JP2020530996A - 核酸の操作のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位の対にフランキングする第1の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;
b)同一の組換え部位が組み換わって、第1の挿入核酸および第1の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップa)のゲノムポリヌクレオチドを、第1の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ;
c)ステップb)のゲノムポリヌクレオチド中に、第2の組換え部位が互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位の対にフランキングする第2の挿入核酸を挿入するステップ;ならびに
d)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチド配列を除去することなく、第2の挿入核酸および第2の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップc)のゲノムポリヌクレオチドを、第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法が提供される。
a)i)第1の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位にフランキングする、ii)第2の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位にフランキングする、およびiii)任意のさらなる組換え部位が、第1または第2の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する核酸配列を有する、少なくとも第1および第2の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;ならびに
b)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチドを除去することなく、同一の組換え部位にフランキングする挿入核酸の切出しをもたらすように、ゲノムポリヌクレオチドを、第1および第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法も提供される。
a)グリコシル化されたタンパク質の産生にとって好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ、および
b)培養物からグリコシル化されたタンパク質を単離するステップ
を含むプロセスが提供される。
a)組換え部位の第1の対にフランキングする第1の選択マーカーを含む第1のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;
b)組換え部位の第1の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第1の選択マーカーを除去するステップ;
c)組換え部位の第2の対にフランキングする第2の選択マーカーを含む第2のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;および
d)組換え部位の第2の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第2の選択マーカーを除去するステップ
を含み、
組換え部位の第1の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第2の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第1および第2の対が、90〜98%の核酸配列同一性を有する、プロセスが提供される。
a)互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位の対にフランキングする第1の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;
b)同一の組換え部位が組み換わって、第1の挿入核酸および第1の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップa)のゲノムポリヌクレオチドを、第1の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ;
c)ステップb)のゲノムポリヌクレオチド中に、第2の組換え部位が互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位の対にフランキングする第2の挿入核酸を挿入するステップ;ならびに
d)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチド配列を除去することなく、第2の挿入核酸および第2の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップc)のゲノムポリヌクレオチドを、第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法を提供する。
a)i)第1の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位の対にフランキングする、ii)第2の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位の第2の対にフランキングする、およびiii)任意のさらなる組換え部位が、第1または第2の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する核酸配列を有する、少なくとも第1および第2の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;ならびに
b)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチドを除去することなく、同一の組換え部位にフランキングする挿入核酸の切出しをもたらすように、ゲノムポリヌクレオチドを、第1および第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法も提供する。
b-----→a’----→スペーサー←--a。
a)グリコシル化されたタンパク質の産生にとって好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ、および
b)培養物からグリコシル化されたタンパク質を単離するステップ
を含むプロセスを開示する。
a)組換え部位の第1の対にフランキングする第1の選択マーカーを含む第1のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;
b)組換え部位の第1の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第1の選択マーカーを除去するステップ;
c)組換え部位の第2の対にフランキングする第2の選択マーカーを含む第2のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;および
d)組換え部位の第2の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第2の選択マーカーを除去するステップ
を含み、
組換え部位の第1の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第2の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第1および第2の対が、90〜98%の核酸配列同一性を有する、プロセスである。
a)互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位の対にフランキングする第1の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;
