JP2020533379A - マレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のｈｍ−１およびその応用 - Google Patents

Abstract

本発明は、マレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のＨＭ−１およびその応用を開示し、ポリペプチド薬品の技術分野に属する。本発明は、適切なマレイミド基を選択して血管新生阻害剤のポリペプチドＨＭ−１のＮ末端を修飾し、得られたＸ１−Ｘ９０ポリペプチド配列の標的は変化せず、同時に、ポリペプチド分子の生体内半減期が延長され、クリアランスが低く、免疫原性および抗原性が低下し、腫瘍、各種類の炎症および眼内血管新生疾患の予防と治療に使用でき、かつ抗腫瘍活性がそのまま維持する一方で、病変部位の血漿中濃度が増加し、それによって、投与頻度が減少し、マレイミド基で修飾されたＨＭ−１は、元々の１日２回の投与から７日１回の投与に変更される。【選択図】なし

Description

本発明は、ポリペプチド薬品の技術分野に属し、より具体的には、マレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のＨＭ−１およびその応用に関する。

インテグリンは、複数の細胞外マトリックス成分を認識する受容体ファミリーであり、細胞表面に広く分布しており、細胞と細胞外マトリックスおよび細胞と細胞の間の接着を媒介し、かつ細胞内細胞骨格タンパク質と細胞外マトリックス分子との間の相互作用を介して血管新生に関与することができる。このような受容体は、αとβの二つの鎖で構成され、現在１５種類のα鎖と９種類のβ鎖が発見されており、異なるα鎖とβ鎖の組み合わせによってリガンドの特異性が決定され、インテグリンα_１β_１、α_２β_１、α_３β_１、α_６β１、α_６β_４、α_５β_１、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５は、血管新生および細胞遊走に関与し、その中で、α_ｖβ_３は癌化におけるいくつかの重要なプロセスに影響を与える可能性がある。α_ｖβ_３は多くの細胞タイプで発現でき、リガンド分子中のアルギニル−グリシル−アスパルチル配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、ＲＧＤ）を認識し、かつ腫瘍の血管新生、浸潤、転移、炎症、創傷治癒や血液凝固などの生理学的および病理学的プロセスに関与することができる。従って、ＲＧＤ配列は、新生血管内皮細胞への標的輸送のためのベクターとして使用でき、それにより血管新生疾患のより効率的な治療効果を達成できる。「多機能性融合ポリペプチドおよびその調製方法と応用」と題される特許文献（中国特許出願番号２０１４１０３２４５６８．９）には、いくつかの血管新生阻害剤のポリペプチドが紹介されており、ＨＭ−１はその中の一つとして、配列はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであり、この配列には、インテグリンリガンド配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）および新生血管阻害配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ）が含まれ、このポリペプチドは、生体内および生体外で活性評価を繰り返すことにより、固形腫瘍、関節リウマチおよび眼内血管新生疾患の治療に優れた効果があることが確認される。しかしながら、上記ポリペプチドは、半減期が短く、頻繁な投与を必要とし、患者にいくらかの痛みをもたらしてしまう。「ポリエチレングリコールで修飾された血管新生阻害剤のＨＭ−１および応用」と題される特許文献（中国特許出願番号２０１６１０２１１０００．５）には、ポリペプチドの半減期を延長できるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたＨＭ−１を開示している。この特許と比較して、本研究の内容は、より長い半減期を持っている。ポリペプチド薬品は、その特異性により、任意のアミノ酸または環境の変化でも、その構造、活性および機能に直接影響し、そして、ポリペプチド薬品の作用部位の違いもその修飾方法の選択に影響し、従来技術における化学薬品への修飾または変更方法は、ポリペプチド薬品に対して、技術的示唆を与えることなく、従来のポリペプチド薬品の修飾方法でも、そのポリペプチド配列の違いにより必然的な示唆をもたらさない。これは、新薬開発への道が長く困難となる理由である。

文献では、分子構造の修飾または変更は、半減期が短く、連続的に投与する必要があるという問題を解決する一般的な方法である。ポリペプチドは、マレイミド基側鎖のアミノ基に結合した後、マレイミド基を介してアルブミン３４位のメルカプト基に結合し、生体内の安定性を高め、ペプチダーゼまたはプロテアーゼ分解に対する感受性を低減することができ、また、アルブミンと結合すると分子量が増加し、ＨＭ−１の半減期が長くなるだけでなく、病変部位の血漿中濃度も増加する。ただし、マレイミド基で修飾されて、生体内でアルブミンに結合した後に、タンパク質およびポリペプチドの生物学的活性、例えば、標的へのポリペプチドの結合などにも影響を与え、その影響の程度は、マレイミド基の特性、例えば、その側鎖の長さ、柔軟性などに関連し、修飾生成物の生物学的活性を決定するには、一連の生体内外での薬力学的試験が必要である。

１．解決しようとする問題
従来の血管新生阻害剤のポリペプチドＨＭ−１（配列はＳＥＱ．ＮＯ．１に示す）における半減期が短く、血漿クリアランスが高く、頻繁な投与が必要である、などの欠点に対して、本発明は、マレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のＨＭ−１およびその応用を提供し、当該修飾されたポリペプチドは、アルブミン３４位のメルカプト基と１：１のモル比で迅速に反応できるため、ペプチダーゼまたはプロテアーゼ分解に対する感受性が低下し、分子量が増加し、ポリペプチドＨＭ−１の半減期が長くなり、かつその生物学的活性の多様性が良好に維持され、合成方法は簡単で、ポリペプチド固相合成により完成でき、コストが低いため、腫瘍、様々な炎症および眼内血管新生疾患の予防と治療により適切に適用できる。

２．技術的解決手段
上記問題を解決するために、本発明によって使用される技術的解決手段は以下のとおりである：
修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドは、マレイミド基で血管新生阻害剤のポリペプチドを修飾し、マレイミド基のカルボキシル基がポリペプチドのＮ末端Ａｒｇのアミノ基とアミド結合を形成する。例えば、次のポリペプチドＰ１〜Ｐ４：
ポリペプチドＰ１：

ポリペプチドＰ２：

ポリペプチドＰ３：

ポリペプチドＰ４：

である。

さらに、修飾された血管新生阻害剤のポリペプチド配列には、二つの官能基Ａ、Ｂが含まれ、官能基Ａは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａであるか、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａにおける一つまたは二つのアミノ酸残基が置換、削除、添加を行って得られる誘導ポリペプチドであり、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａと同等の血管新生阻害および抗腫瘍作用、抗炎症活性を有し、官能基Ｂは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであり、そのうち、ＡとＢの官能基はｌｉｎｋｅｒを介して接続され、つまり、修飾されたポリペプチド配列構造はＡ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｂである。

さらに、前記ｌｉｎｋｅｒは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＬｙｓまたはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒである。

さらに、修飾されたポリペプチド配列は、

または

または

である。

さらに、ポリペプチドセグメントとマレイミド基は異なるｌｉｎｋｅｒを介して接続され、そのうち、ｎ、ｍ、ｘ、ｙはそれぞれ、上記構造式における繰り返し構造単位のメチレン基、メチレン基、オキシエチレン、メチレン基の数であり、前記ｎ、ｍ、ｘ、ｙはいずれも整数であり、具体的な数値範囲は、ｎ＝１−１２、ｍ＝１−１２、ｘ＝１−５、ｙ＝０−６であり、具体的なポリペプチド配列構造は、
ポリペプチドＸ１：

