WO2019035605A9 - 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트 및 이의 용도 - Google Patents

리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트 및 이의 용도 Download PDF

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안병철
조현진
백승희
정은정
정수경
신나리
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine adjuvant comprising a lipopeptide having a lipopeptide inserted therein as an active ingredient and a use thereof.
  • Herpes Zoster is caused by Varicella-Zoster Virus (VZV) and is a skin disorder that occurs in the spinal cord or sensory nerves of the brain.
  • VZV Varicella-Zoster Virus
  • the virus penetrates into peripheral nerve cells after proliferation in epidermal and dermal regions of the skin, and is present in latent state.
  • varicella develops and oscillates, and if it is latent in the ganglion and then becomes less resistant to the body, the VZV reactivates and appears as a herpes zoster.
  • VZV reactivation and onset of herpes zoster are associated with weakening of T cell-mediated cellular immune responses, especially in elderly people and those receiving immunosuppressive treatment.
  • a bulbous lesion appears and even if the lesion is restored, the aftereffects of the neuralgia remain.
  • Neuralgia, once it occurs, is difficult to cure and it causes poor quality of life due to severe pain.
  • VZV When VZV is transmitted, neglecting the initial response and neglecting the incubation period, eventually, reactivation of VZV causes herpes zoster and accompanies severe pain. In this case, generally, an antiviral agent is administered, but it has a problem that it is difficult to induce the death or inhibition of the activity of VZV, which is likely to have resistance in the body during the incubation period.
  • antiviral agents for VZV include ascrovirus, foot acyclovir, and palmyclover. Among them, ascrovirus is the most commercially available. However, acyclovir can be significantly effective only when administered within 24 hours after varicella. In other words, the acyclovir is not effective enough as an antiviral agent when it is prescribed 24 hours after viral infection or chickenpox rash, or after the occurrence of herpes zoster due to reactivation of VZV.
  • herpes zoster As the number of elderly people and immunosuppressed patients increases, the incidence of herpes zoster is rapidly increasing in Korea, but there is no essential treatment method, so it is necessary to develop a vaccine that can prevent it.
  • the efficacy of the anti-herpes zoster vaccine currently on the market has been recognized in clinical trials, the efficacy of vaccination against herpes zoster is only 50% lower than that of vaccine.
  • currently available anti-herpes zoster vaccine is an attenuated live vaccine, so there is a limitation in administration to immunosuppressed patients with a high incidence of herpes zoster, pregnant women, and possibly pregnant people.
  • the herpes zoster is latent in the ganglion and the body resistance is low, the VZV is reactivated. Therefore, it is more important to induce the cellular immune response than the humoral immune response in order to treat it. Therefore, it is necessary to develop a herpes zoster vaccine that can induce an effective and safe cellular immune response.
  • the molecular pattern of the antigen affects the outcome of the immune response. This is particularly important when the whole pathogenic microorganism is used as an antigen.
  • These antigens are mixed with several kinds of pathogen associated molecular pattern (PAMP) ligands such as lipopolysaccharide, nucleic acid, lipid protein or protein.
  • PAMP pathogen associated molecular pattern
  • the pathogen recognition receptor (PRR) on the surface of the antigen presenting cell is involved in the type of immune response induced by stimulating signals to induce various co-stimulatory molecules and cytokines by recognizing PAMP.
  • interferon gamma and IL-12 induce Th1 cell responses that are important for immune responses to viral infections.
  • the Th1 type of immune response induces more IgG2a or IgG2b production and a strong cellular immune response.
  • Korean Patent Registration No. 10-1723605 discloses a DNA vaccine composition for preventing and treating herpes zoster which contains a plasmid containing an insertion site of a VZV-derived gene encoding a protein of VZV
  • 10-2014-0022799 discloses a varicella vaccine and a varicella vaccine comprising as an active ingredient a genomic DNA of VZV MVA06 isolated from a Korean patient and a protein encoded by the open reading frame thereof.
  • the present inventors have conducted studies to develop a herpes simplex vaccine which induces not only a humoral immune response but also a cellular immune response with high safety.
  • the inventors of the present invention have found that a liposome-type conjugate conjugate containing Pam3-CSKKKK (Pam3CSK4) lipopeptide and lipid
  • the vaccine composition comprising poly (I: C) and an antigen in the prepared adjuvant, as well as a humoral immune response against a recombinant protein antigen having a small molecular weight, Respectively.
  • the vaccine composition of the present invention may be prepared by using various lipopeptides including Pam3-CSKKK, Dhc-SKKKK, PamDhc-SKKKK, etc., as well as the gE (glycoprotein E) antigen of Varicella- (Glycoprotein E) or seasonal inactivated influenza virus (AGE) antigens.
  • gE glycoprotein E
  • AGE seasonal inactivated influenza virus
  • An object of the present invention is to provide a vaccine adjuvant comprising a lipopeptide having a lipopeptide inserted therein as an active ingredient, a vaccine composition comprising the vaccine and a use thereof.
  • the present invention provides a vaccine adjuvant comprising liposome having lipopeptide inserted therein as an active ingredient.
  • the present invention also provides a vaccine composition comprising an adjuvant and an antigen of the present invention.
  • the present invention also provides a vaccine composition for preventing or treating viral infection comprising the vaccine composition of the present invention as an effective ingredient.
  • the present invention also provides a preventive or therapeutic agent for cancer comprising the vaccine composition of the present invention as an effective ingredient.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating infection of a virus comprising administering the vaccine composition of the present invention to a subject.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating cancer, comprising administering the vaccine composition of the present invention to a subject.
  • the present invention also provides the use of the vaccine composition of the present invention for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of infection of a virus.
  • the present invention provides the use of the vaccine composition of the present invention for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of cancer.
  • the vaccine composition comprising Lipo-Pam, which is a complex adjuvant comprising the lipids and lipopeptides of the present invention, can induce a humoral immune response as well as a high level of cellular immune response, and can be used not only as a gE antigen of Varicella- But also when gE antigen of seasonal influenza virus or seasonal inactivated influenza virus antigen is used, the composition of the present invention can be used commercially.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the production of a pPGXII-VZV gE plasmid in which a gE gene of VZV is introduced into a pPGXII vector.
  • FIG. 2A is an SDS-PAGE analysis of purification steps of VZV recombinant gE antigen.
  • M is a marker for confirming the size
  • 1 is a cell culture broth
  • 2 is a butyl-Sepharose chromatography eluate
  • 3 is DEAE-Sepharose chromatography eluent
  • 4 is CHT chromatography eluate
  • 5 is SP- Sepharose chromatography
  • the eluent and 6 means after concentration-desalting filtration.
  • Figure 2b shows the Western blot results of the recombinant gE antigen of the final purified VZV. 6 means after concentration-desalting filtration.
  • FIG. 3A is a graph comparing the total IgG antibody to the recombinant gE antigen of VZV of the recombinant vaccine according to the production method of the liposome and the ratio of components contained in the liposome.
  • FIG. 3B is a graph comparing the isotype of the antibody against the recombinant gE antigen of VZV of the recombinant vaccine according to the production method of the liposome and the proportion of components contained in the liposome.
  • 4A is a graph comparing ELISPOT analysis results of IFN-y and IL-4 with recombinant gE antigens of VZV of a recombinant vaccine according to the production method of liposome and components contained in the liposome.
  • 4B is a graph comparing ELISA analysis results of IFN-y, IL-4 and TNF-a with recombinant gE antigen of VZV of recombinant vaccine according to the production method of liposome and components contained in the liposome.
  • FIG. 5 is a view showing the structure of a vaccine prepared using Lipo-pam using a confocal microscope.
  • Figure 6 shows the total IgG antibody titers for vaccine compositions comprising adjuvant and recombinant gE antigen of VZV prepared by varying lipid and Pam3-CSKKKK composition and poly (I: C) capacity in Lipo-pam
  • FIG. 6 shows the total IgG antibody titers for vaccine compositions comprising adjuvant and recombinant gE antigen of VZV prepared by varying lipid and Pam3-CSKKKK composition and poly (I: C) capacity in Lipo-pam
  • 7A is a graph showing the effect of IFN-? And IL on the vaccine composition comprising the recombinant gE antigen of adjuvant and VZV prepared by varying the lipid contained in Lipo-pam and the composition of Pam3-CSKKKK and poly (I: C) -4 in the ELISPOT assay.
  • FIG. 7B is a graph showing the effect of IFN- ⁇ , IL (1: C) on the vaccine composition comprising adjuvant and recombinant gE antigen of VZV prepared by varying the lipid contained in Lipo-pam and the composition of Pam3-CSKKKK and poly -4 and TNF- ?.
  • FIG. 8 is a graph comparing total IgG antibody titers against vaccine compositions comprising adjuvants prepared by varying the lipid capacities of Lipo-pam and recombinant gE antigens of different doses of VZV.
  • Figure 9a compares ELISPOT analysis of IFN-y and IL-4 to vaccine compositions comprising adjuvants prepared with different lipid capacities in Lipo-pam and recombinant gE antigens of different doses of VZV Graph.
  • FIG. 9b shows ELISA analysis of IFN-y, IL-4 and TNF-alpha for vaccine compositions containing adjuvant and different doses of lipid contained in lipo-pam and recombinant gE antigens of different doses of VZV Fig.
  • Figure 10 compares total IgG antibody titers to vaccine compositions comprising adjuvants prepared by varying the lipid and poly (I: C) content of Lipo-pam and recombinant gE antigens of different doses of VZV Graph.
  • Figure 11a shows the effect of IFN-y and IL-4 on the vaccine composition comprising adjuvant and different doses of VZV recombinant gE antigen prepared by varying the lipid and poly (I: C) capacities of Lipo-pam Of the ELISPOT assay.
  • FIG. 11B shows the effect of IFN-.gamma., IL-4 on the adjuvant prepared by varying the lipid and poly (I: C) capacity of Lipo-pam and the vaccine composition containing recombinant gE antigen of different dose of VZV And TNF-a.
  • Figure 12 is a graph comparing total IgG antibody titers against recombinant gE antigens of VZV of recombinant vaccine according to attenuated herpes zoster vaccine and adjuvant formulation.
  • 13A is a graph comparing ELISPOT analysis results of IFN-y and IL-4 to recombinant gE antigens of VZV of recombinant vaccine according to attenuated herpes zoster vaccine and adjuvant formulation.
  • FIG. 13B is a graph comparing ELISA results of IFN-y, IL-4 and TNF-a with recombinant gE antigens of VZV of recombinant vaccine according to attenuated herpes zoster vaccine and adjuvant formulation.
  • FIG. 14 is a graph comparing the frequency of CD4 + T cells secreting a cytokine of a recombinant vaccine according to an attenuated herpes zoonotic vaccine and an adjuvant formulation.
  • 15 is a graph comparing the multifunctional activity of CD4 + T cells of the recombinant vaccine according to the attenuated herpes zoonotic vaccine and the adjuvant formulation.
  • 16 is a graph comparing total IgG antibody titers against recombinant VZV gE antigens of the recombinant vaccine according to the attenuated target herzin vaccine and the adjuvant composition and formulation.
  • 17A is a graph comparing ELISPOT analysis results of IFN-y and IL-4 against recombinant VZV gE antigens of recombinant vaccines according to the attenuated herpes zoster vaccine and adjuvant composition and formulation.
  • Figure 17B is a graph comparing ELISA results of IFN-y, IL-4 and TNF- alpha against recombinant VZV gE antigens of recombinant vaccines according to the attenuated herpes zoster vaccine and adjuvant composition and formulation.
  • 19A is a graph comparing ELISPOT analysis results of IFN-y and IL-4 with recombinant gE antigens of VZV of recombinant vaccine according to the composition and production method of Lipo-pam.
  • FIG. 19B is a graph comparing ELISA results of IFN-y, IL-4 and TNF-a with recombinant gE antigen of VZV of recombinant vaccine according to the composition and production method of Lipo-pam.
  • FIG. 20 shows the results of a recombinant vaccine according to the type and amount of lipid, the kind of immunologically active substance, and the recombinant gE antigenic capacity of VZV 0.0 > IgG < / RTI > antibody against recombinant gE antigen of VZV.
  • 21A is a graph comparing ELISPOT analysis results of IFN-y and IL-4 with recombinant gE antigens of VZV of recombinant vaccine according to lipid type and dose, type of immunologically active substance, and recombinant gE antigen dose of VZV.
  • Figure 21B compares the ELISA results of IFN-y, IL-4 and TNF-a with recombinant gE antigens of VZV of recombinant vaccine according to lipid type and dosage, type of immunologically active substance and recombinant gE antigen dose of VZV It is a graph.
  • FIG. 22 is a graph comparing total IgG antibody titers against recombinant VZV recombinant gE antigens of recombinant vaccines according to the types of lipopeptides constituting Lipo-pam.
  • 23A is a graph comparing ELISPOT analysis results of IFN- ⁇ and IL-4 with respect to VZV recombinant gE antigen of a recombinant vaccine according to the kind of lipopeptides constituting Lipo-pam.
  • 23B is a graph comparing the results of ELISA analysis of IFN-y, IL-4 and TNF-alpha against VZV recombinant gE antigen of recombinant vaccine according to the kind of lipopeptide constituting Lipo-pam.
  • 24A is a graph comparing total IgG antibody titers against recombinant JEV gE antigens.
  • Figure 24B is a graph comparing total IgG antibody titers against inactivated JEV antigens to recombinant JEV gE antigens.
  • 25A is a graph comparing ELISPOT analysis results of IFN-y and IL-4 against the gE antigen of Japanese encephalitis virus of recombinant vaccine according to the adjuvant formulation.
  • 25B is a graph comparing the results of ELISA analysis of IFN-y, IL-4 and TNF-alpha against gE antigen of Japanese encephalitis virus of recombinant vaccine according to the adjuvant formulation.
  • FIG. 26 is a graph comparing total IgG antibody titers against four strains (H1N1, H3N2, B-Y, or B-V) of seasonal inactivated influenza virus according to the adjuvant formulation.
  • Figure 27 shows ELISPOT analysis of IFN-y against four strains of seasonal inactivated influenza virus according to the adjuvant formulation (H1N1, H3N2, B-Y or B-V).
  • Figure 28 shows ELISPOT analysis of IL-4 against four strains of seasonal inactivated influenza virus (H1N1, H3N2, B-Y or B-V) according to the adjuvant formulation.
  • Figure 30 shows the results of ELISA analysis of TNF-a against four strains of seasonal inactivated influenza virus (H1N1, H3N2, B-Y or B-V).
  • Figure 31 shows the results of ELISA analysis of IL-4 against four strains of seasonal inactivated influenza virus (H1N1, H3N2, B-Y, or B-V).
  • the present invention provides a vaccine adjuvant comprising as an active ingredient a lipopeptide having a lipopeptide inserted therein.
  • the lipopeptide may be composed of a fatty acid bonded to a glycerol molecule and various amino acids.
  • the number of amino acids constituting the fatty acid or lipopeptide in the glycerol molecule may be one or more.
  • the fatty acid and the amino acid may be chemically modified.
  • the lipopeptide may be part of a molecule derived from gram-positive or gram-negative bacteria or mycoplasma, or may be a lipid protein in its entire molecular form.
  • the lipopeptide may be selected from the group consisting of Pam3Cys-SKKKK, Pam3-CSKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys- SKKKK, PamCys (Pam) -SKKKK, Ole2Cys- SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc- Dhc-SKKKK, and FSL-1.
  • the lipopeptides may be added to liposomes at concentrations ranging from 20 to 250, 20 to 50, 50 to 250, 150 to 250, 50 to 150, 20 to 2500, 20 to 500, 50 to 2500, 150 to 2500, Can be inserted.
  • the liposome may be composed of lipid.
  • the lipid may be a cation, an anion or a neutral lipid.
  • the lipid may be selected from the group consisting of DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane), DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DDA (Dimethyldioctadecylammonium), DC- (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- [Phospho-rac- (1-glycerol)]), DPPC (1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) and cholesterol.
  • DOTAP 1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-
  • the vaccine adjuvant according to the present invention may further comprise an immunologically active substance.
  • the immunoactive substance may be any one selected from the group consisting of poly (I: C), QS21, monophosphoryl lipid A (MPLA), CpG and flagellin.
  • the poly (I: C) has been used as a powerful derivative of type 1 interferon in in vitro and in vivo studies. Furthermore, poly (I: C) has been shown to stably and maturely form dendritic cells, the most potent antigen presenting cells in mammals (Rous, R. et al. 2004, International Immunol, 16: 767-773).
  • IL-12 is a potent IL-12 inducer that stimulates the immune response to develop Th1, leading to cell-mediated immune responses and IgG2a or IgG2b antibody formation to be.
