BR112020006609A2

BR112020006609A2 - composição inalável de clofazimina e seus métodos de uso

Info

Publication number: BR112020006609A2
Application number: BR112020006609-5A
Authority: BR
Inventors: Hugh Smyth; Ashlee BRUNAUGH
Original assignee: Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date: 2017-10-02
Filing date: 2018-10-02
Publication date: 2020-10-06
Also published as: EP3691646A4; AU2018345609A1; JP2020536123A; JP2023171770A; WO2019070693A1; CN111212645A; EP3691646A1; US20240099967A1; US20200297626A1; CA3077421A1

Abstract

É fornecida aqui uma composição inalável de clofazimina. São ainda aqui fornecidos métodos de produção da composição inalável de clofazimina por moagem a jato. Também são aqui fornecidos métodos de tratamento de doenças pulmonares, pela administração da composição inalável de clofazimina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM-

POSIÇÃO INALÁVEL DE CLOFAZIMINA E SEUS MÉTODOS DE USO".

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório dos Estados Unidos, Nº de Série 62/566.633, depositado em 2 de outubro de 2017, cujo conteúdo integral está sendo incorporado por referên- cia.

ANTECEDENTES

1. Campo

[002] A presente invenção refere-se geralmente aos campos da farmacologia e medicina. Mais particularmente, diz respeito às compo- sições de clofazimina inaláveis e seus métodos de uso.

2. Descrição da Técnica Relacionada

[003] Há uma necessidade crescente e urgente de novos fárma- cos para uso contra a tuberculose. 10,4 milhões de novos casos de TB foram relatados em todo o mundo em 2015, com 580.000 desses ca- sos considerados tuberculose multirresistente (MDR-TB), definida co- mo M. tuberculosis resistente contra a rifampicina ou rifampicina e iso- niazida (Organização Mundial da Saúde, 2016). Além disso, todas as regiões do mundo exibiram casos de TB extensivamente resistente a fármacos (XDR-TB), definida como M. tuberculosis resistente contra a isoniazida e rifampicina, além de qualquer fluoroquinolona e pelo me- nos um dos três fármacos injetáveis de segunda linha (amicacina, ca- namicina ou capreomicina) (Organização Mundial da Saúde, 2016). Com o advento da globalização e migração em massa de áreas de alto ônus, espera-se que essas cepas resistentes se espalhem. À medida que as opções de tratamento diminuem, a reformulação de agentes anti-infecciosos altamente ativos e pouco toleráveis, como a clofazimi- na (CFZ), é um método potencial para superar a TB resistente, princi- palmente se puderem ser direcionados ao local de infecção. Existem vários desafios no desenvolvimento de tais formulações. Para ser efe-

tivamente implementado nos países com poucos recursos nos quais a TB predomina, qualquer tratamento potencial deve ser econômico, além de ser facilmente transportado e administrado. Além disso, um tratamento potencial deve exibir uma alta especificidade em relação aos macrófagos alveolares através dos quais a infecção por M. tuber- culosis é iniciada e propagada (Bloom, 1994). Os bacilos infecciosos são inalados como gotículas e fagocitados por macrófagos alveolares e sobrevivem ao ambiente intracelular hostil, ao restringir a acidifica- ção do macrófago e limitando a fusão do lisossomo. Na infecção crôni- ca, esse mecanismo leva a uma população estável de micobactérias intracelulares (Russel, 2007).

[004] A clofazimina é um antibiótico iminofenazina fracamente básico que exibe atividade contra micobactérias, como Mycobacte- rium leprae, Mycobacterium avium complex (MAC), e M. tuberculosis com uma concentração inibitória mínima (MIC) variando de 0,125 a 2 µg/mL (Arbriser et al., 1995, Gangadharam et al., 1992; Lindholm-Levy et al., 1998; Shafran et al., 1996; Kemper et al., 1992; Twomey et al., 1957; Schön et al., 2011; Diacon et al., 2015; Cavanaugh et al., 2017). É importante ressaltar que a clofazimina exibe atividade contra a TB resistente a fármacos e agora é recomendada pela Organização Mun- dial da Saúde como agente de segunda linha no tratamento da MDR- TB (Organização Mundial da Saúde, 2016; Cavanaugh et al., 2017; Rastogi et al., 1996; Reddy et al, 1996). A clofazimina também pode ser usada para o tratamento de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e distúrbios inflamatórios dos pulmões. A clofazimi- na também exibe inúmeras outras propriedades que podem ser alta- mente benéficas no tratamento da TB, incluindo menor duração da te- rapia, sinergia com outros agentes antimicrobianos, como pirazinami- da, rifampina, fluoroquinolonas e amicacina, que resultam em atividade bactericida aprimorada contra bacilos de fase estacionária e atividade anti-inflamatória (Tyagi et al., 2015; Zhang et al., 2017; Cholo et al., 2017). Em particular, a clofazimina demonstra uma afinidade única pa- ra captação e sequestro de macrófagos. Após a captação do fármaco, os macrófagos transformam a clofazimina em estruturas de cristal lí- quido delimitadas por uma membrana de duas camadas (Baik e Rosa- nia, 2012; Baik et al., 2013). Essas estruturas intracelulares únicas de clofazimina podem servir como um mecanismo de proteção contra ci- totoxicidade e permitir a mobilização e acúmulo de fármaco no local da infecção, a fim de maximizar a eficácia terapêutica (Baik e Rosania, 2012; Baik et al., 2013; Yoon et al., 2016; Yoon et al., 2015).

[005] Embora altamente ativa contra micobactéria, a eficácia te- rapêutica da formulação oral comercial de clofazimina existente (Lam- prene®, Novartis) é limitada por sua baixa solubilidade em água (10 mg/L), início de ação lento e perfil de efeito adverso significativo. A bi- odisponibilidade oral varia de 45 a 62% e exibe um alto grau de varia- bilidade interpaciente e efeito alimentar (Bolla e Nangia, 2012; Clofa- zimine, 2008; Nix et al., 2004; Holdiness, 1989). Além disso, a clofazi- mina exibe solubilidade dependente de pH, com valores de pKa de 2,31 e 9,29 (Keswani et al., 2015). A mudança de pH que acompanha a transição do estômago para o ambiente intestinal pode potencial- mente levar à recristalização e precipitação da clofazimina e reduzir a absorção sistêmica. São necessários pelo menos 30 dias de adminis- tração para atingir concentrações de estado estacionário, necessitan- do do uso de grandes doses de carga, e ocorre um atraso na atividade bactericida por até duas semanas após a dose oral, independentemen- te da dose administrada (Holdiness, 1989; Swanson et al., 2015). As altas doses sistêmicas necessárias estão associadas a efeitos adver- sos que incluem pele marrom-avermelhada e descoloração da conjun- tiva (75 a 100%), angústia gastrointestinal (40 a 50%), incluindo dor abdominal, náusea, diarreia, vômito e complicações graves, como in-

farto esplênico, obstrução intestinal e sangramento fatal secundários ao acúmulo de depósitos cristalinos (Novartis, 2006). Além disso, a disponibilidade da formulação oral é limitada. Nos EUA, o Lamprene® está disponível apenas para o tratamento da MDR-TB por meio de pe- didos de Investigação de Novo Fármaco (INDs) para um único pacien- te, administrados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA (Cunningham, 2004; Clofazimine, 2009). Claramente, existe a neces- sidade de reduzir os efeitos adversos sistêmicos indesejáveis e melho- rar a eficácia terapêutica, bem como a necessidade de uma formula- ção mais direcionada de clofazimina.

SUMÁRIO

[006] Em uma primeira modalidade, a presente divulgação forne- ce uma composição farmacêutica compreendendo partículas microni- zadas de clofazimina com um diâmetro médio das partículas de 0,5 a 10 µm, em que a composição compreende menos de 10% de material amorfo. Em alguns aspectos, uma composição é um pó seco. Em as- pectos específicos, o pó seco é formulado para inalação. Em aspectos específicos, a composição compreende um único ingrediente ativo, em que o único agente ativo é a clofazimina.

[007] Em aspectos particulares, a composição é substancialmen- te livre de excipientes. Em alguns aspectos, a composição é essenci- almente livre de excipientes. Em aspectos particulares, a composição é livre de excipientes adicionados. Em aspectos específicos, a compo- sição é livre de excipientes. Em alguns aspectos, a composição é livre de excipientes, aditivos, diluentes, transportadores e adjuvantes. Em aspectos específicos, a composição é livre de um ou mais açúcares, lubrificantes, agentes antiestáticos, antiaderentes, glidantes, aminoáci- dos, peptídeos, surfactantes, lipídios (por exemplo, leucina, isoleucina, lisina, valina, e/ou metionina), e fosfolipídios. Em aspectos particula- res, a composição é livre ou essencialmente livre de DMSO, ciclodex-

trina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), lactose, estearato de magnésio e sílica coloidal. A composição pode ser livre ou essencialmente livre de DMSO, ciclodextrina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), estearato de magnésio e sílica coloidal. A composição pode compreender lacto- se, como em uma concentração de até 10% em peso, tal como 0,1 a 10% em peso, como 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% em peso.

[008] Em alguns aspectos, as partículas micronizadas de clofa- zimina são substancialmente cristalinas. Em aspectos particulares, as partículas micronizadas de clofazimina são essencialmente cristalinas. Em certos aspectos, as partículas micronizadas de clofazimina são cristalinas.

[009] Em aspectos específicos, a composição compreende pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95%, como 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, em peso de partículas micronizadas de clofazimina.

[0010] Em aspectos particulares, as partículas micronizadas de clofazimina compreendem um diâmetro médio das partículas de 0,5 a 5 µm, como 0,75 a 4 µm, particularmente 1 a 3 µm. Em algum aspecto, pelo menos 80% das partículas micronizadas de clofazimina compre- endem um diâmetro equivalente em volume de 1 a 3 µm. Em alguns aspectos, as partículas micronizadas de clofazimina formam agrega- dos. A composição pode ter uma área de superfície específica de 1,9 a 2,3 m2/g, tais como 2,1 a 2,2 m2/g, tais como 2,11, 2,12, 2,13, 2,14, 2,15, 2,16, 2,17, 2,18, 2,19, ou 2,2 m2/g. A composição pode ter um índice de compressibilidade de 32 a 37, particularmente 33,9 a 34,0, como 33,91, 33,92, 33,93, 33,94, 33,94, 33,95, 33,96, 33,97, 33,98, 33,99 ou 34,0. A composição pode ter uma proporção de Hausner de 10 a 20, tal como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. A composi- ção pode ter um ângulo de resposta de 15° a 30°, em particular, 21 a 23°, tais como 22,1, 22,2, 22,3, 22,4, 22,5, 22,6, 22,7, 22,8, 22,9, ou 23,0°.

[0011] Em alguns aspectos, a composição compreende uma fra- ção de partículas finas (FPF) de pelo menos 50%, como pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80%. Em certos aspectos, a composi- ção compreende uma taxa de dissolução inferior a 30% em 24 horas em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 com meio de disso- lução de polissorbato 80 a 0,2%. Em alguns aspectos, a composição não é encapsulada em lipossomas.

[0012] Em certos aspectos, a composição compreende menos que 5% de material amorfo. Em aspectos particulares, a composição é substancialmente livre de material amorfo. Em alguns aspectos, a composição é essencialmente livre de partículas amorfas, conforme determinado por difração de raios-x ou calorimetria de varredura dife- rencial .

[0013] Em alguns aspectos, a composição é produzida por moa- gem a jato, como a moagem a jato de ar. Em aspectos particulares, a composição não é produzida por secagem por secagem por pulveriza- ção ou homogeneização ultrassônica.

[0014] Em outros aspectos, a composição é embalada como uma forma de dosagem unitária. Por exemplo, a forma de dosagem unitária pode ser embalada como um cartucho, blíster ou cápsula. Em aspec- tos particulares, a dose de pacote unitária é livre de excipientes. Em alguns aspectos, a forma de dosagem unitária compreende 5 a 30 mg (por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 mg) de partículas micronizadas de clofazimina. Em alguns aspectos, a forma de dosagem unitária com- preende pelo menos 10 mg de partículas micronizadas de clofazimina. Em aspectos particulares, a forma de dosagem unitária compreende pelo menos 20 mg de partículas micronizadas de clofazimina.

[0015] Em aspectos adicionais, o pó seco é carregado em um ina- lador de pó seco, como um inalador de pó seco simples. Em alguns aspectos, o inalador de pó seco é um inalador ativo. Em outros aspec- tos, o inalador de pó seco é um inalador passivo. Em alguns aspectos, o inalador de pó seco simples compreende menos de 10 partes. Em um aspecto específico, o inalador de pó seco simples é um inalador de pó seco monodose RSO1. Em alguns aspectos, o inalador de pó seco compreende uma resistência ao fluxo de ar de 0,01 kPa0,5min/L e 0,06 kPa0,5min/L, como 0,02 kPa0,5min/L e 0,04 kPa0,5min/L.

[0016] É ainda aqui fornecido um pó para uso em um inalador de pó seco, o pó compreendendo a composição de partículas microniza- das de clofazimina das modalidades, como uma composição de clofa- zimina inalável sem excipiente.

[0017] Em outra modalidade, é fornecida uma composição com- preendendo uma forma de dosagem unitária de partículas microniza- das de clofazimina, em que as partículas compreendem um diâmetro médio das partículas de 0,5 a 10 µm e a composição é substancial- mente livre de excipientes. Em alguns aspectos, a forma de dosagem unitária compreende uma composição de partículas micronizadas de clofazimina das modalidades. Em alguns aspectos, a forma de dosa- gem unitária é compreendida em um cartucho, blíster ou cápsula. Em certos aspectos, a forma de dosagem unitária compreende pelo menos 10 mg de partículas micronizadas de clofazimina. Em aspectos particu- lares, a forma de dosagem unitária compreende pelo menos 20 mg de partículas micronizadas de clofazimina.

