CN114080220A - 制备凝胶形成组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备用于肠胃外施用的凝胶形成组合物的方法，所述方法包括将哺乳动物来源的血浆和透明质酸或其盐或酯的混合物与钙源混合的步骤，并且其中将所述钙源加入所述混合物中，使得钙浓度为0.2‑1.4mg/ml。本发明还涉及通过该方法获得的组合物。

Description

制备凝胶形成组合物的方法

技术领域

本发明涉及用于肠胃外施用的凝胶形成组合物的制备方法。本发明涉及医学和兽医科学技术领域。

背景技术

肌肉骨骼疾病或病症可影响骨、肌肉、关节、软骨、腱、韧带以及将组织和器官支持和结合在一起的其它结缔组织。这些疾病可随时间发展或可由于例如过度使用肌肉骨骼系统或创伤引起。由于肌肉骨骼系统与其它内部系统的紧密关系，肌肉骨骼疾病难以诊断和/或治疗。

其它和/或改进的药物制剂被配置用于局部施用以治疗肌肉骨骼系统。所关注的特定制剂在施用后显示或达到凝胶稠度。这些制剂通常包括药物活性成分和/或治疗细胞。

EP 2900247公开了包含溶剂/去污剂处理的血浆(S/D血浆)和透明质酸的药物制剂。

EP 2185163公开了一种治疗关节的方法，所述方法包括在关节中浸润化合物，其中所述化合物包括至少一种血液来源的物质。

WO2013076160公开了包含糖胺聚糖、缓释剂和一种或多种药物活性成分的凝胶形成制剂。

US 2012171169描述了用于预防骨和软骨疾病的药物组合物。该组合物包含脂肪来源的干细胞、PRP、HA和氯化钙。

WO2014/035721涉及在伤口愈合和其它应用中用作水凝胶的改性血浆。

WO2009/016451涉及治疗关节病或疼痛的方法，其基于利用血液来源的物质如PRP和富含生长因子的血浆的关节浸润。可以将HA加入组合物中。

尽管现有技术的凝胶形成组合物具有改进的性质，设计用于治疗肌肉骨骼系统，但凝胶形成组合物的胶凝性能是可变的。这些性质通常受组合物制备中的不同处理程序的影响。由于预期的施用方式，具有可控胶凝性质的可再现的凝胶形成组合物应是可掌控的。

因此，本领域仍然需要制备凝胶形成组合物的方法和胶凝受控的改进的凝胶形成组合物。本发明旨在解决上述问题和缺点。

发明内容

本发明及其实施方式用于提供针对上述缺点中的一个或多个的解决方案。为此，本发明涉及如权利要求1所述的制备用于肠胃外施用的凝胶形成组合物的方法。

本发明公开的方法能够制备凝胶形成组合物，允许组合物逐渐和受控地胶凝。

该方法的优选实施方式在权利要求2至13的任一项中示出。

在第二方面，本发明涉及如权利要求14所述的组合物。更具体地，本文所述的组合物提供了最佳的胶凝过程，使得所述组合物可以安全地处理和施用，并且所述组合物在损伤部位胶凝，建立细胞支持环境并持续释放包含在组合物内的药物活性成分。

在第三方面，本发明涉及如权利要求15所述用途的组合物。该用途的优选实施方式在权利要求16至18中示出。

定义

除非另外定义，否则在公开本发明中使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。

如本文所用，以下术语具有以下含义：

如本文所用的“一个”，“一种”和“该”是指单数和复数指示物，除非背景另有明确说明。举例来说，“一个隔室”是指一个或多于一个隔室。

本文所用的“约”针对可测量的值，例如参数、量、持续时间等，其意指涵盖指定值的+/-20％以下，优选+/-10％以下，更优选+/-5％以下，甚至更优选+/-1％以下，并且还更优选+/-0.1％以下的变化，在此范围内，这些变化适合于在本公开的发明中进行。然而，应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体公开。

本文所用的“包括”与“包含”或“含有”是同义的，并且是包含性或开放式术语，其表明了后面的内容(例如组分)的存在，并且不排除或排除本领域已知的或其中公开的其它未列举的组分、特征、要素、成员、步骤的存在。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的要素，而不一定用于描述顺序或时间次序，除非特别说明。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且在此描述的本发明的实施方式能够以不同于在此描述或示出的其它顺序操作。

由端点表述的数值范围包括该范围内包含的所有数值和分数，以及所表述的端点。

除非另外定义，否则此处和整个说明书中的表述“重量％”是指基于制剂总重量的相应组分的相对重量。

而术语“一个或多个”，例如一组成员中的一个或多个成员本身是清楚的，通过进一步的示例，该术语尤其包括对所述成员中的任何一个的引用，或对所述成员中的任何两个以上的引用，例如所述成员中的任何≥3，≥4，≥5，≥6或≥7等，乃至所有所述成员。

术语“制剂”、“组合物”或“制备物”在本文中可以互换使用。

术语“血浆”应理解为获自全血样品的级分，提供或接触抗凝剂，例如CPDA-1(包含柠檬酸盐、磷酸盐、葡萄糖和/或腺苷)、肝素、柠檬酸盐、草酸盐或EDTA。通过适当的技术(例如离心或单采血液成分术(apheresis))将血样的细胞成分(即白细胞和红细胞)与液体成分(即血浆)分离。然后，可任选地对血浆进行溶剂/去污剂处理，例如用以消除病毒。溶剂/去污剂处理能够消除细胞和/或细胞碎片，例如脂质膜、脂质和/或磷脂。这通常称为溶剂/去污剂处理的血浆(S/D血浆)。未进行溶剂/去污剂处理的血浆可标记为未处理的血浆或天然血浆。在本发明的一个实施方式中，不处理血浆并且不希望受理论束缚，所述血浆被理解为包含细胞、脂质和/或磷脂。因此，所述血浆具有与天然血浆相似或相同的组成特性。本发明的“血浆”优选是哺乳动物来源的。

