JP2022540578A - ゲル形成組成物の調製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、非経口投与用ゲル形成組成物の調製方法に関し、前記方法は哺乳類由来血漿とヒアルロン酸またはその塩もしくはエステルとの混合物とカルシウム源とを混合する工程を含み、前記カルシウム源は、カルシウム濃度が０．２～１．４ｍｇ／ｍｌとなるように前記混合物に添加される。本発明はまた、この方法によって得られる組成物に関する。

Description

（発明の分野）
本発明は、非経口投与用ゲル形成組成物の製造方法に関する。本発明は、医学および獣医学の技術分野に関する。

（背景）
筋骨格系疾患または障害は、骨、筋肉、継手、軟骨、腱、靭帯、および組織と器官を共に支持し結合する他の結合組織を侵しうる。これらの疾患は経時的に発症し得るか、または、例えば、筋骨格系の過剰な使用によって、または外傷から生じ得る。筋骨格系疾患は、筋骨格系と他の内部系との密接な関係のため、診断および／または治療が困難である。

さらなるおよび／または改善された医薬製剤は、筋骨格系の治療のための局所投与のために構成される。関心の特定の配合は、投与時にゲルコンシステンシーを示すか、または達成する。これらの製剤はしばしば、医薬活性成分および／または治療細胞を含む。

ＥＰ ２ ９００ ２４７は、溶媒／界面活性剤処理血漿（Ｓ／Ｄ血漿）およびヒアルロン酸を含む医薬製剤を開示している。

欧州特許出願公開第２ １８５ １６３号は継手の処理のための方法を開示しており、前記方法は継手における化合物の浸潤を含み、前記化合物は、少なくとも１つの血液由来物質を含む。

国際公開第２０１３ ０７６ １６０号は、グリコサミノグリカン、徐放剤、および１以上の医薬活性成分を含むゲル形成配合を開示している。

ＵＳ２０１２１７１１６９は、骨および軟骨疾患の防止のための医薬組成物を記載する。この組成物は、脂肪由来幹細胞、ＰＲＰ、ＨＡおよび塩化カルシウムを含む。

国際公開第２０１４／０３５７２１号は、創傷治癒および他の適用においてハイドロゲルとして使用される改変血漿に関する。

国際公開第２００９／０１６４５１号は、ＰＲＰおよび増殖因子にリッチ血漿などの血液由来物質による継手浸透に基づく、継手疾患または疼痛を治療するための方法に関する。ＨＡを組成物に添加してもよい。

従来技術のゲル形成組成物は筋骨格系の治療のために設計された改善された特性を有するが、ゲル形成組成物のゼリー化特性は可変である。これらの特性はしばしば、組成物の調製における異なる処理手順によって影響される。意図された投与様式のために、制御されたゼリー化特性を有する再現性のあるゲル形成組成物が手近であるべきである。

したがって、ゲル形成組成物および制御されたゼリー化を伴う改良されたゲル形成組成物の調製のための方法が、当該技術分野において依然として必要とされている。本発明は、上述した課題及び欠点を解決することを目的とする。

（発明の要旨）

本発明およびその実施形態は、上述の欠点のうちの１以上に対する解決策を提供するのに役立つ。この目的のために、本発明は、請求項１に記載の非経口投与用ゲル形成組成物の調製方法に関する。

本発明において開示する方法はゲル形成組成物の調製を可能にし、組成物の漸進的かつ制御されたゼリー化を可能にする。

本方法の好ましい実施形態は、請求項２～１３のいずれかに示されている。

第２の態様において、本発明は、請求項１４に記載の組成物に関する。より具体的には本明細書に記載される組成物が最適なゼリー化処理を提供し、その結果、組成物は安全に取り扱われ、投与され得、そして組成物は損傷部位でゼリー化し、細胞支持性環境および組成物内に含まれる医薬活性成分の徐放性を確立する。

第３の態様において、本発明は、請求項１５に記載の使用のための組成物に関する。この使用の好ましい実施形態は、請求項１６～１８に示される。

（定義）
別段の定義がない限り、技術用語および科学用語を含む、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。さらなる指針により、用語の定義は、本発明の教示をより良く理解するために含まれる。

本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有する。

本明細書で使用される「Ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈が明らかにそわないと指示しない限り、単数および複数の両方の指示対象を指す。例として、「コンパートメント（ａ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）」は、１または１より多いコンパートメントを指す。

パラメータ、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す本明細書で使用される「約」は開示される発明で実行するのに適切である限り、特定の値の＋／－２０％以下、好ましくは＋／－１０％以下、より好ましくは＋／－５％以下、さらにより好ましくは＋／－１％以下、さらにより好ましくは＋／－０．１％以下、および特定の値からの変動を包含することを意味する。しかし、修飾詞「約」が言及する値は、それ自体もまた、特に開示されることが理解されるべきである。

「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる／含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる／含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含んでいる／含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であり、例えば、構成要素に続くもの存在を特定し、当技術分野で公知または開示された追加の、列挙されていない構成要素、特徴、要素、成分、工程の存在を除外または排除しない、包括的またはオープンエンドの用語である。

さらに、明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は同様の要素を区別するために使用され、特定されない限り、必ずしも連続する順序または時系列の順序を説明するために使用されるわけではない。そのように使用される用語は適切な状況下で交換可能であり、本明細書で説明される本発明の実施形態は、本明細書で説明または図示される以外の順序で動作することができることを理解されたい。

終点による数値範囲の列挙は列挙された終点と同様に、その範囲内に包含されるすべての数および分数を含む。

本明細書および明細書全体を通して、特に定義しない限り、「重量％」という表現は、製剤の全重量に基づくそれぞれの成分の相対重量を指す。

部材のグループの１以上の部材などの「１以上」という用語はそれ自体、さらなる例示によって明らかであるが、この用語はとりわけ、前記部材のいずれか１つ、または前記部材のいずれか２つ以上、例えば、前記部材のいずれか≧３、≧４、≧５、≧６、もしくは≧７など、およびすべての前記部材への言及を包含する。

用語「製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」、「組成物」、または「調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。

用語「血漿」は抗凝固剤、例えば、ＣＰＤＡ－１（クエン酸塩、リン酸塩、デキストロース、および／またはアデノシンを含む）ヘパリン、クエン酸塩、シュウ酸塩、またはＥＤＴＡと提供または接触される、全血のサンプルから得られる画分として理解されるべきである。血液サンプルの細胞成分、すなわち白血球および赤血球は、適切な技術、例えば遠心分離またはアフェレーシスによって、液体成分、すなわち血漿から分離される。その後、血漿は例えばウイルスを排除するために、任意に溶媒／界面活性剤処理されてもよい。溶媒／界面活性剤処理は細胞および／または細胞残屑（例えば、脂質膜、脂質および／またはリン脂質）の排除を可能にする。これは、典型的には溶媒／界面活性剤処理血漿（Ｓ／Ｄ血漿）と呼ばれる。溶媒／界面活性剤処理を受けなかった血漿は、未処理血漿または天然血漿として標識することができる。本発明の一実施形態では血漿は処理されず、理論に束縛されることを望まないが、前記血漿は細胞、脂質、および／またはリン脂質を含むと理解される。結果として、前記血漿は、天然血漿と同様のまたは同じ組成特性を有する。本発明の「血漿」は、好ましくは哺乳類由来である。

