CN110914432A - 用于操纵核酸的方法 - Google Patents

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CN110914432A CN201880051217.1A CN201880051217A CN110914432A CN 110914432 A CN110914432 A CN 110914432A CN 201880051217 A CN201880051217 A CN 201880051217A CN 110914432 A CN110914432 A CN 110914432A
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Abstract

本发明公开了用于工程改造宿主细胞的方法，其包括以下步骤：a)整合第一多核苷酸盒，所述第一多核苷酸盒包括侧接第一对重组位点的第一选择标记；b)通过识别所述第一对重组位点的重组酶的作用除去所述第一选择标记；c)整合第二多核苷酸盒，所述第二多核苷酸盒包括侧接第二对重组位点的第二选择标记；和d)通过识别所述第二对重组位点的重组酶的作用除去所述第二选择标记；其中所述第一对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第二对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第一和第二对重组位点共有90‑98%核酸序列同一性。还公开了宿主细胞基因组多核苷酸，其包含第一重组工程改造的区域和第二重组工程改造的区域，其中第一单一重组位点与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二单一重组位点与所述第二重组工程改造的区域相邻，其中所述第一和第二重组位点具有与彼此以及任选地与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点的核酸序列共有90‑98%同一性的核苷酸序列。

Description

用于操纵核酸的方法
技术领域
本发明涉及核酸的重组操纵的领域，并且具体地涉及精确除去核酸的特定区域，同时确保不除去所需的核酸部分。具体地，本发明允许在基因组多核苷酸的重组操纵期间除去可能已经例如作为选择标记并入的多个不想要的遗传元件。该方法使用短重组位点，诸如FRT位点，以侧接遗传元件，随后将其除去。使用不相同的重组位点以侧接待除去的不同的遗传元件允许有效地除去意欲的遗传元件而不丢失来自基因组多核苷酸的其他元件。
背景
原核和真核生物的遗传操纵经常涉及将遗传元件稳定插入基因组中，使得可以生成具有所需属性的稳定系。或者，可以使用遗传操纵来除去遗传物质的不想要的元件，任选地用其他遗传插入物替换除去的遗传物质。通常在遗传操纵期间引入选择标记，使得可以选择含有正确的遗传操纵的细胞。然而，一旦已经建立正确操纵的宿主细胞，随后除去标记是有用的，特别是如果宿主细胞待用于制造用于医学或兽医用途的产品。
从基因组除去单一遗传标记是已知的。发现Flp重组酶在酵母遗传物质的转化中具有作用(Broach和Hicks (1980) Cell 21; 501-506, Broach等人 (1982) Cell 29;227-234)。在大肠杆菌中研究Flp重组酶的潜能(Cox (1983) P.N.A.S. 80; 4223-4227,Vetter等人 (1983) PNAS 80; 7204-7288, Andrews等人 (1985) Cell 40; 795-803)并且阐明Flp-重组酶在遗传元件的切除、倒置、易位和插入中的作用(Gronostajski和Sadowski (1985) J. Biol. Chem. 260; 12328-35)。Flp-重组酶在Flp重组酶靶标(FRT)位点(其为约48bp的遗传元件)之间产生重组。FRT位点已被用于侧接选择标记，使得其能够随后使用Flp重组酶从酵母基因组切除(Cregg和Madden (1989) Mol. Gen. Genet. 219;320-323)并且已经使用类似的策略来切除大肠杆菌中的抗生素抗性标记(Cherepanov和Wackernagel (1995) Gene 158; 9-14)。
原核和真核生物的更复杂的遗传操纵需要将多个遗传元件稳定整合至基因组中和/或从基因组中除去。例如，已经描述操纵大肠杆菌以产生与特定糖连接的蛋白(WO 09/104074、WO 11/60615、WO 11/138361)。为了在大肠杆菌中完成生物缀合物的产生，有必要将多个遗传元件引入宿主细胞，包括一个或多个拷贝的编码组装所需糖链所需的糖基转移酶的几种基因，编码寡糖基转移酶诸如PglB的基因，编码含有糖基化位点的所需蛋白的基因，和可能另外的编码其他酶(诸如聚合酶、共聚酶、翻转酶、和/或正确装饰糖的酶)的基因。除去特定遗传元件诸如脂多糖O-抗原连接酶、天然糖基转移酶或寡糖基转移酶、翻转酶、聚合酶或共聚酶也是有益的。将这些基因中的几种整合至生产细胞基因组中并除去不想要的基因以促进生产将是有益的(WO 14/57109、WO 15/52344)。然而，使用标准方法，这是困难的(Datsenko和Wanner (2000) PNAS 97; 6640-5, Kuhlman和Cox (2010) 38;e92)。具体而言，难以除去与多次整合相关的多个选择标记，因为可以在侧接选择标记的重组位点之间发生干扰，导致切除所需的遗传物质以及选择标记中的一些。如果待切除的选择标记在基因组中彼此相对靠近定位，则这尤其成问题。图4中表明了该问题。
本发明通过使用数对相同的重组位点以侧接待从基因组除去的每个核酸区段来提供该问题的解决方案；其中每相同对的重组位点与侧接待从基因组除去的其他核酸区段的所述对重组位点是不同的。
因此，提供了从宿主细胞中的基因组多核苷酸除去插入核酸的至少两个部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 制备包含第一插入核酸的基因组多核苷酸，所述第一插入核酸侧接一对彼此相同且具有第一核酸序列的相同取向的第一重组位点；
b) 将步骤a)的所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第一重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除所述第一插入核酸和所述第一重组位点之一；
c) 将第二插入核酸插入步骤b)的所述基因组多核苷酸中，所述第二插入核酸侧接一对相同取向的第二重组位点，其中所述第二重组位点彼此相同且具有与所述第一核酸序列共有不超过98%序列同一性的第二核酸序列；和