术语“新鲜冷冻血浆”应理解为在如血浆定义中所提及的其制备之后在-18℃或低于-18℃下于12小时内冷冻的血浆。

术语“单采血液成分的血浆(apheresed plasma)”应理解为通过血浆置换(plasmapheresis)获得的血浆，血浆置换是一种医学技术，其中血液通过将血浆与所有血液分离的装置(即，单采血液成分术)而从供体收集，通过将剩余流体直接返回至供体。经历了单采血液成分的血浆与抗凝剂如CPDA1、ACD、肝素、柠檬酸盐、草酸盐或EDTA接触。

术语“离心的血浆”应理解为通过将与抗凝剂接触的所有血液离心以使血浆与所有血液分离而获得的血浆。进行离心的血浆可与抗凝剂如CPDA1、ACD、肝素、柠檬酸盐、草酸盐或EDTA接触。

在本说明书的全部内容中，术语“凝胶形成剂”包括能够形成固体、胶状物质(凝胶)的试剂。特别地，当与有助于凝胶形成的材料和/或条件组合或暴露于有助于凝胶形成的材料和/或条件时(例如但不限于，当溶解或分散于合适的液相如水溶液中时)，凝胶形成剂形成凝胶。

术语“透明质酸”与“透明质酸盐”可互换使用。术语“透明质酸”是指由通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺组成的二糖的阴离子型非硫酸化聚合物。透明质酸衍生物包括但不限于透明质酸盐如透明质酸钠，或透明质酸与脂族、杂环或脂环族醇的酯，或透明质酸的硫酸化形式或含有透明质酸的试剂的组合。

术语“受试者”或“患者”可互换使用，并且是指动物，优选温血动物，更优选脊椎动物，甚至更优选哺乳动物。优选的患者是马、牛、猪、绵羊、犬、猫受试者。

术语“需要治疗的受试者”包括将受益于给定病症，特别是肌肉骨骼疾病如骨病或关节病的治疗的受试者。可选地或额外地，所述疾病可影响肌腱和/或韧带。此类受试者可包括但不限于已被诊断患有所述病症的受试者、易于发展所述病症的受试者和/或待预防所述病症的受试者。

术语“治疗”包括已经发展的疾病或病症的治疗性治疗，以及预防性或防止性措施，其中目的是防止或减少不希望的痛苦发生的机会，例如防止疾病或病症进展的机会。有益的或期望的临床结果可包括但不限于一种或多种症状或一种或多种生物标志物的减轻、疾病程度的减轻、疾病的稳定状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改进或减轻等。术语“治疗”还可以指与未接受治疗的预期存活相比延长的存活。

本文所用的术语“持续释放”泛指与从参考组合物(如现有技术中已知的组合物)中释放该化合物相比，该化合物从组合物中释放的时间延长、拉长或增加。如本文所用，持续释放是指组合物的一种或多种化合物，即哺乳动物血浆或一种或多种另外的活性药物成分的延长释放。例如，从现有技术中已知高分子量透明质酸在膝关节中的半衰期为约10至15小时。因此，如本文所用，持续释放是指透明质酸从本发明组合物的释放延长，例如在一天或多天内释放，例如在2天、3天、4天、5天、6天内释放，或在一周或多周内释放，例如在1.5周、2周、3周内释放，或在一个月或多个月内释放。因此，这些术语还可以具体包括延长释放、延迟释放或受控释放。

术语“药物化合物”泛指当以有效量提供时实现期望的治疗和/或预防结果的化合物、物质或组分。通常，活性药物成分可以通过与活细胞或生物体相互作用和/或调节活细胞或生物体来实现这样的效果。术语“药物化合物”还包括标题化合物或物质的任何药理学活性盐、酯，N-氧化物或前药。

本文所用的术语“局部施用”是指在体内靶位点内或附近的肠胃外施用。

本说明书中引用的所有参考文献通过引用以其整体并入本文。特别地，本文具体提及的所有参考文献的教导通过引用并入。

除非另外定义，否则在公开本发明中使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括说明书中使用的术语的定义以更好地理解本发明的教导。本文所用的术语或定义仅用于帮助理解本发明。

在整个说明书中对“一个实施方式”或“一种实施方式”的提及意味着结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，在本说明书中各处出现的短语“在一个实施方式中”或“在一种实施方式中”不一定都指同一实施方式，而是可以指同一实施方式。此外，在一个或多个实施方式中，具体特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合，这对于本领域技术人员根据本公开内容将是显而易见的。此外，如本领域技术人员将理解的，虽然在此描述的一些实施方式包括一些特征但不包括在其它实施方式中的其它特征，但是不同实施方式的特征的组合意味着在本发明的范围内，并且形成不同的实施方式。例如，在随附的权利要求中，所要求保护的任意实施方式可以以任何组合使用。

具体实施方式

本发明涉及凝胶形成组合物的制备方法。凝胶形成组合物的制备总体而言是精细的方法，其中组合物中每种化合物的质量、数量和活性是关键的。本发明的方法是有利的，因为凝胶形成组合物的胶凝是受控的，以稳定的方式发生，并且允许肠胃外施用。

在第一方面，提供了一种制备用于肠胃外施用的凝胶形成组合物的方法，所述方法包括将哺乳动物来源的血浆和透明质酸或其盐或酯的混合物与钙源混合的步骤，其中将所述钙源加入所述混合物中，使得钙浓度为0.2-1.4mg/ml。

在一个实施方式中，哺乳动物来源的血浆和透明质酸或其盐或酯的混合物是预制的混合物。在另一个实施方式中，哺乳动物来源的血浆和透明质酸或其盐或酯的混合物可以在混合所述钙源的步骤之前混合。向所述混合物中加入钙源。发现步骤的顺序有助于所述凝胶形成组合物的均匀和稳定的胶凝。考虑到所述组合物具有肠胃外施用的目的，逐渐和受控的胶凝是绝对必要的。此外，所述钙源在凝胶形成组合物中的总浓度应当为0.2-1.4mg/ml，以获得所需的效果。

在凝胶形成组合物的一个实施方式中，所述组合物包含约50至99重量％的血浆，更优选约60至99重量％，更优选约70至99重量％，更优选约80至99重量％，更优选约90至99重量％，更优选约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99重量％的血浆。

