散させる工程;
リン脂質分散物を均質化する工程;
均質化したリン脂質を濾過して滅菌する工程;及び
濾過したリン脂質分散物を凍結乾燥する工程
を含む、本発明に係るリン脂質の製造方法がさらに提供される。
本発明の方法において、均質化したリン脂質を濾過することが可能であったことは驚くべきことであった。極性溶媒にリン脂質を分散させたものは、フィルターの孔を詰まらせる凝集を形成するであろうと予測されていた。本発明に係る方法は、DPPCを治療的により活性を有する形態にする手法を提供する。かくして、前記方法は、DPPCをさらに希釈することなく、かつ、副作用のリスクを伴う可能性がある添加剤を導入することなく、DPPCの治療活性形態を提供する代替的な手段を提供する。
前記濾過工程は、好ましくは0.5μm、より好ましくは0.2μmのフィルターを使用する。ある態様では、滅菌工程は加圧濾過を使用する。
本発明に係る方法の分散工程で使用する極性溶媒は、一般的には、リン脂質がリポソーム分散物を形成する極性溶媒である。ある実施態様では、前記極性溶媒は水であってよい。プマクタントなどの幾つかのリン脂質は、温度及び/又は水感受性である。したがって、本発明の方法が、治療活性を有するリン脂質の製造に効果的であることは驚くべきことである。
均質化工程では、リポソーム分散物中のリポソームのサイズが低減される。ある実施態様では、前記均質化工程はホモジナイザーを使用する。前記ホモジナイザーは、超音波、圧力、又は機械的なホモジナイザーであってよい。
凍結乾燥工程は、好ましくは、抗凍結剤を使用せずに実施される。抗凍結剤は、例えば、氷の結晶の形成による、凍結損傷から物質を保護するために使用される物質である。一般的に使用される抗凍結剤の例は、グルコース、スクロース、マンニトール、又はトレハロースなどの糖分子を含む。
分散工程、均質化工程、及び/又は滅菌工程は、リン脂質の転移温度よりも高い温度で実施される。リン脂質の関連する転移温度は、脂質の存在下において固体相から液層にリン脂質が相転移する温度、すなわち、リン脂質が脂質表面に広がり及び/又は界面活性になる温度である。
本発明によれば、
極性溶媒にリン脂質を分散させる工程;
前記リン脂質分散物を均質化する工程;
前記リン脂質分散物を凍結乾燥する工程;
前記凍結乾燥したリン脂質を微粉化する工程
を含む、本発明に係るリン脂質を調製する方法も提供される。前記方法は、場合によって、濾過工程を含む。
極性溶媒にリン脂質を分散させる工程;
前記リン脂質分散物を均質化する工程;
前記リン脂質分散物を凍結乾燥する工程;
前記凍結乾燥したリン脂質を微粉化する工程
を含む、本発明に係るリン脂質を調製する方法も提供される。前記方法は、場合によって、濾過工程を含む。
本発明によれば、本発明の方法によって得られ得る第二のリン脂質も提供される。
本発明によれば、製薬学的に許容される希釈剤とともに、本発明に係る第一又は第二のリン脂質を含む医薬組成物も提供される。
本発明に係る医薬組成物は、製薬学的に許容される希釈剤又はビヒクルを含む。任意の適合する希釈剤又はビヒクルが使用されてよい。ある態様では、前記希釈剤は、等張極性溶媒、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、リンガー乳酸塩、注射用水、M199、及び/又はハートマン液である。ある態様では、希釈剤を添加してもよい。ある態様では、前記希釈剤は、グリセロールを実質的に含まない。ある態様では、前記希釈剤は、水酸化ナトリウムを実質的に含まなくてよい。ある態様では、前記希釈剤は、緩衝液、例えば、Tris及び/又は乳酸塩を含んでよい。
ある実施態様では、本発明で使用する製薬学的に許容される希釈剤は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、体温より高い融点を有するリン脂質を前記組成物で使用することを可能にするため有用である。より好ましくは、前記界面活性剤は、製薬学的に許容される界面活性剤又は疎水性タンパク質である。その様な化学物質の例は、21アミノ酸の合成ペプチドであるKL−4;非イオン性界面活性剤であるチロキサポール;セチルアルコール(又はヘキサデカノール);又はパルミチン酸コレステリルを含む。さらに適切な希釈剤は、タンパク質、特に吸収を促進するタンパク質、例えば、アポプロテインBである。
本発明によれば、第一の部分は本発明に係る第一又は第二のリン脂質を含み、第二の部分は製薬学的に許容される希釈剤を含む、少なくとも2つの部分を有する、本発明に係る医薬組成物を調製するためのキットも提供される。
ある実施態様では、本発明に係るキットの各部分は、容器、例えば、袋又はバイアルにて提供される。
本発明によれば、損傷組織の治療において使用するための、本発明に係る第一若しくは第二のリン脂質又は本発明に係る医薬組成物が提供される。
本発明によれば、損傷組織の治療において使用するための医薬の製造における、本発明に係る第一若しくは第二のリン脂質又は本発明に係る医薬組成物の使用も提供される。
本発明によれば、治療上有効量の本発明に係る第一又は第二のリン脂質を、治療が必要なヒト又は動物の患者に適用する工程を含む、損傷組織の治療方法も提供される。前記第一又は第二のリン脂質は、好ましくは、本発明に係る医薬組成物の形態にある。
前記リン脂質は、好ましくは、1、好ましくは10μg、より好ましくは50μgから1000mgまで、好ましくは800mgまで、より好ましくは300mgまでの量で適用される。適用されるリン脂質の量は、損傷組織の領域若しくは容量又は患者の体重に依存してよい。
ある態様では、本発明における損傷組織の治療は、例えば、ケラチン生成細胞、腱鞘の滑液分泌内皮細胞(lining cell)、又は他の上皮細胞の再上皮化を容易にする。本発明によって容易にされる可能性があるさらなる修復プロセスは、内在性又は移動細胞(例えば、繊維芽細胞)の表現型又は機能の変化である。換言すると、リン脂質は、好ましくは、再上皮化及び/又は内在性細胞型の表現型又は機能の変化を容易にすることによって損傷組織を治療するために使用される。再上皮化は、上皮又は他の表面細胞の再成長を意味する。
本発明によって治療しようとする損傷組織は、外来性又は内在性の組織であってよい。前記損傷組織は、皮膚、器官組織、結合組織(特に、負荷がかかっている(load bearing)結合組織(例えば、腱組織及び/又は腱鞘))、又は膜(上皮又は結合組織の膜)であってよい。ある態様では、本発明によって治療しようとする損傷組織は、ヒト又は動物の表面上の開放又は擦傷である。治療しようとするヒト又は動物の身体の表面は、場合によって、内部又は外部表面のいずれかである。前記組織は、物理的外傷の結果で損傷しているか、又は慢性的な炎症プロセスによるものであってよい。物理的外傷の例は、例えば、火傷による怪我若しくは損傷、事故若しくは手術による切開、暴力的若しくは破壊的な行為を含む。本発明によって治療される内部の物理的外傷は、事故的な作用又は手術のような意図した作用による損傷によって生じる内部の事故的な物理的外傷である。本発明によって治療しようとする外部の物理的外傷は、外部の事故的な物理的外傷、並びに例えば皮膚移植のために皮膚を除去することによって生じる外傷などの手術による外部の手術による物理的損傷を含む。前記損傷組織は、場合によっては、火傷、開放、又は擦傷などの、表面の状態が事故的に侵食されたヒト又は動物の表面上の部位である。組織に対する損傷は、炎症によって悪化されている可能性がある。本発明によって治療しようとする動物は、哺乳動物であってよい。
本発明に係るリン脂質又は医薬組成物は、好ましくは、傷に局所的に適用される。
ある態様では、本発明における損傷組織の治療は、手術による癒着を防止するための、手術過程における損傷組織の治療を含む。実施例12のデータは、プマクタントを用いた治療によって、癒着の組織/存在の統計的に有意な低減がもたらされたことを示す。
本発明を、特許請求の範囲を制限することを意図していない、図面を参照することによって説明する。
本発明を、特許請求の範囲を制限することを意図しない以下の実施例によって説明する。
(実施例1)
以下の実施例では、本発明に係るリン脂質の製造を説明する。各々300mgのリン脂質を含有する100のバイアルを調製した。
以下の実施例では、本発明に係るリン脂質の製造を説明する。各々300mgのリン脂質を含有する100のバイアルを調製した。
実施例1に記載のように調製したリン脂質の30gを、0.4リットルの水を含有するバイアルに約50から60℃で30分間にわたって攪拌して溶解することによって、0.75%w/vのリン脂質を含有する水性分散物を調製した。
その水性分散物を、960バールで高圧ホモジナイザーを用いて3回反復して均質化した。
半透明の均質化した水性分散物を、0.2μmの酢酸セルロース膜を使用して圧力をかけて濾過することによって滅菌した。2リットルの容量の加圧濾過ユニットを、窒素ガス条件で使用した。濾過ユニットは、60℃において均質化した水性分散物で満たして、濾過した均質化水性分散物の最終温度が40から50℃になるようにした。濾過を容易にする、実施例1に記載のように調製したリン脂質の相転移温度より高いため、この温度を選択した。濾過ユニットを密閉した後に、2から3バールの圧力で窒素ガスを適用した。濾過したものを、滅菌したボトルに回収した。
滅菌した均質化水性分散物を、各々4mlの容量で10mlバイアルに分注して、各バイアルに300mgのリン脂質を含有させた。
そのバイアルを次いで凍結乾燥サイクル:
・8℃の装置温度を有する凍結乾燥器にバイアルを入れた;
・バイアルを凍結させた;
・装置温度を−40℃に設定して、バイアルを48分にわたって−1℃/分で当該温度まで傾斜冷却した;
・バイアルを−40℃に3時間にわたって保持した;
・真空にした;
・真空を少なくとも0.1ミリバールで適用しながら、バイアルを−40℃に45分間にわたって保持した;
・装置を45分にわたって1℃/分の加温速度で5℃まで温めた;
・主要乾燥期間として、バイアルを5℃に20時間にわたって保持した;
・装置を11分にわたって1℃/分で16℃まで温めた;
・最終乾燥期間として、バイアルを16℃に20時間にわたって保持した;
・装置を11分にわたって1℃/分で5℃まで冷却した;及び
・凍結乾燥器から取りだす前に、完全な真空条件下で栓をするまで、サンプルを5℃に保持した
に供した。
・8℃の装置温度を有する凍結乾燥器にバイアルを入れた;
・バイアルを凍結させた;
・装置温度を−40℃に設定して、バイアルを48分にわたって−1℃/分で当該温度まで傾斜冷却した;
・バイアルを−40℃に3時間にわたって保持した;
・真空にした;
・真空を少なくとも0.1ミリバールで適用しながら、バイアルを−40℃に45分間にわたって保持した;
・装置を45分にわたって1℃/分の加温速度で5℃まで温めた;
・主要乾燥期間として、バイアルを5℃に20時間にわたって保持した;
・装置を11分にわたって1℃/分で16℃まで温めた;
・最終乾燥期間として、バイアルを16℃に20時間にわたって保持した;
・装置を11分にわたって1℃/分で5℃まで冷却した;及び
・凍結乾燥器から取りだす前に、完全な真空条件下で栓をするまで、サンプルを5℃に保持した
に供した。
(実施例2)
肺への投与に適するリン脂質を調製するために、滅菌濾過工程なしで実施例1を繰り返す。かくして、960バールで高圧ホモジナイザーを使用して3回反復して水性分散物を均質化した後に、その均質化した水性分散物を、各々4mlの容量で10mlバイアルに分注して、各バイアルに300mgのリン脂質を含有させる。次いで、バイアルを実施例1に記載した凍結乾燥サイクルに供する。次いで、高圧エアジェットミルで微粉化して、10μm未満の空気動力学的中央粒子径を有する、肺への投与に適するリン脂質が得られる微粉化工程に、サンプルを供する。
肺への投与に適するリン脂質を調製するために、滅菌濾過工程なしで実施例1を繰り返す。かくして、960バールで高圧ホモジナイザーを使用して3回反復して水性分散物を均質化した後に、その均質化した水性分散物を、各々4mlの容量で10mlバイアルに分注して、各バイアルに300mgのリン脂質を含有させる。次いで、バイアルを実施例1に記載した凍結乾燥サイクルに供する。次いで、高圧エアジェットミルで微粉化して、10μm未満の空気動力学的中央粒子径を有する、肺への投与に適するリン脂質が得られる微粉化工程に、サンプルを供する。
本実施例に記載の調製方法の代替例として、実施例1の方法を使用して、上述の微粉化工程を含むが実施例1の方法を繰り返すことによって、肺への投与に適するリン脂質を調製してよい。
(実施例3)
本実施例では、FCS、実施例1で調製したリン脂質(振動及び非振動)、有機非極性溶媒を使用して濾過前にリン脂質を分散させる方法によって調製した従来技術のリン脂質(ALEC(登録商標)乾燥粉末(Britannia Pharmaceuticals Ltd))、リゾホスファチジン酸(LPA)、DPPC、DPPC/LPA、POPC,Curosurf、及びIntralipidの、擦傷後の再上皮化(細胞増殖、移動)速度に対する効果を、ヒト腹腔中皮細胞(HPMC)、ヒトケラチン生成細胞、及びヒト肺上皮細胞において調べた。
本実施例では、FCS、実施例1で調製したリン脂質(振動及び非振動)、有機非極性溶媒を使用して濾過前にリン脂質を分散させる方法によって調製した従来技術のリン脂質(ALEC(登録商標)乾燥粉末(Britannia Pharmaceuticals Ltd))、リゾホスファチジン酸(LPA)、DPPC、DPPC/LPA、POPC,Curosurf、及びIntralipidの、擦傷後の再上皮化(細胞増殖、移動)速度に対する効果を、ヒト腹腔中皮細胞(HPMC)、ヒトケラチン生成細胞、及びヒト肺上皮細胞において調べた。
再上皮化(ヒト腹腔中皮細胞、ケラチン生成細胞、及び肺上皮細胞)に対するリン脂質の影響は、(Yung et al.1994、1998、及び2000、並びにMorgan et al.2003において以前に報告されているように)低速度撮影の光学顕微鏡によって評価した。
連続的なトリプシン消化(Morgan et al.2003)によって健康なヒトドナーの網から得られた中皮細胞(HPMC)及びヒト表皮ケラチン生成細胞(NHEK−A、TCS Cell Works、Buckingham、UK)を24ウェル培養プレートに播種した。増殖停止(48時間)後に、無血清培地において、滅菌したピペットチップを使用して機械的に直線状に擦ることによって、単層を損傷させて、細胞が存在しない再生可能な領域とした。ウェルを無血清培地で洗浄して、剥がれた細胞を除去した。
M199(37℃)で再構成した本発明に係るリン脂質を、無血清培地(1mL)中のHPMC及びNHEK−A単層に直接適用した。使用した対照は、無血清培地のみ、又は2%(v/v)FCSを添加したM199培地(陽性対象)であった。各ウェルの剥がした領域は、顕微鏡で認識して、その後のデータ収集のために座標を記録した。コンピューターで制御されたXY自動スキャンステージ及びインキュベーターに取り付けられたAxiovert 100M倒立顕微鏡を使用して、再中皮化が連続的に観察された。加湿インキュベーターを、加熱した挿入及び方向性気流を使用して、37℃、5%CO2に維持した(Carl Zeiss、Oberkochen、Germany)。Orca C5985デジタルビデオカメラ(Hamamatsu Photonics、Hamamatsu City、Japan)2.5×対物レンズを使用して、60分の間隔で、24ウェルプレートの各ウェルで同じ位置から画像を得た。画像は、Macintosh G4コンピューターでOpenlab version 3.0.8(Improvision,Ltd.,Coventry,UK)を使用して分析した。再中皮化の速度は、傷が閉じるのを確認するまで、60分の間隔で剥がした領域(ピクセル)の低減を測定することによって算出した。
従来技術のリン脂質(ALEC(登録商標)乾燥粉末)を用いて、V−PAG装置を使用して適用して得られた過去のデータは、内在性のもの(対照のプロセス)と比較して顕著に増大したHPMCの傷が閉じる速度であるが、2%v/vのFCSによる誘導よりは遅い速度であることを示した(図1)。このデータは、国際特許出願公開番号WO 2006/056800に開示されている。
実施例1に記載したように調製してM199(Gibco Product No.31150−022)に再懸濁したリン脂質を最大溶解用量(100%用量、すなわち4mg/ml)、最大溶解用量の半分(50%用量、すなわち2mg/ml)、最大溶解用量の四分の一(25%用量、すなわち1mg/ml)でHPMCの処理を実施した。100%及び50%用量については、双方の細胞タイプにおいて傷の閉鎖が顕著に増大した(図2)。これらの場合において、傷が閉じる速度が、2%v/v FCSによる誘導よりも大きかった。
100%、50%、及び25%用量を使用したNHEK−Aの処理は、同様の結果をもたらし、内在性対照よりも大きく、かつ、100%及び50%用量については2%v/v FCS陽性対照よりも大きかった(図3)。
図4は、対照及び2%v/v FCSと比較して、100%及び50%用量で処理したHPMCにおける傷の閉鎖の時間が促進されたことを示す。傷の領域が約50000ピクセルである際は、目に見える傷の閉鎖が存在した。図4は、50%用量については7.5時間後、100%用量については9時間後に傷の閉鎖が完了したことを示す。10時間後には、2%v/v FCSについて傷の閉鎖が存在したが、対照では存在しなかった。