d) 将步骤c)的所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第二重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除所述第二插入核酸和所述第二重组位点之一，但不除去不侧接相同的重组位点的基因组多核苷酸序列。
因此，还提供了用于从宿主细胞中的基因组多核苷酸除去插入核酸的至少两个部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备包含至少第一和第二插入核酸的基因组多核苷酸，其中i)所述第一插入核酸侧接彼此相同且具有第一核酸序列的相同取向的第一重组位点，ii)所述第二插入核酸侧接相同取向的第二重组位点，所述第二重组位点彼此相同且具有与所述第一核酸序列共有不超过98%序列同一性的第二核酸序列，且iii)任何另外的重组位点具有与所述第一或第二核酸序列共有不超过98%序列同一性的核酸序列；和b)将所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第一和第二重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除侧接相同的重组位点的插入核酸，但不除去不侧接相同的重组位点的基因组多核苷酸。
不希望受理论所束缚，使用不同对的重组位点有利于相同对的重组位点之间的重组，使得优先除去预期的核酸区段。
在本发明的第二方面，提供了包含通过本发明的方法制备的基因组多核苷酸的宿主细胞。
在本发明的第三方面，提供了宿主细胞基因组多核苷酸，其包含第一重组工程改造的区域和第二重组工程改造的区域，其中第一单一重组位点与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二单一重组位点与所述第二重组工程改造的区域相邻，其中所述第一和第二重组位点具有与彼此以及与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点的核酸序列共有90-98%同一性的核苷酸序列。
在本发明的第四方面，提供了包含宿主细胞基因组多核苷酸的宿主细胞，所述宿主细胞基因组多核苷酸含有第一重组工程改造的区域和第二重组工程改造的区域，其中第一重组位点疤痕(scar)与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二重组位点疤痕与所述第二重组工程改造的区域相邻；其中所述第一和第二重组位点疤痕具有不同的多核苷酸序列，所述不同的多核苷酸序列与彼此具有小于98%同一性，且与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点疤痕的多核苷酸序列具有小于98%同一性。
在本发明的第五方面，提供了用于制备糖基化蛋白的方法，其包括以下步骤：
a) 在适用于产生糖基化蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，和
b) 从培养物分离所述糖基化蛋白。
在本发明的第六方面，提供了原核基因组多核苷酸或真核染色体，其包含与至少两个重组区域相邻的至少两个重组位点疤痕，其中每个重组位点疤痕具有不同的多核苷酸序列。
在本发明的第七方面，提供了用于工程改造宿主细胞的方法，其包括以下步骤：
a) 整合第一多核苷酸盒，所述第一多核苷酸盒包括侧接第一对重组位点的第一选择标记；
b) 通过识别所述第一对重组位点的重组酶的作用除去所述第一选择标记；
c) 整合第二多核苷酸盒，所述第二多核苷酸盒包括侧接第二对重组位点的第二选择标记；和
d) 通过识别所述第二对重组位点的重组酶的作用除去所述第二选择标记；
其中所述第一对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第二对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第一和第二对重组位点共有90-98%核酸序列同一性。
在本发明的第八方面，提供了可通过本发明的方法获得的工程改造的宿主细胞。例如，工程改造的宿主细胞任选地通过插入多个拷贝的特定基因或基因簇来修饰。可以选择用于整合的特定基因座以优化不同基因的表达水平。类似地，在不同基因座处整合2、3、4、5、6或更多个拷贝的基因或基因簇可以优化所述基因或基因簇的表达。
附图简述
图1 -上样有周质提取物的SDS PAGE上的Western印迹。左小图：用His抗血清检测。右小图：用抗33F抗血清检测。泳道1含有分子量标记，泳道2含有菌株8661，泳道3含有菌株10852，且泳道4含有菌株10853。
图2 -菌株10175和10180中替换的wca和rfb簇的基因组组构的方案。
图3 -对选择的克隆的菌落PCR，所述选择的克隆衍生自从菌株10175至10180的FLP-介导的抗性盒除去。泳道1、14和27含有GeneRulerTM 1kb DNA梯，泳道2含有除去前的St10175，泳道3和4含有FRTwt，模式B，泳道5和6含有FRTwt，模式E，泳道7、8和9含有FRT3，模式E，泳道10、11和12含有FRT3，模式D，泳道13、15和16含有FRT10，模式E，泳道17和18含有FRT10，模式D，泳道19和20含有FRT10，模式C，泳道21和22含有FRT13，模式E，泳道23含有FRT13，模式A，泳道24和25含有FRT13，模式D，泳道26和28含有FRT13，模式C，泳道29含有FRT13，模式B，泳道30、31、32和33含有FRT14，模式E，泳道34含有FRT14，模式D，泳道35和36含有FRT15，模式E，且泳道37、38和39含有FRT15，模式C。
图4-对衍生自FLP-介导的抗性盒除去的基因组DNA菌株的制备PCR。
图5 -表明使用替代FRT位点的优势的概念方案。
详述
本发明提供了从宿主细胞中的基因组多核苷酸除去插入核酸的至少两个部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 制备包含第一插入核酸的基因组多核苷酸，所述第一插入核酸侧接一对彼此相同且具有第一核酸序列的相同取向的第一重组位点；
b) 将步骤a)的所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第一重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除所述第一插入核酸和所述第一重组位点之一；
c) 将第二插入核酸插入步骤b)的所述基因组多核苷酸中，所述第二插入核酸侧接一对相同取向的第二重组位点，其中所述第二重组位点彼此相同且具有与所述第一核酸序列共有不超过98%序列同一性的第二核酸序列；和
d) 将步骤c)的所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第二重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除所述第二插入核酸和所述第二重组位点之一，但不除去不侧接相同的重组位点的基因组多核苷酸序列。