在一个实施方式中，组合物的主要组分是哺乳动物来源的血浆。

在本发明的优选实施方式中，所述血浆来源于哺乳动物，更优选来源于马、牛、猪、绵羊、犬或猫血液。

优选地，血浆可以是哺乳动物血浆，使得包含哺乳动物血浆的凝胶形成组合物特别适于施用于哺乳动物受试者。优选地，血浆是同种异体的。同种异体血浆的收集过程在抗凝剂的使用、分离和处理技术、离心力以及温度和时间方面是成熟且高度标准化的，导致高度可预测量的细胞和固体组分。优选地，血浆是同种异体的马、牛、猪、绵羊、犬或猫血浆。

在一个实施方式中，血浆可以包括离心的或单采血液成分的血浆。哺乳动物血浆可以是新鲜冷冻血浆。优选地，本发明的哺乳动物血浆是单采血液成分的新鲜冷冻血浆。

在一个实施方式中，所述血浆是非溶剂/去污剂处理的血浆。

哺乳动物来源的血浆包括从来自哺乳动物来源如马、牛、猪、绵羊、犬或猫的单个或多个供体收集的血浆，其在塑料袋或玻璃瓶中，并通过上述方法与血细胞分离。收集后，将哺乳动物来源的血浆储存在-18℃或低于-18℃，优选低于-18℃。

血浆包含脂质和/或磷脂，其可包括但不限于一种或多种鞘脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯、二酰基甘油酯、卵磷脂、脂质体、微量血浆脂质及其组合。血浆脂质和/或磷脂促进与触发凝血级联的凝血因子形成复合物。

虽然脂质和/或磷脂可以外部添加到组合物中，但在一个实施方式中，所述血浆将是脂质和/或磷脂的来源。

各种分析方法可用于测定血浆脂质和/或磷脂浓度和特征。色谱法是用于分离和分析脂质的分析方法。薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)和高压液相色谱(HPLC)常用于评估血浆脂质和/或磷脂。另外，光谱测定法是评估血浆中的血浆脂质和/或磷脂的已知技术，如质谱测定法或核磁共振(NMR)光谱法。酶联免疫吸附测定(ELISA)也是评估血浆中的血浆脂质和/或磷脂的技术。

血浆脂质和/或磷脂优选通过使用HPLC技术量化。对本发明的血浆中的血浆脂质的量设定限制，使得血浆的质量可再现。

在一个实施方式中，所述血浆包含脂质和/或磷脂。优选地，血浆包含脂质和/或磷脂，其中所述脂质和/或磷脂的总浓度为0.2-7mg/ml。更优选地，血浆中脂质和/或磷脂的总浓度为0.4-6mg/ml，更优选0.5-5mg/ml。不希望受理论束缚，所述脂质和/或磷脂被理解为在血浆中具有促凝血活性，并且至少部分允许凝胶形成组合物的改进的胶凝。

在另一个实施方式中，所述血浆包含微量血浆脂质。不希望受理论束缚，所述微量血浆脂质被理解为在血浆中具有促凝血活性，并且至少部分允许凝胶形成组合物的改进的胶凝。

在本发明的优选实施方式中，所述微量血浆脂质优选选自由棕榈酰乙醇酰胺(PEA)、硬脂酰乙醇酰胺(SEA)、花生四烯酰乙醇酰胺(AEA)组成的组。

在一个实施方式中，哺乳动物血浆中微量血浆脂质的总浓度为5-50nmol/l，更优选6-30nmol/l。

在本发明更优选的实施方式中，所述组合物包含PEA、SEA和AEA，其中每种脂质以0.2-14nmol/l的浓度存在。在另一个实施方式中，每种微量血浆脂质以0.5-12nmol/l，更优选0.8-8.5nmol/l的浓度存在。

血浆的胶凝活性可以通过评估凝固参数，优选PTT和aPTT，和/或凝固因子，优选因子VIII和纤维蛋白原来测量。

在一个实施方式中，所用血浆具有高于75％的抗血友病因子(因子VIII)活性。量化因子VIII活性的测定法是本领域已知的，可包括基于凝块的测定法、显色测定法或免疫测定法如ELISA。在一个实施方式中，所述抗血友病因子(因子VIII)活性通过使用基于粘度的检测系统的凝块检测方法来测量，所述系统例如为

半自动台式分析仪或自动STAR

2，皆来自Stago(Cupaiolo R,Govaerts D,Blauwaert M,Cauchie P.新型

自动止血分析仪的性能评价：The STAR

2.Int J Lab Hematol.2019；41(6):731-737.doi:10.1111/ijlh.13100)。简言之，所述方法使用被测试的血浆粘度的增加用于凝块检测。通过监测特别设计的试管中振荡钢球的振幅来测量粘度的变化。钢球的运动由两个激励线圈调节，交替工作以引起和保持自然振动。当加入起始试剂时，检测和计时器立即同时开始。当球左右摆动时，测量运动的振幅。计时器将样品的凝血计时。在整个凝血过程中监测振幅。当不存在凝块时，振幅保持恒定。当凝块形成时，粘度增加且振幅降低。使用算法确定凝血时间。

在一个实施方式中，所用的血浆具有0.25-3g/l的纤维蛋白原(因子I)浓度。在一个实施方式中，所用的血浆具有12-65秒的活化部分凝血活酶时间(aPTT)活性和/或5-17秒的部分凝血活酶时间(PTT)活性。测量(a)PTT的适宜方法是通过使用基于粘度的检测系统(例如如上所述的Stago的

半自动台式分析仪)的凝块检测方法。在另一个优选实施方式中，所述血浆符合所有上述特征。量化因子VIII、纤维蛋白原浓度、aPTT活性和PTT活性的测定法是本领域技术人员已知的。

纤维蛋白原作为可溶性血浆糖蛋白在血浆中循环。纤维蛋白原参与纤维蛋白的形成，并通过形成桥和通过结合激活血小板来促进血液凝固。

优选地，本发明的哺乳动物血浆中纤维蛋白原的总浓度为0.25-3g/l，更优选0.3-2.5g/l，更优选0.4-2.1g/l。现有技术文献优选去纤维蛋白血浆，然而本发明需要具有0.25g/l的最小纤维蛋白原浓度的哺乳动物血浆。

