WO2019035605A2 - 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트 및 이의 용도 - Google Patents
리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 리포좀 및 리포펩티드를 포함하는 재조합 대상포진 백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 리포좀 및 다양한 종류의 리포펩티드를 포함하는 복합 아쥬반트인 Lipo-Pam과 바리셀라-조스터 바이러스 gE 항원 또는 일본뇌염 바이러스 gE 항원 또는 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 이용하여 제조한 백신 조성물이 체액성 면역반응 뿐만 아니라 세포성 면역반응도 높게 유도함으로써, 본 발명의 조성물은 상업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트 및 이의 용도에 관한 것이다.
수두 또는 대상포진(Herpes Zoster)은 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus: VZV)에 의해 유발되며, 단일 척수 혹은 뇌신경의 감각신경에 분포하는 피부에 발생하는 질환이다. VZV의 감염초기에는 바이러스가 피부의 표피와 진피 부위에서 증식한 후 주변 신경세포 속으로 침투하여 잠복상태로 존재한다. 이러한 잠복기 이전에 증식하는 과정에서 수두가 발생 및 발진하게 되며, 이후 신경절 안에 잠복해 있다가 신체 저항력이 떨어지게 되면, VZV가 재활성화되면서 대상포진 형태로 나타나게 된다. VZV의 재활성화 및 대상포진의 발병은 T 세포를 중심으로 하는 세포면역 반응의 약화와 관련이 있으며, 특히 고령자나 면역억제 치료를 받는 사람에서 호발한다. 대상포진이 발병하면 수포성 병변이 나타나고, 병변이 회복되더라도 신경통의 후유증이 남는데 신경통은 일단 발생하면 완치가 어렵고 극심한 통증으로 인해 삶의 질을 떨어지게 한다.
VZV에 전염되고 초기 대응에 소홀하여 이의 잠복기를 방치하게 되면, 결국 VZV의 재활성화로 인해 대상포진이 발생하며 심한 고통을 수반한다. 이러한 경우 일반적으로, 항바이러스제를 투여하지만 이는 잠복기 동안 이미 몸 안에서 내성이 생겼을 가능성이 큰 VZV의 사멸이나 활성의 저해를 이끌어내기 어렵다는 문제점이 있다.
VZV에 대한 항바이러스제로 알려진 제제로는 아시클로버, 발아시클로버, 팜시클로버 등이 있으며, 이중 아시클로버가 가장 상용화되어 있다. 하지만, 아시클로버는 수두가 발진한 후 24시간 이내에 투여하는 경우에만 유의적인 효과를 볼 수 있다. 즉, 아시클로버는 바이러스 감염 또는 수두 발진 후 24시간 이후, 또는 VZV의 재활성화에 따른 대상포진 발생 후에 처방하는 경우에는 항바이러스제로서 충분한 효과를 보기 어렵다.
고령자 및 면역억제 환자가 증가하면서 국내에서 대상포진의 발병율은 급속도로 증가하고 있으나 근원적인 치료법이 없기 때문에 이를 예방할 수 있는 백신을 개발하는 것이 필요하다.
현재 시판되고 있는 대상포진 예방백신은 임상시험에서 그 효능을 인정받기는 하였으나 예방백신 투여에 의한 대상포진 발생율은 50% 정도만이 감소함으로써 효능이 미미하다. 또한, 현재 시판되고 있는 대상포진 예방백신은 약독화된 생백신이기 때문에 대상포진의 발병율이 높은 면역억제 환자, 임산부 및 임신 가능성이 있는 사람에게 투여하는데 제한이 있다. 또한, 대상포진은 신경절 안에 잠복해 있다가 신체 저항력이 떨어지면 VZV가 재활성화되면서 발병하므로, 이를 치료하기 위해서는 체액성 면역반응보다 세포성 면역반응을 유도하는 것이 더욱 중요하다. 따라서, 효과적이고 안전하면서 세포성 면역반응을 유도할 수 있는 대상포진 백신의 개발이 필요하다.
항원의 분자패턴은 면역반응의 결과에 영향을 준다. 이는 특히 병원성 미생물 전체가 항원으로 사용되는 경우에 중요한데 이러한 항원은 리포폴리사카라이드, 핵산, 지질단백질 또는 단백질과 같은 여러 종류의 PAMP(pathogen associated molecular pattern) 리간드가 섞여있다. 항원제시 세포(antigen presenting cell) 표면에 있는 PRR(pathogen recognition receptor)은 PAMP를 인지하여 다양한 공동자극 분자와 사이토카인을 유도하기 위한 신호를 촉진시켜 유도되는 면역반응의 종류에 관여한다. 예를 들면, 인터페론 감마와 IL-12는 바이러스 감염에 대한 면역반응에 중요한 Th1 세포 반응을 유도한다. Th1 타입의 면역반응은 더 많은 IgG2a 또는 IgG2b 생성과 강력한 세포성 면역반응을 유도한다.
이와 관련하여, 대한민국 특허등록 제10-1723605호에는 VZV의 단백질을 코딩하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하는 플라스미드를 함유하는 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제10-2014-0022799호에는 한국인 환자로부터 분리된 VZV MVA06의 게놈 DNA 및 이의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 단백질을 유효성분으로 하는 수두 및 대상포진 바이러스 백신 조성물이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 안전하면서도 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 높게 유도하는 대상포진 백신을 개발하기 위해 연구하던 중, Pam3-CSKKKK(Pam3CSK4) 리포펩티드와 지질을 포함하는 리포좀 형태의 복합 아쥬반트인 Lipo-pam을 제조한 후, 상기 제조된 아쥬반트에 폴리(I:C)와 항원을 포함하는 백신 조성물이 분자량이 작은 재조합 단백질 항원에 대한 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응 또한 높게 유도하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 백신 조성물이 Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, PamDhc-SKKKK 등을 포함하는 다양한 리포펩티드를 사용하여 제조하거나, 바리셀라-조스터 바이러스의 gE(glycoprotein E) 항원뿐만 아니라 일본뇌염 바이러스의 gE(glycoprotein E) 항원 또는 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 이용하였을 때에도 유의적인 효과를 보임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 아쥬반트를 포함하는 백신 조성물은 리포펩티드 및 항원의 종류에 제한없이 상업적으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트, 이를 포함하는 백신조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 예방 또는 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스의 감염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스의 감염 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 지질 및 리포펩티드를 포함하는 복합 아쥬반트인 Lipo-Pam을 포함하는 백신 조성물은 체액성 면역반응 뿐만 아니라 세포성 면역반응 또한 높게 유도할 수 있으며, 바리셀라-조스터 바이러스의 gE 항원뿐만 아니라 일본뇌염 바이러스의 gE 항원 또는 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 이용하였을 때에도 유의적인 효과를 보임으로써, 본 발명의 조성물은 상업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 VZV의 gE 유전자가 pPGXII 벡터에 도입된 pPGXII-VZV gE 플라스미드의 제작 모식도이다.
도 2a는 VZV의 재조합 gE 항원의 정제 단계별로 SDS-PAGE를 분석한 도이다. M은 사이즈를 확인하기 위한 마커를, 1은 세포 배양액, 2는 부틸-세파로스 크로마토그래피 용출액, 3은 DEAE-세파로스 크로마토그래피 용출액, 4는 CHT 크로마토그래피 용출액, 5는 SP-세파로스 크로마토그래피 용출액 및 6은 농축-탈염 여과 후를 의미한다.
도 2b는 최종 정제된 VZV의 재조합 gE 항원의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다. 6은 농축-탈염 여과 후를 의미한다.
도 3a는 리포좀의 제조방법 및 리포좀에 포함되는 성분의 비율에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 3b는 리포좀의 제조방법 및 리포좀에 포함되는 성분의 비율에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 항체의 이소타입을 비교한 그래프이다.
도 4a는 리포좀의 제조방법 및 리포좀에 포함되는 성분의 비율에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 4b는 리포좀의 제조방법 및 리포좀에 포함되는 성분의 비율에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 5는 Lipo-pam을 이용하여 제조된 백신의 구조를 공초점 현미경을 이용해 확인한 도이다.
도 6은 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 Pam3-CSKKKK의 조성과 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 7a는 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 Pam3-CSKKKK의 조성과 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 7b는 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 Pam3-CSKKKK의 조성과 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 8은 Lipo-pam에 포함되는 지질의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 9a는 Lipo-pam에 포함되는 지질의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 9b는 Lipo-pam에 포함되는 지질의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 10은 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 11a는 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 11b는 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 12는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 13a는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 13b는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 14는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포의 빈도를 비교한 그래프이다.