本发明还提供了用于从宿主细胞中的基因组多核苷酸除去插入核酸的至少两个部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备包含至少第一和第二插入核酸的基因组多核苷酸，其中i)所述第一插入核酸侧接一对彼此相同且具有第一核酸序列的相同取向的第一重组位点，ii)所述第二插入核酸侧接相同取向的第二对第二重组位点，所述第二对第二重组位点彼此相同且具有与所述第一核酸序列共有不超过98%序列同一性的第二核酸序列，且iii)任何另外的重组位点具有与所述第一或第二核酸序列共有不超过98%序列同一性的核酸序列；和
b)将所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第一和第二重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除侧接相同的重组位点的插入核酸，但不除去不侧接相同的重组位点的基因组多核苷酸。
尽管不希望受理论所束缚，使用不同对的重组位点有利于相同对的重组位点之间的重组，使得优先除去预期的核酸区段。
术语“插入核酸”意指由于基因组多核苷酸的遗传操纵而变得整合至所述基因组多核苷酸中的核酸区段。所述插入核酸通常是作为遗传重组过程的不想要的结果而变得整合至基因组多核苷酸中的核酸区段，而不是作为遗传重组以引入的目的的核酸区段，例如待表达的基因。因此，所述插入核酸任选地是遗传标记，诸如抗生素抗性标记。或者，所述插入核酸是插入所述基因组多核苷酸中以帮助同源重组的序列，例如“着陆垫(landingpad)”。本发明的目的是提供一旦已完成所需的多次遗传操纵就从基因组多核苷酸有效地除去插入核酸的有效方式。
术语“重组位点”意指插入核酸的任一侧的序列，其允许其随后通过由重组酶介导的基因重组从基因组多核苷酸除去。这些通常是由重组酶识别的核苷酸序列，允许同源重组后缺失间插序列。
术语“重组工程改造的区域”意指已被工程改造的基因组多核苷酸的一部分。这可涉及添加核酸序列、缺失核酸序列或替换核酸序列。
术语“基因组多核苷酸”意指遗传物质的大片段，例如真核染色体或原核遗传物质。
术语“宿主细胞”意指原核或真核细胞。通常，已经对宿主细胞进行遗传操纵以含有新的遗传物质和/或除去遗传物质。在一个实施方案中，将已对宿主细胞实施多次遗传操纵，导致至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个插入核酸可以使用本发明的方法有效地切除。
本发明的方法可以用于在任何形式的先前遗传操纵之后除去插入核酸。例如，由于添加遗传物质、除去遗传物质或用额外的遗传物质替换缺失的遗传物质，所述插入核酸可以存在于所述基因组多核苷酸中。本发明的方法适合与原核基因组多核苷酸、与质粒或与真核染色体一起使用。
在一个实施方案中，所述第一和第二插入核酸是选择标记，例如，用于鉴定宿主细胞(在所述宿主细胞中，已经成功地发生遗传物质的添加、除去或替换)的选择标记。在一个实施方案中，所述选择标记是抗生素抗性标记。在一个实施方案中，所述选择标记编码赋予对抗生素(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、壮观霉素或庆大霉素)的抗性的蛋白。
在一个实施方案中，侧接所述插入核酸的所述对的重组位点彼此相同。在一个实施方案中，侧接插入核酸的所述对的重组位点呈相同取向。这允许在识别所述重组位点的重组酶存在的情况下发生有效的重组，导致缺失所述插入核酸和所述重组位点之一。这种重组导致剩余单一重组位点；即作为所述基因组多核苷酸中的“重组位点疤痕”。
在一个实施方案中，所述第一和第二对重组位点具有共有不超过98%、96%、94%、92%、90%、85%、80%、75%或70%同一性的核酸序列。在一个实施方案中，所述第一和第二对重组位点具有共有70-98%、75-98%、80-98%、85-98%、90-98%、92-98%、94-98%或96-98%同一性的核酸序列。在合适的实施方案中，所述第一和第二对重组位点在所述第一重组位点的序列和所述第二重组位点的序列之间共有90-98%同一性。
在一个实施方案中，所述第一和第二识别位点与所述基因组多核苷酸中的任何其他重组位点共有不超过98%、96%、94%、92%、90%、85%、80%、75%或70%同一性。在一个实施方案中，所述第一和第二重组位点具有与所述基因组多核苷酸中存在的任何其他重组位点共有70-98%、75-98%、80-98%、85-98%、90-98%、92-98%、94-98%或96-98%同一性的核酸序列。在合适的实施方案中，所述第一和第二对重组位点在所述第一重组位点的序列以及所述第二重组位点和所述基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点的序列之间共有90-98%同一性。
在一个实施方案中，步骤a)制备包含第三插入核酸的基因组多核苷酸，所述第三插入核酸侧接一组相同的第三重组位点，所述第三重组位点具有第三核酸序列，所述第三核酸序列与所述第一或第二重组位点或任何另外的重组位点的核酸序列共有不超过98%、96%、94%、92%或90%或50%-98%、60%-98%、70%-98%、80%-98%、85%-98%、90-98%、92-98%、94%-98%或96%-98%序列同一性。在合适的实施方案中，所述第三重组位点与所述第一或第二重组位点或任何另外的重组位点共有90-98%同一性。
在一个实施方案中，步骤a)制备包含第四插入核酸的基因组多核苷酸，所述第四插入核酸侧接一组相同的第四重组位点，所述第四重组位点具有第四核酸序列，所述第四核酸序列与所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列或任何另外的重组位点的核酸序列共有不超过98%、96%、94%、92%或90%或50%-98%、60%-98%、70%-98%、80%-98%、85%-98%、90-98%、92-98%、94%-98%或96%-98%序列同一性。在合适的实施方案中，所述第四重组位点与所述第一或第二重组位点或任何另外的重组位点共有90-98%同一性。
在一个实施方案中，步骤a)制备包含第五插入核酸的基因组多核苷酸，所述第五插入核酸侧接一组相同的第五重组位点，所述第五重组位点具有第五核酸序列，所述第五核酸序列与所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列、第四核酸或任何另外的重组位点的核酸序列共有不超过98%、96%、94%、92%或90%或50%-98%、60%-98%、70%-98%、80%-98%、85%-98%、90-98%、92-98%、94%-98%或96%-98%序列同一性。在合适的实施方案中，所述第五重组位点与所述第一或第二重组位点或任何另外的重组位点共有90-98%同一性。
