JP2020531579A - 有効成分としてリポペプチド挿入リポソームを含むワクチンアジュバントおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
1.発明の分野
本発明は、活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含むワクチンアジュバント、およびその使用に関する。
水疱または帯状疱疹は、VZV(水痘帯状疱疹ウイルス)により引き起こされ、単一の脊髄または脳神経の感覚神経において分布して皮膚上で発症する疾患である。VZV感染の初期段階においては、ウイルスは、皮膚の表皮および真皮において増殖し、次いで周囲の神経細胞中に浸透し、潜伏し続ける。増殖のプロセスにおいて、潜伏期の前に水疱が発生して発疹が生じ、その後、ウイルスは神経節において潜伏し続ける。身体の耐性が低下すると、VZVは再活性化し、帯状疱疹の形態において現われる。VZVの再活性化および帯状疱疹の発症は、特に高齢者および免疫抑制剤処置を受けている者において、T細胞を中心とする細胞性免疫応答の低下と関連する。帯状疱疹が発症すると、水泡性病変が現れ、病変が回復した場合であっても、神経痛が後効果として残る。神経痛は、いったん発症すると、治癒させることが困難であり、重篤な疼痛に起因する低いクオリティ・オブ・ライフを引き起こす。
活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含む、ワクチンアジュバント、これを含むワクチン組成物、およびその使用を提供することが、本発明の目的である。
本発明はまた、本発明のアジュバントおよび抗原を含む、ワクチン組成物を提供する。
本発明はまた、活性成分として本発明のワクチン組成物を含む、ウイルス感染のための予防または治療剤を提供する。
加えて、本発明は、本発明のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、ウイルス感染のための予防または治療方法を提供する。
加えて、本発明は、本発明のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、がんのための予防または治療方法を提供する。
加えて、本発明は、がんのための予防または治療剤を調製するために使用するための、本発明のワクチン組成物の使用を提供する。
本発明の脂質およびリポペプチドを含む複合アジュバントであるLipo−Pamを含むワクチン組成物は、細胞媒介性免疫応答のみならず体液性免疫応答をも高度に誘導し、水痘帯状疱疹ウイルスのgE抗原ならびに日本脳炎ウイルスまたは季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原のgE抗原を用いることにより調製されたワクチン組成物は、顕著な効果を示した。したがって、本発明の組成物は、商業的に有効に用いることができる。
本明細書において以後、本発明を詳細に記載する。
本発明は、活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含む、ワクチンアジュバントを提供する。
アジュバントは、上記のような特徴を有していてもよい。例えば、アジュバントは、リポペプチド挿入リポソームを含んでもよく、免疫活性物質をさらに含んでもよい。
ワクチンは、抗原特異的体液性免疫応答のみならず、細胞媒介性免疫応答をも高度に誘導することができる。
組み換えワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞媒介性免疫応答をも高度に誘導した(図3、4および6〜21を参照)。
ワクチン組成物は、上記のような特徴を有していてもよい。例えば、ワクチン組成物は、アジュバントおよび抗原を含んでもよい。アジュバントは、リポペプチド挿入リポソームを含んでもよく、免疫活性物質をさらに含んでもよい。
しかし、以下の例は、単に本発明を説明するためのものであり、本発明の内容は、それらに限定されない。
<1−1>プラスミドの構築
第1に、遺伝子(配列番号1)を、VZVのgE(糖タンパク質E)遺伝子発現領域の外側の領域において制限酵素認識配列(5’におけるNheI部位および3’におけるXhoI部位)ならびにコザック配列を含むように合成した。この時点において、ヒトヘルペスウイルス3型(HHV−3)ゲノム全体のORF68(糖タンパク質E)からC末端アンカードメインを取り除く形態におけるCHO細胞についてのコドン最適化配列を、鋳型として用いた。配列番号1により表されるVZVの1.6kbのgE遺伝子を、NheIおよびXhoI制限酵素で消化し、pPGXIIベクター中にサブクローニングした。結果として、VZVgE発現プラスミドであるpPGXII−VZVgEを調製した(図1)。
例<1−1>において調製したpPGXII−VZVgEプラスミドのDNAを、AhdI制限酵素で自由化し、これを、HT(ヒポキサンチン−チミジン)を含む培地中で6回継代したCHO DG44(S)−EX細胞中に、pDCH1P(dhfr)プラスミドDNAと一緒に、エレクトロポレーションによりトランスフェクトした。次いで、形質転換した細胞を、HTを含む培地中に播種した。細胞が十分に増殖したら、細胞を選択培地中でHTなしで培養した。約2週間後、最初に順応させた細胞群を得た。得られた細胞群を用いて、ドットブロットおよびウェスタンブロットを行って、最初に順応させた細胞群から4つの高生産株を選択した。選択された株を、限界希釈法により希釈し、各々の株を、1細胞/ウェルとなるように、10プレートの96ウェルプレート中に播種し、単一細胞株を単離した。単離された単一細胞株のコロニーを24ウェルのプレートに移し、培養し、次いで、十分な細胞数を確保してから、エルレンマイヤーフラスコ中で懸濁培養した。6回の継代の後、細胞が一定の速度で増殖しつつ95%以上の生存率が保たれている場合、流加培養を行って、生産性および安定性を確認した。最終的な細胞株は、高い生産性を有し、かつ80%以上の安定性を保つ、5つの候補細胞株の中から、細胞増殖および生産性を考慮して選択した。