  • the poly (I: C) may be 50 to 5,000 bp in length. Wherein the poly (I: C) has a weight average molecular weight of from 10 to 150, from 10 to 90, from 10 to 50, from 10 to 30, from 30 to 60, from 30 to 90, from 30 to 150, from 30 to 50, from 10 to 1500, 500, 10 to 300, 30 to 600, 30 to 900, 30 to 1500 or 30 to 500 ⁇ ⁇ / dose.
  • the QS21 is a fraction of a saponin substance called triterpene glucoside having a molecular weight of 1990.14 Da extracted from the bark of Quillaja saponaria Molina of South America.
  • QS21 When used in conjunction with lipids such as MPLA or cholesterol, QS21 is known to induce humoral and cellular immune responses by secretion of Th1 type cytokines in antigen presenting cells such as macrophages and dendritic cells.
  • said QS21 is selected from the group consisting of 1 to 150, 1 to 90, 1 to 50, 1 to 30, 3 to 60, 3 to 90, 3 to 150, 3 to 50, 1 to 1500, 1 to 900, 1 to 500, , 3 to 600, 3 to 900, 3 to 1500, or 3 to 500 [mu] g / dose.
  • the present invention also provides a vaccine composition comprising an adjuvant and an antigen of the present invention.
  • the adjuvant may have the above-described characteristics.
  • the adjuvant may include a lipopeptide having a lipopeptide inserted therein, and may further include an immunologically active substance.
  • the antigen may be any substance capable of being recognized by the immune system of the host and capable of causing an immune response when it enters the host's body and may be a protein, a recombinant protein, a glycoprotein, a peptide, a polysaccharide, a lipopolysaccharide or a polynucleotide Lt; / RTI >
  • the antigen may be a gE (glycoprotein E) antigen of Varicella-Zoster Virus; GE (glycoprotein E) antigen of Japanese encephalitis; A seasonal inactivated influenza virus antigen; The haemagglutinin and neuraminidase antigens of the influenza virus; Pertussis toxin antigen, filamentous haemagglutinin antigen and pertactin antigens of Bordetella pertussis; Antigens of human papilloma virus (HPV), climatic polysaccharide antigens of the
  • the vaccine composition may additionally comprise buffers, isotonic agents, preservatives, stabilizers and solubilizing aids.
  • buffers phosphate, acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, citrate and the like can be used.
  • the vaccine may induce a high cellular immune response as well as an antigenic-specific humoral immune response.
  • the vaccine may enhance the Th1 immune response.
  • Antibodies of IgG2a or IgG2b that promote Th1 immune responses effective against antiviral and anticancer immune responses are produced by cytokines produced by helper T cell 1 (Th1). Therefore, the vaccine composition of the present invention can also be used as a preventive or therapeutic agent for viral infection or cancer.
  • recombinant Varicella-Chooster virus gE antigen see FIGS. 1 and 2
  • mixed DC-Chol, DOPE or DPPC lipid with Pam3-CSKKKK, -Pam was prepared by adding poly (I: C) or QS21 as an immunologically active substance thereto, and the recombinant gE antigen of the prepared Barissera-Zoster virus was added thereto to prepare a recombinant vaccine against Barisella- .
  • the recombinant vaccine showed that Pam3-CSKKKK forms a liposome together with lipid, and recombinant gE antigen of VZV forms a structure bound to the surface of liposome (FIG. 5).
  • the recombinant vaccine induced not only the humoral immune response but also the cellular immune response (see FIGS. 3, 4 and 6 to 21).
  • a recombinant vaccine prepared by mixing Lipo-pam with various types of lipopeptides together with DC-Chol and DPPC and adding the recombinant gE antigen of poly (I: C) and VZV to the Lipo-pam, Induced high cellular immune responses as well as sexual and immune responses (see Figures 22 and 23).
  • a recombinant vaccine against Japanese encephalitis virus was prepared by adding poly (I: C) and recombinant gE antigen of Japanese encephalitis virus to Lipo-Pam prepared by mixing DC-Chol, DPPC and Pam3-CSKKKK, The vaccine highly induced the humoral immune response as well as the cellular immune response (see FIGS. 24 and 25).
  • the vaccine composition comprising LIPO-Pam with the lipopeptide of the present invention as an adjuvant can be used commercially advantageously because it has an immune enhancing effect without limitation on the kind of antigen.
  • the present invention provides a viral infection or cancer preventive or therapeutic agent comprising the vaccine composition of the present invention as an effective ingredient.
  • the vaccine composition may have the characteristics as described above.
  • the vaccine composition may comprise an adjuvant and an antigen.
  • the adjuvant may include a liposome having a lipopeptide inserted therein, and may further comprise an immunostimulatory substance.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated for human or veterinary administration and administered by various routes.
  • the administration route can be administered by oral, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, and other routes. Preferably, it is formulated and administered as an injection.
  • the injectable solution may be an aqueous solvent such as physiological saline solution or ring gel solution, a non-aqueous solvent such as vegetable oil, higher fatty acid ester (e.g., oleic acid), alcohol (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.) (Such as ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrophosphate, BHA, tocopherol, EDTA, etc.), emulsifiers, buffers for pH control, inhibition of microbial growth (For example, mercuric nitrate, thimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.), for example.
  • aqueous solvent such as physiological saline solution or ring gel solution
  • a non-aqueous solvent such as vegetable oil, higher fatty acid ester (e.g., oleic acid), alcohol (e.g., ethanol,
  • the present invention also provides a method for preventing or treating infection of a virus or cancer, comprising administering a vaccine composition of the present invention to a subject.
  • the vaccine composition may have the characteristics as described above.
  • the vaccine composition may comprise an adjuvant and an antigen.
  • the adjuvant may include a liposome having a lipopeptide inserted therein, and may further comprise an immunostimulatory substance.
  • the subject may be a mammal, particularly a human.
  • the administration can be a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount that is capable of exhibiting a therapeutic effect and at the same time not causing side effects or serious or excessive immune response, and the exact dosage level may vary depending on the antigen to be included in the vaccine.
  • the administration can be easily determined by those skilled in the art according to factors well known in the medical field such as the patient's age, body weight, health, sex and sensitivity to the drug, route of administration and administration method. The administration may be from one time to several times.
  • the present invention provides the use of the vaccine composition of the present invention for use in the manufacture of a medicament for infecting a virus or preventing or treating cancer.
  • the vaccine composition may have the characteristics as described above.
  • the vaccine composition may comprise an adjuvant and an antigen.
  • the adjuvant may include a liposome having a lipopeptide inserted therein, and may further comprise an immunostimulatory substance.
  • a gene (SEQ ID NO: 1) was inserted so that a restriction enzyme recognition sequence (Nhe I at the 5 'region, Xho I at the 3' region) and a kozak sequence were contained in the outside region of the gE (glycoprotein E) gene expression site of VZV.
  • a codon-optimized sequence was used for the CHO cell in which the anchor domain of the C-terminal was removed from ORF68 (glycoprotein E) of the entire genome of human herpesvirus type 3 (HHV-3) Respectively.
  • VZV gE gene described in SEQ ID NO: 1 was digested with Nhe I and Xho I restriction enzymes and subcloned into the pPGXII vector to prepare a VZV gE expression plasmid pPGXII-VZV gE (FIG. 1).
  • the pPGXII-VZV gE plasmid DNA prepared in Example ⁇ 1-1> was linearized with Ahd I restriction enzyme and then ligated with pDCH1P (dhfr) plasmid DNA using an electroporation method in a medium containing HT (Hypoxantine-Thymidine) In CHO DG44 (S) -EX cells cultured in passage 6. Subsequently, the transformed cells were inoculated into a medium containing HT, cultured in a selective medium containing no HT when the cells were fully grown, and initially adapted cells were obtained after about two weeks.
  • Dot blotting and western blotting were carried out using the obtained cell groups, and four types of cells having excellent productivity among the initially adapted cell groups were selected.
  • the selected strains were diluted by the limiting dilution method, and single cell lines were separated by inoculating 10 plates each into 96 well plates so as to be 1 cell / well.
  • the isolated single cell line colonies were transferred to a 24 well plate and cultured. When the cell count was sufficient, the cells were transferred to Erlenmeyer flask and suspension culture was started. The cell viability was maintained at 95% or higher after 6th generation, and the productivity and stability were confirmed by culturing the cells at a constant rate.
  • the final cell line was selected considering cell growth and productivity.
  • EfficientFeed C + (Invitrogen) was added to 7.5 L of a jar fermenter containing the HyCell CHO (GE Healthcare) medium and the cell line finally selected in Example ⁇ 1-2> was added to 6.5 x 10 6 cells / mL .
  • the permenter was operated at 32 ° C, DO 30%, and 100 rpm, and the pH of the medium was maintained at 6.8 or more.
  • the content of glucose and lactic acid in the permerer was analyzed daily and the glucose content fell below 20 mmol / L, 45% D-glucose was added at a concentration of 1 v / v% for 10 days.
  • the culture solution was recovered from the cells cultured in Example ⁇ 1-3 > using a depth-filter, and the recombinant gE antigen of VZV was purified therefrom.
  • a four-step column chromatography using butyl-sepharose, DEAE-sepharose, CHT hydroxyapatite and SP-sepharose sequentially,
  • the recombinant gE antigen of VZV was purified using the UF / DF method and the one - time UF / DF method for buffer exchange.
  • the purified recombinant gE antigen of VZV showed a molecular weight of about 70 kDa (Fig. 2).
  • DC-Chol and DOPE were dissolved in chloroform to prepare DC-Chol: DOPE liposome, respectively, and DC-Chol and DOPE were mixed at a ratio of 3: 7. And the organic solvent was vaporized with nitrogen gas. At this time, a thin film was formed on the base wall. The organic solvent remaining in the formed film was removed by being stored in a vacuum decicator for 1 hour. Distilled water was added to the completely dried lipid film and rehydrated for 10 minutes using a sonic bath. When a multilamellar vesicle (MLV) suspension was generated, a 2X buffer solution (pH 7.0) containing 300 mM NaCl in 20 mM sodium phosphate was added in the same amount as the distilled water.
  • MLV multilamellar vesicle
  • the resulting MLV was sonicated for 5 minutes for 3 minutes / 3 seconds (pulse on / off) for 5 minutes to produce a DC-Chol: DOPE liposome in the form of a small unilamellar vesicle (SUV) Respectively.
  • Lipo-Pam was prepared by dissolving DC-Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK in an organic solvent, then mixing DC-Chol and DOPE at a ratio of 3: 7 and adding Pam3-CSKKKK at 25 / / dose Chol: DOPE < / RTI > liposomes, except that the concentration was 100 ⁇ ⁇ / dose.
  • control group L-pampo was prepared by mixing 25 ⁇ g of Pam3-CSKKKK, which is a lipopeptide, with 20 ⁇ g or 200 ⁇ g of poly (I: C).
  • a test vaccine was prepared by adding 5 ⁇ g / dose of VZV gE antigen to the mixture.
  • the mixture was sonicated and antigen was added to produce a test vaccine.
  • the prepared vaccine was intramuscularly injected into female C57BL / 6 mice at 6 weeks of age (Orient Bio, Korea) at 2-week intervals.
  • the total IgG antibody to the recombinant VZV gE antigen was determined by the following method. Specifically, purified VZV recombinant gE antigen was coated on a 96-well microplate at a concentration of 100 ng / well, and 1% bovine serum albumin was added to prevent non-specific binding. .
  • Mouse IgG-HRP human IgG-HRP (horse radish heroxidase, KPL, USA) was added as a secondary antibody to the wells and incubated for 1 hour at 37 ° C. The reaction was carried out under the same conditions.
  • the reacted microplate was washed and reacted with a coloring reagent TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine) peroxidase substrate (KPL, USA) for 10 minutes at room temperature, , The OD was measured at 450 nm using an ELISA reader.
  • Antibody was defined as the reciprocal of the antibody dilution factor representing the OD value corresponding to twice the negative control OD value.
  • the isotype of the antibody against the recombinant gE antigen of VZV was determined by using goat anti-mouse IgG1, goat anti-mouse IgG2a, goat anti-mouse IgG2b or goat anti-mouse IgG2c as primary antibodies, All antibodies to recombinant gE antigens of VZV were analyzed in the same manner as the assay except that rabbit anti-goat IgG-HRP was used as an antibody.
  • isotype analysis of antibodies against recombinant gE antigens of VZV showed IgG2b and IgG2c antibody titers to be higher than IgG1 in all test groups.
  • the IgG2-type antibody was higher in the G3 group mixed with -pampo and the G6 group mixed with poly (I: C) in Lipo-pam (FIG. 3b).
  • the cell-mediated immune response induced by the test vaccine administered in Example ⁇ 2-1> was obtained by isolating splenocytes from the spleen from the mice at 4 weeks after the 2nd vaccination, Assay and cytokine ELISA method.
  • ELISPOT plates with antibodies against IFN-y or IL-4 were first washed with PBS, and complete media was added to activate the plates. After dispense of mouse spleen cells in the ELISPOT plate with 5 ⁇ 10 5 cells / well, ⁇ Example 1> The recombinant VZV gE antigen prepared into, 37 °C, in an incubator of 5% CO 2 conditions, 24 hours or in And reacted for 48 hours. The spleen cells were then removed and the plates were washed with PBS and the biotin conjugated antibody in the Mouse IFN-?
  • ELISpot PLUS kit (Mabtech, Sweden) and Mouse IL-4 ELISpot PLUS kit (Mabtech, Sweden) Diluted with PBS containing FBS and added to the wells of the plates, respectively. This was reacted at room temperature for 2 hours, washed, and HRP-conjugated streptavidin was added to each well of the plate, and reacted at room temperature for 1 hour. The reaction mixture was washed with TMB coloring reagent and allowed to react until a clear spot was formed. After completion of the reaction, third distilled water was added to stop the reaction. Plates were washed several times with distilled water, dried at room temperature and the spots were calculated using an ELISPOT reader.
  • splenocytes of mouse were dispensed at a density of 1.5 ⁇ 10 6 cells / well in a 96-well plate, and then the recombinant VZV gE antigen prepared in Example 1 was added thereto, And incubated for 48 hours in a 5% CO 2 incubator. The culture broth was transferred to each test group and centrifuged at 4 ° C and 3000 rpm for 5 minutes. The supernatant thus obtained was used as a sample for performing cytokine ELISA.
  • the coating antibody contained in the Mouse IFN-? ELISA kit (BD, USA), Mouse IL-4 ELISA kit (BD, USA) and Mouse TNF-?
  • IFN- ⁇ ELISPOT analysis showed that Lipo-Pam and poly (I: C) were prepared by mixing Lipo-Pam and L-pampo compared to G2 and G3, Induced overall generation of high IFN-y.
  • the G6 group produced significantly higher IFN- ⁇ than the other test groups, and the G8 and G9 groups also produced relatively higher IFN- ⁇ .
  • the G9 group to which the ultrasonic treatment was added before addition of the antigen produced significantly more IFN- ⁇ than the G7 group.
  • IL-4 was highly produced in G6 group. Comparing the cellular immune response with the combination of Lipo-pam and poly (I: C), Lipo-pam did not have poly (I: C) (IFN-y) and IL-4 were produced in the G6 group administered with the vaccine prepared by mixing the poly (I: C) and poly (I: C).
  • the results of ELISA analysis of IL-4 and TNF- ⁇ also showed similar trends with the results of ELISA analysis of IFN- ⁇ , and a large amount of IL-4 and TNF- ⁇ were induced in the G6 group.
  • Lipo-pam did not have poly (I: C) 4b and TNF-a were secreted in the G6 group administered with the vaccine prepared by mixing the poly (I: C) and poly (I: C).
  • the herpes zoster vaccine induces a cellular immune response as compared with the humoral immune response.
  • the vaccine mixed with L-pampo in the liposome disperses and stabilizes the particle size of the mixture uniformly
  • vaccines made by mixing Lipo-pam and poly (I: C) will maintain the size of the particles for a longer period of time with no additional steps . It was found effective to develop a vaccine formulation based on Lipo-Pam which induces cellular immune response better and has excellent stability of formulation.
  • DC-Chol dimethylethancarbanoyl cholesterol
  • DOPE dioleoyl-phosphatidylethanolamine
  • Pam3-CSKKKK was used as 6-TAMRA
  • SE 6-Carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester
  • VZV gE antigen was stained with fluorescein.
  • Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK were dissolved, and then DC-Chol and DOPE were mixed at a ratio of 3: 7 and Pam3-CSKKKK was added to the mixture at a concentration of 25 ⁇ g / dose.
  • Lipo-Pam was prepared. Thereafter, the Lipo-Pam was mixed with poly (I: C) at a concentration of 40 / / dose, and the mixture was added with 5 / / dose of antigen to prepare a test vaccine. Respectively.
  • the radius of the liposome lipid-stained dye was almost the same as that of the pigment stained with Pam3CSK.
  • the dye coloration by the dye stained with the recombinant gE antigen of VZV The radius was larger than these.