ポリペプチドＸ２：

ポリペプチドＸ３：

ポリペプチドＸ４：

ポリペプチドＸ５：

ポリペプチドＸ６：

ポリペプチドＸ７：

ポリペプチドＸ８：

ポリペプチドＸ９：

ポリペプチドＸ１０：

ポリペプチドＸ１１：

ポリペプチドＸ１２：

ポリペプチドＸ１３：

ポリペプチドＸ１４：

ポリペプチドＸ１５：

ポリペプチドＸ１６：

ポリペプチドＸ１７：

ポリペプチドＸ１８：

ポリペプチドＸ１９：

ポリペプチドＸ２０：

ポリペプチドＸ２１：

ポリペプチドＸ２２：

ポリペプチドＸ２３：

ポリペプチドＸ２４：

ポリペプチドＸ２５：

ポリペプチドＸ２６：

ポリペプチドＸ２７：

ポリペプチドＸ２８：

ポリペプチドＸ２９：

ポリペプチドＸ３０：

ポリペプチドＸ３１：

ポリペプチドＸ３２：

ポリペプチドＸ３３：

ポリペプチドＸ３４：

ポリペプチドＸ３５：

ポリペプチドＸ３６：

ポリペプチドＸ３７：

ポリペプチドＸ３８：

ポリペプチドＸ３９：

ポリペプチドＸ４０：

ポリペプチドＸ４１：

ポリペプチドＸ４２：

ポリペプチドＸ４３：

ポリペプチドＸ４４：

ポリペプチドＸ４５：

ポリペプチドＸ４６：

ポリペプチドＸ４７：

ポリペプチドＸ４８：

ポリペプチドＸ４９：

ポリペプチドＸ５０：

ポリペプチドＸ５１：

ポリペプチドＸ５２：

ポリペプチドＸ５３：

ポリペプチドＸ５４：

ポリペプチドＸ５５：

ポリペプチドＸ５６：

ポリペプチドＸ５７：

ポリペプチドＸ５８：

ポリペプチドＸ５９：

ポリペプチドＸ６０：

ポリペプチドＸ６１：

ポリペプチドＸ６２：

ポリペプチドＸ６３：

ポリペプチドＸ６４：

ポリペプチドＸ６５：

ポリペプチドＸ６６：

ポリペプチドＸ６７：

ポリペプチドＸ６８：

ポリペプチドＸ６９：

ポリペプチドＸ７０：

ポリペプチドＸ７１：

ポリペプチドＸ７２：

ポリペプチドＸ７３：

ポリペプチドＸ７４：

ポリペプチドＸ７５：

ポリペプチドＸ７６：

ポリペプチドＸ７７：

ポリペプチドＸ７８：

ポリペプチドＸ７９：

ポリペプチドＸ８０：

ポリペプチドＸ８１：

ポリペプチドＸ８２：

ポリペプチドＸ８３：

ポリペプチドＸ８４：

ポリペプチドＸ８５：

ポリペプチドＸ８６：

ポリペプチドＸ８７：

ポリペプチドＸ８８：

ポリペプチドＸ８９：

ポリペプチドＸ９０：

である。

本発明における官能基Ａは、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａおよびその中の一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、またはその中の一つのアミノ酸が欠損し、または二つのアミノ酸の間に一つまたは二つのアミノ酸を添加して得られる誘導ポリペプチドを含み、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａと同等の血管新生阻害および抗腫瘍作用、抗炎症活性を有すれば、本発明のマレイミド基で修飾して半減期を延長することができ、抗腫瘍活性を持つ。

例えば：
１）ポリペプチドＰ５は、３−マレイミド基プロピオン酸修飾構造を有し、そのうち、位置３のアミノ酸ＡｌａがＧｌｕで置換される：
ポリペプチドＰ５：

２）ポリペプチドＰ６は、６−マレイミド基ヘキサン酸修飾構造を有し、そのうち、位置３のアミノ酸ＡｌａがＧｌｕで置換される：
ポリペプチドＰ６：

３）ポリペプチドＰ７は、３−マレイミド基プロピオン酸修飾構造を有し、そのうち、位置３のアミノ酸Ａｌａが欠損する：
ポリペプチドＰ７：

４）ポリペプチドＰ８は、６−マレイミド基ヘキサン酸修飾構造を有し、そのうち、位置３のアミノ酸Ａｌａが欠損する：
ポリペプチドＰ８：

５）ポリペプチドＰ９は、３−マレイミド基プロピオン酸修飾構造を有し、そのうち、位置３と位置４のアミノ酸の間にＶａｌアミノ酸構造が添加される：
ポリペプチドＰ９：

６）ポリペプチドＰ１０は、６−マレイミド基ヘキサン酸修飾構造を有し、そのうち、位置３と位置４のアミノ酸の間にＶａｌアミノ酸構造が添加される：
ポリペプチドＰ１０：

である。

官能基ＡとＢの間のｌｉｎｋｅｒは、主に接続作用を果たし、官能基ＡとＢの活性に影響せずに両者を接続できる短鎖ポリペプチドであればよく、好ましくは、ｌｉｎｋｅｒはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒである；例えば、
Ｐ１１は、ｌｉｎｋｅｒとしてＧｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓを使用し、かつ３−マレイミド基プロピオン酸で修飾される：
ポリペプチドＰ１１：

ポリペプチドＰ１２は、ｌｉｎｋｅｒとしてＧｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓを使用し、かつ６−マレイミド基カプロン酸で修飾される：
ポリペプチドＰ１２：

ポリペプチドＰ１３は、ｌｉｎｋｅｒとしてＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒを使用し、かつ３−マレイミド基プロピオン酸で修飾される：
ポリペプチドＰ１３：

ポリペプチドＰ１４は、ｌｉｎｋｅｒとしてＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒを使用し、かつ６−マレイミド基カプロン酸で修飾される：
ポリペプチドＰ１４：

である。

上記の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドは、腫瘍、炎症および眼内血管新生疾患を治療するための薬剤の調製に応用される。

さらに、前記腫瘍は、ヒトの頭頸部、脳、甲状腺、食道、膵臓、肺、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸または直腸、卵巣、血管、子宮頸、前立腺、膀胱または精巣に由来する原発性または続発性癌、黒色腫、血管腫および肉腫である。

さらに、前記炎症は、関節リウマチ、痛風性関節炎、反応性関節炎、変形性関節症、乾癬、感染性関節炎、外傷性関節炎および強直性脊椎炎を含む。

さらに、前記眼内血管新生疾患は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、虹彩血管新生、脈絡膜血管新生、網膜血管新生または角膜血管新生を含む。

腫瘍、炎症および／または眼内血管新生疾患を治療するための薬剤であって、上記修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む。

さらに、薬剤の投与方法は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、硝子体注射および静脈点滴を含む注射投与である。

上記マレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のＨＭ−１の調製方法は、以下のステップを含む：（１）マレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のＨＭ−１配列を合成する；（２）分離および精製して溶液状態のマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のＨＭ−１を得る；（３）分離および精製により得られた修飾生成物の溶液に対して、回転蒸発および濃縮を行い、次いで真空下で凍結乾燥して修飾生成物粉末を得て、かつそれを−７０℃で保存する。

配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａは、腫瘍血管新生を阻害する効果がある。アルギニル−グリシル−アスパルチル（ＲＧＤ）配列は、インテグリンの一つの重要なリガンドであるため、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐも、インテグリンを特異的に認識できる。本発明に係る血管新生阻害剤のポリペプチドＨＭ−１は、血管新生阻害作用を有する配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−ＡｌａのＣ末端でＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を接続して得られたポリペプチドであり、インテグリンと親和性および結合能を有するが、当該ＨＭ−１ポリペプチドの半減期が短く、頻繁な投与が必要である。ＨＭ−１配列の半減期を延長するために、出願人は、一連の研究を行い、ＨＭ−１配列の標的および生物学的活性に影響を与えることなく、マレイミド基でＨＭ−１ポリペプチドのＮ末端を修飾し、最終的に最適化された配列は、上記ポリペプチド（Ｘ１〜Ｘ９０）であり、マレイミド基、およびアミノ酸を１３個有するポリペプチドを含み、分子におけるＲＧＤ配列の作用標的はインテグリンα_ｖβ_３およびα_５β_１であるが、主な結合標的は依然としてインテグリンα_ｖβ_３であり、当該配列中の新生血管阻害配列に結合することで、腫瘍血管新生を効果的に阻害し、さらに腫瘍の成長と転移を阻害する効果を達成する。

ポリペプチドＨＭ−１は、マレイミド基によって修飾された後、その標的が変化せず、同時に、ポリペプチド分子の生体内半減期が延長され、クリアランスが低くなり（表１のＣＬ（Ｌ／ｈ／ｋｇ）を参照）、免疫原性および抗原性が低下し、かつ抗腫瘍活性がそのまま維持するが（表５の実験結果を参照）、病変部位の血漿中濃度が増加するため、投与頻度が減少し、マレイミド基で修飾されたＨＭ−１は、元々の１日２回の投与から７日１回の投与に変更される。マレイミド基で修飾されたＨＭ−１ポリペプチドは、主にアルブミンの３４位のメルカプト基と反応して役割を果たす。アルブミンが腫瘍部位に蓄積する理由は以下のとおりである：１）腫瘍組織の血管内皮細胞間隙が大きく、高分子が腫瘍組織の血管壁を透過する原因は健康な組織の血管への透過と異なり、また、腫瘍部位にはリンパ逆流がなく、腫瘍組織の血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果がある；２）アルブミンは、血管内皮細胞膜表面の特異的受容体ｇｐ６０に結合し、カベオリン−１（ｃａｖｅｏｌｉｎ−１）を活性化して小胞を形成して内皮細胞を通し、さらに、腫瘍組織隙間にあるシステインに富む酸分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）に結合することができ、ＳＰＡＲＣは、アルブミンを特異的に引き付けて接着することができるため、アルブミンを吸着し、さらに腫瘍細胞表面に蓄積し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。

多くの試験によって分かるように、本発明に係るマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤は、ヒト臍帯静脉内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖、遊走を顕著に阻害し、ヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞、ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞、ヒト神経膠腫Ｕ８７細胞、ヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などの腫瘍細胞の増殖に対して顕著な阻害作用を有する。

多くの試験によって分かるように、本発明におけるマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤は、血管新生による炎症を効果的に治療することができる。試験により、本発明は、ＲＡにおけるパンヌス形成プロセス中の新生血管内皮を標的とし、血管新生を阻害し、さらに関節リウマチを予防または治療する効果を達成できることが証明される。さらに、アジュバント形態のラット関節リウマチおよびＤＢＡ／１マウスコラーゲン型関節リウマチのモデルによって、本発明は、関節リウマチを治療する顕著な効果を有し、かつ副作用が少なく、用量が低く、コストが低いということが証明される。