도 15는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 CD4+ T 세포의 다작용성을 비교한 그래프이다.
도 16은 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 조성 및 제형에 따른 재조합 백신의 재조합 VZV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 17a는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 조성 및 제형에 따른 재조합 백신의 재조합 VZV gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 17b는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 조성 및 제형에 따른 재조합 백신의 재조합 VZV gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 18은 Lipo-pam의 조성 및 제조방법에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 19a는 Lipo-pam의 조성 및 제조방법에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 19b는 Lipo-pam의 조성 및 제조방법에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 20은 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 21a는 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 22b는 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 22는 Lipo-pam을 구성하는 리포펩티드의 종류에 따른 재조합 백신의 VZV 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 23a는 Lipo-pam을 구성하는 리포펩티드의 종류에 따른 재조합 백신의 VZV 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 23b는 Lipo-pam을 구성하는 리포펩티드의 종류에 따른 재조합 백신의 VZV 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 24a는 재조합 JEV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 24b는 재조합 JEV gE 항원에 대한 불활성화된 JEV 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 25a는 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 일본뇌염 바이러스의 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 25b는 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 일본뇌염 바이러스의 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 26은 아쥬반트 제형에 따른 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 27은 아쥬반트 제형에 따른 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 IFN-γ의 ELISPOT 분석 결과이다.
도 28은 아쥬반트 제형에 따른 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 IL-4의 ELISPOT 분석 결과이다.
도 29는 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 IFN-γ의 ELISA 분석 결과이다.
도 30은 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 TNF-α의 ELISA 분석 결과이다.
도 31은 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 IL-4의 ELISA 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트를 제공한다.
상기 리포펩티드는 글리세롤 분자에 결합된 지방산과 여러 아미노산으로 구성될 수 있다. 상기 글리세롤 분자 내의 지방산이나 리포펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 하나이거나 그 이상일 수 있다. 이때, 지방산과 아미노산은 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 상기 리포펩티드는 그람 양성이나 그람 음성인 박테리아나 마이코플라즈마로부터 유래한 분자 일부이거나 분자 전체 형태로 된 지질 단백질일 수 있다. 일례로, 상기 리포펩티드는 Pam3Cys-SKKKK, Pam3-CSKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, Pam-CSKKKK, Dhc-SKKKK 및 FSL-1로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 리포펩티드는 20 내지 250, 20 내지 50, 50 내지 250, 150 내지 250, 50 내지 150, 20 내지 2500, 20 내지 500, 50 내지 2500, 150 내지 2500 또는 50 내지 1500 ㎍/dose 농도로 리포좀에 삽입될 수 있다.
상기 리포좀은 지질로 구성된 것일 수 있다. 상기 지질은 양이온, 음이온 또는 중성 지질일 수 있다. 일례로, 상기 지질은 DOTAP(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DDA(Dimethyldioctadecylammonium), DC-chol(3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol), DOPG(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 지질은 15 내지 300, 15 내지 150, 15 내지 90, 15 내지 50, 15 내지 40, 20 내지 30, 15 내지 3000, 15 내지 1500, 15 내지 900, 15 내지 500, 15 내지 400 또는 20 내지 300 ㎍/dose 농도로 리포좀에 삽입될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 아쥬반트는 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 면역활성물질은 폴리(I:C), QS21, MPLA(Monophosphoryl Lipid A), CpG 및 플라겔린(Flagellin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 폴리(I:C)는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구에서 타입 1 인터페론의 강력한 유도체로 사용되어왔다. 더욱이 폴리(I:C)는 포유류에서 가장 강력한 항원제시세포인 수지상세포를 안정적이고 성숙하게 형성하는 것으로 알려졌다(Rous, R. et
al 2004, International Immunol, 16:767-773). 이러한 기존보고에 따르면 폴리(I:C)는 강력한 IL-12 유도물질이며, IL-12는 면역반응을 Th1이 발달하도록 추진하여 세포성 면역반응과 IgG2a 또는 IgG2b 항체 형성을 유도하는 중요한 면역활성물질이다. 폴리(I:C)는 그 길이가 50 내지 5,000 bp일 수 있다. 상기 폴리(I:C)는 10 내지 150, 10 내지 90, 10 내지 50, 10 내지 30, 30 내지 60, 30 내지 90, 30 내지 150, 30 내지 50, 10 내지 1500, 10 내지 900, 10 내지 500, 10 내지 300, 30 내지 600, 30 내지 900, 30 내지 1500 또는 30 내지 500 ㎍/dose 농도로 아쥬반트에 포함될 수 있다.
상기 QS21은 남아메리카의 Quillaja saponaria Molina 나무 껍질에서 추출한 분자량 1990.14 Da의 트리테르펜 글루코시드(triterpene glucoside)라는 사포닌 물질의 분획이다. QS21은 MPLA나 콜레스테롤과 같은 지질과 함께 사용하면 대식세포나 수지상세포와 같은 항원제시세포에서 Th1 타입의 사이토카인을 분비함으로써 체액성 및 세포성 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 QS21은 1 내지 150, 1 내지 90, 1 내지 50, 1 내지 30, 3 내지 60, 3 내지 90, 3 내지 150, 3 내지 50, 1 내지 1500, 1 내지 900, 1 내지 500, 1 내지 300, 3 내지 600, 3 내지 900, 3 내지 1500 또는 3 내지 500 ㎍/dose 농도로 아쥬반트에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 아쥬반트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 아쥬반트는 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 항원은 숙주의 체내에 들어왔을 때, 숙주의 면역계에 의해 인식되어 면역반응을 일으킬 수 있는 모든 물질을 포함하고, 이는 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일례로, 상기 항원은 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus)의 gE(glycoprotein E) 항원; 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis)의 gE(glycoprotein E) 항원; 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원; 인플루엔자 바이러스(influenza virus)의 헤마글루티닌(haemagglutinin) 항원 및 뉴라미니다제(neuraminidase) 항원; 백일해균(Bordetella pertussis)의 백일해 독소(pertussis toxin) 항원, 선모적혈구 응집소(filamentous haemagglutinin) 항원 및 퍼택틴(pertactin) 항원; 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV)의 항원, 헬리코박터파이로리(Helicobacterpylori)의 A, B, C, Y 및 W-135 그룹의 협막다당체 항원; 파상풍균(Clostridium tetani)의 파상풍 독소(tetanus toxoid) 항원; 디프테리아균(diphtheria)의 디프테리아 독소(diphtheria toxoid) 항원; 폐렴균(pneumococcal)의 폐렴균 타입 3 협막다당체(Streptococcus pnemoniae type 3 capsular polysaccharide) 항원; 결핵균(tuberculosis)의 항원; 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)의 GP-120 및 GP-160 항원; 콜레라(cholera)의 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit) 항원; 포도상구균(staphylococcal)의 포도상구균 엔테로톡신 B(staphylococcal enterotoxin B) 항원; 적리균(shigella)의 격리균 다당체(shigella polysaccharides) 항원; 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus)의 소수포성 입안염 바이러스 당단백질(vesicular stomatitis virus glycoprotein) 항원; 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV)의 항원, 간염바이러스(hepatitis)의 간염바이러스 A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원; 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV)의 항원 또는 허피스 심플렉스(herpes simplex)의 항원일 수 있다.
상기 백신 조성물은 부가적으로 완충제, 등장화제, 보존제, 안정화제 및 용해보조제를 포함할 수 있다. 완충제로는 인산염, 초산염, 인산암모늄, 탄산암모늄, 구연산염 등을 사용할 수 있다.
상기 백신은 항원에 특이적인 체액성 면역반응뿐만 아니라 높은 세포성 면역반응을 유도할 수 있다.
상기 백신은 Th1 면역반응을 증진시킬 수 있다. 항바이러스 및 항암 면역반응에 효과적인 Th1 면역반응을 증진시키는 IgG2a 또는 IgG2b의 항체는 도움 T 세포 1(helper T cell 1; Th1)에 의해 생산되는 사이토카인에 의해 생산된다. 따라서, 본 발명의 백신 조성물은 바이러스 감염이나 암의 예방 또는 치료제로도 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 먼저, 재조합 바리셀라-조스터 바이러스 gE 항원을 제조한 후(도 1 및 2 참조), DC-Chol, DOPE 또는 DPPC 지질과 Pam3-CSKKKK를 혼합하여 Lipo-Pam을 제조하고, 여기에 면역활성물질로 폴리(I:C) 또는 QS21을 첨가하고, 제조한 바리셀라-조스터 바이러스의 재조합 gE 항원을 첨가하여 바리셀라-조스터 바이러스에 대한 재조합 백신을 제조하였다.