本发明的哺乳动物血浆的总蛋白浓度优选为10-100g/l，优选15-85g/l，更优选20-80g/l。不希望受理论束缚，据信当施用于受试者时，高于该浓度的蛋白质水平可导致阻塞的问题。

在更优选的实施方式中，所述血浆的白细胞(WBC)浓度小于200mil/l，WBC浓度优选3-145mil/l，更优选5-85mil/l，理想地为10-50mil/l。

哺乳动物来源的血浆包含不干扰组合物胶凝的量的白细胞，也称为白血球。

在特别优选的实施方式中，所述血浆的血小板浓度(BP)小于50,000mil/l，BP浓度优选1,000-35,000mil/l，BP浓度更优选2,000-20,000mil/l。

血小板，也称为凝血细胞，有助于血液凝固过程。此外，血小板含有数百种被称为生长因子的蛋白质。这些血小板来源的生长因子可用于再生医学，特别是用于刺激骨、软骨、腱或韧带缺损的修复或用于替代受损的骨、软骨、腱或韧带。血小板浓度低于全血。尽管现有技术中的其它文献优选使用富含血小板的血浆来增强伤口愈合，但是血小板的浓度特别低。

在一个实施方式中，所述组合物包含一种或多种糖胺聚糖。在某些实施方式中，糖胺聚糖可选自由以下组成的组：透明质酸及其衍生物，蛋白聚糖及其衍生物，硫酸软骨素，硫酸角质素，壳聚糖及其衍生物，壳多糖及其衍生物；或前述物质的混合物。

在一个优选的实施方式中，所述糖胺聚糖是透明质酸或其衍生物。透明质酸在生物体中起重要作用，首先作为许多组织如皮肤、腱、肌肉和软骨的细胞的机械支持物，因此其是细胞外基质的主要成分。但透明质酸在生物过程中也发挥其它功能，如组织的水合作用、可移动部分的润滑作用、细胞迁移、细胞功能和分化。

在本发明的组合物中，透明质酸的存在将有助于生物过程，例如组织水合、蛋白聚糖组织、细胞分化、细胞增殖和血管生成。透明质酸衍生物保持所述糖胺聚糖的所有性质，其优点是能够以各种形式加工并且具有根据衍生的类型和百分比而变化的溶解度和降解时间。透明质酸的衍生物可以是透明质酸的盐，透明质酸与脂族、杂环或脂环族醇系列的酯，或透明质酸的硫酸化形式。非限制性地，合适的衍生物可以是透明质酸盐，例如优选透明质酸钠。

在本发明的优选实施方式中，所述透明质酸或其衍生物的分子量小于1,800kDa，更优选为700-1,600kDa，最优选为700-1,000kDa。

优选地，透明质酸或其衍生物具有高分子量。透明质酸或衍生物的高分子量应理解为700-1,000kDa的分子量。例如，注射高分子量的透明质酸对于恢复受骨关节炎影响的关节的机械完整性是有效的。特别优选地，透明质酸或其衍生物具有窄尺寸分布。观察到实施方式中公开的分子量范围确保对透明质酸受体的合适亲和力和对透明质酸生物合成的更好刺激。理想地，透明质酸或其衍生物具有高分子量和窄尺寸分布。此外，分子量为700-1,000kDa的透明质酸或其衍生物在植入或注射到需要治疗的组织中时提高周围细胞的细胞活力。此外，发现700-1,000kDa的透明质酸能够实现制备的产品批料的质量和再现性。

高分子量透明质酸或其衍生物表现出比具有低分子量的透明质酸或其衍生物更大的粘弹性。与本发明的血浆混合的本发明实施方式的具有高分子量的透明质酸或其衍生物由于血浆的相当天然的组成而呈现甚至更大的粘弹性。这些大的粘弹性质具有显著的意义，特别是考虑到必须吸收主要的压力变化，例如在体内(如在关节中)发生的压力变化。

优选地，透明质酸或其衍生物是无支链的直链透明质酸。

透明质酸天然存在并且不具有物种或器官特异性，即使当植入或注射到活体中时。透明质酸显示出优异的生物相容性。因此，透明质酸可以是动物来源的或生物发酵来源的。本领域熟知的透明质酸来源是公鸡鸡冠。优选地，透明质酸是生物发酵来源的。

非限制性地，凝胶形成组合物可以包含浓度为约0.10-200mg/ml，优选约1-100mg/ml，更优选约2-50mg/ml，更优选约4-20mg/ml的透明质酸或其衍生物。

在一个实施方式中，透明质酸或其衍生物优选是灭菌的。透明质酸可以是蒸汽灭菌的或过滤灭菌的。优选地，透明质酸是过滤灭菌的，因为蒸汽灭菌可能影响透明质酸纤维的分子量分布范围。透明质酸优选被溶解并通过过滤灭菌。

优选地，哺乳动物血浆通过无菌过滤器。

哺乳动物血浆和透明质酸的过滤灭菌对凝胶形成组合物的制备的质量和再现性具有有益的影响。

制备至少根据如上所述实施方式之一的血浆和透明质酸的混合物。将哺乳动物来源的血浆和透明质酸或其衍生物混合，得到血浆和透明质酸混合物。

在一个实施方式中，所述混合物是冷冻干燥的。因此，获得冻干的产物。冷冻干燥在本领域中也可以称为冻干。以下术语“冻干的产物”和“冷冻干燥的混合物”在本文中可互换使用。

在优选的实施方式中，在冷冻干燥之前稀释血浆和透明质酸的混合物。优选地，将所述混合物在水溶液中溶解至少4次，优选至少3次，更优选至少2次，理想地2次，从而降低产物粘度并利于其它制造步骤。

在另一个实施方式中，在加入所述钙源之前将所述血浆和透明质酸混合物冷冻干燥。

所述混合物的冷冻干燥增加了保质期。所述混合物的冷冻干燥提供了冻干和稳定数月的产品。冻干产品可以容易地储存、运输和重构用于注射。冻干产物在15℃-25℃的温度下是稳定的。在室温下具有稳定性的冻干产品对医疗从业者是有益的。产品可以容易地运输或处理，而基本上不降低产品质量。不需要特殊的冷却容器。