[0018] Em ainda outra modalidade, é fornecido um inalador de pó seco compreendendo uma forma de dosagem unitária das modalida- des. Em alguns aspectos, o inalador de pó seco é um inalador de pó seco simples. Em aspectos particulares, o inalador de pó seco simples compreende menos de 10 partes. Por exemplo, o inalador de pó seco simples é um inalador de pó seco monodose RSO1. Em aspectos es- pecíficos, o inalador de pó seco compreende uma resistência ao fluxo de ar de 0,02 kPa0,5min/L e 0,04 kPa0,5min / L. Em alguns aspectos, o inalador de pó seco fornece uma dose emitida de 10 a 20 mg com um acionamento do dispositivo. Em aspectos particulares, o inalador de pó seco fornece uma dose de partículas finas de 5 a 15 mg com um acio- namento do dispositivo. Em alguns aspectos, a dose de partículas fi- nas é de pelo menos 50%, como pelo menos 60% ou 70% da dose emitida com um acionamento do dispositivo. Em aspectos particulares, uma mudança na queda de pressão através do dispositivo de kPa para 1 kPa não resulta em uma diminuição da dose emitida em mais de 25%. Em aspectos específicos, uma mudança na queda de pressão através do dispositivo de 4 kPa para 1 kPa não resulta em uma redu- ção na dose de partículas finas em mais de 15%.

[0019] Em uma modalidade adicional, é fornecido um método para preparar a composição das modalidades (por exemplo, uma composi- ção compreendendo partículas micronizadas de clofazimina), compre- endendo obter clofazimina; sujeitar a clofazimina a um moinho a jato; e coletar as partículas micronizadas de clofazimina com um diâmetro médio das partículas de 0,5 a 10 µm, em que o método não compre- ende a adição de um excipiente. Em alguns aspectos, o moinho a jato é ainda definido como um moinho a jato de ar. Em aspectos particula- res, o método não compreende a adição de um solvente. Em aspectos adicionais, o método compreende ainda carregar as partículas micro- nizadas de clofazimina em um inalador de pó seco. Em aspectos parti- culares, o inalador de pó seco é um inalador de pó seco simples.

[0020] Outra modalidade fornece um método para tratar ou preve- nir uma infecção pulmonar em um paciente, compreendendo adminis- trar uma quantidade eficaz da composição de partículas micronizadas de clofazimina das modalidades ao paciente.

[0021] Em alguns aspectos, a administração compreende a inala- ção das partículas micronizadas de clofazimina nos pulmões do paci-

ente. Em certos aspectos, a inalação compreende o uso de um inala- dor. Em alguns aspectos, o inalador é um inalador de pó seco, um ina- lador dosimetrado ou um nebulizador.

[0022] Em certos aspectos, a infecção pulmonar é uma infecção bacteriana. Em aspectos particulares, a infecção pulmonar é uma in- fecção micobacteriana. Em alguns aspectos, a infecção micobacteria- na é uma infecção por Mycobacterium tuberculosis, infecção por Mycobacterium abscesses, infecção por Mycobacterium kansasii, ou uma infecção por Mycobacterium avium complex. Em aspectos parti- culares, o Mycobacterium tuberculosis é resistente a múltiplos fárma- cos (multirresistente). Em alguns aspectos, o Mycobacterium tubercu- losis é extensivamente resistente a fármacos. Em alguns aspectos, a infecção pulmonar é uma infecção latente. Em aspectos particulares, a infecção por Mycobacterium tuberculosis é latente. Em alguns aspec- tos, a infecção pulmonar é pneumonia, como associada ao staphylo- coccus aureus resistente à meticilina, ou uma infecção associada à fibrose cística.

[0023] Em aspectos adicionais, o método compreende ainda ad- ministrar pelo menos um segundo agente terapêutico. Em alguns as- pectos, o pelo menos um segundo agente é selecionado a partir do grupo que consiste em bedaquilina, pirazinamida, um inibidor de ácido nucleico, um inibidor de síntese de proteína e um inibidor de envelope celular. Em certos aspectos, o inibidor de síntese de proteína é linezo- lida, claritromicina, amicacina, canamicina, capreomicina ou estrepto- micina. Em alguns aspectos, o inibidor de envelope celular é etambu- tol, etionamida, tioacetizona, isoniazida, imipenem, clavulanato, ciclo- serina, terizidona, amoxicilina ou protionamida. Em alguns aspectos, o inibidor de ácido nucleico é rifampicina, rifabutina, rifapentina, ácido 4- aminosalicílico, moxifloxacina, ofloxacina ou levofloxacina. O segundo agente terapêutico pode ser administrado separadamente a partir da composição de partículas de clofazimina, como por via retal, nasal, bucal, vaginal, subcutânea, intracutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intrastemal, intratecal, in- tralesional ou intracraniana, ou através de um reservatório implantado. O segundo agente terapêutico pode ser administrado antes ou depois da composição de partículas de clofazimina.

[0024] Em aspectos particulares, a composição de partículas mi- cronizadas de clofazimina é administrada mais de uma vez, tal como uma vez por dia, em dias alternados, a cada 3 dias ou semanalmente.

[0025] Em outras modalidades, é fornecido um método para o tra- tamento do câncer em um paciente, compreendendo administrar uma quantidade eficaz da composição de partículas micronizadas de clofa- zimina das modalidades ao paciente. Em alguns aspectos, o câncer é câncer de pulmão.

[0026] Em aspectos adicionais, o método compreende ainda ad- ministrar um agente anticâncer. Em alguns aspectos, o agente anti- câncer é quimioterapia, radioterapia, terapia genética, cirurgia, terapia hormonal, terapia antiangiogênica ou terapia citocina.

[0027] Em certos aspectos, a administração compreende inalar as partículas micronizadas de clofazimina nos pulmões do paciente. Em aspectos particulares, a inalação compreende o uso de um inalador. Em alguns aspectos, o inalador é um inalador de pó seco, um inalador dosimetrado ou um nebulizador. Em aspectos particulares, a composi- ção de partículas micronizadas de clofazimina é administrada mais de uma vez.

[0028] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método para reduzir a inflamação pulmonar em um paciente, compreendendo ad- ministrar uma quantidade eficaz da composição de partículas microni- zadas de clofazimina das modalidades ao paciente. Em alguns aspec- tos, a inflamação pulmonar está associada à asma, COPD, fibrose pulmonar idiopática ou fibrose cística. Em aspectos particulares, a ad- ministração compreende a inalar as partículas micronizadas de clofa- zimina nos pulmões do paciente. Em alguns aspectos, a inalação compreende o uso de um inalador. Em alguns aspectos, o inalador é um inalador de pó seco, inalador dosimetrado ou nebulizador. Em as- pectos particulares, a composição de partículas micronizadas de clofa- zimina é administrada mais de uma vez.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0029] As figuras a seguir fazem parte do presente relatório descri- tivo e são incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da presen- te invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a uma ou mais dessas figuras em combinação com a descrição deta- lhada de modalidades específicas aqui apresentadas.

[0030] Figura 1: Imagens SEM (microscópio eletrônico de varredu- ra) de clofazimina sem excipiente seco seca por pulverização em sol- ventes orgânicos.

[0031] Figura 2: Dados de difração de cristalografia de raios-x para clofazimina seca por pulverização em solventes orgânicos.

[0032] Figura 3: Diagrama esquemático do moinho a jato Aljet usado para a micronização da clofazimina.

[0033] Figura 4: Distribuições de tamanho de partícula coletadas de diferentes áreas do moinho a jato Aljet.

[0034] Figuras 5A a 5E: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de cristais de clofazimina. A) clofazimina não processada; B) partículas micronizadas de clofazimina coletadas da região do recipi- ente de coleta do moinho Aljet; C) partículas micronizadas de clofazi- mina coletadas da região do recipiente de coleta do moinho Aljet dis- persas usando a aplicação de pressão de ar de 3 Bar de uma unidade dispersora Sympatec RODOS; D) partículas micronizadas de clofazi- mina coletadas da região de ciclone do moinho Aljet; E) partículas mi-

cronizadas de clofazimina coletadas da região de ciclone do moinho Aljet dispersas usando a aplicação de pressão de ar de 3 Bar de uma unidade dispersora Sympatec RODOS.

[0035] Figura 6: Dados de difração de cristalografia de raios-x e calorimetria de varredura diferencial para clofazimina moída e não processada.

[0036] Figuras 7A a 7C: Frações de partículas recuperadas como uma fração da massa recuperada e determinação do diâmetro aerodi- nâmico mediano da massa (MMAD). A) Fração emitida (EF%), fração de partículas finas menor que 5 µm de diâmetro aerodinâmico (FPF<5 µm), fração menor que 3 µm de diâmetro aerodinâmico (FPF<3 µm) e MMAD para partículas de clofazimina moídas com um diâmetro médio de volume geométrico de 2,69 µm e 1,81 µm; B) EF%, FPF<5µm, FPF<3µm e MMAD para partículas de clofazimina moídas com diâme- tro médio de volume geométrico de 1,81 µm aerossolizado sob condi- ções de queda de pressão de 4 kPa através de uma baixa resistência RS01 DPI e queda de pressão de 1 kPa através de uma baixa resis- tência RS01 DPI; C)Padrões de deposição de estágios do Next Gene- ration Impactor (NGI) para clofazimina moída.

[0037] Figura 8: Análise de ângulo de repouso da clofazimina moí- da livre de excipiente.

[0038] Figura 9: A fagocitose de macrófagos da clofazimina moída ocorre a uma taxa logarítmica.

[0039] Figura 10: Os macrófagos J774.A1 expostos à clofazimina moída por 24 horas exibiram uma população significativa de células fluorescentes na emissão de 660 nm, o que é indicativo de biotrans- formação intracelular da clofazimina.

[0040] Figura 11: Proliferação celular em relação ao controle após tratamento com quantidade indicada de clofazimina moída ou não mo- ída.

[0041] Figura 12: Dissolução de clofazimina moída.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0042] Uma vez que os efeitos adversos da CFZ estão relaciona- dos à dose e mais frequentemente relacionados ao GI, a administra- ção da CFZ por uma via alternativa pode aliviar ou pelo menos limitar seus efeitos colaterais. Em particular, a liberação de CFZ por via de inalação seria altamente benéfica, dado que o início e a propagação de infecções por TB e NTM ocorrem dentro do ambiente intracelular de macrófagos pulmonares alveolares. Em contraste com a dosagem oral, o direcionamento direto de CFZ para os pulmões por inalação pode ser usado para alcançar rapidamente concentrações terapêuticas de fármaco no local da infecção, aproveitando o mecanismo de depu- ração natural do pulmão, a fagocitose de macrófagos alveolares, para direcionar partículas de fármaco para bactéria intracelular. O uso de um inalador de pó seco para a liberação de CFZ é especialmente favo- rável, pois o produto não requer um suprimento de cadeia de frio e, portanto, é bem adequado para administração em regiões com poucos recursos.

[0043] A solubilidade é um fator limitante importante para o desen- volvimento de uma formulação farmaceuticamente aceitável de CFZ. CFZ é praticamente insolúvel em água. Além disso, este antibiótico altamente benéfico exibe solubilidade limitada em uma variedade de outros solventes. De acordo com o Índice Merck, a clofazimina é solú- vel em DMF e benzeno, solúvel em 15 partes de clorofórmio, 700 par- tes de etanol, 1000 partes de éter, moderadamente solúvel em aceto- na e acetato de etila e praticamente insolúvel em água. Também foi relatado que uma solução de clofazimina a 0,1% em metanol pode ser formada (Sabnis et al., 2015). As orientações do Conselho Internacio- nal de Harmonização de Requisitos Técnicos para Produtos Farma- cêuticos para Uso Humano (ICH) para as Impurezas Q3C da indústria:

Os solventes residuais reconhecem o benzeno como um solvente de classe 1 (não deve ser empregado na fabricação de fármaco; limite de concentração de 2 ppm), clorofórmio, metanol, acetonitrila e são sol- ventes de classe 2 (devem ser limitados em produtos de fármaco devi- do à toxicidade inerente; 60 ppm, 3000 ppm e 410 ppm, respectiva- mente) e ácido acético diluído e etanol são listados como reconheci- dos como solventes de classe 3. Considerando os grandes volumes necessários para a dissolução total, bem como as limitações de segu- rança do uso desses solventes, a fabricação de partículas de CFZ res- piráveis por meio de técnicas de engenharia de partículas construtivas (de baixo para cima) comumente usadas para a formulação de pó se- co, como secagem por pulverização, é extremamente desafiadora. É relatado que a secagem por pulverização bem-sucedida de partículas respiráveis de CFZ requer a adição de excipientes à formulação, como leucina ou dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), a fim de formular um pro- duto adequado para a deposição pulmonar (Germishuizen et al. 2013; Sabnis, 2015). A secagem por pulverização de CFZ pura em solventes orgânicos, como etanol ou metanol, resulta na formação de cristais em forma de agulha pouco dispersíveis (Figura 1). Se for formulada uma solução supersaturada de CFZ para a alimentação líquida, ocorrerá uma distribuição de tamanho multimodal, potencialmente devido ao fármaco que precipita para fora da alimentação líquida antes da seca- gem completa das gotículas. Se uma solução saturada for formulada para a alimentação de solvente orgânico, definida como a dissolução completa de CFZ no solvente, ocorrerá uma formulação parcialmente amorfa de CFZ, que é propensa à instabilidade físico-química (Figura 2). Assim, são necessários métodos para superar essas limitações.