또한, 상기 재조합 백신은 Pam3-CSKKKK가 지질과 함께 리포좀을 이루고 있으며, VZV의 재조합 gE 항원은 리포좀의 표면에 결합된 구조를 형성하였다(도 5).
또한, 상기 재조합 백신은 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응도 높게 유도하였다(도 3, 4 및 6 내지 21 참조).
또한, DC-Chol 및 DPPC와 함께 다양한 종류의 리포펩티드를 혼합하여 Lipo-pam을 제조하고, 상기 Lipo-pam에 폴리(I:C) 및 VZV의 재조합 gE 항원을 첨가하여 제조된 재조합 백신은 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 높게 유도하였다(도 22 및 23 참조).
또한, DC-Chol, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하여 제조된 Lipo-Pam에 폴리(I:C) 및 일본뇌염 바이러스의 재조합 gE 항원을 첨가하여 일본뇌염 바이러스에 대한 재조합 백신을 제조하고, 상기 재조합 백신은 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 높게 유도하였다(도 24 및 25 참조).
나아가, DC-Chol, DOPE 또는 DPPC 지질, 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하여 제조된 Lipo-Pam에 폴리(I:C) 및 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 첨가하여 계절형 불활화 독감 바이러스에 대한 재조합 백신을 제조하고, 상기 제조합 백신은 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 높게 유도하였다(도 26 및 31 참조).
따라서, 본 발명의 리포펩티드가 삽입된 Lipo-Pam를 아쥬반트로 포함하는 백신 조성물은 항원의 종류에 제한없이 면역증강 효능이 있으므로 상업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염, 또는 암의 예방 또는 치료제를 제공한다.
상기 백신 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 백신 조성물은 아쥬반트 및 항원을 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 여기에 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코욜, 프로필렌글리콘, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스의 감염, 또는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 백신 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 백신 조성물은 아쥬반트 및 항원을 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 여기에 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다.
상기 투여는 약제학적으로 유효한 양일 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 치료 효과를 나타낼 수 있는 동시에 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 백신에 포함될 항원에 따라 달라질 수 있다. 또한, 상기 투여는 환자의 연령, 체중, 건강, 성별 및 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 투여 방법 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 투여는 1회 내지 수회 투여일 수 있다.
또한, 본 발명은 바이러스의 감염, 또는 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
상기 백신 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 백신 조성물은 아쥬반트 및 항원을 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 여기에 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 바리셀라-조스터 바이러스의
재조합
gE 항원 제조
<1-1> 플라스미드의 제작
먼저, VZV의 gE(glycoprotein E) 유전자 발현부위의 바깥부위에 제한효소 인식서열(5' 부위에 Nhe I, 3' 부위에 Xho I)과 코작(kozak) 서열이 포함되도록 유전자(서열번호 1)를 합성하였다. 이때, 주형으로 인간 허피스바이러스 3형(human herpesvirus type 3, HHV-3) 전체 게놈의 ORF68(glycoprotein E)에서 C-말단의 앵커(anchor) 도메인을 제거한 형태로 CHO 세포에 코돈 최적화된 서열을 이용하였다. 상기 서열번호 1로 기재되는 1.6 kb의 VZV의 gE 유전자를 Nhe I 및 Xho I 제한효소로 절단하고, pPGXII 벡터에 서브클로닝하여 VZV gE 발현 플라스미드인 pPGXII-VZV gE를 제작하였다(도 1).
<1-2> 세포주의 선별
실시예 <1-1>에서 제작한 pPGXII-VZV gE 플라스미드 DNA를 Ahd I 제한효소로 선형화한 후, 전기천공법을 이용하여 pDCH1P(dhfr) 플라스미드 DNA와 함께 HT(Hypoxantine-Thymidine)가 포함된 배지에서 6번 계대배양한 CHO DG44(S)-EX 세포에 형질도입하였다. 이후, 형질전환된 세포를 HT가 포함된 배지에 접종하여 세포들이 충분히 자랐을 때 HT가 포함되지 않은 선택배지에서 배양하고, 약 2주 후에 초기 적응된 세포군들을 확보하였다. 확보된 세포군을 이용하여, 점 블럿(dot blot)과 웨스턴 블럿을 수행하여 초기 적응된 세포군 중에 생산성이 우수한 4종을 선별하였다. 선별된 균주를 한계 희석법으로 희석하고, 1 cell/well이 되도록 96 웰 플레이트에 각각 10 플레이트씩 접종하여 단일 세포주를 분리하였다. 분리된 단일 세포주의 콜로니를 24 웰 플레이트로 옮겨서 배양한 후, 세포수가 충분히 확보되었을 때 에를렌마이어 플라스크로 옮겨서 부유배양을 시작하였다. 6번 계대한 이후 생존력(viability)을 95% 이상 유지하면서 세포가 일정한 속도로 증식할 때 유가배양을 수행하여 생산성과 안정성을 확인하였다. 생산성이 높고 안정성을 80% 이상 유지하는 5종의 후보 세포주 중 세포성장 및 생산성을 고려하여 최종 세포주를 선별하였다.
<1-3> 세포주의 배양
실시예 <1-2>에서 최종 선별된 세포주를 HyCell CHO(GE Healthcare) 배지를 넣은 7.5 ℓ의 자 퍼멘터(jar fermentor)에 EfficientFeed C+(Invitrogen)를 첨가한 후, 6.5 x 106 cells/㎖의 농도로 접종 및 배양하였다. 이때, 퍼멘터는 32℃, DO 30%, 100 rpm의 조건으로 가동하였고, 배지의 pH는 6.8 이상으로 유지하였다. 또한, 매일 퍼멘터 내의 포도당과 젖산의 함량을 분석하여 포도당의 함량이 20 mmol/ℓ 이하로 떨어지면 45% D-포도당을 1 v/v%의 농도로 첨가하면서 10일 동안 배양하였다.
<1-4> 항원의 정제
실시예 <1-3>에서 배양한 세포로부터 심층여과필터(depth-filter)를 이용해 배양액을 회수하고, 이로부터 VZV의 재조합 gE 항원을 정제하였다. 구체적으로, 부틸-세파로스(butyl-sepharose), DEAE-세파로스(DEAE-sepharose), CHT 하이드록시아파타이트(CHT hydroxyapatite) 및 SP-세파로스(SP-sepharose)를 순차적으로 이용한 4단계의 컬럼 크로마토그래피 방법과 버퍼 교환을 위한 1회의 UF/DF 방법을 이용해 VZV의 재조합 gE 항원을 정제하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정제된 VZV의 재조합 gE 항원은 약 70 kDa의 분자량을 나타내었다(도 2).
실시예
2.
리포펩티드
및
폴리(I:C)의
용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
<2-1> 시험 백신의 제조 및 투여
먼저, DC-Chol:DOPE 리포좀을 제조하기 위해 클로로포름을 이용해 DC-Chol 및 DOPE를 각각 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE를 3:7의 비율로 혼합한 혼합액이 유리 용기의 기벽에 골고루 분포할 수 있도록 돌려가며 질소가스로 유기용매를 기화시켰다. 이때, 기벽에 얇은 필름이 만들어지는데 형성된 막에 잔존하는 유기용매는 진공 데시케이터(decicator)에 1시간 동안 보관하여 제거하였다. 완전히 건조된 지질 필름에 증류수를 첨가한 후, 초음파 수조(sonic bath)를 이용해 10분간 충분히 재수화시켰다. 다층판의 소포(multilamella vesicle, MLV) 현탁 용액이 생성되면 20 mM의 인산나트륨에 300 mM의 NaCl이 포함된 pH 7.0의 2X 완충용액을 증류수와 동일한 양으로 넣어주었다. 생성된 MLV를 3초/3초(pulse on/off)의 조건으로 5분씩 5사이클 동안 초음파처리를 하여, 작은 다층판의 소포(small unilamellar vesicle, SUV)형태인 DC-Chol:DOPE 리포좀을 제조하였다.
또한, Lipo-Pam은 유기용매를 이용해 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 각각 녹인 후, 3:7의 비율이 되도록 DC-Chol 및 DOPE를 혼합하고 여기에 Pam3-CSKKKK를 25 ㎍/dose 또는 100 ㎍/dose 농도가 되도록 첨가한 것을 제외하고는 상기 DC-Chol:DOPE 리포좀과 동일한 방법으로 제조하였다.