在一个实施方案中，步骤a)制备包含第六插入核酸的基因组多核苷酸，所述第六插入核酸侧接一组相同的第六重组位点，所述第六重组位点具有第六核酸序列，所述第六核酸序列与所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列、第四核酸、第五核酸或任何另外的重组位点的核酸序列共有不超过98%、96%、94%、92%或90%或50%-98%、60%-98%、70%-98%、80%-98%、85%-98%、90-98%、92-98%、94%-98%或96%-98%序列同一性。在合适的实施方案中，所述第六重组位点与所述第一或第二重组位点或任何另外的重组位点共有90-98%同一性。
用于设计FRT位点的原理描述于Turan S, Kuehle J, Schambach A, Baum C和Bode J (2010) J. Mol. Biol. 402; 52-69。例如，典型的FRT位点由48个碱基对组成，所述48个碱基对由以下组成：围绕8-bp间隔区的两个反向的13-bp重复区(a’和a)和另外的重复区(b)，其以直接取向与相邻重复区隔开1-bp空位：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
通常将变异引入间隔区序列中。优选地，所述间隔区的AT含量高于75%。优选地，在所述间隔区的位置2、3、4、5、6或7中的至少一个处对所述bp进行改变。优选地，所述间隔区的位置1和8是不变的。优选地，不进行5’ – 多聚嘧啶段的大间插。
在一个实施方案中，步骤a)中制备的基因组多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个插入核酸，其各自侧接相同对的重组位点，其中每对重组位点与其他对重组位点是不同的，例如，特定对重组位点与所述基因组多核苷酸中的任何其他对重组位点共有90%-98%序列同一性。
在一个实施方案中，所述重组位点长度为30-50或40-50个碱基对，优选长度为48个碱基对。在一个实施方案中，所述重组位点被重组酶识别。在一个实施方案中，所述重组酶优选为FLP-重组酶。例如，所述第一和第二重组位点(作为数对，或重组后，作为疤痕)与各其他翻转酶识别靶标(FRT)位点或变体FRT位点是不同的。
在一个实施方案中，所述第一重组位点是具有序列5’-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3’ (SEQ ID NO:1)的FRT位点，且所述第二重组位点是具有SEQ ID NO:2的序列的FRT位点。
在一个实施方案中，所述第一重组位点是具有序列5’-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3’ (SEQ ID NO:1)的FRT位点，且所述第二重组位点是具有SEQ ID NO:3的序列的FRT位点。
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在一个实施方案中，所述第一重组位点是具有SEQ ID NO:10的序列的FRT位点，且所述第二重组位点是具有SEQ ID NO:7的序列的FRT位点。
在一个实施方案中，所述第一重组位点是具有SEQ ID NO:10的序列的FRT位点，且所述第二重组位点是具有SEQ ID NO:8的序列的FRT位点。
在一个实施方案中，所述第一重组位点是具有SEQ ID NO:10的序列的FRT位点，且所述第二重组位点是具有SEQ ID NO:9的序列的FRT位点。
在一个实施方案中，所述第一和第二插入核酸位于所述基因组多核苷酸上，其中所述第一和第二插入核酸之间的距离小于500kb、400kB、300kb、200kb、150kb、100kb、75kb、50kb或25kb。
在一个实施方案中，在步骤b)中，通过将编码FLP-重组酶的基因引入宿主细胞，将所述基因组多核苷酸暴露于所述重组酶。任选地，将编码FLP-重组酶的基因在质粒中在诱导型启动子或组成型启动子的控制下引入所述宿主细胞中。在使用诱导型启动子的情况下，可以合适地使用具有SEQ ID NO:13的核酸序列的质粒pCP20。
在一个实施方案中，编码FLP-重组酶的基因具有与SEQ ID NO:12的序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的核酸序列。在一个实施方案中，所述FLP-重组酶具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述插入核酸编码至少一个选择标记。然而，当至少2、3、4、5或6个插入核酸各自编码选择标记时，本发明的方法是特别有用的。在这些情况下，可以在单一步骤中从基因组多核苷酸除去多个选择标记，而不通过不想要的重组事件除去选择标记之间的DNA的区域。在选择标记位于所述基因组多核苷酸中的彼此的100、75、50、25、10、5或2kb内的情况下，该益处尤其强。
在一个实施方案中，所述基因组多核苷酸来自埃希氏杆菌、奈瑟氏菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌、黄单胞菌(Xhantomonas)、沙门氏菌、耶尔森氏菌、乳球菌、乳杆菌、假单胞菌、棒杆菌、链霉菌、链球菌、葡萄球菌、芽孢杆菌或梭菌物种。然而，清楚的是，本发明的方法可用于从来自任何生物的基因组多核苷酸除去多个插入核酸，所述生物包括真核和原核生物，植物，昆虫，酵母，和哺乳动物生物，包括小鼠，大鼠，兔。在所述基因组多核苷酸来自大肠杆菌的情况下，本发明的方法是合适的。
本发明的一个进一步方面是通过本发明的方法制备的基因组多核苷酸。
在执行本发明的方法之后，重组地操纵所述基因组多核苷酸的至少第一和第二区域，并且在所述对的相同的重组位点之间发生两次核酸缺失。这导致丢失每对一个重组位点和间插核酸。结果是宿主细胞基因组多核苷酸，其包含第一重组工程改造的位点和第二重组工程改造的位点，其中第一单一重组位点与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二单一重组位点与所述第二重组工程改造的区域相邻，其中所述第一和第二重组位点具有与彼此以及与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点的核酸序列共有90-98%同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述第一和第二重组工程改造的区域是宿主细胞基因组的一部分已被除去的区域。在一个实施方案中，所述第一和第二重组工程改造的区域是已插入长度超过20、50、100、250或500个碱基对的额外核酸区段的位点。在一个实施方案中，所述第一和第二重组位点是重组酶(例如FLP重组酶，例如具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的FLP重组酶)的重组位点。