  • the prepared vaccine had a structure in which Pam3-CSKKKK and lipid form a liposome (Lipo-pam) and a recombinant gE antigen of VZV is bonded to the surface of the liposome (FIG. 5).
  • the ratio of lipid, the capacity of Pam3-CSKKKK, the capacity of poly (I: C), and the immunogenicity of recombinant vaccine according to the degree of recombination of VZV gE antigen with liposomes were compared.
  • DC-Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK were dissolved and then DC-Chol and DOPE were mixed at a ratio of 1: 1 or 3: 7 and Pam3-CSKKKK was added thereto at a concentration of 25 or 100 / / Lipo-Pam was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1>.
  • poly (I: C) at a concentration of 20, 40, 60, 80 or 160 / / dose with Lipo-Pam as shown in Table 2 below
  • a recombinant gE antigen of 5 / / dose of VZV was prepared.
  • the prepared vaccine was intramuscularly injected into female C57BL / 6 mice at 6 weeks of age (Orient Bio, Korea) at 2-week intervals.
  • mice were immunized at week 0, 2 weeks after the first vaccination and 2 weeks after the second vaccination, Of the serum was separated to prepare a sample. Using the prepared sample, the whole IgG antibody to the recombinant gE antigen of VZV was analyzed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • the ratio of DC-Chol: DOPE of Lipo-pam prepared by mixing the ratio of DC-Chol: DOPE of 3: 7 (G2 to G7) was 1: 1 (G8 to G12 ),
  • the IgG antibody titer was higher than that of IgG antibody.
  • the total IgG antibody level was highly induced in proportion to the capacity of the lipopeptides Pam3-CSKKKK and poly (I: C) (FIG. 6).
  • G2, G5, G6, and G7 were found to bind most of the recombinant gE antigen of VZV to Lipo-pam.
  • Example ⁇ 4-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 4-1 >, the spleen was removed from the mice at 4 weeks after the 2nd vaccination, 2-3>, ELISPOT assay and cytokine ELISA were performed to analyze the cellular immune response.
  • the vaccine prepared with the ratio of DC-Chol: DOPE of 3: 7 showed a higher IFN- ⁇ ratio than the vaccine prepared with the ratio of DC-Chol: DOPE of 1: And IL-4.
  • Pam3-CSKKKK was used at a concentration of 25 ⁇ g / dose
  • IFN- ⁇ and IL-4 were most abundant when DC-Chol: DOPE was used at 3: 7
  • poly (I: C) at 40 ⁇ g / IFN- ⁇ and IL-4 were produced as the concentration of poly (I: C) was higher when Pam3-CSKKKK was used at 100 ⁇ g / dose or 200 ⁇ g / dose, but Pam3-CSKKKK at 25 ⁇ g / dose IFN-y and IL-4 were significantly lower than those in the test group (Fig. 7A).
  • cytokine ELISA analysis showed that the vaccine prepared with a ratio of DC-Chol: DOPE of 3: 7 was higher than that prepared with a ratio of DC-Chol: DOPE of 1: 1 More secretion of IFN- ⁇ and IL-4 was induced, whereas TNF- ⁇ was similar in two ratios. Similar to the ELISPOT results, the vaccine using Pam3-CSKKKK at 25 ⁇ g / dose induced more IFN- ⁇ , IL-4 and TNF- ⁇ secretion than the vaccine at 100 or 200 ⁇ g / dose.
  • the ratio of DC-Chol: DOPE was 1: 1 in the G3 group using poly (I: C)
  • the secretion of three cytokines was most induced in G8 group using poly (I: C) at 20 / / dose (Fig. 7B).
  • Example 5 Lipids and Of VZV Recombination gE Comparison of immunogenicity of recombinant vaccine according to antigen dose
  • the amount of recombinant gE antigen added to the lipid and VZV was determined by using DC-Chol: DOPE, 25 ⁇ g / dose of Pam3-CSKKKK and 20 ⁇ g / dose of poly (I: C) Were compared with the immunogenicity of the vaccine.
  • mice were immunized at the 0th week after immunization, at 2 weeks after the first vaccination and at 2 weeks after the second vaccination, Of the serum was separated to prepare a sample. Using the prepared sample, the whole IgG antibody to the recombinant gE antigen of VZV was analyzed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • Example ⁇ 5-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 5-1 >, the spleen was removed from the mice at 4 weeks after the 2nd vaccination, 2-3>, ELISPOT assay and cytokine ELISA were performed to analyze the cellular immune response.
  • ELISPOT analysis of IFN- ⁇ and IL-4 showed that recombinant gE antigen of VZV at a concentration of 2 ⁇ g / dose and DC-Chol: DOPE lipid at a concentration of 125 ⁇ g / IFN-y and IL-4 were most abundant in the G8 group (Fig. 9A).
  • cytokine ELISA analysis showed that recombinant gE antigen of VZV at a concentration of 2 / / dose and G8 produced by using DC-Chol: DOPE lipid at a concentration of 125 ⁇ g / , Whereas the G11 group produced using DC-Chol and DOPC produced the least amount of cytokine secretion compared to the other test groups (FIG. 9b).
  • Example ⁇ 6-1 > To evaluate the humoral immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 6-1 >, the mice were immunized at 0, 2, and 4 weeks after the first vaccination and 2 weeks after the second vaccination, And a sample was prepared. Using the prepared samples, the total IgG antibody to VZV gE antigen and the isotype of the antibody were analyzed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • Example ⁇ 6-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 6-1 >, spleen was removed from the mice at 4 weeks after the 2nd vaccination, 2-3>, ELISPOT assay and cytokine ELISA were performed to analyze the cellular immune response.
  • IFN-? And IL-4 ELISPOT analysis showed that lipid was 125 ⁇ ⁇ / dose, poly (I: C) was 40 ⁇ ⁇ / dose and recombinant gE IFN-y and IL-4 were produced in the G6 group using the antigen at 2 / / dose (Fig. 11A).
  • cytokine ELISA analysis showed that lipid was 125 / / dose, poly (I: C) was 40 ⁇ g / dose, and recombinant gE antigen of VZV was 2 ⁇ g / dose IFN-y, IL-4 and TNF-a were most secreted in G6 group (Fig. 11B).
  • immunogenicity of the vaccine was compared according to the antigenic dose contained in the recombinant vaccine prepared using the attenuated live vaccine Zostavax and the recombinant VZV gE antigen.
  • DC-Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK, DC-Chol and DOPE mixed lipids were mixed at a ratio of 3: 7 at a concentration of 125 / / dose, and Pam3- CSKKKK at a concentration of 25 / / Lipo-Pam was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1>, except that Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK were mixed.
  • L-pampo was also prepared by mixing 25 ⁇ g / dose of Pam3-CSKKKK, 200 ⁇ g / dose of poly (I: C) and 5 ⁇ g / dose of antigen and used as a control. Thereafter, test vaccines having compositions as described in Table 5 below were prepared.
  • the prepared vaccine or crude Starbox was intramuscularly injected into 6-week-old C57BL / 6 female mice (Orient Bio, Korea) at 2-week intervals.
  • mice were immunized at 0, 2, and 4 weeks after the first vaccination and 2 weeks after the second vaccination, Of the serum was separated to prepare a sample. Using the prepared samples, the total IgG antibody to the recombinant gE antigen of VZV and the isotype of the antibody were analyzed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • the G2 group administered with ZosterBox and the G3 group using aluminum hydroxide showed lower total IgG antibody than the G4, G5 and G6 groups using L-pampo or Lipo-Pam 12).
  • the ratio of IgG2b / IgG1 to IgG2c / IgG1 was higher in the G4 group using L-pampo than in the G5 group using Lipo-pam Respectively.
  • Example ⁇ 7-1 &gt To analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 7-1 >, spleen was isolated from mice at 4 weeks after the second vaccination, to isolate whole splenocytes.
  • ELISPOT assays and cytokine ELISA were performed using the spleen cells in the same manner as in Example ⁇ 2-3>, and the intracellular cytokine staining for IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and IL-2 was performed using a flow cytometer (intracellular cytokine staining, ICS) analysis.
  • Cellular immune responses were analyzed by comparing the degree of CD4 + T cells secreting cytokines specific for recombinant VZV gE antigen in each formulation.
  • IFN- ⁇ and IL-4 ELISPOT analysis showed that the G2 group treated with Joostab had significantly lower IFN- ⁇ and IL-4, whereas G5 with Lipo-pam And G6 group produced the most IFN-y and IL-4 (Fig. 13A).
  • cytokine ELISA analysis showed that the G2 group administered with Zostarbox induced the least secretion of IFN-y, IL-4 and TNF-alpha, while G5 with Lipo-pam And G6 group were the most induced secretion of IFN-y, IL-4 and TNF-a (Fig. 13B).
  • cytokines secreted from each test group was high in the frequencies of CD4 + T cells secreting respective cytokines in the G5 and G6 groups using Lipo-pam (Fig. 14).
  • Fig. 15 when comparing the polyfunctionality of gE antigen-specific CD4 + T cells, assuming that the number of cells that secrete one or more kinds of cytokines in each test group is 100% , And CD4 + T cells secreting one or more cytokines.
  • the highest test group that secreted all three cytokines was the G5 and G6 groups using Lipo-pam.
  • the ratio of CD4 + T cells secreting only one cytokine was high and it was confirmed that multifunctionality was low (Fig. 15).
  • Example 8 Attenuated The lipid ratio of the shingles vaccine to the recombinant vaccine and Of poly (I: C) Comparison of immunogenicity by dose
  • the immunogenicity of the vaccine according to the ratio of lipid contained in the recombinant vaccine prepared using the attenuated live vaccine Joostabox and recombinant gE antigen of VZV and poly (I: C) was compared .
  • DC-Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK were dissolved, and DC-Chol and DOPE were added to a concentration of 125 ⁇ g / dose in a ratio of 3: 7 such that the concentration of Pam3-CSKKKK was 25 ⁇ g / DPOL and Pam3-CSKKKK so that the concentration of Pam3-CSKKKK was 25 ⁇ g / dose such that DOPE and Pam3-CSKKKK were mixed or the lipid having a ratio of DC-Chol and DPPC of 125:
  • Lipo-Pam was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1 > L-pampo was also prepared by mixing 25 ⁇ g / dose of Pam3-CSKKKK, 200 ⁇ g / dose of poly (I: C) and 5 ⁇ g / dose of recombinant gE antigen of VZV.
  • the DC-Chol DOPE liposome was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1>. Thereafter, Lipo-Pam was mixed with poly (I: C) at a concentration of 20, 40 or 80 / / dose as shown in Table 6, and then 5 ⁇ g / dose of recombinant VZV gE antigen was added to the mixture (G10 and G11), L-pampo and DC-Chol: Lipo-Pam were simultaneously mixed with poly (I: C) and 5 ⁇ g / dose of recombinant VZV gE antigen DOPE liposomes were mixed (G5 group) or mixed with 5 ⁇ g / dose of recombinant VZV gE antigen (G2 group) in aluminum hydroxide at a concentration of 100 ⁇ g / dose to prepare a test vaccine. The prepared vaccine or Joostabox was intramuscularly injected twice at 6-week-old C57BL / 6 female mice (Orient Bio, Korea) at intervals of 2 weeks.
  • mice were immunized at 0, 2, and 4 weeks after the first vaccination and 2 weeks after the second vaccination, Of the serum was separated to prepare a sample.
  • Antibody specific antibody formation was analyzed by ELISA using the prepared samples to determine antibody titers.
  • the whole IgG antibody to the recombinant gE antigen of VZV was analyzed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • the G3 group administered with crude starbox and the G2 group using aluminum hydroxide showed lower IgG antibody level than the G4 to G11 group using L-pampo or Lipo-Pam (Fig. 16 ).
  • Example ⁇ 8-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 8-1 >, the spleen was removed from the mice at 4 weeks after the 2nd vaccination, 2-3>, ELISPOT assay and cytokine ELISA were performed to analyze the cellular immune response.
  • IFN- ⁇ and IL-4 ELISPOT showed that IFN- ⁇ and IL-4 were significantly reduced in the G3 group treated with ZosterBox, while DC-Chol: DPPC (I: C) and 5 ⁇ g / dose of recombinant Lipo-pam at a concentration of 40 ⁇ g / dose were added to G7 and Lipo-Pam using 40 ⁇ g / And a large number of IFN-y and IL-4 were produced in the G11 group in which VZV gE antigen was simultaneously mixed (Fig. 17A).
  • cytokine ELISA analysis showed that Lipo-pam prepared using DC-Chol: DPPC (1: 1) and G7 group using poly (I: C) at 40 / / DC-Chol: The highest secretion of IFN- ⁇ was induced in the G5 group mixed with DOPE liposome and L-pampo.
  • IL-4 was not largely differentiated from the formulation, but many secretions were induced in the G7 to G9 and G11 groups using Lipo-pam prepared using DC-Chol: DPPC (1: 1). TNF- ⁇ was secreted in a large number in the G5, G7, G9 and G11 groups (Fig. 17B).
  • Example 9 Types of lipids, Of poly (I: C) Capacity and Of VZV Recombination gE Comparison of Immunogenicity of Recombinant Vaccines by Mixing Agents
  • DC-Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK were dissolved, and DC-Chol and DOPE were added to a concentration of 125 ⁇ g / dose in a ratio of 3: 7 such that the concentration of Pam3-CSKKKK was 25 ⁇ g / DOPE and Pam3-CSKKKK or DC-Chol and DPPC such that the concentration of Pam3-CSKKKK was 25 ⁇ g / dose so that the concentration of lipid having a ratio of 1: 1 or 3: 7 of DC-Chol and DPPC was 125 ⁇ g / And Pam3-CSKKKK were mixed, Lipo-Pam was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1>.
  • L-pampo was also prepared by mixing 25 ⁇ g / dose of Pam3-CSKKKK, 200 ⁇ g / dose of poly (I: C) and 5 ⁇ g / dose of recombinant VZV gE antigen. Thereafter, Lipo-Pam and poly (I: C) at a concentration of 40 or 200 / / dose were mixed as shown in the following Table 7, and the mixture was further supplemented with 5 / / dose of recombinant VZV gE antigen (G3 to G6 ), Lipo-Pam and poly (I: C) at a concentration of 40 or 200 ⁇ g / dose and 5 ⁇ g / dose of recombinant VZV gE antigen simultaneously (G7 to G10 group).
  • the prepared vaccine was intramuscularly injected into female C57BL / 6 mice at 6 weeks of age (Orient Bio, Korea) at 2-week intervals.
  • Example ⁇ 9-1 > To analyze the humoral immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 9-1 >, the mice were immunized at 0, 2, and 4 weeks after the first vaccination and 2 weeks after the second vaccination And a sample was prepared. Using the prepared sample, the whole IgG antibody to the recombinant gE antigen of VZV was analyzed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • Example ⁇ 9-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 9-1 >, splenic cells were isolated from the mice at 4 weeks after the 2nd vaccination, 2-3>, ELISPOT assay and cytokine ELISA were performed to analyze the cellular immune response.
  • cytokine ELISA analysis showed that the secretion of IFN-? And TNF-? was induced more in the formulation using DC-Chol: DPPC than in the formulation using DC-Chol: DOPE, The highest secretion of IFN- ⁇ and TNF- ⁇ was induced in the G6 and G10 groups, in which the ratio of -Chol: DPPC was 1: 1.
  • IL-4 was more secreted in the G6 and G10 groups using the ratio of G2 and DC-Chol: DPPC using L-pampo at a ratio of 1: 1, compared with other formulations, and G3 with DC-Chol: DOPE
  • secretion of IL-4 was induced to a degree similar to that of the formulation using DC-Chol: DPPC (Fig. 19B).
  • Example 10 Types and amounts of lipids, types of immunologically active substances, and Of VZV Recombination gE Comparison of immunogenicity of recombinant vaccine according to antigen dose
  • DC-Chol and DOPE were added at a concentration of 3: 7 lipid to a concentration of 125 / / dose, and Pam3-CSKKKK to a concentration of 25 / / Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK, or a mixture of DC-Chol and DPPC such that Pam3-CSKKKK is at a concentration of 25 ⁇ g / dose such that lipid having a ratio of 1: 1 of DC-Chol and DPPC is 62.5, 125 or 250 ⁇ g / , DPPC and Pam3-CSKKKK were mixed, Lipo-Pam was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1>.
  • a test vaccine was prepared by adding 5 ⁇ g / dose of recombinant VZV gE antigen to the mixture.
  • the prepared vaccine was intramuscularly injected into female C57BL / 6 mice at 6 weeks of age (Orient Bio, Korea) at 2-week intervals.
  • Example ⁇ 10-1 > To evaluate the humoral immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 10-1 >, the mice were immunized at 0, 2, and 4 weeks after the first vaccination and 2 weeks after the second vaccination, And a sample was prepared. Using the prepared sample, the whole IgG antibody to the recombinant gE antigen of VZV was analyzed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • the total antibody titer according to the type of lipid was highest in the G2 group using Lipo-pam prepared by using the lipids of DC-Chol and DOPE, : C) High antibody formation was also induced in G9 group using QS21 instead (Fig. 20).