用語「新鮮な凍結血漿」は血漿定義において言及されるように、その調製後－１８℃以下で１２時間以内に凍結される血漿として理解されるべきである。

用語「アフェレーズされた血漿」は血漿を全ての血液から分離し、残りの流体をドナーに直接戻す装置（すなわち、アフェレーシス）を通過させて、血液がドナーから収集される医療技術で血漿アフェレーシスによって得られる血漿として理解されるべきである。アフェレーシスを受けた血漿を、抗凝固剤（例えば、ＣＰＤＡ １、ＡＣＤ、ヘパリン、クエン酸塩、シュウ酸塩またはＥＤＴＡ）と接触させる。

用語「遠心分離された血漿」は、全ての血液からの血漿の分離を可能にする抗凝固剤と接触された全ての血液の遠心分離によって得られる血漿として理解されるべきである。遠心分離を受けた血漿は、ＣＰＤＡ １、ＡＣＤ、ヘパリン、クエン酸塩、シュウ酸塩またはＥＤＴＡなどの抗凝固剤と接触させることができる。

明細書を通して意図される「ゲル形成剤」という用語は、固形のゼリー様材料（ゲル）を形成することができる薬剤を包含する。特に、ゲル形成剤は例えば、限定されるものではないが、水溶液中などの適切な液相中に溶解または分散された場合に、ゲル形成をもたらす材料および／または条件と組み合わせるか、またはそれらに曝露された場合に、ゲルを形成する。

用語「ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）」は、「ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ）」と交換可能に使用され得る。用語「ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）」は、交互のβ－１，４およびβ－１，３グリコシド結合を介して連結された、Ｄ－グルクロン酸およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンから構成される二糖類のアニオン性非硫酸化ポリマーを指す。ヒアルロン酸誘導体にはヒアルロン酸の塩、例えばヒアルロン酸ナトリウムまたはヒアルロン酸と脂肪族、複素環式もしくは脂環式シリーズのアルコールとのエステル、またはヒアルロン酸の硫酸化形態、またはヒアルロン酸を含有する薬剤の組合せが含まれるが、これらに限定されない。

用語「対象」または「患者」は、互換的に使用され、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳類を指す。好ましい患者は、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコの被験者である。

用語「治療を必要とする対象」は、所定の状態、特に骨疾患または関節疾患などの筋骨格疾患の治療から利益を得る対象を含む。あるいは、またはそれに加えて、前記疾患は腱および／または靭帯に影響を及ぼし得る。そのような対象には限定されるものではないが、前記条件と診断された対象、前記条件を発症する傾向がある対象、および／または前記条件を予防すべき対象が含まれ得る。

用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は既に発症した疾患または状態の治療的処置、ならびに予防的または予防策両方を包含し、その目的は望ましくない苦痛の発生の機会を予防または軽減すること、例えば、疾患または状態の進行の機会を予防することである。有益なまたは所望の臨床結果としては１以上の症状または１以上の生物学的マーカーの軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化状態、疾患進行の遅延または遅延、疾患状態の改善または緩和などが挙げられ得るが、これらに限定されない。「治療」という用語は、治療を受けていない場合に期待される生存期間と比較して、生存期間を延長することを意味することもできる。

本明細書で使用される「徐放性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）」という用語は、先行技術で公知の組成物などの参照組成物からの前記化合物の放出と比較して、延長された、延長された、または増加された期間にわたる組成物からの化合物の放出を広く指す。本明細書中で使用される場合、徐放性は、組成物の化合物のうちの１以上、すなわち哺乳類血漿または１以上のさらなる活性医薬成分の徐放性をいう。例えば、膝関節における高分子量ヒアルロン酸の半減期は約１０～１５時間であることが先行技術から知られている。したがって、本明細書で使用される徐放性は本組成物からのヒアルロン酸の徐放性、例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間などの１日以上の間、または１．５週間、２週間、３週間、または１ヶ月以上などの１週間以上の間の放出を指す。したがって、これらの用語は、延長放出、遅延放出または制御放出も特に包含し得る。

用語「医薬化合物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、有効量で提供される場合、所望の治療的および／または予防的結果を達成する化合物、物質または成分を広く指す。典型的には、活性医薬成分が生きている細胞または生物と相互作用および／または調節することによって、そのような結果を達成することができる。用語「医薬化合物」はまた、表題化合物または物質の任意の薬理学的に活性な塩、エステル、Ｎ－酸化物またはプロドラッグを包含する。

本明細書で使用される「局所投与（ｌｏｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、体内の標的部位またはその近傍における非経口投与を指す。

本明細書において引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書において特に参照される全ての参考文献の教示は、参照により組み込まれる。

別段の定義がない限り、技術用語および科学用語を含む、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。さらなる指針により、本明細書で使用される用語の定義は、本発明の教示をより良く理解するために含まれる。本明細書で使用される用語または定義は、単に本発明の理解を助けるために提供される。

明細書を通して、「１実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の種々の場所における「１実施形態において（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施形態において（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではなく、そうであってもよい。さらに、特定の特徴、構造、または特性は１以上の実施形態において、本開示から当業者には明らかであるように、任意の適切な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書で説明されるいくつかの実施形態は他の実施形態に含まれる他の特徴ではなく、いくつかの実施形態を含むが、異なる実施形態の特徴の組合せは当業者によって理解されるように、本発明の範囲内であり、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、以下の特許請求の範囲では、特許請求の範囲に記載された実施形態のいずれも、任意の組合せで使用することができる。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ゲル形成組成物の調製方法に関する。ゲル形成組成物の調製は一般に、組成物内の各化合物の品質、量および活性が重要である繊細なプロセスである。本発明の方法はゲル形成組成物のゼリー化が制御され、安定な様式で起こり、非経口投与を可能にするので有利である。

第１の態様において、非経口投与用ゲル形成組成物の調製のための方法が提供され、該方法は哺乳類由来の血漿およびヒアルロン酸またはその塩もしくはエステルの混合物をカルシウム源と混合する工程を包含し、ここで、該カルシウム源はカルシウム濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ～１．４ｍｇ／ｍｌであるように、該混合物に添加される。

一実施形態では、哺乳類由来の血漿とヒアルロン酸またはその塩もしくはエステルとの混合物が予め作製された混合物である。別の実施形態において、哺乳類由来の血漿とヒアルロン酸またはその塩もしくはエステルとの混合物は、前記カルシウム源を混合する工程の前に混合され得る。カルシウム源を前記混合物に添加する。一連の工程は、前記ゲル形成組成物の均一かつ安定なゼリー化を助けることが見出された。漸進的かつ制御されたゼリー化は、前記組成物が非経口的に投与される目的を有することを考慮すると、絶対的な必要性である。さらに、ゲル形成組成物中の前記カルシウム源の総濃度は所望の効果を得るために、０．２～１．４ｍｇ／ｍｌであるべきである。

ゲル形成組成物の実施形態では、前記組成物が約５０～９９重量％の血漿、より好ましくは約６０～９９重量％、より好ましくは約７０～９９重量％、より好ましくは約８０～９９重量％、より好ましくは約９０～９９重量％、より好ましくは約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９重量％の血漿を含む。