b)同一の組換え部位が組み換わって、第1の挿入核酸および第1の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップa)のゲノムポリヌクレオチドを、第1の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ;
c)ステップb)のゲノムポリヌクレオチド中に、第2の組換え部位が互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位の対にフランキングする第2の挿入核酸を挿入するステップ;ならびに
d)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチド配列を除去することなく、第2の挿入核酸および第2の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップc)のゲノムポリヌクレオチドを、第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法。
a)i)第1の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位にフランキングする、ii)第2の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位にフランキングする、およびiii)任意のさらなる組換え部位が、第1または第2の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する核酸配列を有する、少なくとも第1および第2の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;ならびに
b)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチドを除去することなく、同一の組換え部位にフランキングする挿入核酸の切出しをもたらすように、ゲノムポリヌクレオチドを、第1および第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法。
a)組換え部位の第1の対にフランキングする第1の選択マーカーを含む第1のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;
b)組換え部位の第1の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第1の選択マーカーを除去するステップ;
c)組換え部位の第2の対にフランキングする第2の選択マーカーを含む第2のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;および
d)組換え部位の第2の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第2の選択マーカーを除去するステップ
を含み、
組換え部位の第1の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第2の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第1および第2の対が、90〜98%の核酸配列同一性を有する、方法。
i)グリコシル化されたタンパク質の産生にとって好適な条件下で段落60に記載の宿主細胞を培養するステップ、および
ii)培養物からグリコシル化されたタンパク質を単離するステップを含む方法。
(実施例)
stGVXN8661株は、単一のFRTwtが、組換え事象の部位に隣接する、ゲノムDNA上の3つの位置に存在するような、FRTwtの使用を含むいくつかのゲノム改変を含有する大腸菌W3110の誘導株である。
代替的なFRT配列の存在についてのみ異なる、一連の大腸菌W3110誘導株を構築した。第1に、O16 rfbクラスターを、置換されるクラスターの同じ向きの、ゲンタマイシン耐性カセットgntR、次いで、反対の向きの、クロラムフェニコール耐性カセットclmRによって置き換え、2個のFRTwt部位の間に封入した。第2に、6回の平行相同組換えを実行して、コラン酸wcaクラスターを、置き換えられるクラスターの反対の向きにある、カナマイシン耐性カセットkanRで置き換え、2個のFRTwt、FRT3、FRt10、FRT13、FRT14、およびFRT15部位の間に封入して、それぞれ、10175、10176、10177、10178、10179、および10180株を得た。
stGVXN9876株は、単一コピーのFRTwtが、組換え事象の部位に隣接する、ゲノムDNA上の3つの位置に存在するような、FRTwtの使用を含むいくつかのゲノム改変を含有する大腸菌W3110の誘導株である。
stLMTB11280株は、FRTwtのコピーが、組換え事象の部位に隣接する、ゲノムDNA上の複数の位置に存在するような、FRTwtの使用を含むいくつかのゲノム改変を含有する大腸菌W3110の誘導株である。2個の単一コピーのFRTwtならびにクロラムフェニコール耐性カセットにフランキングするFRTwt配列の対が存在していた。
stLMTB10502株は、以下の遺伝子:i. 1個のFRTwt部位で置き換えられたwaaL;ii. 1個のFRT3部位で置き換えられた、rfbDからwbbLまでのrfb O16クラスターが欠失している、大腸菌W3110の誘導株である。
stLMTB10739株を、2つの高度に相同な遺伝子クラスターの組込みのための出発株として用いた。
(1)宿主細胞中のゲノムポリヌクレオチドから挿入核酸の少なくとも2つの部分を除去する方法であって、
a)互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位の対にフランキングする第1の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;
b)同一の組換え部位が組み換わって、第1の挿入核酸および第1の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップa)のゲノムポリヌクレオチドを、第1の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ;
c)ステップb)のゲノムポリヌクレオチド中に、第2の組換え部位が互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位の対にフランキングする第2の挿入核酸を挿入するステップ;ならびに
d)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチド配列を除去することなく、第2の挿入核酸および第2の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップc)のゲノムポリヌクレオチドを、第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法。
(2)宿主細胞中のゲノムポリヌクレオチドから挿入核酸の少なくとも2つの部分を除去する方法であって、
a)i)第1の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位にフランキングする、ii)第2の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位にフランキングする、およびiii)任意のさらなる組換え部位が、第1または第2の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する核酸配列を有する、少なくとも第1および第2の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;ならびに
b)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチドを除去することなく、同一の組換え部位にフランキングする挿入核酸の切出しをもたらすように、ゲノムポリヌクレオチドを、第1および第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法。