在优选的实施方式中，在冻干血浆和透明质酸混合物后加入钙源。钙源优选在血浆和透明质酸混合物冷冻干燥后以及可能在向混合物补充一种或多种药物化合物后加入。

随后，一旦制备血浆和透明质酸的混合物并冻干以获得所述冻干产物，则加入钙源，使得凝胶形成组合物中的最终钙浓度为0.2-1.4mg/ml。优选地，所述组合物中所述钙源的总浓度为0.4-1.2mg/ml，更优选为0.6-1.0mg/ml，更优选为0.65-0.95mg/ml，更优选为0.7-0.9mg/ml，更优选为0.75-0.85mg/ml。

本发明的钙源使得凝胶形成组合物的胶凝成为可能。所述钙源可以选自适量的药学上可接受的钙盐，优选可溶性钙盐。此类Ca²⁺盐可以与无机酸或有机酸形成。此类盐的实例包括氯化钙(CaCl₂)、甘油磷酸钙、磷酸钙、碳酸氢钙、硫酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、抗坏血酸钙及其混合物。特别优选的是氯化钙，其有利地显示出良好的溶解度并且在可注射溶液中是良好耐受的。

在优选的实施方式中，钙源是钙溶液。优选地，通过将钙源，优选氯化钙加入酸性溶液(例如氯化氢溶液)中来制备钙溶液。优选地，组合物中酸性溶液的最终pH为1-4，更优选1.5-2.5。

所述酸性溶液优选为药学上可接受的酸。药学上可接受的酸可以包括但不限于(i)无机酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸等)，(ii)有机一元、二元或三元羧酸(例如甲酸、乙酸、己二酸、藻酸、柠檬酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、丁酸、樟脑酸、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、谷氨酸、庚酸、己酸、富马酸、乳酸、乳糖酸、丙二酸、马来酸、烟酸、草酸、双羟萘酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、十一烷酸等)，或(iii)磺酸(例如苯磺酸、硫酸氢钠、硫酸、樟脑磺酸、十二烷基磺酸、乙磺酸、甲磺酸、羟乙磺酸、萘磺酸、对甲苯磺酸等)。

在本发明的一个实施方式中，所述钙源是氯化钙溶液。在本发明特别优选的实施方式中，所述氯化钙溶液的酸性pH优选为1-4。所述氯化钙溶液优选与冻干混合物混合以溶解该混合物，然后施用。所述氯化钙溶液能够形成具有高粘性的凝胶，允许在损伤部位凝胶形成组合物的最佳整合。一旦混合，组合物的pH是生理性的，优选pH为5-8，更优选pH为6-7.8。

除了哺乳动物血浆和透明质酸或其衍生物之外，凝胶形成组合物还可以包含一种或多种药物化合物。在其它实施方式中，血浆和糖胺聚糖可以是组合物的仅有的化合物；因此，在这样的实施方式中，组合物可以由或基本上由血浆和糖胺聚糖组成。

根据药物化合物的性质，所述化合物可以在凝胶形成组合物的制备中的不同时间加入。在一个实施方式中，将所述药物化合物与血浆和透明质酸混合物混合。在一个实施方式中，将所述药物化合物与血浆和透明质酸混合物混合，然后将所述混合物冷冻干燥。在一个实施方式中，将所述药物化合物与冻干的血浆和透明质酸混合物混合。在优选的实施方式中，在加入钙源之前，将所述药物化合物与冻干或非冻干的血浆和透明质酸混合物混合。

在某些实施方式中，组合物可有利地进一步包含一种或多种药物化合物。本发明的适用性不限于任何药物化合物或药物化合物的类别。药物化合物本身可以是药理学活性的，或者可以通过体内化学或酶促过程转化为药理学活性种类，即药物化合物可以是前药。本发明的凝胶形成组合物可特别用于稳定性差的药物化合物。稳定性差的药物化合物的说明性非限制性实例包括肽和蛋白质如生长因子、肽样活性成分、抗体和疫苗、小干扰RNA(siRNA)、DNA、激素等。

此外，可包括两种以上药物化合物的组合或剂量组合作为药物组分。在这种情况下，每种化合物的释放可以相同或不同，例如在两种化合物的组合的情况下，其中第一种为立即释放形式，而第二种为控制释放形式。类似地，也可获得相同化合物的立即释放和控制释放形式的组合，以提供快速和持续的效果。

在本发明的一个实施方式中，所述凝胶形成组合物还包含一种或多种药物化合物，其中所述化合物选自由活性药物成分、抗生素、细胞组合物、有机小分子、蛋白质或肽组成的组。

在优选的实施方式中，所述活性药物成分是α-2肾上腺素能受体激动剂，优选可乐定或其衍生物，优选可乐定。

在一个具体的实施方式中，α-2肾上腺素能受体激动剂可以选自由以下组成的组：可乐定及其衍生物，包括2,6-二甲基可乐定、4-叠氮可乐定、4-羧基可乐定-甲基3,5-二氯酪氨酸、4-羟基可乐定、4-碘可乐定、烯丙尼定、阿可乐定、氯乙基可乐定、可乐定4-异硫氰酸酯、可乐定4-甲基异硫氰酸酯、可乐定受体、可乐定取代物质、羟基苯乙酰基氨基可乐定、N,N'-二甲基可乐定、对氨基可乐定和噻美尼定；咪唑烷类，包括咪唑啉、英普咪定、地托咪定、美托咪定、右美托咪定、左旋咪唑、氯沙坦(losartane)、洛非西定、咪康唑、萘甲唑啉、尼立达唑、硝基咪唑、昂丹司琼、羟甲唑啉、酚妥拉明、四咪唑、甲巯咪唑、替扎尼定、妥拉唑林、樟磺咪芬；咪唑类、包括4-(3-丁氧基-4-甲氧基苄基)咪唑烷-2-酮、尿刊酸、氨基-咪唑甲酰胺、安他唑啉、钙长石、双(4-甲基-1-单哌嗪硫代羰基)二硫醚、卡比马唑、西咪替丁、克霉唑、肌酸酐、达卡巴嗪、右美托咪定、益康唑、依诺昔酮、乙霉唑(ethymizol)、依托咪酯、法倔唑、氟司必林、咪唑克生、米伐折醇；胍类，包括胍丁胺、倍他尼定、双胍、西咪替丁、肌酸、加贝酯、胍乙啶、硫酸胍乙啶、胍氯芬、胍法辛、胍、胍沙苄、英普咪定、碘-3苄基胍、甲基胍、米托胍腙、亚硝基胍、吡那地尔、罗贝胍、磺胺胍、扎那米韦；α-methyinorepherine、氮卓克唑(indoramin)、5-溴-6-(2-咪唑烷-2-基氨基)喹喔啉、富马酸福莫特罗、吲哚拉明、6-烯丙基-2-氨基-5,6,7,8-四氢-4H-噻唑并[4,5-d]氮杂二盐酸盐、尼麦角林、利美尼定、N-(2-溴-6-氟苯基)-4,5-二氢-1H-咪唑-2-胺和甲苯噻嗪。