例<1−2>において最終的に選択された細胞株を、EfficientFeed C+(Invitrogen)を添加した後、
HyCell CHO(GE Healthcare)培地を含む7.5リットルの広口瓶の発酵槽中に、6.5×106細胞/mlの密度で播種し、培養した。この時点において、発酵槽は、32℃、DO30%、100rpmで操作し、培地のpHを6.8より高く維持した。発酵槽中のグルコースおよび乳酸の含有量を、毎日分析し、グルコース含有量が20mmol/lより下に低下した場合、45%のD−グルコースを1v/v%の濃度で添加し、10日間にわたり培養した。
例<1−3>において培養された細胞から、デプスフィルターを用いて培養培地を回収し、それからVZVの組み換えgE抗原を精製した。特に、組み換えVZVgE抗原を、4ステップのカラムクロマトグラフィーにより、ブチル−セファロース、DEAE−セファロース、CHTヒドロキシアパタイトおよびSP−セファロースを連続して、ならびにワンタイムUF/DFをバッファー交換のために用いて、精製した。
結果として、図2において示されるとおり、精製された組み換えVZVgE抗原は、約70kDaの分子量を示した(図2)。
<2−1>試験ワクチンの調製および投与
第1に、DC−Chol:DOPEリポソームを調製するために、DC−CholおよびDOPEを、それぞれクロロホルム中に溶解し、次いで、窒素ガスにより有機溶媒を蒸発させつつ、混合溶液が容器の底壁上に均一に分布するように、ガラス容器を回転させた。この時点において、底壁上に薄いフィルムが形成された。形成されたフィルム中に残留している有機溶媒を、真空乾燥機中で1時間にわたり保管することにより取り除いた。完全に乾燥した脂質フィルムに蒸留水を添加し、その後、超音波浴を用いて10分間かけて十分に再水和した。多重膜ベジクル(MLV)懸濁液が生成されたら、20mMのリン酸ナトリウム中に300mMのNaClを含む2×のバッファー溶液(pH7.0)を、蒸留水と同じ量で添加した。生じたMLVを、3秒/3秒(パルスオン/オフ)の条件下において5サイクルの超音波処理(5分/サイクル)に供し、DC−Chol:DOPEリポソームを小単層ベジクル(SUV)の形態において調製した。
その後、アジュバントを、以下の表1において示される組成物と混合し、VZVgE抗原を、5μg/用量の濃度で混合物に添加して、試験ワクチンを調製した。G2、G5およびG9群の場合、混合物を超音波処理し、抗原を添加して、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<2−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、抗原特異的抗体形成をELISAで分析することにより、抗体価を決定した。
例<2−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を、第2のワクチン接種の2週間後である第4週においてマウスから脾臓を抽出することにより全脾細胞を単離した後で行ったELISPOTおよびサイトカインELISAにより分析した。
第1に、Lipo−pamを用いることにより調製されたワクチンの構造を確認するために、DC−Chol(ジメチルエタンカルバモイルコレステロール)およびDOPE(ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン)脂質を、Marina Blueで染色し、Pam3−CSKKKKを、6−TAMRAおよびSE(6−カルボキシテトラメチルローダミン、サクシニミジルエステル)で染色し、組み換えVZVgE抗原を、フルオレセインでそれぞれ染色した。Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−CholとDOPEとを混合し(3:7)、Pam3−CSKKKKを25μg/用量の濃度でそれに添加したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、Lipo−PamおよびPoly(I:C)を40μg/用量の濃度で混合し、抗原を5μg/用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。共焦点顕微鏡を用いて、ワクチンの構造を確認した。
脂質の比、Pam3−CSKKKKの用量、Poly(I:C)の用量、およびリポソームへの組み換えVZVgE抗原の結合の程度により、組み換えワクチンの免疫原性を比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−CholとDOPEとを混合し(1:1〜3:7)、Pam3−CSKKKKを25または100μg/用量の濃度でそれに添加したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、Lipo−PamおよびPoly(I:C)を、20、40、60、80または160μg/用量の濃度で混合し、組み換えVZVgE抗原を5μg/用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<4−1>において調製されたLipo−pamと、例1において調製された組み換えVZVgE抗原との間の結合力を、分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、常法により確認した。
結果として、高Pam3−CSKKKK処方物中においては(G5〜G7、G11およびG12群)、組み換えVZVgE抗原の大部分が、Lipo−pamに組み合わされた。加えて、gE抗原に競合的に結合する低用量のPoly(I:C)を有するG2群においては、組み換えVZVgE抗原の大部分が、Lipo−pamに結合した。