(3)ゲノムポリヌクレオチドが原核生物のゲノムポリヌクレオチドまたはプラスミドである、(1)または(2)に記載の方法。
(4)ゲノムポリヌクレオチドが真核生物の染色体である、(1)または(2)または(3)に記載の方法。
(5)第1および第2の挿入核酸が選択マーカーである、(1)〜(4)のいずれか一に記載の方法。
(6)第1の単一の組換え部位が、第1の組換え操作される領域に隣接し、第2の単一の組換え部位が、第2の組換え操作される領域に隣接し、第1および第2の組換え部位が、互いに、必要に応じて、宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド中に存在する任意のさらなる組換え部位の核酸配列との90〜98%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、第1の組換え操作された領域および第2の組換え操作された領域を含む宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド。
(7)第1の組換え部位の傷が、第1の組換え操作される領域に隣接し、第2の組換え部位の傷が、第2の組換え操作される領域に隣接し、第1および第2の組換え部位の傷が、互いに98%未満同一であり、必要に応じて、宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド中に存在する任意のさらなる組換え部位の傷のポリヌクレオチド配列と98%未満同一である異なるポリヌクレオチド配列を有する、第1の組換え操作された領域および第2の組換え操作された領域を含有する宿主細胞ゲノムポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
(8)第1および第2の組換え部位が、リコンビナーゼ、例えば、FLPリコンビナーゼのための組換え部位である、(7)に記載の宿主細胞。
(9)第1の組換え部位が配列番号1〜10のいずれか1つの核酸配列を有する、(8)に記載の宿主細胞。
(10)第1および第2の組換え部位が、100、75、50、25、10または5kベース未満隔てられている、(7)〜(9)のいずれか一に記載の宿主細胞。
(11)それぞれの組換え部位の傷が、異なるポリヌクレオチド配列を有する、少なくとも2つの組換え操作される領域に隣接する少なくとも2つの組換え部位の傷を含む原核生物のゲノムポリヌクレオチドまたは真核生物の染色体。
(12)宿主細胞を操作するための方法であって、
a)組換え部位の第1の対にフランキングする第1の選択マーカーを含む第1のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;
b)組換え部位の第1の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第1の選択マーカーを除去するステップ;
c)組換え部位の第2の対にフランキングする第2の選択マーカーを含む第2のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;および
d)組換え部位の第2の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第2の選択マーカーを除去するステップ
を含み、
組換え部位の第1の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第2の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第1および第2の対が、90〜98%の核酸配列同一性を有する、方法。
(13)ステップb)およびd)のリコンビナーゼがFLPリコンビナーゼである、(12)に記載の方法。
(14)FLPリコンビナーゼが、配列番号11と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、(13)に記載の方法。
(15)(12)〜(14)のいずれか一に記載の方法によって得られる操作された宿主細胞。
(16)それぞれの組換え部位が他の組換え部位と98%未満同一であるヌクレオチド配列を有する、宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド中に少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個の組換え部位の単一のコピーを含む操作された宿主細胞。
(17)少なくとも2個の組換え部位がFRT部位である、(16)に記載の操作された宿主細胞。
(18)少なくとも2個の組換え部位が、宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド中で100kb、75kb、50kb、25kb、10kb、5kb、3kbまたは1kb未満隔てられている、(16)または(17)に記載の操作された宿主細胞。
(19)rfbクラスターのインタクトなプロモーターを維持しながら、天然のrfbクラスターの少なくとも一部およびwcaコラン酸クラスターの少なくとも一部が欠失している、操作されたグラム陰性宿主細胞。
(20)waaL遺伝子も欠失している、(19)に記載の操作されたグラム陰性宿主細胞。
(21)グラム陰性宿主細胞が大腸菌である、(19)または(20)に記載の操作されたグラム陰性宿主細胞。
(22)天然のrfbクラスターの少なくとも一部が異種グリカンクラスターと置き換えられる、(19)〜(21)のいずれか一に記載の操作されたグラム陰性宿主細胞。
(23)waaL遺伝子がpglB遺伝子またはpglL遺伝子と置き換えられる、(19)〜(22)のいずれか一に記載の操作されたグラム陰性宿主細胞。
(24)宿主細胞が、a)オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、例えば、PglBまたはPglL;b)異種グリカンクラスター、例えば、rfbクラスターまたは莢膜多糖を合成するのに必要とされるグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子クラスター;およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼによって認識されるグリコシル化部位を含有するタンパク質、例えば、WO 06/119987(請求項1)に開示された最適化されたコンセンサス配列を発現するように操作される、(6)〜(10)または(16)〜(23)のいずれか一に記載の宿主細胞。
(25)グリコシル化されたタンパク質を作製するための方法であって、
i)グリコシル化されたタンパク質の産生にとって好適な条件下で(24)に記載の宿主細胞を培養するステップ、および
ii)培養物からグリコシル化されたタンパク質を単離するステップ
を含む方法。
本発明をより良く理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示に過ぎず、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
(実施例)
Claims (25)
- 宿主細胞中のゲノムポリヌクレオチドから挿入核酸の少なくとも2つの部分を除去する方法であって、
a)互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位の対にフランキングする第1の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;
b)同一の組換え部位が組み換わって、第1の挿入核酸および第1の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップa)のゲノムポリヌクレオチドを、第1の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ;
c)ステップb)のゲノムポリヌクレオチド中に、第2の組換え部位が互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位の対にフランキングする第2の挿入核酸を挿入するステップ;ならびに