一実施形態では、組成物の主成分が哺乳類由来血漿である。

本発明の好ましい実施形態において、前記血漿は哺乳類由来であり、より好ましくは、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネコの血液に由来する。

好ましくは、哺乳類血漿を含むゲル形成組成物が哺乳類被験体への投与に特に適しているように、血漿は哺乳類血漿であってもよい。好ましくは、血漿は同種異系である。同種血漿の収集プロセスは十分に確立されており、抗凝固剤、分離および処理技術、遠心力、ならびに温度および時間の使用に関して高度に標準化されており、その結果、細胞および固形成分の高度に予測可能な量が得られる。好ましくは、血漿が同種異系ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネコの血漿である。

一実施形態では、血漿が遠心分離された血漿またはアフェレーシスされた血漿を含むことができる。哺乳類血漿は、新鮮な凍結血漿であり得る。好ましくは、本発明の哺乳類血漿が電流された新鮮な凍結血漿である。

一実施形態では、前記血漿が非溶媒／界面活性剤処理血漿である。

哺乳類由来血漿は、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネコのような哺乳類供給源からの単一または複数のドナーからプラスチックバッグまたはガラス瓶中で収集され、上記の手段を介して血液細胞から分離された血漿を含む。回収後、哺乳類由来血漿を－１８℃以下、好ましくは－１８℃未満で保存する。

血漿は脂質および／またはリン脂質を含み、脂質および／またはリン脂質は１以上のスフィンゴ脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリド、ジアシルグリセリド、レシチン、リポソーム、少量の血漿脂質、およびこれらの組合せを含み得るが、これらに限定されない。血漿脂質および／またはリン脂質は、血液凝固カスケードを誘発する血液凝固因子との複合体形成を促進する。

脂質および／またはリン脂質は組成物に外部から添加され得るが、一実施形態では前記血漿が脂質および／またはリン脂質の供給源である。

血漿脂質および／またはリン脂質の濃度および特性を決定するために、様々な分析方法が利用可能である。クロマトグラフィーは、脂質を分離および分析するための分析手順である。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、血漿脂質および／またはリン脂質の評価にしばしば使用される。質量分析法または核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法のような、血漿中の血漿脂質および／またはリン脂質を評価するための公知の技術もまた、分光法である。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）はまた、血漿中の血漿脂質および／またはリン脂質を評価するための技術である。

血漿脂質および／またはリン脂質は、好ましくはＨＰＬＣ技術を用いて定量される。本発明の血漿中の血漿脂質の量には限界が設定され、血漿の品質再現性を可能にする。

一実施形態では、前記血漿が脂質および／またはリン脂質を含む。好ましくは血漿が脂質および／またはリン脂質を含み、ここで、脂質および／またはリン脂質の前記総濃度は０．２～７ｍｇ／ｍｌである。より好ましくは、血漿中の脂質および／またはリン脂質の総濃度が０．４～６ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍｌである。理論に束縛されることを望まないが、前記脂質および／またはリン脂質は血漿中で凝固促進活性を有し、ゲル形成組成物の改善されたゼリー化を少なくとも部分的に可能にすると理解される。

さらなる実施形態では、前記血漿が少量の血漿脂質を含む。理論に束縛されることを望むものではないが、前記少量の血漿脂質は血漿中で凝固促進活性を有し、ゲル形成組成物の改善されたゼリー化を少なくとも部分的に可能にすると理解される。

本発明の好ましい実施形態において、前記微量血漿脂質は、好ましくはパルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）、ステアロイルエタノールアミド（ＳＥＡ）、アラキドノイルエタノールアミド（ＡＥＡ）の群から選択される。

一実施形態では、哺乳類血漿中の少量血漿脂質の総濃度が５～５０ｎｍｏｌ／ｌ、より好ましくは６～３０ｎｍｏｌ／ｌである。

本発明のより好ましい実施形態では、前記組成物はＰＥＡ、ＳＥＡおよびＡＥＡを含み、各脂質は０．２～１４ｎｍｏｌ／ｌの濃度で存在する。さらなる実施形態では、各少量血漿脂質が０．５～１２ｎｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．８～８．５ ｎｍｏｌ／ｌの濃度で存在する。

血漿のゼリー化活性は、凝固パラメータ、好ましくはＰＴＴおよびａＰＴＴ、および／または凝固因子、好ましくは第ＶＩＩＩ因子およびフィブリノーゲンを評価することによって測定することができる。

一実施形態では、使用される血漿が７５％より高い抗血友病因子（第ＶＩＩＩ因子）活性を有する。第ＶＩＩＩ因子活性を定量するためのアッセイは当技術分野で公知であり、凝血塊ベースのアッセイ、発色性アッセイまたはＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを含み得る。一実施形態では、前記抗血友病因子（第ＶＩＩＩ因子）活性は、粘度ベースの検出システムを使用する血餅検出法、例えば、ＳＴａｒｔ（登録商標）半自動ベンチトップアナライザーまたは自動化ＳＴＡ Ｒ Ｍａｘ（登録商標） ２、両方ともＳｔａｇｏから入手、によって測定される（Ｃｕｐａｉｏｌｏ Ｒ， Ｇｏｖａｅｒｔｓ Ｄ， Ｂｌａｕｗａｅｒｔ Ｍ， Ｃａｕｃｈｉｅ Ｐ． Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ Ｓｔａｇｏ（登録商標） ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎａｌｙｓｅｒ： Ｔｈｅ ＳＴＡ Ｒ Ｍａｘ（登録商標） ２． Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２０１９；４１（６）：７３１－７３７． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｊｌｈ．１３１００）。要するに、前記方法は、塊検出のために試験される血漿の粘度の増加を使用する。粘度の変化は、特別に設計されたキュベット内の振動する鋼球の振幅をモニターすることによって測定される。鋼球の運動は２つの活性化コイルによって媒介され、自然振動を誘起し、維持するために交互に働く。開始試薬が添加されると、検出およびクロノメーターが直ちにかつ同時に開始する。ボールが左右に振動すると、動きの振幅が測定される。クロノメーターは、試料の凝固を時間測定する。振幅は、全体凝固プロセスの間モニターされる。血餅が存在しない間、振幅は一定のままである。血餅が発達することにつれて、粘度は増加し、振幅は減少する。アルゴリズムは、凝固時間を決定するために使用される。

一実施形態では、使用される血漿が０．２５～３ｇ／ｌの範囲のフィブリノーゲン（第Ｉ因子）濃度を有する。一実施形態では、使用される血漿が１２～６５秒の範囲の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）活性および／または５～１７秒の範囲の部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）活性を有する。（ａ）ＰＴＴを測定するのに適した方法は、上記のＳｔａｇｏのＳＴａｒｔ（登録商標）半自動ベンチトップ分析器などの粘度ベースの検出システムを使用する塊検出方法による。さらなる好ましい実施形態では、前記血漿が上記の特徴のすべてに準拠する。第ＶＩＩＩ因子、フィブリノーゲン濃度、ａＰＴＴ活性、およびＰＴＴ活性を定量するためのアッセイは、当業者に公知である。

フィブリノーゲンは血漿中で水溶性の血漿糖蛋白として循環する。フィブリノーゲンはフィブリンの形成に関与し、架橋を形成し、結合によって血小板を活性化することによって血液凝固を促進する。