在一个实施方案中，所述第一和第二重组位点长度为30-50或40-50个碱基对，优选长度为48个碱基对。在一个实施方案中，所述第一重组位点具有SEQ ID NO:1-10的核酸序列。如上所概述，设想SEQ ID NO:1-10的重组位点中的任一种可以与SEQ ID NO:1-10的任何其他重组位点一起使用，使得重组在同源对的重组位点之间发生，但不在异源对的重组位点之间发生。优选的组合拥有具有选自SEQ ID NO:1-6的序列的第一重组位点，其与具有选自SEQ ID NO:1-6的序列的第二重组位点组合使用(其中所述第二重组位点不同于所述第一重组位点)。
在一个实施方案中，本发明的方法产生包含宿主细胞基因组多核苷酸的宿主细胞，所述宿主细胞基因组多核苷酸含有第一重组工程改造的区域和第二重组工程改造的区域，其中第一重组位点疤痕与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二重组位点疤痕与所述第二重组工程改造的区域相邻；其中所述第一和第二重组位点疤痕具有不同的多核苷酸序列，所述不同的多核苷酸序列与彼此具有小于98%同一性，且与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点疤痕的多核苷酸序列具有小于98%同一性。
在一个实施方案中，所述第一和第二重组工程改造的区域是宿主细胞基因组的一部分已被除去的区域。在一个实施方案中，所述第一和第二重组工程改造的区域是已插入长度超过20、50、100、250或500个碱基对的额外核酸区段的区域。
在一个实施方案中，所述第一和第二重组位点是重组酶(例如FLP重组酶，例如具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的FLP重组酶)的重组位点。
在一个实施方案中，所述第一和第二重组位点长度为30-50或40-50个碱基对，优选长度为48个碱基对。在一个实施方案中，所述第一重组位点具有SEQ ID NO:1-10的核酸序列。第二重组位点将具有不同的核酸序列，其任选地选自SEQ ID NO:1-10。均具有SEQ IDNO:1-6的第一和第二重组位点的组合是优选的。
在一个实施方案中，所述第一和第二重组位点被隔开小于500千碱基、400千碱基、300千碱基、200千碱基、150千碱基、100千碱基、75千碱基、50千碱基、25千碱基、10千碱基、5千碱基、4千碱基、3千碱基、2千碱基、1千碱基。在所述第一和第二重组位点接近的情况下，如果不遵循本发明的方法，则间插核酸被无意缺失的机会更高。因此，在所述第一和第二重组位点更接近的情况下，本发明的方法更有利。
在一个实施方案中，所述遗传操纵是在大肠杆菌基因组、例如大肠杆菌菌株W3110中。所述遗传操纵任选地涉及除去wca可拉酸(colanic acid)簇，并任选地将其用插入DNA、例如异源聚糖簇替换。所述遗传操纵任选地涉及缺失waaL基因，并任选地将其用pglB基因替换。所述遗传操纵任选地涉及缺失rfb簇的至少一部分，例如rfb O16簇的至少一部分。在一个实施方案中，缺失waaL基因、rfb簇的至少一部分和wca可拉酸簇的至少一部分中的至少1个、2个或全部3个。在一个实施方案中，waaL基因、rfb簇的至少一部分和wca可拉酸簇的至少一部分中的至少1个、2个或全部3个被异源基因(任选地如上所述)替换。
本发明还公开了用于制备糖基化蛋白的方法，其包括以下步骤：
a) 在适用于产生糖基化蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，和
b) 从培养物分离所述糖基化蛋白。
细菌宿主细胞中工程改造的糖基化蛋白的产生可需要多次操纵宿主细胞基因组多核苷酸，以缺失一些宿主细胞基因并并入编码制备设计的糖基化蛋白(例如生物缀合物)所需的蛋白的异源基因。宿主细胞基因组的多次重组操纵可引入会有利地除去的多个遗传标记。因此，本发明的方法特别适用于宿主细胞的构建，所述宿主细胞随后用于产生糖基化蛋白，例如生物缀合物。
本发明的一个进一步方面是包含与至少两个(例如3、4、5、6、7、8、9或10个)重组区域相邻的至少两个(例如3、4、5、6、7、8、9或10个)重组位点疤痕的原核基因组多核苷酸或真核染色体，其中每个重组位点疤痕具有不同的多核苷酸序列。通常，重组位点疤痕的数目等于重组区域的数目。
本发明的一个进一步方面是用于工程改造宿主细胞的方法，其包括以下步骤：
a) 整合第一多核苷酸盒，所述第一多核苷酸盒包括侧接第一对重组位点的第一选择标记；
b) 通过识别所述第一对重组位点的重组酶的作用除去所述第一选择标记；
c) 整合第二多核苷酸盒，所述第二多核苷酸盒包括侧接第二对重组位点的第二选择标记；和
d) 通过识别所述第二对重组位点的重组酶的作用除去所述第二选择标记；
其中所述第一对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第二对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第一和第二对重组位点共有90-98%核酸序列同一性。
在一个实施方案中，步骤b)和步骤d)的重组酶是FLP重组酶，例如具有与SEQ IDNO:7具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的FLP重组酶。
本发明的一个进一步方面是可通过本发明的方法获得的工程改造的宿主细胞。
本专利说明书内引用的所有参考文献或专利申请都通过引用并入本文。
本发明进一步描述于以下段落中：
1. 从宿主细胞中的基因组多核苷酸除去插入核酸的至少两个部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 制备包含第一插入核酸的基因组多核苷酸，所述第一插入核酸侧接一对彼此相同且具有第一核酸序列的相同取向的第一重组位点；
b) 将步骤a)的所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第一重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除所述第一插入核酸和所述第一重组位点之一；
c) 将第二插入核酸插入步骤b)的所述基因组多核苷酸中，所述第二插入核酸侧接一对相同取向的第二重组位点，其中所述第二重组位点彼此相同且具有与所述第一核酸序列共有不超过98%序列同一性的第二核酸序列；和
d) 将步骤c)的所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第二重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除所述第二插入核酸和所述第二重组位点之一，但不除去不侧接相同的重组位点的基因组多核苷酸序列。