  • Example ⁇ 10-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 10-1 >, the spleen was removed from the mouse at the 4th week after the second vaccination, 2-3>, ELISPOT assay and cytokine ELISA were performed to analyze the cellular immune response.
  • IFN-y ELISPOT results showed that IFN-y was produced in the test group using DC-Chol and DPPC as lipids as compared with the G2 group using DC-Chol and DOPE as lipids, Lipo-pam, which was prepared by using DC-Chol and DPPC as lipid, and IFN- ⁇ , which was obtained by mixing QS21 as an immunoreactive substance, were produced in the G9 group.
  • IL-4 ELISPOT results showed that more IL-4 was produced in the test group using DC-Chol and DPPC as lipids compared to the G2 group using DC-Chol and DOPE as lipids, and 40 ⁇ g
  • the G6 group which was mixed with poly (I: C) / dose 5 ⁇ g / dose of recombinant VZV gE antigen
  • cytokine ELISA analysis showed that more IFN-?, IL-4 and? -GHP in the G3 to G8 group using DC-Chol: DPPC than in the G2 group using DC-Chol: Secretion of TNF- ⁇ was induced.
  • G6 group with 40 ⁇ g / dose poly (I: C) and 5 ⁇ g / dose recombinant VZV gE antigen, 5 ⁇ g / dose QS21 and 5 ⁇ g / dose recombinant VZV gE The secretion of IFN- ⁇ and TNF- ⁇ in the G9 group mixed with the antigen was higher in the G9 group and the secretion of IL-4 was induced to a similar level (FIG. 21b).
  • the immunogenicity of the vaccine according to the type of lipopeptide contained in the recombinant vaccine prepared using recombinant gE antigen of VZV was compared.
  • Lipo-Pam was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1> except that lipopeptide was mixed, and the size and zeta potential of Lipo-Pam were measured using a particle size analyzer (Malvern, Nono-ZS) Respectively.
  • a test vaccine was prepared by mixing Lipo-Pam and poly (I: C) at a concentration of 40 ⁇ g / dose, and then adding 5 ⁇ g / dose of recombinant gE antigen of VZV to the mixture.
  • Nono-ZS was used to measure the size and zeta potential of the test vaccine composition.
  • the size and zeta potential of the recombinant vaccine according to the type of lipopeptide The lipopeptides used in vaccine manufacture Size (nm) Particle distribution (PDI) Zeta potential (mV) Pam3-CSKKKK + poly (I: C) + antigen 211.9 0.191 -53.7 Dhc-SKKKK + poly (I: C) + antigen 128.0 0.163 -38.8 PamDhc-SKKKK + poly (I: C) + antigen 180.5 0.156 -28.5 Pam-CSKKKK + poly (I: C) + antigen 207.8 0.182 -30.2 Pam2Cys-SKKKK + poly (I: C) + antigen 138.6 0.180 -34.5 PHC-SKKKK + poly (I: C) + antigen 122.2 0.178 -35.0 FSL-1 + poly (I: C) + antigen 276.0 0.273 -35.2
  • Lipo-Pam produced a recombinant vaccine properly without sediment, which was 90-130 nm in size (Table 9).
  • vaccine compositions containing lipopeptides, poly (I: C) and antigens formed recombinant vaccines at sizes of 120-300 nm (Table 10).
  • the vaccine prepared above was intramuscularly injected twice at 6-week-old C57BL / 6 female mice (Orient Bio, Korea) at intervals of 2 weeks as shown in Table 11 below.
  • mice were immunized at week 0, 2 weeks after the first immunization, 2 weeks after the second vaccination, Of the serum was separated to prepare a sample. Using the prepared sample, the whole IgG antibody to the recombinant gE antigen of VZV was analyzed in the same manner as in Example ⁇ 2-2>.
  • Example ⁇ 11-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 11-1 >, splenic cells were isolated from the mice at 4 weeks after the second vaccination, 2-3>, ELISPOT assay and cytokine ELISA were performed to analyze the cellular immune response.
  • IFN-? ELISPOT resulted in the generation of antibodies in all the test groups.
  • antibodies to G3, G4, and G4 using Pam3-CSKKKK, Dhc- SKKKK, Pam-CSKKKK, or PHC- SKKKK as lipopeptides IFN- ⁇ was well produced in the G6 and G8 groups.
  • IL-4 ELISPOT produced IL-4 well in G3, G4, G7 and G8 groups using Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK or PHC-SKKKK as lipopeptides (Fig. 23A).
  • cytokine ELISA analysis revealed that the secretion of IFN-y, IL-4 and TNF- alpha was induced more in the G3 and G4 groups using Pam3-CSKKKK or Dhc-SKKKK as the lipopeptide .
  • Example 11 it can be seen that, in the production of Lipo-pam, the humoral and cellular immune responses are induced even when any kind of lipopeptide is used, whereby the Lipo-pam according to the present invention, Peptide combinations of the present invention.
  • the efficacy of the vaccine can be improved by using Pam3-CSKKKK, which induces both humoral and cellular immune responses, as a lipopeptide.
  • Example 12 L- pampo or Lipo - with pam Of the formulated recombinant vaccine Japanese encephalitis Comparison of immunogenicity of virus against gE antigen
  • DC-Chol, DOPE and Pam3-CSKKKK were dissolved, and DC-Chol and DOPE were added to a concentration of 125 ⁇ g / dose in a ratio of 3: 7 such that the concentration of Pam3-CSKKKK was 25 ⁇ g / Lipo-Pam was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1>, except that DOPE and Pam3-CSKKKK were mixed.
  • L-pampo was also prepared by mixing 25 ⁇ g / dose of Pam3-CSKKKK, 20 ⁇ g / dose of poly (I: C), and 0.1 or 0.5 ⁇ g / dose of recombinant JEV gE antigen.
  • the recombinant JEV gE antigen was expressed in a baculovirus-insect cell system and purified. Thereafter, Lipo-Pam and poly (I: C) at a concentration of 40 / / dose were mixed as shown in Table 12, and then 0.1 or 0.5 / / dose of recombinant JEV gE antigen was added to the mixture to prepare a test vaccine Respectively.
  • the prepared vaccine was intramuscularly injected twice at 6-week-old BALB / c mouse female (Orient Bio, Korea) at intervals of 2 weeks.
  • mice were immunized at the 0th week after immunization, at the 2nd week after the first vaccination and at the second week after the second vaccination, Of the serum was separated to prepare a sample.
  • the whole IgG antibody to the JEV gE antigen using the prepared sample was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-2 > except that the recombinant JEV gE antigen or the inactivated JEV antigen was coated on a 96-well microplate at a concentration of 100 ng / Were analyzed in the same manner.
  • the total IgG antibody against the recombinant JEV gE antigen (FIG. 24A) and the total IgG antibody against the inactivated JEV antigen (FIG. 24B) contained 0.5 ⁇ g / dose of antigen And the highest in the Lipo-pam formulation (G7 group) used.
  • Isotype analysis of antibodies against recombinant JEV gE antigens showed that IgG1 antibody titers were highest in the G5 group using L-pampo when 0.5 ⁇ g / dose of antigen was used, and IgG2a and IgG2b antibody titers And the highest in the G7 group using Lipo-pam.
  • Example ⁇ 12-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 12-1 >, splenic cells were isolated from the mice at 4 weeks after the second vaccination, and then splenic cells were isolated and then the recombinant JEV gE ELISPOT assay and cytokine ELISA were performed in the same manner as in Example ⁇ 2-3 > except that the antigen or the inactivated JEV antigen was used to analyze the cellular immune response.
  • IFN-y and IL-4 ELISPOT resulted in the highest production of IFN-y and IL-4 in the Lipo-pam formulations G6 and G7 (Fig. 25A).
  • cytokine ELISA analysis showed that both IFN-y, IL-4 and TNF-a were in the Lipo-pam formulations (G6 and G7), L-pampo formulations (G4 and G5) Secretion was induced in the order of inactivated vaccine (G2, G3 group) (Fig. 25B).
  • Lipo-pam as an immunity enhancer in the preparation of a recombinant Japanese encephalitis vaccine helps to improve the efficacy of vaccine by inducing humoral and cellular immune responses well , Indicating that Lipo-pam has immune-enhancing activity against various antigens.
  • Example 13 Alum ( alum ), L- pampo or Lipo - with pam Immunogenicity of seasonal inactivated influenza virus antigens in formulated vaccines
  • lipids with a ratio of 3: 7 of DC-Chol and DOPE or lipids with a ratio of DC: Chol and DPPC of 1: Lipo-pam was prepared in the same manner as in Example ⁇ 2-1> except that DC-Chol, DOPE, DPPC and Pam3-CSKKKK were mixed so that the concentration of Pam3-CSKKKK was 25 ⁇ g / dose.
  • L-pampo contained 0.5 ⁇ g / strain / dose of seasonal inactivated influenza virus antigen at 25 ⁇ g / dose of Pam3-CSKKKK, 20 ⁇ g / dose of poly (I: C), and 4 strains .
  • the seasonal inactivated influenza virus antigens of the four strains were identified as A / California / 07/2009 (H1N1), A / Hong Kong / 4801/2014 (H3N2), B / nostri / 3073/2013 (BY) or B / Brisbane / These antigens were amplified in eggs, purified and used after production. Thereafter, Lipo-pam and poly (I: C) at a concentration of 40 / / dose were mixed as shown in Table 13 below, and 0.5 ⁇ g / strain / dose of seasonal inactivated influenza virus antigen was further added to the mixture, .
  • the prepared vaccine was intramuscularly injected twice at 6-week-old BALB / c mouse female (Orient Bio, Korea) at intervals of 2 weeks.
  • mice were immunized at the 0th week after immunization, at the 2nd week after the first vaccination and at the second week after the second vaccination, Of the serum was separated to prepare a sample. Using the prepared samples, the total IgG antibody to the seasonal inactivated influenza virus antigens was sequenced except for the seasonal inactivated influenza virus antigens of four strains were coated at a concentration of 25 ng / well in a 96-well microplate, respectively.
  • the total IgG antibody titer against the seasonal inactivated influenza virus antigen was the highest in the L-pampo formulations (G4 group) in all four strains, but the Lipo-pam formulations G5 and G6 (G6 group) in which 1: 1 ratio of DC-Chol and DPPC was included, showed high IgG antibody titer.
  • the total IgG antibody titer of the test group (G3 group) using alum alone (G2 group) and alum as an immunity enhancer was significantly lower than that of Lipo-pam (Fig. 26).
  • Example ⁇ 13-1 > In order to analyze the cellular immune response of the test vaccine administered in Example ⁇ 13-1 >, the spleen was removed from the mouse at the 4th week after the 2nd vaccination, ELISPOT assays and cytokine ELISA were performed in the same manner as in Example ⁇ 2-3 > except that the seasonal inactivated influenza virus antigens were used.
  • IFN-gamma ELISPOT resulted in the highest production of IFN-y for seasonal inactivated influenza virus antigens of four strains in the Lipo-pam formulations G5 and G6 ).
  • IL-4 ELISPOT revealed that IL-4 was also secreted in G5 and G6 groups, which are lower than the formulations (G2 and G3) in which the antigen alone or alum was added, but Lipo-pam formulations (Fig. 28) .
  • cytokine ELISA analysis showed that IFN-? And TNF-? Were produced in the Lipo-pam formulations G5 and G6 (FIGS. 29 and 30) Was lower than that of the added formulations (G2 and G3) but secreted IL-4 (Fig. 31).
  • Lipo-pam as an adjuvant in the preparation of a seasonal inactivated influenza vaccine can improve vaccine efficacy by inducing both humoral and cellular immune responses
  • Lipo-pam a vaccine adjuvant according to the present invention, can be used together with various kinds of antigens without being limited to the kinds of antigens.

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Abstract

본 발명은 리포좀 및 리포펩티드를 포함하는 재조합 대상포진 백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 리포좀 및 다양한 종류의 리포펩티드를 포함하는 복합 아쥬반트인 Lipo-Pam과 바리셀라-조스터 바이러스 gE 항원 또는 일본뇌염 바이러스 gE 항원 또는 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 이용하여 제조한 백신 조성물이 체액성 면역반응 뿐만 아니라 세포성 면역반응도 높게 유도함으로써, 본 발명의 조성물은 상업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트 및 이의 용도
본 발명은 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트 및 이의 용도에 관한 것이다.
수두 또는 대상포진(Herpes Zoster)은 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus: VZV)에 의해 유발되며, 단일 척수 혹은 뇌신경의 감각신경에 분포하는 피부에 발생하는 질환이다. VZV의 감염초기에는 바이러스가 피부의 표피와 진피 부위에서 증식한 후 주변 신경세포 속으로 침투하여 잠복상태로 존재한다. 이러한 잠복기 이전에 증식하는 과정에서 수두가 발생 및 발진하게 되며, 이후 신경절 안에 잠복해 있다가 신체 저항력이 떨어지게 되면, VZV가 재활성화되면서 대상포진 형태로 나타나게 된다. VZV의 재활성화 및 대상포진의 발병은 T 세포를 중심으로 하는 세포면역 반응의 약화와 관련이 있으며, 특히 고령자나 면역억제 치료를 받는 사람에서 호발한다. 대상포진이 발병하면 수포성 병변이 나타나고, 병변이 회복되더라도 신경통의 후유증이 남는데 신경통은 일단 발생하면 완치가 어렵고 극심한 통증으로 인해 삶의 질을 떨어지게 한다.
VZV에 전염되고 초기 대응에 소홀하여 이의 잠복기를 방치하게 되면, 결국 VZV의 재활성화로 인해 대상포진이 발생하며 심한 고통을 수반한다. 이러한 경우 일반적으로, 항바이러스제를 투여하지만 이는 잠복기 동안 이미 몸 안에서 내성이 생겼을 가능성이 큰 VZV의 사멸이나 활성의 저해를 이끌어내기 어렵다는 문제점이 있다.
VZV에 대한 항바이러스제로 알려진 제제로는 아시클로버, 발아시클로버, 팜시클로버 등이 있으며, 이중 아시클로버가 가장 상용화되어 있다. 하지만, 아시클로버는 수두가 발진한 후 24시간 이내에 투여하는 경우에만 유의적인 효과를 볼 수 있다. 즉, 아시클로버는 바이러스 감염 또는 수두 발진 후 24시간 이후, 또는 VZV의 재활성화에 따른 대상포진 발생 후에 처방하는 경우에는 항바이러스제로서 충분한 효과를 보기 어렵다.
고령자 및 면역억제 환자가 증가하면서 국내에서 대상포진의 발병율은 급속도로 증가하고 있으나 근원적인 치료법이 없기 때문에 이를 예방할 수 있는 백신을 개발하는 것이 필요하다.
현재 시판되고 있는 대상포진 예방백신은 임상시험에서 그 효능을 인정받기는 하였으나 예방백신 투여에 의한 대상포진 발생율은 50% 정도만이 감소함으로써 효능이 미미하다. 또한, 현재 시판되고 있는 대상포진 예방백신은 약독화된 생백신이기 때문에 대상포진의 발병율이 높은 면역억제 환자, 임산부 및 임신 가능성이 있는 사람에게 투여하는데 제한이 있다. 또한, 대상포진은 신경절 안에 잠복해 있다가 신체 저항력이 떨어지면 VZV가 재활성화되면서 발병하므로, 이를 치료하기 위해서는 체액성 면역반응보다 세포성 면역반응을 유도하는 것이 더욱 중요하다. 따라서, 효과적이고 안전하면서 세포성 면역반응을 유도할 수 있는 대상포진 백신의 개발이 필요하다.
항원의 분자패턴은 면역반응의 결과에 영향을 준다. 이는 특히 병원성 미생물 전체가 항원으로 사용되는 경우에 중요한데 이러한 항원은 리포폴리사카라이드, 핵산, 지질단백질 또는 단백질과 같은 여러 종류의 PAMP(pathogen associated molecular pattern) 리간드가 섞여있다. 항원제시 세포(antigen presenting cell) 표면에 있는 PRR(pathogen recognition receptor)은 PAMP를 인지하여 다양한 공동자극 분자와 사이토카인을 유도하기 위한 신호를 촉진시켜 유도되는 면역반응의 종류에 관여한다. 예를 들면, 인터페론 감마와 IL-12는 바이러스 감염에 대한 면역반응에 중요한 Th1 세포 반응을 유도한다. Th1 타입의 면역반응은 더 많은 IgG2a 또는 IgG2b 생성과 강력한 세포성 면역반응을 유도한다.