可乐定是中枢作用的α-2肾上腺素能受体激动剂。其通常用作抗高血压剂。可乐定通常也称为2,6-二氯-N-2-亚咪唑烷基苯胺(C₉H₉Cl₂N₃)。凝胶形成组合物中可乐定的浓度优选为0.01-0.5mg/ml，更优选为0.03-0.3mg/ml，更优选为0.05-0.2mg/ml。凝胶形成组合物中所述低浓度的可乐定或其衍生物在治疗的组织中是有效的。这些低浓度的可乐定在损伤组织中是有效的，因为凝胶形成使可乐定保持活性并缓慢释放到损伤组织中的理想基质。

在优选的实施方式中，所述细胞组合物包含一种或多种抗生素。在本发明的背景中，抗生素剂是具有抑制细菌和其它微生物生长或破坏细菌和其它微生物的能力的物质。在更优选的实施方式中，抗生素选自由以下组成的组：β-内酰胺抗生素、氨基糖苷类、柄型抗生素、蒽醌类、抗生素唑类、抗生素糖肽类、大环内酯类、抗生素核苷类、抗生素肽类、抗生素多烯类、抗生素聚醚类、喹诺酮类、抗生素甾族化合物、磺酰胺类、四环素、二元羧酸、抗生素金属、氧化剂、释放自由基和/或活性氧的物质、阳离子抗微生物剂、季铵化合物、双胍类、三胍类、二双胍类(bisbiguanides)及其类似物和聚合物以及天然存在的抗生素化合物。优选地，抗生素是氨基糖苷类，优选庆大霉素。

在另一个或进一步的实施方式中，所述细胞组合物包含间充质干细胞、骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞和/或软骨细胞。

间充质干细胞(MSC)能够进行成骨或成软骨分化。其它细胞已经定向于成骨细胞或成软骨细胞谱系。优选地，本发明的细胞组合物的细胞可以是动物细胞，优选温血动物细胞，更优选哺乳动物细胞。哺乳动物细胞优选是马、牛、猪、绵羊、犬或猫来源的。

非限制性地，组合物可包含约0.05×10⁶至5×10⁹个细胞，优选约0.5×10⁶至1×10⁹个细胞，更优选约4×10⁶至250×10⁶个细胞的细胞量。

在一个实施方式中，在冻干血浆和透明质酸混合物之后加入所述细胞组合物，以防止破坏所述细胞。

在另一个或更优选的实施方式中，所述有机小分子是具有骨传导性质的支架或基质组分，优选磷酸三钙颗粒(TCP)。

骨传导性基质还允许在本发明的组合物中持续释放药物化合物，例如可乐定，并促进骨修复。基质允许如上所述的细胞流入，促进骨形成和骨折部位的修复。磷酸三钙颗粒是有效提供用于骨向内生长的支架或基质的矿物材料。优选地，TCP的平均粒径为约5-200μm，更通常为约10-100μm，理想地为约20-60μm。测量TCP粒径的方法是本领域已知的，并且可以包括沉降测量法、分析离心法和各种光谱法。在一个实施方式中，所述TCP粒径通过激光衍射测量。组合物中TCP的浓度优选为10-200mg/ml，更优选30-150mg/ml，更优选50-100mg/ml。本发明的骨传导性基质可以具有任何形状，并且是可延展的，粘性的，并且可以在靶组织部位或其附近注射。

本发明的凝胶形成组合物可另外包含蛋白质或(多)肽。本发明组合物中适合于施用的生物活性蛋白质、肽和多肽包括生长激素、生长因子和其它生物活性片段及其衍生物。优选的蛋白质包括马、牛、猪、绵羊、犬或猫生长激素；并且意在包括天然、合成、重组或生物合成来源的那些。另外，与生物活性蛋白质、肽和多肽相关的金属或金属化合物以及酸式盐、衍生物和复合物和抗水合剂适于掺入本发明的组合物中。

除本文特别指定的药物化合物外，本发明组合物可包含一种或多种药物赋形剂。合适的赋形剂取决于所述化合物的剂型和特性，并且可由本领域技术人员选择。药物赋形剂不应干扰血浆、透明质酸或药物化合物的活性。

在一个实施方式中，组合物还可包含全血或全血的分级组分。向本发明的组合物中加入全血或所述分级组分(优选全血)可以至少部分地改进再生特性。包含全血或其所述分级组分的组合物有利地包含血小板来源的生长因子，其可用于再生医学，特别是用于刺激骨、软骨、腱或韧带缺陷的修复或用于替代受损的骨、软骨、腱或韧带。例如，全血对于接受制剂的受试者可以是同种异体的或自体的。

在一个实施方式中，所述组合物不含或基本上不含血清。

在另一个实施方式中，组合物还可包含一种或多种具有成骨、骨诱导和/或骨传导性质的物质。在优选的实施方式中，这样的物质可以选自由以下组成的组：成纤维细胞生长因子(FGF)，优选FGF-2，转化生长因子β(TGFB)，优选TGFB-1，血小板来源生长因子(PDGF)，白介素-8(IL-8)，骨形态发生蛋白(BMP)，例如BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7中的任何一种或多种，甲状旁腺激素(PTH)，甲状旁腺激素相关的蛋白质(PTHrp)和干细胞因子(SCF)。因此，在某些实施方式中，药物活性蛋白质或肽可以是生长因子，优选选自由FGF、TGFB、PDGF、IL-8、BMP、PTH、PTHrp和SCF组成的组的生长因子，更优选选自由FGF-2、TGFB-1、PDGF、IL-8、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、PTH、PTHrp和SCF组成的组的生长因子。