2. 用于从宿主细胞中的基因组多核苷酸除去插入核酸的至少两个部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 制备包含至少第一和第二插入核酸的基因组多核苷酸，其中i)所述第一插入核酸侧接彼此相同且具有第一核酸序列的相同取向的第一重组位点，ii)所述第二插入核酸侧接相同取向的第二重组位点，所述第二重组位点彼此相同且具有与所述第一核酸序列共有不超过98%序列同一性的第二核酸序列，且iii)任何另外的重组位点具有与所述第一或第二核酸序列共有不超过98%序列同一性的核酸序列；和
b) 将所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第一和第二重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除侧接相同的重组位点的插入核酸，但不除去不侧接相同的重组位点的基因组多核苷酸序列。
3. 段落1或2的方法，其中所述基因组多核苷酸是原核基因组多核苷酸或质粒。
4. 段落1或2或3的方法，其中所述基因组多核苷酸是真核染色体。
5. 段落1-4中任一项的方法，其中所述第一和第二插入核酸是选择标记。
6. 段落5的方法，其中所述第一和第二插入核酸是选择标记，其编码赋予对氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、壮观霉素或庆大霉素的抗性的蛋白。
7. 段落2-6中任一项的方法，其中步骤a)制备包含第三插入核酸的基因组多核苷酸，所述第三插入核酸侧接一组相同的第三重组位点，所述第三重组位点具有第三核酸序列，所述第三核酸序列与所述第一核酸序列、第二核酸序列或任何另外的重组位点的核酸序列共有不超过98%序列同一性。
8. 段落7的方法，其中步骤a)制备包含第四插入核酸的基因组多核苷酸，所述第四插入核酸侧接一组相同的第四重组位点，所述第四重组位点具有第四核酸序列，所述第四核酸序列与所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列或任何另外的重组位点的核酸序列共有不超过98%序列同一性。
9. 段落8的方法，其中步骤a)制备包含第五插入核酸的基因组多核苷酸，所述第五插入核酸侧接一组相同的第五重组位点，所述第五重组位点具有第五核酸序列，所述第五核酸序列与所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列、第四核酸或任何另外的重组位点的核酸序列共有不超过98%序列同一性。
10. 段落9的方法，其中步骤a)制备包含第六插入核酸的基因组多核苷酸，所述第六插入核酸侧接一组相同的第六重组位点，所述第六重组位点具有第六核酸序列，所述第六核酸序列与所述第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列、第四核酸、第五核酸或任何另外的重组位点的核酸序列共有不超过98%序列同一性。
11. 段落2-5中任一项的方法，其中步骤a)中制备的基因组多核苷酸包含3、4、5、6、7、8、9或10个插入核酸，其各自侧接相同对的重组位点，其中每对重组位点与任何其他对重组位点共有90%-98%序列同一性。
12. 段落1-11中任一项的方法，其中所述重组位点长度为30-50个碱基对，优选长度为48个碱基对。
13. 段落1-12中任一项的方法，其中所述重组位点被重组酶、优选FLP-重组酶识别。
14. 段落1-13中任一项的方法，其中所述第一和第二插入核酸位于所述基因组多核苷酸上，其中所述第一和第二插入核酸之间的距离小于100kb。
15. 段落1-14中任一项的方法，其中所述第一和第二重组位点是翻转酶识别靶标(FRT)位点或变体FRT位点。
16. 段落15的方法，其中所述第一重组位点是具有序列5’-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3’ (SEQ ID NO:1)的FRT位点。
17. 段落15-16中任一项的方法，其中所述第二重组位点是具有SEQ ID NO:2、3、4、5或6中任一者的序列的FRT变体位点。
18. 段落1-17中任一项的方法，其中在步骤b)中，通过将编码FLP-重组酶的基因引入宿主细胞，将所述基因组多核苷酸暴露于所述重组酶。
19. 段落18的方法，其中编码FLP-重组酶的基因具有与SEQ ID NO:12的序列具有至少80%同一性的核酸序列。
20. 段落18的方法，其中所述FLP-重组酶具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
21. 段落18-20中任一项的方法，其中将编码FLP-重组酶的基因在质粒中在诱导型启动子或组成型启动子的控制下引入所述宿主细胞中。
22. 段落21的方法，其中所述质粒含有在诱导型启动子的控制下的FLP-重组酶基因。
23. 段落21的方法，其中所述质粒是pCP20，其具有SEQ ID NO:12的核酸序列。
24. 段落1-23中任一项的方法，其中所述插入核酸编码至少一个选择标记。
25. 段落24的方法，其中至少2、3、4、5或6个插入核酸各自编码选择标记。
26. 段落1-25中任一项的方法，其中所述基因组多核苷酸来自埃希氏杆菌、奈瑟氏菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌、黄单胞菌(Xhantomonas)、沙门氏菌、耶尔森氏菌、乳球菌、乳杆菌、假单胞菌、棒杆菌、链霉菌、链球菌、葡萄球菌、芽孢杆菌或梭菌物种。
27. 段落26的方法，其中所述基因组多核苷酸来自大肠杆菌。
28. 包含通过段落1-27中任一项的方法制备的基因组多核苷酸的宿主细胞。
29. 宿主细胞基因组多核苷酸，其包含第一重组工程改造的区域和第二重组工程改造的区域，其中第一单一重组位点与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二单一重组位点与所述第二重组工程改造的区域相邻，其中所述第一和第二重组位点具有与彼此以及任选地与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点的核酸序列共有90-98%同一性的核苷酸序列。
30. 段落29的宿主细胞基因组多核苷酸，其中所述第一和第二重组工程改造的区域是宿主细胞基因组的一部分已被除去的区域。
31. 段落29或30的宿主细胞基因组多核苷酸，其中所述第一和第二重组工程改造的区域是已插入长度超过20、50、100、200、300、400或500个碱基对的额外核酸区段的区域。
32. 段落29-31中任一项的宿主细胞基因组多核苷酸，其中所述第一和第二重组位点是重组酶的重组位点。