이와 관련하여, 대한민국 특허등록 제10-1723605호에는 VZV의 단백질을 코딩하는 VZV 유래 유전자의 삽입 부위를 포함하는 플라스미드를 함유하는 대상포진 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제10-2014-0022799호에는 한국인 환자로부터 분리된 VZV MVA06의 게놈 DNA 및 이의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 단백질을 유효성분으로 하는 수두 및 대상포진 바이러스 백신 조성물이 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 안전하면서도 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 높게 유도하는 대상포진 백신을 개발하기 위해 연구하던 중, Pam3-CSKKKK(Pam3CSK4) 리포펩티드와 지질을 포함하는 리포좀 형태의 복합 아쥬반트인 Lipo-pam을 제조한 후, 상기 제조된 아쥬반트에 폴리(I:C)와 항원을 포함하는 백신 조성물이 분자량이 작은 재조합 단백질 항원에 대한 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응 또한 높게 유도하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 백신 조성물이 Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, PamDhc-SKKKK 등을 포함하는 다양한 리포펩티드를 사용하여 제조하거나, 바리셀라-조스터 바이러스의 gE(glycoprotein E) 항원뿐만 아니라 일본뇌염 바이러스의 gE(glycoprotein E) 항원 또는 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 이용하였을 때에도 유의적인 효과를 보임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 아쥬반트를 포함하는 백신 조성물은 리포펩티드 및 항원의 종류에 제한없이 상업적으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트, 이를 포함하는 백신조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 예방 또는 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스의 감염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스의 감염 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 지질 및 리포펩티드를 포함하는 복합 아쥬반트인 Lipo-Pam을 포함하는 백신 조성물은 체액성 면역반응 뿐만 아니라 세포성 면역반응 또한 높게 유도할 수 있으며, 바리셀라-조스터 바이러스의 gE 항원뿐만 아니라 일본뇌염 바이러스의 gE 항원 또는 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 이용하였을 때에도 유의적인 효과를 보임으로써, 본 발명의 조성물은 상업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 VZV의 gE 유전자가 pPGXII 벡터에 도입된 pPGXII-VZV gE 플라스미드의 제작 모식도이다.
도 2a는 VZV의 재조합 gE 항원의 정제 단계별로 SDS-PAGE를 분석한 도이다. M은 사이즈를 확인하기 위한 마커를, 1은 세포 배양액, 2는 부틸-세파로스 크로마토그래피 용출액, 3은 DEAE-세파로스 크로마토그래피 용출액, 4는 CHT 크로마토그래피 용출액, 5는 SP-세파로스 크로마토그래피 용출액 및 6은 농축-탈염 여과 후를 의미한다.
도 2b는 최종 정제된 VZV의 재조합 gE 항원의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다. 6은 농축-탈염 여과 후를 의미한다.
도 3a는 리포좀의 제조방법 및 리포좀에 포함되는 성분의 비율에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 3b는 리포좀의 제조방법 및 리포좀에 포함되는 성분의 비율에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 항체의 이소타입을 비교한 그래프이다.
도 4a는 리포좀의 제조방법 및 리포좀에 포함되는 성분의 비율에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 4b는 리포좀의 제조방법 및 리포좀에 포함되는 성분의 비율에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 5는 Lipo-pam을 이용하여 제조된 백신의 구조를 공초점 현미경을 이용해 확인한 도이다.
도 6은 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 Pam3-CSKKKK의 조성과 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 7a는 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 Pam3-CSKKKK의 조성과 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 7b는 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 Pam3-CSKKKK의 조성과 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 8은 Lipo-pam에 포함되는 지질의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 9a는 Lipo-pam에 포함되는 지질의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 9b는 Lipo-pam에 포함되는 지질의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 10은 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 11a는 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 11b는 Lipo-pam에 포함되는 지질 및 폴리(I:C)의 용량을 달리하여 제조된 아쥬반트 및 서로 다른 용량의 VZV의 재조합 gE 항원을 포함하는 백신 조성물에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 12는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 13a는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 13b는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 14는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포의 빈도를 비교한 그래프이다.
도 15는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 CD4+ T 세포의 다작용성을 비교한 그래프이다.
도 16은 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 조성 및 제형에 따른 재조합 백신의 재조합 VZV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 17a는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 조성 및 제형에 따른 재조합 백신의 재조합 VZV gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 17b는 약독화된 대상포진 백신과 아쥬반트 조성 및 제형에 따른 재조합 백신의 재조합 VZV gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 18은 Lipo-pam의 조성 및 제조방법에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 19a는 Lipo-pam의 조성 및 제조방법에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 19b는 Lipo-pam의 조성 및 제조방법에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 20은 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 21a는 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
[규칙 제91조에 의한 정정 24.08.2018]　
도 21b는 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 재조합 백신의 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 22는 Lipo-pam을 구성하는 리포펩티드의 종류에 따른 재조합 백신의 VZV 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 23a는 Lipo-pam을 구성하는 리포펩티드의 종류에 따른 재조합 백신의 VZV 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 23b는 Lipo-pam을 구성하는 리포펩티드의 종류에 따른 재조합 백신의 VZV 재조합 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 24a는 재조합 JEV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 24b는 재조합 JEV gE 항원에 대한 불활성화된 JEV 항원에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 25a는 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 일본뇌염 바이러스의 gE 항원에 대한 IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 25b는 아쥬반트 제형에 따른 재조합 백신의 일본뇌염 바이러스의 gE 항원에 대한 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과를 비교한 그래프이다.
도 26은 아쥬반트 제형에 따른 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 전체 IgG 항체가를 비교한 그래프이다.
도 27은 아쥬반트 제형에 따른 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 IFN-γ의 ELISPOT 분석 결과이다.
도 28은 아쥬반트 제형에 따른 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 IL-4의 ELISPOT 분석 결과이다.
도 29는 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 IFN-γ의 ELISA 분석 결과이다.
도 30은 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 TNF-α의 ELISA 분석 결과이다.
도 31은 계절형 불활화 독감 바이러스의 4종류 균주(H1N1, H3N2, B-Y 또는 B-V)에 대한 IL-4의 ELISA 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트를 제공한다.
상기 리포펩티드는 글리세롤 분자에 결합된 지방산과 여러 아미노산으로 구성될 수 있다. 상기 글리세롤 분자 내의 지방산이나 리포펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 하나이거나 그 이상일 수 있다. 이때, 지방산과 아미노산은 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 상기 리포펩티드는 그람 양성이나 그람 음성인 박테리아나 마이코플라즈마로부터 유래한 분자 일부이거나 분자 전체 형태로 된 지질 단백질일 수 있다. 일례로, 상기 리포펩티드는 Pam3Cys-SKKKK, Pam3-CSKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, Pam-CSKKKK, Dhc-SKKKK 및 FSL-1로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 리포펩티드는 20 내지 250, 20 내지 50, 50 내지 250, 150 내지 250, 50 내지 150, 20 내지 2500, 20 내지 500, 50 내지 2500, 150 내지 2500 또는 50 내지 1500 ㎍/dose 농도로 리포좀에 삽입될 수 있다.
상기 리포좀은 지질로 구성된 것일 수 있다. 상기 지질은 양이온, 음이온 또는 중성 지질일 수 있다. 일례로, 상기 지질은 DOTAP(1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DDA(Dimethyldioctadecylammonium), DC-chol(3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol), DOPG(1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 지질은 15 내지 300, 15 내지 150, 15 내지 90, 15 내지 50, 15 내지 40, 20 내지 30, 15 내지 3000, 15 내지 1500, 15 내지 900, 15 내지 500, 15 내지 400 또는 20 내지 300 ㎍/dose 농도로 리포좀에 삽입될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 아쥬반트는 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 면역활성물질은 폴리(I:C), QS21, MPLA(Monophosphoryl Lipid A), CpG 및 플라겔린(Flagellin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 폴리(I:C)는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구에서 타입 1 인터페론의 강력한 유도체로 사용되어왔다. 더욱이 폴리(I:C)는 포유류에서 가장 강력한 항원제시세포인 수지상세포를 안정적이고 성숙하게 형성하는 것으로 알려졌다(Rous, R. et al 2004, International Immunol, 16:767-773). 이러한 기존보고에 따르면 폴리(I:C)는 강력한 IL-12 유도물질이며, IL-12는 면역반응을 Th1이 발달하도록 추진하여 세포성 면역반응과 IgG2a 또는 IgG2b 항체 형성을 유도하는 중요한 면역활성물질이다. 폴리(I:C)는 그 길이가 50 내지 5,000 bp일 수 있다. 상기 폴리(I:C)는 10 내지 150, 10 내지 90, 10 내지 50, 10 내지 30, 30 내지 60, 30 내지 90, 30 내지 150, 30 내지 50, 10 내지 1500, 10 내지 900, 10 내지 500, 10 내지 300, 30 내지 600, 30 내지 900, 30 내지 1500 또는 30 내지 500 ㎍/dose 농도로 아쥬반트에 포함될 수 있다.
상기 QS21은 남아메리카의 Quillaja saponaria Molina 나무 껍질에서 추출한 분자량 1990.14 Da의 트리테르펜 글루코시드(triterpene glucoside)라는 사포닌 물질의 분획이다. QS21은 MPLA나 콜레스테롤과 같은 지질과 함께 사용하면 대식세포나 수지상세포와 같은 항원제시세포에서 Th1 타입의 사이토카인을 분비함으로써 체액성 및 세포성 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 QS21은 1 내지 150, 1 내지 90, 1 내지 50, 1 내지 30, 3 내지 60, 3 내지 90, 3 내지 150, 3 내지 50, 1 내지 1500, 1 내지 900, 1 내지 500, 1 내지 300, 3 내지 600, 3 내지 900, 3 내지 1500 또는 3 내지 500 ㎍/dose 농도로 아쥬반트에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 아쥬반트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 아쥬반트는 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 항원은 숙주의 체내에 들어왔을 때, 숙주의 면역계에 의해 인식되어 면역반응을 일으킬 수 있는 모든 물질을 포함하고, 이는 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일례로, 상기 항원은 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus)의 gE(glycoprotein E) 항원; 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis)의 gE(glycoprotein E) 항원; 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원; 인플루엔자 바이러스(influenza virus)의 헤마글루티닌(haemagglutinin) 항원 및 뉴라미니다제(neuraminidase) 항원; 백일해균(Bordetella pertussis)의 백일해 독소(pertussis toxin) 항원, 선모적혈구 응집소(filamentous haemagglutinin) 항원 및 퍼택틴(pertactin) 항원; 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV)의 항원, 헬리코박터파이로리(Helicobacterpylori)의 A, B, C, Y 및 W-135 그룹의 협막다당체 항원; 파상풍균(Clostridium tetani)의 파상풍 독소(tetanus toxoid) 항원; 디프테리아균(diphtheria)의 디프테리아 독소(diphtheria toxoid) 항원; 폐렴균(pneumococcal)의 폐렴균 타입 3 협막다당체(Streptococcus pnemoniae type 3 capsular polysaccharide) 항원; 결핵균(tuberculosis)의 항원; 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)의 GP-120 및 GP-160 항원; 콜레라(cholera)의 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit) 항원; 포도상구균(staphylococcal)의 포도상구균 엔테로톡신 B(staphylococcal enterotoxin B) 항원; 적리균(shigella)의 격리균 다당체(shigella polysaccharides) 항원; 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus)의 소수포성 입안염 바이러스 당단백질(vesicular stomatitis virus glycoprotein) 항원; 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV)의 항원, 간염바이러스(hepatitis)의 간염바이러스 A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원; 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV)의 항원 또는 허피스 심플렉스(herpes simplex)의 항원일 수 있다.
상기 백신 조성물은 부가적으로 완충제, 등장화제, 보존제, 안정화제 및 용해보조제를 포함할 수 있다. 완충제로는 인산염, 초산염, 인산암모늄, 탄산암모늄, 구연산염 등을 사용할 수 있다.
상기 백신은 항원에 특이적인 체액성 면역반응뿐만 아니라 높은 세포성 면역반응을 유도할 수 있다.
상기 백신은 Th1 면역반응을 증진시킬 수 있다. 항바이러스 및 항암 면역반응에 효과적인 Th1 면역반응을 증진시키는 IgG2a 또는 IgG2b의 항체는 도움 T 세포 1(helper T cell 1; Th1)에 의해 생산되는 사이토카인에 의해 생산된다. 따라서, 본 발명의 백신 조성물은 바이러스 감염이나 암의 예방 또는 치료제로도 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 먼저, 재조합 바리셀라-조스터 바이러스 gE 항원을 제조한 후(도 1 및 2 참조), DC-Chol, DOPE 또는 DPPC 지질과 Pam3-CSKKKK를 혼합하여 Lipo-Pam을 제조하고, 여기에 면역활성물질로 폴리(I:C) 또는 QS21을 첨가하고, 제조한 바리셀라-조스터 바이러스의 재조합 gE 항원을 첨가하여 바리셀라-조스터 바이러스에 대한 재조합 백신을 제조하였다.
또한, 상기 재조합 백신은 Pam3-CSKKKK가 지질과 함께 리포좀을 이루고 있으며, VZV의 재조합 gE 항원은 리포좀의 표면에 결합된 구조를 형성하였다(도 5).
또한, 상기 재조합 백신은 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응도 높게 유도하였다(도 3, 4 및 6 내지 21 참조).
또한, DC-Chol 및 DPPC와 함께 다양한 종류의 리포펩티드를 혼합하여 Lipo-pam을 제조하고, 상기 Lipo-pam에 폴리(I:C) 및 VZV의 재조합 gE 항원을 첨가하여 제조된 재조합 백신은 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 높게 유도하였다(도 22 및 23 참조).
또한, DC-Chol, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하여 제조된 Lipo-Pam에 폴리(I:C) 및 일본뇌염 바이러스의 재조합 gE 항원을 첨가하여 일본뇌염 바이러스에 대한 재조합 백신을 제조하고, 상기 재조합 백신은 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 높게 유도하였다(도 24 및 25 참조).
나아가, DC-Chol, DOPE 또는 DPPC 지질, 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하여 제조된 Lipo-Pam에 폴리(I:C) 및 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 첨가하여 계절형 불활화 독감 바이러스에 대한 재조합 백신을 제조하고, 상기 제조합 백신은 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 높게 유도하였다(도 26 및 31 참조).
따라서, 본 발명의 리포펩티드가 삽입된 Lipo-Pam를 아쥬반트로 포함하는 백신 조성물은 항원의 종류에 제한없이 면역증강 효능이 있으므로 상업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염, 또는 암의 예방 또는 치료제를 제공한다.
상기 백신 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 백신 조성물은 아쥬반트 및 항원을 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 여기에 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코욜, 프로필렌글리콘, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스의 감염, 또는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 백신 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 백신 조성물은 아쥬반트 및 항원을 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 여기에 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다.
상기 투여는 약제학적으로 유효한 양일 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 치료 효과를 나타낼 수 있는 동시에 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 백신에 포함될 항원에 따라 달라질 수 있다. 또한, 상기 투여는 환자의 연령, 체중, 건강, 성별 및 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 투여 방법 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 투여는 1회 내지 수회 투여일 수 있다.
또한, 본 발명은 바이러스의 감염, 또는 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 백신 조성물의 용도를 제공한다.
상기 백신 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 백신 조성물은 아쥬반트 및 항원을 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 리포펩티드가 삽입된 리포좀을 포함할 수 있으며, 여기에 면역활성물질을 추가로 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 바리셀라-조스터 바이러스의 재조합 gE 항원 제조
<1-1> 플라스미드의 제작
먼저, VZV의 gE(glycoprotein E) 유전자 발현부위의 바깥부위에 제한효소 인식서열(5' 부위에 Nhe I, 3' 부위에 Xho I)과 코작(kozak) 서열이 포함되도록 유전자(서열번호 1)를 합성하였다. 이때, 주형으로 인간 허피스바이러스 3형(human herpesvirus type 3, HHV-3) 전체 게놈의 ORF68(glycoprotein E)에서 C-말단의 앵커(anchor) 도메인을 제거한 형태로 CHO 세포에 코돈 최적화된 서열을 이용하였다. 상기 서열번호 1로 기재되는 1.6 kb의 VZV의 gE 유전자를 Nhe I 및 Xho I 제한효소로 절단하고, pPGXII 벡터에 서브클로닝하여 VZV gE 발현 플라스미드인 pPGXII-VZV gE를 제작하였다(도 1).