例<4−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えVZVgE抗原に対する全IgG抗体価を、調製された試料を用いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により分析した。
例<4−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
3:7の比で混合されたDC−Chol:DOPE、25μg/用量のPam3−CSKKKK、および20μg/用量のPoly(I:C)を用い、脂質の用量および組み換えVZVgE抗原によるワクチンの免疫原性を比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=3:7)が31.25、62.5または125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、以下の表3において示されるとおり、Lipo−Pamを20μg/用量の濃度でPoly(I:C)と混合し、組み換えVZVgE抗原を2、5または10μg/用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<5−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えVZVgE抗原に対する全IgG抗体価を、調製された試料を用いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により分析した。
例<5−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
図9Bにおいて示されるとおり、サイトカインELISAの結果により、2μg/用量の組み換えVZVgE抗原および125μg/用量のDC−Chol:DOPE脂質を用いることにより調製されたG8群は、3種のサイトカインの最も多い分泌を誘導し、これは、ELISPOTアッセイの結果と同様であった。しかし、DC−CholおよびDOPCを用いることにより調製されたG11群は、他の試験群より少ないサイトカイン分泌を誘導した(図9B)。
3:7の比で混合されたDC−Chol:DOPE、および25μg/用量のPam3−CSKKKKを用い、脂質の用量、Poly(I:C)および組み換えVZVgE抗原によるワクチンの免疫原性を比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=3:7)が62.5、125または250μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、以下の表4において示されるとおり、Lipo−Pamを20、40、80または100μg/用量の濃度でPoly(I:C)と混合し、組み換えVZVgE抗原を2、5または10μg/用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<6−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えVZVgE抗原に対する全IgG抗体価を、調製された試料を用いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により分析した。
例<6−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
組み換えワクチン中に含まれる抗原の用量による、Zostavax、市販の弱毒化生ワクチン、および組み換えVZVgE抗原を用いることにより調製された組み換えワクチンの免疫原性を比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=3:7)が125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。加えて、25μg/用量のPam3−CSKKKK、200μg/用量のPoly(I:C)および5μg/用量の抗原を混合することによりL−pampoを調製し、これを対照として用いた。その後、以下の表5において記載されるとおりの組成を有する試験ワクチンを、調製した。Zostavaxまたは調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<7−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えVZVgE抗原およびそのアイソタイプに対する全IgG抗体価を、調製された試料を用いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により分析した。
例<7−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、脾細胞を用いて、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAを行った。フローサイトメーターを用いてIFN−γ、TNF−αおよびIL−2についての細胞内サイトカイン染色(ICS)分析を行うことにより、各処方物中の組み換えVZVgE抗原に対して特異的なサイトカインを分泌するCD4+T細胞のレベルを比較することにより、細胞媒介性免疫応答を分析した。
図11Bにおいて示されるとおり、サイトカインELISAの結果により、Zostavaxを投与されたG2群においては、最も少ないIFN−γ、IL−4およびTNF−αの分泌が誘導され、一方、Lipo−pamを用いたG5およびG6群においては、最も多いIFN−γ、IL−4およびTNF−αの分泌が誘導された(図13B)。