33. 段落32的宿主细胞基因组多核苷酸，其中所述重组酶是FLP重组酶。
34. 段落33的宿主细胞基因组多核苷酸，其中所述FLP重组酶具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
35. 段落29-34中任一项的宿主细胞基因组多核苷酸，其中所述第一和第二重组位点长度为30-50个碱基对，优选长度为48个碱基对。
36. 段落35的宿主细胞基因组多核苷酸，其中所述第一重组位点具有SEQ ID NO:1-10中任一者的核酸序列。
37. 包含宿主细胞基因组多核苷酸的宿主细胞，所述宿主细胞基因组多核苷酸含有第一重组工程改造的区域和第二重组工程改造的区域，其中第一重组位点疤痕与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二重组位点疤痕与所述第二重组工程改造的区域相邻；其中所述第一和第二重组位点疤痕具有不同的多核苷酸序列，所述不同的多核苷酸序列与彼此具有小于98%同一性，且任选地与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点疤痕的多核苷酸序列具有小于98%同一性。
38. 段落37的宿主细胞，其中所述第一和第二重组工程改造的区域是宿主细胞基因组的一部分已被除去的区域。
39. 段落37或38的宿主细胞，其中所述第一和第二重组工程改造的区域是已插入长度超过20、50、100、200、300、400或500个碱基对的额外核酸区段的区域。
40. 段落37-39中任一项的宿主细胞，其中所述第一和第二重组位点是重组酶的重组位点。
41. 段落40的宿主细胞，其中所述重组酶是FLP重组酶。
42. 段落41的宿主细胞，其中所述FLP重组酶具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
43. 段落37-42中任一项的宿主细胞，其中所述第一和第二重组位点长度为30-50个碱基对，优选长度为48个碱基对。
44. 段落43的宿主细胞，其中所述第一重组位点具有SEQ ID NO:1-10中任一者的核酸序列。
45. 段落37-44中任一项的宿主细胞，其中所述第一和第二重组位点被隔开小于100千碱基、75千碱基、50千碱基、25千碱基、10千碱基、5千碱基、4千碱基、3千碱基、2千碱基或1千碱基。
46. 段落45的宿主细胞，其中所述第一和第二重组位点被隔开小于5千碱基。
47. 原核基因组多核苷酸或真核染色体，其包含与至少两个重组工程改造的区域相邻的至少两个重组位点疤痕，其中每个重组位点疤痕具有不同的多核苷酸序列。
48. 用于工程改造宿主细胞的方法，其包括以下步骤：
a) 整合第一多核苷酸盒，所述第一多核苷酸盒包括侧接第一对重组位点的第一选择标记；
b) 通过识别所述第一对重组位点的重组酶的作用除去所述第一选择标记；
c) 整合第二多核苷酸盒，所述第二多核苷酸盒包括侧接第二对重组位点的第二选择标记；和
d) 通过识别所述第二对重组位点的重组酶的作用除去所述第二选择标记；
其中所述第一对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第二对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第一和第二对重组位点共有90-98%核酸序列同一性。
49. 段落48的方法，其中步骤b)和d)的重组酶是FLP重组酶。
50. 段落49的方法，其中所述FLP重组酶具有与SEQ ID NO:11具有至少80%同一性的氨基酸序列。
51. 可通过段落48-50中任一项的方法获得的工程改造的宿主细胞。
52. 工程改造的宿主细胞，其在所述宿主细胞基因组多核苷酸中包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个重组位点的单一拷贝，其中每个重组位点具有与其他重组位点具有小于98%同一性的核苷酸序列。
53. 段落52的工程改造的宿主细胞，其中所述至少2个重组位点是FRT位点。
54. 段落52或权利要求53的工程改造的宿主细胞，其中所述至少2个重组位点在所述宿主细胞基因组多核苷酸中隔开小于100kb、75kb、50kb、25kb、10kb、5kb、3kb或1kb。
55. 工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中天然rfb簇的至少一部分和wca可拉酸簇的至少一部分已被缺失，同时维持所述rfb簇的启动子完整。
56. 段落53的工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中还缺失waaL基因。
57. 段落53或54的工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中所述革兰氏阴性宿主细胞是大肠杆菌。
58. 段落53-55中任一项的工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中天然rfb簇的至少一部分被异源聚糖簇替换。
59. 段落53-56中任一项的工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中所述waaL基因被pglB基因替换。
60. 段落28或37-46或51-59中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞经工程改造以表达a)寡糖基转移酶，例如PglB或PglL；b)异源聚糖簇，例如rfb簇或编码合成荚膜多糖所需的糖基转移酶的基因簇；以及含有被所述寡糖基转移酶识别的糖基化位点、例如WO06/119987 (权利要求1)中公开的优化的共有序列的蛋白。
61. 用于制备糖基化蛋白的方法，其包括以下步骤：
i) 在适用于产生糖基化蛋白的条件下培养段落60的宿主细胞，和
ii) 从培养物分离所述糖基化蛋白。
为了可以更好地理解本发明，阐述以下实施例。这些实施例仅用于举例说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：在菌株构建的场合使用两个替代的FRT对用于肺炎链球菌血清型33F荚膜多糖缀合物产生
菌株stGVXN8661是大肠杆菌W3110的衍生物，其含有几种涉及使用FRTwt的基因组修饰，使得单一FRTwt存在于基因组DNA上与重组事件的位点相邻的三个位置。
使用另外的基因组操纵以从stGVXN8661缺失另外的基因，同时维持基因组的剩余部分完整。需要除去选择标记以允许进一步修饰菌株。