[0044] Por conseguinte, em algumas modalidades, a presente di- vulgação fornece uma composição de pó seco de clofazimina livre de excipiente para inalação. A presente composição de clofazimina inalá-

vel pode ter partículas dentro de uma faixa diâmetro médio das partí- culas de 0,5 a 10 µm, particularmente na faixa de 0,75 a 4 µm, o que permite aerossolização eficiente para a liberação pulmonar. Em parti- cular, a presente composição pode fornecer doses elevadas, indepen- dentemente do quociente de vazão de inalação do paciente, tais como um dispositivo de inalação de pó seco passivo simples. Além disso, as partículas de clofazimina podem ser rápida e eficientemente absorvi- das em macrófagos alveolares, o que permite direcionar infecções in- tracelulares e fornecer um reservatório de fármaco para liberação sus- tentada e atividade anti-infecciosa. Os presentes estudos descobriram que a clofazimina micronizada é rapidamente transformada em uma forma semelhante à forma cristalina anti-inflamatória e de baixa toxici- dade, quando absorvida por macrófagos alveolares. Essa forma crista- lina é benéfica para o início rápido da ação de efeitos terapêuticos que podem ser retardados por até duas semanas nas formas de dosagem atualmente disponíveis.

[0045] Além disso, a baixa solubilidade aquosa da presente com- posição limita a dissolução do pulmão e a absorção sistêmica, redu- zindo assim os efeitos colaterais sistêmicos. Após a liberação aos ma- crófagos, os cristais sofrem resultados de biotransformação e seques- tro, os quais estão associados à atividade anti-inflamatória e ao acú- mulo no local da ação. Em comparação com a forma solubilizada do fármaco, a presente composição reduziu a toxicidade de macrófagos. Além disso, a presente composição está substancialmente livre de par- tículas amorfas que podem resultar de métodos como secagem por pulverização e levar à dissolução muito rápida e precipitação de fár- maco. De fato, a presente composição diminui a solubilidade e permite a captação de partículas pelos macrófagos.

[0046] A presente divulgação fornece ainda métodos para produzir a composição de clofazimina inalável, ao sujeitar cristais de clofazimi-

na em bruto disponíveis comercialmente à moagem a jato, como moa- gem a jato de ar, e coletar frações de clofazimina dentro de uma faixa específica de diâmetro médio das partículas, como 0,5 a 10 µm, parti- cularmente menos do que 5 µm. Em alguns aspectos, a clofazimina de saída pode ser reaplicada no moinho para aumentar a fração de partí- culas finas. Assim, o presente método é um método de micronização mecanicamente simples, ecológico e econômico para a produção da composição de pó seco de clofazimina.

[0047] Modalidades adicionais fornecem métodos de tratamento ou prevenção de doenças através da administração da composição inalável de clofazimina aqui fornecida. Por exemplo, a terapia pode ser usada para tratar infecções pulmonares, como infecções pulmonares por TB, incluindo infecções latentes, pneumonia (por exemplo, MRSA), infecções pulmonares por fibrose cística, infecções inflamatórias pul- monares e câncer de pulmão. Em particular, a clofazimina inalável po- de ser usada para tratar infecções por micobactérias. II. Definições

[0048] Conforme usado aqui, o termo "substancialmente livre" sig- nifica que uma composição contém menos de 1% de um componente (por exemplo, excipiente) que não seja o agente ativo (por exemplo, clofazimina).

[0049] Conforme usado aqui, "essencialmente livre", em termos de um componente especificado, é usado aqui para significar que ne- nhum componente especificado foi propositadamente formulado em uma composição e/ou está presente apenas como contaminante ou em pequenas quantidades. A quantidade total do componente especi- ficado resultante de qualquer contaminação não intencional de uma composição está preferencialmente abaixo de 0,01%. A mais preferida é uma composição na qual nenhuma quantidade do componente es- pecificado pode ser detectada com métodos analíticos padrão.

[0050] Conforme usado aqui no relatório descritivo e nas reivindi- cações, "um(a)" ou "o(a)" pode significar um ou mais. Conforme usado aqui no relatório descritivo e nas reivindicações, quando usado em conjunto com a palavra "compreendendo", as palavras "um(a)" ou "o(a)" podem significar um ou mais de um. Conforme usado aqui no relatório descritivo e na reivindicação, "outro(a)" ou "um(a) adicional" podem significar pelo menos um segundo ou mais.

[0051] Os termos "cerca de", "substancialmente" e "aproximada- mente" significam, em geral, o valor declarado, mais ou menos 5%.

[0052] Conforme usado aqui no relatório descritivo e nas reivindi- cações, o termo "micronizar" ou "micronizado(a)" é usado para indicar que uma substância deve ser, ou foi, quebrada em partículas muito finas, tipicamente menores que 10 µm, preferencialmente entre 0,5 e 5 µm, mais preferencialmente entre 1 e 3 µm. Uma substância pode ser micronizada por moagem, esmerilhamento ou trituração. A moagem pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, como moinho a jato de ar, moinho de bolas, moinho úmido, homogeneização de alta pressão ou moinho criogênico.

[0053] Conforme usado aqui, no relatório descritivo e nas reivindi- cações, o termo "moinho a jato de ar" refere-se a um dispositivo ou método para reduzir o tamanho de partícula usando um jato de gás comprimido para impactar partículas entre si ou nas paredes do moi- nho, pulverizando assim as partículas. Um moinho a jato de ar pode ser usado para micronizar partículas. Moinhos a jato de ar estão dis- poníveis comercialmente, como o Aljet Model 00 Jet-O-Mizer™ (Fluid Energy, Telford, PA).

[0054] Conforme usado aqui no relatório descritivo e nas reivindi- cações, o termo "moinho de bolas" refere-se a um dispositivo ou méto- do para reduzir o tamanho de partícula adicionando-se a partícula de interesse e um meio de moagem ao interior de um cilindro e girando o cilindro. As partículas de interesse são quebradas à medida que o meio de moagem levanta-se e cai ao longo do exterior do cilindro en- quanto ele gira.

[0055] Conforme usado aqui no relatório descritivo e nas reivindi- cações, o termo "moinho úmido" ou "moinho de meio" refere-se a um dispositivo ou método para reduzir o tamanho de partícula adicionan- do-se a partícula de interesse ao dispositivo com um agitador, conten- do um meio que compreende um líquido e um meio de esmerilhamen- to. Com a adição da partícula de interesse, à medida que o agitador gira, a energia que ele dispersa faz com que o meio de esmerilhamen- to e as partículas de interesse entrem em contato e quebrem as partí- culas de interesse.

[0056] Conforme usado aqui no relatório descritivo e nas reivindi- cações, o termo "homogeneização de alta pressão" refere-se a um mé- todo de redução do tamanho de partícula, adicionando-se a partícula de interesse a um dispositivo que combina forças mecânicas e pres- são e para quebrar a partícula de interesse. As forças mecânicas usa- das na homogeneização de alta pressão podem incluir impacto, cisa- lhamento e cavitação, entre outras.

[0057] Conforme usado aqui no relatório descritivo e nas reivindi- cações, o termo "moinho criogênico" refere-se a um dispositivo ou mé- todo para reduzir o tamanho de partícula, primeiro esfriando-se uma partícula de interesse com gelo seco, nitrogênio líquido ou outro líqui- do criogênico e, subsequentemente, moendo a partícula de interesse para reduzir o tamanho.

[0058] Os termos "composições", "composições farmacêuticas", "formulações" e "preparações" são usados aqui como sinônimos e in- tercambiáveis.

[0059] O termo "clofazimina" refere-se a N,5-bis(4-clorofenil)-3-(1- metiletilimino)-5H-fenazin-2-amina em qualquer uma de suas formas,

incluindo formas não-sal e sal (por exemplo , mesilato de clofazimina), formas de ésteres, anidros e hidratos, de formas não-sal e sal, solva- tos de formas não-sal e sal, seus enantiômeros (formas R e S, que também podem ser identificadas como formas d e l) e misturas des- ses enantiômeros (por exemplo, mistura racêmica ou misturas enri- quecidas em um dos enantiômeros em relação ao outro).

[0060] "Tratar" ou tratamento de uma doença ou condição refere- se à execução de um protocolo, que pode incluir a administração de um ou mais fármacos a um paciente, em um esforço para aliviar os sinais ou sintomas da doença. Os efeitos desejáveis do tratamento in- cluem a diminuição da taxa de progressão da doença, melhoramento ou amenização do estado da doença e remissão ou prognóstico apri- morado. O alívio pode ocorrer antes que os sinais ou sintomas da do- ença ou condição apareçam, bem como após o seu aparecimento. As- sim, "tratar" ou "tratamento" podem incluir "prevenir" ou "prevenção" de doença ou condição indesejável. Além disso, "tratar" ou "tratamento" não requer alívio completo de sinais ou sintomas, não requer cura e inclui especificamente protocolos que têm apenas um efeito marginal no paciente.

[0061] O termo "benefício terapêutico" ou "terapeuticamente efi- caz", conforme usado ao longo deste pedido, refere-se a qualquer coi- sa que promova ou melhore o bem-estar do paciente em relação ao tratamento médico dessa condição. Isso inclui, mas não se limita a, uma redução na frequência ou gravidade dos sinais ou sintomas de uma doença. Por exemplo, o tratamento do câncer pode envolver, por exemplo, uma redução no tamanho de um tumor, uma redução na in- vasão de um tumor, redução na taxa de crescimento do câncer ou prevenção de metástases. O tratamento do câncer também pode se referir ao prolongamento da sobrevivência de um paciente com câncer.

[0062] "Indivíduo" e "paciente" referem-se a um humano ou não-

humano, como primatas, mamíferos e vertebrados. Em modalidades particulares, o paciente é um humano.

[0063] Como geralmente usado aqui, "farmaceuticamente aceitá- vel" refere-se aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de um julgamento médico ade- quado, adequados para uso em contato com tecidos, órgãos e/ou flui- dos corporais de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outros problemas ou complicações pro- porcionais a uma relação risco/benefício razoável.

[0064] "Sais farmaceuticamente aceitáveis" significa sais dos compostos aqui divulgados que são farmaceuticamente aceitáveis, conforme definido acima, e que possuem a atividade farmacológica desejada. Tais sais incluem sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares; ou com ácidos orgâ- nicos como ácido 1,2-etanodissulfônico, ácido 2- hidroxietanossulfônico, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 3- fenilpropiônico, 4,4'-metilenobis (ácido 3-hidróxi-2-eno-1-carboxílico), ácido 4-metilbiciclo[2.2.2]oct-2-eno-1-carboxílico, ácido acético, ácidos alifáticos mono e dicarboxílicos, ácidos sulfúricos alifáticos, ácidos sul- fúricos aromáticos, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido canforossulfônico, ácido carbônico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclopentanopropiônico, ácido etanossulfônico, ácido fumárico, ácido glucoheptônico, ácido glucônico, ácido glutâmico, ácido glicólico, ácido heptanoico, ácido hexanoico, ácido hidroxinaftoico, ácido lático, ácido laurilsulfúrico, ácido maleico, ácido málico, ácido malônico, ácido man- délico, ácido metanossulfônico, ácido mucônico, ácido o-(4- hidroxibenzoil)benzoico, ácido oxálico, ácido p- clorobenzenossulfônico, ácidos alcanoicos substituídos por fenila, áci- do propiônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido pirúvico, ácido salicíli-

co, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido terciáriobuti- lacético, ácido trimetilacético, e semelhantes. Os sais farmaceutica- mente aceitáveis também incluem sais de adição de bases que podem ser formados quando prótons ácidos presentes são capazes de reagir com bases inorgânicas ou orgânicas. As bases inorgânicas aceitáveis incluem hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de alumínio e hidróxido de cálcio. Bases orgânicas aceitáveis incluem etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N- metilglucamina e similares. Deve-se reconhecer que o ânion ou cátion particular que faz parte de qualquer sal desta invenção não é crítico, desde que o sal, como um todo, seja farmacologicamente aceitável. Exemplos adicionais de sais farmaceuticamente aceitáveis e seus mé- todos de preparação e uso são apresentados no Handbook of Phar- maceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).

[0065] Um "transportador farmaceuticamente aceitável", "transpor- tador de fármaco" ou simplesmente "transportador" é uma substância farmaceuticamente aceitável, formulada juntamente com a medicação com ingrediente ativo envolvido no transporte, liberação e/ou transpor- te de um agente químico. Os transportadores de fármaco podem ser usados para melhorar a liberação e a eficácia dos fármacos, incluindo, por exemplo, a tecnologia de liberação controlada para modular a bio- disponibilidade da fármaco, diminuir o metabolismo do fármaco e/ou reduzir a toxicidade do fármaco. Alguns transportadores de fármaco podem aumentar a eficácia da liberação de fármaco para os locais- alvo específicos. Exemplos de transportadores incluem: lipossomas, microesferas (por exemplo, feitas de ácido poli(láctico-co-glicólico), microesferas de albumina, polímeros sintéticos, nanofibras, complexos de proteína-DNA, conjugados de proteínas, eritrócitos, virossomas e dendrímeros.

[0066] O termo "derivado do mesmo/seu derivado" refere-se a qualquer polissacarídeo quimicamente modificado, em que pelo menos uma das unidades de sacarídeos monoméricos é modificada pela substituição de átomos ou grupos ou ligações moleculares. Numa mo- dalidade, um seu derivado é um sal do mesmo. Os sais são, por exemplo, sais com ácidos minerais adequados, tais como ácidos halí- dricos, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico, por exemplo cloridratos, bro- midratos, sulfatos, sulfatos de hidrogênio ou fosfatos, sais com ácidos carboxílicos adequados, como ácidos alcanoicos inferiores opcional- mente hidroxilados, por exemplo ácido acético, ácido glicólico, ácido propiônico, ácido lático ou ácido piválico, ácidos alcanodicarboxílicos inferiores opcionalmente hidroxilados e/ou oxo-substituídos, por exem- plo ácido oxálico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, pirúvico ácido, ácido málico, ácido ascórbico e também com ácidos carboxílicos aromáticos, heteroaromáticos ou ara- lifáticos, como ácido benzoico, ácido nicotínico ou ácido mandélico e sais com ácidos sulfônicos alifáticos ou aromáticos adequados ou áci- dos sulfâmicos N-substituídos, por exemplo metanossulfonatos, ben- zenossulfonatos, p-toluenossulfonatos ou N-ciclo-hexilsulfamatos (ci- clamatos).