이때, 대조군인 L-pampo는 리포펩티드인 25 ㎍의 Pam3-CSKKKK와 20 ㎍ 또는 200 ㎍의 폴리(I:C)를 섞어서 제조하였다.
이후, 하기 표 1과 같은 조성으로 아쥬반트를 혼합하고, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 VZV gE 항원을 첨가하여 시험 백신을 제조하였다. G2군, G5군 및 G9군의 경우, 상기 혼합물에 초음파를 처리하고, 항원을 첨가하여 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | 리포좀(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍)+L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 20 ㎍)+항원 5 ㎍/초음파처리 |
| G3 | 리포좀(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍)+L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍ |
| G4 | 리포좀(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G5 | Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+항원 5 ㎍/초음파처리 |
| G6 | Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G7 | Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 200 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G8 | Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 200 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G9 | Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 200 ㎍/초음파처리+항원 5 ㎍ |
<2-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <2-1>에서 투여된 시험 백신에 의해 유도된 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 항원 특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다.
먼저, 재조합 VZV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 하기와 같은 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 정제된 VZV의 재조합 gE 항원을 96웰 마이크로플레이트에 100 ng/well의 농도로 코팅한 뒤, 비특이적 결합을 막기 위하여 1%의 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 상기 마이크로플레이트를 세척하고 각 웰에 순차적으로 희석된 혈청을 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체로 항-마우스 IgG-HRP(horse radish heroxidase, KPL, 미국)를 넣고 1시간 동안 동일한 조건에서 반응시켰다. 상기 반응시킨 마이크로플레이트를 세척하고 발색시약 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) 페록시다아제 기질(peroxidase substrate, KPL, 미국)을 첨가하고 10분간 상온에서 반응시킨 다음 정지 용액을 이용해 발색 반응을 멈춘 후, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다. 항체가는 음성대조군 OD 값의 2배에 해당하는 OD 값을 나타내는 항체 희석배수의 역수로 정의하였다.
한편, VZV의 재조합 gE 항원에 대한 항체의 이소타입(isotype)은 1차 항체로서 염소 항-마우스 IgG1, 염소 항-마우스 IgG2a, 염소 항-마우스 IgG2b 또는 염소 항-마우스 IgG2c를 사용하고, 2차 항체로써, 토끼 항-염소 IgG-HRP를 사용한 것을 제외하고는 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 항체가 분석방법과 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 DC-Chol:DOPE 리포좀에 L-pampo(폴리(I:C) 200 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)를 혼합하여 제조된 백신을 투여한 G3군에서 가장 높았으며, Lipo-pam과 폴리(I:C)의 혼합 여부에 따른 체액성 면역반응을 비교해 보면, Lipo-pam 단독으로 항원을 혼합하여 제조된 백신을 투여한 G5군에 비해 Lipo-pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조한 백신을 투여한 G6군에서 전체 IgG가 높았다(도 3a).
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, VZV의 재조합 gE 항원에 대한 항체의 이소타입 분석 결과, 모든 시험군에서 전반적으로 IgG1에 비해 IgG2b 및 IgG2c 타입의 항체가가 높게 나타났으며, 특히, 리포좀에 L-pampo를 혼합한 G3군과 Lipo-pam에 폴리(I:C)를 혼합한 G6군에서 IgG2 타입의 항체가가 높았다(도 3b).
<2-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <2-1>에서 투여된 시험 백신에 의해 유도된 세포성 면역반응은 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, ELISPOT 어세이와 사이토카인 ELISA 방법을 사용하여 분석하였다.
구체적으로, ELISPOT 어세이를 수행하기 위해 먼저, IFN-γ 또는 IL-4에 대한 항체가 부착된 ELISPOT 플레이트를 PBS로 세척한 후, 완전 배지(complete media)를 첨가하여 플레이트를 활성화하였다. 상기 ELISPOT 플레이트에 마우스의 비장세포를 5 × 105 cells/well로 분주한 후, <실시예 1>에서 제조한 재조합 VZV gE 항원을 넣고, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 또는 48시간 동안 반응시켰다. 이후, 비장세포를 제거하고 PBS로 플레이트를 세척한 다음, Mouse IFN-γ ELISpotPLUS 키트(Mabtech, 스웨덴) 및 Mouse IL-4 ELISpotPLUS 키트(Mabtech, 스웨덴)에 있는 비오틴이 결합된 항체를 0.5% FBS가 포함된 PBS로 희석해 플레이트의 웰에 각각 첨가하였다. 이를 상온에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 세척하고 HRP가 결합된 스트렙타비딘을 플레이트의 웰에 각각 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 세척하고 TMB 발색시약을 넣고 뚜렷한 스팟이 나올 때까지 반응시킨 후, 반응이 완료되면 3차 증류수를 넣어 반응을 정지시켰다. 플레이트를 증류수로 여러번 세척하고, 실온에서 건조시킨 후 ELISPOT 리더기를 이용해 스팟을 계산하였다.
한편, 사이토카인 ELISA를 수행하기 위해 먼저, 96 웰 플레이트에 마우스의 비장세포를 1.5 × 106 cells/well로 분주한 후, <실시예 1>에서 제조한 재조합 VZV gE 항원을 넣고, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 48시간 동안 반응시켰다. 배양액을 각각의 시험군별로 튜브로 옮긴 후, 4℃, 3000 rpm 조건에서 5분간 원심분리하여 수득된 상층액을 사이토카인 ELISA를 수행하기 위한 시료로서 사용하였다. Mouse IFN-γ ELISA 키트(BD, 미국), Mouse IL-4 ELISA 키트(BD, 미국) 및 Mouse TNF-α ELISA 키트(BD, 미국)에 포함된 코팅용 항체를 코팅 버퍼에 희석해 96 웰 플레이트에 분주하고, 37℃에서 2시간 동안 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 세척한 다음 10% FBS를 넣고, 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 세척한 후, 표준 용액과 상기에서 수득한 비장세포 배양액을 각각 100 ㎕/well씩 분주하고, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척한 후, 비오틴이 결합된 항체와 HRP가 결합된 스트렙타비딘을 혼합한 작동 디텍터(working detector)를 100 ㎕/well씩 분주하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척한 후, TMB 발색시약을 넣고 상온에서 5 내지 10분간 반응시킨 다음 정지 용액을 이용해 발색 반응을 멈추고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT의 분석 결과, 리포좀 및 L-pampo를 혼합하여 제조된 백신인 G2 및 G3 군에 비해 Lipo-Pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조된 백신이 전반적으로 높은 IFN-γ의 생성을 유도하였다. 특히, G6군은 다른 시험군에 비해 현저히 높은 IFN-γ를 생성하였고, G8 및 G9군도 비교적 높게 IFN-γ 를 생성하였다. 또한, G7군과 동일한 제형이지만 항원을 추가하기 전에 초음파처리 과정을 추가한 G9군은 G7군에 비해 현저히 많은 IFN-γ를 생성하였다. IL-4의 ELISPOT 분석 결과 또한 IFN-γ ELISPOT 결과와 유사한 경향을 나타내었으며, G6군에서 높게 IL-4를 생성하였다. 또한, Lipo-pam과 폴리(I:C)의 혼합 여부에 따른 세포성 면역반응을 비교해 보면, Lipo-pam에 폴리(I:C)를 추가하지 않고 항원만을 혼합하여 투여한 G5군에 비해 Lipo-pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조한 백신을 투여한 G6군에서 더 높은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 4a).
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISA 분석 결과, 리포좀 및 L-pampo를 혼합하여 제조된 백신에 비해 Lipo-Pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조된 백신이 전반적으로 많은 양의 IFN-γ의 분비를 유도하였다. 특히, G6 및 G8군에서 가장 많은 IFN-γ의 분비가 유도되었다. IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과 또한 IFN-γ의 ELISA 분석 결과와 유사한 경향을 나타내었으며, G6군에서 많은 양의 IL-4 및 TNF-α의 분비가 유도되었다. 또한, Lipo-pam과 폴리(I:C)의 혼합 여부에 따른 세포성 면역반응을 비교해 보면, Lipo-pam에 폴리(I:C)를 추가하지 않고 항원만을 혼합하여 투여한 G5군에 비해 Lipo-pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조한 백신을 투여한 G6군에서 더 많은 양의 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 유도되었다(도 4b).