実施例1に記載のように調製してM199(Gibco Product ref.31150−022)に懸濁したリン脂質を、最大溶解用量の25%(1mg/ml用量)、最大溶解用量の12.5%(0.5%mg/ml用量)、最大溶解用量の6.25%(0.25mg/ml用量)、最大溶解用量の3.125%(0.125mg/ml用量)で使用したHPMC細胞の処理を実施した。図5は、M199培地中の2.5%v/v FCSと比較した、3.125%、6.25%、12.5%、及び25%用量の実施例1にしたがって調製したリン脂質を使用して処理したHPMC細胞の増殖における変化の速度を示す。
実施例1に従って調製して液状に再構成したリン脂質は、驚くべきことに、既知の製剤と比較して改善された結果を示す。本発明に係るリン脂質は、中皮細胞とケラチン生成細胞の双方における再上皮化プロセスを促進する。異なるドナー細胞を用いて実施した独立した実験の数に基づいて(各々n=3)、傷の治癒プロセスの促進において、本発明に係るリン脂質の適用は、既知のALEC(登録商標)乾燥粉末製剤を超える利点を有する。
(実施例4)
ヒト腹膜中皮細胞増殖を誘導する、実施例1に記載のように調製したリン脂質(及び/又はその構成化合物)の効果は、Alamer Blue(商標)アッセイ及びMTTアッセイを使用して評価した。
ヒト腹膜中皮細胞増殖を誘導する、実施例1に記載のように調製したリン脂質(及び/又はその構成化合物)の効果は、Alamer Blue(商標)アッセイ及びMTTアッセイを使用して評価した。
Alamar Blue(商標)アッセイは、細胞の代謝及び酸化還元指標(Alamar Blue(商標))を低減する能力を測定することによって各種の細胞タイプの増殖を測定するために設計されている。酸化還元指標の低減は、蛍光活性を変化させる。したがって、測定される蛍光活性は細胞増殖に比例する。
MTTアッセイは、各種の細胞の増殖を測定し、テトラゾリウム塩である3−[4,5−ジメチル−チアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラジウムブロミド(MTT)の不溶性ホルマザン塩へのミトコンドリアによる変換に基づく。得られる色の変化は、生存細胞数に直接関係する。
Morgan LW et al(“Glucose degradation products (GDP) re−mesothelialisation independently of D−glucose concentration” Kidney Int 64:1854−1866,2003)に記載されているように、初代HPMCを、同意を得て任意腹部手術をうけた患者によって提供された大網組織生検から単離する。細胞を96ウェルプレート(Falcon)で約60%コンフルエントまで増殖させて、2回の継代で使用した。すべての細胞について、使用前24時間にわたって、無血清M199で増殖を停止させた。
MTTアッセイについては、以下の材料を使用した:
3−[4,5−ジメチル−チアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラジウムブロミド(Sigma)
ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)(Sigma)
PBS(Gibco)
N,N−ジメチルホルムアミド
滅菌水
酢酸(氷酢酸)
HCL
3−[4,5−ジメチル−チアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラジウムブロミド(Sigma)
ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)(Sigma)
PBS(Gibco)
N,N−ジメチルホルムアミド
滅菌水
酢酸(氷酢酸)
HCL
添加M199培地は以下のように調製した:
Earle塩培地M199に、100μ/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミン、5μg/mlインスリン、5μg/mlトランスフェリン、及び0.4μg/mlヒドロコルチゾン、並びに2mmol/L N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N‘−2エタンスルホン酸を添加した。
Earle塩培地M199に、100μ/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mMグルタミン、5μg/mlインスリン、5μg/mlトランスフェリン、及び0.4μg/mlヒドロコルチゾン、並びに2mmol/L N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N‘−2エタンスルホン酸を添加した。
実施例1に記載したように調製したリン脂質を以下のように調製した。22kPaの圧力及び2.5秒の送達時間に設定したプマクタント送達装置(Britannia Pharmaceuticals Ltd,Redhill UK)を使用して、約5mg(単回用量)の実施例1に記載したように調製したリン脂質を、25mlのユニバーサル(universal)中の1ml(サンプル毎)の添加M199培地(37℃)に添加した。少し攪拌(ボルテックスによって)した後に、次いで、1時間にわたって37℃でサンプルをインキュベートした。サンプル用量の1/4倍及び1/2倍希釈物を、上述の溶液の適当な希釈物を使用して調製した。
MTT溶液(5mg/ml)を以下のように調製した。100mgのMTTを20mlの滅菌PBSに溶解した。次いで、その溶液をボルテックスして、軽い耐久性のある容器に保存した。
MTTアッセイのための溶解緩衝液は、20gのSDSを50ml N.N−ジメチルホルムアミド及び50ml滅菌水と混合して調製した。溶液のpHは、80mlの酢酸、2.5mlの1N HCL、及び17.5mlの滅菌水から形成される酸混合物の適当量の添加によって、4.7に調整した(pHメーターを使用して測定した)。
方法
ウェル毎に200μlの容量を刺激に使用した。各々刺激の性質は、以下に説明するように図6Aから6F、7Aから7F、8Aから8F、9Aから9F、及び10Aから10Fに示す。所定濃度のFCSを含む添加M199の陽性対照を使用し、添加M199の陰性対照を使用した。各刺激は、各時点において三回重複して実施した。
ウェル毎に200μlの容量を刺激に使用した。各々刺激の性質は、以下に説明するように図6Aから6F、7Aから7F、8Aから8F、9Aから9F、及び10Aから10Fに示す。所定濃度のFCSを含む添加M199の陽性対照を使用し、添加M199の陰性対照を使用した。各刺激は、各時点において三回重複して実施した。
増殖培地を各ウェルから吸い取って、200μl添加培地を使用して一回洗浄した。割り当てられたウェルに対して、200μlの各刺激を添加して、ウェルを3つに分割した。
プレートを組織培養インキュベーターでインキュベートした。各時点において、HPMCのアッセイをAlamer Blue(商標)及びMTTを使用して増殖に関して実施した。MTTアッセイは、Alamar Blue(商標)試薬の非毒性の性質によるAlamar Blue(商標)処理に従って実施することが可能である。
Alamar Blue(商標)アッセイ
適当量のAlamer Blue(商標)試薬を添加M199に添加して、10%(v/v)Alamar Blue(商標)溶液を製造した。
適当量のAlamer Blue(商標)試薬を添加M199に添加して、10%(v/v)Alamar Blue(商標)溶液を製造した。
増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、ウェル毎に200μlの添加M199を使用してウェルを一度洗浄した。ウェル毎に200μlの前に調製した10%Alamar Blue(商標)溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で5% CO2条件下で1時間にわたってインキュベートした。100μlのサンプルを各ウェルからMicrofluor 1 黒色平底マイクロタイタープレートの対応するウェルに移した。540nm(波長)におけるAlamar Blue(商標)蛍光活性を、Dynex Revalation 96マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。FCS標準曲線を使用して、各時点について、図14に示し、かつ、「任意単位」と表記しているように、結果を未処理の陰性対照値(C)に標準化した。
MTTアッセイ
増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、ウェル毎に200μlの添加M199を使用して各ウェルを一度洗浄した(Alamar Blue(商標)アッセイの使用に従って本アッセイを使用した。この工程は、200μlの温かいPBSを使用して各ウェルを洗浄する工程に置き換えた)。マルチチャンネルピペットを使用して、100μlの前に作製したMTT溶液を各ウェルに添加した。37℃、5%CO2条件下で4時間にわたって(暗所で)プレートをインキュベートした。インキュベート後に、100μlの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、37℃、5%CO2条件下で一晩にわたってプレートをインキュベートした。600nm(波長)における吸光を、Dynex Revalation96マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。各時点について未刺激の対照値(C)に吸光/蛍光知を標準化することによって結果を解釈し、「相対蛍光/吸光」又は「任意単位」と表記している。Alamar Blue(商標)データとMTTデータとの間の相関は図15に示す。
増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、ウェル毎に200μlの添加M199を使用して各ウェルを一度洗浄した(Alamar Blue(商標)アッセイの使用に従って本アッセイを使用した。この工程は、200μlの温かいPBSを使用して各ウェルを洗浄する工程に置き換えた)。マルチチャンネルピペットを使用して、100μlの前に作製したMTT溶液を各ウェルに添加した。37℃、5%CO2条件下で4時間にわたって(暗所で)プレートをインキュベートした。インキュベート後に、100μlの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、37℃、5%CO2条件下で一晩にわたってプレートをインキュベートした。600nm(波長)における吸光を、Dynex Revalation96マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。各時点について未刺激の対照値(C)に吸光/蛍光知を標準化することによって結果を解釈し、「相対蛍光/吸光」又は「任意単位」と表記している。Alamar Blue(商標)データとMTTデータとの間の相関は図15に示す。
結果
HPMCのアッセイの結果は、48時間及び72時間後に得られた。
HPMCのアッセイの結果は、48時間及び72時間後に得られた。
陽性対照として、添加M199中のFCSを使用して、HPMC刺激して、48時間及び72時間の時点で得られたデータを図6A及び6Dの各々の棒グラフに示す。図6Aのデータは12ウェルからのものであったが、図6Dのデータは11ウェルからのものであった。これらの棒グラフでは、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。FCSは0.156、0.313、0.625、1.25、及び2.5の濃度(v/v%)で使用して、各濃度について得られた結果を棒グラフの各々隣り合うバーに示す。図6A及び6Dの結果は、陰性対照との比較において、FCSに対する顕著に用量依存的な増殖応答を示す。
実施例1に記載のように調製して、添加M199に分散させた振動リン脂質を使用してHPMCを刺激し、48時間及び72時間の時点で得られたデータを図6B及び6Eの各々の棒グラフに示す。図6B及び6Eのデータは各々6ウェルからのものであった。これらの棒グラフでは、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した振動リン脂質を、0.125、0.25、0.5、1、2、及び4の濃度(mg/ml)で使用して、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。図6B及び6Eの結果は、陰性対照との比較において、実施例1に記載のように調製した振動リン脂質が、特に、48時間の時点で0.125から2mg/ml及び72時間の時点で0.125から1mg/mlの濃度で、HPMCの増殖を顕著に刺激したことを示す。結果は、増殖速度が経時的に加速することを示す。
実施例1に記載のように調製して添加M199に分散させた非振動リン脂質を使用して、HPMCを刺激して、48時間及び72時間の時点で得られたデータを図6C及び6Fの各々の棒グラフに示す。図6C及び6Fのデータは各々4ウェルからのものである。これらの棒グラフでは、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した非振動リン脂質は、0.125、0.25、0.5、1、2、及び4の濃度(mg/ml)で使用して、各濃度について得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。図6C及び6Fの結果は、陰性対照との比較において、実施例1に記載のように調製した非振動リン脂質が、顕著にHPMCの増殖を、特に48時間の時点では0.125から1mg/mlの濃度で及び72時間の時点では0.125から0.5mg/mlの濃度で刺激したことを示す。
添加M199中のリゾホスファチジン酸(LPA)を使用してHPMCを刺激し、48時間及び72時間の時点で得られたデータを図7A及び7Dの各々の棒グラフに示す。図7Aのデータは3ウェルからのものであり、図7Dのデータは4ウェルからのものである。これらの棒グラフでは、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。2.5、5、10、20、40、及び80の濃度(μg/ml)でLPAを使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、HPMC増殖の顕著な刺激を示さない。
添加M199中のジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)を使用してHPPCを刺激し、48時間及び72時間の時点で得られたデータを図7B及び7Eの各々の棒グラフに示す。図7Bのデータは3ウェルからのものであり、図7Eのデータは4ウェルからのものである。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。0.0875、0.175、0.35、0.7、1.4、及び2.8の濃度(mg/ml)でDPPCを使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接したバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、HPMC増殖の顕著な刺激を示さない。
添加M199中のDPPC及びLPAの混合物を使用してHPMCを刺激して、48時間及び72時間の時点で得られた結果を図7C及び7Fの各々の棒グラフに示す。図7C及び7Fのデータは各々3ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。0.0875/2.5、0.175/5、0.35/10、0.7/20、1.4/40、及び2.8/80の各々の濃度((mg/ml)(μg/ml))でDPPC/LPA混合物を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、HPMC増殖の顕著な刺激を示さない。
添加M199中のパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)を使用してHPMCを刺激して、48時間及び72時間の時点で得られた結果を図8A及び8Dの各々の棒グラフに示す。図8A及び8Dのデータは各々3ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。0.0875、0.175、0.35、0.7、1.4、及び2.8の濃度(mg/ml)でPOPCを使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、HPMC増殖の顕著な刺激を示さない。