多くの試験によって分かるように、本発明におけるマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤は、ヒト網膜血管内皮細胞（ＨＲＣＥＣ）の増殖を阻害することができ、一定の範囲内での投与量依存性を示す。マウス角膜新生血管およびウサギ虹彩新生血管に対する血管新生阻害剤のポリペプチドの作用により、本発明に係るマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤は、角膜および虹彩新生血管の成長を阻害でき、角膜血管新生および虹彩血管新生の治療薬として開発する可能性があり、眼内血管新生疾患の治療に潜在的な役割を持つことが示される。

脈絡膜が眼球の後ろに位置し、試験により、血管新生阻害剤が脈絡膜の血流を改善できることが示され、投与後、全身循環または強膜−ブドウ膜−視神経経路を介して、できるだけ早く脈絡膜に到達し、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の脈絡膜血管新生を阻害することができ、早期ＡＭＤおよび他の脈絡膜血管新生疾患の予防または治療に使用されることが期待されている。同時に、ラット脈絡膜新生血管の生成を阻害することにより、加齢黄斑変性症を含む脈絡膜血管新生疾患に対して一定の治療効果がある。

本発明によって設計されるマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤は、科学的および合理的で、効果的且つ実行可能であり、ヒト腫瘍、様々な炎症および眼内血管新生疾患の治療のための治療薬として使用でき、当該血管新生阻害剤の治療スペクトルを大幅に拡大し、将来の薬剤開発のために新しいアイデアと展望を提供する。

修飾前のポリペプチドＨＭ−１の半減期は０．３４ｈであり、マレイミド基で修飾されたポリペプチドの半減期は、表１〜３に示される。

３． 有益な効果
従来技術と比較して、本発明の有益効果は次のとおりである：
（１）本発明においてマレイミド基で修飾されたＨＭ−１ポリペプチドの半減期は、ＨＭ−１配列よりもはるかに長く、０．３４ｈから３０ｈ以上に延長され、効果は非常に顕著であり、また、修飾されたポリペプチドＨＭ−１をアルブミンに結合した後、分子量が増加し、病変部位の血漿中濃度が増加するため、投与頻度が減少し、元々の１日２回の投与から７日１回の投与に変更される。

（２）本発明は、固相合成方法を使用してマレイミド基をＨＭ−１と反応させ、ＰＥＧで修飾されたＨＭ−１と比較して、本発明の反応が簡単で、コストが低く、収率が高く、不純物が少なく、本発明において修飾されたポリペプチドは、主に、マレイミド基を介してアルブミンの３４位のメルカプト基と１：１のモル比で反応して機能するが、ポリペプチドがマレイミド基を介してアルブミンと反応した後、ポリペプチド分子については、ポリペプチドの分子量が小さく、アルブミンの分子量が大きいため、その活性部位を覆い、その活性を低下させるか完全に喪失する可能性があり、これは予測不可能であり、異なるマレイミド基分子を選択することによってのみ、活性に影響を与えずに半減期を延長する、理想的な分子を得ることができる。

（３）本発明は、ポリペプチドＨＭ−１のマレイミド基により修飾された新しい分子であり、本発明における３種類のマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤について、多くの生体内外活性研究が行われ、それの様々な病症に対する治療効果を研究することにより、投与頻度を減らした条件下で、様々な修飾生成物はいずれもＨＭ−１の良好な活性を維持し、ポリペプチドのＨＭ−１およびＰＥＧ−ＨＭ−１を上回り、その社会的および経済的価値を拡大することが分かった。

（４）タンパク質ペプチド分子の場合、一つのアミノ酸が変化すれば、一つの新しい分子が形成され、これは生体高分子の特性であり、従って、ポリペプチド分子を含む生体高分子については、どの技術も普遍的ではなく、この新しい分子に適しているかどうかを調べるために模索と試験をする必要があり、本発明におけるポリペプチドは、出願人によって設計して発見された新しい分子であり、初めてマレイミド基で修飾されたものであり、推測では達成できず、予想される効果を得るために多くの試験を必要とし、本発明のマレイミド基で修飾された生成物も新しい分子に属し、修飾前の分子とは活性の面で、異なる効果を持つ。

以下、具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。

実施例１
血管新生阻害剤のポリペプチドＸ１−Ｘ９０の調製および検定
ポリペプチドＸ１−Ｘ９０は、固相合成法によって合成され、分取ＨＰＬＣによって分離および精製を行い、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによってその純度を測定する。

ポリペプチドＸ１−Ｘ９０の合成方法は比較的類似しており、いずれも固相合成法を使用し、Ｆｍｏｃ−ｗａｎｇ−ｒｅｓｉｎを出発材料とし、そして、保護アミノ酸でジペプチドからトライデカケップを順に接続してから、マレイミド基を接続し、合成が完了した後、充分に洗浄し、続いて、ペプチドを切断して後処理を行い、血管新生阻害剤粗生成物を取得する。粗生成物を溶解し、分取高性能液相で２回精製し、濃縮および凍結乾燥を行って純粋な生成物を得、最後に３回目の精製を行ってポリペプチド精製生成物が得られる。当該方法は、合成の効率を確保するだけでなく、生成物の純度を向上させることもできる。

１．ペプチドを接続するステップは以下のとおりである：
適量のＦｍｏｃ−ｗａｎｇ−ｒｅｓｉｎを秤量し、ガラスフリット反応カラムに注ぎ、適量のＣＨ_２Ｃｌ_２を添加して樹脂を充分に膨張させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解されている、以下の保護されたアミノ酸およびマレイミド基、即ちＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｏｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、マレイミド基を樹脂に順次添加し、そして、順次１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）で活性化する。２０％ピペリジンを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液でＦｍｏｃ保護基を２０分間除去する。トリフルオロ酢酸：フェノール：水：アニソール：ＥＤＴ＝９０：３：３：２：２で、ペプチドを樹脂から切り取り、続いて、ドライアイスで冷却したエーテルで沈殿させる。

ａ．脱キャップ：適量のヘキサヒドロピリジン／ＤＭＦの脱キャップ溶液を添加し、一定の期間反応させた後に脱キャップ溶液を完全に吸い出し、その間、ＤＭＦで反応物を一回洗浄してから、適量の脱キャップ溶液を再度添加して反応させ、Ｆｍｏｃ保護基を除去する；
ｂ．洗浄：脱キャップ溶液を完全に吸い出し、ＤＭＦで樹脂を数回洗浄し、副生成物を充分に洗浄する；
ｃ．縮合：ペプチドの接続に使用される保護アミノ酸およびアクティベーターをＤＭＦと縮合剤に溶解し、よく振って、温度を約３４℃に制御し、反応釜内に充分に反応させる；
ｄ．洗浄：反応液を完全に吸い出し、ＤＭＦで樹脂を充分に洗浄し、副生成物を洗浄する。

２．ペプチドを切断するステップは次のとおりである：
水切りした樹脂を丸底フラスコに入れ、合成されたＸ１−Ｘ９０中間体を充分に分解するために溶解液を加え、フリット漏斗を使用して樹脂をポリペプチドから分離し、前記溶解液の組成は体積比で、トリフルオロ酢酸：フェノール：水：アニソール：ＥＤＴ＝９０：３：３：２：２である。

３．後処理のステップは次のとおりである：
まず、無水エーテルを切断溶液に加えてポリペプチドを析出し、次に遠心分離し、上清を捨て、続いて、無水エーテルでポリペプチドを洗浄し、水切りしてポリペプチド粗生成物を得る。

４．精製のステップは次のとおりである：
ａ．溶解：粗生成物を精密に秤量し、適当な精製水を加えて５−２０ｇ／Ｌの溶液にし、顆粒なしの上清溶液になるように超音波で撹拌する；
ｂ．濾過：粗生成物溶液をフリットフィルターの０．４５μｍの混合濾過膜で濾過する；
ｃ．調製：セミ分取高速液体クロマトグラフィーによって１回目の精製、２回目の精製および３回目の精製を行ってポリペプチドの精製合格品を得て、移動相：Ａ相はアセトニトリルで、Ｂ相は水溶液である。

〔１〕１回目の精製：１０％のアセトニトリルおよび９０％の水溶液を使用して、６０ｍＬ／ｍｉｎの流速で、１０ｍｉｎすすぎ、分取カラムを平衡化し、給液ポンプでローディングする。溶出勾配は表４に示される。

紫外波長が２２０ｎｍで、吸収値が２００ｍＶを超える溶液を収集し、測定によって純度が９５％を超えるものを組み合わせてピークトップとし、二回目の分離および精製に備える。

〔２〕２回目の精製：１回目の精製で得られたピークトップを回転蒸発して有機溶媒を除去し、５％のアセトニトリルおよび９５％の水溶液を使用して、６０ｍＬ／ｍｉｎの流速で、１０ｍｉｎすすぎ、分取カラムを平衡化し、給液ポンプでローディングする。溶出勾配は表５に示される。

紫外波長が２２０ｎｍで、吸収値が２００ｍＶを超える溶液を収集し、測定によって純度が９８．５％を超えるものを合格品とする。

ｄ．濃縮、濾過、凍結乾燥：合格溶液をロータリーエバポレーターで３７℃で減圧下で濃縮し、残留溶媒および一部の水分を除去する。最後に、０．２２μｍの濾過膜で濾過し、濾液を凍結乾燥皿に入れ、凍結乾燥機で凍結乾燥して純粋な生成物が得られる。