따라서, 상술한 바와 같이 대상포진 백신은 체액성 면역반응에 비해 세포성 면역반응을 유도하는 것이 더욱 중요하고, 리포좀에 L-pampo를 혼합한 백신은 혼합물의 파티클 크기를 균일하게 분산시키고 안정화 시켜주기 위해 추가적인 초음파처리, 마이크로플루다이저 또는 익스트루더 등의 과정을 거쳐야 하지만, Lipo-pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조한 백신은 추가적인 과정 없이도 보다 안정적으로 장기간 파티클의 크기가 유지되므로, 세포성 면역반응을 보다 잘 유도하고, 제형의 안정성도 우수한 Lipo-Pam을 기반으로 백신 제형을 개발하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 3. Lipo-pam을 이용하여 제조한 재조합 백신의 구조 확인
Lipo-pam을 이용하여 제조한 백신의 구조를 확인하기 위해 먼저, DC-Chol(dimethylethancarbanoyl cholesterol) 및 DOPE(dioleoyl- phosphatidylethanolamine) 지질은 마리나블루(marina blue)로, Pam3-CSKKKK는 6-TAMRA, SE(6-Carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester)로, 재조합 VZV gE 항원은 플루오레세인(fluorescein)으로 각각 염색하였다. DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE를 혼합하고 여기에 25 ㎍/dose 농도로 Pam3-CSKKKK를 첨가한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 상기 Lipo-Pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 항원을 추가하여 시험 백신을 제조하고, 공초점 현미경을 이용해 그 구조를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 리포좀의 지질에 염색된 염료에 의해 발색된 반경과 Pam3CSK에 염색된 염료에 의해 발색된 반경은 거의 동일하였으나,VZV의 재조합 gE 항원에 염색된 염료에 의해 발색된 반경은 이들보다 컸다. 이를 통해, 제조된 백신은 Pam3-CSKKKK 및 지질이 리포좀을 이루고 있으며(Lipo-pam), VZV의 재조합 gE 항원이 리포좀의 표면에 결합되어 있는 구조를 가짐을 알 수 있었다(도 5).
실시예
4. 지질,
리포펩티드
및
폴리(I:C)의
용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
지질의 비율, Pam3-CSKKKK의 용량, 폴리(I:C)의 용량 및 VZV의 재조합 gE 항원이 리포좀에 결합되는 정도에 따른 재조합 백신의 면역원성을 비교하였다.
<4-1>
시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 1:1 또는 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE를 혼합하고 여기에 25 또는 100 ㎍/dose 농도로 Pam3-CSKKKK를 첨가한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 하기 표 2와 같이 Lipo-Pam과 20, 40, 60, 80 또는 160 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 VZV의 재조합 gE 항원을 추가하여 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G3 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G4 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G5 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 60 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G7 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 200 ㎍)+폴리(I:C) 160 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G8 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G9 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G10 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G11 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 60 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G12 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍ |
<4-2> VZV의 재조합 gE 항원과 Lipo-pam의 결합력 확인
크기-배제 크로마토그래피를 이용해 통상적인 방법으로 실시예 <4-1>에서 제조한 Lipo-pam과 <실시예 1>에서 제조한 VZV의 재조합 gE 항원의 결합력을 확인하였다.
그 결과, Pam3-CSKKKK의 함량이 높은 제형(G5 내지 G7, G11, G12군)에서 대부분의 VZV의 재조합 gE 항원이 Lipo-pam과 결합되었다. 또한, Lipo-pam에 gE 항원과 경쟁적으로 결합하는 폴리(I:C)의 용량이 낮은 G2군에서도 대부분의 재조합 VZV gE 항원이 결합되었다.
<4-3> 체액성 면역반응 분석
실시예 <4-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, DC-Chol:DOPE의 비율을 3:7(G2 내지 G7)로 혼합하여 제조된 Lipo-pam이 DC-Chol:DOPE의 비율을 1:1(G8 내지 G12)로 혼합하여 제조한 경우보다 IgG 항체가가 전반적으로 높은 경향을 보였다. 또한, 리포펩티드인 Pam3-CSKKKK와 폴리(I:C)의 용량에 비례하여 전체 IgG 항체가가 높게 유도되었다(도 6). 또한, VZV의 재조합 gE 항원의 대부분이 Lipo-pam에 결합된 것으로 확인된 G2, G5, G6, G7군 중에서 특히 G2, G6 및 G7군에서 전체 IgG 항체가가 높았다.
한편, Pam3-CSKKKK와 폴리(I:C)의 용량을 각각 25 ㎍과 20 ㎍/dose로 사용한 G2군과 100 ㎍과 80 ㎍/dose로 사용한 G6군의 전체 IgG 항체가가 비슷한 것으로 확인됨으로써, Lipo-pam을 구성하는 지질이나 백신에 사용된 VZV의 재조합 gE 항원의 용량에 따라 Pam3-CSKKKK와 폴리(I:C)의 적정 용량이 결정됨을 알 수 있었다.
<4-4> 세포성 면역반응 분석
실시예 <4-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, DC-Chol:DOPE을 3:7의 비율로 하여 제조된 백신은 DC-Chol:DOPE을 1:1의 비율로 하여 제조된 백신에 비해 더 많은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다. 또한, Pam3-CSKKKK를 25 ㎍/dose로 사용하였을 때에는 DC-Chol:DOPE을 3:7로, 폴리(I:C)를 40 ㎍/dose로 사용하였을 때 가장 많이 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였고, Pam3-CSKKKK를 100 ㎍/dose 또는 200 ㎍/dose로 사용하였을 때에는 폴리(I:C)의 농도가 높을수록 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였으나, Pam3-CSKKKK를 25 ㎍/dose로 사용한 시험군에 비해 현저히 낮은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 7a).
또한, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, DC-Chol:DOPE을 3:7의 비율로 하여 제조된 백신은 DC-Chol:DOPE을 1:1의 비율로 하여 제조된 백신에 비해 더 많은 IFN-γ 및 IL-4의 분비가 유도된 반면, TNF-α는 두가지 비율에서 유사하게 나타났다. 또한, ELISPOT 결과와 유사하게 Pam3-CSKKKK를 25 ㎍/dose로 사용한 백신은 100 또는 200 ㎍/dose로 사용한 백신에 비해 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 더 많이 유도되었다. 특히, DC-Chol:DOPE을 3:7의 비율로 하여 제조된 백신 중에서는 폴리(I:C)를 40 ㎍/dose로 사용한 G3군에서, DC-Chol:DOPE을 1:1의 비율로 하여 제조된 백신 중에서는 폴리(I:C)를 20 ㎍/dose로 사용한 G8군에서 세가지 사이토카인의 분비가 가장 많이 유도되었다(도 7b).
실시예
5. 지질 및
VZV의
재조합
gE
항원의 용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
3:7의 비율로 혼합된 DC-Chol:DOPE, 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 20 ㎍/dose의 폴리(I:C)를 사용하고, 이때 첨가되는 지질 및 VZV의 재조합 gE 항원의 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<5-1>
시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE가 혼합된 지질을 31.25, 62.5 또는 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 하기 표 3과 같이 Lipo-Pam과 20 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 2, 5 또는 10 ㎍/dose의 VZV의 재조합 gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 31.25 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G3 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 31.25 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G4 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 31.25 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 10 ㎍ |
| G5 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G7 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 10 ㎍ |
| G8 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G9 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G10 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 10 ㎍ |
| G11 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
<5-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <5-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 항원의 용량 증가에 따라 지질의 용량도 함께 증가하는 것이 항체의 유도에 도움이 됨을 알 수 있었다. 또한, DC-Chol과 DOPC를 사용하여 제조된 G11군은 다른 시험군에 비해 전체 IgG 항체가가 낮았다(도 8).
<5-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <5-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과, 2 ㎍/dose 농도의 VZV의 재조합 gE 항원 및 125 ㎍/dose 농도의 DC-Chol:DOPE 지질을 사용하여 제조된 G8군에서 가장 많은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 9a).
또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, ELISPOT 결과와 유사하게 2 ㎍/dose 농도의 VZV의 재조합 gE 항원 및 125 ㎍/dose 농도의 DC-Chol:DOPE 지질을 사용하여 제조된 G8군에서 세가지 사이토카인의 분비가 가장 많이 유도된 반면, DC-Chol과 DOPC를 사용하여 제조된 G11군은 다른 시험군에 비해 사이토카인의 분비가 가장 적게 유도되었다(도 9b).