在另一个实施方式中，所述凝胶形成组合物被配制用于肠胃外施用，优选用于骨内、骨周围、关节内、关节周围施用，或用于腱内、腱周围、韧带内或韧带周围施用。

本发明的组合物优选被配制用于肠胃外施用。例如，组合物可以是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。肠胃外施用的优点是可以进行局部注射并且可以特异性靶向和治疗损伤部位。通过本发明的组合物的所述靶向治疗安全且有效，并且不涉及复杂的功能性测量，如用于口服施用的药物。根据损伤部位，优选不同的施用途径位置。本领域技术人员熟悉这些应用途径。凝胶形成组合物优选使用针头和注射器通过注射施用。

在一个具体的实施方式中，组合物被配制用于骨内或骨周围施用。骨内施用或递送通常是指将治疗直接或间接递送到骨(小梁或皮质)中的方法。骨周围施用或递送通常是指在骨周围(特别是骨折/损伤部位周围)递送治疗的方法。在另一个具体的实施方式中，组合物被配制用于关节内或关节周围施用。关节内施用或递送通常是指将治疗直接或间接递送到接合的关节的滑液囊中的方法。关节周围施用或递送通常是指在接合的关节的滑液囊和/或软骨下骨的周围递送治疗的方法。在另一个实施方式中，所述组合物被配制用于腱内或腱周围施用。在另一个和进一步的实施方式中，组合物被配制用于韧带内或韧带周围施用。

本发明的第二方面涉及通过本发明的方法获得的组合物。有利地，所述组合物在加入所述钙源后30分钟内胶凝。

凝胶形成组合物在30分钟内从液体物质变成胶状物。该时间范围对于从业者来说足以安全地处理凝胶形成组合物并将其施用到损伤部位。优选地，所述组合物在加入所述钙源后25分钟内胶凝，更优选地，所述组合物在加入所述钙源后20分钟内胶凝。因此，当组合物仍是液体并且组合物以几乎胶冻状态到达损伤部位时，凝胶形成组合物仍可由从业者处理，从而能够靶向递送和持续释放掺入组合物中的生物物质。

因此，在本发明的一个实施方式中，刚好在施用最终组合物之前将钙源加入血浆和透明质酸混合物中。由此，可以获得组合物的受控递送。

在一个实施方式中，本发明的组合物用于治疗肌肉骨骼疾病，优选地其中肌肉骨骼疾病是骨病或关节病。

可选地或额外地，所述肌肉骨骼疾病可影响肌腱和/或韧带。另一目的在于上述凝胶形成组合物在制备用于治疗肌肉骨骼疾病，优选骨病或关节病的药物中的用途。可选地或额外地，所述肌肉骨骼疾病可影响肌腱和/或韧带。进一步的目的在于在需要这种治疗的受试者中治疗肌肉骨骼疾病，优选骨病或关节病(可选地或额外地，所述疾病可影响肌腱和/或韧带)的方法，包括对所述受试者施用治疗或预防上有效量的上述凝胶形成组合物。

在一个实施方式中，本发明涉及用于治疗骨关节炎的组合物或试剂盒。骨关节炎是由软骨退化引起的关节炎症逐渐恶化。在健康的关节中，软骨用作垫子以允许关节在其整个运动范围内平滑地移动。在骨关节炎的情况下，该软骨垫由于诸如年龄、损伤、重复性压力、疾病或遗传倾向等因素而开始分解。这种保护垫的损失导致疼痛、炎症、运动范围减小和骨刺的发展。诊断通常基于体征和症状，使用医学成像和其它测试来支持或排除其它问题。

在一个实施方式中，本发明涉及用于预防前十字韧带(CCL)破裂的组合物或试剂盒。前十字韧带是膝关节(后腿的中间关节)内最重要的稳定器之一。前十字韧带断裂是后肢跛行、疼痛和随后的膝关节炎的最常见原因之一。尽管与CCL破裂相关的临床征象不同，但病症总是引起后肢功能障碍和疼痛。创伤占CCL破裂的少数，而韧带的进行性退化归因于多种因素，其可广泛地分类为遗传的、构象的、环境的、免疫介导的和炎性的。使用步态观察、身体检查发现和射线照相术(X射线)的组合容易地实现诊断CCL的完全撕裂。相比之下，部分CCL撕裂的诊断更具挑战性。本发明的组合物或试剂盒用于治疗和/或预防受试者(例如动物)中的部分前十字韧带断裂的用途显著减少韧带退化的迹象，帮助预防完全前十字韧带断裂，并且降低患有单侧CCL断裂的受试者中的对侧疾病的发病率。

在一个实施方式中，本发明涉及用于治疗肌腱病，例如冈上肌腱病和跟腱断裂的组合物或试剂盒。肌腱病是一种导致疼痛、肿胀和功能受损的肌腱病症。冈上肌腱病是用于描述冈上肌腱中和周围撕裂、钙化肌腱病、肌腱变性和/或损伤的术语，并且是前肢跛行的原因。冈上肌是肩关节的重要被动稳定器，负责肩关节伸展和肢体推进。冈上肌肌腱损伤导致炎症。腱纤维的撕裂和产生的炎症可导致腱的矿化和钙化，这是疼痛和跛行的根源。跟腱的主要功能是后肢向前发展，其有助于蹄的被动支持。跟腱损伤的病因通常是创伤性的。取决于创伤，损伤的严重程度可显著变化，导致伸展的、小的或部分的撕裂或完全破裂。

因此，相关的方面提供了包含哺乳动物来源的血浆和透明质酸或其衍生物的凝胶形成组合物，其用作赋形剂，优选用作配置用于肠胃外施用的药物制剂中的赋形剂，所述药物制剂更优选用于骨内、骨周围、关节内或关节周围施用，或用于腱内、腱周围、韧带内或韧带周围施用。