d)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチド配列を除去することなく、第2の挿入核酸および第2の組換え部位の1つの切出しをもたらすように、ステップc)のゲノムポリヌクレオチドを、第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法。 - 宿主細胞中のゲノムポリヌクレオチドから挿入核酸の少なくとも2つの部分を除去する方法であって、
a)i)第1の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列を有する、同じ向きにある第1の組換え部位にフランキングする、ii)第2の挿入核酸が、互いに同一であり、第1の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する第2の核酸配列を有する、同じ向きにある第2の組換え部位にフランキングする、およびiii)任意のさらなる組換え部位が、第1または第2の核酸配列との98%以下の配列同一性を有する核酸配列を有する、少なくとも第1および第2の挿入核酸を含むゲノムポリヌクレオチドを調製するステップ;ならびに
b)同一の組換え部位が組み換わって、同一の組換え部位にフランキングしていないゲノムポリヌクレオチドを除去することなく、同一の組換え部位にフランキングする挿入核酸の切出しをもたらすように、ゲノムポリヌクレオチドを、第1および第2の組換え部位を認識するリコンビナーゼに曝露するステップ
を含む方法。 - ゲノムポリヌクレオチドが原核生物のゲノムポリヌクレオチドまたはプラスミドである、請求項1または2に記載の方法。
- ゲノムポリヌクレオチドが真核生物の染色体である、請求項1または2または3に記載の方法。
- 第1および第2の挿入核酸が選択マーカーである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の単一の組換え部位が、第1の組換え操作される領域に隣接し、第2の単一の組換え部位が、第2の組換え操作される領域に隣接し、第1および第2の組換え部位が、互いに、必要に応じて、宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド中に存在する任意のさらなる組換え部位の核酸配列との90〜98%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する、第1の組換え操作された領域および第2の組換え操作された領域を含む宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド。
- 第1の組換え部位の傷が、第1の組換え操作される領域に隣接し、第2の組換え部位の傷が、第2の組換え操作される領域に隣接し、第1および第2の組換え部位の傷が、互いに98%未満同一であり、必要に応じて、宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド中に存在する任意のさらなる組換え部位の傷のポリヌクレオチド配列と98%未満同一である異なるポリヌクレオチド配列を有する、第1の組換え操作された領域および第2の組換え操作された領域を含有する宿主細胞ゲノムポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 第1および第2の組換え部位が、リコンビナーゼ、例えば、FLPリコンビナーゼのための組換え部位である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 第1の組換え部位が配列番号1〜10のいずれか1つの核酸配列を有する、請求項8に記載の宿主細胞。
- 第1および第2の組換え部位が、100、75、50、25、10または5kベース未満隔てられている、請求項7〜9のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- それぞれの組換え部位の傷が、異なるポリヌクレオチド配列を有する、少なくとも2つの組換え操作される領域に隣接する少なくとも2つの組換え部位の傷を含む原核生物のゲノムポリヌクレオチドまたは真核生物の染色体。
- 宿主細胞を操作するための方法であって、
a)組換え部位の第1の対にフランキングする第1の選択マーカーを含む第1のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;
b)組換え部位の第1の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第1の選択マーカーを除去するステップ;
c)組換え部位の第2の対にフランキングする第2の選択マーカーを含む第2のポリヌクレオチドカセットを組み込むステップ;および
d)組換え部位の第2の対を認識するリコンビナーゼの作用によって第2の選択マーカーを除去するステップ
を含み、
組換え部位の第1の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第2の対が、同一の核酸配列を有し、組換え部位の第1および第2の対が、90〜98%の核酸配列同一性を有する、方法。 - ステップb)およびd)のリコンビナーゼがFLPリコンビナーゼである、請求項12に記載の方法。
- FLPリコンビナーゼが、配列番号11と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の方法。
- 請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法によって得られる操作された宿主細胞。
- それぞれの組換え部位が他の組換え部位と98%未満同一であるヌクレオチド配列を有する、宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド中に少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個の組換え部位の単一のコピーを含む操作された宿主細胞。
- 少なくとも2個の組換え部位がFRT部位である、請求項16に記載の操作された宿主細胞。
- 少なくとも2個の組換え部位が、宿主細胞ゲノムポリヌクレオチド中で100kb、75kb、50kb、25kb、10kb、5kb、3kbまたは1kb未満隔てられている、請求項16または17に記載の操作された宿主細胞。
- rfbクラスターのインタクトなプロモーターを維持しながら、天然のrfbクラスターの少なくとも一部およびwcaコラン酸クラスターの少なくとも一部が欠失している、操作されたグラム陰性宿主細胞。
- waaL遺伝子も欠失している、請求項19に記載の操作されたグラム陰性宿主細胞。
- グラム陰性宿主細胞が大腸菌である、請求項19または20に記載の操作されたグラム陰性宿主細胞。
- 天然のrfbクラスターの少なくとも一部が異種グリカンクラスターと置き換えられる、請求項19〜21のいずれか一項に記載の操作されたグラム陰性宿主細胞。
- waaL遺伝子がpglB遺伝子またはpglL遺伝子と置き換えられる、請求項19〜22のいずれか一項に記載の操作されたグラム陰性宿主細胞。
- 宿主細胞が、a)オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、例えば、PglBまたはPglL;b)異種グリカンクラスター、例えば、rfbクラスターまたは莢膜多糖を合成するのに必要とされるグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子クラスター;およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼによって認識されるグリコシル化部位を含有するタンパク質、例えば、WO 06/119987(請求項1)に開示された最適化されたコンセンサス配列を発現するように操作される、請求項6〜10または16〜23のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- グリコシル化されたタンパク質を作製するための方法であって、
i)グリコシル化されたタンパク質の産生にとって好適な条件下で請求項24に記載の宿主細胞を培養するステップ、および
ii)培養物からグリコシル化されたタンパク質を単離するステップ
を含む方法。
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