５．生成物の純度分析
凍結乾燥した生成物について、分析高速液体クロマトグラフィーによって純度を分析し、分析条件は次のとおりである：
分析カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ（５μｍフィラー）；
移動相：Ａ相は水で、Ｂ相はアセトニトリルである；
ローディング量：２０μＬ；
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ；
測定波長：２２０ｎｍ；
溶出勾配は表６に示される。

結果：合成されたポリペプチドは、逆相液体クロマトグラフィーによって純度を分析し、検定結果を表６に示し、ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の純度はいずれも９５％を超え、設計要件を満たす。

実施例２
様々な腫瘍細胞に対するマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドの増殖阻害試験
ＭＴＴ法によって、様々な腫瘍細胞成長を阻害するＸ１〜Ｘ９０の活性を測定する。腫瘍細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で９０％以上のコンフルエンシーまで培養した場合、トリプシン消化により収集し、培養液で細胞を再懸濁し、かつ顕微鏡でカウントし、細胞濃度を２×１０^４個／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、かつ３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養する。Ｘ１〜Ｘ９０を培養液で各所定濃度に希釈する。ドセタキセルを培養液で最終濃度に希釈する。細胞を壁に完全に付着させた後、各希釈剤を９６ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）にそれぞれ加える。ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０希釈剤を加えたものを投与群とし、ドセタキセルを加えたものを陽性対照群とし、いかなる薬剤も含まない培養液を陰性対照群とする。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４８ｈインキュベートする。９６ウェルプレートに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを加え、穴あたり２０μＬ加え、４ｈ連続して培養する。培地を吸引し、各ウェルに１５０μＬ ＤＭＳＯを加えて溶解し、１０ｍｉｎ振盪して軽く混ぜる。マイクロプレートリーダーを使用して、測定波長が５７０ｎｍで、基準波長が６３０ｎｍである場所で吸光度を測定し、かつ成長阻害率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＰＩ）を計算し、式は次のとおりである：
ＰＩ（％）＝１−投与群／陰性群
試験は独立して３回繰り返され、試験結果はｍｅａｎ±ＳＤで表され、試験結果は表７に示される。

結果：陰性対照と比較して、Ｘ１〜Ｘ９０は、様々な腫瘍細胞の増殖を顕著に阻害し、その中でＸ５は最高の効果を示し、本発明を有効な抗腫瘍薬剤として開発するために良好な展望を提供する。

実施例３
様々な腫瘍細胞に対するマレイミド基で修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドＰ１〜Ｐ４の増殖阻害率（％）
ＭＴＴ法によって、様々な腫瘍細胞成長を阻害するＰ１〜Ｐ４の活性を測定する。腫瘍細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で９０％以上のコンフルエンシーまで培養した場合、トリプシン消化により収集し、培養液で細胞を再懸濁し、かつ顕微鏡でカウントし、細胞濃度を２×１０^４個／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、かつ３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養する。Ｐ１〜Ｐ４を培養液で各所定濃度に希釈する。ドセタキセルを培養液で最終濃度に希釈する。細胞を壁に完全に付着させた後、各希釈剤を９６ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）にそれぞれ加える。ポリペプチドＰ１〜Ｐ４希釈剤を加えたものを投与群とし、ドセタキセルを加えたものを陽性対照群とし、いかなる薬剤も含まない培養液を陰性対照群とする。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４８ｈインキュベートする。９６ウェルプレートに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを加え、穴あたり２０μＬ加え、４ｈ連続して培養する。培地を吸引し、各ウェルに１５０μＬ ＤＭＳＯを加えて溶解し、１０ｍｉｎ振盪して軽く混ぜる。マイクロプレートリーダーを使用して、測定波長が５７０ｎｍで、基準波長が６３０ｎｍである場所で吸光度を測定し、かつ成長阻害率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＰＩ）を計算し、式は次のとおりである：
ＰＩ（％）＝１−投与群／陰性群
試験は独立して３回繰り返され、試験結果はｍｅａｎ±ＳＤで表され、試験結果は表８に示される。

実施例４
ヒト臍帯静脉内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するポリペプチドＰ１〜Ｐ４の遊走阻害作用
１０ｍｇ／ｍＬ ＭａｔｒｉｇｅｌをＨＵＶＥＣ特殊培地で１：２で希釈し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー膜に塗布し、室温で空気乾燥する。対数成長期まで培養されたＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン消化液で消化し、収集し、ＰＢＳで２回洗浄してから、ブランクＨＵＶＥＣｓ特殊培地で再懸濁する。顕微鏡でカウントし、細胞濃度を１×１０^５個／ｍＬに調整する。各群の試験用溶液を調製し、試験用溶液には濃度の異なるポリペプチドＰ１〜Ｐ４が含まれ、ブランクＨＵＶＥＣｓ特殊培地で１００μＬに希釈する。細胞をｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーに接種し、各ウェル１００μＬであり、かつ各群の試験用溶液をチャンバーに加える。５％ウシ胎児血清および１％ＥＣＧＳを含む内皮細胞培養液０．６ｍＬを２４ウェルプレートに加えて細胞遊走を刺激し、５％ＣＯ_２、３７℃で２４ｈ培養する。ウェル内の培養液を捨て、９０％アルコールで常温で３０ｍｉｎ固定し、０．１％クリスタルバイオレットで常温で１０ｍｉｎ染色し、水で洗い流し、綿棒で上部の遊走していない細胞を軽く拭き取り、顕微鏡で観察し、四つの視野を選択して撮影してカウントする。次の式に従って遊走阻害率（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＭＩ）を計算する：

そのうち、Ｎ_ｔｅｓｔは試験群の細胞遊走数であり、Ｎ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}はブランク対照群の細胞遊走数である。

試験は独立して３回繰り返され、試験結果によってｍｅａｎ±ＳＤとして計算し、かつ統計学的Ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表す。試験結果は表９に示される。

実施例５
様々な腫瘍細胞に対する誘導ポリペプチドＰ５〜Ｐ１０の増殖阻害率（％）
ＭＴＴ方法を使用して、様々な腫瘍細胞成長を阻害するＰ５〜Ｐ１０の活性を測定する。腫瘍細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で９０％以上のコンフルエンシーまで培養した場合、トリプシン消化により収集し、培養液で細胞を再懸濁し、かつ顕微鏡でカウントし、細胞濃度を２×１０^４個／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、かつ３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養する。Ｐ５〜Ｐ１０を培養液で各所定濃度に希釈する。ドセタキセルを培養液で最終濃度に希釈する。細胞を壁に完全に付着させた後、各希釈剤を９６ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）にそれぞれ加える。ポリペプチドＰ５〜Ｐ１０希釈剤を加えたものを投与群とし、ドセタキセルを加えたものを陽性対照群とし、いかなる薬剤も含まない培養液を陰性対照群とする。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４８ｈインキュベートする。９６ウェルプレートに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを加え、穴あたり２０μＬ加え、４ｈ連続して培養する。培地を吸引し、各ウェルに１５０μＬ ＤＭＳＯを加えて溶解し、１０ｍｉｎ振盪して軽く混ぜる。マイクロプレートリーダーを使用して、測定波長が５７０ｎｍで、基準波長が６３０ｎｍである場所で吸光度を測定し、かつ成長阻害率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＰＩ）を計算し、式は次のとおりである：
ＰＩ（％）＝１−投与群／陰性群
試験は独立して３回繰り返され、試験結果はｍｅａｎ±ＳＤで表され、試験結果は表１０に示される。

実施例６
ヒト臍帯静脉内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するポリペプチドＰ５〜Ｐ１０の遊走阻害作用
１０ｍｇ／ｍＬ ＭａｔｒｉｇｅｌをＨＵＶＥＣ特殊培地で１：２で希釈し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー膜に塗布し、室温で空気乾燥する。対数成長期まで培養されたＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン消化液によって消化し、収集し、ＰＢＳで２回洗浄してから、ブランクＨＵＶＥＣｓ特殊培地で再懸濁する。顕微鏡でカウントし、細胞濃度を１×１０^５個／ｍＬに調整する。各群の試験用溶液を調製し、試験用溶液には濃度の異なるポリペプチドＰ５〜Ｐ１０が含まれ、ブランクＨＵＶＥＣｓ特殊培地で１００μＬに希釈する。細胞をｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーに接種し、各ウェル１００μＬであり、かつ各群の試験用溶液をチャンバーに加える。５％ウシ胎児血清および１％ＥＣＧＳを含む内皮細胞培養液０．６ｍＬを２４ウェルプレートに加えて細胞遊走を刺激し、５％ＣＯ_２、３７℃で２４ｈ培養する。ウェル内の培養液を捨て、９０％アルコールで常温で３０ｍｉｎ固定し、０．１％クリスタルバイオレットで常温で１０ｍｉｎ染色し、水で洗い流し、綿棒で上部の遊走していない細胞を軽く拭き取り、顕微鏡で観察し、四つの視野を選択して撮影してカウントする。次の式に従って遊走阻害率（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＭＩ）を計算する：

そのうち、Ｎ_ｔｅｓｔは試験群の細胞遊走数であり、Ｎ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}はブランク対照群の細胞遊走数である。

試験は独立して３回繰り返され、試験結果によってｍｅａｎ±ＳＤとして計算し、かつ統計学的Ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表す。試験結果は表１１に示される。