添加M199中のCurosurf(商標)(Chiesi Pharmaceutici)を使用してHPMCを刺激して、48時間及び72時間の時点で得られた結果を図8B及び8Eの各々の棒グラフに示す。図8B及び8Eのデータは各々3ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。31.25、62.5、125、250、500、及び1000の濃度(μg/ml)でCurosurf(商標)を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、HPMCの増殖を、48時間の時点では62.5から1000μg/mlの濃度で及び72時間の時点ではすべての試験した濃度で顕著に低減したことを示す。
添加M199中のタマゴ−PG(EPG)を使用してHPMCを刺激して、48時間及び72時間の時点で得られた結果を図8C及び8Fの各々の棒グラフに示す。図8C及び8Fのデータは各々3ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。0.0875、0.175、0.35、0.7、1.4、及び2.8の濃度(mg/ml)でEPGを使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、HPMCの増殖を、48時間の時点では0.35から2.8mg/mlの濃度で及び72時間の時点ではすべての試験した濃度で顕著に低減したことを示す。
添加M199中のIntrapid(商標)−10%(Fresemois Kabi,Germany)を使用してHPMCを刺激して、48時間及び72時間の時点で得られたデータを図9A及び9Dの各々の棒グラフに示す。Intrapid(商標)−10%は水中の脂質の10%v/v懸濁物である。特に、Intrapid(商標)−10%は、50g大豆油、6gレシチン、11.25gグリセリン、及び430.5g水を含有する。図9Aのデータは3ウェルからのものであり、図9Dのデータは4ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。3.125、6.25、12.5、25、50、及び100%の無血清組織培養培地(M199)中の濃度(v/v%)でIntrapid(商標)−10%を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、HPMCの増殖を、48時間及び72時間の時点ですべての試験した濃度で顕著に低減したことを示す。
添加M199中のIntralipid(商標)−20%(Fresenius Kabi,Germany)を使用してHPMCを刺激して、48時間及び72時間の時点で得られたデータを図9B及び9Eの各々の棒グラフに示す。Intrapid(商標)−20%は、Intrapid(商標)−10%と似た成分を有する、水中の脂質の20%v/v懸濁物である。図9Bのデータは3ウェルからのものであり、図9Eのデータは4ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。3.125、6.25、12.5、25、50、及び100%の無血清組織培養培地(M199)中の濃度(v/v%)でIntrapid(商標)−20%を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、HPMCの増殖を、48時間及び72時間の時点ですべての試験した濃度で顕著に低減したことを示す。
添加M199中のIntralipid(商標)−30%(Fresenius Kabi,Germany)を使用してHPMCを刺激して、48時間及び72時間の時点で得られたデータを図9C及び9Fの各々の棒グラフに示す。Intrapid(商標)−30%は、Intrapid(商標)−10%と似た成分を有する、水中の脂質の30%v/v懸濁物である。図9Cのデータは3ウェルからのものであり、図9Fのデータは4ウェルからのものであった。これらの棒グラフにおいて、左から一つ目のバーは陰性対照(C)である。3.125、6.25、12.5、25、50、及び100%の無血清組織培養培地(M199)中の濃度(v/v%)でIntrapid(商標)−30%を使用し、各濃度で得られた結果を棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、48時間の時点で3.12から50%及び100%で、陰性対照との比較において、顕著にHPMCの増殖を低減し、72時間の時点で3.12から12.5%及び100%の濃度で、陰性対照との比較において、顕著に低減したことを示す。
(実施例5)
FCS、実施例1にしたがって調製したリン脂質(振動及び非振動)、リゾホスファチジン酸(LPA)、DPPC、DPPC/LPA、POPC、Curusurf、タマゴ−PG(EPG)、及び三種のIntralipid(商標)製品で刺激した後のHPMCの生存率を、ATPアッセイを使用して測定した。このアッセイは、ATP濃度を正確に定量するために、ルシフェリンのATP依存性酸化の間の発光を測定する。
FCS、実施例1にしたがって調製したリン脂質(振動及び非振動)、リゾホスファチジン酸(LPA)、DPPC、DPPC/LPA、POPC、Curusurf、タマゴ−PG(EPG)、及び三種のIntralipid(商標)製品で刺激した後のHPMCの生存率を、ATPアッセイを使用して測定した。このアッセイは、ATP濃度を正確に定量するために、ルシフェリンのATP依存性酸化の間の発光を測定する。
実施例3に記載のように、初代HPMCを、同意を得た任意の腹部手術を受けた患者から提供された大網組織生検から単離した。約60%コンフルエントまで96ウェルプレート(Falcon)で細胞を増殖させて、2回の継代で使用した。使用前の24時間にわたって無血清M199中で、全ての細胞の増殖を停止させた。
ATP生物発光アッセイキットCLS II(Roche Diagnostics,Cat No 1 699 695,11857300)を使用した。当該キットは、ATP標準物質、ルシフェラーゼ、及び蒸留水を含む。1.8612gのEDTA(Fischer Scientific,Code D/0650/60、Batch0447430、Mr − 372.24)を500mlのH2O(又は3.7224g/1リットル)に溶解して、10mM EDTA溶液を調製した。1g 塩化ベンザルコニウム(Sigma−Aldrich,Cat:−23,442−7、Lot S22104−334)を1リットルの10mM EDTAに溶解して、BAC抽出溶液を調製した。2.9788g Hepes(Sigma,H3375−25G,Batch 094K5432,Mr − 238.31)を500mlの10mM EDTA(又は5.9577g Hepes/1リットル)溶解して、25mM Hepes溶液を調製した。
以下の手順の前に、実施例3(Alamar Blue(商標)Proliferation study)で使用したHPMCをPBSで洗浄して、1mg/ml BAC抽出溶液及び25mM Hepesで溶解した。次いで、必要となるまで−20℃でサンプルを凍結保存した。
ATPアッセイを実施する前に、以下の工程を使用して、標準曲線を作成することが必要である。
1)10mlの蒸留水を生物発光キットのルシフェラーゼ試薬に添加し、5分放置する(振らない)。混合するために、容器を注意深く振盪する。
2)1.65μM ATPの基本濃度を有するATP標準溶液を作製する。1650から0.0126nMのATPの濃度範囲が得られるまで蒸留水を使用して、1.65μM ATP(=1650nM)の段階的な希釈物を作製する。
3)標準曲線の濃度範囲を決定する、例えば、206.25から0.0126nMであり、20μlの分量の標準物質を白色96ウェルプレートのウェルに以下のテンプレートのように3つに重複して入れる。蒸留水を対照として使用する。
4)Fluostar Optimaプレートをセットして発光を測定する。Fluostar Optimaプレートリーダーポンプをセットして、20μlのルシフェラーゼを必要なウェルの各々に注入する。
5)プレートをプレートリーダーにおいて、相対光単位(RLU)を測定する。
6)ALP濃度に対するRLUのグラフをプロットすることによって、図16に示すような標準曲線を作成する。
1)10mlの蒸留水を生物発光キットのルシフェラーゼ試薬に添加し、5分放置する(振らない)。混合するために、容器を注意深く振盪する。
2)1.65μM ATPの基本濃度を有するATP標準溶液を作製する。1650から0.0126nMのATPの濃度範囲が得られるまで蒸留水を使用して、1.65μM ATP(=1650nM)の段階的な希釈物を作製する。
3)標準曲線の濃度範囲を決定する、例えば、206.25から0.0126nMであり、20μlの分量の標準物質を白色96ウェルプレートのウェルに以下のテンプレートのように3つに重複して入れる。蒸留水を対照として使用する。
4)Fluostar Optimaプレートをセットして発光を測定する。Fluostar Optimaプレートリーダーポンプをセットして、20μlのルシフェラーゼを必要なウェルの各々に注入する。
5)プレートをプレートリーダーにおいて、相対光単位(RLU)を測定する。
6)ALP濃度に対するRLUのグラフをプロットすることによって、図16に示すような標準曲線を作成する。
HPMC増殖試験からの96ウェルプレートを解凍した。各ウェル由来のサンプルの40μlを、白色96ウェルプレートの対応するウェルに移した。ATP標準曲線の手順のステップ4から6にしたがって、サンプルのRLUを測定した。標準曲線を使用して、ATP濃度をサンプルのRLUから算出した。ATP標準曲線の使用の代替的な方法として、データを未刺激の対照に対して標準化して、「ATP(対照の%)」と表わす。
結果
72時間後のアッセイからの結果を図11Aから11Lに示す。各アッセイのデータは単独のウェルからのものであった。
72時間後のアッセイからの結果を図11Aから11Lに示す。各アッセイのデータは単独のウェルからのものであった。
陽性対照として、添加M199中のFCSを使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Aの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。FCSは、0.156、0.312、0.625、1.25、及び2.5の濃度(v/v%)で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。図11Aの結果は、陰性対照との比較における、FCSに対する用量依存的な増殖応答を示す。
実施例1に記載のように調製して添加M199に分散させた振動リン脂質を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Bの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した振動リン脂質は、0.125、0.25、0.5、1、2、及び4の濃度(mg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。図11Bの結果は、実施例1に記載のように調製した振動リン脂質が、陰性対照との比較において、0.125から0.25mg/mlの濃度でHPMC増殖を増大させたことを示す。
実施例1に記載のように調製して添加M199に分散させた非振動リン脂質を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Cの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した非振動リン脂質は、0.125、0.25、0.5、1、2、及び4の濃度(mg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。図11Cの結果は、実施例1に記載のように調製した非振動リン脂質が、陰性対照との比較において、0.125から0.5mg/mlの濃度でHPMC増殖を増大させたことを示す。実施例1に記載のように調製した非振動リン脂質は、実施例1に記載に記載のように調製した振動リン脂質よりもHPMC増殖増大に対する大きな効果を有していた。
添加M199中のリゾホスファチジン酸(LPA)を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Dの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。LPAは、2.5、5、10、20、40、及び80の濃度(μg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、LPAによるHPMC増殖における増大は示さない。
添加M199中のジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Eの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。DPPCは、0.0875、0.175、0.35、0.7、1.4、及び2.8の濃度(mg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、DPPCによるHPMC増殖における増大は示さない。
添加M199中のDPPC及びLPAの混合物を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Fの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。DPPC/LPA混合物は、0.0875/2.5、0.175/5、0.35/10、0.7/20、1.4/40、及び2.8/80の濃度((mg/ml)(μg/ml))で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、DPPC/LPA混合物によるHPMC増殖における増大は示さない。
添加M199中のパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Gの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。POPCは、0.0875、0.175、0.35、0.7、1.4、及び2.8の濃度(mg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、POPCは、0.0875mg/mlの濃度でHPMC増殖を増大させたことを示す。
添加M199中のCurosurf(商標)(Chiesi Farmaceutici)を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Hの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。Curosurf(商標)は、31.25、62.5、125、250、500、及び1000の濃度(μg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、CurosurfはHPMC増殖を低減させたことを示す。
添加M199中のタマゴ−PG(EPG)を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Iの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。EPGは、0.0875、0.175、0.35、0.7、1.4、及び2.8の濃度(mg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、EPGはHPMC増殖を低減させたことを示す。
添加M199中のIntralipid(商標)−10%(Fresenius Kabi,Germany)を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Jの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。Intralipid(商標)−10%は、無血清培地(M199)中のIntralipid(商標)−10%の10%v/v脂質エマルションの3.125、6.25、12.5、25、50、及び100%のv/v%で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、Intralipid(商標)−10%はHPMC増殖を低減させたことを示す。
添加M199中のIntralipid(商標)−20%(Fresenius Kabi,Germany)を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Kの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。Intralipid(商標)−20%は、無血清培地(M199)中のIntralipid(商標)−20%の20%v/v脂質エマルションの3.125、6.25、12.5、25、50、及び100%のv/v%で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、Intralipid(商標)−20%はHPMC増殖を低減させたことを示す。