<1-2> 세포주의 선별
실시예 <1-1>에서 제작한 pPGXII-VZV gE 플라스미드 DNA를 Ahd I 제한효소로 선형화한 후, 전기천공법을 이용하여 pDCH1P(dhfr) 플라스미드 DNA와 함께 HT(Hypoxantine-Thymidine)가 포함된 배지에서 6번 계대배양한 CHO DG44(S)-EX 세포에 형질도입하였다. 이후, 형질전환된 세포를 HT가 포함된 배지에 접종하여 세포들이 충분히 자랐을 때 HT가 포함되지 않은 선택배지에서 배양하고, 약 2주 후에 초기 적응된 세포군들을 확보하였다. 확보된 세포군을 이용하여, 점 블럿(dot blot)과 웨스턴 블럿을 수행하여 초기 적응된 세포군 중에 생산성이 우수한 4종을 선별하였다. 선별된 균주를 한계 희석법으로 희석하고, 1 cell/well이 되도록 96 웰 플레이트에 각각 10 플레이트씩 접종하여 단일 세포주를 분리하였다. 분리된 단일 세포주의 콜로니를 24 웰 플레이트로 옮겨서 배양한 후, 세포수가 충분히 확보되었을 때 에를렌마이어 플라스크로 옮겨서 부유배양을 시작하였다. 6번 계대한 이후 생존력(viability)을 95% 이상 유지하면서 세포가 일정한 속도로 증식할 때 유가배양을 수행하여 생산성과 안정성을 확인하였다. 생산성이 높고 안정성을 80% 이상 유지하는 5종의 후보 세포주 중 세포성장 및 생산성을 고려하여 최종 세포주를 선별하였다.
<1-3> 세포주의 배양
실시예 <1-2>에서 최종 선별된 세포주를 HyCell CHO(GE Healthcare) 배지를 넣은 7.5 ℓ의 자 퍼멘터(jar fermentor)에 EfficientFeed C+(Invitrogen)를 첨가한 후, 6.5 x 106 cells/㎖의 농도로 접종 및 배양하였다. 이때, 퍼멘터는 32℃, DO 30%, 100 rpm의 조건으로 가동하였고, 배지의 pH는 6.8 이상으로 유지하였다. 또한, 매일 퍼멘터 내의 포도당과 젖산의 함량을 분석하여 포도당의 함량이 20 mmol/ℓ 이하로 떨어지면 45% D-포도당을 1 v/v%의 농도로 첨가하면서 10일 동안 배양하였다.
<1-4> 항원의 정제
실시예 <1-3>에서 배양한 세포로부터 심층여과필터(depth-filter)를 이용해 배양액을 회수하고, 이로부터 VZV의 재조합 gE 항원을 정제하였다. 구체적으로, 부틸-세파로스(butyl-sepharose), DEAE-세파로스(DEAE-sepharose), CHT 하이드록시아파타이트(CHT hydroxyapatite) 및 SP-세파로스(SP-sepharose)를 순차적으로 이용한 4단계의 컬럼 크로마토그래피 방법과 버퍼 교환을 위한 1회의 UF/DF 방법을 이용해 VZV의 재조합 gE 항원을 정제하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정제된 VZV의 재조합 gE 항원은 약 70 kDa의 분자량을 나타내었다(도 2).
실시예 2. 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
<2-1> 시험 백신의 제조 및 투여
먼저, DC-Chol:DOPE 리포좀을 제조하기 위해 클로로포름을 이용해 DC-Chol 및 DOPE를 각각 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE를 3:7의 비율로 혼합한 혼합액이 유리 용기의 기벽에 골고루 분포할 수 있도록 돌려가며 질소가스로 유기용매를 기화시켰다. 이때, 기벽에 얇은 필름이 만들어지는데 형성된 막에 잔존하는 유기용매는 진공 데시케이터(decicator)에 1시간 동안 보관하여 제거하였다. 완전히 건조된 지질 필름에 증류수를 첨가한 후, 초음파 수조(sonic bath)를 이용해 10분간 충분히 재수화시켰다. 다층판의 소포(multilamella vesicle, MLV) 현탁 용액이 생성되면 20 mM의 인산나트륨에 300 mM의 NaCl이 포함된 pH 7.0의 2X 완충용액을 증류수와 동일한 양으로 넣어주었다. 생성된 MLV를 3초/3초(pulse on/off)의 조건으로 5분씩 5사이클 동안 초음파처리를 하여, 작은 다층판의 소포(small unilamellar vesicle, SUV)형태인 DC-Chol:DOPE 리포좀을 제조하였다.
또한, Lipo-Pam은 유기용매를 이용해 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 각각 녹인 후, 3:7의 비율이 되도록 DC-Chol 및 DOPE를 혼합하고 여기에 Pam3-CSKKKK를 25 ㎍/dose 또는 100 ㎍/dose 농도가 되도록 첨가한 것을 제외하고는 상기 DC-Chol:DOPE 리포좀과 동일한 방법으로 제조하였다.
이때, 대조군인 L-pampo는 리포펩티드인 25 ㎍의 Pam3-CSKKKK와 20 ㎍ 또는 200 ㎍의 폴리(I:C)를 섞어서 제조하였다.
이후, 하기 표 1과 같은 조성으로 아쥬반트를 혼합하고, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 VZV gE 항원을 첨가하여 시험 백신을 제조하였다. G2군, G5군 및 G9군의 경우, 상기 혼합물에 초음파를 처리하고, 항원을 첨가하여 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 리포좀(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍)+L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 20 ㎍)+항원 5 ㎍/초음파처리
G3 리포좀(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍)+L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍
G4 리포좀(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G5 Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+항원 5 ㎍/초음파처리
G6 Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G7 Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 200 ㎍+항원 5 ㎍
G8 Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 200 ㎍+항원 5 ㎍
G9 Lipo-Pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 200 ㎍/초음파처리+항원 5 ㎍
<2-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <2-1>에서 투여된 시험 백신에 의해 유도된 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 항원 특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다.
먼저, 재조합 VZV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 하기와 같은 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 정제된 VZV의 재조합 gE 항원을 96웰 마이크로플레이트에 100 ng/well의 농도로 코팅한 뒤, 비특이적 결합을 막기 위하여 1%의 소혈청 알부민(bovine serum albumin)을 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 상기 마이크로플레이트를 세척하고 각 웰에 순차적으로 희석된 혈청을 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체로 항-마우스 IgG-HRP(horse radish heroxidase, KPL, 미국)를 넣고 1시간 동안 동일한 조건에서 반응시켰다. 상기 반응시킨 마이크로플레이트를 세척하고 발색시약 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) 페록시다아제 기질(peroxidase substrate, KPL, 미국)을 첨가하고 10분간 상온에서 반응시킨 다음 정지 용액을 이용해 발색 반응을 멈춘 후, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다. 항체가는 음성대조군 OD 값의 2배에 해당하는 OD 값을 나타내는 항체 희석배수의 역수로 정의하였다.
한편, VZV의 재조합 gE 항원에 대한 항체의 이소타입(isotype)은 1차 항체로서 염소 항-마우스 IgG1, 염소 항-마우스 IgG2a, 염소 항-마우스 IgG2b 또는 염소 항-마우스 IgG2c를 사용하고, 2차 항체로써, 토끼 항-염소 IgG-HRP를 사용한 것을 제외하고는 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 항체가 분석방법과 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 DC-Chol:DOPE 리포좀에 L-pampo(폴리(I:C) 200 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)를 혼합하여 제조된 백신을 투여한 G3군에서 가장 높았으며, Lipo-pam과 폴리(I:C)의 혼합 여부에 따른 체액성 면역반응을 비교해 보면, Lipo-pam 단독으로 항원을 혼합하여 제조된 백신을 투여한 G5군에 비해 Lipo-pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조한 백신을 투여한 G6군에서 전체 IgG가 높았다(도 3a).
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, VZV의 재조합 gE 항원에 대한 항체의 이소타입 분석 결과, 모든 시험군에서 전반적으로 IgG1에 비해 IgG2b 및 IgG2c 타입의 항체가가 높게 나타났으며, 특히, 리포좀에 L-pampo를 혼합한 G3군과 Lipo-pam에 폴리(I:C)를 혼합한 G6군에서 IgG2 타입의 항체가가 높았다(도 3b).
<2-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <2-1>에서 투여된 시험 백신에 의해 유도된 세포성 면역반응은 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포(splenocyte)를 분리한 후, ELISPOT 어세이와 사이토카인 ELISA 방법을 사용하여 분석하였다.
구체적으로, ELISPOT 어세이를 수행하기 위해 먼저, IFN-γ 또는 IL-4에 대한 항체가 부착된 ELISPOT 플레이트를 PBS로 세척한 후, 완전 배지(complete media)를 첨가하여 플레이트를 활성화하였다. 상기 ELISPOT 플레이트에 마우스의 비장세포를 5 × 105 cells/well로 분주한 후, <실시예 1>에서 제조한 재조합 VZV gE 항원을 넣고, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 또는 48시간 동안 반응시켰다. 이후, 비장세포를 제거하고 PBS로 플레이트를 세척한 다음, Mouse IFN-γ ELISpotPLUS 키트(Mabtech, 스웨덴) 및 Mouse IL-4 ELISpotPLUS 키트(Mabtech, 스웨덴)에 있는 비오틴이 결합된 항체를 0.5% FBS가 포함된 PBS로 희석해 플레이트의 웰에 각각 첨가하였다. 이를 상온에서 2시간 동안 반응시킨 뒤, 세척하고 HRP가 결합된 스트렙타비딘을 플레이트의 웰에 각각 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 세척하고 TMB 발색시약을 넣고 뚜렷한 스팟이 나올 때까지 반응시킨 후, 반응이 완료되면 3차 증류수를 넣어 반응을 정지시켰다. 플레이트를 증류수로 여러번 세척하고, 실온에서 건조시킨 후 ELISPOT 리더기를 이용해 스팟을 계산하였다.
한편, 사이토카인 ELISA를 수행하기 위해 먼저, 96 웰 플레이트에 마우스의 비장세포를 1.5 × 106 cells/well로 분주한 후, <실시예 1>에서 제조한 재조합 VZV gE 항원을 넣고, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 48시간 동안 반응시켰다. 배양액을 각각의 시험군별로 튜브로 옮긴 후, 4℃, 3000 rpm 조건에서 5분간 원심분리하여 수득된 상층액을 사이토카인 ELISA를 수행하기 위한 시료로서 사용하였다. Mouse IFN-γ ELISA 키트(BD, 미국), Mouse IL-4 ELISA 키트(BD, 미국) 및 Mouse TNF-α ELISA 키트(BD, 미국)에 포함된 코팅용 항체를 코팅 버퍼에 희석해 96 웰 플레이트에 분주하고, 37℃에서 2시간 동안 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 PBST로 세척한 다음 10% FBS를 넣고, 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 세척한 후, 표준 용액과 상기에서 수득한 비장세포 배양액을 각각 100 ㎕/well씩 분주하고, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척한 후, 비오틴이 결합된 항체와 HRP가 결합된 스트렙타비딘을 혼합한 작동 디텍터(working detector)를 100 ㎕/well씩 분주하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척한 후, TMB 발색시약을 넣고 상온에서 5 내지 10분간 반응시킨 다음 정지 용액을 이용해 발색 반응을 멈추고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT의 분석 결과, 리포좀 및 L-pampo를 혼합하여 제조된 백신인 G2 및 G3 군에 비해 Lipo-Pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조된 백신이 전반적으로 높은 IFN-γ의 생성을 유도하였다. 특히, G6군은 다른 시험군에 비해 현저히 높은 IFN-γ를 생성하였고, G8 및 G9군도 비교적 높게 IFN-γ 를 생성하였다. 또한, G7군과 동일한 제형이지만 항원을 추가하기 전에 초음파처리 과정을 추가한 G9군은 G7군에 비해 현저히 많은 IFN-γ를 생성하였다. IL-4의 ELISPOT 분석 결과 또한 IFN-γ ELISPOT 결과와 유사한 경향을 나타내었으며, G6군에서 높게 IL-4를 생성하였다. 또한, Lipo-pam과 폴리(I:C)의 혼합 여부에 따른 세포성 면역반응을 비교해 보면, Lipo-pam에 폴리(I:C)를 추가하지 않고 항원만을 혼합하여 투여한 G5군에 비해 Lipo-pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조한 백신을 투여한 G6군에서 더 높은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 4a).
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISA 분석 결과, 리포좀 및 L-pampo를 혼합하여 제조된 백신에 비해 Lipo-Pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조된 백신이 전반적으로 많은 양의 IFN-γ의 분비를 유도하였다. 특히, G6 및 G8군에서 가장 많은 IFN-γ의 분비가 유도되었다. IL-4 및 TNF-α의 ELISA 분석 결과 또한 IFN-γ의 ELISA 분석 결과와 유사한 경향을 나타내었으며, G6군에서 많은 양의 IL-4 및 TNF-α의 분비가 유도되었다. 또한, Lipo-pam과 폴리(I:C)의 혼합 여부에 따른 세포성 면역반응을 비교해 보면, Lipo-pam에 폴리(I:C)를 추가하지 않고 항원만을 혼합하여 투여한 G5군에 비해 Lipo-pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조한 백신을 투여한 G6군에서 더 많은 양의 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 유도되었다(도 4b).
따라서, 상술한 바와 같이 대상포진 백신은 체액성 면역반응에 비해 세포성 면역반응을 유도하는 것이 더욱 중요하고, 리포좀에 L-pampo를 혼합한 백신은 혼합물의 파티클 크기를 균일하게 분산시키고 안정화 시켜주기 위해 추가적인 초음파처리, 마이크로플루다이저 또는 익스트루더 등의 과정을 거쳐야 하지만, Lipo-pam 및 폴리(I:C)를 혼합하여 제조한 백신은 추가적인 과정 없이도 보다 안정적으로 장기간 파티클의 크기가 유지되므로, 세포성 면역반응을 보다 잘 유도하고, 제형의 안정성도 우수한 Lipo-Pam을 기반으로 백신 제형을 개발하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 3. Lipo-pam을 이용하여 제조한 재조합 백신의 구조 확인
Lipo-pam을 이용하여 제조한 백신의 구조를 확인하기 위해 먼저, DC-Chol(dimethylethancarbanoyl cholesterol) 및 DOPE(dioleoyl- phosphatidylethanolamine) 지질은 마리나블루(marina blue)로, Pam3-CSKKKK는 6-TAMRA, SE(6-Carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester)로, 재조합 VZV gE 항원은 플루오레세인(fluorescein)으로 각각 염색하였다. DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE를 혼합하고 여기에 25 ㎍/dose 농도로 Pam3-CSKKKK를 첨가한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 상기 Lipo-Pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 항원을 추가하여 시험 백신을 제조하고, 공초점 현미경을 이용해 그 구조를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 리포좀의 지질에 염색된 염료에 의해 발색된 반경과 Pam3CSK에 염색된 염료에 의해 발색된 반경은 거의 동일하였으나,VZV의 재조합 gE 항원에 염색된 염료에 의해 발색된 반경은 이들보다 컸다. 이를 통해, 제조된 백신은 Pam3-CSKKKK 및 지질이 리포좀을 이루고 있으며(Lipo-pam), VZV의 재조합 gE 항원이 리포좀의 표면에 결합되어 있는 구조를 가짐을 알 수 있었다(도 5).
실시예 4. 지질, 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
지질의 비율, Pam3-CSKKKK의 용량, 폴리(I:C)의 용량 및 VZV의 재조합 gE 항원이 리포좀에 결합되는 정도에 따른 재조합 백신의 면역원성을 비교하였다.
<4-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 1:1 또는 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE를 혼합하고 여기에 25 또는 100 ㎍/dose 농도로 Pam3-CSKKKK를 첨가한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 하기 표 2와 같이 Lipo-Pam과 20, 40, 60, 80 또는 160 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 VZV의 재조합 gE 항원을 추가하여 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G3 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G4 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍
G5 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 60 ㎍+항원 5 ㎍
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍
G7 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 200 ㎍)+폴리(I:C) 160 ㎍+항원 5 ㎍
G8 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G9 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G10 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍
G11 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 60 ㎍+항원 5 ㎍
G12 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 100 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍
<4-2> VZV의 재조합 gE 항원과 Lipo-pam의 결합력 확인
크기-배제 크로마토그래피를 이용해 통상적인 방법으로 실시예 <4-1>에서 제조한 Lipo-pam과 <실시예 1>에서 제조한 VZV의 재조합 gE 항원의 결합력을 확인하였다.
그 결과, Pam3-CSKKKK의 함량이 높은 제형(G5 내지 G7, G11, G12군)에서 대부분의 VZV의 재조합 gE 항원이 Lipo-pam과 결합되었다. 또한, Lipo-pam에 gE 항원과 경쟁적으로 결합하는 폴리(I:C)의 용량이 낮은 G2군에서도 대부분의 재조합 VZV gE 항원이 결합되었다.
<4-3> 체액성 면역반응 분석
실시예 <4-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, DC-Chol:DOPE의 비율을 3:7(G2 내지 G7)로 혼합하여 제조된 Lipo-pam이 DC-Chol:DOPE의 비율을 1:1(G8 내지 G12)로 혼합하여 제조한 경우보다 IgG 항체가가 전반적으로 높은 경향을 보였다. 또한, 리포펩티드인 Pam3-CSKKKK와 폴리(I:C)의 용량에 비례하여 전체 IgG 항체가가 높게 유도되었다(도 6). 또한, VZV의 재조합 gE 항원의 대부분이 Lipo-pam에 결합된 것으로 확인된 G2, G5, G6, G7군 중에서 특히 G2, G6 및 G7군에서 전체 IgG 항체가가 높았다.