実施例７
様々な腫瘍細胞に対する誘導ポリペプチドＰ１１〜Ｐ１４の増殖阻害率（％）
ＭＴＴ法を使用して、様々な腫瘍細胞成長を阻害するポリペプチドＰ１１〜Ｐ１４の活性を測定する。腫瘍細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で９０％以上のコンフルエンシーまで培養した場合、トリプシン消化により収集し、培養液で細胞を再懸濁し、かつ顕微鏡でカウントし、細胞濃度を２×１０^４個／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、かつ３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養する。ポリペプチドＰ１１〜Ｐ１４を培養液で各所定濃度に希釈する。ドセタキセルを培養液で最終濃度に希釈する。細胞を壁に完全に付着させた後、各希釈剤を９６ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）にそれぞれ加える。ポリペプチドＰ１１〜Ｐ１４を加えた希釈剤を投与群とし、ドセタキセルを加えたものを陽性対照群とし、いかなる薬剤も含まない培養液を陰性対照群とする。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４８ｈインキュベートする。９６ウェルプレートに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを加え、穴あたり２０μＬ加え、４ｈ連続して培養する。培地を吸引し、各ウェルに１５０μＬ ＤＭＳＯを加えて溶解し、１０ｍｉｎ振盪して軽く混ぜる。マイクロプレートリーダーを使用して、測定波長が５７０ｎｍで、基準波長が６３０ｎｍである場所で吸光度を測定し、かつ成長阻害率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＰＩ）を計算し、式は次のとおりである：
ＰＩ（％）＝１−投与群／陰性群
試験は独立して３回繰り返され、試験結果はｍｅａｎ±ＳＤで表され、試験結果は表１２に示される。

実施例８
ヒト臍帯静脉内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するポリペプチドＰ１１〜Ｐ１４の遊走阻害作用
１０ｍｇ／ｍＬ ＭａｔｒｉｇｅｌをＨＵＶＥＣ特殊培地で１：２で希釈し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー膜に塗布し、室温で空気乾燥する。対数成長期まで培養されたＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン消化液によって消化し、収集し、ＰＢＳで２回洗浄してから、ブランクＨＵＶＥＣｓ特殊培地で再懸濁する。顕微鏡でカウントし、細胞濃度を１×１０^５個／ｍＬに調整する。各群の試験用溶液を調製し、試験用溶液には濃度の異なるポリペプチドＰ１１〜Ｐ１４が含まれ、ブランクＨＵＶＥＣｓ特殊培地で１００μＬに希釈する。細胞をｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーに接種し、各ウェル１００μＬであり、かつ各群の試験用溶液をチャンバーに加える。５％ウシ胎児血清および１％ＥＣＧＳを含む内皮細胞培養液０．６ｍＬを２４ウェルプレートに加えて細胞遊走を刺激し、５％ＣＯ_２、３７℃で２４ｈ培養する。ウェル内の培養液を捨て、９０％アルコールで常温で３０ｍｉｎ固定し、０．１％クリスタルバイオレットで常温で１０ｍｉｎ染色し、水で洗い流し、綿棒で上部の遊走していない細胞を軽く拭き取り、顕微鏡で観察し、四つの視野を選択して撮影してカウントする。次の式に従って遊走阻害率（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＭＩ）を計算する：

そのうち、Ｎ_ｔｅｓｔは試験群の細胞遊走数であり、Ｎ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}はブランク対照群の細胞遊走数である。

試験は独立して３回繰り返され、試験結果によってｍｅａｎ±ＳＤとして計算し、かつ統計学的Ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表す。試験結果は表１３に示される。

実施例９
ヒト臍帯静脉内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の遊走阻害作用
１０ｍｇ／ｍＬ ＭａｔｒｉｇｅｌをＨＵＶＥＣ特殊培地で１：２で希釈し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー膜に塗布し、室温で空気乾燥する。対数成長期まで培養されたＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン消化液で消化し、収集し、ＰＢＳで２回洗浄してから、ブランクＨＵＶＥＣｓ特殊培地で再懸濁する。顕微鏡でカウントし、細胞濃度を１×１０^５個／ｍＬに調整する。各群の試験用溶液を調製し、試験用溶液には濃度の異なるポリペプチドＸ１〜Ｘ９０が含まれ、ブランクＨＵＶＥＣｓ特殊培地で１００μＬに希釈する。細胞をｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーに接種し、各ウェル１００μＬであり、かつ各群の試験用溶液をチャンバーに加える。５％ウシ胎児血清および１％ＥＣＧＳを含む内皮細胞培養液０．６ｍＬを２４ウェルプレートに加えて細胞遊走を刺激し、５％ＣＯ_２、３７℃で２４ｈ培養する。ウェル内の培養液を捨て、９０％アルコールで常温で３０ｍｉｎ固定し、０．１％クリスタルバイオレットで常温で１０ｍｉｎ染色し、水で洗い流し、綿棒で上部の遊走していない細胞を軽く拭き取り、顕微鏡で観察し、四つの視野を選択して撮影してカウントする。次の式に従って遊走阻害率（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＭＩ）を計算する：

そのうち、Ｎ_ｔｅｓｔは試験群の細胞遊走数であり、Ｎ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}はブランク対照群の細胞遊走数である。

試験は独立して３回繰り返され、試験結果によってｍｅａｎ±ＳＤとして計算し、かつ統計学的Ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表す。試験結果は表１４に示される。

結果：ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の作用下で、遊走する内皮細胞数は著しく減少する。ブランク対照群と比較して、５％ウシ胎児血清および１％ＥＣＧＳによって誘発されるＨＵＶＥＣの遊走作用を阻害することができる。０．２μＭの投与量での細胞遊走に対するポリペプチドＸ５９の阻害作用は、ブランク対照と比較して非常に有意な差（＊＊Ｐ＜０．０１）を示し、阻害率は５８．０２％に達する。

実施例１０
マウス脾臓リンパ球増殖に対するポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の影響
無菌条件下でマウス脾臓を取り、ブランク１６４０培地で３回洗浄し、５ｍＬシリンジコアで粉砕し、２００メッシュのふるいで濾過し、単一細胞懸濁液にし、遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）し、上清を捨て、Ｔｒｉｓ−ＮＨ_４Ｃｌで赤血球を分解し、氷水浴に４ｍｉｎ放置し、遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）し、上清を捨て、無菌ＰＢＳで細胞を２回洗浄する。最後に、１０％ウシ血清のＲＰＭＩ １６４０培養液（５ｍＬ）を加えて細胞を懸濁し、細胞をカウントし、細胞濃度を５×１０^６個／ｍＬに調整し、９６ウェル培養プレートで培養する。

試験では、ブランク対照群、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）群、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）群、ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０群は試験群として設けられる。脾臓リンパ球懸濁液を１００μＬ／ウェルで各群にそれぞれ加えた後、ブランク１６４０培養液１００μＬをブランク対照群に加え、ＣｏｎＡをＣｏｎＡ群に加え、ＤｅｘをＤｅｘ群に加え、試験群には濃度の異なるポリペプチドＸ１〜Ｘ９０を加えた上でＣｏｎＡを加える。３７℃で細胞インキュベーター内で４８ｈ放置培養し、培養後、各ウェルに２０μＬ ＭＴＴを加え、４ｈ連続して培養し、最後に、各ウェル内のすべての溶液を捨て、各ウェルに１００μＬ ＤＭＳＯを加え、振って、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍでのＯＤ値を測定し、各ウェルに対して五つの平行対照を設ける。結果は表１５に示される。

結果：異なるポリペプチドＸ１〜Ｘ９０はいずれも、マウス脾臓リンパ球の増殖をある程度阻害でき、そのうち、０．２μＭの薬剤投与量でのＸ５１の阻害率は３６．２０％に達し、かつ各投与群の阻害作用は、一定の投与量依存性を示す。

実施例１１
マウス腹腔マクロファージによるＩＬ−１β産生に対するポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の影響
（１）ＩＬ−１β産生：マウス腹腔に１ｍＬブロス培地（６％含有）澱粉を注射し、３日後、無菌でマウス腹腔マクロファージを取り、１６４０培地で２回洗浄し、細胞濃度を２×１０^６個／ｍＬに調整し、２４ウェル培養プレートに注入し、各ウェルに１ｍＬ注入し、細胞インキュベーターに放置して３ｈインキュベートし、３０ｍｉｎおきに１回振動させ、細胞を壁に充分に付着させる。次に、培養液で２回洗浄し、壁に付着していない細胞を除去する。ブランク群にＰＢＳを加え、陽性群に陽性薬物デキサメタゾン（Ｄｅｘ）を加え、モデル群に投与せず、試験群に低濃度、中濃度、高濃度のポリペプチドＸ１〜Ｘ９０を加え、投与後、４８ｈ連続して培養し、１０００ｒ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離する。上清を、ＩＬ−１β活性を測定するサンプルとして収集する。

（２）ＩＬ−１β含有量の測定：Ｒ＆Ｄ会社のマウスＩＬ−１β酵素免疫測定キットで測定し、キットの取扱い説明書に従って次のように操作する：測定されるサンプルおよび濃度の異なる標準液をそれぞれ加え、反応ウェルをシーリングテープで密封し、３７℃で９０ｍｉｎインキュベートし、プレートを４回洗浄し、ビオチン化抗体作動液（１００μＬ／ウェル）を加え、反応ウェルをシーリングテープで密封し、３７℃で６０ｍｉｎインキュベートし、プレートを４回洗浄し、酵素コンジュゲート作動液（１００μＬ／ウェル）を加え、反応ウェルをシーリングテープで密封し、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、プレートを４回洗浄し、発色剤（１００μＬ／ウェル）を加え、３７℃で暗所で１０−２０ｍｉｎインキュベートし、停止液（１００μＬ／ウェル）を加え、混合後にＯＤ４５０値を測定することができる。