添加M199中のIntralipid(商標)−30%(Fresenius Kabi,Germany)を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図11Lの棒グラフに示す。当該棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。Intralipid(商標)−30%は、無血清培地(M199)中のIntralipid(商標)−30%の30%v/v脂質エマルションの3.125、6.25、12.5、25、50、及び100%のv/v%で使用した。各濃度で得られた結果は棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、Intralipid(商標)−30%はHPMC増殖を低減させたことを示す。
(実施例6)
実施例1に記載のように調製したリン脂質又は市販のDPPCのヒトケラチン生成細胞増殖を誘導する効果を、Alamar Blue(商標)アッセイ及びMTTアッセイを使用して評価した。
実施例1に記載のように調製したリン脂質又は市販のDPPCのヒトケラチン生成細胞増殖を誘導する効果を、Alamar Blue(商標)アッセイ及びMTTアッセイを使用して評価した。
実験は、ヒト上皮ケラチン生成細胞株(TCS CellWorks)を使用して実施した。96ウェルプレート(ファルコン)で約60%コンフルエントまで細胞を増殖させて、二回の継代で使用した。使用前の24時間にわたって無血清ケラチン生成細胞基本培地(TCS CellWorks)で、全ての細胞の増殖を停止させた。
MTTアッセイについては、実施例3に記載の以下の物質を使用した。
添加無血清ケラチン生成細胞基本培地は、1% FCS及び上皮ケラチン生成細胞増殖添加物パック(TCS CellWorks)を上皮ケラチン生成細胞基本培地(TCS CellWorks)に添加することによって調製した。上皮ケラチン生成細胞増殖添加物パックは、ウシインスリン、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリン、ヒト上皮増殖因子、ウシ下垂体、25μg/mlゲンタマイシン、及び25μg/mlアンホテリシンBを含む。
リン脂質は以下のように調製した。プマクタント送達装置(圧力:22Kpa、送達時間:2.5秒)を使用して、約5mg(単回用量)の実施例1に記載のように調製したリン脂質を、25mlのユニバーサル中の1ml(サンプルあたり)の添加ケラチン生成細胞基本培地(37℃)に添加した。簡単に攪拌(ボルテックスによる)の後に、次いで、サンプルを1時間にわたって37℃でインキュベートした。サンプル用量の1/4倍及び1/2倍希釈物は、上述の溶液の適当な希釈物を使用して調製した。
MTT溶液及び溶解緩衝溶液は、実施例3に記載のように調製した。
方法
ウェルあたり200μlの用量を刺激に使用した。各刺激の性質は、以下に記載するように図12Aから12Fに示している。所定の濃度のFCSを含む添加ケラチン生成細胞基本培地の陽性対照を使用し、添加ケラチン生成細胞基本培地の陰性対照を使用した。各刺激は、各時点で3回重複して実施した。
ウェルあたり200μlの用量を刺激に使用した。各刺激の性質は、以下に記載するように図12Aから12Fに示している。所定の濃度のFCSを含む添加ケラチン生成細胞基本培地の陽性対照を使用し、添加ケラチン生成細胞基本培地の陰性対照を使用した。各刺激は、各時点で3回重複して実施した。
増殖培地を各ウェルから吸い取って、200μlの添加培地を使用して一度洗浄した。割り当てられたウェルに、200μlの各刺激を加えて、ウェルを3つに分割した。
プレートを組織培養インキュベーターでインキュベートする。各時点において、Alamar Blue(商標)及び/又はMTTを使用して、NHEK−Aのアッセイを増殖について実施した。Alamar Blue(商標)試薬の非毒性によるAlamar Blue(商標)処理にしたがってMTTアッセイを実施できる。
Alamar Blue(商標)アッセイ
適当量のAlamar Blue(商標)試薬を、添加ケラチン生成細胞基本培地に添加して、10%(v/v)Alamar Blue(商標)溶液を製造した。
適当量のAlamar Blue(商標)試薬を、添加ケラチン生成細胞基本培地に添加して、10%(v/v)Alamar Blue(商標)溶液を製造した。
増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、ウェルを200μl/ウェルの添加ケラチン生成細胞基本培地を使用して一度洗浄した。各ウェルに、200μl/ウェルの前に調製した10% Alamar Blue(商標)溶液を添加した。プレートを37℃で5%CO2条件下で1時間にわたってインキュベートした。100μlのサンプルを、各ウェルからMicrofluor 1黒色平底マイクロタイタープレートの対応するウェルに移した。540nm(波長)のAlamar Blue(商標)の蛍光活性を、Dynex Revalation 96マルチウェルプレートリーダーを使用して測定した。各時点について、結果を未刺激陰性対照値(C)に対して標準化し、「任意単位」で表わした。
MTTアッセイ
増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、各ウェルを、200μl/ウェルの添加ケラチン生成細胞基本培地を使用して一度洗浄した(このアッセイは、Alamar Blue(商標)アッセイの使用にしたがって使用し、この工程は、200μlの暖かいPBSを使用して各ウェルを洗浄する工程に置き換えた)。マルチチャンネルピペットを使用して、100μlの前に作製したMTT溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で5%CO2条件下で4時間にわたって(暗所で)インキュベートした。インキュベート後に、100μlの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、プレートを37℃で5%CO2条件下で一晩にわたってインキュベートした。Dynex Revalation 96マルチウェルプレートリーダーを使用して、600nm(波長)の吸光を測定した。結果は、各時点について、吸光/蛍光値を未刺激の対照値(C)に対して標準化することによって解釈し、「相対蛍光/吸光」又は「任意単位」と表わす。
増殖培地を各ウェルから吸い取り、次いで、各ウェルを、200μl/ウェルの添加ケラチン生成細胞基本培地を使用して一度洗浄した(このアッセイは、Alamar Blue(商標)アッセイの使用にしたがって使用し、この工程は、200μlの暖かいPBSを使用して各ウェルを洗浄する工程に置き換えた)。マルチチャンネルピペットを使用して、100μlの前に作製したMTT溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で5%CO2条件下で4時間にわたって(暗所で)インキュベートした。インキュベート後に、100μlの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、プレートを37℃で5%CO2条件下で一晩にわたってインキュベートした。Dynex Revalation 96マルチウェルプレートリーダーを使用して、600nm(波長)の吸光を測定した。結果は、各時点について、吸光/蛍光値を未刺激の対照値(C)に対して標準化することによって解釈し、「相対蛍光/吸光」又は「任意単位」と表わす。
結果
陽性対照として、添加ケラチン生成細胞基本培地中のFCSを使用して、NEKaケラチン生成細胞を刺激した。48時間及び72時間後のAlamar Blue(商標)アッセイから得られたデータを図12A及び12Dの棒グラフの各々に示す。これらの棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。FCSは、0.062、0.125、0.25、0.5、及び1.00の濃度(v/v%)で使用した。各濃度で得られた結果は、棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、FCSに対する用量依存的な増殖応答を示す。
陽性対照として、添加ケラチン生成細胞基本培地中のFCSを使用して、NEKaケラチン生成細胞を刺激した。48時間及び72時間後のAlamar Blue(商標)アッセイから得られたデータを図12A及び12Dの棒グラフの各々に示す。これらの棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。FCSは、0.062、0.125、0.25、0.5、及び1.00の濃度(v/v%)で使用した。各濃度で得られた結果は、棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、FCSに対する用量依存的な増殖応答を示す。
実施例1に記載のように調製し、添加ケラチン生成細胞基本培地に分散させた振動リン脂質を使用して、NEKaケラチン生成細胞を刺激した。48時間及び72時間後にAlamar Blue(商標)アッセイから得られたデータを、図12B及び12Eの棒グラフの各々に示す。これらの棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した振動リン脂質は、0.125、0.25、0.5、1、2、及び4の濃度(mg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は、棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、実施例1に記載のように調製した振動リン脂質が、48時間後に4mg/mlの濃度でNEKa増殖を顕著に増大させたことを示す。72時間では、結果は、陰性対照との比較において、実施例1に記載のように調製した振動リン脂質が0.125mg/mlの濃度でNEKa増殖を顕著に増大させたことを示す。
実施例1に記載のように調製し、添加ケラチン生成細胞基本培地に分散させた非振動リン脂質を使用して、NEKaケラチン生成細胞を刺激した。48時間及び72時間後にAlamar Blue(商標)アッセイから得られたデータを、図12C及び12Fの棒グラフの各々に示す。これらの棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した非振動リン脂質は、0.125、0.25、0.5、1、2、及び4の濃度(mg/ml)で使用した。各濃度で得られた結果は、棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、実施例1に記載のように調製した非振動リン脂質が、0.125mg/ml及び0.5mg/mlの濃度でNEKa増殖を顕著に増大させたことを示す。
(実施例7)
実施例1に記載のように調製したリン脂質の分散物又はDPPCの分散物の形成に使用するための各種の培地の適性を調べた。実施例3に記載のHPMC増殖のAlamar Blue(商標)アッセイを、試験培地に分散させたFCSの陽性対照、試験培地の陰性対照、及び試験培地に分散させたリン脂質を用いる各刺激について単独のウェルの細胞を使用して繰り返した。48時間後に得られた結果を図13Aから13Jに示し、以下に説明する。
実施例1に記載のように調製したリン脂質の分散物又はDPPCの分散物の形成に使用するための各種の培地の適性を調べた。実施例3に記載のHPMC増殖のAlamar Blue(商標)アッセイを、試験培地に分散させたFCSの陽性対照、試験培地の陰性対照、及び試験培地に分散させたリン脂質を用いる各刺激について単独のウェルの細胞を使用して繰り返した。48時間後に得られた結果を図13Aから13Jに示し、以下に説明する。
第一の試験培地は、ハートマン溶液(Fresenius Kabi)及び添加M199の50/50v/v混合物であった。陽性対照として、第一の試験培地中のFCSを使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図13A及び13Gの棒グラフに示す。これらの棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。FCSは、第一の試験培地中において0.156、0.313、0.625,1.25、及び2.5の濃度(v/v%)で使用した。得られた結果は、図13A及び13Gの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、第一の試験培地中のFCSに対して用量依存的に増大したHPMC増殖応答が存在したことを示す。しかしながら、増大した量は、図6Aに示す、添加M199中のFCSを用いた場合ほど大きくなかった。
実施例1に記載のように調製し、第一の試験培地中に分散させた振動リン脂質を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図13Bの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した振動リン脂質は、第一の試験培地中において0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、30、及び40の濃度(mg/ml)で使用した。得られた結果は図13Bの棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第一の試験溶媒中の実施例1に記載のように調製した振動リン脂質に対する増殖応答の増大は、図6Bに示す、添加M199中の実施例1に記載のように調製した振動リン脂質を用いた場合ほど大きくなかった。
第一の試験培地中に分散させたDPPCを使用してHPMCを刺激した。得られたデータは図13Hの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。DPPCは、第一の試験培地中において0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、及び40の濃度(mg/ml)で使用した。得られた結果は、図13Hの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第一の試験溶媒中のDPPCに対する増殖応答の増大は、図7Bに示す、添加M199中のDPPCを用いた場合ほど大きくなかった。
第二の試験培地は、リンガー溶液(Fresenius Kabi)及び添加M199の50/50v/v混合物であった。陽性対照として、第二の試験培地中のFCSを使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図13Cの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。FCSは、第二の試験培地中において0.156、0.313、0.625,1.25、及び2.5の濃度(v/v%)で使用した。得られた結果は、図13Cの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、第二の試験培地中のFCSに対して用量依存的に増大したHPMC増殖応答が存在したことを示す。しかしながら、増大した量は、図13Aに示す、第一の試験培地中のFCSを用いた場合ほど大きくなかった。
実施例1に記載のように調製し、第二の試験培地中に分散させた振動リン脂質を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図13Dの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した振動リン脂質は、第二の試験培地中において0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、30、及び40の濃度(mg/ml)で使用した。得られた結果は図13Dの棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第二の試験溶媒中の実施例1に記載のように調製した振動リン脂質に対する増殖応答の増大は、図13Bに示す第一の試験培地中の振動リン脂質よりも良好であったが、図6Bに示す、添加M199中の振動リン脂質を用いた場合ほど大きくなかった。
第三の試験培地は、生理食塩水溶液(0.9%w/v塩化ナトリウム水)及び添加M199の50/50v/v混合物であった。陽性対照として、第三の試験培地中のFCSを使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図13Eの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)を示す。FCSは、第三の試験培地中において0.156、0.313、0.625,1.25、及び2.5の濃度(v/v%)で使用した。得られた結果は、図13Eの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、第三の試験培地中のFCSに対して用量依存的に増大したHPMC増殖応答が存在したことを示す。しかしながら、増大した量は、図13Aに示す、第一の試験培地中のFCSを用いた場合ほど大きくなかった。