好ましくは、本発明の哺乳類血漿が０．２５～３ｇ／ｌ、より好ましくは０．３～２．５ｇ／ｌ、より好ましくは０．４～２．１ｇ／ｌのフィブリノーゲンの総濃度を有する。先行技術文献は電流血漿を好むが、本発明は０．２５ｇ／ｌの最小濃度のフィブリノーゲンを有する哺乳類血漿を必要とする。

本発明の哺乳類血漿の総タンパク質濃度は、好ましくは１０～１００ｇ／ｌ、好ましくは１５～８５ｇ／ｌ、より好ましくは２０～８０ｇ／ｌである。理論に束縛されることを望むものではないが、この濃度を超えるタンパク質レベルは被験体に投与された場合に、目詰まりに関する問題をもたらし得ると考えられる。

より好ましい実施形態では、前記血漿が２００ミル／ｌ未満の白血球（ＷＢＣ）濃度、好ましくは３～１４５ミル／ｌ、より好ましくは５～８５ミル／ｌ、望ましくは１０～５０ミル／ｌのＷＢＣ濃度を有する。

哺乳類由来血漿は、組成物のゼリー化を妨害しない量の白血球（白血球とも呼ばれる）を含む。

特に好ましい実施形態では、前記血漿が５０，０００ミル／ｌ未満の血小板（ＢＰ）濃度、好ましくは１，０００～３５，０００ミル／ｌのＢＰ濃度、より好ましくは２，０００～２０，０００ミル／ｌのＢＰ濃度を有する。

血小板（Ｂｌｏｏｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）は、血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ）とも呼ばれ、血液凝固過程を助ける。さらに、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）は、増殖因子として知られる数百のタンパク質を含有する。これらの血小板由来増殖因子は再生医療において、特に、骨、軟骨、腱または靭帯の欠損の修理を刺激するため、または損傷した骨、軟骨、腱または靭帯を置換するために有用である。血小板濃度は全血よりも低い。先行技術における他の文献は創傷治癒を増強するために多血小板血漿の使用を好むが、血小板の濃度は特に低い。

一実施形態では、組成物が１以上のグリコサミノグリカンを含む。特定の実施形態では、グリコサミノグリカンがヒアルロン酸およびその誘導体、プロテオグリカンおよびその誘導体、コンドロイチン硫酸塩、ケラタン硫酸塩、キトサンおよびその誘導体、キチンおよびその誘導体、または上記の混合物からなる群より選択され得る。

好ましい実施形態において、前記グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸またはその誘導体である。ヒアルロン酸は生体において重要な役割を果たし、第一に表皮、腱、筋肉および軟骨などの多くの組織の細胞の機械的支持体として重要であり、したがってそれは細胞外マトリックスの主成分である。しかし、ヒアルロン酸はまた、生物学的過程における他の機能（例えば、組織の水和、可動部分の潤滑、細胞移動、細胞機能および分化）を実行する。

本組成物において、ヒアルロン酸の存在は、組織水和、プロテオグリカン機構、細胞分化、細胞増殖および血管新生のような生物学的過程を補助する。ヒアルロン酸誘導体は前記グリコサミノグリカンのすべての特性を維持し、様々な形態で加工することができ、誘導体の型およびパーセンテージに応じて溶解性と分解時間が異なるという利点がある。ヒアルロン酸の誘導体は、ヒアルロン酸の塩、ヒアルロン酸と脂肪族、複素環式または脂環式シリーズのアルコールとのエステル、または硫酸化形態のヒアルロン酸であってもよい。限定するものではないが、好適な誘導体はヒアルロン酸の塩、例えば好ましくはヒアルロン酸ナトリウムであってもよい。

本発明の好ましい実施形態において、前記ヒアルロン酸またはその誘導体は、１，８００ｋＤａ未満、より好ましくは７００～１，６００ｋＤａ、最も好ましくは７００～１，０００ｋＤａの分子量を有する。

好ましくは、ヒアルロン酸またはその誘導体が高分子量を有する。ヒアルロン酸または誘導体の高分子量は、７００～１，０００ｋＤａの分子量として理解されるべきである。例えば、高分子量のヒアルロン酸を注射することは、変形性関節症に冒された関節の機械的一体性を回復させるのに有効である。特に好ましくは、ヒアルロン酸またはその誘導体が狭いサイズ分布を有する。実施形態において開示されるような分子量範囲は、ヒアルロン酸レセプターに対する適切な親和性およびヒアルロン酸生合成のより良好な刺激を確保することが観察された。望ましくは、ヒアルロン酸またはその誘導体が高分子量および狭いサイズ分布を有する。さらに、７００～１，０００ｋＤａの分子量を有するヒアルロン酸またはその誘導体は、処置を必要とする組織に移植または注射された周囲細胞の細胞生存率を改善する。さらに、７００～１，０００ｋＤａのヒアルロン酸が、調製された生成物バッチの品質および再現性を可能にすることが見出された。

高分子量ヒアルロン酸またはその誘導体は、低分子量のものよりも大きな粘弾性特性を示す。本発明の血漿と混合された本実施形態による高分子量のヒアルロン酸またはその誘導体は血漿のむしろ天然組成のために、さらに大きな粘弾性特性を示す。これらの大きな粘弾性特性は特に、継手のように、インビボで起こるような圧力の大きな変動を吸収する必要性の観点から、かなり興味深い。

好ましくは、ヒアルロン酸またはその誘導体が非分岐直鎖ヒアルロン酸である。

ヒアルロン酸は生体内に移植または注射された場合でさえ、天然に存在し、種または器官特異性を有さない。ヒアルロン酸は優れた生体適合性を示す。したがって、ヒアルロン酸は、動物由来であっても、生物発酵起点であってもよい。当技術分野で既知のヒアルロン酸源は雄鶏の櫛である。好ましくは、ヒアルロン酸は生物発酵起点のものである。

限定されないが、ゲル形成組成物はヒアルロン酸またはその誘導体を、約０．１０～２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１～１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２～５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約４～２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で含み得る。

一実施形態では、ヒアルロン酸またはその誘導体が好ましくは滅菌される。ヒアルロン酸は、蒸気滅菌または濾過滅菌することができる。好ましくは、ヒアルロン酸がオートクレーブ滅菌がヒアルロン酸繊維の分子量分布範囲に影響を及ぼし得るので、濾過滅菌される。ヒアルロン酸は、好ましくは可溶化され、濾過により滅菌される。

好ましくは、哺乳類血漿が無菌フィルターを通る。

哺乳類血漿およびヒアルロン酸のフィルター滅菌は、ゲル形成組成物の調製の品質および再現性に有益な影響を及ぼす。

上記のような実施形態のうちの１つによる少なくとも血漿とヒアルロン酸との混合物が作製される。哺乳類由来の血漿およびヒアルロン酸またはその誘導体を混合し、血漿およびヒアルロン酸混合物を得る。

一実施形態では、前記混合物は凍結乾燥される。その結果、凍結乾燥生成物が得られる。凍結乾燥はまた、当該分野で凍結乾燥として公知であり得る。以下の用語「凍結乾燥生成物」および「凍結乾燥混合物」は、本明細書において互換的に使用される。

好ましい実施形態において、血漿およびヒアルロン酸混合物は、凍結乾燥の前に希釈される。好ましくは、前記混合物を水溶液中で少なくとも４回、好ましくは少なくとも３回、より好ましくは少なくとも２回、望ましくは２回可溶化して、生成物粘度を低下させ、さらなる製造工程を容易にする。