結果：ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０はいずれも、マウス脾臓リンパ球の増殖を顕著に阻害でき、陰性群と比較して有意差を示し、そのうち、０．２μＭの薬剤投与量でのＸ６０の阻害率は４６．７８％に達し、かつ一定の投与量依存性を示す。

実施例１２
キシレンによるマウス耳の腫脹に対するポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の影響
昆明マウスを取り、生理食塩水群をブランク対照群とし、アスピリン群（２００ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照群とし、Ｘ１〜Ｘ９０投与群を試験群とする。マウスには５日間連続して１日１回注射投与する。ブランク対照群には等体積の生理食塩水を与える。最後の投与の１ｈ後、マウスの右耳の両面にキシレンを０．０５ｍＬ塗布して炎症を引き起こし、左耳は塗布されなかった正常なものである。２ｈ後に、脱臼によりマウスを死なせ、耳介に沿って両耳を切り、パンチで耳のスライスを採取し、計量し、腫脹度および腫脹率を計算する。腫脹度＝右耳スライスの重量−左耳スライスの重量、腫脹率＝（腫脹度／左耳スライスの重量）×１００％。試験結果について統計学的Ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表し、結果は表１７に示される。

結果：ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０はいずれも、キシレンによるマウス耳の腫脹を顕著に阻害でき、ポリペプチドＸ５１の阻害率は５１．５２％に達し、陽性群よりも良好であり、かつ投与量依存性を示す。

実施例１３
コラーゲン誘発マウス関節炎動物モデルに対するポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の生体内免疫保護作用
コラーゲン型マウス関節炎動物モデルを確立し、マウスコラーゲン誘発関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＣＩＡ）に対するＸ１〜Ｘ９０の治療効果を研究する。体重が１８−２２ｇで、７−８週齢のＳＰＦグレードのオスのＤＢＡ／１マウスを試験動物として使用し、それぞれ正常対照群、モデル対照群、Ｘ１〜Ｘ９０群、陽性薬物対照群（メトトレキサート１ｍｇ／ｋｇ）にランダムに分ける。正常群を除いて、０日目に各試験群でマウスＣＩＡモデルを確立し、この方法として、鶏軟骨ＩＩＩ型コラーゲン（ｃＩＩＩ）を０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸で４ｍｇ／ｍＬの溶液に溶解し、４℃で冷蔵庫で一晩放置する。試験当日に、ＩＩＩ型コラーゲンを４ｍｇ／ｍＬ Ｍｙｅｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｔｒａｉｎｈ３７Ｒｖを含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と等体積で充分に乳化させ、ＤＢＡ／１マウスに麻酔をかけた後、その尾の皮膚に乳化剤を５０μＬ注射して感作させ、２１日後に、４ｍｇ／ｍＬのＩＩＩ型コラーゲン（ｃＩＩＩ）を非完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と等体積で充分に乳化させてから、同じ投与量の乳化剤を使用して尾を再免疫する。モデル確立後の３０日目から皮下注射で投与する：Ｘ１〜Ｘ９０群は３日１回で注射し、陽性薬物対照群（メトトレキサート１ｍｇ／ｋｇ）は５日１回で、３回連続して注射し、正常対照群およびモデル対照群（生理食塩水）は１０日連続して注射する。モデル確立後の２１日目から７０日目まで、３日ごとに計量し、関節を評点し、左右後足の足首の直径をそれぞれ測定して、マウスコラーゲン型関節炎に対する薬剤の影響を観察する。７０日目に、脱臼によりマウスを死なせる。

関節炎の評価指標は次のとおりである：（１）関節評点：四肢をグレード０−４で評点する：０＝紅斑または腫脹なし；１＝軽度の紅斑または腫脹、前／後つま先関節のいずれかに紅斑または腫脹がある；２＝一つ以上のつま先に紅斑または腫脹がある；３＝足首または手首関節下の足爪に腫脹がある；４＝足首関節を含むすべての足爪に腫脹がある。マウスの４本の足についてそれぞれ評点し、最高評点は１６ポイントである。モデル確立後に、２１日目から７０日目まで、３日ごとに関節を評点し、かつ結果を記録する。（２）足首の直径の測定について、それぞれ、モデル確立前およびモデル確立後の２１日目から７０日目まで、３日ごとにノギスでマウスの左、右足首内側から外側までの直径および足首の厚さを測定し、かつ結果を記録する。

試験は独立して３回繰り返され、試験結果はｍｅａｎ±ＳＤで表され、かつ統計学的Ｔ検定を行い、表において、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表す。

結果：モデル確立後のマウスは、正常マウスと比較して、マウスの尾の皮内に対して不活化結核菌含有完全フロイントアジュバントとコラーゲンを等体積で混合した乳化剤を注射し、２１日後に、尾の皮内に対して非完全フロイントアジュバントとコラーゲンを等体積で混合した乳化剤を注射し、免疫後の２７日目に、ＣＩＡマウス足爪が赤く腫れ、関節炎指数評点が増加し、モデル群の４５日目−６０日目に腫脹のピークが観察され、モデル群の体重は３５日目からほとんど増加せず、後期にわずかに減少する。ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０は、コラーゲン誘発マウス関節炎動物モデルでいずれも生体内免疫保護作用を発揮し、陽性対照群、Ｘ１〜Ｘ９０群はいずれも、モデル群と比較して、非常に有意な差（ｐ＊＊＜０．０１）を示し、ポリペプチドＸ１６群の四肢評点は、モデル対照群より顕著に低く、保護作用が最も顕著である。

実施例１４
アジュバント形態のラット関節炎動物モデルに対するＸ１〜Ｘ９０の生体内免疫保護作用
アジュバント形態のラット関節炎動物モデルを確立し、アジュバント形態の関節炎（Ａｄｊｕｖａｎｔａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＡＡ）ラットに対するＸ１〜Ｘ９０の治療効果を研究する。体重が１４０−１６０ｇで、ＳＰＦグレードのオスのＳＤラットを試験動物として使用し、それぞれ正常対照群、モデル対照群、Ｘ１〜Ｘ９０群および陽性薬物対照群（メトトレキサート１ｍｇ／ｋｇ）にランダムに分ける。正常群を除いて、０日目に各試験群でラットＡＡモデルを確立し、この方法として、ラットの左側後足足底に不活化結核菌含有（Ｈ３７ＲＡ、１０ｍｇ／ｍＬ）完全フロイントアジュバント０．０８ｍＬを注射して、ラットアジュバント形態の関節炎モデルを確立する。モデル確立後の１０日目から尾に静脈内注射で投与する：Ｘ１〜Ｘ９０は５日１回で注射し、陽性薬物対照群（メトトレキサート１ｍｇ／ｋｇ）は５日１回で、３回連続して注射し、正常対照群およびモデル対照群（生理食塩水）は１０日連続して注射する。モデル確立後の８日目、１１日目、１４日目、１７日目、２０日目、２３日目および２６日目に、関節を評点し、左右後足足首の直径をそれぞれ測定して、ラットアジュバント形態の関節炎に対する薬剤の影響を観察する。

関節炎評価指標は次のとおりである：（１）関節評点：四肢をグレード０−４で評点する：０＝紅斑または腫脹なし；１＝軽度の紅斑または腫脹、前／後つま先関節のいずれかに紅斑または腫脹がある；２＝一つ以上のつま先に紅斑または腫脹がある；３＝足首または手首関節下の足爪に腫脹がある；４＝足首関節を含むすべての足爪に腫脹がある。ラットの４本の足についてそれぞれ評点し、最高評点は１６ポイントである。モデル確立後の８日目、１１日目、１４日目、１７日目、２０日目、２３日目および２６日目に、関節を評点し、かつ結果を記録する。（２）足首の直径の測定について、モデル確立前およびモデル確立後の８日目、１１日目、１４日目、１７日目、２０日目、２３日目および２６日目に、ノギスでラットの左、右足首内側から外側までの直径および足首の厚さを測定し、かつ結果を記録する。試験は独立して３回繰り返され、試験結果はｍｅａｎ±ＳＤで表され、かつ統計学的Ｔ検定を行い、表において、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表す。

結果：モデル確立後のラットは正常ラットと比較して、ラット左後足底に対して不活化結核菌含有完全フロイントアジュバントを注射した後、左後足はすぐに原発性関節炎が発症し、顕著な腫脹とそれに伴う潰瘍が現れ、右後足は、約１０日後に、続発性関節炎が発症し始め、評点の値が徐々に増加し、同時に、耳部には血管が著しく増殖し、顕著に腫れ上がり、尾の関節に腫脹が現れ、分子量の異なるＸ１〜Ｘ９０群はいずれも、モデル群と比較して、アジュバント形態のラット関節炎動物モデルに対して一定の生体内免疫保護作用を発揮でき、その中でＸ７６の効果は最も顕著である。