[0067] O termo "dissolução", conforme usado aqui, refere-se a um processo pelo qual uma substância sólida, aqui os ingredientes ativos, é dispersa na forma molecular em um meio. A taxa de dissolução dos ingredientes ativos da dose farmacêutica da invenção é definida pela quantidade de substância farmacêutica que entra em solução por uni- dade de tempo sob condições padronizadas de interface líquido/sólido, temperatura e composição do solvente.

[0068] Um "ingrediente ativo" (AI) (também chamado de composto ativo, substância ativa, agente ativo, agente farmacêutico, agente, mo- lécula biologicamente ativa ou um composto terapêutico) é o ingredi-

ente em um medicamento farmacêutico biologicamente ativo. Os ter- mos similares ingrediente farmacêutico ativo (API) e princípio ativo também são usados na medicina.

[0069] Conforme usado aqui, "excipiente" refere-se a transportado- res farmaceuticamente aceitáveis que são substâncias relativamente inertes usadas para facilitar a administração ou liberação de um API em um paciente, ou usados para facilitar o processamento de um API em formulações de fármaco que podem ser usadas farmaceuticamen- te para a liberação no local de ação de um paciente. Exemplos não limitativos de excipientes incluem agentes estabilizadores, surfactan- tes, modificadores de superfície, intensificadores de solubilidade, tam- pões, agentes encapsulantes, antioxidantes, conservantes, agentes umectantes ou umectantes não iônicos, agentes de aumento de visco- sidade e agentes de aperfeiçoamento de absorção.

[0070] Conforme usado aqui, o termo "aerossóis" refere-se a dis- persões no ar de partículas sólidas ou líquidas, com tamanho de partí- cula suficientemente fino e consequentes baixas velocidades de sedi- mentação para ter relativa estabilidade no ar (vide Knight, V., Viral and Mycoplasmal Infections of the Respiratory Tract. 1973, Lea e Febiger, Phila. Pa., pp. 2). Os "aerossóis de clofazimina" consistem em clofazi- mina micronizada, essencialmente isenta de excipientes, destinada a ser entregue no trato respiratório de uma pessoa ou animal.

[0071] Conforme usado aqui, "inalação" ou "inalação pulmonar" é usado para se referir à administração de preparações farmacêuticas por inalação, de modo que elas atinjam os pulmões e, em modalidades particulares, as regiões alveolares do pulmão. Tipicamente, a inalação é através da boca, mas em modalidades alternativas pode implicar a inalação através do nariz.

[0072] Como usado aqui, "pó seco" refere-se a uma composição de partículas finas que não é suspensa ou dissolvida em um líquido aquoso.

[0073] Um "inalador de pó seco simples" refere-se a um dispositivo para a liberação da medicação ao trato respiratório, no qual a medica- ção é liberada como pó seco de maneira de uso único e dose única. Em aspectos particulares, um inalador de pó seco simples possui me- nos de 10 peças funcionais. Em alguns aspectos, o inalador de pó se- co simples é um inalador passivo, de modo que a energia de dispersão é fornecida pela força de inalação do paciente, e não pela aplicação de uma fonte de energia externa.

[0074] Um "diâmetro médio das partículas" refere-se ao diâmetro geométrico medido por difração por laser ou análise de imagens. Em alguns aspectos, pelo menos 80% das partículas por volume estão na faixa mediana do diâmetro das partículas.

[0075] Um "diâmetro aerodinâmico mediano da massa (MMAD)" refere-se ao diâmetro aerodinâmico (diferente do diâmetro geométrico) e é medido por impactação em cascata ou tempo de voo.

[0076] O termo "amorfo" refere-se a um sólido não cristalino em que as moléculas não estão organizadas em um padrão de rede defi- nido. Em alguns aspectos, menos de 10% da composição pode ser uma forma sólida amorfa de clofazimina. III. Composição de Clofazimina para Inalação

[0077] Em modalidades particulares, a presente divulgação forne- ce uma composição de clofazimina inalável (ou seu derivado ou sal farmaceuticamente aceitável). A composição de clofazimina pode ser produzida por moagem a jato de clofazimina nativa para produzir partí- culas de clofazimina cristalinas para inalação que podem ter um diâ- metro médio das partículas de 0,5 a 12 µm, como cerca de 0,5 µm a 10 µm, preferencialmente 1 µm a 6 µm e mais preferencialmente cerca de 2 a 4 µm. Ao criar partículas inaladas com uma faixa de tamanho relativamente estreita, é possível aumentar ainda mais a eficiência do sistema de liberação de fármaco e melhorar a repetibilidade da dosa- gem. Assim, é preferível que as partículas não apenas tenham um ta- manho na faixa de 0,5 µm a 12 µm ou 2 µm a 6 µm ou cerca de 0,75 a 4 µm, mas que o tamanho médio das partículas esteja dentro de uma faixa estreita, de modo que 80% ou mais partículas na formulação te- nha um diâmetro de partícula que está dentro de ± 20% do tamanho médio das partículas, preferencialmente ± 10% e mais preferencial- mente ± 5% do tamanho médio das partículas. O diâmetro médio das partículas pode estar na faixa de 0,5 a 8 µm, 0,75 a 5 µm, 0,5 a 4 µm, 0,75 a 4 µm, 0,75 a 3 µm 1 a 3 µm ou 1,5 a 3 µm. Em alguns aspectos, as partículas cristalinas (por exemplo, nanopartículas) dessas faixas de tamanho, como 2 a 4 µm, podem formar agregados que são maio- res em tamanho, mas podem ser medidas usando difração a laser pa- ra compreender partículas dentro das faixas acima.

[0078] Em alguns aspectos, as partículas podem estar em um an- tissolvente e medidas usando uma difração a laser sob agitação leve para determinar o diâmetro médio das partículas. Em outros aspectos, o diâmetro médio das partículas pode ser medido com as partículas dispersas como um pó seco usando um sistema dispersor (por exem- plo, Sympatec Rodos) usando cisalhamento máximo.

[0079] A composição de clofazimina pode estar na forma cristalina. As moléculas de clofazimina cristalina estão dispostas em uma estru- tura altamente organizada, regular e repetitiva, estendendo-se em to- das as direções. A clofazimina cristalina pode ter menos de 10% de partículas amorfas. Em modalidades particulares, a clofazimina crista- lina pode não ter partículas amorfas. Em algumas modalidades, a quantidade de clofazimina amorfa na clofazimina cristalina pode estar entre 0 a 10%, 0,1 a 10%, 0,1 a 5%, 1a 10% ou 1 a 5%. As composi- ções cristalinas podem dissolver-se lentamente devido à sua natureza altamente ordenada.

[0080] A composição de clofazimina inalável pode compreender um único ingrediente ativo (por exemplo, clofazimina) e, assim, pode estar livre de qualquer outro ingrediente ativo. A composição pode ser de pelo menos 90%, como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de clofazimina.

[0081] Em modalidades particulares, a composição inalável de clofazimina aqui fornecida é essencialmente livre de excipientes e adi- tivos. Em aspectos particulares, a presente composição está livre de quaisquer excipientes adicionados. A presente composição de clofa- zimina pode compreender menos de 10%, como menos que 5%, es- pecificamente menos que 1%, particularmente menos que 0,1%, como menos que 0,01%, de ciclodextrina, glicose anidra, lactose anidra, lac- tose monohidratada, manitol, monossacarídeos, dissacarídeos, oligos- sacarídeos, brometo de aclidínio, fumaril-dicetopiperazina, estearato de magnésio, acetato de celubiose, água, etanol, álcool isopropílico, L- leucina, dextrano, quitosana, quitosana desacetilada, ácido ascórbico, ácido esteárico, plurônico F-68, plurônico F-127, desoxicolato, mo- noestearato de glicerila, fosfatidilcolina de soja, poloxamer 188, Preci- rol ATO5, Capriol-90, ácido láurico, EDTA cálcio-dissódico, poli(álcool vinílico), desoxicolato de sódio, tripolifosfato de sódio, lecitina, álcool cetílico, polivinilpirrolidona, policaprolactona, dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilglicerol, Lactohale 300M, Farmatose 150M, álcool terc-butílico, desoxicolato de sódio, poli(ε-caprolactona), colesterol, diclorometano, dextrano enxertado com estearilamina, dipalmitoilfosfa- tidilcolina, alginato de sódio, Compritol 888, tristearina, ciclodextrina, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxipropil celulose, etil celulose, sílica, povidona, amido, polietileno glicol, carbômero, poli(ácido lático), po- li(ácido D,L-láctico-co-glicólico), hidroxipropilcelulose, carboximetilcelu- lose de sódio, metacrilato de polimetila, acroleína, metacrilato de glici- dila, lactidos, poli(alquil cianoacrilato), polianidretos, poli(ácido D,L-

láctico-co-glicólico), poli(acril) dextrano, poli(acril) amido, carragenina e gelatina.

[0082] Modalidades adicionais fornecem métodos de produção da composição inalável de clofazimina aqui fornecida. A clofazimina nati- va (por exemplo, a clofazimina comercialmente disponível) pode ser submetida à moagem, como moagem a jato, principalmente moagem a jato de ar, para produzir a composição de clofazimina inalável livre de excipiente aqui fornecida. Moinhos a jato de ar exemplares que podem ser usados nos presentes métodos incluem, mas não se limitam, ao moinho de energia de fluidos Aljet, ao moinho Jet Pulverizer Micron- Master e ao Sturtevant Micronizer Jet Mill.

[0083] Em um método exemplar, a clofazimina nativa pode ser mi- cronizada usando um moinho a jato de ar Aljet em escala de laborató- rio (Model 00 Jet-O-Mizer™, Fluid Energy, Telford, PA), para uma dis- tribuição de tamanho de partícula dentro da faixa respirável de 0,5 a 5 µm. O moinho a jato de ar pode ser ajustado a uma pressão de moa- gem de cerca de 70 a 80 PSI, como 75 PSI, uma pressão de alimenta- ção de cerca de 60 a 70 PSI, como 65 PSI, e uma taxa de alimentação de cerca de 0,5 a 2 grama/minuto , como cerca de 1 grama/minuto. Aproximadamente 1 a 20, como 5 a 10, particularmente 3 a 4,5 gra- mas de CFZ podem ser moídos por lote. A distribuição geométrica do tamanho de partícula para cada lote moído pode ser avaliada com um instrumento de difração a laser, como um instrumento de difração a laser HELOS (Sympatec GmbH, Alemanha) usando dispersão RODOS a 3 a 4 Bar. As medições podem ser realizadas a cada 10 ms após a dispersão do pó. Medições que estão entre 5 a 25% de densidade óp- tica podem ser calculadas para determinar a distribuição do tamanho de partícula. IV. Métodos de Uso

[0084] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para o tratamento ou prevenção de uma infecção pulmonar compreendendo a administração da composição de clofazimina inalá- vel fornecida aqui. A infecção pode ser, mas não está limitada a, Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis resistente a múltiplos fármacos (multirresistente), M. tuberculosisextensivamente resistente a fármacos, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium abscesses, Mycobacterium kansasii, Staphylococcus aureus, e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Em algumas modalidades, o tratamento pode ser profilático para pacientes em risco de desenvolver uma infecção pulmonar, como pacientes com um membro da família diagnosticado com uma infecção pulmonar, pacientes que viajam para áreas com altas taxas de infecção pulmonar ou profissionais de saúde.

[0085] A presente divulgação fornece ainda métodos de tratamen- to, redução ou prevenção de uma inflamação pulmonar através da administração da composição de clofazimina inalável aqui fornecida. Por exemplo, os métodos podem ser aplicados a pacientes com dis- túrbios respiratórios, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica e fibrose cística. O distúrbio respiratório, no contexto da presente in- venção, inclui, mas não está limitado a, asma, enfisema, bronquite, COPD, sinusite, depressão respiratória, síndrome da disfunção reativa das vias aéreas (RADS), síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), asma induzida por irritante, asma ocupacional, hiper- reatividade sensorial, inflamação das vias aéreas (ou pulmonares), sensibilidade química múltipla e auxílio na terapia de cessação do ta- bagismo. O termo "asma" pode se referir a asma aguda, asma crônica, asma intermitente, asma persistente leve, asma persistente moderada, asma persistente grave, asma persistente crônica, asma leve a mode- rada, asma persistente leve a moderada, asma persistente crônica le- ve a moderada, asma alérgica (extrínseca), asma não alérgica (intrín- seca), asma noturna, asma brônquica, asma induzida por exercício,

asma ocupacional, asma sazonal, asma silenciosa, asma gastroesofá- gica, asma idiopática e asma variante da tosse.

[0086] Em outras modalidades, são fornecidos métodos para o tra- tamento de câncer de pulmão, como uma redução na inflamação do pulmão, através da administração da composição de clofazimina inalá- vel aqui fornecida. Em outra modalidade, a composição de clofazimina inalável é administrada para servir como um agente de contraste.

[0087] Em algumas modalidades, o tratamento de um paciente com clofazimina micronizada pode compreender liberação modulada de fármaco. Em algumas modalidades, a clofazimina micronizada po- de ser formulada para liberação lenta ou retardada. Em algumas mo- dalidades, a clofazimina micronizada pode ser formulada para libera- ção rápida. Em outras modalidades, a clofazimina micronizada pode ser formulada para liberação lenta e rápida (por exemplo, perfil de libe- ração dupla).