加えて、図15において示されるとおり、gE抗原特異的CD4+T細胞の多機能性を比較した結果により、各々の試験群において100%の細胞がサイトカインのうちの1つ以上の型を分泌すると仮定すると、1つ以上のサイトカインを分泌するCD4+T細胞のうち、3つ全てのサイトカインを分泌するT細胞が高い試験群は、Lipo−pamを有したG5およびG6群であった。一方、Zostavaxを投与されたG2群および水酸化アルミニウムを用いたG3群は、1つのみのサイトカインを分泌するCD4+T細胞の比率が高いことを示し、このことは、低い多機能性を確認する(図15)。
Zostavax、市販の弱毒化生ワクチン、および組み換えVZVgE抗原を用いることにより調製された組み換えワクチンの免疫原性を、組み換えワクチン中に含まれる脂質およびPoly(I:C)の用量により比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=3:7)が125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるか、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=1:1)が125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。加えて、25μg/用量のPam3−CSKKKK、200μg/用量のPoly(I:C)および5μg/用量の抗原を混合することにより、L−pampoを調製した。DC−Chol:DOPEリポソームは、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。次いで、Lipo−Pamを20、40または80μg/用量の濃度のPoly(I:C)と混合し、組み換えVZVgE抗原を5μg/用量の濃度ででそれに添加すること(G6〜G9群)により、同時に、Lipo−Pamを40μg/用量の濃度のPoly(I:C)および5μg/用量の濃度の組み換えVZVgE抗原と混合することにより(G10およびG11)、Lipo−PamをDC−Chol:DOPEリポソームと混合することにより(G5群)、または100μg/用量の水酸化アルミニウムと5μg/用量の組み換えVZVgE抗原とを混合することにより、試験ワクチンを調製した。Zostavaxまたは調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<8−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。調製された試料を用いるELISAによる抗原特異的抗体形成の分析により、抗体価を決定した。組み換えVZVgE抗原に対する全IgG抗体価を、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により分析した。
例<8−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
脂質の型、Poly(I:C)の用量、およびLipo−pamの調製において組み換えVZVgE抗原を混合する方法による、ワクチンの免疫原性を比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=3:7)が125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるか、脂質の濃度(DC−Chol:DPPC=1:1または3:7)が125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。加えて、25μg/用量のPam3−CSKKKK、200μg/用量のPoly(I:C)および5μg/用量の組み換えVZVgE抗原を混合することにより、L−pampoを調製した。次いで、Lipo−Pamを40または200μg/用量の濃度のPoly(I:C)と混合し、組み換えVZVgE抗原を5μg/用量の濃度でそれに添加することにより、(G3〜G6群)、または、Lipo−Pamを40または200μg/用量の濃度のPoly(I:C)および5μg/用量の濃度の組み換えVZVgE抗原と同時に混合することにより、試験ワクチンを調製した(G7〜G10群)。調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<9−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えVZVgE抗原に対する全IgG抗体価を、調製された試料を用いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により分析した。
例<9−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
脂質の型および用量、免疫活性物質の種類および組み換えVZVgE抗原の用量により、ワクチンの免疫原性を比較した。免疫活性物質として、Poly(I:C)またはQS21を用いた。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPE、DPPCおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−Chol、DPPCおよびPam3−CSKKKKを、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=3:7)が125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるか、脂質の濃度(DC−Chol:DPPC=1:1)が、62.5、125または250μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除き、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。加えて、25μg/用量のPam3−CSKKKK、200μg/用量のPoly(I:C)および5μg/用量の組み換えVZVgE抗原を混合することにより、L−pampoを調製した。次いで、Lipo−Pamを40μg/用量の濃度でPoly(I:C)と混合することにより(G2〜G8群)、または、Lipo−Pamを、5μg/用量の濃度のQS21と混合すること(G9)および組み換えVZVgE抗原を5μg/用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<10−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えVZVgE抗原に対する全IgG抗体価を、調製された試料を用いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により分析した。