別の実施形態において、前記血漿およびヒアルロン酸混合物は、前記カルシウム源の添加前に凍結乾燥される。

前記混合物の凍結乾燥は、貯蔵寿命を増加させる。前記混合物の凍結乾燥は、数ヶ月間、凍結乾燥された安定した製品を提供する。凍結乾燥された生成物は容易に貯蔵し、輸送し、そして注射のために再構成することができる。凍結乾燥生成物は、１５～２５℃の温度で安定である。室温で安定な凍結乾燥製品を有することは、医師にとって有益である。製品の品質を実質的に低下させることなく、製品を容易に輸送または取り扱うことができる。特別な冷却容器は不要である。

好ましい実施形態において、カルシウム源は、血漿およびヒアルロン酸混合物が凍結乾燥された後に添加される。カルシウム源は、好ましくは血漿およびヒアルロン酸混合物が凍結乾燥された後、および場合によっては混合物に１以上の医薬化合物を補充した後に添加される。

続いて、血漿とヒアルロン酸との混合物が作られ、凍結乾燥されて前記凍結乾燥生成物が得られると、ゲル形成組成物中の最終カルシウム濃度が０．２～１．４ｍｇ／ｍｌとなるように、カルシウム源が添加される。好ましくは、前記組成物中の前記カルシウム源の総濃度が０．４～１．２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．６～１．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．６５～０．９５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．７～０．９ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．７５～０．８５ｍｇ／ｍｌである。

本発明のカルシウム源は、ゲル形成組成物のゼリー化を可能にする。前記カルシウム源は、適切な量の薬学的に許容されるカルシウム塩、好ましくは可溶性カルシウム塩から選択され得る。このようなＣａ^２＋塩は、無機酸または有機酸で形成することができる。このような塩の例としては、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、グリセロリン酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、およびこれらの混合物が挙げられる。特に好ましいのは塩化カルシウムであり、これは有利には良好な溶解性を示し、そして注射溶液中で十分に耐性である。

好ましい実施形態では、カルシウム源はカルシウム溶液である。好ましくは、カルシウム溶液が例えば塩化水素溶液のような酸性溶液にカルシウム、好ましい塩化カルシウムの供給源を添加することによって調製される。好ましくは、組成物中の酸性溶液の最終ｐＨが１～４、より好ましくは１．５～２．５である。

前記酸性溶液は、好ましくは薬学的に許容される酸である。薬学的に許容される酸としては、（ｉ）塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、（ｉｉ）有機モノ－、ジ－カルボン酸、酢酸、アルギン酸、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸、酪酸、グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マロン酸、ニコチン酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、３－フェニルプロピオン酸、ピバル酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、ウンデカン酸など、または（ｉｉｉ）スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸）が含まれ得るが、これらに限定されない。重硫酸ナトリウム、カンファースルホン酸、ドデシルスルホン酸、エタンスルホン酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸、ナフタレンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態では、前記カルシウム源は塩化カルシウム水溶液である。本発明の特に好ましい実施形態では、前記塩化カルシウム水溶液が好ましくはｐＨ１～４の酸性ｐＨを有する。前記塩化カルシウム水溶液は好ましくは投与前に混合物を溶解するために、凍結乾燥混合物と混合される。前記塩化カルシウム水溶液は高い凝集特性を有するゲルの形成を可能にし、損傷部位でのゲル形成組成物の最適な統合を可能にする。一旦混合されると、組成物のｐＨは生理学的であり、好ましくは５～８のｐＨであり、より好ましくは６～７．８のｐＨである

ゲル形成組成物は、哺乳類血漿およびヒアルロン酸またはその誘導体に加えて、１以上の医薬化合物を含み得る。他の実施形態では血漿およびグリコサミノグリカンが組成物の唯一の化合物であってもよく、したがって、そのような実施形態では組成物が血漿およびグリコサミノグリカンからなるか、または本質的にそれらからなってもよい。

医薬化合物の性質に応じて、前記化合物は、ゲル形成組成物の調製内の異なるタイミングで添加され得る。一実施形態では、前記医薬化合物が血漿およびヒアルロン酸混合物と混合される。一実施形態では、前記医薬化合物が前記混合物を凍結乾燥する前に、血漿およびヒアルロン酸混合物と混合される。一実施形態では、前記医薬化合物が凍結乾燥血漿およびヒアルロン酸混合物と混合される。好ましい実施形態において、前記医薬化合物はカルシウム源の添加の前に、血漿およびヒアルロン酸混合物と混合され、凍結乾燥されるかまたはされない。

特定の実施形態では、組成物が有利には１以上の医薬化合物をさらに含むことができる。本発明の利用可能性は、任意の医薬化合物または医薬化合物のクラスに限定されない。医薬化合物はそれ自体薬理学的に活性であってもよく、または体内での化学的または酵素的プロセスによって薬理学的に活性な種に変換されてもよく、すなわち、医薬化合物はプロドラッグであってもよい。現在のゲル形成組成物は、不十分に安定な医薬化合物に特に有用であり得る。不十分に安定な医薬化合物の例示的な非限定的な例としては、増殖因子、ペプチド様活性成分、抗体およびワクチン、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ、ホルモンなどのペプチドおよびタンパク質が挙げられる。

さらに、２つ以上の医薬化合物の組合せまたは用量の組合せが、薬物成分として含まれ得る。この場合、各化合物の放出は例えば、第１の化合物が即時放出形態として提示され、第２の化合物が制御放出として提示される２つの化合物の組合せの場合のように、同一であっても異なっていてもよい。同様に、迅速かつ持続的な効果を提供するために、同一化合物について即時放出形態および制御放出形態の組合せも得られ得る。

本発明の実施形態では前記ゲル形成組成物が１以上の医薬化合物をさらに含み、前記化合物は活性医薬成分、抗生物質剤、細胞組成物、有機小分子、タンパク質またはペプチドからなる群から選択される。

好ましい実施形態では、前記活性医薬成分がα－２アドレナリン作動性受容体アゴニスト、好ましくはクロニジンまたはその誘導体、好ましくはクロニジンである。

具体的な実施形態では、α－２アドレナリン受容体アゴニストが２、６－ジメチルクロニジン、４－カルボキシクロニジン、４－ジクロロチロシン、アリニジン、クロレチルクロニジン、４－イソチオシアナート、クロニジン受容体、クロニジン置換物質、ヒドロキシフェナセチルアミノクロニジン、Ｎ’－ジメチルクロニジン、ｐ－アミノクロニジン、およびチアゾリジンからなる群より選択され得る；イミダゾリン、インプロミジン、デトミジン、メデトミジン、レバミソール、ロサルタン、ロフェキシジン、ミコナゾール、ナファゾリン ニリダゾール、ニトロイミダゾール、オキシメタゾリン、フェントラミン、テトラミソール、チアマゾール、トラゾリン、トリメタゾール；４－（３－ブトキシ－４－メトキシベンジル）イミダゾリジン－２－オン、ウロカニン酸、アンタゾリン、ビオチン（４－メチル－１－ホモピペラジニルチオカルボニル）ジスルフィド、カルビマゾール、シメチジン、クロトリマゾール、クレアチニン、ダカルバジン、デクスメデトミジン、エコナゾール、エチミゾール、エトミダート、ファドロゾール 、フルスピリレン、イダゾキサン、シメチジン、ミバゼロール；グアネチジン、グアネチジン、硫酸グアネチジン、グアンクロフィン、グアニジン、イムノキサベンズ、ヨード－３ベンジルグアニジン、メチルグアニジン、ニトロソグアニジン、ピナシジン、スルファグアニジン；α－メチノレフェリン、アゼペキソール、５－ブロモ－６－（２ イミダゾリジン－２－イルアミノ）キノキサリン、フマル酸ホルモテロール、インドラミン、６－アリル－２－５，６，７－テトラヒドロ４Ｈ－チアゾロ［４，５－ｄ］アゼピンジＨＣｌ、ニセルゴリン、リルメニジン Ｎ－（２－ブロモ－６－フルオロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－アミンおよびキシラジンからなる群から選択されてもよい。