実施例１５
カラジーナンによって誘発されるラットの足つま先の腫脹急性炎症に対するＸ１〜Ｘ９０の影響
ＳＤラットを取り、ブランクモデル群、デキサメタゾン陽性群（５ｍｇ／ｋｇ）およびＸ１〜Ｘ９０試験群に分ける。注射投与は１日１回行われ、モデル群には等体積の生理食塩水を３日連続して与え、且つ正常に給餌する。最後の投与後の１時間目に、ラットの右後足底皮下に１％カラジーナン０．１ｍＬを注射して炎症を引き起こし、炎症が誘発した１ｈ後、３ｈ後、５ｈ後、７ｈ後に足の容積を測定する。次の式に従って足腫脹度を計算する：足腫脹度（ｍＬ）＝炎症誘発後の足の容積−炎症誘発前の容積。溢れた液体のミリリットル数を記録する（方法：ボールペンを使用して、右関節の突出点で丸を付けて測定マークとし、各ラットの右後足を容積測定装置に順次入れ、バレルの外側に後肢を漏出させ、浸漬の深さは、丸付き部が液面と重なるように決定される。当該足が液体に入ると、液面が高くなり、溢れた液体の体積は、当該ラットの右後足の体積となり、各ラットの右後足の正常な体積を順次測定する）。

結果：モデル確立後に、各群のラットは、足つま先部が急速に腫れ、約３〜５ｈで腫脹のピークに達し、７ｈ後に収まり始める。ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０群はいずれも、カラジーナンによって誘発されるラットの足つま先腫脹に対して、顕著な阻害作用を発揮でき、かつ高投与量群の効果が低投与量群よりも優れ、その中でＸ５の薬剤投与量が２．０ｍｇ／ｋｇである場合には、最も顕著な効果がある。

実施例１６
ヒト網膜血管内皮細胞（ＨＲＣＥＣ）に対するポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の増殖阻害作用
ＭＴＴ法を使用して、ヒト網膜血管内皮細胞増殖を阻害する血管新生阻害剤のポリペプチドの活性を測定する。ＨＲＣＥＣ細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で９０％以上の密度まで培養した場合、トリプシン消化により収集し、培養液で細胞を再懸濁し、かつ顕微鏡でカウントし、細胞濃度を３．０×１０^４個／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、かつ３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養する。細胞を壁に完全に付着させた後、血管新生阻害剤のポリペプチドを加えたものを投与群とし、Ａｖａｓｔｉｎを陽性対照群とし、いかなる薬剤も含まない培養液をブランク対照群とし、培養液で各所定濃度に希釈する。各希釈剤を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにそれぞれ加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４８ｈインキュベートする。９６ウェルプレートに対して、ウェル当たり２０μＬ ５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを加え、連続して４ｈ培養する。培地を吸引し、ウェルあたり１００μＬ ＤＭＳＯを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを使用して、測定波長が５７０ｎｍで、基準波長が６３０ｎｍである場所で吸光度を測定し、かつ成長阻害率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、ＰＩ）を計算し、式は次のとおりである：
ＰＩ（％）＝１−投与群／陰性群
試験は独立して３回繰り返され、試験結果はｍｅａｎ±ＳＤで表され、かつ統計学的Ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表す。試験結果は表２１に示される。

結果：分子量の異なるＸ１〜Ｘ９０は、いずれもＨＲＣＥＣの増殖を顕著に阻害でき、かつ投与量依存性を示し、高投与量群の阻害率は陽性薬物に近く、そのうち、０．２μＭの薬剤投与量でのＸ２８の阻害率は６９．７１％に達し、陽性薬物よりわずかに高い。

実施例１７
ＢＡＬＢ／ｃマウス角膜新生血管に対するポリペプチドＸ１〜Ｘ９０の作用
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスのアルカリによる熱傷で誘発される角膜新生血管モデルの調製：マウスをＸ１〜Ｘ９０実験群および対照群にランダムに分け、群ごとに５匹あり、アルカリによって熱傷した後、硝子体腔に、それぞれＸ１〜Ｘ９０及び生理食塩水を１日１回で連続して１週間注射し、アルカリによる熱傷後の１日目、７日目、１４日目に、細隙灯顕微鏡で各群の角膜炎症反応および新生血管状況を観察する。アルカリによる熱傷後の１４日目に、前眼部撮影機能付きの細隙灯顕微鏡で各群の角膜血管新生状況を撮影して記録し、その後、頸部脱臼によりすべてのマウスを死なせて眼球を摘出し、生理食塩水で血痕を洗い流し、４％パラホルムアルデヒドで１．５ｈ固定し、３０％ショ糖を含むＰＢＳ内に一晩脱水させ、ＯＣＴ凍結切片包埋剤で包埋し、−８０℃の冷蔵庫で保存し、８μｍの凍結切片を作成して免疫組織化学法によりＣＤ３１の発見を測定する。

（２）角膜組織微小血管密度の定量的測定：微小血管密度（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＭＶＤ）は、血管形成を評価するための指標である。抗ＣＤ３１抗体免疫組織化学法により血管内皮細胞を標識し、単位面積当たりの微小血管数をカウントし、これによって新生血管の生成度を測定する。微小血管の統計標準：顕微鏡下で観察して、角膜組織における、隣接組織との境界が明確であり、かつ茶色または褐色で染色された内皮細胞または細胞クラスターをすべて新生血管としてカウントする。１０×２０の顕微鏡で切片全体の新生血管の数をカウントし、角膜組織片を撮影した後、画像処理ソフトウェアのＩｍａｇｅ Ｊで角膜組織片全体の面積を計算し、切片全体の新生血管の密度を求める。

試験は独立して３回繰り返され、試験結果はｍｅａｎ±ＳＤで表され、かつ統計学的Ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を表し、＊＊Ｐ＜０．０１は非常に有意な差を表す。試験結果は表２２に示される。

試験結果から分かるように、異なるポリペプチドＸ１〜Ｘ９０はいずれも、角膜新生血管の成長を顕著に阻害でき、その中でＸ３７の阻害率は５５．２１％に達する。

実施例１８
ウサギ虹彩新生血管に対するＸ１〜Ｘ９０の作用
５７７ｎｍのアルゴンイオンレーザーでウサギ網膜主枝静脈を凝固させ、眼底フルオレセイン血管造影（ＦＦＡ）により静脈の閉塞に成功したことが確認された。５−１２日後、フルオレセイン虹彩血管造影（ＩＦＡ）により、虹彩血管は、正常対照群と比較して、フルオレセインの顕著な漏出を示し、虹彩血管新生の動物モデル（ＮＶＩ）の形成が確認された。

モデル確立に成功した２７３の眼をランダムに群に分け、群当たり３匹がある。それぞれ陰性対照群、Ｘ１〜Ｘ９０治療群としてマークし、三つを一群に分け、それぞれ生理食塩水、０．０５μＭの薬剤投与量のＸ１〜Ｘ９０を２週間連続して１日１回で硝子体腔注射で投与する。３週目に、光学および電子顕微鏡で観察する。

結果：光学顕微鏡下で、虹彩の前面に主に線維組織で構成される線維性血管膜残留であり、開放血内腔が非常に少ないことが観察される。虹彩マトリックス内に見られる血管残骸は、壊死細胞や細胞破片である。光学顕微鏡下での対照眼の虹彩表面には、分岐および潜在的血管腔のある線維血管膜があり、治療群の虹彩の超微細構造には、虹彩マトリックスの中央にある大血管の内皮細胞が、正常な細胞核、細胞質および細胞結合を備え、虹彩マトリックスの中央や虹彩の前面には毛細血管残留があり、周囲には細胞破片があり、且つマクロファージが浸潤し、潜在的血管腔のある毛細血管や変性した壁細胞がないというような一連の退行性変化があり、新生血管の退行を示す。

試験結果から分かるように、Ｘ１〜Ｘ９０はいずれも、ウサギ虹彩血管新生を阻害し、かつ形成された血管を退行させることができる。

実施例１９
ラット脈絡膜新生血管に対するＸ１〜Ｘ９０の作用
６−８週間のオスのＢＮラットに対して、０．５ｍＬ／ｋｇの８４６化合物麻酔薬を腹腔内に注射して充分に麻酔させ、レーザー光凝固を実施する５ｍｉｎ前に、化合物トロピカミド点眼液を１回滴下して両眼の瞳孔を完全に広げる。動物を固定し、−５３．００Ｄコンタクトレンズの助けを借りて、視神経乳頭の周りであって視神経乳頭から２ＰＤ離れた位置において、等距離でクリプトンイオンレーザー光凝固を実施し、合計八つの光凝固スポットがあり、激光波長は６４７．１ｎｍであり、パワーは３５０ｍＷであり、光凝固スポットの直径と時間はそれぞれ５０μｍと０．０５ｓである。光凝固直後に、眼底撮影を実施する。凝固後の３日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目に、ＦＦＡ、組織病理および透過型電子顕微鏡検査をそれぞれ実施する。

眼底撮影およびＦＦＡ検査により、光凝固後の２１日目に光凝固スポットのフルオレセイン漏出がピークに達することが確認され、同時に組織病理学的検査を実施する。光凝固後の２１日目に、光学顕微鏡下で、ＣＮＶが顕著な線維血管増殖を示し、その中で多くの新生血管が見られ、且つ血管腔内に赤血球が見られることが観察され、そして、顕微鏡下で、脈絡膜メラニン細胞の間には毛細血管が凝集的に変化し、内皮細胞が凝集することが観察された。２１日目後、ラット脈絡膜新生血管モデルが形成されたことが示された。