실시예
6. 지질,
폴리
(
I:C
) 및
VZV의
재조합
gE
항원의 용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
3:7의 비율로 혼합된 DC-Chol:DOPE, 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK를 사용하고, 이때 첨가되는 지질, 폴리(I:C) 및 VZV의 재조합 gE 항원의 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<6-1>
시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE가 혼합된 지질을 62.5, 125 또는 250 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 하기 표 4와 같이 Lipo-Pam과 20, 40, 80 또는 100 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 2, 5 또는 10 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G3 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G4 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G5 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G7 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G8 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G9 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G10 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 10 ㎍ |
| G11 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 100 ㎍+항원 5 ㎍ |
<6-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <6-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가 및 항체의 이소타입은 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, Lipo-pam 제조시, 지질을 62.5 ㎍/dose, Poly(I:C)를 20 ㎍/dose로 사용하였을 때, 재조합 VZV gE 항원을 2 ㎍/dose 또는 5 ㎍/dose로 사용한 G2와 G3군에서 전체 IgG 항체가는 비슷하였다. 또한, Lipo-pam 제조시, 지질을 250 ㎍/dose, Poly(I:C)를 80 ㎍/dose로 사용하였을 때, 재조합 VZV gE 항원을 2, 5 또는 10 ㎍/dose로 사용한 G8, G9 및 G10군에서 전체 IgG 항체가는 비슷하였다(도 10). 또한, 이소타입 분석에서 IgG2b/IgG1의 비율은 G8, G9, G2, G6군에서, IgG2c/IgG1의 비율은 G8, G6, G9군에서 다른 시험군에 비해 높은 경향을 나타내었다.
<6-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <6-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 분석 결과, Lipo-pam 제조시, 지질을 125 ㎍/dose, Poly(I:C)를 40 ㎍/dose, VZV의 재조합 gE 항원을 2 ㎍/dose로 사용한 G6군에서 가장 많은 IFN-γ 및 IL-4을 생성하였다(도 11a).
또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, Lipo-pam 제조시, 지질을 125 ㎍/dose, Poly(I:C)를 40 ㎍/dose, VZV의 재조합 gE 항원을 2 ㎍/dose로 사용한 G6군에서 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 가장 많이 유도되었다(도 11b).
실시예
7.
약독화된
대상포진 백신과 재조합 백신의 항원 용량에 따른 면역원성 비교
상용화되고 있는 백신으로서, 약독화된 생백신인 조스타박스(Zostavax)와 재조합 VZV gE 항원을 이용해 제조한 재조합 백신에 포함되는 항원 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<7-1>
시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE를 혼합한 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 또한, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 200 ㎍/dose의 폴리(I:C) 및 5 ㎍/dose의 항원을 혼합하여 제조하고, 대조군으로 사용하였다. 이후, 하기 표 5에 기재된 바와 같은 조성을 갖는 시험 백신을 제조하였다. 제조된 백신 또는 조스타박스를 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | 조스타박스(약독수두생바이러스 1940 PFU, 사람에 투여하는 양의 1/10) |
| G3 | 수산화알루미늄 100 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G4 | L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍ |
| G5 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
<7-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <7-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가 및 항체의 이소타입은 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 조스타박스를 투여한 G2군 및 수산화알루미늄을 사용한 G3군은 L-pampo 또는 Lipo-Pam을 사용한 G4, G5 및 G6군 보다 전체 IgG 항체가가 낮게 나타났다(도 12). 또한, 이소타입 분석에서 수산화알루미늄을 사용한 G3군은 대부분 IgG1 타입의 항체가 형성되었으며, IgG2b/IgG1와 IgG2c/IgG1의 비율은 Lipo-pam을 사용한 G5 및 G6군이 L-pampo를 사용한 G4군에 비해 높게 나타났다.
<7-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <7-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리하였다. 상기 비장세포를 이용하여 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하였고, 유세포분석기를 이용해 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2에 대한 세포내 사이토카인 착색(intracellular cytokine staining, ICS) 분석을 수행하여, 각 제형별로 재조합 VZV gE 항원에 특이적인 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포의 정도를 비교함으로써, 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 13a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 분석 결과, 조스타박스를 투여한 G2군은 현저히 낮은 IFN-γ 및 IL-4를 생성한 반면, Lipo-pam을 사용한 G5 및 G6군은 가장 많은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 13a).
또한, 도 13b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, 조스타박스를 투여한 G2군은 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 가장 적게 유도된 반면, Lipo-pam을 사용한 G5 및 G6군은 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 가장 많이 유도되었다(도 13b).
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 각 시험군에서 분비되는 사이토카인의 경향을 보면, Lipo-pam을 사용한 G5 및 G6군에서 각각의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포의 빈도(frequency)가 높게 나타났다(도 14).
또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 각 시험군마다 한종류 이상의 사이토카인을 분비하는 세포의 수를 100%라고 가정했을 때 나타나는 gE 항원 특이적인 CD4+ T 세포의 다작용성(polyfunctionality)을 비교한 결과, 하나 이상의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포 중 3가지 사이토카인을 모두 분비하는 T 세포가 높은 시험군은 Lipo-pam를 사용한 G5 및 G6군이었다. 반면, 조스타박스를 투여한 G2군과 수산화알루미늄을 사용한 G3군은 1가지 사이토카인만을 분비하는 CD4+ T 세포의 비율이 높게나타나, 다작용성이 낮음을 확인하였다(도 15).
실시예
8.
약독화된
대상포진 백신과 재조합 백신의 지질 비율 및
폴리(I:C)의
용량에 따른 면역원성 비교
상용화되고 있는 백신으로서, 약독화된 생백신인 조스타박스와 VZV의 재조합 gE 항원을 이용해 제조한 재조합 백신에 포함되는 지질의 비율 및 폴리(I:C)의 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<8-1>
시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하거나 DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 또한, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 200 ㎍/dose의 폴리(I:C) 및 5 ㎍/dose의 VZV의 재조합 gE 항원을 혼합하여 제조하였다. 또한, DC-Chol:DOPE 리포좀은 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 제조하였다. 이후, 하기 표 6과 같이 Lipo-Pam과 20, 40 또는 80 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 추가로 넣거나(G6 내지 G9군), Lipo-Pam에 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 동시에 혼합하거나(G10 및 G11군), L-pampo와 DC-Chol:DOPE 리포좀을 혼합하거나(G5군), 100 ㎍/dose 농도의 수산화알루미늄에 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합(G2군)하여 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신 또는 조스타박스를 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | 수산화알루미늄 100 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G3 | 조스타박스(약독수두생바이러스 1940 PFU, 사람에 투여하는 양의 1/10) |
| G4 | L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍ |
| G5 | 리포좀(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍)+L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍/초음파처리 |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G7 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G8 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G9 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G10 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍] |
| G11 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍] |
<8-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <8-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 항원 특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다. VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 조스타박스를 투여한 G3군 및 수산화알루미늄을 사용한 G2군은 L-pampo 또는 Lipo-Pam을 사용한 G4 내지 G11군 보다 전체 IgG 항체가가 낮게 나타났다(도 16).
<8-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <8-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 17a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 결과, 조스타박스를 투여한 G3군은 IFN-γ 및 IL-4를 매우 적게 생성한 반면, DC-Chol:DPPC(1:1)를 사용하여 제조된 Lipo-pam과 40 ㎍/dose의 폴리(I:C)를 사용한 G7 및 Lipo-Pam에 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 동시에 혼합한 G11군에서는 많은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 17a).
또한, 도 17b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, DC-Chol:DPPC(1:1)를 사용하여 제조된 Lipo-pam과 40 ㎍/dose의 폴리(I:C)를 사용한 G7군 및 DC-Chol:DOPE 리포좀과 L-pampo를 혼합한 G5군에서 가장 많은 IFN-γ의 분비가 유도되었다. 또한, IL-4는 제형별 차이가 크지 않았으나 DC-Chol:DPPC(1:1)를 사용하여 제조된 Lipo-pam을 사용한 G7 내지 G9 및 G11군에서 많은 분비가 유도되었다. TNF-α는 G5, G7, G9 및 G11군에서 많은 분비가 유도되었다(도 17b).
실시예
9. 지질의 종류,
폴리(I:C)의
용량 및
VZV의
재조합
gE
항원을 혼합하는 방법에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
Lipo-pam 제조시, 지질의 종류, 폴리(I:C)의 용량 및 Lipo-pam에 VZV의 재조합 gE 항원을 혼합하는 방법에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<9-1>
시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하거나 DC-Chol 및 DPPC가 1:1 또는 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 또한, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 200 ㎍/dose의 폴리(I:C) 및 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합하여 제조하였다. 이후, 하기 표 7과 같이 Lipo-Pam과 40 또는 200 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 추가로 넣거나(G3 내지 G6군), Lipo-Pam과 40 또는 200 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 동시에 혼합(G7 내지 G10군)하여 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍ |
| G3 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G4 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G5 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 200 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G7 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍] |
| G8 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍] |
| G9 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 200 ㎍+항원 5 ㎍] |
| G10 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍] |
<9-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <9-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 지질의 종류 및 폴리(I:C)와 항원을 혼합하는 방법에 의한 전체 IgG 항체가의 차이는 없었다(도 18). 또한, 이소타입 분석에서 DC-Chol:DPPC 지질을 3:7 또는 1:1로 사용한 G4 내지 G6군에서 IgG2b/IgG1와 IgG2c/IgG1 비율이 다른 군에 비해 높게 나타났다.