実施例1に記載のように調製し、第三の試験培地中に分散させた振動リン脂質を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図13Fの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した振動リン脂質は、第三の試験培地中において0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、30、及び40の濃度(mg/ml)で使用した。得られた結果は図13Fの棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第三の試験溶媒中の振動リン脂質に対する増殖応答の増大は、図13Bに示す第一の試験培地中の振動リン脂質を用いた場合ほど大きくなかった。
第四の試験培地は、ハートマン溶液及び添加M199の90/10v/v混合物であった。陽性対照として、第四の試験培地中のFCSを使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図13Iの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)を示す。FCSは、第四の試験培地中において0.156、0.313、0.625,1.25、及び2.5の濃度(v/v%)で使用した。得られた結果は、図13Iの棒グラフの各々隣接するバーに示す。結果は、陰性対照との比較において、第四の試験培地中のFCSがHPMC増殖を増大させなかったことを示す。したがって、図13Iに示す結果の図6Aの結果との比較から、第四の試験培地は、添加M199自体よりも効果的でないことが明らかである。
実施例1に記載のように調製し、第四の試験培地中に分散させた振動リン脂質を使用してHPMCを刺激した。得られたデータを図13Jの棒グラフに示す。この棒グラフにおいて、左から1つ目のバーは陰性対照(C)である。実施例1に記載のように調製した振動リン脂質は、第四の試験培地中において0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20、30、及び40の濃度(mg/ml)で使用した。得られた結果は図13Jの棒グラフの各々隣り合うバーに示す。結果は、陰性対照との比較における、第四の試験溶媒中の振動リン脂質に対する増殖応答の増大は、図6Bに示す添加M199中の振動リン脂質を用いた場合ほど大きくなかった。
実施例8
この実施例では、実施例1に記載のように調製したリン脂質によって形成される分散物の特性を、異なる温度及び異なる培地中で調べた。
この実施例では、実施例1に記載のように調製したリン脂質によって形成される分散物の特性を、異なる温度及び異なる培地中で調べた。
第一の実験では、0.5mg/mlの実施例1に記載のように調製したリン脂質をM199培地に室温で分散させた。30分後に、図17Aに示す顕微鏡写真を、像の最終倍率が50倍となるように、5倍の対物レンズ(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)を備えたAxiovert 100M倒立顕微鏡を使用して撮影した。この顕微鏡写真は、本発明に係るリン脂質の分散物がリン脂質の離散した結晶を含むことを示す。
第二の実験では、0.5mg/mlの実施例1に記載のように調製したリン脂質をM199に37℃で分散させた。30分後に、図17Bに示す顕微鏡写真を、図17Bと同じ方法で撮影した。この顕微鏡写真は、ミセル凝集を実質的に有しない本発明に係るリン脂質の微細なミセルの分散を示す。
第三の実験では、1mg/mlの実施例1に記載のように調製したリン脂質を室温でリンガー乳酸塩、注射用水、及び生理食塩水に分散させ、各分散物を各々ラベルを貼ったバイアルに入れた。30分が経過した後に、図18に示すバイアルの写真を撮影した。この写真は、本発明に係るリン脂質の注射用水中の分散は微細であり、裸眼では見ることができないことを示す。かくして、前記分散は、わずかに曇りを有するのみであり、半透明である。本発明に係るリン脂質のリンガー乳酸塩及び生理食塩水中の分散は、注射用水中の本発明に係るリン脂質の分散ほど微細でない。これら2つの分散物は曇っているが、分散物は可視の巨視的なミセルの凝集を欠いていることは明らかである。
(実施例9)
実施例1に記載のように調製したリン脂質は、実施例2において、擦傷によって損傷された中皮細胞及びケラチン生成細胞の単層の再上皮化を促進したことが示されている。これは、部分的には、細胞増殖および細胞移動に対する効果によって達成する(Yung, S. et al; 1998; "Response of the human peritoneal mesothelial cell to injury: an in vitro model of peritoneal wound healing. " Kidney international 54:2160-2169; and Yung, S. et al 2000 "Induction of hyaluronan metabolism after mechanical injury of human peritoneal mesothelial cells in vitro" ; Kidney international 58: 1953-1962)。
実施例1に記載のように調製したリン脂質は、実施例2において、擦傷によって損傷された中皮細胞及びケラチン生成細胞の単層の再上皮化を促進したことが示されている。これは、部分的には、細胞増殖および細胞移動に対する効果によって達成する(Yung, S. et al; 1998; "Response of the human peritoneal mesothelial cell to injury: an in vitro model of peritoneal wound healing. " Kidney international 54:2160-2169; and Yung, S. et al 2000 "Induction of hyaluronan metabolism after mechanical injury of human peritoneal mesothelial cells in vitro" ; Kidney international 58: 1953-1962)。
実施例1に記載のように調製したリン脂質が、腱の損傷に関する修復プロセスに対しても同様の効果を有するか否かを確立するために、腱鞘の滑膜表層細胞又は腱若しくはエピテノン(epitenon)由来の細胞を使用して実験を実施した(Lundborg, G. et al; 1978; "Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition" The Journal of hand surgery 3:21-31 ; Manske, P. R. et al; 1984; "Histologic evidence of intrinsic flexor tendon repair in various experimental animals. An in vitro study. " Clinical orthopaedics and related research :297-304; Gelberman, R. H. et al; 1984; "Flexor tendon repair in vitro: a comparative histologic study of the rabbit, chicken, dog, and monkey" ; Journal of orthopaedic research 2:39- 48)。腱複合体は、エピテノン(腱の外表)由来の細胞、エンドテノン(腱内部)由来の細胞、及び腱鞘の滑膜表層細胞からなる。細胞増殖の速度が、増殖因子に対する応答において、これら3種の細胞タイプの間で顕著に変化する証拠が存在する(Khan, U. et al; 1998; "Differences in proliferative rate and collagen lattice contraction between endotenon and synovial fibroblasts . " The Journal of hand surgery 23:266-273)。
方法
損傷後の細胞増殖及び修復に対する、実施例1に記載のように調製したリン脂質の影響を評価するために、腱又は鞘由来細胞(鞘、エピテノン、及びエンドテノン)を、コンフルエント又はサブコンフルエントまでの単層培養物に確立する(Vater, CA. et al; 1979; "Inhibitor of human collagenase from cultures of human tendon. " The Journal of biological chemistry 254:3045-3053 ; Becker, H. et al; 1981 ; "Intrinsic tendon cell proliferation in tissue culture. " The Journal of hand surgery 6:616-619)。
損傷後の細胞増殖及び修復に対する、実施例1に記載のように調製したリン脂質の影響を評価するために、腱又は鞘由来細胞(鞘、エピテノン、及びエンドテノン)を、コンフルエント又はサブコンフルエントまでの単層培養物に確立する(Vater, CA. et al; 1979; "Inhibitor of human collagenase from cultures of human tendon. " The Journal of biological chemistry 254:3045-3053 ; Becker, H. et al; 1981 ; "Intrinsic tendon cell proliferation in tissue culture. " The Journal of hand surgery 6:616-619)。
コンフルエントな培養物において、過去に開示されているように(Yung et al. 1998, 2000)、金属ロッドを使用して細胞を掻きとって損傷させる。実施例1に記載のように調製したリン脂質の量を増大させながら存在させるか(0.1から4mg/ml)又はその不在下において、7日までの期間にわたって低速度撮影のビデオ顕微鏡を使用して、損傷が閉じるのをモニターする(Morgan, L. W. et al; 2003; "Glucose degradation products (GDP) retard remesothelialization independently of D-glucose concentration" Kidney international 64: 1854- 1866)。
サブコンフルエントの細胞において、実施例1に記載のように調製したリン脂質によって処置するか又は対照処置をした後に、腱由来の細胞増殖を72時間の期間にわたってAlamar Blue細胞増殖アッセイを使用して評価する(Squatrito, R. C. et al; 1995; "Comparison of a novel redox dye cell growth assay to the ATP bioluminescence assay" Gynecologic oncology 58:101-105)。
(実施例10)
ALEC(登録商標)(Britannia Pharmaceuticals Ltd)は、マウスモデルの癒着形成を低減することが過去に示されており、そのため、実施例1に記載のように調製したリン脂質が、手術修復後の腱の癒着の低減において類似の保護メカニズムを備えている可能性がある。腱の損傷後において、癒着形成は、瘢痕の形成をもたらす、コラーゲン及び他の細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン及びフィブロネクチン)の沈着の増大を伴うと解されている。過去の研究は、TGF−β mRNA発現(細胞外マトリックス代謝回転の強力な調節因子)の変化が、エンドテノン及びエピテノン並びにインビトロの腱鞘細胞のいずれにおいても発生し得ることを示している(Chang, J. et al; "Gene expression of transforming growth factor beta-1 in rabbit zone II flexor tendon wound healing: evidence for dual mechanisms of repair. " Plast Reconstr Surg 1997; 100: 937-994)。
ALEC(登録商標)(Britannia Pharmaceuticals Ltd)は、マウスモデルの癒着形成を低減することが過去に示されており、そのため、実施例1に記載のように調製したリン脂質が、手術修復後の腱の癒着の低減において類似の保護メカニズムを備えている可能性がある。腱の損傷後において、癒着形成は、瘢痕の形成をもたらす、コラーゲン及び他の細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン及びフィブロネクチン)の沈着の増大を伴うと解されている。過去の研究は、TGF−β mRNA発現(細胞外マトリックス代謝回転の強力な調節因子)の変化が、エンドテノン及びエピテノン並びにインビトロの腱鞘細胞のいずれにおいても発生し得ることを示している(Chang, J. et al; "Gene expression of transforming growth factor beta-1 in rabbit zone II flexor tendon wound healing: evidence for dual mechanisms of repair. " Plast Reconstr Surg 1997; 100: 937-994)。
方法
腱細胞の細胞外マトリックス生産に対する実施例1に記載のように調製したリン脂質の影響を評価するために、腱細胞(鞘、エピテノン、及びエンドテノン)のサブコンフルエントまでの単層培養物を確立した(Vater, CA. et al; 1979; "Inhibitor of human collagenase from cultures of human tendon. " The Journal of biological chemistry 254:3045-3053; Becker, H. et al; 1981 ; "Intrinsic tendon cell proliferation in tissue culture" The Journal of hand surgery 6:616-619)。
腱細胞の細胞外マトリックス生産に対する実施例1に記載のように調製したリン脂質の影響を評価するために、腱細胞(鞘、エピテノン、及びエンドテノン)のサブコンフルエントまでの単層培養物を確立した(Vater, CA. et al; 1979; "Inhibitor of human collagenase from cultures of human tendon. " The Journal of biological chemistry 254:3045-3053; Becker, H. et al; 1981 ; "Intrinsic tendon cell proliferation in tissue culture" The Journal of hand surgery 6:616-619)。
サブコンフルエントな腱由来の細胞における、構成的及びサイトカイン(例えば、インターロイキン−1)駆動性の増殖因子(TGF−β)及び細胞外マトリックス(コラーゲンI/III及びフィブロネクチン)mRNA発現の双方を、市販の有効なプライマーセットを使用してApplied Biosystems(ABI)9700マルチアナライザーを使用して定量PCR(qPCR)によって評価する。これらの実験は、増大する用量の実施例1に記載のように調製したリン脂質(0.1から4mg/ml)の存在下又は不在下において72時間の期間にわたって実施する。
(実施例11)
腱の損傷修復後の癒着形成は、大きな医学的な問題である。これらは、近接して向かい合った腱の間又は腱と腱鞘との間において生じる。腱の損傷は再生プロセスではなく、瘢痕組織の形成によって治癒するため、腱の修復は、機能の損傷(腱の滑り及び制限された可動性)又は更なる損傷(破裂)をもたらし得る、欠陥がある生体力学特性を有することが多い。腱の癒着形成を低減するための試みは、多くの場合に成功しないままであり、市場で得られる治療方法は限られている。
腱の損傷修復後の癒着形成は、大きな医学的な問題である。これらは、近接して向かい合った腱の間又は腱と腱鞘との間において生じる。腱の損傷は再生プロセスではなく、瘢痕組織の形成によって治癒するため、腱の修復は、機能の損傷(腱の滑り及び制限された可動性)又は更なる損傷(破裂)をもたらし得る、欠陥がある生体力学特性を有することが多い。腱の癒着形成を低減するための試みは、多くの場合に成功しないままであり、市場で得られる治療方法は限られている。