デル確立に成功したラットをランダムに群に分け、群当たり３匹のラットがある。それぞれ陰性対照群、Ｘ１〜Ｘ９０治療群としてマークし、生理食塩水、Ｘ１〜Ｘ９０（Ｘ１〜Ｘ９０薬剤投与量はいずれも０．０５μＭである）をそれぞれ１週間連続して１日１回硝子体腔注射で投与する。投与後の３日目、７日目、１４日目および２８日目にＦＦＡ検査を行う。試験結果は表２３に示される。

結果：ＦＦＡ測定によると、投与後の３日目に、Ｘ１〜Ｘ９０治療群のフルオレセイン漏出は、投与前と比較して顕著に変化し、投与後の７、１４日目に、治療群のフルオレセイン漏出は、投与前よりも徐々に減少し、投与後の２８目日に、フルオレセイン漏出は投与後の１４日目よりも少ない。Ｘ１〜Ｘ９０はラット脈絡膜新生血管を治療できることを示しており、中でもＸ１１の効果は最も顕著であり、投与後の２８日目に、ＣＮＶ発生率は３４．７８％と最も低い。

実施例２０
ＯＩＲマウスにおける網膜血管に対するＸ１〜Ｘ９０の影響
ＯＩＲモデルの確立：Ｃ５７／Ｂ１６マウスの出産後７日目から１２日目まで、子マウスおよび雌マウスを７５％の高濃度酸素環境にさらすと、その中央網膜の毛細血管が急速に消えることを引き起こせる。１２日目に室内の空気に戻すと、高濃度酸素にさらされた網膜血管が急速に消え、広範囲の異常な血管新生を引き起こし、網膜の中央部分は長い間ほとんど血管のない状態を維持する。血管が完全に消えた後、１３日目に、生理食塩水（陰性群）、Ｘ１〜Ｘ１２、Ｘ１３〜Ｘ４４、Ｘ４５〜Ｘ９０をそれぞれ硝子体腔注射で投与し、１７日目に網膜血管を評価する（閉鎖されていない血管をマークするために、５０ｍＬテキサスレッドでマークされたトマトレクチンを左心室に注射して５ｍｉｎ循環させる）。試験結果は表２４に示される。

陰性対照と比較して、ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０で処理されたＯＩＲマウス網膜における新生血管叢が顕著に減少し、ポリペプチドＸ１〜Ｘ９０投与群の中でも、Ｘ１３の効果は最も良好で、０．０５μＭの薬剤投与量での阻害率は６２．２６％に達する。

実施例２１
未熟児網膜症のラットモデル新生血管に対するＸ１〜Ｘ９０の作用
変動酸素誘発動物モデルを使用して、同じ日に自然に生まれた新生ラット（１２ｈ内）を酸素供給モデル群、酸素供給治療群および正常対照群の３群にランダムに分ける。酸素供給モデルをさらに三つの亜群モデル群に分けて、治療群と共にプレキシガラス製の半密閉酸素チャンバーに置き、チャンバー内に医療用酸素を注入し、酸素メーターによって濃度を８０％±２％に調整し、２４ｈ後に、窒素を酸素チャンバーに導入し、酸素濃度を１０％±２％に速く調整し、かつ２４ｈ維持する。このように繰り返して、酸素チャンバー内の酸素濃度を２４ｈおきに８０％と１０％の間で交互に維持し、７日間継続してから空気に移して飼育する。酸素濃度を１日８回監視し、チャンバー内の環境温度を２３℃±２℃に制御し、敷料を交換し、食物を追加し、水を交換し、雌ラットを１回交換する。正常対照群を動物房の飼育環境に置く。モデル群は、対照群と比較して、網膜スプレッドのＡＤＰ酵素染色によると、血管の変化が明らかであり、網膜内境界膜を通過して硝子体に侵入した血管内皮細胞核の数が増加し、その差が統計学的意味がある場合、モデル確立に成功する。

酸素供給治療群を三つの亜群に分け、モデル確立の７日目に、Ｘ１〜Ｘ３０、Ｘ３１〜Ｘ６０、Ｘ６１〜Ｘ９０をそれぞれ硝子体腔注入で投与し、酸素供給モデル群および対照群には生理食塩水のみ投与し、１週間連続して投与する。１４日目に、エーテルで麻酔して死なせた後、眼球を摘出し、４０ｇ／Ｌパラホルムアルデヒド溶液内に２４ｈ固定する。勾配アルコールで脱水させ、キシレンで透明にする。ワックスに浸漬した後、視神経乳頭の周囲を避けるように、連続的に切片を作成し、厚さは４μｍである。角膜から視神経乳頭までの矢状面に平行であるように切片を作成する。各眼球から１０枚の切片をランダムに採取し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い、網膜の内境界膜を通過した血管内皮細胞核の数（内境界膜に密接に関連する血管内皮細胞核のみ）をカウントし、各眼球の切片当たりの細胞の平均数を統計する。

結果：対照群には、切片で網膜内境界膜を通過して硝子体に侵入した血管内皮細胞核が発見されていなかった、またはその数が非常に少ない。モデル群では、網膜内境界膜を通過した血管内皮細胞核の数が多く見られ、一部は単独で現れ、一部はクラスターとして現れ、また、いくつかの切片では、さらに網膜深部血管に隣接する血管内皮細胞核が見られ、これらは硝子体または眼部の他の組織ではなく、網膜から由来することが確認された。治療群の切片では、網膜内境界膜を通過した血管内皮細胞核はわずかに見られた。実験結果は表２５に示される。

結果から、Ｘ１〜Ｘ９０治療群の網膜血管内皮細胞核のカウントは、酸素供給モデル群の２７．４６３±２．２１３と比較して、血管内皮細胞核数が顕著に減少したことが示され、酸素誘発新生ラットの網膜病変モデルの新生血管の形成をある程度阻害できることが確認され、中でもＸ１７の効果は最も良好で、薬剤投与量が０．０５μＭである場合、細胞核のカウントは７．０１２±１．３２１である。

Claims (11)

1. マレイミド基で血管新生阻害剤のポリペプチドを修飾し、マレイミド基のカルボキシル基がポリペプチドのＮ末端Ａｒｇのアミノ基とアミド結合を形成することを特徴とする修飾された血管新生阻害剤のポリペプチド。
2. 修飾された血管新生阻害剤のポリペプチド配列には、二つの官能基Ａ、Ｂが含まれ、官能基Ａは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａであるか、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌにおける一つまたは二つのアミノ酸残基が置換、削除、添加を行って得られる誘導ポリペプチドであり、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａと同等の血管新生阻害および抗腫瘍作用、抗炎活性を有し、官能基Ｂは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐであり、そのうち、ＡとＢの官能基はｌｉｎｋｅｒを介して接続され、つまり、修飾されたポリペプチド配列構造はＡ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｂであることを特徴とする請求項１に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチド。
3. 前記のｌｉｎｋｅｒは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＬｙｓまたはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒであることを特徴とする請求項２に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチド。
4. 修飾されたポリペプチド配列は、好ましくは、
   

   

   または
   

   

   または
   

   

   であることを特徴とする請求項１または２または３に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチド。
5. ポリペプチドセグメントとマレイミド基は異なるｌｉｎｋｅｒを介して接続され、そのうち、ｎ、ｍ、ｘ、ｙはぞれぞれ、繰り返し構造単位のメチレン基、メチレン基、オキシエチレン、メチレン基の数であり、前記のｎ、ｍ、ｘ、ｙはいずれも整数であり、具体的な数値範囲は、ｎ＝１−１２、ｍ＝１−１２、ｘ＝１−５、ｙ＝０−６であることを特徴とする請求項４に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチド。
6. 腫瘍、炎症および眼内血管新生疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項４に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドの応用。
7. 前記の腫瘍は、ヒトの頭頸部、脳、甲状腺、食道、膵臓、肺、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸または直腸、卵巣、血管、子宮頸、前立腺、膀胱または精巣に由来する原発性または続発性癌、黒色腫、血管腫および肉腫であることを特徴とする腫瘍、炎症および眼内血管新生疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項６に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドの応用。
8. 前記の炎症は、関節リウマチ、痛風性関節炎、反応性関節炎、変形性関節症、乾癬、感染性関節炎、外傷性関節炎および強直性脊椎炎を含むことを特徴とする腫瘍、炎症および眼内血管新生疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項６に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドの応用。
9. 前記の眼内血管新生疾患は、ＡＭＤ、虹彩血管新生、脈絡膜血管新生、網膜血管新生または角膜血管新生を含むことを特徴とする腫瘍、炎症および眼内血管新生疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項６に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドの応用。
10. 請求項１または２または３に記載の修飾された血管新生阻害剤のポリペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする腫瘍、炎症および／または眼内血管新生疾患を治療するための薬剤。
11. 薬剤の投与方法は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、眼硝子体注射および静脈点滴を含む注射投与であることを特徴とする請求項１０に記載の腫瘍、炎症および／または眼内血管新生疾患を治療するための薬剤。