根据患者的病理生理学状况和医疗从业者建立的方案，凝胶形成组合物可以以用于肠胃外施用的组合物的单个治疗有效剂量施用，或以该组合物的多个治疗有效剂量施用。

在一个实施方式中，本发明的组合物以单个或多个治疗有效剂量关节内或局部施用。所述剂量适合于受试者的目标关节和体重。

具体地，在肌腱病的情况下，本发明的组合物是单个或多个治疗有效剂量关节周围、腱周围或腱内施用。所述剂量适合于受试者的目标关节和体重。

另一目的在于上述组合物在制备用于治疗肌肉骨骼疾病，优选骨病或关节病，更优选骨关节炎，预防CLL破裂或肌腱病如冈上肌腱病和跟腱破裂的药物中的用途。

通过以下非限制性实施例进一步描述本发明，所述实施例进一步说明本发明，并且不旨在也不应将它们解释为限制本发明的范围。

实施例

现在将参考以下实施例进一步举例说明本发明。本发明决不限于所给出的实施例。

实施例1：凝胶形成组合物的制备方案

凝胶形成组合物以不同的产品批次制备。除了制备具有最佳性质的凝胶形成组合物之外，每个产品批次应显示出相似的最佳性质。

将通过单采血液成分术制备的冷冻犬血浆在37℃下解冻60分钟，优选40分钟，更优选30分钟。所述犬血浆通过过滤器尺寸为0.4μm至5μm，更优选0.6μm至1.2μm的过滤器过滤，然后无菌过滤。将过滤的犬血浆和透明质酸混合以构成混合物。将所述混合物在水溶液中溶解4次，优选3次，更优选2次，以降低产物粘度并利于其它制造步骤。随后，在持续72至120小时的过程中冷冻干燥所述混合物。优化该过程的持续时间，以便提供更通气的冻干产品，其随后可以容易地重构。在下一步骤中，将氯化钙粉末溶解在氯化氢溶液中，并将溶解的氯化钙无菌过滤。在此，氯化氢溶液用作氯化钙粉末的稀释剂。

实施例2：配制凝胶形成组合物，然后使用。

将包含冻干犬血浆和透明质酸冻干产物的小瓶用灭菌的氯化钙溶液重构。再悬浮时间仅计数5分钟。其它凝胶形成组合物具有再悬浮时间，即长于2小时。所述冻干的混合物可包含浓度为0.05-0.2mg/ml的可乐定。这种再悬浮的组合物可以肠胃外施用。

实施例3：凝胶形成组合物的比较例

凝胶形成组合物优选包含99％的非S/D处理的血浆、5-24mg/ml的透明质酸钠、0.05-0.2mg/ml的可乐定、0.6-1mg/ml的氯化钙和0.4-0.65mg/ml的HCl。

氯化钙的浓度从0.10mg/ml变为2mg/ml，使得组合物快速胶凝。因此，从业者不能在损伤部位适当地施用组合物。另一方面，0.05mg/ml的氯化钙的浓度显示出组合物没有不充分的胶凝，该组合物保持为液体。

透明质酸或其衍生物的浓度也对凝胶形成组合物的胶凝具有影响，这通过具有低浓度透明质酸钠(0.05mg/ml)和高浓度透明质酸钠(250mg/ml)的组合物显示。对于氯化钙观察到了类似的结果。

血浆也影响组合物的胶凝。实际上，脂质和/或磷脂在未处理血浆中的存在通过触发凝血级联而促进胶凝过程。在使用溶剂-去污剂血浆的情况下，由于缺乏血浆脂质和/或磷脂，故发生了不充分的胶凝。

所述血浆、透明质酸或衍生物和氯化钙的浓度和性质影响凝胶形成组合物的胶凝，因此应优选落入本发明公开的范围内。

Claims (18)

1.一种制备用于肠胃外施用的凝胶形成组合物的方法，所述方法包括将哺乳动物来源的血浆和透明质酸或其盐或酯的混合物与钙源混合的步骤，其特征在于，将所述钙源加入所述混合物中，使得钙浓度为0.2-1.4mg/ml。

2.如权利要求1的方法，其特征在于，所述钙源是氯化钙溶液。

3.如权利要求1或2的方法，其特征在于，所述氯化钙溶液具有酸性pH。

4.如前述权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在加入所述钙源之前将所述血浆和透明质酸混合物冷冻干燥。

5.如前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述血浆包含脂质和/或磷脂，其中所述脂质和/或磷脂以0.2-7mg/l的总浓度存在。

6.如前述权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述脂质包含微量血浆脂质，其中所述微量血浆脂质优选选自棕榈酰乙醇酰胺(PEA)、硬脂酰乙醇酰胺(SEA)、花生四烯酰乙醇酰胺(AEA)，并且其中微量血浆脂质的总浓度为5-50nmol/l。

7.如前述权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述血浆的白细胞(WBC)浓度小于200mil/l，WBC浓度优选为3-145mil/l，更优选为5-85mil/l。

8.如前述权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述血浆的血小板(BP)浓度小于50,000mil/l，BP浓度优选为1,000-35,000mil/l，BP浓度更优选为2,000-20,000mil/l。

9.如前述权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述透明质酸或其衍生物的分子量小于1,800kDa，更优选为700-1,600kDa，更优选为700-1,000kDa。

10.如前述权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述血浆和透明质酸混合物还包含选自由活性药物成分、抗生素、细胞组合物、小有机分子、蛋白质和肽组成的组中的一种或多种药物化合物。

11.如前述权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述活性药物成分是α-2肾上腺素能受体激动剂，优选可乐定或其衍生物，优选可乐定。

12.如前述权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述有机小分子是具有骨传导性质的支架或基质组分，优选磷酸三钙颗粒(TCP)。

13.如前述权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述凝胶形成制剂被配制用于肠胃外施用，优选用于骨内、骨周围、关节内、关节周围施用，或用于腱内、腱周围、韧带内或韧带周围施用。

14.通过前述权利要求1至13中任一项所述的方法获得的组合物。

15.如权利要求14所述的组合物，其用于治疗受试者的肌肉骨骼疾病，其中所述肌肉骨骼疾病优选为骨病或关节病。

16.如权利要求15的组合物，其用于治疗骨关节炎。

17.如权利要求15的组合物，其用于治疗或预防前十字韧带断裂。

18.如权利要求15的组合物，其用于治疗肌腱病。