クロニジンは中枢作用性アルファ－２アドレナリン受容体作動薬である。通常、降圧剤として用いられる。クロニジンは、一般に、２，６－ジクロロ－Ｎ－２－イミダゾリジニルデンベンゼンアミン（Ｃ_９Ｈ_９Ｃｌ_２Ｎ_３）とも呼ばれる。ゲル形成組成物中のクロニジンの濃度は、好ましくは０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０３～０．３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌである。ゲル形成組成物中の前記低濃度のクロニジンまたはその誘導体は、治療される組織において有効である。これらの低濃度のクロニジンは、ゲルがクロニジンが活性を維持し、損傷組織中にゆっくりと放出されるための理想的なマトリックスを形成するので、損傷組織において有効である。

好ましい実施形態において、前記細胞組成物は、１以上の抗生物質剤を含む。本発明の文脈において、抗生物質は、細菌および他の微生物の成長を阻害するか、またはそれらを破壊する能力を有する物質である。より好ましい実施形態において、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質、アミノグリコシド、アンサ型抗生物質、アントラキノン、抗生物質アゾール、抗生物質グリコペプチド、マクロライド、抗生物質ヌクレオシド、抗生物質ペプチド、抗生物質ポリエン、抗生物質ポリエーテル、キノロン、抗生物質ステロイド、スルホンアミド、テトラサイクリン、ジカルボン酸、抗生物質金属、酸化剤、フリーラジカルおよび／または活性酸素を放出する物質、カチオン性抗菌剤、第四級アンモニウム化合物、ビグアニド、トリグアニド、ビスビグアニド、ならびにそれらのアナログおよび重合体ならびに天然に存在する抗生物質化合物からなる教室から選択される。好ましくは、抗生物質はアミノグリコシド、好ましくはゲンタマイシンである。

別のまたはさらなる実施形態において、前記細胞組成物は、間葉幹細胞、骨前駆細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞および／または軟骨細胞を含む。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨形成または軟骨形成分化を受けることができる。他の細胞はすでに骨芽細胞系列または軟骨芽細胞系列に向かって運命づけられている。好ましくは、本発明の細胞組成物の細胞が動物細胞、好ましくは温血動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞であり得る。哺乳類細胞は、好ましくはウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネコ起点である。

限定するものではないが、該組成物は約０．０５×１０^６～５×１０^９細胞、好ましくは約０．５×１０^６～１×１０^９細胞、より好ましくは約４×１０^６～２５０×１０^６細胞の範囲の細胞量を含むことができる。

一実施形態では、前記細胞組成物が前記細胞の破壊を防止するために、血漿およびヒアルロン酸混合物の凍結乾燥後に添加される。

別のまたはさらなる好ましい実施形態では、前記有機小分子が骨伝導特性を有する足場またはマトリックス成分、好ましくはリン酸三カルシウム粒子（ＴＣＰ）である。

骨伝導性マトリックスはさらに、本発明の組成物中で、例えばクロニジンのような医薬化合物の徐放性を可能にし、骨修復を促進する。マトリックスは上述のように細胞の流入を可能にし、骨折部位の骨形成および修理を容易にする。リン酸三カルシウム粒子は、骨の内部成長のための足場またはマトリックスを提供するのに有効な鉱物材料である。好ましくは、ＴＣＰが約５～２００μｍ、より典型的には約１０～１００μｍ、望ましくは約２０～６０μｍの平均粒径を有する。ＴＣＰの粒径を測定する方法は当技術分野で知られており、沈降測定、分析遠心分離、および様々な種類の分光測定を含むことができる。一実施形態では、前記ＴＣＰ粒径がレーザー回折によって測定される。組成物中のＴＣＰの濃度は、好ましくは１０～２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは３０～１５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０～１００ｍｇ／ｍｌである。本発明の骨伝導性マトリックスは任意の形状をとることができ、可鍛性であり、凝集性であり、標的組織部位またはその近くに注射することができる。

本発明のゲル形成組成物は、タンパク質または（ポリ）ペプチドをさらに含み得る。本発明の組成物における投与に適した生物学的に活性なタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドには、成長ホルモン、増殖因子、ならびに他の生物学的に活性なその断片および誘導体が含まれる。好ましいタンパク質には、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネコ成長ホルモンが含まれ；天然、合成、組換えまたは生合成起源のものを包含することが意図される。さらに、生物学的に活性なタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドに関連する金属または金属化合物、ならびに酸塩、誘導体および錯体ならびに抗水和剤が、本発明の組成物への組込みに適している。

本組成物は、本明細書中で特に特定される医薬化合物に加えて、１以上の医薬賦形剤を含み得る。適切な賦形剤は剤形および前記化合物のアイデンティティに依存し、当業者によって選択され得る。医薬賦形剤は、血漿、ヒアルロン酸または医薬化合物の活性を妨害してはならない。

一実施形態では、組成物が全血または全血の分画成分をさらに含んでもよい。本組成物への全血または、好ましくは全血の前記分画成分の添加が再生特性を少なくとも部分的に改善することを可能にし得る。全血またはその分画成分を含む組成物は有利には再生医療において、特に骨、軟骨、腱または靭帯欠陥の修理を刺激するために、または損傷した骨、軟骨、腱または靭帯を置換するために有用な血小板由来増殖因子を含む。例えば、全血は、製剤を受ける対象に対して同種または自己であってもよい。

一実施形態では、組成物が血清を欠いているか、または実質的に欠いている。

別の実施形態では、組成物が骨形成特性、骨誘導特性、および／または骨伝導特性を有する１以上の物質をさらに含み得る。好ましい実施形態では、このような物質が線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、好ましくはＦＧＦ－２、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦＢ）、好ましくはＴＧＦＢ－１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６およびＢＭＰ７のいずれか１以上、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒｐ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含むか、またはこれらからなる群から選択され得る。したがって、特定の実施形態では、医薬活性タンパク質またはペプチドが増殖因子、好ましくはＦＧＦ、ＴＧＦＢ、ＰＤＧＦ、ＩＬ８、ＢＭＰ、ＰＴＨ、ＰＴＨｒｐ、およびＳＣＦからなる群より選択される増殖因子、より好ましくはＦＧＦ－２、ＴＧＦＢ－１、ＰＤＧＦ、ＩＬ－８、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＰＴＨ、ＰＴＨｒｐ、およびＳＣＦからなる群より選択される増殖因子であってもよい。