[0088] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para a administração da composição de clofazimina inalável aqui fornecida. A administração pode ser, mas não está limitada, à ina- lação de clofazimina micronizada usando um inalador. Em algumas modalidades, um inalador é um inalador de pó seco passivo simples (DPI), como um Plastiape RSO1 monodose DPI. Em um inalador de pó seco simples, o pó seco é armazenado em uma cápsula ou reser- vatório e fornecido aos pulmões por inalação sem o uso de propulso- res.

[0089] Em alguns aspectos, o quociente de vazão inspiratório ne- cessário para o uso de um inalador pode ser inferior a 95 L/min, como cerca de 90 L/min, como entre cerca de 15 a 90 L/min, preferencial- mente cerca de 30 L/min. Em algumas modalidades, a aerossolização eficiente da clofazimina micronizada é independente da força inspirató- ria.

[0090] Em algumas modalidades, um inalador é um DPI de dose única, como um DoseOne™, Spinhaler, Rotohaler®, Aerolizer® ou Handihaler. Em algumas modalidades, um inalador é um DPI multido- se, como um Plastiape RS02, Turbuhaler®, Twisthaler™, Diskhaler®, Diskus®, ou Ellipta™. Em algumas modalidades, o inalador é Twin- cer®, Orbital®, TwinCaps®, Powdair, Cipla Rotahaler, DP Haler, Revo- lizer, Multi-haler, Twister, Starhaler, ou Flexhaler®. Em algumas moda- lidades, um inalador é um DPI de plurimonodose para a liberação si- multânea de doses únicas de vários medicamentos, como um DPI de plurimonodose de Plastiape RS04. Os inaladores de pó seco têm me- dicamentos armazenados em um reservatório interno e os medica- mentos são liberados por inalação com ou sem o uso de propulsores. Os inaladores de pó seco podem exigir um quociente de vazão inspira- tório superior a 30 L/min para uma liberação eficaz, como entre cerca de 30 a 120 L/min. Em algumas modalidades, a aerossolização efici- ente da clofazimina micronizada é independente da força inspiratória. Em algumas modalidades, o inalador de pó seco tem uma resistência ao fluxo entre 0,01 kPa0,1min/L e 0,06 kPa0,5min/L, como entre 0,02 kPa0,5min/L e 0,04 kPa0,5min/L.

[0091] Em algumas modalidades, a clofazimina inalável é forneci- da como uma formulação propulsora, como propulsores HFA ou QNasl.

[0092] Em algumas modalidades, o inalador pode ser um inalador dosimetrado. Os inaladores dosimetrados liberam uma quantidade definida de medicação aos pulmões em uma pequena rajada de medi- camento em aerossol auxiliado pelo uso de propulsores. Os inaladores dosimetrados compreendem três partes principais: um recipiente, uma válvula dosadora e um acionador. A formulação da medicação, inclu- indo os propulsores e quaisquer excipientes necessários, são armaze- nados no recipiente. A válvula de medição permite dispensar uma quantidade definida da formulação da medicação. O acionador do ina- lador dosimetrado, ou bocal, contém o bico de descarga de acopla- mento e tipicamente inclui uma tampa de proteção contra poeira para evitar contaminação.

[0093] Em algumas modalidades, um inalador é um nebulizador. Um nebulizador é usado para fornecer a medicação na forma de uma névoa em aerossol inalada nos pulmões. A formulação da medicação deve ser aerossolizada por gás comprimido ou por ondas ultrassôni- cas. Um nebulizador a jato é conectado a um compressor. O compres- sor emite gás comprimido através de uma formulação da medicação líquida em alta velocidade, fazendo a formulação da medicação aeros- solizar. A medicação aerossolizada é então inalada pelo paciente. Um nebulizador de ondas ultrassônicas gera uma onda ultrassônica de alta frequência, causando a vibração de um elemento interno em contato com um reservatório de líquido da formulação da medicação, fazendo a formulação da medicação aerossolizar. A medicação aerossolizada é então inalada pelo paciente. Um nebulizador pode usar um quociente de vazão entre cerca de 3 a 12 L/min, tal como cerca de 6 L/min. Em algumas modalidades, o nebulizador é um nebulizador de pó seco.

[0094] Em algumas modalidades, a composição pode ser adminis- trada em um cronograma de rotina. Como usado aqui, um cronograma de rotina refere-se a um período de tempo designado predeterminado. O cronograma de rotina pode abranger períodos de tempo idênticos ou diferentes, desde que o cronograma seja predeterminado. Por exem- plo, o cronograma de rotina pode envolver a administração duas vezes por dia, todos os dias, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, semanalmente, mensalmente ou qualquer número definido de dias ou semanas entre as mesmas. Alternativamente, o esquema de rotina predeterminado pode envolver a administração duas vezes ao dia durante a primeira semana, segui-

da por uma base diária por vários meses, etc. Em algumas modalida- des, a clofazimina é administrada uma vez por dia. Nas modalidades preferidas, a clofazimina é administrada menos de uma vez por dia, tal como em dias alternados, de três em três dias ou uma vez por sema- na. Em algumas modalidades, uma dose completa de clofazimina está entre 1 a 100 mg, tais como 20 a 100, 50 a 100, 10 a 20, 20 a 40, 50 a 70, ou 80 a 90 mg.

[0095] Em algumas modalidades, a clofazimina pode ser fornecida numa forma de dosagem unitária, tal como numa cápsula, num blíster ou num cartucho, em que a dose unitária inclui pelo menos 10 mg de clofazmina, tais como pelo menos 15 mg ou 20 mg de clofazimina por dose. Em aspectos específicos, a forma de dosagem unitária não compreende a administração ou a adição de qualquer excipiente e é apenas usada para segurar o pó para inalação (isto é, a cápsula, o blíster ou o cartucho não são administrados). Em algumas modalida- des, a clofazimina pode ser administrada numa dose emitida elevada, tal como pelo menos 10 mg, preferencialmente pelo menos 15 mg, ainda mais preferencialmente 20 mg. Em algumas modalidades, a ad- ministração de clofazimina micronizada resulta numa dose de partícu- las finas elevada no pulmão profundo, tal como superior a 5 mg. De preferência, a dose de partículas finas no pulmão profundo é de pelo menos 10 mg, ainda mais preferencialmente de pelo menos 15 mg. Em alguns aspectos, a dose de partículas finas é de, pelo menos, 50%, como pelo menos 60, 65, 70, 75 ou 80% da dose emitida.

[0096] Em algumas modalidades, as mudanças na queda de pres- são através do dispositivo resultam em uma mudança na dose emitida. Em algumas modalidades, mudanças na queda de pressão através do dispositivo de 3 kPa, como a partir de 4 kPa a 1 kPa, resultam em uma redução de dose emitida inferior a 25%, como 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%,

8%, 7%, 6%, 5% ou menos. Em algumas modalidades, mudanças na queda de pressão de inalação através do dispositivo resultam numa mudança na dose de partículas finas. Em algumas modalidades, mu- danças na queda de pressão de inalação no dispositivo de 3 kPa, tais como de 4kPa a 1 kPa, resultam numa redução da dose de partículas finas de menos de 15%, tais como 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% ou menos.

[0097] Em algumas modalidades, a taxa de dissolução da clofazi- mina é medida. Em algumas modalidades, a clofazimina cristalina tem uma taxa de dissolução lenta. Em algumas modalidades, a taxa de dissolução da clofazimina é tal que não mais de 30%, como menos de 25, 20, 15, ou 10%, da clofazimina por massa dissolve-se em meio de dissolução dentro de 15 minutos após a adição. Em algumas modali- dades, o meio de dissolução é solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 + polissorbato 80 a 0,2%.

[0098] Em algumas modalidades, a clofazimina é internalizada pe- las culturas de macrófago J774.A1. Em algumas modalidades, a clofa- zimina é cristalina. Em algumas modalidades a clofazimina é microni- zada. Em algumas modalidades, as partículas cristalinas micronizadas de clofazimina são internalizadas pelas culturas de macrófago J774.A1. Em outras modalidades, a taxa de internalização das partícu- las pelos macrófagos é alta, tal como internalização superior a 80% após 8 horas de incubação. Em algumas modalidades, os macrófagos transformam a clofazimina numa forma diferente similar à cristalina. Em algumas modalidades, a mudança na forma cristalina da clofazimi- na é detectada por uma mudança de fluorescência. Em algumas mo- dalidades, a mudança de fluorescência é de cerca de 590 nm para cerca de 660 nm. Em algumas modalidades, a mudança de fluores- cência ocorre em um curto espaço de tempo. Em algumas modalida- des, a mudança de fluorescência ocorre dentro de 1 semana, como em 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias 3 dias, 2 dias, ou dentro de 24 horas.

[0099] Em algumas modalidades, os métodos de tratamento aqui fornecidos podem incluir a administração de, pelo menos, um segundo agente terapêutico. O segundo agente pode ser, mas não se limita a, bedaquilina, pirazinamida, inibidores do ácido nucleico, inibidores de síntese de proteína e inibidores de envelope celular. O grupo de inibi- dores de síntese de proteína do grupo pode incluir, mas não se limita a, linezolida, claritromicina, amicacina, canamicina, capreomicina e estreptomicina. O grupo de inibidores de envelope celular do grupo pode incluir, mas não se limita a, etambutol, etionamida, tioacetizona, isoniazida, imipenem, clavulanato, cicloserina, terizidona, amoxicilina e protionamida. O grupo de inibidores de ácido nucleico pode incluir, mas não se limita a, rifampicina, rifabutina, rifapentina, ácido 4- aminosalicílico, moxifloxacina, ofloxacina e levofloxacina. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico pode ser a clofazimina. Outros agentes exemplares incluem, mas não se limitam, à vancomici- na, tobramicina, ciprofloxacina, fosfomicina e rifaximina. As terapias combinadas podem ser administradas simultaneamente, sequencial- mente ou separadamente.

[00100] Outros objetos, características e vantagens da presente in- venção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem certas modalidades da invenção, são dados apenas a título ilustrativo, uma vez que várias mudanças e mo- dificações dentro do espírito e escopo da invenção serão evidentes para os técnicos no assunto a partir desta descrição detalhada. IV. Exemplos

[00101] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar mo- dalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado pelos técnicos no assunto que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir repre-

sentam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prá- tica da invenção e, portanto, podem ser consideradas como modos preferidos para a sua prática. No entanto, os técnicos no assunto de- vem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças po- dem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e, ain- da, obter um resultado similar ou semelhante sem se afastar do espíri- to e escopo da invenção. Exemplo 1 – Materiais e Métodos

[00102] Micronização da clofazimina: Um moinho a jato de ar Aljet em escala de laboratório (também conhecido como Model 00 Jet-O- Mizer™, Fluid Energy, Telford, PA) foi usado para micronizar clofazi- mina (Sigma; Lot: SLBL8945V) a uma distribuição de tamanho de par- tícula dentro do intervalo respirável de 0,5 a 5 µm. Foi usado gás ni- trogênio a uma pressão de moagem de 75 PSI e uma pressão de ali- mentação de 65 PSI, em conjunto com uma taxa de alimentação de matéria sólida de 1 grama/min. A distribuição geométrica das partícu- las para cada lote moído foi avaliada com um instrumento de difração laser HELOS (Sympatec GmbH, Alemanha) usando dispersão de RO- DOS a 3 Bar. Foram feitas medições a cada 10 mseg após dispersão do pó. Medições que foram entre 5 a 25% de densidade óptica foram calculadas na média para determinar a distribuição de tamanho das partículas.

[00103] Microscopia eletrônica de varredura da clofazimina mi- cronizada: Para analisar a morfologia da clofazimina moída, as amos- tras foram montadas em "stubs" de alumínio SEM e revestidas por pul- verização com 12 nm de platina/paládio (Pt/Pd) usando um revestidor por pulverização de Cressington 208 HR (Cressington Scientific Ins- truments Ltd., Watford, UK). O registro da imagem foi realizado usando uma Zeiss Supra 40VP SEM (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha). Examinaram-se as partículas não dispersas e partículas dispersas usando o dispersor RODOS a 3 Bar.

[00104] Cristalografia de difração de raios-x e calorimetria de varredura diferencial: A presença de cristalinidade e transformação polimorfa na clofazimina moída foi determinada usando difração em pó de raios-x (XRD) e calorimetria de varredura diferencial (DSC). Difrac- togramas unidimensionais de pó de clofazimina moída e não moída foram obtidos usando um Rigaku MiniFlex 600 II (Rigaku Corporation, Tóquio, Japão), controlado pelo software Rigaku Guidance e configu- rado para uma radiação alvo de cobre a uma voltagem de 40 KV e cor- rente de 40 mA. Difractogramas foram analisados usando Jade (Raga- ku Corporation, Tóquio, Japão). Os termogramas de clofazimina moída e não moída foram obtidos usando um Auto Q20 DSC controlado pelo software TA Advantage e equipado com um sistema de arrefecimento refrigerado RCS40 (TA Instruments-Waters LLC, New Castle, DE, EUA) com purga de nitrogênio de 50 mL/min. Foram carregados apro- ximadamente 4 mg de cada amostra em panelas DSC padrão (DSC Consumables Inc., Austin, MN, EUA) e foram frisados usando uma prensa de amostra Tzero (TA Instruments-Waters LLC, New Castle, DE, EUA). As amostras foram aquecidas a uma taxa de 5°C/min, de 30°C a 300°C.

[00105] Análise da área de superfície específica da clofazimina moída livre de excipiente:

[00106] A área de superfície específica da clofazimina moída foi avaliada utilizando uma unidade de adsorção de gás Monosorb (Quan- tachrome Instruments). Três amostras foram carregadas em células de medição de vidro e deixadas desgaseificar sob hélio a 80°C por 18 ho- ras. Usando o método Brauner Emmett Teller (BET) de ponto único e 30 mol de fração de nitrogênio em hélio como adsorvido, foi calculada a área de superfície de cada amostra. Para determinar a área de su- perfície específica, a área de superfície foi dividida pelo peso da amos-

tra após desgaseificação.