<9-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <9-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 19a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 결과, DC-Chol:DPPC를 사용한 Lipo-pam 제형인 G4 내지 G6군과 G8 내지 G10군에서 L-pampo를 사용한 G2군및 DC-Chol:DOPE를 사용한 G3 및 G7군에 비해 많은 IFN-γ을 생성하였다. IL-4 ELISPOT 결과, 모든 시험군에서 비슷한 수준의 IL-4을 생성하였다(도 19a).
또한, 도 19b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, DC-Chol:DOPE를 사용한 제형에 비해 DC-Chol:DPPC를 사용한 제형에서 더 많은 IFN-γ와 TNF-α의 분비가 유도되었고, DC-Chol:DPPC의 비율을 1:1로 사용한 G6군과 G10군에서 IFN-γ와 TNF-α의 분비가 가장 많이 유도되었다. IL-4는 L-pampo를 사용한 G2군과 DC-Chol:DPPC의 비율을 1:1로 사용한 G6 및 G10군에서 다른 제형에 비해 더 많이 분비가 유도되었고, DC-Chol:DOPE를 사용한 G3 및 G7군에서도 DC-Chol:DPPC를 사용한 제형과 유사한 정도의 IL-4의 분비가 유도되었다(도 19b).
실시예
10. 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및
VZV의
재조합
gE
항원 용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
Lipo-pam 제조시, 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다. 면역활성물질로는 폴리(I:C) 또는 QS21을 사용하였다.
<10-1>
시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하거나 DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율인 지질을 62.5, 125 또는 250 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 하기 표 8과 같이 Lipo-Pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합하거나(G2 내지 G8군), Lipo-pam과 5 ㎍/dose 농도의 QS21을 혼합한(G9군) 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G3 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G4 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G5 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G7 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍ |
| G8 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G9 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+QS21 5 ㎍+항원 5 ㎍ |
<10-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <10-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 지질의 종류에 따른 전체 항체가는 DC-Chol 및 DOPE의 지질을 사용하여 제조한 Lipo-pam을 사용한 G2군에서 가장 높게 유도되었으며, 면역활성물질로 폴리(I:C) 대신 QS21을 사용한 G9군에서도 높은 항체 형성이 유도되었다(도 20).
<10-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <10-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 21a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 결과, 지질로 DC-Chol 및 DOPE를 사용한 G2군에 비해 지질로 DC-Chol 및 DPPC를 사용한 시험군에서 더 많은 IFN-γ를 생성하였고, 지질로 DC-Chol 및 DPPC를 사용하여 제조한 Lipo-pam과 면역활성물질로 QS21을 혼합한 G9군에서 가장 많은 IFN-γ를 생성하였다. 또한, IL-4 ELISPOT 결과, 지질로 DC-Chol 및 DOPE를 사용한 G2군에 비해 지질로 DC-Chol 및 DPPC를 사용한 시험군에서 더 많은 IL-4를 생성하였고, 동일한 Lipo-pam 조성에서 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합한 G6군과 5 ㎍/dose 농도의 QS21과 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합한 G9군에서는 비슷한 수준의 IL-4을 생성하였다(도 21a).
또한, 도 21b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, 지질로 DC-Chol:DOPE를 사용한 G2군에 비해 DC-Chol:DPPC를 사용한 G3 내지 G8군에서 더 많은 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 유도되었다. 동일한 Lipo-pam 조성에서 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합한 G6군과 5 ㎍/dose 농도의 QS21과 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합한 G9군에서 IFN-γ와 TNF-α의 분비는 G9군에서 더 많았고 IL-4의 분비는 비슷한 수준으로 유도되었다.(도 21b).
따라서, <실시예 10>의 결과로부터, Lipo-pam 제조시, 면역활성물질로서 폴리(I:C)뿐만 아니라 QS21을 사용하여도 체액성 및 세포성 면역반응을 잘 유도함으로써 백신의 효능을 개선하는데 도움이 됨을 알 수 있었다.
실시예 11. 리포펩티드의 종류에 따른
재조합 백신의 면역원성 비교
VZV의 재조합 gE 항원을 이용해 제조한 재조합 백신에 포함되는 리포펩티드의 종류에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<11-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DPPC 및 리포펩티드를 녹인 후, DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, 리포펩티드가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DPPC 및 리포펩티드를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조한 후, 입도분석기(Malvern, Nono-ZS)를 이용하여 Lipo-Pam의 크기와 제타포텐셜을 측정하였다. 이때, 리포펩티드로는 Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, PamDhc-SKKKK, Pam-CSKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PHC-SKKKK 또는 FSL-1를 사용하였다. 이후, Lipo-Pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 VZV의 재조합 gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하고, 입도분석기(Malvern, Nono-ZS)를 이용하여 시험 백신 조성물의 크기와 제타포텐셜을 측정하였다.
| Lipo-Pam에 삽입된 리포펩티드 | 크기(nm) | 입자의 분포도(PDI) | 제타포텐셜(mV) |
| Pam3-CSKKKK | 96.49 | 0.1465 | 27.2 |
| Dhc-SKKKK | 116.4 | 0.217 | 56.1 |
| PamDhc-SKKKK | 98.46 | 0.218 | 59.1 |
| Pam-CSKKKK | 89.05 | 0.151 | 42.9 |
| Pam2Cys-SKKKK | 97.74 | 0.222 | 54.4 |
| PHC-SKKKK | 95.96 | 0.206 | 50.3 |
| FSL-1 | 125.9 | 0.168 | 37.8 |
| 백신 제조에 사용된 리포펩티드 | 크기(nm) | 입자의 분포도(PDI) | 제타포텐셜(mV) |
| Pam3-CSKKKK+폴리(I:C)+항원 | 211.9 | 0.191 | -53.7 |
| Dhc-SKKKK+폴리(I:C)+항원 | 128.0 | 0.163 | -38.8 |
| PamDhc-SKKKK+폴리(I:C)+항원 | 180.5 | 0.156 | -28.5 |
| Pam-CSKKKK+폴리(I:C)+항원 | 207.8 | 0.182 | -30.2 |
| Pam2Cys-SKKKK+폴리(I:C)+항원 | 138.6 | 0.180 | -34.5 |
| PHC-SKKKK+폴리(I:C)+항원 | 122.2 | 0.178 | -35.0 |
| FSL-1+폴리(I:C)+항원 | 276.0 | 0.273 | -35.2 |
그 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이, Lipo-Pam은 침전물 없이 제대로 재조합 백신을 생성하였으며, 이는 90 내지 130 nm의 크기였다(표 9). 또한, 표 10에 나타낸 바와 같이, 리포펩티드, 폴리(I:C) 및 항원이 포함된 백신 조성물은 120 내지 300 nm의 크기로 재조합 백신을 형성하였다(표 10).
이후, 상기 제조한 백신을 하기 표 11과 같이 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | 조스타박스(약독수두생바이러스 1940 PFU, 사람에 투여하는 양의 1/10) |
| G3 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G4 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Dhc-SKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G5 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+PamDhc-SKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G7 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam2Cys-SKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G8 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+PHC-SKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
| G9 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+FSL-1 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍ |
<11-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <11-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, 모든 시험군에서 항체가 생성되었으며, 특히, 리포펩티드로서 Pam3-CSKKKK, Pam2Cys-SKKKK 및 FSL-1을 사용하여 제조한 Lipo-pam을 사용한 G3, G7 및 G9군이 다른 시험군에 비해 높은 항체가가 유도되었다(도 22).
<11-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <11-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 23a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 결과, 모든 시험군에서 항체가 생성되었으며, 특히 리포펩티드로서 Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, Pam-CSKKKK 또는 PHC-SKKKK를 사용한 G3, G4, G6 및 G8군에서 IFN-γ를 잘 생성하였다. 또한, IL-4 ELISPOT 결과, 리포펩티드로 Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK 또는 PHC-SKKKK를 사용한 G3, G4, G7 및 G8군에서 IL-4를 잘 생성하였다(도 23a).