別の実施形態では、前記ゲル形成組成物が非経口投与のために、好ましくは骨内、骨周囲、関節内、関節周囲投与のために、または腱内、腱周囲、靭帯内、または靭帯周囲投与のために構成される。

本発明による組成物は、好ましくは非経口投与のために構成される。例えば、組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。非経口投与は、局所注射が起こり得、そして損傷部位が特異的に標的化され得、そして処置され得るという利点を有する。本発明の組成物による前記標的治療は安全かつ効率的であり、経口投与のための医薬品のような複雑な機能性測定を伴わない。損傷部位に応じて、適用経路の異なる位置が好ましい。当業者は、これらの適用経路に精通している。ゲル形成組成物は、注射によって、注射針およびシリンジを使用して投与されることが好ましい。

特定の実施形態では、組成物が骨内または骨周囲投与のために構成される。骨内投与または送達は一般に、処理が骨（小柱または皮質）内に直接的または間接的に送達される方法を指す。骨周囲投与または送達は一般に、処理が骨の周囲（特に骨折／損傷部位の周囲）に送達される方法を指す。別の特定の実施形態では、組成物が関節内または関節周囲投与のために構成される。関節内投与または送達は一般に、処理が関節の滑膜カプセルに直接的または間接的に送達される方法を指す。関節周囲投与または送達は一般に、処理が関節関節の滑膜カプセルおよび／または軟骨下骨の周囲に送達される方法を指す。さらなる実施形態において、組成物は、腱内または腱周囲投与のために構成される。別のさらなる実施形態では、組成物が靭帯内または靭帯周囲投与のために構成される。

本発明の第２の態様は、本発明の方法によって得られる組成物に関する。有利には、前記組成物が前記カルシウム源の添加後３０分以内にゼリー化する。

ゲル形成組成物は、３０分以内に液体物質からゼリー物質に変化する。このタイムフレームは、医師がゲル形成組成物を安全に取り扱い、損傷部位に投与するのに十分なタイムフレームである。好ましくは組成物がカルシウム源の添加後２５分以内にゼリー化し、より好ましくは組成物がカルシウム源の添加後２０分以内にゼリー化する。それによって、ゲル形成組成物は組成物が依然として液体であり、組成物がほぼゼリー状態で損傷部位に到達する間、開業医によって依然として取り扱うことができ、組成物に組み込まれた生物学的物質の標的送達および徐放性を可能にする。

したがって、本発明の一実施形態では、カルシウム源が最終組成物の投与の直前に血漿およびヒアルロン酸混合物に添加されるだけである。したがって、組成物の制御された送達を得ることができる。

一実施形態では本発明の組成物が筋骨格系疾患の治療に使用するためのものであり、好ましくは筋骨格系疾患は骨疾患または関節疾患である。

あるいは、またはそれに加えて、前記筋骨格疾患は腱および／または靭帯に影響を及ぼし得る。また、筋骨格疾患、好ましくは骨疾患または関節疾患の治療のための薬剤の製造のための、上記のゲル形成組成物の使用が意図される。あるいは、またはそれに加えて、前記筋骨格疾患は腱および／または靭帯に影響を及ぼし得る。さらに、筋骨格疾患、好ましくは骨疾患または関節疾患（あるいは、またはそれに加えて、前記疾患は腱および／または靭帯に影響を及ぼし得る）を、そのような治療を必要とする被験体において治療するための方法であって、前記被験体に、上記のようなゲル形成組成物の治療的または予防的有効量を投与することを含む方法が意図される。

一実施形態では、本発明が変形性関節症の治療に使用するための組成物またはキットに関する。変形性関節症は、軟骨の劣化によって関節の炎症が徐々に劣化する病気である。健康な関節では、軟骨が関節がその全運動範囲にわたって滑らかに動くことを可能にするクッションとして作用する。変形性関節症の場合、この軟骨クッションは、年齢、損傷、反復ストレス、疾患または遺伝的素因などの因子のために壊れ始める。この保護クッションが失われると、疼痛、炎症、運動範囲の減少、骨棘の発生が起こる。診断は典型的には徴候および症状に基づいて行い、他の問題を支持または除外するために医用画像検査および他の検査を用いる。

一実施形態では、本発明が頭蓋十字靭帯（ＣＣＬ）破裂の予防に使用するための組成物またはキットに関する。頭十字靭帯は膝関節の内側にある最も重要な安定剤の１つで、後脚の中央の関節である。頭十字靭帯の破断は、後肢跛行、疼痛、およびその後の膝関節炎の最も一般的な理由の１つ。ＣＣＬ破断に関連する臨床徴候は様々であるが、この条件は常に後肢機能不全および疼痛を引き起こす。外傷はＣＣＬ破裂の少数をアカウントが靭帯の進行性変性は、遺伝的、立体構造的、環境的、免疫介在性、および炎症性に大別される可能性のある様々な因子に起因している。ＣＣＬの完全断裂の診断は、歩行観察、身体診察所見、およびＸ線撮影（Ｘ線）の組合せを用いて容易に達成される。対照的に、ＣＣＬ部分断裂は診断がより困難な場合がある。動物などの被験体における頭蓋十字靭帯の部分的断裂を治療および／または予防するための現在の組成物またはキットの使用は靭帯変性の徴候を有意に減少させ、完成頭蓋十字靭帯断裂を予防し、片側ＣＣＬ断裂を有する被験体における対側疾患の発生率を減少させるのに役立つ。

一実施形態では、本発明が棘上腱電流およびアキレス腱断裂などの腱電流の治療に使用するための組成物またはキットに関する。腱障害は腱の障害の一種で、疼痛、腫れ、機能障害を引き起こす。棘上筋腱症は棘上筋の腱およびその周囲の断裂、石灰沈着性腱症、腱症および／または損傷を記述するために使用される用語であり、前肢跛行の原因である。きょく上筋は肩関節の重要な受動的安定化剤であり、肩の伸展と四肢の前進を担っている。棘上筋の腱が損傷すると炎症が起こる。腱線維の断裂およびその結果生じる炎症は腱の石灰化および石灰化を引き起こすことがあり、これらは疼痛および跛行の原因となる。アキレス腱の主な機能は後肢前進であり、ホックの受動的支持に寄与する。アキレス腱損傷の病因は通常外傷性である。外傷によって、病変の重症度はかなり異なり、伸展、小さなまたは部分的な裂傷、または完全な破裂を引き起こすことがある。

したがって、関連する態様は、賦形剤として、好ましくは非経口投与、より好ましくは骨内、骨周囲、関節内、または関節周囲投与、または腱内、腱周囲、靭帯内、または靭帯周囲投与のために構成された医薬製剤中の賦形剤として使用するための、哺乳類由来血漿およびヒアルロン酸またはその誘導体を含むゲル形成組成物を提供する。

ゲル形成組成物は、患者の生理病理学的条件および医師によって確立されたプロトコルに従って、単一の治療有効用量として投与され得るか、または非経口投与のための組成物の複数の治療有効用量として投与され得る。

一実施形態では、本発明による組成物が単一または複数の治療有効用量で関節内または局所的に投与される。用量は、標的関節および対象の体重に適合される。

特に腱障害の場合、本発明による組成物は、単回または複数回の治療有効用量で投与される関節周囲、腱周囲または腱内である。用量は、対象の標的部位および体重に適合される。