[00107] Análise da densidade da clofazimina moída livre de ex- cipiente: Para avaliar a densidade aparente e derivada de clofazimina moída livre de excipiente, calibrou-se um tubo de ensaio de vidro para 0,25 mL usando-se uma pipeta. O tubo foi preenchido com um volume correspondente a uma marca de calibração de 2 a 3 mL e depois pe- sado para se obter a densidade aparente. O tubo foi então explorado 10 vezes e o volume foi novamente medido para obter a densidade derivada.

[00108] Análise de ângulo de repouso da clofazimina moída li- vre de excipiente: Para avaliar o ângulo de repouso da clofazimina moída livre de excipiente, aproximadamente 500 a 800 mg de clofazi- mina moída foi vertida a partir de um funil colocado a aproximadamen- te 4,5 cm acima de um cilindro aberto, oco, com um raio de 1,25 cm e uma altura de 1,2 cm. A altura do cone resultante do pó derramado foi determinada usando o software de análise de imagem Image J. Três alturas de cone foram obtidas e calculada a média para o ângulo final da determinação de repouso. O ângulo de repouso foi calculado de acordo com a equação abaixo: altura

[00109] Determinação do desempenho da aerossolização da clofazimina moída livre de excipiente: Foram realizados testes de desempenho aerodinâmico in vitro usando uma Monodose RS01 DPI de baixa resistência Model 7 e uma Monodose RS01 DPI de alta resis- tência, da Plastiape S.p.a (Osnago, Itália). As cápsulas de tamanho 3 da hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) foram fornecidas pela Capsugel Inc. (Morristown, New Jersey, EUA). A resistência da RS01 Monodose DPI de baixa resistência usada nos estudos de impactação em casca- ta foi determinada usando uma unidade de amostragem de dose de acordo com o aparelho B do USP chapter 601, e calculada em 0,021 kPa0,5min/L. A resistência do RS01 Monodose DPI de alta resistência usado nos estudos de impactação em cascata foi relatada como sendo de 0, 036 kPa0,5min/L (Elkins, Anderson et al. 2014). Foram realizados estudos de impactação em cascata para a clofazimina moída no Next Generation Impactor (NGI) (MSP Corporation, MN, EUA). Os diâme- tros de corte do estágio 1 a 7 foram determinados usando a equação 1 e os diâmetros de corte de MOC foram determinados usando a equa- ção 2.

em que D50,Q é o diâmetro de corte no quociente de vazão, Q, e o subscrito, n, refere-se ao valor de referência arquivística para Qn = 60 L/min, e os valores para o expoente, x, foram determinados pelos cál- culos de quociente de vazão de tamanho de corte de estágio NGI ar- quivístico, determinados por Marple et al. Para reduzir o salto e o rear- rastamento das partículas, as placas NGI foram revestidas com óleo de silício de 1% (v/v) em hexano e deixadas secar. Para determinar a influência da dimensão das partículas no desempenho aerodinâmico da clofazimina moída, foi realizada uma análise com base na baixa resistência RS01 DPI nas partículas moídas obtidas especificamente a partir do segundo lote moído. Duas populações diferentes de partícu- las foram testadas: aquelas com um diâmetro geométrico médio (D50) de 2,69 µm (CFZ2,69µm), derivadas da unidade de ciclone do moinho a jato (Figura 1) e partículas moídas com um D50 de 1,81 µm (CFZ1,81µm), derivadas da unidade de recipiente de coleta do moinho a jato (Figura 1). Impactação em cascata foi realizada nestas amostras em queda de pressão de 4 kPa (equivalente a 93 L/min no dispositivo

RS01 de baixa resistência e equivalente a 55,6 L/min no dispositivo RS01 de alta resistência) em um período de tempo suficiente para ex- trair 4 litros de ar através do aparelho (equivalente a 2,6 segundos no dispositivo RS01 de baixa resistência e 4,3 segundos no dispositivo RS01 de alta resistência). Para determinar a dependência do quocien- te de vazão da dispersão de clofazimina moída, a impactação em cas- cata também foi realizada em partículas CFZ1.81µm a uma queda de pressão de 1 kPa através do dispositivo (equivalente a 47 L/min) du- rante um período de 5,1 segundos. Para comparar o desempenho da clofazimina moída em aerossol no dispositivo RS01 de baixa resistên- cia versus o dispositivo RS01 de alta resistência, foram usadas amos- tras de clofazimina a partir de um lote moído com um tamanho médio de partícula de volume de 2,44 µm (como medido usando-se uma uni- dade de difração laser Sympatec com dispersão a seco RODOS a uma pressão de 4 Bar e analisados usando software HELOS versão

5.6.0.0 com um modelo HRLD para determinar a distribuição de tama- nho de partícula). O pó disperso resultante foi colhido da cápsula, do inalador, do adaptador, da porta de indução, dos estágios 1 a 7 e do micro-orifício coletor (MOC) por lavagem com etanol ou álcool isopro- pílico. A massa de fármaco em cada amostra foi quantificada medindo- se a absorvância de UV em um comprimento de onda de 480 nm usando um leitor de microplacas multimodo Tecan Infinite M200 PRO (Tecan Systems, Inc., San Jose, CA, EUA). A fração emitida (EF) foi calculada como o fármaco total emitido pelo dispositivo em percenta- gem da massa total do fármaco colhido. A fração de partículas finas (<5 µm) (FPF5µm/EF) e a fração de partículas finas (<3 µm) (FPF3µm/EF) correspondiam à percentagem da dose emitida prevista para ter o di- âmetro aerodinâmico inferior a 5 µm e 3 µm. Os valores FPF5µm/EF, e FPF3µm/EF foram interpolados a partir de um gráfico com a percentagem cumulativa da dose emitida depositada a jusante de um estágio NGI como a ordenação e o tamanho do corte de partículas desse estágio como a abscissa. Para cada amostra, o diâmetro aerodinâmico media- no da massa (MMAD), que representa o ponto médio baseado na massa da distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica (APSD), e o desvio padrão geométrico (GSD), que representa a propagação da APSD, foram determinados plotando-se a porcentagem cumulativa de massa menor que o tamanho de corte aerodinâmico declarado (ex- presso como Probits)contra o diâmetro aerodinâmico (escala logarít- mica). As distribuições estavam log normal. Foi realizada uma regres- são linear para determinar os diâmetros aerodinâmicos corresponden- tes ao percentil de 50% (Probit 5) para determinar o MMAD, e os diâ- metros aerodinâmicos correspondentes ao percentil de 15,87% (Probit 4) e percentil de 84,13% (Probit 6) para calcular o GSD.

[00110] Determinação do desempenho da aerossolização da clofazimina moída misturada com lactose: A clofazimina moída, compreendendo um tamanho médio de partícula de 2,44 µm, medida usando um difrator a Laser Sympatec com dispersão de RODOS à pressão de 4 Bar, foi misturada com lactose Inhalac 230 (Meggle Pharma), relatada como tendo um tamanho médio de partícula de 70 a 110 µm. 135 mg de clofazimina moída foram misturados com 15 mg de lactose através de um processo de espatulação dentro de um frasco de cintilação em vidro. A lactose foi adicionada primeiro, e a CFZ foi incorporada através de um processo de diluição geométrica. Foram colhidas 5 amostras para avaliar a homogeneidade da mistura e a po- tência média da clofazimina na mistura foi de 86,5% p/p. Foram reali- zados testes de desempenho aerodinâmico in vitro usando uma Mo- nodose RS01 DPI de baixa resistência Model 7, da Plastiape S.p.a (Osnago, Itália). As cápsulas de tamanho 3 da hidroxipropilmetilcelulo- se (HPMC) foram fornecidas pela Capsugel Inc. (Morristwon, New Jer- sey, EUA). A resistência da RS01 Monodose DPI usada nos estudos de impactação em cascata foi determinada usando uma unidade de amostragem de dose de acordo com o aparelho B do USP chapter 601, e calculada em 0,021 kPa0,5min/L. Foram realizados estudos de impactação em cascata para a clofazimina moída no Next Generation Impactor (NGI) (MSP Corporation, MN, EUA). Os diâmetros de corte do estágio 1 a 7 foram determinados usando a equação 1 e os diâme- tros de corte de MOC foram determinados usando a equação 2.

em que D50,Q é o diâmetro de corte no quociente de vazão, Q, e o subscrito, n, refere-se ao valor de referência arquivística para Qn = 60 L/min, e os valores para o expoente, x, foram determinados pelos cál- culos de quociente de vazão de tamanho de corte de estágio NGI ar- quivístico, determinados por Marple et al. Para reduzir o salto e o rear- rastamento das partículas, as placas NGI foram revestidas com óleo de silício de 1% (v/v) em hexano e deixadas secar. Para determinar a influência da dimensão das partículas no desempenho aerodinâmico da clofazimina moída, procedeu-se a uma análise das partículas moí- das obtidas especificamente a partir do segundo lote moído. Duas po- pulações diferentes de partículas foram testadas: aquelas com um di- âmetro geométrico médio (D50) de 2,69 µm (CFZ2,69µm), derivadas da unidade de ciclone do moinho a jato (Figura 1) e partículas moídas com um D50 de 1,81 µm (CFZ1,81µm), derivadas da unidade de recipi- ente de coleta do moinho a jato (Figura 1). A impactação em cascata foi realizada nestas amostras a uma queda de pressão de 4 kPa (equi- valente a 93 L/min no dispositivo RS01 de baixa resistência) durante um período de tempo suficiente para extrair 4 litros de ar através do aparelho (2,6 segundos). O pó disperso resultante foi colhido da cáp-

sula, do inalador, do adaptador, da porta de indução, do pré- separador, dos estágios 1 a 7 e do micro-orifício coletor (MOC) por la- vagem com álcool isopropílico. A massa de fármaco em cada amostra foi quantificada medindo-se a absorvância de UV em um comprimento de onda de 480 nm usando um leitor de microplacas multimodo Tecan Infinite M200 PRO (Tecan Systems, Inc., San Jose, CA, EUA). A fra- ção emitida (EF) foi calculada como o fármaco total emitido pelo dis- positivo em percentagem da massa total do fármaco colhido. A fração de partículas finas (<5 µm) (FPF5µm/EF) e a fração de partículas finas (<3 µm) (FPF3µm/EF) correspondiam à percentagem da dose emitida prevista para ter o diâmetro aerodinâmico inferior a 5 µm e 3 µm. Os valores FPF5µm/EF, e FPF3µm/EF foram interpolados a partir de um gráfico com a percentagem cumulativa da dose emitida depositada a jusante de um estágio NGI como a ordenação e o tamanho do corte de partí- culas desse estágio como a abscissa. Para cada amostra, o diâmetro aerodinâmico mediano da massa (MMAD), que representa o ponto médio baseado na massa da distribuição de tamanho de partícula ae- rodinâmica (APSD), e o desvio padrão geométrico (GSD), que repre- senta a propagação da APSD, foram determinados plotando-se a por- centagem cumulativa de massa menor que o tamanho de corte aero- dinâmico declarado (expresso como Probits)contra o diâmetro aerodi- nâmico (escala logarítmica). As distribuições estavam log normal. Foi realizada uma regressão linear para determinar os diâmetros aerodi- nâmicos correspondentes ao percentil de 50% (Probit 5) para determi- nar o MMAD, e os diâmetros aerodinâmicos correspondentes ao per- centil de 15,87% (Probit 4) e percentil de 84,13% (Probit 6) para calcu- lar o GSD.

[00111] Captação de macrófagos da clofazimina moída: Os ma- crófagos murinos J774.A1 foram cultivados em Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), complementados com 10% de soro fetal bovi-

no (FBS), 1% de penicilina e 1% de estreptomicina. As células foram mantidas a 5% de CO2 a 37°C. A passagem foi realizada antes das células atingirem 80% de confluência.

[00112] Para determinar a toxicidade da clofazimina moída em comparação com a clofazimina solubilizada, foi realizado um ensaio MTT. As células J774.A1 foram banhadas em uma placa de 96 poços a 104 células/poço em replicados de seis e deixadas crescer por 24 horas. Foram adicionadas às células concentrações variáveis (5 µm, 10 µm, 20 µm) de partículas solubilizadas ou moídas, e as células fo- ram incubadas durante 24 horas. Os tratamentos com a clofazimina solubilizada foram feitos dissolvendo-se a clofazimina em DMSO e di- luindo de acordo com a concentração comum. Não mais que 0,4% de DMSO foi adicionado às células para reduzir qualquer efeito tóxico do DMSO nas células. Os tratamentos com clofazimina moída foram fei- tos através da suspensão de partículas moídas em PBS, com sonifica- ção durante 5 minutos para assegurar a dispersão, e diluição em con- formidade. Após 24 horas de exposição, os tratamentos de fármaco foram removidos e as células foram incubadas com uma solução de reagente MTT (0,5 mg/mL em meio sem fenol) durante 1 hora a 37°C e 5% de CO2. Tudo, exceto 25 µL do reagente MTT foi então aspirado e 50 µl de DMSO foram adicionados para solubilizar as células. A pla- ca foi lida com espectrofotômetro (Infinite M200, Tecan) a 540 nm. A absorvância das células tratadas foi normalizada com os controles po- sitivos das células tratadas apenas com PBS ou DMSO.