実施例1に記載のように調製したリン脂質が腱の治癒を改善し、並びに損傷及び手術後の修復の後に機能する潜在能力を有するか否かを確立するために、確立され、かつ、有効性が確認されたインビボモデルを使用する。ウサギの前足屈筋腱修復モデルが腱の治癒及び損傷後の機能を定量するための最適なモデルであることがよく確立されている(Lundborg, G. et al; 1985; "Intrinsic tendon healing. A new experimental model" Scandinavian journal of plastic and reconstructive surgery 19: 113-117; Greenwald, D. et al; 1991 ; "Biomechanical analysis of intrinsic tendon healing in vitro and the effects of vitamins A and E" Plastic and reconstructive surgery 87:925-930; discussion 931-922)。
手術は、癒着対照としての損傷した未処理の腱とともに、各処理群において8匹のウサギの右前肢の2及び4の指で実施する。中手指節関節の近位で切開して、滑液鞘に対する直接的な損傷を避ける。床指屈筋腱の滑液嚢内箇所を、近位の収縮によって評価し、部分的な腱切除を実施する。腱の損傷は実施例1に記載のように調製したリン脂質、及び滑液嚢内箇所に戻した腱で被覆する。二週間後に指を回収し、腱−滑膜癒着複合体を注意深く切除する。
引張強度の評価
未処理の指を使用して、対照の癒着強度を測定する。処理後の損傷した指を試験して、癒着強度の修正における実施例1に記載のように調製したリン脂質の効果を調べる。
未処理の指を使用して、対照の癒着強度を測定する。処理後の損傷した指を試験して、癒着強度の修正における実施例1に記載のように調製したリン脂質の効果を調べる。
引張試験機装置の使用は、腱の修復及び癒着形成の生体力学を評価するためによく確立されている(He Q et al . , "Repair of flexor tendon defects of rabbit with tissue engineering method" Chin J Traumatol 2002; 5: 200-8; Jones ME et al, "The role of human-derived fibrin sealant in the reduction of postoperative flexor tendon adhesion formation in rabbits" J Hand Surg (Br) 2002; 27: 278-82)。クランプを使用して指の爪を保持し、FDP腱をシルク2/0縫合糸で引張強度試験装置に結紮する(Zwick Roell Group,Ulm,Germany)。引張は、一定速度(2.5mm/分)で実施して、評価の直前にその付着点から切断した腱を使用して、鞘から腱を引き出すのに必要な力を測定する。
(実施例12)
本実施例の目的は、実施例1によって調製したリン脂質が、腱由来の線維芽細胞の増殖を変化させるか否か、腱由来の線維芽細胞の細胞外マトリックス合成に対する効果を有するか否か、遺伝子転写を変化させるか否か、及びインビボモデルにおける癒着の形成を予防するか否かを評価することであった。
本実施例の目的は、実施例1によって調製したリン脂質が、腱由来の線維芽細胞の増殖を変化させるか否か、腱由来の線維芽細胞の細胞外マトリックス合成に対する効果を有するか否か、遺伝子転写を変化させるか否か、及びインビボモデルにおける癒着の形成を予防するか否かを評価することであった。
屈筋腱損傷は、米国において一年に100万の約3分の1の指の屈筋腱損傷が存在するほど、一般的な損傷である(Pennisi, 2002)。現在の最適な手術技術及び早期の修復後の運動プロトコールの遵守にもかかわらず、外傷を受けた手の修復後の裂けた滑膜内の指の屈筋腱の15から20%において乏しい結果のみが依然として得られる。損傷が指の滑膜鞘の領域である場合に、乏しい結果は機能障害を引き起こす癒着であることが多い(Potenza 1963; Matthews and Richards 1976; Manske, 1988; Khan et al. 1996)。これらの半数は、屈筋腱剥離術の形態の追加の手術を必要とする(Strickland 2000)。二段階の腱再構成は、手術及びリハビリテーションを終えるまでに一年の休暇を必要とし、28%は段階的な腱再構築において乏しい結果を有すると評価されている。
腱は再生プロセスでは治癒せず、治癒は繊維状の瘢痕の形成により生じる(Gelberman et al, 1985a, 1986, 1985b; Speer et al, 1985; Hatano et al, 2000)。この修復は、妥協的な機能を生じる粗悪な生体力学的特性を有する。さらに、腱と鞘との間の癒着は、腱が滑るメカニズムに害を及ぼし、限られた可動性を生じさせ得る(Manske et al, 1985)。新しい手術技術及びリハビリテーションにより結果が改善されているが、癒着は依然として大きな問題のままである(Gelberman et al, 1985a, Porat et al, 1980; Speer et al, 1985; Manske et al, 1985; Thomas et al, 1986; Nyska et al, 1987; Beredjiklian, 2003)。現在までの癒着形成を制御する試みは失敗しており、物理的又は薬理学的手段による創傷治癒プロセスの取扱いに集中しており、癒着の形成を低減し得るが、破裂率の増大をもたらす(例えば、ADCON; Golash et al, 2003)。
腱の治癒は、修復の3つの連続するフェーズ:炎症、線維芽細胞、及びリモデリングを有する。腱の修復の2つのメカニズム:腱細胞及び炎症細胞芽が末梢から修復部位に移動して治癒を促進する外因性のものと、腱(エンドテンシン)内の細胞が修復部位に移動することによる内因性のもの(Manske et al, 1985; Gelberman et al, 1986))とを提唱する多くの研究が存在する。外因性の修復は癒着形成と関連する。最近の研究により、腱の修復は外因性及び内因性修復の双方の組み合わせによることが示唆されている。線維芽細胞の移動が癒着形成における役割を担っており、創傷の数日後かつ修復中に線維芽細胞走化性及び基底層への癒着がフィブロネクチン分泌と直接関係しているようであることがよく確立されている(Gelberman et a, 1991)。他の研究によって、フィブロネクチン及びTGFβ1 ROが、重度の癒着形成を有する腱において上方調節されていることが示唆されている(Ngo et al, 203)。
未損傷の腱は、骨から筋肉への結合を可能にする、密に一定の間隔で組織化されたコラーゲン線維からなる。腱の構造は、縦方向に配置されたコラーゲン線維から構成される。未損傷の腱は、60から85%のコラーゲンタイプIから構成され、0から10%のみがコラーゲンタイプIIIから構成される(乾燥重量)。コラーゲンタイプの比率又はその架橋が変化すると、腱は負荷に対する耐久性が乏しくなるか、又は多すぎる細胞マトリクスが生産されると、癒着の形成が生じる。
材料及び方法
エピテノン(表面)、エンドテノン(コア)、及び鞘由来の腱の細胞は、複数の増殖因子(Khan et al,1998)、阻害抗体(Zhang et al,2004)、細胞外マトリックス遺伝子転写(Berguland et al,2006)、コラーゲンゲル縮小(Ragoowansi et al,2003)、及びフィブロネクチン分泌(Gelberman et al,1991)に対して異なる増殖速度を有することが示されている。したがって、3種全ての細胞タイプを確立し、別々の細胞株として培養した。
エピテノン(表面)、エンドテノン(コア)、及び鞘由来の腱の細胞は、複数の増殖因子(Khan et al,1998)、阻害抗体(Zhang et al,2004)、細胞外マトリックス遺伝子転写(Berguland et al,2006)、コラーゲンゲル縮小(Ragoowansi et al,2003)、及びフィブロネクチン分泌(Gelberman et al,1991)に対して異なる増殖速度を有することが示されている。したがって、3種全ての細胞タイプを確立し、別々の細胞株として培養した。
腱由来の線維芽細胞を、10%ウシ胎仔血清、2mMグルタミン、100U/mlペニシリン、及び100mg/mlストレプトマイシン(NGM)を添加したDulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)中で培養した。
リン脂質の調製
実施例1にしたがって調製され、「プマクタント」と本実施例で称されるリン脂質の5mg/ml溶液を、滅菌した100mlの容器中で無血清培地に溶解し、37℃でインキュベートし、次いで、1mg/mlの濃度までさらに希釈した。
実施例1にしたがって調製され、「プマクタント」と本実施例で称されるリン脂質の5mg/ml溶液を、滅菌した100mlの容器中で無血清培地に溶解し、37℃でインキュベートし、次いで、1mg/mlの濃度までさらに希釈した。
TGF−βの調製
2ng/μlのストック濃度で、TGF−βを製造業者の説明書にしたがって希釈した。濃度は2ng/μlを採用した(過去に最適化した)。
2ng/μlのストック濃度で、TGF−βを製造業者の説明書にしたがって希釈した。濃度は2ng/μlを採用した(過去に最適化した)。
ウシ胎仔血清の調製
5%(v/v)、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%の濃度のウシ胎仔血清(FCS)を無血清培地に希釈した。
5%(v/v)、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%の濃度のウシ胎仔血清(FCS)を無血清培地に希釈した。
増殖アッセイ
腱由来の線維芽細胞を5×103/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレート(Greiner)に播種して、最小培地(0.4%FCSを添加したDMEM)中で一晩にわたって接着させ、健康であるが休止状態に細胞を維持した。24時間後に、培地を吸い取って、試験培地(複数の濃度のプマクタント、又は異なる濃度のウシ胎仔血清、又は異なる濃度のTGF−β1を添加した最小培地)に置換して、24、48、及び72時間にわたって培養した。WST−1アッセイ(Roche Products Ltd)を使用して細胞数を評価した。試験培地を除去して、ウェルを最小培地で二回洗浄し、最小培地を置換して、10μlのWST−1溶液を各ウェルに添加した。細胞を1時間にわたって標準の組織培養条件下においてインキュベートした。試薬を着色したホルマザン結晶に変換する生細胞数に関連する吸光度を、450nmでBio−Radプレートリーダーで読み取った。実験は、各細胞株について三回重複して実施した。
腱由来の線維芽細胞を5×103/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレート(Greiner)に播種して、最小培地(0.4%FCSを添加したDMEM)中で一晩にわたって接着させ、健康であるが休止状態に細胞を維持した。24時間後に、培地を吸い取って、試験培地(複数の濃度のプマクタント、又は異なる濃度のウシ胎仔血清、又は異なる濃度のTGF−β1を添加した最小培地)に置換して、24、48、及び72時間にわたって培養した。WST−1アッセイ(Roche Products Ltd)を使用して細胞数を評価した。試験培地を除去して、ウェルを最小培地で二回洗浄し、最小培地を置換して、10μlのWST−1溶液を各ウェルに添加した。細胞を1時間にわたって標準の組織培養条件下においてインキュベートした。試薬を着色したホルマザン結晶に変換する生細胞数に関連する吸光度を、450nmでBio−Radプレートリーダーで読み取った。実験は、各細胞株について三回重複して実施した。
接着アッセイ
コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIII、若しくはフィブロネクチンで被覆しているか又は未被覆のウェルを有する、Nunc maxabsorb 96ウェル培養プレートを使用した。ウェルは3つ重複して用意した。細胞をプラスチックフラスコからAccutaseを使用して取り出して、NGMに再懸濁した。2×105細胞/mlが必要であった。細胞を処理(プマクタント1mg/ml)して、37℃で30分間にわたって懸濁物中でインキュベートした。100μl細胞及び処理溶液を被覆ウェルに播種した。細胞/処理溶液を2時間にわたって、加湿5%CO2条件下において37℃でインキュベートする。処理溶液を吸い取って、ウェルをPBSでやさしく洗浄する。最後に、細胞を固定化し、crystal violet溶液(0.5% crystal violet、5%ホルモル生理食塩水、50%エタノール、0.85%NaCl)で染色する。crystal violetを除去して、リン酸緩衝生理食塩水を用いてウェルを注意深く洗浄する。結合したcrystal violetを33%酢酸に可溶化し、プレートをBio−Radプレートリーダーにおいて595nmで読取った。
コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIII、若しくはフィブロネクチンで被覆しているか又は未被覆のウェルを有する、Nunc maxabsorb 96ウェル培養プレートを使用した。ウェルは3つ重複して用意した。細胞をプラスチックフラスコからAccutaseを使用して取り出して、NGMに再懸濁した。2×105細胞/mlが必要であった。細胞を処理(プマクタント1mg/ml)して、37℃で30分間にわたって懸濁物中でインキュベートした。100μl細胞及び処理溶液を被覆ウェルに播種した。細胞/処理溶液を2時間にわたって、加湿5%CO2条件下において37℃でインキュベートする。処理溶液を吸い取って、ウェルをPBSでやさしく洗浄する。最後に、細胞を固定化し、crystal violet溶液(0.5% crystal violet、5%ホルモル生理食塩水、50%エタノール、0.85%NaCl)で染色する。crystal violetを除去して、リン酸緩衝生理食塩水を用いてウェルを注意深く洗浄する。結合したcrystal violetを33%酢酸に可溶化し、プレートをBio−Radプレートリーダーにおいて595nmで読取った。
細胞外マトリックス生産
Sircolアッセイ(Biocolor Ltd)を過去に開示されているように実施した(Rolfe et al,2007)。腱由来の線維芽細胞を106細胞/25cm2フラスコに播種して、接着させ、NGM中で一晩拡散させた。PBSを用いて細胞を二回洗浄して、5%ウシ胎仔血清+/−プマクタント(1mg/ml)又は+/−TGF−β1(2ng/ml)を添加したDMEMで培地を置換した。次いで、条件培地を回収した。細胞をトリプシンで処理して、計数し、後のコラーゲン定量を細胞数について修正した。Sirus red染料に対するプマクタントの結合により、プマクタントを含有する条件培地を10,000gで5分間にわたって遠心分離した(最適化後、データ示さず)。200μlの条件培地を、1mlのSircol染料と30分間にわたってインキュベートした。次いで、管を10,000gで10分間にわたって遠心分離し、沈殿したコラーゲン−染料複合体をペレット状にした。
Sircolアッセイ(Biocolor Ltd)を過去に開示されているように実施した(Rolfe et al,2007)。腱由来の線維芽細胞を106細胞/25cm2フラスコに播種して、接着させ、NGM中で一晩拡散させた。PBSを用いて細胞を二回洗浄して、5%ウシ胎仔血清+/−プマクタント(1mg/ml)又は+/−TGF−β1(2ng/ml)を添加したDMEMで培地を置換した。次いで、条件培地を回収した。細胞をトリプシンで処理して、計数し、後のコラーゲン定量を細胞数について修正した。Sirus red染料に対するプマクタントの結合により、プマクタントを含有する条件培地を10,000gで5分間にわたって遠心分離した(最適化後、データ示さず)。200μlの条件培地を、1mlのSircol染料と30分間にわたってインキュベートした。次いで、管を10,000gで10分間にわたって遠心分離し、沈殿したコラーゲン−染料複合体をペレット状にした。
上清を除去して、1mlのアルカリ試薬をコラーゲンペレットに添加した。溶解したコラーゲン及び染料溶液を、次いで、コラーゲン標準物質とともに、96ウェルプレートに3ウェル重複させて分取した(200μl/ウェル)。次いで、溶液を540nmで読取った。全ての実験を3回繰り返して、各実験を三回重複して実施した。結果は、細胞数で標準化した。
QRT−PCR