また、筋骨格疾患、好ましくは骨疾患または関節疾患、より好ましくは変形性関節症、ＣＬＬ破裂または棘上腱処理およびアキレス腱破裂などの腱処理の防止のための医薬の製造のための、上記の組成物の使用が意図される。

本発明は、本発明をさらに説明する以下の非限定的な実施例によってさらに説明され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでもない。

以下の実施例を参照して、本発明をさらに例示する。本発明は、決して与えられた実施例に限定されるものではない。

（実施例１：ゲル形成組成物の調製プロトコル）
ゲル形成組成物は、異なる製品バッチで調製される。最適な特性を有するゲル形成組成物を調製することに加えて、各製品バッチは、同様の最適な特性を示すべきである。

アフェレーシスによって調製した凍結イヌ血漿を３７℃で６０分間、好ましくは４０分間、より好ましくは３０分間解凍する。前記イヌ血漿を、０．４μｍ～５μｍ、より好ましくは０．６μｍ～１．２μｍの範囲内のフィルターサイズを有するフィルターを通して濾過し、次いで滅菌濾過する。濾過したイヌ血漿とヒアルロン酸を混合して混合物を構成する。前記混合物は生成物粘度を低下させ、さらなる製造工程を容易にするために、水溶液中で４回、好ましくは３回、より好ましくは２回可溶化される。続いて、前記混合物を、７２～１２０時間続くプロセスの間に凍結乾燥する。プロセスの持続時間は、より通気された凍結乾燥生成物が提供されるように最適化され、これは後に容易に再構成することができる。次の工程では、塩化カルシウム粉末を塩化水素溶液に溶解し、溶解した塩化カルシウムを滅菌濾過する。ここで、塩化水素溶液は、塩化カルシウム粉末の希釈剤として作用する。

（実施例２：使用前にゲル形成組成物を処方する。）
凍結乾燥したイヌ血漿およびヒアルロン酸凍結乾燥生成物を含むバイアルを、滅菌した塩化カルシウム溶液で再構成する。再懸濁の時間はわずか５分間である。他のゲル形成組成物は、再懸濁時間、すなわち２時間より長い時間を有する。前記凍結乾燥混合物は、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のクロニジンを含むことができる。この組成物は、一旦再懸濁されると、非経口的に投与され得る。

（実施例３：ゲル形成組成物の比較例）
ゲル形成組成物は、好ましくは９９％の非Ｓ／Ｄ処理血漿、５～２４ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸ナトリウム、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌのクロニジン、０．６～１ｍｇ／ｍｌの塩化カルシウムおよび０．４～０．６５ｍｇ／ｍｌのＨＣｌを含む。

塩化カルシウムの濃度を０．１０ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌに変化させると、組成物の迅速なゼリー化もたらされる。その結果、医師は、損傷部位に組成物を適切に投与することができない。一方、０．０５ｍｇ／ｍｌ塩化カルシウムの濃度は、組成物が液体のままであるという点で、不十分なゼリー化のない組成物を示す。

ヒアルロン酸またはその誘導体の濃度も、ゲル形成組成物のゼリー化に影響を及ぼし、これは、低濃度のヒアルロン酸ナトリウム（０．０５ｍｇ／ｍｌ）および高濃度のヒアルロン酸ナトリウム（２５０ｍｇ／ｍｌ）を有する組成物によって示される。塩化カルシウムについても同様の結果が見られた。

また、血漿は、組成物のゼリー化に影響を及ぼす。実際、未処理血漿中の脂質および／またはリン脂質の存在は、凝固カスケードを誘発することによってゼリー化プロセスを促進する。溶媒－界面活性剤血漿が使用される場合、血漿脂質および／またはリン脂質の欠如のために、不十分なゼリー化が起こる。

前記血漿、ヒアルロン酸または誘導体および塩化カルシウムの濃度および特性はゲル形成組成物のゼリー化に影響を及ぼし、したがって、好ましくは、開示された本発明の範囲内に入るべきである。

Claims (18)

1. 非経口投与用ゲル形成組成物の調製方法であって、前記方法は、哺乳類由来血漿とヒアルロン酸またはその塩もしくはエステルとの混合物とカルシウムの源とを混合する工程を含み、前記カルシウム源は、カルシウム濃度が０．２～１．４ｍｇ／ｍｌとなるように前記混合物に添加されることを特徴とする、方法。
2. 前記カルシウム源が、塩化カルシウム溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記塩化カルシウム溶液が、酸性ｐＨを有することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記血漿およびヒアルロン酸混合物が、前記カルシウム源の添加前に凍結乾燥されることを特徴とする、先行する請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記血漿が、脂質および／またはリン脂質を含み、前記脂質および／またはリン脂質が、０．２～７ｍｇ／ｌの総濃度で存在することを特徴とする、先行する請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記脂質が、少量の血漿脂質を含み、前記少量の血漿脂質が、好ましくはパルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）、ステアロイルエタノールアミド（ＳＥＡ）、アラキドノイルエタノールアミド（ＡＥＡ）の群から選択され、少量の血漿脂質の総濃度が５～５０ｎｍｏｌ／ｌであることを特徴とする、先行する請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記血漿が、２００ミル／ｌ未満の白血球（ＷＢＣ）濃度、好ましくは３～１４５ミル／ｌ、より好ましくは５～８５ミル／ｌのＷＢＣ濃度を有することを特徴とする、先行する請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記血漿が、５０，０００ミル／ｌ未満の血小板（ＢＰ）の濃度、好ましくは１，０００～３５，０００ミル／ｌのＢＰの濃度、より好ましくは２，０００～２０，０００ミル／ｌのＢＰの濃度を有することを特徴とする、先行する請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. ヒアルロン酸またはその誘導体が、１，８００ｋＤａ未満、より好ましくは７００～１，６００ｋＤａ、より好ましくは７００～１，０００ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、先行する請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記血漿およびヒアルロン酸混合物が、活性医薬成分、抗生物質、細胞組成物、有機小分子、タンパク質、およびペプチドの群から選択される１以上の医薬化合物をさらに含むことを特徴とする、先行する請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記活性医薬成分が、α－２アドレナリン受容体アゴニスト、好ましくはクロニジンまたはその誘導体、好ましくはクロニジンであることを特徴とする、先行する請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記有機小分子が、骨伝導特性を有する足場またはマトリックス成分、好ましくはリン酸三カルシウム粒子（ＴＣＰ）であることを特徴とする、先行する請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記ゲル形成配合が、非経口投与のために、好ましくは骨内、骨周囲、関節内、関節周囲投与のために、または腱内、腱周囲、靭帯内、もしくは靭帯周囲投与のために構成されることを特徴とする、先行する請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
14. 先行する請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法によって得られる組成物。
15. 対象における筋骨格系疾患の治療に使用するための、請求項１４に記載の組成物であって、前記筋骨格系疾患が、好ましくは骨疾患または関節疾患である、組成物。
16. 変形性関節症の治療に使用するための、請求項１５に記載の組成物。
17. 頭蓋十字靭帯破裂の治療または予防に使用するための、請求項１５に記載の組成物。
18. 腱障害の治療に使用するための、請求項１５に記載の組成物。