[00113] Para avaliar a taxa de fagocitose da clofazimina moída, os macrófagos J774.A1 foram registrados em imagens em vários pontos de tempo após a exposição ao fármaco. As células foram semeadas em prato com fundo de vidro de 35 mm com 3x105 células e foram dei- xadas crescer por 24 horas, momento no qual foram adicionadas par- tículas de clofazimina D501,90µm (derivadas da região do recipiente de coleta do moinho Aljet) e partículas de clofazimina de D502,83µm (deri- vadas da região de ciclone do moinho Aljet). Os tratamentos medica- mentosos foram preparados como descrito para o ensaio MTT. Todos os grupos de tratamento foram adicionados aos macrófagos a uma concentração de 20 µg/mL. Imagens de Brightfield foram tiradas em um EVOS XL Core Imaging System (Thermo Fisher Scientific; Wal- tham, MA) com ampliação de 40X. As imagens do ponto de tempo fo- ram obtidas às 0,5 horas, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas e 24 horas de exposição ao fármaco. Pelo menos 6 imagens foram obti- das em cada ponto de tempo. Foi realizada uma contagem manual de partículas de clofazimina dentro das células e fora das células para determinar a taxa de captação das partículas, com pelo menos 540 células contadas em cada ponto de tempo. Uma curva foi ajustada aos dados usando Excel (Microsoft Corporation).

[00114] Quantificação por citometria de fluxo da clofazimina: Para quantificar a captação macrófaga da clofazimina e avaliar a bio- transformação intracelular da clofazimina moída em cristais líquidos, foi realizada citometria de fluxo. A configuração experimental para a citometria de fluxo foi semelhante ao experimento de microscopia. Grupos de tratamento consistiram de clofazimina solubilizada, clofazi- mina não moída, partículas de clofazimina D501,90µm (média de tama- nho; derivadas de região do recipiente de coleta do moinho Aljet) e partículas de clofazimina D502,83µm (média de tamanho; derivadas da região de ciclone do moinho Aljet), bem como grupos de controle que continha PBS ou DMSO. Após 24 horas de exposição ao fármaco, o meio contendo o fármaco foi removido e as células foram suspensas em 1 mL de PBS para análise. Um Citômetro de Fluxo Accuri SORP (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) equipado com um laser de 551 nm foi usado para analisar células com base na presença de clofazimina en- golida. A triagem foi realizada tanto em um passa-faixa de 610/20 bp

(correspondente à forma triclínica de clofazimina) quanto em 660/20 bp (correspondente à forma de cristal líquido de clofazimina). Um cito- grama baseado na dispersão da luz em ângulo para a frente (FSC) versus a dispersão lateral em ângulo reto (SSC) foi usado para elimi- nar agregados, detritos e células mortas antes da fluorescência ser detectada. Todo o controle e análise foram efetuados em triplicado em pelo menos 10.000 células. A aquisição de amostras foi realizada na FACSDiva v6.1.3 (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA). A análise da amostra foi realizada em FlowJo (FlowJo, LLC, Ashland, OR).

[00115] Dissolução da clofazimina moída: O estudo de dissolu- ção da clofazimina moída utilizou o NGI com um estágio de impactador modificado para permitir a coleta de partículas aerodinamicamente se- paradas, que foi então colocado dentro de um banho de dissolução de USP Apparatus II (pá). A fim de quantificar a dissolução da clofazimina pouco solúvel em água, PBS contendo 0, 2% de polissorbato 80 foi usada como meio de dissolução. Antes do estudo de dissolução, a so- lubilidade de saturação de clofazimina em PBS + 0,2% de polissorbato 80 foi determinada pela colocação de um excesso de clofazimina moí- da no meio e colocar em uma MaxQ 4450 Shaker (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) em 75 RPM e 37°C por 24 horas, após o qual a agitação foi interrompida e as amostras sedimentaram por 48 horas a 37°C. Uma alíquota foi extraída a partir do sobrenadante e foi avaliada com um espectrofotômetro (Infinite M200, Tecan). Para avaliar a disso- lução da clofazimina moída, 9 mg de fármaco foi carregado numa cáp- sula e acionado num NGI. O estágio 5 (correspondente a um corte de tamanho de partícula aerodinâmica de 0,75 µm a 93 L/min) foi substi- tuído pelo estágio de dissolução NGI modificado. Após dispersão na NGI, o pó no estágio modificado foi coberto com um filtro de policarbo- nato Whatman® (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, EUA) de 90 mm de diâmetro, 0,05 µm de tamanho de poros, cortado ao tama-

nho, selado com o anel de vedação correspondente, e colocado em banho de dissolução Varian VK2000 (Agilent Technologies, Santa Cla- ra, CA, EUA) com aparato de pá. O recipiente de dissolução continha 300 mL de meio de dissolução preaquecido e a pá estava configurada a 10 mm de distância do estágio. A rotação foi configurada em 75 RPM e a temperatura foi configurada em 37°C. Foram obtidas amos- tras de 3 mL ao longo de 24 horas e repostas por um novo meio. Após a conclusão do estudo, o fármaco remanescente no estágio NGI modi- ficado foi lavado com etanol. As amostras foram analisadas usando fluorescência (excitação de 480 nm, emissão de 580 nm), para permitir a detecção de quantidades mínimas de fármaco. Tabela 1. Perfil alvo da formulação de CFZ DPI para liberação pulmo- nar Barreira: Método para abordar a barreira: Dose elevada necessária para a efi- Desenvolver formulação livre cácia de excipiente Deve visar o local de infecção no Assegurar MMAD < 3 µm pulmão periférico TB acompanhada por remodelação Desempenho da aerossoliza- pulmonar e alteração da função ção independente do quociente pulmonar, e afeta pacientes pediá- de vazão inspiratório do paci- tricos ente TB predomina nos países de poucos Usar um sistema de produção recursos e liberação econômico

[00116] Análise estatística: A significância estatística dos resulta- dos experimentais foi avaliada usando a Análise de Variância (ANO- VA) no Excel (Microsoft Corporation) com a análise post-hoc do Tukey HSD, quando necessário. O nível alfa foi estabelecido em 0,05. Exemplo 2 – Caracterização da Clofazimina Micronizada

[00117] A moagem a jato de clofazimina, de acordo com as condi- ções descritas, resultou numa distribuição de tamanho de partícula (PSD) dentro da faixa respirável, com o tamanho das partículas vari-

ando de acordo com a área do moinho a jato da qual foram colhidas (Figura 4 e Tabela 2). O rendimento percentual médio do processo de moagem foi de 48,34% ± 4,82%. As porções de recipiente de coleta e de ciclone (Figura 3) do moinho apresentaram maior rendimento, com uma média de 71,96% ± 4,93% e 13,35% ± 8,32%, respectivamente, e foram, portanto, selecionados para estudos posteriores. Tabela 2. Distribuição de tamanho de partícula médio (n = 3) da clofa- zimina moída X10 (µm) X10 (µm) X10 (µm) Período Clofazimina não proces- 1,55 7,90 21,96 2,62 sada Clofazimina moída: Área 0,95 2,83 6,11 1,83 de ciclone do moinho Aljet Clofazimina moída: área 0,76 1,90 3,95 1,68 de recipiente de coleta do moinho Aljet

[00118] As imagens SEM revelaram que a clofazimina não moída exibia um hábito de cristal tabular que é mantido na moagem, e partí- culas moídas altamente aglomeradas que se dispersam em partículas primárias após dispersão com RODOS a pressões de 3 Bar (Figura 5).

[00119] A análise XRD e DSC não revelou mudanças detectáveis na cristalinidade (Figura 6). Os difractogramas da clofazimina não mo- ída e da clofazimina moída demonstraram uma posição de pico idênti- ca. Os termogramas tanto de não moído quanto moído revelaram um único evento endotérmico a 222°C.

[00120] A análise da área de superfície utilizando o método BET de ponto único mostrou uma área de superfície específica média de 2,149 m2/g. A análise da densidade da clofazimina moída livre de excipiente demonstrou uma densidade média aparente de 0,09 g/mL e uma den- sidade média derivada de 0,14 g/mL. Isto resulta em um índice de compressibilidade de 33,97 e uma proporção de Hausner de 1,5. A análise de ângulo de repouso da clofazimina moída livre de excipiente demonstrou um ângulo de repouso de 22,82 graus.

[00121] Para avaliar o desempenho de aerossolização da clofazimi- na moída livre de excipiente, 20 mg de clofazimina moída pura foi ae- rossolizada a partir da RS01 Monodose DPI de baixa resistência sem necessidade de excipientes adicionais ou etapas de processamento. Comparou-se o desempenho das amostras D502,69µm e D501,81µm (Figuras 7A, 7C). Uma redução de 0,88 µm no diâmetro geométrico médio das partículas de diâmetro, resultou em um EF 8% menor (P = 0,014), um FPF5µm/EF 27% maior (P = 0,0006) e um FPF3µm/EF 50% maior (P = 0,0006) (Figura 7A). O MMAD estava intimamente correla- cionado com o diâmetro geométrico médio (Figura 7A), com D502,69µm e D501,81 com um MMAD de 2,57 µm e 1,74 µm, respecti- vamente. A amostra D501,81µm também foi testada com queda de pressão reduzida (Figuras 7B, 7C). Redução na queda de pressão do dispositivo de 4 kPa (93 L/min) a 1 kPa (47 L/min) resultou em uma diminuição de 12% em EF (P = 0,002) e uma diminuição de 5% em FPF5µm/EF (P = 0,290), e uma diminuição de 11% em FPF3µm/EF (P = 0,054), embora estas não foram estatisticamente significativas (Figura 7B). Apesar das amostras terem o mesmo diâmetro geométrico médio, quando a queda de pressão do dispositivo foi diminuída, o MMAD au- mentou de 1,74 µm ± 0,08 µm para 2,19 µm ± 0,08 µm (P = 0,002) (Fi- gura 7B).

[00122] Para avaliar a influência da resistência do dispositivo no desempenho da aerossolização da clofazimina moída livre de excipi- ente, 20 mg de clofazimina moída pura (tamanho médio de partícula de 2,44 µm) foi aerossolizada a partir da RS01 Monodose DPI de bai- xa resistência ou Monodose DPI de alta resistência. Usando o RS01 de baixa resistência, as amostras deste lote de clofazimina moída apresentaram um EF de 90,19%, um FPF5µm/EF de 63,45%, e um FPF3µm/EF de 44,59%, enquanto usando o dispositivo RS01 de alta re-

sistência, a EF foi de 83,52%, FPF5µm/EF foi de 68,75%, e um FPF3µm/EF de 48,90%.

[00123] Para avaliar o desempenho da aerossolização da clofazimi- na moída misturada com lactose de grau de inalação, 20mg de uma mistura de clofazimina-lactose contendo aproximadamente 90% de clofazimina foi aerossolizada a partir de RS01 Monodose DPI de baixa resistência, e comparada contra o desempenho da clofazimina moída livre de excipiente do mesmo lote de moagem. Usando o RS01 de bai- xa resistência, verificou-se que a clofazimina moída livre de excipiente deste lote de clofazimina moída tem uma EF de 90,19%, uma FPF5µm/EF de 63,45%, e uma FPF3µm/EF de 44,59%. Clofazimina do mesmo lote misturado com lactose em uma proporção aproximada de 90:10, apresentou um EF de 92,69%, um FPF5µm/EF de 69,44%, e um FPF3µm/EF de 50,91%.

[00124] Para avaliar a captação dos macrófagos da clofazimina mo- ída, macrófagos J774.A1 foram incubados com clofazimina D501,90µm ou D502,83µm. Experimentos preliminares qualitativos indicaram que não houve diferença na fagocitose de macrófagos de partículas de clofazimina D501,90µm (média de tamanho; derivadas da região do recipiente de coleta do moinho Aljet) e partículas de clofazimina D502,83µm (média de tamanho; derivadas região de ciclone do moinho Aljet). As contagens manuais realizadas em partículas de CFZ de D501,90µm foram, portanto, consideradas apenas na determinação da taxa geral de fagocitose de macrófagos da clofazimina moída. A cap- tação da clofazimina moída pelos macrófagos ocorreu rapidamente, com a maioria (96 a 97%) de partículas moídas internalizadas em 4 a 8 horas após a exposição ao fármaco (Figura 9) a transformação de partículas internalizadas em uma morfologia distinta, em forma de agu- lha, indicativa da formação de cristal líquido, foi observada 24 horas após a exposição inicial. O maior número de macrófagos contendo

CFZ foi observado 6 horas após a exposição ao fármaco, com a dimi- nuição do número de células contendo fármaco em pontos de tempo posteriores, provavelmente devido à continuação da divisão celular.

[00125] Análise da citometria de fluxo dos macrófagos J774.A1 ex- postos a diferentes tratamentos com clofazimina durante 24 horas re- velaram que a captação de clofazimina e a biotransformação intracelu- lar para cristais líquidos de clofazimina estavam dependentes do tipo de tratamento aplicado. Com base na fluorescência a 610 nm de emis- são (específica para clofazimina cristalina), das 10.000 células anali- sadas, 2,48% ± 0,55% das células expostas à clofazimina solubilizada continham fármaco (Tabela 3 e Figura 10). Uma maior porcentagem de células expostas à clofazimina moída D502,83 µm exibiu fluorescên- cia neste comprimento de onda, com 4,11% ± 0,11% (P = 0,001) de células que contém o fármaco. Em comparação com o tratamento me- dicamentoso solubilizado, as células expostas à clofazimina moída D501,90µm também continham um maior número de células fluores- centes (3,24% ± 0,42%), mas esta diferença não foi significativa (P = 0,063). A análise de células com base na fluorescência a 660 nm de emissão, que é indicativa da biotransformação por macrófagos de clofazimina para cristais líquidos, revelou diferenças significativas en- tre os tratamentos de clofazimina solubilizada e os tratamentos de clofazimina moída (Figura 10). Apenas 0,21% ± 0,06% das células ex- postas à clofazimina solubilizada apresentaram fluorescência (Tabela 4). 5,83% ± 0,12% das células expostas à clofazimina D502,83µm moí- da e 5,58% ± 0,19% das células expostas à clofazimina D501,90µm moída exibiu fluorescência, que foi significativamente maior que o grupo de tratamento solubilizado (P = 0,001). Não houve diferenças significativas entre os dois grupos de tratamento moídos (P = 0,158).