プマクタント又はTGF−β1を用いる刺激の前に、細胞を無血清培地中に24時間にわたって置いて、トリパンブルーを使用して生存率を評価した(Sigma;データ示さず)。静止細胞を、プマクタント(1mg/ml)を用いて0から24時間にわたって又はTGF−β1を用いて0から24時間にわたって(陽性対照)処理した。全RNAを処理サンプル及び未処理サンプルからTrizol(Gibco)を使用して単離した。Quant−iT(商標) Ribogreen(登録商標) RNAキット(Invitrogen)を使用してRNA濃度を測定した。第一鎖cDNAは、StrataScript(登録商標) first−strand synthesis system(Stratagene(登録商標))を、オリゴヌクレオチドdT(0.5μg/μl)とともに使用して製造業者の説明書にしたがって合成した。
プマクタント又はTGF−β1を用いる刺激の前に、細胞を無血清培地中に24時間にわたって置いて、トリパンブルーを使用して生存率を評価した(Sigma;データ示さず)。静止細胞を、プマクタント(1mg/ml)を用いて0から24時間にわたって又はTGF−β1を用いて0から24時間にわたって(陽性対照)処理した。全RNAを処理サンプル及び未処理サンプルからTrizol(Gibco)を使用して単離した。Quant−iT(商標) Ribogreen(登録商標) RNAキット(Invitrogen)を使用してRNA濃度を測定した。第一鎖cDNAは、StrataScript(登録商標) first−strand synthesis system(Stratagene(登録商標))を、オリゴヌクレオチドdT(0.5μg/μl)とともに使用して製造業者の説明書にしたがって合成した。
定量リアルタイムPCR
12.5μlのSYBR Green PCR Master Mix(Stratagene(商標)、La Jolla、California)及び10pMの各プライマーを含有する25μlの反応溶液中で、製造業者の説明書にしたがって、2μlの第一鎖cDNA産物を増幅に三回重複して使用した。プライマー配列は表1に記載している。プライマー配列は、本願明細書に添付し、その一部である配列表にも記載している。
12.5μlのSYBR Green PCR Master Mix(Stratagene(商標)、La Jolla、California)及び10pMの各プライマーを含有する25μlの反応溶液中で、製造業者の説明書にしたがって、2μlの第一鎖cDNA産物を増幅に三回重複して使用した。プライマー配列は表1に記載している。プライマー配列は、本願明細書に添付し、その一部である配列表にも記載している。
PCR反応をMX3000P(Stratagene,La Jolla,California)で実施した。PCRプログラムは、反応物を10分間にわたって95℃でインキュベートする最初の変性、95℃で30秒、60℃で1分のプライマーのアニーリング、72℃で30秒の伸長の40サイクルでDNAを増幅する第二のステップからなる。解離曲線により、プライマー二量体が各PCRの実施後に存在しないことを確実にした。
インビボアッセイ
Chang et al(2000)は、ウサギ屈筋修復モデルが、腱瘢痕形成を基節骨と末節骨との間の屈曲の程度に基づいて定量するために有用であることを示した。
Chang et al(2000)は、ウサギ屈筋修復モデルが、腱瘢痕形成を基節骨と末節骨との間の屈曲の程度に基づいて定量するために有用であることを示した。
全ての動物のケアは、「UK Home office Guide for the Care and the use of Laboratory Animals’ 1996」を遵守した。全身麻酔(クエン酸フェンタニル及びフルアニソン及びイソフルラン/O2)下で16匹のNew Zealand White ウサギ(NZW)の右前肢の2及び4の指に対して、手術を過去(Branford et al)に開示されているように実施した。手術部位は剃毛して、クロルヘキシジンを用いて下処理をした。滑液鞘に対する直接的損傷を避けながら、中手指節関節に近接した「V」型の切開を、深指屈筋(FDP)腱にアクセスした。浅指屈筋腱を切除して、癒着をFDP腱と鞘との間の形成されるものに限定した。滑液嚢内腱を曝露することによって、FDP腱を縮めた。外科用メスを使用して、半分の厚さ及び5mmの長さの損傷を作成した(Jones et al,2002)(この技術は多数の文献に開示されている(Kakar et al,1998、Akali et al,1999、Khan et al,2000))。指を広げて、損傷を滑液嚢内の位置に戻して、腱を縫合し、固定した(近位相互作用によって)。
プマクタント(滅菌水に溶解した10mg/ml)で処理した群又は未処理の群に、NZWをランダムに分けた。針を除去した24ゲージのカニューレを使用して処置(鞘当たりの10mg/mlプマクタントの0.5ml)を、腱鞘に浸潤させた。
残部のプマクタントを皮膚の組織片の下に置いた。清潔な4/0ナイロン縫合糸を使用して皮膚を閉じ、抗生物質(オーレオマイシン)粉末を局所的に適用した。動物を移動させ、次いで、14日目に処分した。
未手術の対照として、左前肢の指2及び4を回収した。i.力学的評価又はii.定量的組織学的評価に、指をランダムに分けた。
力学的評価
腱/癒着最大抗張力の間の関係は、組成並びにコラーゲン線維の長さ及び機械的挙動に依存する。引張強度試験装置の使用は、腱修復及び癒着形成の生体力学評価に関する文献でよく確立されている(He et al,2002、Jones et al,2002、Momose et al,2001、Branford et al,2007)。
腱/癒着最大抗張力の間の関係は、組成並びにコラーゲン線維の長さ及び機械的挙動に依存する。引張強度試験装置の使用は、腱修復及び癒着形成の生体力学評価に関する文献でよく確立されている(He et al,2002、Jones et al,2002、Momose et al,2001、Branford et al,2007)。
前肢を新しく評価した。試験する前に、V型の傷を再び開き、処理した腱の各々の近位遊離端を同定した。遠位切断面をFDPの遠位指節骨への付着上に作製した。これにより、腱を鞘の中に自由に入れることが可能となり、近位に適用した力が、鞘と腱との間に存在する任意の癒着の強度のみを測定するように両端が接続されていない状態である。クランプを使用して指の爪の各々を保持し、近位FDP腱を引張強度試験装置(Mecmesin)に固定した。次いで、癒着が壊れるまで、近位腱を鞘から引っ張った(5mm/分)。最大の力をニュートンで測定した。
組織学的分析
指をホルマリン中で固定して、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)中で脱灰し、パラフィンで包んだ。縦断面を標準の深さで切断し、腱全体の任意の癒着形成を評価した。次いで、前記断面をヘマトキシリン及びエオシン又はMasson Trichomeのいずれかで染色した(コラーゲンの構造を決定するため)。周囲の組織に対して腱を接続する特徴的な高密度の細胞帯としての、顕微鏡検査における癒着の存在が記録され、次いで、下記の表2に示すように、Tang et al(1996)によって開示されているように癒着の採点を実施した。
指をホルマリン中で固定して、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)中で脱灰し、パラフィンで包んだ。縦断面を標準の深さで切断し、腱全体の任意の癒着形成を評価した。次いで、前記断面をヘマトキシリン及びエオシン又はMasson Trichomeのいずれかで染色した(コラーゲンの構造を決定するため)。周囲の組織に対して腱を接続する特徴的な高密度の細胞帯としての、顕微鏡検査における癒着の存在が記録され、次いで、下記の表2に示すように、Tang et al(1996)によって開示されているように癒着の採点を実施した。
データ分析
リアルタイムPCRにおいて相対発現レベルを算出するために、相対的発現ソフトウェアツール(REST(登録商標))を使用した(Pfaffl et al,2002)。この数学モデルは、PCR効率、及び処理細胞と未処理細胞との間の平均クロシングポイント(crossing point)偏差に基づく。2種のハウスキーピング遺伝子であるGAPDH及びACTBを使用して、標的遺伝子発現を標準化した。Pair Wise Fixed Reallocation Randomization Testによって群間の相違の統計分析を実施し、REST−XLソフトウェア(Pfaffl et al,2002)で解釈し、変動係数を得た。Sigma Plotを使用して、対数グラフを示す。
リアルタイムPCRにおいて相対発現レベルを算出するために、相対的発現ソフトウェアツール(REST(登録商標))を使用した(Pfaffl et al,2002)。この数学モデルは、PCR効率、及び処理細胞と未処理細胞との間の平均クロシングポイント(crossing point)偏差に基づく。2種のハウスキーピング遺伝子であるGAPDH及びACTBを使用して、標的遺伝子発現を標準化した。Pair Wise Fixed Reallocation Randomization Testによって群間の相違の統計分析を実施し、REST−XLソフトウェア(Pfaffl et al,2002)で解釈し、変動係数を得た。Sigma Plotを使用して、対数グラフを示す。
統計学的な優位性は、適当な場合にStudent t−testを使用して分析した。<0.05のp値は、統計的に有意であると解した。
結果
増殖:
腱鞘:0.25mg/mlのプマクタント中で培養した腱鞘由来の細胞は、24時間で細胞数における有意な低減を示した(p=0.04;図19)。残りの濃度は細胞数における増大を示したが、いずれの濃度も、最小培地のみで増殖させた細胞との比較における統計的優位性を示さなかった。各種の濃度のTGF−β1又はFCSで培養した鞘細胞において統計的優位性は存在しなかった(データ示さず)。
増殖:
腱鞘:0.25mg/mlのプマクタント中で培養した腱鞘由来の細胞は、24時間で細胞数における有意な低減を示した(p=0.04;図19)。残りの濃度は細胞数における増大を示したが、いずれの濃度も、最小培地のみで増殖させた細胞との比較における統計的優位性を示さなかった。各種の濃度のTGF−β1又はFCSで培養した鞘細胞において統計的優位性は存在しなかった(データ示さず)。
プマクタント中で培養した腱由来の鞘細胞は、48時間ではいずれの濃度においても統計的優位性を示さなかった(図20A)。しかしながら、48時間における腱鞘細胞(図20B)は、無血清培地中で増殖させた細胞と比較して、各種の濃度のFCS:0.6%(p=0.025)、1.25%(p=0.03)、2.5%(p=0.003)、及び5%(p=0.01)において増殖における統計的に有意な増大を示した。腱鞘由来の細胞は、48時間で任意の濃度のTGF−β1で培養した際には、統計的優位性を示さなかった。
プマクタント中で培養した72時間の時点の腱鞘細胞(図21A)は、最小培地のみで増殖させた細胞と比較して、4mg/ml(p=0.022)及び2mg/ml(p=0.018)の双方において統計的に有意な増大を示した。全ての濃度のウシ胎仔血清が、無血清培地中で増殖させた細胞と比較して、統計的な増大を示した(図21B)。
腱表面細胞:24時間の時点の腱の表面由来の細胞(図22A)は、プマクタント中で培養した際に、2及び4mg/mlで増殖における増大を示したが、統計的な優位性にまでは至らなかった。腱の表面細胞は、0.6%(p=0.027)及び2.5%(p=0.001;図22B)のウシ胎仔血清で、無血清培地中で増殖させた細胞と比較して統計的に優位な増大を示したが、TGF−β1中で培養した細胞は、いずれの濃度においても統計的に有意な差異は示さなかった。
48時間では、腱表面細胞は、最小培地で増殖させた細胞と比較して、2mg/mlのプマクタントと培養した際に統計的に有意な増大を示した(図23A)。0.6%を除く全ての濃度のウシ胎仔血清は、無血清培地中で培養した細胞と比較して統計的に有意な増大を示した(図23B)。いずれのTGF−β1の濃度も、48時間の時点では有意な増大を示さなかった(データ示さず)。
72時間の時点の腱表面細胞(図24A)は、2及び4mg/mlのプマクタント中で培養した際に増殖における増大を示したが、統計的な優位性にまでは至らなかった。腱表面細胞は、無血清培地のみで増殖させた細胞と比較して、2.5%(p=0.03)及び5%(p=0.04;図24B)ウシ胎仔血清において、増殖における統計的に有意な増大を示した。さらに、2ng/mlのTGF−β1中で培養した腱表面細胞は、増殖における統計的に有意な増大を示した(p=0.003;図24C)。
腱コア細胞:プマクタント中で培養したコア細胞は、0.5mg/mlから4mg/mlで増殖における増大を示したが、いずれの濃度においても、最小培地で増殖させた細胞と比較して統計的に有意な増大は示さなかった(図25)。さらに、いずれの割合のFCS又はいずれの濃度のTGF−β1に関しても、増殖の統計的な増大は認められなかった(データ示さず)。しかしながら、プマクタント中で48時間にわたって培養した腱コア由来の細胞は、最小培地で培養したものと比較して、0.5mg/mlで細胞増殖における統計的に有意な増大を示した(p=0.049;図26)。いずれの濃度又は処理についても他に有意性は認められなかった。72時間の時点のコア由来の細胞では、プマクタント(図27)又は複数の濃度のウシ胎仔血清若しくはTGF−β1について統計的な優位性が示されなかった(データ示さず)。
遺伝子転写:
全ての試験した遺伝子は、処理した又は未処理の全ての細胞において検出可能なレベルで発現していた。
全ての試験した遺伝子は、処理した又は未処理の全ての細胞において検出可能なレベルで発現していた。
表面由来細胞:
細胞は、TGF−β1と培養した腱の表面に由来するものであった(陽性対照)。TGF−β1との培養は、細胞にコラーゲンタイプI遺伝子転写の上方調節を誘導させ、これは24時間及び48時間の時点で統計的に有意であった(p<0.05;図28)。逆に、コラーゲンタイプIIIは、1、2、6、16、及び48時間の時点で統計的に顕著な下方調節を示した(p<0.05)。フィブロネクチン及びPAI−1の双方が、TGF−β1に対する応答で上方調節を示し、これはフィブロネクチンに関しては24時間の時点で統計的に有意であり(p=0.03)、PAI−1に関しては4時間の時点で統計的に有意であった(p=0.026)。
細胞は、TGF−β1と培養した腱の表面に由来するものであった(陽性対照)。TGF−β1との培養は、細胞にコラーゲンタイプI遺伝子転写の上方調節を誘導させ、これは24時間及び48時間の時点で統計的に有意であった(p<0.05;図28)。逆に、コラーゲンタイプIIIは、1、2、6、16、及び48時間の時点で統計的に顕著な下方調節を示した(p<0.05)。フィブロネクチン及びPAI−1の双方が、TGF−β1に対する応答で上方調節を示し、これはフィブロネクチンに関しては24時間の時点で統計的に有意であり(p=0.03)、PAI−1に関しては4時間の時点で統計的に有意であった(p=0.026)。
試験した遺伝子のいずれもが、プマクタントに対する応答では、経時的な統計的変化を示さなかった(図29)。
鞘由来細胞
TGF−β1は、鞘由来の細胞に経時的なコラーゲンタイプI遺伝子転写の上方調節をもたらすが、これは統計的な優位性にまでは至らなかった。コラーゲンタイプIIIは上方調節を示し、これは6時間、8時間、(p=0.03;図30)、16及び24時間(p<0.05)の時点で統計的に有意であった。フィブロネクチン及びPAI−1は、時間経過全体にわたって統計的変化を示さなかった。tPAは遺伝子転写の下方調節を示し、これは2時間(p=0.013)、4時間、及び24時間(p=0.001)の時点で統計的に有意であった。
TGF−β1は、鞘由来の細胞に経時的なコラーゲンタイプI遺伝子転写の上方調節をもたらすが、これは統計的な優位性にまでは至らなかった。コラーゲンタイプIIIは上方調節を示し、これは6時間、8時間、(p=0.03;図30)、16及び24時間(p<0.05)の時点で統計的に有意であった。フィブロネクチン及びPAI−1は、時間経過全体にわたって統計的変化を示さなかった。tPAは遺伝子転写の下方調節を示し、これは2時間(p=0.013)、4時間、及び24時間(p=0.001)の時点で統計的に有意であった。
プマクタント中で培養した鞘に由来する細胞は、時間経過の開始時点でコラーゲンタイプIの下方調節を示し、16時間からは(図31)上方調節を示したが、いずれの時点においても統計的優位性にまでは至らなかった。コラーゲンタイプIIIは、48時間を除く全ての時点で上方調節を示したが、ここでも統計的優位性にまでは至らなかった。フィブロネクチン遺伝子転写は、プマクタントに応答して上方調節されたが、統計的優位性にまでは至らなかった。PAI−1は、1時間の時点で遺伝子転写の統計的な下方調節を示し(p=0.001)、tPAは、経時的な下方調節を示したが、統計的優位性にまでは至らなかった。
コア由来細胞:
コア由来細胞は、48時間の時間経過にわたってコラーゲンタイプI遺伝子転写において、TGF−β1(2ng/ml)と培養した際に、統計的な変化を示さなかった。コラーゲンタイプIII遺伝子転写は、2、6、及び8時間という時間経過の早期において、統計的に有意な下方調節を示したが(p=0.03;図32)、後の時点では、統計的に有意ではないが上方調節を示した。フィブロネクチン遺伝子転写は、6時間の時点において統計的に有意な下方調節を示し(p=0.024)、後に、24及び48時間の時点では、統計的に有意な上方調節に逆転した(p<0.05)。プラスミノゲンアクチベーターインヒビター1(PAI−1)は、2及び4時間で遺伝子転写の上方調節を示したが、2時間でのみ統計的に有意であった(p=0.001)。tPAは、1、2、6,8、及び24時間(p=0.01)並びに16時間(p=0.002)で遺伝子転写における統計的に有意な下方調節を示した。
コア由来細胞は、48時間の時間経過にわたってコラーゲンタイプI遺伝子転写において、TGF−β1(2ng/ml)と培養した際に、統計的な変化を示さなかった。コラーゲンタイプIII遺伝子転写は、2、6、及び8時間という時間経過の早期において、統計的に有意な下方調節を示したが(p=0.03;図32)、後の時点では、統計的に有意ではないが上方調節を示した。フィブロネクチン遺伝子転写は、6時間の時点において統計的に有意な下方調節を示し(p=0.024)、後に、24及び48時間の時点では、統計的に有意な上方調節に逆転した(p<0.05)。プラスミノゲンアクチベーターインヒビター1(PAI−1)は、2及び4時間で遺伝子転写の上方調節を示したが、2時間でのみ統計的に有意であった(p=0.001)。tPAは、1、2、6,8、及び24時間(p=0.01)並びに16時間(p=0.002)で遺伝子転写における統計的に有意な下方調節を示した。
プマクタント中で培養したコア由来の細胞は、コラーゲンタイプIの下方調節を示したが、いずれの時点においても、1mg/mlプマクタントで培養した際には統計的有意性には至らなかった。しかしながら、コラーゲンタイプIIIは、24時間及び48時間の時点において統計的に有意な上方調節を示した(p=0.025;図33)。フィブロネクチンは、経時的に統計的に優位な変化は示さなかった。PAI−1は、1及び2時間の早期においてプマクタントに対する応答で遺伝子転写の統計的に有意な上方調節を示し(p=0.001)、次いで、後に6、8、及び16時間の時点では統計的に有意な下方調節を示した(p=0.001)。tPA遺伝子転写は、時間経過全体にわたって優位な変化は示さなかった。
接着アッセイ
腱由来の線維芽細胞は、プマクタントとともに又はプマクタントなしで培養して試験したマトリックスのいずれに対する接着における統計的に有意な差異は示さなかった(1mg/ml;図34)。
腱由来の線維芽細胞は、プマクタントとともに又はプマクタントなしで培養して試験したマトリックスのいずれに対する接着における統計的に有意な差異は示さなかった(1mg/ml;図34)。
細胞外マトリックス生産:
ウエスタンブロットを、各種の市販の一次抗体(ウサギコラーゲンタイプIを検出する)を使用したコラーゲンタイプIについて実施し、対照を一貫して使用したが、いずれの市販の抗体も、TGF−β1と培養した細胞由来のタンパク質溶解物を試験した際であってもバンドを示さなかった。したがって、ウエスタンブロットを使用するのを止めた。
ウエスタンブロットを、各種の市販の一次抗体(ウサギコラーゲンタイプIを検出する)を使用したコラーゲンタイプIについて実施し、対照を一貫して使用したが、いずれの市販の抗体も、TGF−β1と培養した細胞由来のタンパク質溶解物を試験した際であってもバンドを示さなかった。したがって、ウエスタンブロットを使用するのを止めた。
Sircolコラーゲンアッセイは、インビトロ哺乳動物細胞によって培養培地中に放出された可溶性コラーゲンの分析のために設計された定量的染料結合方法である。哺乳動物コラーゲンタイプIからXIVが検出されるが、染料はそれらを区別しない。染料試薬は、全ての哺乳動物コラーゲンにおいて認められる[Gly−X−Y]ヘリックス構造に特異的に結合する。プマクタントは、培地(5%FCS含む;図35)のみで培養した細胞又はTGF−β1と培養したもののいずれかと比較したところ、いずれの腱細胞タイプについても可溶性コラーゲンの生産に対する効果を有さなかった。
インビトロアッセイ:
力学的アッセイ
引張強度試験装置からの生データ(図36)は、手術した未処理の群(OUT)と実手術の未処理の群(UOUT)との間の観察され得る差異を示す。これら2つの群は、本試験の陽性対照群および陰性対照群の各々をあらわす。本質的には、腱が手術される際には、OUT群で認められるように(ウサギの足が固定化されたため)、癒着が損傷部位の周囲に形成するであろう。3.78Nの平均の力(図36)が、この群で典型的に認められる。腱の損傷が存在しない場合には、UOUT群によって表わされるように癒着形成は認められないはずである。しかしながら、後者の群では、移動を増大させると、負荷における小さな増大(0.2から0.6N)が認められることがあった。
力学的アッセイ
引張強度試験装置からの生データ(図36)は、手術した未処理の群(OUT)と実手術の未処理の群(UOUT)との間の観察され得る差異を示す。これら2つの群は、本試験の陽性対照群および陰性対照群の各々をあらわす。本質的には、腱が手術される際には、OUT群で認められるように(ウサギの足が固定化されたため)、癒着が損傷部位の周囲に形成するであろう。3.78Nの平均の力(図36)が、この群で典型的に認められる。腱の損傷が存在しない場合には、UOUT群によって表わされるように癒着形成は認められないはずである。しかしながら、後者の群では、移動を増大させると、負荷における小さな増大(0.2から0.6N)が認められることがあった。
手術したプマクタントの群からの生データを、未手術の未処理の群(UOUT群;図37)を比較すると、鞘から腱を引き出すのに必要とされる力には小さな差異しかなかった。その力は小さく、0.4N及び0.6Nであり、これについても、癒着の形成よりも腱紐 (vinculae)の形成によるものであろう。
手術した未処理の群は、2.8±1.1の引き抜きを示し、未手術の群は0.398±0.2の引き抜きを示し、プマクタントの群(手術してプマクタントで処理した)は0.8±0.8を示した。手術したが未処理の群は、未処理及びプマクタント処理の群の双方と比較して、力における統計的に有意な増大を必要とした(p<0.0001;図38)。プマクタント処理群を手術した未処理の群と比較すると、癒着を破壊するために必要とされる力における統計的に有意な低減が存在した(p=0.0012)。
組織学的評価
全ての未手術で未処理(UOUT)の群は、予測されるように、巨視的及び微視的調査のいずれにおいても癒着形成の証拠は無かった。マッソントリクロム染色は、手術した腱の群と比較して、未処理の群では、より組織だったコラーゲン線維の形成を示した。未処理の群は、赤色染色によって表わされる、新しい細胞外マトリックス(ECM)沈着も示した(図39)。手術した未処理の群(OUT)は、頻繁に、腱と腱鞘との間の高密度かつ不規則な癒着パターンを示し(図40)、プマクタント処理した腱は、癒着組織の幾つかの散在する線維を示す場合があり、又は癒着が認められないこともあった(図40)。手術した未処理(OUT)のサンプルは、Tang et al(1996)に基づいて4から6の間で採点し(図41)(平均=5.13±0.84)、プマクタント処理した腱は0から5の広い範囲のスコアを示したが、平均では低い値であった(平均=1.88±2.10)。これら2つの群の間には統計的に有意な差異が存在した(p=0.0012;27)。これらの結果は、プマクタントが、癒着形成の組織学的出現を低減できることを示す。
全ての未手術で未処理(UOUT)の群は、予測されるように、巨視的及び微視的調査のいずれにおいても癒着形成の証拠は無かった。マッソントリクロム染色は、手術した腱の群と比較して、未処理の群では、より組織だったコラーゲン線維の形成を示した。未処理の群は、赤色染色によって表わされる、新しい細胞外マトリックス(ECM)沈着も示した(図39)。手術した未処理の群(OUT)は、頻繁に、腱と腱鞘との間の高密度かつ不規則な癒着パターンを示し(図40)、プマクタント処理した腱は、癒着組織の幾つかの散在する線維を示す場合があり、又は癒着が認められないこともあった(図40)。手術した未処理(OUT)のサンプルは、Tang et al(1996)に基づいて4から6の間で採点し(図41)(平均=5.13±0.84)、プマクタント処理した腱は0から5の広い範囲のスコアを示したが、平均では低い値であった(平均=1.88±2.10)。これら2つの群の間には統計的に有意な差異が存在した(p=0.0012;27)。これらの結果は、プマクタントが、癒着形成の組織学的出現を低減できることを示す。
結果のまとめ:
増殖:
プマクタントは、腱−鞘複合体の異なる領域由来の細胞からの、増殖増大における様々な応答を示した。表面由来細胞は、48時間の時点で2mg/mlに統計的に有意な増大を示し、コアは、0.5mg/mlではあるが同じ時点で統計的に有意な増大を示した。鞘は、2及び4mg/mlの双方で72時間の時点において統計的に有意な増大を示した。
増殖:
プマクタントは、腱−鞘複合体の異なる領域由来の細胞からの、増殖増大における様々な応答を示した。表面由来細胞は、48時間の時点で2mg/mlに統計的に有意な増大を示し、コアは、0.5mg/mlではあるが同じ時点で統計的に有意な増大を示した。鞘は、2及び4mg/mlの双方で72時間の時点において統計的に有意な増大を示した。
遺伝子転写:
表面及び鞘は、試験した遺伝子のいずれにおいても遺伝子発現における統計的に有意な変化を示さなかったが、コア(エンドテノン)由来の細胞は、24及び48時間の時点でコラーゲンタイプIIIについて、及び1及び2時間の時点でPAI−1について統計的に有意な増大を示した。
表面及び鞘は、試験した遺伝子のいずれにおいても遺伝子発現における統計的に有意な変化を示さなかったが、コア(エンドテノン)由来の細胞は、24及び48時間の時点でコラーゲンタイプIIIについて、及び1及び2時間の時点でPAI−1について統計的に有意な増大を示した。
接着アッセイ及びコラーゲン生産
いずれの方法についても、どの細胞にでも統計的な優位性は認められなかった。
いずれの方法についても、どの細胞にでも統計的な優位性は認められなかった。
インビボ:
プマクタントは、癒着の組織/存在及び腱の引き出しに必要とされる力の双方における統計的に有意な低減を示した。
プマクタントは、癒着の組織/存在及び腱の引き出しに必要とされる力の双方における統計的に有意な低減を示した。
議論及び結論
プマクタントは、3種全ての細胞タイプにおける増殖を増大したが、これは、用量及び時間のいずれとも一致せず、細胞種の間の変化が大きかった。しかしながら、表面及び鞘由来の細胞は、48時間及び72時間の時点において、各種の濃度のウシ胎仔血清に対して増殖の増大を示し、これらの細胞タイプは、72時間の時点においてTGF−β1に対して増殖における増大も示した。コア由来の細胞は、ウシ胎仔血清及びTGF−β1のいずれに対しても統計的に有意な増大は示さなかったが、他の文献(Khan et al,1998;Kakar et al,1998)は、エンドテノン(コア由来)細胞は、インビボ及びインビトロの双方において増殖速度の低減を示すことも示している。
プマクタントは、3種全ての細胞タイプにおける増殖を増大したが、これは、用量及び時間のいずれとも一致せず、細胞種の間の変化が大きかった。しかしながら、表面及び鞘由来の細胞は、48時間及び72時間の時点において、各種の濃度のウシ胎仔血清に対して増殖の増大を示し、これらの細胞タイプは、72時間の時点においてTGF−β1に対して増殖における増大も示した。コア由来の細胞は、ウシ胎仔血清及びTGF−β1のいずれに対しても統計的に有意な増大は示さなかったが、他の文献(Khan et al,1998;Kakar et al,1998)は、エンドテノン(コア由来)細胞は、インビボ及びインビトロの双方において増殖速度の低減を示すことも示している。
プマクタントは、遺伝子転写に対する効果はほとんど有していないようであるが、遺伝子転写を増大する場合は、コア細胞においてのみ認められた。これは、3種全ての細胞タイプについて多数の遺伝子の転写における増大を示すTGF−β1で処理した同等細胞とは異なる。したがって、プマクタントは、腱の治癒(コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIII)又は癒着形成(フィブロネクチン、PAI−1)に関与する遺伝子の転写を変化することはないようである。さらに、プマクタントは、可溶性コラーゲンの統計的増大を生じさせないが、これは、条件細胞培養培地に放出されたコラーゲンであり、プラスチック上にプレーティングされたコラーゲンを含まない。
プマクタントは、各種のマトリックスに対する細胞接着のいずれにも効果を有しないようであるが、腱由来細胞が、腱と鞘との間に架橋を形成すると解されているフィブロネクチン(フィブロネクチンは腱の修復の早期に沈着する(Williams et al,1984))に対して接着するのを妨げる。Fu et al(2005)は、腱由来細胞がフィブロネクチンに対して接着するのを妨げることは、コラーゲンタイプIの生産を増大し、そのため腱の治癒を助ける可能性があることをも見出した。
プマクタントは、手術したが未処理の腱と比較して、鞘から腱を引き出すのに必要とされる力の量を低減するのみでなく、プマクタント処理群では組織学的採点が統計的により良好であったという点で、インビボモデルに対する顕著な効果を有していた。プマクタントは、腱由来細胞に対する非常に僅かな生物学的効果を有するのみであるようであったが、インビボモデルに対する結果を改善した。
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Claims (18)
- 結晶状態のリン脂質。
- 凍結乾燥されている、請求項1に記載のリン脂質。
- 滅菌されている、請求項1又は2に記載のリン脂質。
- 極性溶媒に室温で分散される際に、形成される分散物が、離散した結晶を含むような状態にあり;好ましくは、極性溶媒に37℃で分散される際に、形成される分散物が、ミセルの可視的な凝集を実質的に有しない微細なミセル分散を含むような状態にあり;より好ましくは、前記極性溶媒が等張極性溶媒である、請求項1から3のいずれか一項に記載のリン脂質。
- 呼吸域粒子の状態であり、好ましくは、前記呼吸域粒子が肺への投与に適切な空気動力学的中央粒子径を有し、より好ましくは、前記呼吸域粒子の空気動力学的中央粒子径が10μm未満である、請求項1から4のいずれか一項に記載のリン脂質。
- 微細粒子の状態にある、請求項1から5のいずれか一項に記載のリン脂質。
- 一般式:
を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載のリン脂質。 - R1又はR2によって独立に表わされる脂肪酸アシル基が、パルミトイルC16:0、ステアロイルC18:0、オレオイルC18:1、及び/又はオレオイルC18:2であり、好ましくは、R1及びR2の各々が水素原子を表わさず;好ましくは、R1及びR2が同一の飽和又は不飽和のアシル基を表わす、請求項7に記載のリン脂質。
- 結晶状態のリン脂質であって、
前記リン脂質が滅菌されており、
一般式:
を有し、
好ましくは請求項2、4、5、6、又は8に記載されたものである、リン脂質。 - リン脂質の製造方法であって、
極性溶媒にリン脂質を分散する工程;
前記リン脂質分散物を均質化する工程;及び
(a)均質化した前記リン脂質を濾過して滅菌し、濾過したリン脂質分散物を凍結乾燥する工程;又は
(b)前記リン脂質分散物を凍結乾燥し、凍結乾燥したリン脂質を微粉化する工程
のいずれかを含む、方法。 - 前記濾過工程が、0.5μmフィルター、好ましくは0.2μmフィルターを使用する、請求項10に記載の方法。
- 請求項10又は11に記載の方法によって得ることができるリン脂質。
- 製薬学的に許容される希釈剤とともに、請求項1から9及び12のいずれか一項に記載のリン脂質を含む、医薬組成物。
- 唯一の活性成分がリン脂質である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 請求項13又は14に記載の医薬組成物を製造するためのキットであって、第一の部分が請求項1から9及び12のいずれか一項に記載のリン脂質を含み、第二の部分が製薬学的に許容される希釈剤を含む、少なくとも2つの部分を有する、キット。
- 損傷組織の治療に使用するための、請求項1から9及び12のいずれか一項に記載のリン脂質、又は請求項13若しくは14に記載の医薬組成物、又は請求項15に記載のキット。
- 損傷組織の治療に使用するための医薬の製造における、請求項1から9及び12のいずれか一項に記載のリン脂質、又は請求項13若しくは14に記載の医薬組成物、又は請求項16に記載のキットの使用。
- 請求項1から9及び12のいずれか一項に記載のリン脂質、又は請求項13若しくは14に記載の医薬組成物、又は請求項16に記載のキットの治療有効量を、治療の必要なヒト又は動物の患者に適用する工程を含む、損傷組織の治療方法。
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