한편, Pam3-CSKKKK와 폴리(I:C)의 용량을 각각 25 ㎍과 20 ㎍/dose로 사용한 G2군과 100 ㎍과 80 ㎍/dose로 사용한 G6군의 전체 IgG 항체가가 비슷한 것으로 확인됨으로써, Lipo-pam을 구성하는 지질이나 백신에 사용된 VZV의 재조합 gE 항원의 용량에 따라 Pam3-CSKKKK와 폴리(I:C)의 적정 용량이 결정됨을 알 수 있었다.
<4-4> 세포성 면역반응 분석
실시예 <4-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, DC-Chol:DOPE을 3:7의 비율로 하여 제조된 백신은 DC-Chol:DOPE을 1:1의 비율로 하여 제조된 백신에 비해 더 많은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다. 또한, Pam3-CSKKKK를 25 ㎍/dose로 사용하였을 때에는 DC-Chol:DOPE을 3:7로, 폴리(I:C)를 40 ㎍/dose로 사용하였을 때 가장 많이 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였고, Pam3-CSKKKK를 100 ㎍/dose 또는 200 ㎍/dose로 사용하였을 때에는 폴리(I:C)의 농도가 높을수록 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였으나, Pam3-CSKKKK를 25 ㎍/dose로 사용한 시험군에 비해 현저히 낮은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 7a).
또한, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, DC-Chol:DOPE을 3:7의 비율로 하여 제조된 백신은 DC-Chol:DOPE을 1:1의 비율로 하여 제조된 백신에 비해 더 많은 IFN-γ 및 IL-4의 분비가 유도된 반면, TNF-α는 두가지 비율에서 유사하게 나타났다. 또한, ELISPOT 결과와 유사하게 Pam3-CSKKKK를 25 ㎍/dose로 사용한 백신은 100 또는 200 ㎍/dose로 사용한 백신에 비해 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 더 많이 유도되었다. 특히, DC-Chol:DOPE을 3:7의 비율로 하여 제조된 백신 중에서는 폴리(I:C)를 40 ㎍/dose로 사용한 G3군에서, DC-Chol:DOPE을 1:1의 비율로 하여 제조된 백신 중에서는 폴리(I:C)를 20 ㎍/dose로 사용한 G8군에서 세가지 사이토카인의 분비가 가장 많이 유도되었다(도 7b).
실시예 5. 지질 및 VZV의 재조합 gE 항원의 용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
3:7의 비율로 혼합된 DC-Chol:DOPE, 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 20 ㎍/dose의 폴리(I:C)를 사용하고, 이때 첨가되는 지질 및 VZV의 재조합 gE 항원의 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<5-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE가 혼합된 지질을 31.25, 62.5 또는 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 하기 표 3과 같이 Lipo-Pam과 20 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 2, 5 또는 10 ㎍/dose의 VZV의 재조합 gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 31.25 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍
G3 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 31.25 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G4 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 31.25 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 10 ㎍
G5 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G7 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 10 ㎍
G8 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍
G9 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G10 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 10 ㎍
G11 Lipo-pam(DC-Chol:DOPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
<5-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <5-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 항원의 용량 증가에 따라 지질의 용량도 함께 증가하는 것이 항체의 유도에 도움이 됨을 알 수 있었다. 또한, DC-Chol과 DOPC를 사용하여 제조된 G11군은 다른 시험군에 비해 전체 IgG 항체가가 낮았다(도 8).
<5-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <5-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4의 ELISPOT 분석 결과, 2 ㎍/dose 농도의 VZV의 재조합 gE 항원 및 125 ㎍/dose 농도의 DC-Chol:DOPE 지질을 사용하여 제조된 G8군에서 가장 많은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 9a).
또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, ELISPOT 결과와 유사하게 2 ㎍/dose 농도의 VZV의 재조합 gE 항원 및 125 ㎍/dose 농도의 DC-Chol:DOPE 지질을 사용하여 제조된 G8군에서 세가지 사이토카인의 분비가 가장 많이 유도된 반면, DC-Chol과 DOPC를 사용하여 제조된 G11군은 다른 시험군에 비해 사이토카인의 분비가 가장 적게 유도되었다(도 9b).
실시예 6. 지질, 폴리 ( I:C ) 및 VZV의 재조합 gE 항원의 용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
3:7의 비율로 혼합된 DC-Chol:DOPE, 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK를 사용하고, 이때 첨가되는 지질, 폴리(I:C) 및 VZV의 재조합 gE 항원의 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<6-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE가 혼합된 지질을 62.5, 125 또는 250 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 하기 표 4와 같이 Lipo-Pam과 20, 40, 80 또는 100 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 2, 5 또는 10 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍
G3 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G4 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 2 ㎍
G5 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍
G7 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G8 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 2 ㎍
G9 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍
G10 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 10 ㎍
G11 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 100 ㎍+항원 5 ㎍
<6-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <6-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가 및 항체의 이소타입은 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, Lipo-pam 제조시, 지질을 62.5 ㎍/dose, Poly(I:C)를 20 ㎍/dose로 사용하였을 때, 재조합 VZV gE 항원을 2 ㎍/dose 또는 5 ㎍/dose로 사용한 G2와 G3군에서 전체 IgG 항체가는 비슷하였다. 또한, Lipo-pam 제조시, 지질을 250 ㎍/dose, Poly(I:C)를 80 ㎍/dose로 사용하였을 때, 재조합 VZV gE 항원을 2, 5 또는 10 ㎍/dose로 사용한 G8, G9 및 G10군에서 전체 IgG 항체가는 비슷하였다(도 10). 또한, 이소타입 분석에서 IgG2b/IgG1의 비율은 G8, G9, G2, G6군에서, IgG2c/IgG1의 비율은 G8, G6, G9군에서 다른 시험군에 비해 높은 경향을 나타내었다.
<6-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <6-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 분석 결과, Lipo-pam 제조시, 지질을 125 ㎍/dose, Poly(I:C)를 40 ㎍/dose, VZV의 재조합 gE 항원을 2 ㎍/dose로 사용한 G6군에서 가장 많은 IFN-γ 및 IL-4을 생성하였다(도 11a).
또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, Lipo-pam 제조시, 지질을 125 ㎍/dose, Poly(I:C)를 40 ㎍/dose, VZV의 재조합 gE 항원을 2 ㎍/dose로 사용한 G6군에서 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 가장 많이 유도되었다(도 11b).
실시예 7. 약독화된 대상포진 백신과 재조합 백신의 항원 용량에 따른 면역원성 비교
상용화되고 있는 백신으로서, 약독화된 생백신인 조스타박스(Zostavax)와 재조합 VZV gE 항원을 이용해 제조한 재조합 백신에 포함되는 항원 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<7-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, 3:7의 비율로 DC-Chol 및 DOPE를 혼합한 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 또한, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 200 ㎍/dose의 폴리(I:C) 및 5 ㎍/dose의 항원을 혼합하여 제조하고, 대조군으로 사용하였다. 이후, 하기 표 5에 기재된 바와 같은 조성을 갖는 시험 백신을 제조하였다. 제조된 백신 또는 조스타박스를 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 조스타박스(약독수두생바이러스 1940 PFU, 사람에 투여하는 양의 1/10)
G3 수산화알루미늄 100 ㎍+항원 5 ㎍
G4 L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍
G5 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
<7-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <7-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가 및 항체의 이소타입은 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 조스타박스를 투여한 G2군 및 수산화알루미늄을 사용한 G3군은 L-pampo 또는 Lipo-Pam을 사용한 G4, G5 및 G6군 보다 전체 IgG 항체가가 낮게 나타났다(도 12). 또한, 이소타입 분석에서 수산화알루미늄을 사용한 G3군은 대부분 IgG1 타입의 항체가 형성되었으며, IgG2b/IgG1와 IgG2c/IgG1의 비율은 Lipo-pam을 사용한 G5 및 G6군이 L-pampo를 사용한 G4군에 비해 높게 나타났다.
<7-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <7-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리하였다. 상기 비장세포를 이용하여 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하였고, 유세포분석기를 이용해 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2에 대한 세포내 사이토카인 착색(intracellular cytokine staining, ICS) 분석을 수행하여, 각 제형별로 재조합 VZV gE 항원에 특이적인 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포의 정도를 비교함으로써, 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 13a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 분석 결과, 조스타박스를 투여한 G2군은 현저히 낮은 IFN-γ 및 IL-4를 생성한 반면, Lipo-pam을 사용한 G5 및 G6군은 가장 많은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 13a).
또한, 도 13b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, 조스타박스를 투여한 G2군은 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 가장 적게 유도된 반면, Lipo-pam을 사용한 G5 및 G6군은 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 가장 많이 유도되었다(도 13b).
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 각 시험군에서 분비되는 사이토카인의 경향을 보면, Lipo-pam을 사용한 G5 및 G6군에서 각각의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포의 빈도(frequency)가 높게 나타났다(도 14).
또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, 각 시험군마다 한종류 이상의 사이토카인을 분비하는 세포의 수를 100%라고 가정했을 때 나타나는 gE 항원 특이적인 CD4+ T 세포의 다작용성(polyfunctionality)을 비교한 결과, 하나 이상의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포 중 3가지 사이토카인을 모두 분비하는 T 세포가 높은 시험군은 Lipo-pam를 사용한 G5 및 G6군이었다. 반면, 조스타박스를 투여한 G2군과 수산화알루미늄을 사용한 G3군은 1가지 사이토카인만을 분비하는 CD4+ T 세포의 비율이 높게나타나, 다작용성이 낮음을 확인하였다(도 15).
실시예 8. 약독화된 대상포진 백신과 재조합 백신의 지질 비율 및 폴리(I:C)의 용량에 따른 면역원성 비교
상용화되고 있는 백신으로서, 약독화된 생백신인 조스타박스와 VZV의 재조합 gE 항원을 이용해 제조한 재조합 백신에 포함되는 지질의 비율 및 폴리(I:C)의 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<8-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하거나 DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 또한, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 200 ㎍/dose의 폴리(I:C) 및 5 ㎍/dose의 VZV의 재조합 gE 항원을 혼합하여 제조하였다. 또한, DC-Chol:DOPE 리포좀은 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 제조하였다. 이후, 하기 표 6과 같이 Lipo-Pam과 20, 40 또는 80 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 추가로 넣거나(G6 내지 G9군), Lipo-Pam에 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 동시에 혼합하거나(G10 및 G11군), L-pampo와 DC-Chol:DOPE 리포좀을 혼합하거나(G5군), 100 ㎍/dose 농도의 수산화알루미늄에 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합(G2군)하여 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신 또는 조스타박스를 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 수산화알루미늄 100 ㎍+항원 5 ㎍
G3 조스타박스(약독수두생바이러스 1940 PFU, 사람에 투여하는 양의 1/10)
G4 L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍
G5 리포좀(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍)+L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍/초음파처리
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G7 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G8 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 20 ㎍+항원 5 ㎍
G9 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 80 ㎍+항원 5 ㎍
G10 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍]
G11 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍]
<8-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <8-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 항원 특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다. VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 조스타박스를 투여한 G3군 및 수산화알루미늄을 사용한 G2군은 L-pampo 또는 Lipo-Pam을 사용한 G4 내지 G11군 보다 전체 IgG 항체가가 낮게 나타났다(도 16).
<8-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <8-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 17a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 결과, 조스타박스를 투여한 G3군은 IFN-γ 및 IL-4를 매우 적게 생성한 반면, DC-Chol:DPPC(1:1)를 사용하여 제조된 Lipo-pam과 40 ㎍/dose의 폴리(I:C)를 사용한 G7 및 Lipo-Pam에 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 동시에 혼합한 G11군에서는 많은 IFN-γ 및 IL-4를 생성하였다(도 17a).
또한, 도 17b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, DC-Chol:DPPC(1:1)를 사용하여 제조된 Lipo-pam과 40 ㎍/dose의 폴리(I:C)를 사용한 G7군 및 DC-Chol:DOPE 리포좀과 L-pampo를 혼합한 G5군에서 가장 많은 IFN-γ의 분비가 유도되었다. 또한, IL-4는 제형별 차이가 크지 않았으나 DC-Chol:DPPC(1:1)를 사용하여 제조된 Lipo-pam을 사용한 G7 내지 G9 및 G11군에서 많은 분비가 유도되었다. TNF-α는 G5, G7, G9 및 G11군에서 많은 분비가 유도되었다(도 17b).
실시예 9. 지질의 종류, 폴리(I:C)의 용량 및 VZV의 재조합 gE 항원을 혼합하는 방법에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
Lipo-pam 제조시, 지질의 종류, 폴리(I:C)의 용량 및 Lipo-pam에 VZV의 재조합 gE 항원을 혼합하는 방법에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<9-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하거나 DC-Chol 및 DPPC가 1:1 또는 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 또한, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 200 ㎍/dose의 폴리(I:C) 및 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합하여 제조하였다. 이후, 하기 표 7과 같이 Lipo-Pam과 40 또는 200 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 추가로 넣거나(G3 내지 G6군), Lipo-Pam과 40 또는 200 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 동시에 혼합(G7 내지 G10군)하여 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 200 ㎍)+항원 5 ㎍
G3 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G4 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G5 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 200 ㎍+항원 5 ㎍
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G7 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍]
G8 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍]
G9 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 200 ㎍+항원 5 ㎍]
G10 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+[폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍]
<9-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <9-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 지질의 종류 및 폴리(I:C)와 항원을 혼합하는 방법에 의한 전체 IgG 항체가의 차이는 없었다(도 18). 또한, 이소타입 분석에서 DC-Chol:DPPC 지질을 3:7 또는 1:1로 사용한 G4 내지 G6군에서 IgG2b/IgG1와 IgG2c/IgG1 비율이 다른 군에 비해 높게 나타났다.
<9-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <9-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 19a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 결과, DC-Chol:DPPC를 사용한 Lipo-pam 제형인 G4 내지 G6군과 G8 내지 G10군에서 L-pampo를 사용한 G2군및 DC-Chol:DOPE를 사용한 G3 및 G7군에 비해 많은 IFN-γ을 생성하였다. IL-4 ELISPOT 결과, 모든 시험군에서 비슷한 수준의 IL-4을 생성하였다(도 19a).
또한, 도 19b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, DC-Chol:DOPE를 사용한 제형에 비해 DC-Chol:DPPC를 사용한 제형에서 더 많은 IFN-γ와 TNF-α의 분비가 유도되었고, DC-Chol:DPPC의 비율을 1:1로 사용한 G6군과 G10군에서 IFN-γ와 TNF-α의 분비가 가장 많이 유도되었다. IL-4는 L-pampo를 사용한 G2군과 DC-Chol:DPPC의 비율을 1:1로 사용한 G6 및 G10군에서 다른 제형에 비해 더 많이 분비가 유도되었고, DC-Chol:DOPE를 사용한 G3 및 G7군에서도 DC-Chol:DPPC를 사용한 제형과 유사한 정도의 IL-4의 분비가 유도되었다(도 19b).
실시예 10. 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
Lipo-pam 제조시, 지질의 종류와 용량, 면역활성물질의 종류 및 VZV의 재조합 gE 항원 용량에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다. 면역활성물질로는 폴리(I:C) 또는 QS21을 사용하였다.
<10-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합하거나 DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율인 지질을 62.5, 125 또는 250 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 이후, 하기 표 8과 같이 Lipo-Pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합하거나(G2 내지 G8군), Lipo-pam과 5 ㎍/dose 농도의 QS21을 혼합한(G9군) 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
시험군 조성
G1 PBS
G2 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G3 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍
G4 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 62.5 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G5 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G7 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 2 ㎍
G8 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 250 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G9 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+QS21 5 ㎍+항원 5 ㎍
<10-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <10-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 지질의 종류에 따른 전체 항체가는 DC-Chol 및 DOPE의 지질을 사용하여 제조한 Lipo-pam을 사용한 G2군에서 가장 높게 유도되었으며, 면역활성물질로 폴리(I:C) 대신 QS21을 사용한 G9군에서도 높은 항체 형성이 유도되었다(도 20).
<10-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <10-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 21a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 결과, 지질로 DC-Chol 및 DOPE를 사용한 G2군에 비해 지질로 DC-Chol 및 DPPC를 사용한 시험군에서 더 많은 IFN-γ를 생성하였고, 지질로 DC-Chol 및 DPPC를 사용하여 제조한 Lipo-pam과 면역활성물질로 QS21을 혼합한 G9군에서 가장 많은 IFN-γ를 생성하였다. 또한, IL-4 ELISPOT 결과, 지질로 DC-Chol 및 DOPE를 사용한 G2군에 비해 지질로 DC-Chol 및 DPPC를 사용한 시험군에서 더 많은 IL-4를 생성하였고, 동일한 Lipo-pam 조성에서 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합한 G6군과 5 ㎍/dose 농도의 QS21과 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합한 G9군에서는 비슷한 수준의 IL-4을 생성하였다(도 21a).