例<10−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
組み換えVZVgE抗原を用いることにより調製された組み換えワクチン中に含まれるリポペプチドの型によるワクチンの免疫原性を比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DPPCおよびリポペプチドを溶解し、DC−Chol、DPPCおよびリポペプチドを、脂質の濃度(DC−Chol:DPPC=1:1)が125μg/用量となり、リポペプチドの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。粒子サイズ分析計(Malvern, Nono-ZS)を用いて、Lipo−Pamのサイズおよびゼータ電位を測定した。この時点において、リポペプチドとして、Pam3−CSKKKK、Dhc−SKKKK、PamDhc−SKKKK、Pam−CSKKKK、Pam2Cys−SKKKK、PHC−SKKKKまたはFSL−1を用いた。
次いで、以下の表11において示されるとおり、調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<11−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えVZVgE抗原に対する全IgG抗体価を、調製された試料を用いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により分析した。
結果として、図22において示されるとおり、抗体は全試験群において生成され、特に、より高い抗体価は、他の試験群と比較して、G3、G7、ならびにリポペプチドとしてPam3−CSKKKK、Pam2Cys−SKKKKおよびFSL−1を用いることにより調製されたLipo−pamを用いたG9群において誘導された(図22)。
例<11−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
したがって、<例11>の結果から、Lipo−pamの調製において用いられた任意の型のリポペプチドが、体液性および細胞媒介性免疫応答を誘導し、したがって、本発明によるLipo−pamは、抗原と多様な型のリポペプチドとの組み合わせを用いたワクチンの調製のために用いることができることを確認した。特に、組み換え帯状疱疹ワクチンの調製において、体液性および細胞媒介性の両方の免疫応答を誘導するPam3−CSKKKKは、ワクチンの効力を改善するためのリポペプチドとして用いることができる。
組み換え日本脳炎ウイルスgE抗原を用いて、L−pampoまたはLipo−pamを用いて処方された組み換えワクチンの免疫原性を比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−Chol、DOPEおよびPam3−CSKKKKを、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=3:7)が125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。25μg/用量のPam3−CSKKKK、20μg/用量のPoly(I:C)および0.1または0.5μg/用量の組み換えJEVgE抗原を混合することにより、L−pampoを調製した。組み換えJEVgE抗原を、バキュロウイルス−昆虫細胞系において発現させ、精製した。次いで、Lipo−Pamを40μg/用量の濃度でPoly(I:C)と混合し、組み換えJEVgE抗原を0.1または0.5μg/用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<12−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。組み換えJEVgE抗原または不活化JEV抗原を、96ウェルのマイクロプレート上に100ng/ウェルの濃度でコーティングしたことを除いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により調製された試料を用いて、JEVgE抗原に対する全IgG抗体価を分析した。
例<12−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、組み換えJEVgE抗原または不活化JEV抗原を用いたことを除いて、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
図25Bにおいて示されるとおり、サイトカインELISAの結果により、IFN−γ、IL−4およびTNF−αは、Lipo−pam処方物(G6およびG7群)、L−pampo処方物(G4およびG5群)および不活化ワクチン(G2およびG3群)の順で分泌された(図25B)。
季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を用いて、ミョウバン、L−pampoまたはLipo−pamを用いて処方されたワクチンの免疫原性を比較した。