[00126] A proliferação foi avaliada com um ensaio MTT. Em compa- ração com o controle, o ensaio MTT revelou uma diminuição significa-

tiva na proliferação/viabilidade celular após 24 horas, com concentra- ções crescentes de clofazimina solubilizada e (P = 1,92 x 10-14) (Figu- ra 11). Em comparação com o controle, o ensaio MTT revelou uma diminuição da proliferação/viabilidade celular com concentrações cres- centes de CFZ solubilizada (Figura 11). Observou-se uma diferença significativa na viabilidade celular entre os grupos de tratamento com CFZ solubilizada e moída em concentrações de fármaco 10 µm (P = 0,045) e 20 µm (P = 0,001).

[00127] Para avaliar a dissolução de clofazimina moída, a solubili- dade intrínseca da clofazimina moída foi medida em PBS pH 7,4 + 0,2% polissorbato 80, sendo 10,9 µg/mL. A clofazimina moída mostrou um baixo grau de dissolução, com 23% de partículas de clofazimina Dae0,75µm dissolvidas dentro de 2 horas, com 48% de dissolução ob- tida em 24 horas e uma concentração final de fármaco a 1,25 µg/mL ± 0,14 µg/mL em 24 horas (Figura 12).

[00128] Todos os métodos divulgados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presen- te divulgação. Enquanto as composições e métodos da presente in- venção têm sido descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para os técnicos no assunto que variações podem ser aplica- das aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método aqui descrito, sem se afastar do conceito, espírito e escopo da inven- ção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que es- tão tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos, ao mesmo tempo que se obtêm os mesmos resultados ou resultados semelhantes. Todos esses substitutos semelhantes e modificações aparentes para os técnicos no assunto são considerados dentro do espírito, escopo e conceito da in- venção, conforme definida pelas reivindicações anexas.

REFERÊNCIAS

[00129] As referências que se seguem, na medida em que forne- cem exemplo de procedimento ou outros detalhes suplementares aos estabelecidos no presente documento, são especificamente incorpora- das no presente documento por referência. Arbiser et al., J. Am. Acad. Dermatol. 1995, 32 (2), 241-247. Baik et al., PLoS One 2012, 7 (10), 474-94. Baik et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2013, 57 (3), 1218-30. Bolla et al., Crystal Growth & Design 2012, 12 (12), 6250-

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica compreendendo partículas micronizadas de clofazimina com um diâmetro médio das partículas de 0,5 a 10 µm, caracterizada pelo fato de que compreende menos de 10% de material amorfo.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de excipientes.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é um pó seco.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 3, caracterizada pelo fato de que o pó seco é formulado para inalação.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas micronizadas de clofazimina são substancialmente cristalinas.

6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas micronizadas de clofazimina são cristalinas.

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um único ingredi- ente ativo.

8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 6, caracterizada pelo fato de que a clofazimina é o único ingre- diente ativo.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é essencialmente livre de ex- cipientes.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é livre de excipientes adicio-

nados.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é livre de excipientes.

12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é livre de excipientes, aditivos, diluentes, transportadores e adjuvantes.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que está livre de um ou mais açú- cares, lubrificantes, agentes antiestáticos, antiaderentes, glidantes, aminoácidos, peptídeos, surfactantes, lipídios e fosfolipídios.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 13, caracterizada pelo fato de que os aminoácidos são leucina, isoleucina, lisina, valina e/ou metionina.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que está livre de DMSO, ciclodex- trina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), lactose, estearato de magnésio e sílica coloidal.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que está livre de DMSO, ciclodex- trina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), estearato de magnésio e sílica coloidal.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende lactose.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 17, caracterizada pelo fato de que a lactose está presente a uma concentração de até 10% em peso.

19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 95% em peso das partículas micronizadas de clofazimina.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi-

cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 99% em peso das partículas micronizadas de clofazimina.

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende 100% em peso das partículas micronizadas de clofazimina.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas micronizadas de clofazimina têm um diâmetro médio das partículas de 0,5 a 5 µm.

23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas micronizadas de clofazimina têm um diâmetro médio das partículas de 0,75 a 4 µm.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas micronizadas de clofazimina têm um diâmetro médio das partículas de 1 a 3 µm.

25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 24, caracterizada pelo fato de que pelo menos 80% das partícu- las micronizadas de clofazimina têm um diâmetro equivalente em vo- lume de 1 a 3 µm.

26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 24, caracterizada pelo fato de que tem uma área de superfície específica de 1,9 a 2,3 m2/g.

27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 24, caracterizada pelo fato de que tem um índice de compressi- bilidade de 32 a 37.

28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 24, caracterizada pelo fato de que tem uma proporção de Haus- ner de 10 a 20.

29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 24, caracterizada pelo fato de que tem um ângulo de resposta de 15° a 30°.

30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas micronizadas de clofazimina formam agregados.

31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma fração de partículas finas (FPF) de pelo menos 50%.

32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma fração de partículas finas (FPF) de pelo menos 60%.

33. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma fração de partículas finas (FPF) de pelo menos 70%.

34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma taxa de dis- solução inferior a 30% em 24 horas em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 com meio de dissolução a 0,2% de polissorbato 80.

35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que compreende menos que 5% de material amorfo.

36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é substancialmente livre de material amorfo.

37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é essencialmente livre de par- tículas amorfas, conforme determinado por difração de raios-x ou calo- rimetria de varredura diferencial .

38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que não está encapsulada em li- possomas.

39. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi-

cação 1, caracterizada pelo fato de que é produzida por moagem a jato.

40. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 39, caracterizada pelo fato de que a moagem a jato é definida ainda como a moagem a jato de ar.

41. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que não é produzida por secagem por pulverização ou homogeneização ultrassônica.

42. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que é embalada como uma forma de dosagem unitária.

43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 42, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária é definida ainda como um cartucho, blíster ou cápsula.

44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 42, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária compreende 5 a 30 mg de partículas micronizadas de clofazimina.

45. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 42, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária compreende pelo menos 10 mg de partículas micronizadas de clofazi- mina.

46. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 42, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária compreende pelo menos 20 mg de partículas micronizadas de clofazi- mina.

47. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 3, caracterizada pelo fato de que o pó seco é carregado num inalador de pó seco.

48. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 47, caracterizada pelo fato de que o inalador de pó seco é um inalador de pó seco simples.

49. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 48, caracterizada pelo fato de que o inalador de pó seco simples compreende menos que 10 partes.

50. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 48, caracterizada pelo fato de que o inalador de pó seco é um inalador de pó seco monodose RSO1.

51. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizada pelo fato de que o ina- lador de pó seco compreende uma resistência ao fluxo de ar de 0,01 kPa0,5min/L e 0,06 kPa0,5min/L.

52. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizada pelo fato de que o ina- lador de pó seco compreende uma resistência ao fluxo de ar de 0,02 kPa0,5min/L e 0,04 kPa0,5min/L.

53. Pó para uso num inalador de pó seco, caracterizado pelo fato de que compreende a composição como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 46.

54. Composição compreendendo uma forma de dosagem unitária de partículas micronizadas de clofazimina, caracterizada pelo fato de que as partículas compreendem um diâmetro médio das partí- culas de 0,5 a 10 µm e a composição é substancialmente livre de exci- pientes.

55. Composição, de acordo com a reivindicação 54, carac- terizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 41.

56. Composição, de acordo com a reivindicação 54, carac- terizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária é compreendida por um cartucho, blíster ou cápsula.

57. Composição, de acordo com a reivindicação 54, carac- terizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária compreende pelo menos 10 mg de partículas micronizadas de clofazimina.

58. Composição, de acordo com a reivindicação 54, carac- terizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária compreende pelo menos 20 mg de partículas micronizadas de clofazimina.

59. Inalador de pó seco, caracterizado pelo fato de que compreende uma forma de dosagem unitária como definida na reivin- dicação 54.

60. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que é um inalador de pó seco simples.

61. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o inalador de pó seco simples com- preende menos que 10 partes.

62. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o inalador de pó seco simples é um inalador de pó seco monodose RSO1.

63. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que compreende uma resistência ao flu- xo de ar de 0,02 kPa0,5min/L e 0,04 kPa0,5min/L.

64. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que libera uma dose emitida de 10 a 20 mg com um acionamento do dispositivo.

65. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que libera uma dose de partículas finas de 5 a 15 mg com um acionamento do dispositivo.

66. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a dose de partículas finas é de pelo menos 50% da dose emitida com um acionamento do dispositivo.

67. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação

65, caracterizado pelo fato de que a dose de partículas finas é de pelo menos 70% da dose emitida com um acionamento do dispositivo.

68. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que uma mudança na queda de pressão através do dispositivo de kPa para 1 kPa não resulta numa diminuição da dose emitida em mais de 25%.

69. Inalador de pó seco, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que uma mudança na queda de pressão através do dispositivo de 4 kPa para 1 kPa não resulta numa diminui- ção na dose de partículas finas em mais de 15%.

70. Método de preparação da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter cristais de clofazimina em bruto; (b) submeter os cristais de clofazimina em bruto a um mo- inho a jato; e (c) coletar partículas micronizadas de clofazimina com um diâmetro médio das partículas de 0,5 a 10 µm, em que o método não compreende a adição de um excipiente.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zado pelo fato de que o moinho a jato é ainda definido como um moi- nho a jato de ar.

72. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zado pelo fato de que não compreende a adição de um solvente.

73. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda carregar as partículas micro- nizadas de clofazimina num inalador de pó seco.

74. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteri- zado pelo fato de que o inalador de pó seco é um inalador de pó seco simples.

75. Método para tratar ou prevenir uma infecção pulmonar num paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz da composição de partículas mi- cronizadas de clofazimina, como definida em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 51.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que a administração compreende a inalação das par- tículas micronizadas de clofazimina para os pulmões dos pacientes.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracteri- zado pelo fato de que a inalação compreende o uso de um inalador.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracteri- zado pelo fato de que o inalador é um inalador de pó seco, um inalador dosimetrado ou um nebulizador.

79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracteri- zado pelo fato de que o inalador é um inalador de pó seco.

80. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que a infecção pulmonar é uma infecção bacteriana.

81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracteri- zado pelo fato de que a infecção pulmonar é uma infecção micobacte- riana.

82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteri- zado pelo fato de que a infecção micobacteriana é uma infecção por Mycobacterium tuberculosis, infecção por Mycobacterium abscesses, infecção por Mycobacterium kansasii, ou uma infecção por Mycobacte- rium avium complex.

83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracteri- zado pelo fato de que a Mycobacterium tuberculosis é resistente a múltiplos fármacos (multirresistente).

84. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracteri- zado pelo fato de que a Mycobacterium tuberculosis é extensivamente resistente a fármacos.

85. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que a infecção pulmonar é uma infecção latente.

86. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracteri- zado pelo fato de que a infecção por Mycobacterium tuberculosis é la- tente.

87. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que a infecção pulmonar é pneumonia.

88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracteri- zado pelo fato de que a pneumonia é associada a staphylococcus au- reus resistente à meticilina.

89. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que a infecção pulmonar é uma infecção associada à fibrose cística.

90. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda administrar pelo menos um segundo agente terapêutico.

91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracteri- zado pelo fato de que o pelo menos um segundo agente é selecionado a partir do grupo que consiste em bedaquilina, pirazinamida, um inibi- dor de ácido nucleico, um inibidor de síntese de proteína e um inibidor de envelope celular.

92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracteri- zado pelo fato de que o inibidor de síntese de proteína é linezolida, claritromicina, amicacina, canamicina, capreomicina ou estreptomicina.

93. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracteri- zado pelo fato de que o inibidor de envelope celular é etambutol, etio- namida, tioacetizona, isoniazida, imipenem, clavulanato, cicloserina, terizidona, amoxicilina ou protionamida.

94. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracteri-

zado pelo fato de que o inibidor de ácido nucleico é rifampicina, rifabu- tina, rifapentina, ácido 4-aminosalicílico, moxifloxacina, ofloxacina ou levofloxacina.

95. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que a composição das partículas micronizadas de clofazimina é administrada mais de uma vez.

96. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteri- zado pelo fato de que a composição das partículas micronizadas de clofazimina é administrada uma vez por dia.

97. Método para tratar câncer num paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz da composição de partículas micronizadas de clofazimina, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 51.

98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão.

99. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda administrar um agente anti- câncer.

100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que o agente anticâncer é quimioterapia, radiotera- pia, terapia genética, cirurgia, terapia hormonal, terapia antiangiogêni- ca ou terapia citocina.

101. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracteri- zado pelo fato de que a administração compreende a inalação das par- tículas micronizadas de clofazimina para os pulmões dos pacientes.

102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que a inalação compreende o uso de um inalador.

103. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o inalador é um inalador de pó seco, um inalador dosimetrado ou um nebulizador.

104. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracteri- zado pelo fato de que a composição das partículas micronizadas de clofazimina é administrada mais de uma vez.

105. Método para reduzir a inflamação pulmonar num paci- ente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paci- ente uma quantidade eficaz da composição de partículas micronizadas de clofazimina, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

51.

106. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracteri- zado pelo fato de que a inflamação pulmonar está associada com as- ma, COPD, fibrose pulmonar idiopática, ou fibrose cística.

107. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracteri- zado pelo fato de que a administração compreende a inalação das par- tículas micronizadas de clofazimina para os pulmões dos pacientes.

108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que a inalação compreende o uso de um inalador.

109. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que o inalador é um inalador de pó seco, inalador dosimetrado ou nebulizador.

110. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracteri- zado pelo fato de que a composição das partículas micronizadas de clofazimina é administrada mais de uma vez.