또한, 도 23b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, 리포펩티드로 Pam3-CSKKKK 또는 Dhc-SKKKK를 사용한 G3 및 G4군에서 더 많은 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 유도되었다.
따라서, <실시예 11>의 결과로부터, Lipo-pam 제조시, 어떠한 종류의 리포펩티드를 사용하더라도 체액성 및 세포성 면역반응이 유도됨으로써, 본 발명에 따른 Lipo-pam이 항원과 다양한 종류의 리포펩티드 조합을 이용한 백신의 제조에 사용될 수 있음을 확인하였다. 특히, 재조합 대상포진 백신을 제조하는 경우에는, 체액성 및 세포성 면역반응 모두를 유도하는 Pam3-CSKKKK를 리포펩티드로서 사용하여 백신의 효능을 개선할 수 있다.
실시예
12. L-
pampo
또는
Lipo
-
pam으로
제제화한 재조합 백신의
일본뇌염
바이러스의 gE 항원에 대한 면역원성 비교
일본뇌염 바이러스의 재조합 gE 항원을 이용해 L-pampo 또는 Lipo-pam으로 제제화한 재조합 백신의 면역원성을 비교하였다.
<12-1>
시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 또한, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 20 ㎍/dose의 폴리(I:C), 및 0.1 또는 0.5 ㎍/dose의 재조합 JEV gE 항원을 혼합하여 제조하였다. 재조합 JEV gE 항원은 배큘로바이러스-인섹트 세포(Baculovirus-insect cell) 시스템에서 발현시킨 후 정제하여 사용하였다. 이후, 하기 표 12와 같이 Lipo-Pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 0.1 또는 0.5 ㎍/dose의 재조합 JEV gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | 불활성화된 JEV 항원 0.1 ㎍/dose |
| G3 | 불활성화된 JEV 항원 0.5 ㎍/dose |
| G4 | L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 20 ㎍)+재조합 JEV gE 항원 0.1 ㎍ |
| G5 | L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 20 ㎍)+재조합 JEV gE 항원 0.5 ㎍ |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+재조합 JEV gE 항원 0.1 ㎍ |
| G7 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+재조합 JEV gE 항원 0.5 ㎍ |
<12-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <12-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 JEV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 재조합 JEV gE 항원 또는 불활성화된 JEV 항원을 96웰 마이크로플레이트에 100 ng/well의 농도로 코팅한 것을 제외하고는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 24a 및 24b에 나타낸 바와 같이, 재조합 JEV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가(도 24a) 및 불활성화된 JEV 항원에 대한 전체 IgG 항체가(도 24b)는 0.5 ㎍/dose의 항원을 사용한 Lipo-pam 제형(G7군)에서 가장 높았다. 또한, 재조합 JEV gE 항원에 대한 항체의 이소타입 분석 결과, 0.5 ㎍/dose의 항원을 사용했을 때, IgG1 타입의 항체가는 L-pampo를 사용한 G5군에서 가장 높았으며, IgG2a 및 IgG2b 타입의 항체가는 Lipo-pam을 사용한 G7군에서 가장 높게 나타났다.
<12-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <12-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 재조합 JEV gE 항원 또는 불활성화된 JEV 항원을 사용한 것을 제외하고는 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 25a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 결과, Lipo-pam 제형인 G6 및 G7군에서 IFN-γ 및 IL-4를 가장 많이 생성하였다(도 25a).
또한, 도 25b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, IFN-γ, IL-4 및 TNF-α는 모두 Lipo-pam 제형(G6 및 G7군), L-pampo 제형(G4 및 G5군) 및 불활성화된 백신(G2, G3군)의 순서로 분비가 유도되었다(도 25b).
따라서, <실시예 12>의 결과로부터, 재조합 일본뇌염 백신 제조시, 면역증강제로 Lipo-pam을 함께 사용하는 것이 체액성 및 세포성 면역반응을 잘 유도함으로써 백신의 효능을 개선하는 데 도움이 되며, 이를 통해 Lipo-pam은 다양한 항원에 대해 면역증강 효능이 있음을 알 수 있었다.
실시예
13.
알룸
(
alum
), L-
pampo
또는
Lipo
-
pam으로
제제화한 백신의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 면역원성 비교
계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 이용해 알룸, L-pampo 또는 Lipo-pam으로 제제화한 백신의 면역원성을 비교하였다.
<13-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질 또는 DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율인 지질을 각각 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-pam을 제조하였다. 한편, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 20 ㎍/dose의 폴리(I:C), 및 4종류 균주(strain)의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원을 0.5 ㎍/strain/dose가 되도록 혼합하여 제조하였다. 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원은 A/California/07/2009(H1N1), A/Hong Kong/4801/2014(H3N2), B/Phuket/3073/2013(BY) 또는 B/Brisbane/60/2008(BV) 균주로부터 수득된 것으로, 이들 항원은 계란에서 증폭시켜 생산 후, 정제하여 사용하였다. 이후, 하기 표 13과 같이 Lipo-pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합하고, 상기 혼합물에 0.5 ㎍/strain/dose의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
| 시험군 | 조성 |
| G1 | PBS |
| G2 | 계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain |
| G3 | 알룸+계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain |
| G4 | L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 20 ㎍)+계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain |
| G5 | Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain |
| G6 | Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain |
<13-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <13-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원을 각각 96웰 마이크로플레이트에 25 ng/well의 농도로 코팅한 것을 제외하고는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 4종류 균주에서 모두 L-pampo 제형(G4군)이 가장 높았으나, Lipo-pam 제형인 G5군 및 G6군에서도 우수하였고, 특히, DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율로 포함된 제형(G6군)도 높은 IgG 항체가를 나타내었다. 반면, 항원을 단독으로 투여하거나(G2군), 알룸을 면역증강제로 사용한 시험군(G3군)의 전체 IgG 항체가는 Lipo-pam 제형에 비해 현저히 낮았다(도 26).
<13-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <13-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원을 사용한 것을 제외하고는 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 결과, Lipo-pam 제형인 G5 및 G6군에서 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대해 IFN-γ를 가장 많이 생성하였다(도 27). 한편, 도 28에 나타낸 바와 같이, IL-4 ELISPOT 결과, 항원 단독이나 알룸을 첨가한 제형(G2 및 G3)보다는 낮으나 Lipo-pam 제형인 G5 및 G6군에서 IL-4도 분비되었다(도 28).
또한, 도 29 내지 31에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, Lipo-pam 제형인 G5 및 G6군에서 IFN-γ 및 TNF-α를 많이 생성하였고(도 29 및 30), 항원 단독이나 알룸을 첨가한 제형(G2 및 G3)보다는 낮으나 IL-4도 분비되었다(도 31).
따라서, <실시예 13>의 결과로부터, 계절형 불활화 독감 백신 제조 시, 아쥬반트로서 Lipo-pam을 사용하는 것이 체액성 및 세포성 면역반응을 모두 유도함으로써 백신의 효능을 개선할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 상기로부터 본 발명에 따른 백신 아쥬반트인 Lipo-pam은 항원의 종류에 제한없이, 다양한 종류의 항원과 함께 사용될 수 있음을 확인하였다.
Claims (17)
- 리포펩티드가 삽입된 리포좀(liposome)을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트(adjuvant).
- 제1항에 있어서, 상기 리포펩티드가 Pam3Cys-SKKKK, Pam3-CSKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, Pam-CSKKKK, Dhc-SKKKK 및 FSL-1로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백신 아쥬반트.
- 제1항에 있어서, 면역활성물질을 추가로 포함하는, 백신 아쥬반트.
- 제3항에 있어서, 상기 면역활성물질이 폴리(I:C), QS21, MPLA(Monophosphoryl Lipid A), CpG 및 플라겔린(Flagellin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백신 아쥬반트.
- 제4항에 있어서, 상기 폴리(I:C)가 50 내지 5,000 bp의 길이인, 백신 아쥬반트.
- 제1항의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 항원이 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류 또는 폴리뉴클레오티드인, 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 항원이 세포 또는 바이러스로부터 유래된 것인, 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 항원이 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus)의 gE(glycoprotein E) 항원, 일본뇌염 바이러스의 gE(glycoprotein E) 항원 및 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 백신이 세포성 면역반응을 유도하는, 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 백신이 Th1 면역반응을 증진시키는, 백신 조성물.
- 제6항의 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 바이러스의 감염 예방 또는 치료제.
- 제6항의 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료제.
- 제6항의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스의 감염 예방 또는 치료 방법.
- 제6항의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
- 바이러스의 감염 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 제 6항의 백신 조성물의 용도.
- 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 제 6항의 백신 조성물의 용도.
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