Lipo−Pamは、DC−Chol、DOPE、DPPCおよびPam3−CSKKKKを溶解し、DC−Chol、DOPE、DPPCおよびPam3−CSKKKKを、脂質の濃度(DC−Chol:DOPE=3:7またはDC−Chol:DOPE=1:1)が125μg/用量となり、Pam3−CSKKKKの濃度が25μg/用量となるように混合したことを除いて、例<2−1>において記載されるものと同じ様式により調製した。25μg/用量のPam3−CSKKKK、20μg/用量のPoly(I:C)、および0.5μg/用量の4株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を混合することにより、L−pampoを調製した。4株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原は、A/California/07/2009(H1N1)、A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)、B/Phuket/3073/2013(BY)およびB/Brisbane/60/2008(BV)から得られた。これらの抗原を、卵中で増幅させ、産生させ、精製した。次いで、Lipo−Pamを40μg/用量の濃度でPoly(I:C)と混合し、季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を0.5μg/用量の濃度でそれに添加することにより、試験ワクチンを調製した。調製されたワクチンを、6週齢のC57BL/6メスマウス(Orient Bio Inc., Korea)に、2週間の間隔で2回、筋肉内注射した。
例<13−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を分析するために、免疫化の前である第0週において、第1のワクチン接種の2週間後である第2週において、および第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスの血清を分離することにより、試料を調製した。調製された試料を用いて、4株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を、96ウェルのマイクロプレート中に、それぞれ25ng/ウェルの濃度でコーティングしたことを除いて、例<2−2>において記載されるものと同じ様式により、季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原に対する全IgG抗体価を分析した。
例<13−1>において投与された試験ワクチンにより誘導された細胞媒介性免疫応答を分析するために、第2のワクチン接種の2週間後である第4週において、マウスから脾臓を抽出することにより、全脾細胞を単離した。次いで、ELISPOTアッセイおよびサイトカインELISAにより、4株の季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原を用いたことを除いて、例<2−3>において記載されるものと同じ様式により、細胞媒介性免疫応答を分析した。
Claims (17)
- 活性成分としてリポペプチド挿入リポソームを含む、ワクチンアジュバント。
- リポペプチドが、Pam3Cys−SKKKK、Pam3−CSKKKK、PHC−SKKKK、Ole2PamCys−SKKKK、Pam2Cys−SKKKK、PamCys(Pam)−SKKKK、Ole2Cys−SKKKK、Myr2Cys−SKKKK、PamDhc−SKKKK、Pam−CSKKKK、Dhc−SKKKKおよびFSL−1からなる群より選択されるいずれか1つ以上である、請求項1に記載のワクチンアジュバント。
- 免疫活性物質をさらに含む、請求項1に記載のワクチンアジュバント。
- 免疫活性物質が、Poly(I:C)、QS21、MPLA(モノホスホリルリピドA)、CpGおよびフラゲリンからなる群より選択されるいずれか1つ以上である、請求項3に記載のワクチンアジュバント。
- Poly(I:C)が、50〜5,000bpの長さである、請求項4に記載のワクチンアジュバント。
- 請求項1に記載のアジュバントおよび抗原を含む、ワクチン組成物。
- 抗原が、病原体のタンパク質、組み換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖、リポ多糖またはポリヌクレオチドである、請求項6に記載のワクチン組成物。
- 抗原が、細胞またはウイルス由来のものである、請求項6に記載のワクチン組成物。
- 抗原が、水痘帯状疱疹ウイルスgE(糖タンパク質E)抗原、日本脳炎ウイルスgE(糖タンパク質E)抗原および季節性不活性型インフルエンザウイルス抗原からなる群より選択されるいずれか1つ以上である、請求項6に記載のワクチン組成物。
- ワクチンが、細胞媒介性免疫応答を誘導する、請求項6に記載のワクチン組成物。
- ワクチンが、Th1免疫応答を誘導する、請求項6に記載のワクチン組成物。
- 活性成分として請求項6に記載のワクチン組成物を含む、ウイルス感染のための予防または治療剤。
- 活性成分として請求項6に記載のワクチン組成物を含む、がんのための予防または治療剤。
- 請求項6に記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、ウイルス感染のための予防または治療方法。
- 請求項6に記載のワクチン組成物を対象に投与するステップを含む、がんのための予防または治療方法。
- ウイルス感染のための予防または治療剤を調製するために使用するための、請求項6に記載のワクチン組成物の使用。
- がんのための予防または治療剤を調製するために使用するための、請求項6に記載のワクチン組成物の使用。
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