또한, 도 21b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, 지질로 DC-Chol:DOPE를 사용한 G2군에 비해 DC-Chol:DPPC를 사용한 G3 내지 G8군에서 더 많은 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 유도되었다. 동일한 Lipo-pam 조성에서 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)와 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합한 G6군과 5 ㎍/dose 농도의 QS21과 5 ㎍/dose의 재조합 VZV gE 항원을 혼합한 G9군에서 IFN-γ와 TNF-α의 분비는 G9군에서 더 많았고 IL-4의 분비는 비슷한 수준으로 유도되었다.(도 21b).
따라서, <실시예 10>의 결과로부터, Lipo-pam 제조시, 면역활성물질로서 폴리(I:C)뿐만 아니라 QS21을 사용하여도 체액성 및 세포성 면역반응을 잘 유도함으로써 백신의 효능을 개선하는데 도움이 됨을 알 수 있었다.
실시예 11. 리포펩티드의 종류에 따른 재조합 백신의 면역원성 비교
VZV의 재조합 gE 항원을 이용해 제조한 재조합 백신에 포함되는 리포펩티드의 종류에 따른 백신의 면역원성을 비교하였다.
<11-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DPPC 및 리포펩티드를 녹인 후, DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, 리포펩티드가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DPPC 및 리포펩티드를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조한 후, 입도분석기(Malvern, Nono-ZS)를 이용하여 Lipo-Pam의 크기와 제타포텐셜을 측정하였다. 이때, 리포펩티드로는 Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, PamDhc-SKKKK, Pam-CSKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PHC-SKKKK 또는 FSL-1를 사용하였다. 이후, Lipo-Pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 5 ㎍/dose의 VZV의 재조합 gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하고, 입도분석기(Malvern, Nono-ZS)를 이용하여 시험 백신 조성물의 크기와 제타포텐셜을 측정하였다.
리포펩티드의 종류에 따른 Lipo-Pam의 크기 및 제타포텐셜
Lipo-Pam에 삽입된 리포펩티드 크기(nm) 입자의 분포도(PDI) 제타포텐셜(mV)
Pam3-CSKKKK 96.49 0.1465 27.2
Dhc-SKKKK 116.4 0.217 56.1
PamDhc-SKKKK 98.46 0.218 59.1
Pam-CSKKKK 89.05 0.151 42.9
Pam2Cys-SKKKK 97.74 0.222 54.4
PHC-SKKKK 95.96 0.206 50.3
FSL-1 125.9 0.168 37.8
리포펩티드의 종류에 따른 재조합 백신의 크기 및 제타포텐셜
백신 제조에 사용된 리포펩티드 크기(nm) 입자의 분포도(PDI) 제타포텐셜(mV)
Pam3-CSKKKK+폴리(I:C)+항원 211.9 0.191 -53.7
Dhc-SKKKK+폴리(I:C)+항원 128.0 0.163 -38.8
PamDhc-SKKKK+폴리(I:C)+항원 180.5 0.156 -28.5
Pam-CSKKKK+폴리(I:C)+항원 207.8 0.182 -30.2
Pam2Cys-SKKKK+폴리(I:C)+항원 138.6 0.180 -34.5
PHC-SKKKK+폴리(I:C)+항원 122.2 0.178 -35.0
FSL-1+폴리(I:C)+항원 276.0 0.273 -35.2
그 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이, Lipo-Pam은 침전물 없이 제대로 재조합 백신을 생성하였으며, 이는 90 내지 130 nm의 크기였다(표 9). 또한, 표 10에 나타낸 바와 같이, 리포펩티드, 폴리(I:C) 및 항원이 포함된 백신 조성물은 120 내지 300 nm의 크기로 재조합 백신을 형성하였다(표 10).
이후, 상기 제조한 백신을 하기 표 11과 같이 6주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 조스타박스(약독수두생바이러스 1940 PFU, 사람에 투여하는 양의 1/10)
G3 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G4 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Dhc-SKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G5 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+PamDhc-SKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G7 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam2Cys-SKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G8 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+PHC-SKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
G9 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+FSL-1 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+항원 5 ㎍
<11-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <11-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 VZV의 재조합 gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, 모든 시험군에서 항체가 생성되었으며, 특히, 리포펩티드로서 Pam3-CSKKKK, Pam2Cys-SKKKK 및 FSL-1을 사용하여 제조한 Lipo-pam을 사용한 G3, G7 및 G9군이 다른 시험군에 비해 높은 항체가가 유도되었다(도 22).
<11-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <11-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 23a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 결과, 모든 시험군에서 항체가 생성되었으며, 특히 리포펩티드로서 Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, Pam-CSKKKK 또는 PHC-SKKKK를 사용한 G3, G4, G6 및 G8군에서 IFN-γ를 잘 생성하였다. 또한, IL-4 ELISPOT 결과, 리포펩티드로 Pam3-CSKKKK, Dhc-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK 또는 PHC-SKKKK를 사용한 G3, G4, G7 및 G8군에서 IL-4를 잘 생성하였다(도 23a).
또한, 도 23b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, 리포펩티드로 Pam3-CSKKKK 또는 Dhc-SKKKK를 사용한 G3 및 G4군에서 더 많은 IFN-γ, IL-4 및 TNF-α의 분비가 유도되었다.
따라서, <실시예 11>의 결과로부터, Lipo-pam 제조시, 어떠한 종류의 리포펩티드를 사용하더라도 체액성 및 세포성 면역반응이 유도됨으로써, 본 발명에 따른 Lipo-pam이 항원과 다양한 종류의 리포펩티드 조합을 이용한 백신의 제조에 사용될 수 있음을 확인하였다. 특히, 재조합 대상포진 백신을 제조하는 경우에는, 체액성 및 세포성 면역반응 모두를 유도하는 Pam3-CSKKKK를 리포펩티드로서 사용하여 백신의 효능을 개선할 수 있다.
실시예 12. L- pampo 또는 Lipo - pam으로 제제화한 재조합 백신의 일본뇌염 바이러스의 gE 항원에 대한 면역원성 비교
일본뇌염 바이러스의 재조합 gE 항원을 이용해 L-pampo 또는 Lipo-pam으로 제제화한 재조합 백신의 면역원성을 비교하였다.
<12-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질을 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-Pam을 제조하였다. 또한, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 20 ㎍/dose의 폴리(I:C), 및 0.1 또는 0.5 ㎍/dose의 재조합 JEV gE 항원을 혼합하여 제조하였다. 재조합 JEV gE 항원은 배큘로바이러스-인섹트 세포(Baculovirus-insect cell) 시스템에서 발현시킨 후 정제하여 사용하였다. 이후, 하기 표 12와 같이 Lipo-Pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합한 후, 상기 혼합물에 0.1 또는 0.5 ㎍/dose의 재조합 JEV gE 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 불활성화된 JEV 항원 0.1 ㎍/dose
G3 불활성화된 JEV 항원 0.5 ㎍/dose
G4 L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 20 ㎍)+재조합 JEV gE 항원 0.1 ㎍
G5 L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 20 ㎍)+재조합 JEV gE 항원 0.5 ㎍
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+재조합 JEV gE 항원 0.1 ㎍
G7 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+재조합 JEV gE 항원 0.5 ㎍
<12-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <12-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 JEV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 재조합 JEV gE 항원 또는 불활성화된 JEV 항원을 96웰 마이크로플레이트에 100 ng/well의 농도로 코팅한 것을 제외하고는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 24a 및 24b에 나타낸 바와 같이, 재조합 JEV gE 항원에 대한 전체 IgG 항체가(도 24a) 및 불활성화된 JEV 항원에 대한 전체 IgG 항체가(도 24b)는 0.5 ㎍/dose의 항원을 사용한 Lipo-pam 제형(G7군)에서 가장 높았다. 또한, 재조합 JEV gE 항원에 대한 항체의 이소타입 분석 결과, 0.5 ㎍/dose의 항원을 사용했을 때, IgG1 타입의 항체가는 L-pampo를 사용한 G5군에서 가장 높았으며, IgG2a 및 IgG2b 타입의 항체가는 Lipo-pam을 사용한 G7군에서 가장 높게 나타났다.
<12-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <12-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 재조합 JEV gE 항원 또는 불활성화된 JEV 항원을 사용한 것을 제외하고는 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 25a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 및 IL-4 ELISPOT 결과, Lipo-pam 제형인 G6 및 G7군에서 IFN-γ 및 IL-4를 가장 많이 생성하였다(도 25a).
또한, 도 25b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, IFN-γ, IL-4 및 TNF-α는 모두 Lipo-pam 제형(G6 및 G7군), L-pampo 제형(G4 및 G5군) 및 불활성화된 백신(G2, G3군)의 순서로 분비가 유도되었다(도 25b).
따라서, <실시예 12>의 결과로부터, 재조합 일본뇌염 백신 제조시, 면역증강제로 Lipo-pam을 함께 사용하는 것이 체액성 및 세포성 면역반응을 잘 유도함으로써 백신의 효능을 개선하는 데 도움이 되며, 이를 통해 Lipo-pam은 다양한 항원에 대해 면역증강 효능이 있음을 알 수 있었다.
실시예 13. 알룸 ( alum ), L- pampo 또는 Lipo - pam으로 제제화한 백신의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 면역원성 비교
계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원을 이용해 알룸, L-pampo 또는 Lipo-pam으로 제제화한 백신의 면역원성을 비교하였다.
<13-1> 시험 백신의 제조 및 투여
DC-Chol, DOPE, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 녹인 후, DC-Chol 및 DOPE가 3:7의 비율인 지질 또는 DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율인 지질을 각각 125 ㎍/dose 농도가 되도록, Pam3-CSKKKK가 25 ㎍/dose 농도가 되도록 DC-Chol, DOPE, DPPC 및 Pam3-CSKKKK를 혼합한 것을 제외하고는 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 Lipo-pam을 제조하였다. 한편, L-pampo는 25 ㎍/dose의 Pam3-CSKKKK, 20 ㎍/dose의 폴리(I:C), 및 4종류 균주(strain)의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원을 0.5 ㎍/strain/dose가 되도록 혼합하여 제조하였다. 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원은 A/California/07/2009(H1N1), A/Hong Kong/4801/2014(H3N2), B/Phuket/3073/2013(BY) 또는 B/Brisbane/60/2008(BV) 균주로부터 수득된 것으로, 이들 항원은 계란에서 증폭시켜 생산 후, 정제하여 사용하였다. 이후, 하기 표 13과 같이 Lipo-pam과 40 ㎍/dose 농도의 폴리(I:C)를 혼합하고, 상기 혼합물에 0.5 ㎍/strain/dose의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원을 추가로 넣어 시험 백신을 제조하였다. 제조한 백신을 6주령 BALB/c 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 2회에 걸쳐서 근육 주사하였다.
각 시험군별 시험 백신의 제조조건
시험군 조성
G1 PBS
G2 계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain
G3 알룸+계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain
G4 L-Pampo(Pam3-CSKKKK 25 ㎍+폴리(I:C) 20 ㎍)+계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain
G5 Lipo-pam(DC-Chol:DOPE(3:7) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain
G6 Lipo-pam(DC-Chol:DPPC(1:1) 125 ㎍+Pam3-CSKKKK 25 ㎍)+폴리(I:C) 40 ㎍+계절형 불활화 독감 바이러스 항원 0.5 ㎍/strain
<13-2> 체액성 면역반응 분석
실시예 <13-1>에서 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전인 0주차, 1차 백신투여 후 2주째인 2주차 및 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스의 혈청을 분리하여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 이용하여 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원을 각각 96웰 마이크로플레이트에 25 ng/well의 농도로 코팅한 것을 제외하고는 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대한 전체 IgG 항체가는 4종류 균주에서 모두 L-pampo 제형(G4군)이 가장 높았으나, Lipo-pam 제형인 G5군 및 G6군에서도 우수하였고, 특히, DC-Chol 및 DPPC가 1:1의 비율로 포함된 제형(G6군)도 높은 IgG 항체가를 나타내었다. 반면, 항원을 단독으로 투여하거나(G2군), 알룸을 면역증강제로 사용한 시험군(G3군)의 전체 IgG 항체가는 Lipo-pam 제형에 비해 현저히 낮았다(도 26).
<13-3> 세포성 면역반응 분석
실시예 <13-1>에서 투여된 시험 백신의 세포성 면역반응을 분석하기 위하여, 2차 백신투여 후 2주째인 4주차에 마우스로부터 비장을 적출하여 전체 비장세포를 분리한 후, 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원을 사용한 것을 제외하고는 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 ELISPOT 어세이 및 사이토카인 ELISA를 수행하여 세포성 면역반응을 분석하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, IFN-γ ELISPOT 결과, Lipo-pam 제형인 G5 및 G6군에서 4종류 균주의 계절형 불활화 독감 바이러스 항원에 대해 IFN-γ를 가장 많이 생성하였다(도 27). 한편, 도 28에 나타낸 바와 같이, IL-4 ELISPOT 결과, 항원 단독이나 알룸을 첨가한 제형(G2 및 G3)보다는 낮으나 Lipo-pam 제형인 G5 및 G6군에서 IL-4도 분비되었다(도 28).
또한, 도 29 내지 31에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 ELISA 분석결과, Lipo-pam 제형인 G5 및 G6군에서 IFN-γ 및 TNF-α를 많이 생성하였고(도 29 및 30), 항원 단독이나 알룸을 첨가한 제형(G2 및 G3)보다는 낮으나 IL-4도 분비되었다(도 31).
따라서, <실시예 13>의 결과로부터, 계절형 불활화 독감 백신 제조 시, 아쥬반트로서 Lipo-pam을 사용하는 것이 체액성 및 세포성 면역반응을 모두 유도함으로써 백신의 효능을 개선할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 상기로부터 본 발명에 따른 백신 아쥬반트인 Lipo-pam은 항원의 종류에 제한없이, 다양한 종류의 항원과 함께 사용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (17)

  1. 리포펩티드가 삽입된 리포좀(liposome)을 유효성분으로 포함하는 백신 아쥬반트(adjuvant).
  2. 제1항에 있어서, 상기 리포펩티드가 Pam3Cys-SKKKK, Pam3-CSKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, Pam-CSKKKK, Dhc-SKKKK 및 FSL-1로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백신 아쥬반트.
  3. 제1항에 있어서, 면역활성물질을 추가로 포함하는, 백신 아쥬반트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 면역활성물질이 폴리(I:C), QS21, MPLA(Monophosphoryl Lipid A), CpG 및 플라겔린(Flagellin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백신 아쥬반트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리(I:C)가 50 내지 5,000 bp의 길이인, 백신 아쥬반트.
  6. 제1항의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항원이 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류 또는 폴리뉴클레오티드인, 백신 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 항원이 세포 또는 바이러스로부터 유래된 것인, 백신 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 항원이 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus)의 gE(glycoprotein E) 항원, 일본뇌염 바이러스의 gE(glycoprotein E) 항원 및 계절형 불활화 독감 바이러스(seasonal inactivated influenza virus) 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 백신 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 백신이 세포성 면역반응을 유도하는, 백신 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 백신이 Th1 면역반응을 증진시키는, 백신 조성물.
  12. 제6항의 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 바이러스의 감염 예방 또는 치료제.
  13. 제6항의 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료제.
  14. 제6항의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스의 감염 예방 또는 치료 방법.
  15. 제6항의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
  16. 바이러스의 감염 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 제 6항의 백신 조성물의 용도.
  17. 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 제 6항의 백신 조성물의 용도.
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DE50309916D1 (de) * 2002-04-04 2008-07-10 Helmholtz Infektionsforschung Verwendung eines lipopeptids oder lipoproteins als adjuvans bei therapeutischer oder prophylaktischer vakzinierung
WO2012116225A2 (en) * 2011-02-24 2012-08-30 Oncothyreon Inc. Muc1 based glycolipopeptide vaccine with adjuvant
RU2580003C2 (ru) 2011-02-24 2016-04-10 Могам Байотекнолоджи Рисерч Инститьют Новые штаммы вируса ветряной оспы и противовирусная вакцина против ветряной оспы и опоясывающего лишая, в которой применяются такие штаммы
KR101501583B1 (ko) * 2013-03-29 2015-03-12 주식회사 차백신연구소 리포펩티드 및 폴리(ｉ:ｃ)를 포함하는 아쥬반트 및 이를 이용한 개선된 제형의 백신 조성물
SG11201509357WA (en) * 2013-05-14 2015-12-30 Merck Patent Gmbh Method of treating lung cancer by vaccination with muc-1 lipopeptide
KR101723605B1 (ko) 2014-10-21 2017-04-07 진원생명과학 주식회사 대상포진 예방 및 치료용 dna 백신 조성물 및 이를 이용한 vzv 항원에 대한 t세포 활성화 방법

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