第一步涉及构建pDOC质粒以用于缺失。p3910和p3911如下制备。使用两种 PCR产物和寡核苷酸对，由组装PCR导致，生成插入物，用于将HR2和clmR盒克隆至供体质粒pDOC-C中。使用编码clmR盒和FRTwt位点的寡核苷酸，从pKD3 (GenBank:AY048742.1)生成一种PCR产物，且另一种是衍生自用寡核苷酸PCR W3110基因组DNA的3’同源性区域。使用BamHI/EcoRI切割组装的DNA，并将其克隆至pDOC-C中的相同位点中，产生p482。然后使用W3110染色体DNA和寡核苷酸生成5’同源性区域的PCR产物，用BamHI和SpeI切割，并克隆至p482的SpeI/BamHI位点中，产生p562。将通过使5’-磷酸化的寡核苷酸退火获得的多克隆位点的核苷酸序列经由NheI和BamHI克隆至p562中，产生p1043。侧接两个FRT3位点的卡那霉素抗性盒(kanR)已经由Genewiz LCC合成并克隆至pUC57 (GenBank:Y14837.1)中，产生p3268。来自p3268的含有FRT3-kanR-FRT3的NdeI/BstBI片段已被克隆至p1043中，取代FRTwt-clmR-FRTwt，产生p3602。p1043和p3602的5’同源性区域已通过经由SpeI/NheI克隆新的5’ 1276-bp同源性区域而替换，分别产生p3910和p3911。
p3910和p3911编码5’和3’同源性区域，其在两者之间分别具有MCS和侧接两个FRTwt位点的反向的clmR抗性盒和侧接两个FRT3位点的kanR抗性盒。这些所得的质粒是供体质粒，用于缺失选择的基因组序列，并将它们用FRTwt-clmR-FRTwt或用FRT3-kanR-FRT3替换。
为了缺失，需要辅助质粒。使用pTKRED (GenBank:GU327533.1)的变体p2824。
缺失和选择。已对菌株stGVXN8661实施两种平行缺失程序。两种程序对于使用p3910或p3911作为供体质粒以及对于应用于选择的抗性而不同：当使用p3910时为氯霉素，且当使用p3911时为卡那霉素。菌株stGVXN8661经由电穿孔用p2824和供体质粒共转化。由于p2824的温度敏感的复制表型，使所得的细胞始终在30℃下分别在补充有壮观霉素(用于选择p2824)和补充有氯霉素或卡那霉素(用于选择p3910和p3911)的LB中生长。将质粒插入受体细胞中，以使得能够在同一细胞内存在供体质粒DNA的情况下表达在辅助质粒上编码的酶。
接下来，进行插入程序。使新鲜转化的菌株在TSB培养基中在氨苄青霉素和壮观霉素存在的情况下在30℃下以5 ml规模以180 rpm生长过夜。将50 μl的致密培养物转移至含有1 ml补充有壮观霉素和氯霉素或卡那霉素的TSB的新管中。然后使新的培养物在30℃下以180 rpm生长2小时，将细胞在4℃下以4000 rpm离心15分钟，并将上清液替换为补充有spec、0.2%阿拉伯糖(w/v)和1 mM IPTG的TSB培养基。培养基组成支持辅助质粒选择，以及重组酶和SceI核酸内切酶表达以使得能够插入。将细胞重悬浮，并在30℃下以180rpm进一步孵育3小时。使用50μl的那些培养物来接种1ml补充有0.2%阿拉伯糖(w/v)和1 mM IPTG的TSB，使其在30℃下以180 rpm生长过夜。在该步骤中没有抗性增强辅助质粒的丢失。
将0.5 ml培养物铺板在补充有clm或kan(这取决于所用的供体质粒)(用于DNA插入物的选择)和10% (w/v)蔗糖(以针对供体质粒反选择)的TSB板上，并在37℃下孵育过夜(以选择温度敏感的辅助质粒的丢失)。
对于两种程序都出现细胞菌苔(lawn)。在补充有clm或kan(其取决于所用的供体质粒)的TSB板上划条纹，且再次在37℃下孵育过夜。
为了针对正确的插入表型筛选所得菌落，将来自划条纹的单一菌落复制铺板至补充有spec、amp或clm的LB板上(当使用p3910时)或复制铺板至补充有spec、amp或kan的LB板上(当使用p3911时)。针对所述插入进一步分析对clm或kan有抗性(对于插入物的存在)、但对amp和spec敏感(对于供体和辅助质粒的不存在)的菌落。
为了证实该菌株丢失被替换的源自W3110的DNA并含有DNA插入物，进行菌落PCR。挑选具有正确表型的候选菌落，并经历菌落PCR测试。执行三种PCR。i)仅在重组正确发生的情况下，一种PCR才扩增插入的DNA的5’的区域。使用的寡核苷酸是用于与p3910整合的4897/3233和用于与p3911整合的4897/4363。ii)仅在重组正确发生的情况下，一种PCR才扩增插入的DNA的3’的区域。使用的寡核苷酸是用于与p3910整合的3315/3208和用于与p3911整合的4364/3208。iii)一种PCR扩增已被取代的基因组区域，意味着正确修饰的菌株不应产生任何产物，而未修饰的菌株则应产生。使用的寡核苷酸是3213/3208。来自两种整合的各个克隆显示正确的PCR模式(PCR i和ii阳性，PCR iii阴性)。当将p3910用作供体质粒时，将所得菌株命名为st8661 Δ::FRTwt-clmR-FRTwt(st10851)，且当将p3911用作供体质粒时，将所得菌株命名为st8661 Δ::FRT3-kanR-FRT3 (st10852)。
接下来的步骤是从整合的菌株除去抗生素抗性以获得wbbIL的“无标记”缺失。用表达FLP重组酶的温度敏感的pCP20质粒[1]转化两种获得的菌株，并铺板在补充有氨苄青霉素的LB板上以选择pCP20。将板在30℃下孵育过夜，以允许质粒复制。用来自板的条纹接种5 ml LB培养物，并在42℃下生长过夜，以确保pCP20的丢失。将来自过夜培养物的系列稀释液铺板在LB板上。当衍生自st8661 Δ::FRTwt-clmR-FRTwt时，将单一菌落复制在补充有氨苄青霉素、氯霉素或无抗生素的LB板上，或者当衍生自st8661 Δ::FRT3-kanR-FRT3时，将单一菌落复制在补充有氨苄青霉素、卡那霉素或无抗生素的LB板上。在两种情况下，100%的菌落仅在没有抗生素的板上生长，表明在两种情况下，抗性盒被pCP20编码的FLP重组酶除去。
为了理解FLP-除去的DNA是否限于FRT-侧接的插入的抗性盒，实施菌落PCR。如果除去抗性并且存在边界区域，则使用的寡核苷酸4897/2174产生2781-bp产物。如果新插入的FRT和上游wca基因座中存在的FRTwt之间的区域丢失，则预期没有条带。仅当从Δ::FRT3-kanR-FRT3除去抗性时才观察到正确的条带，表明wca基因座的FRTwt位点和新引入的FRT3之间未发生FRT交叉反应性。相反，当引入FRTwt时，与wca基因座中存在的其他FRTwt位点的交叉反应性引起两个位点之间的基因组物质的丢失。由来自st8661 Δ::FRT3-kanR-FRT3 (st10852)的卡那霉素抗性盒产生的菌株被命名为st10853。
为了检查菌株st10852和st10853的Sp33F糖缀合物的产生是否与在st8661中观察到的相当，已经实施以下实验。菌株st8661、st10852和st10853已经由电穿孔用质粒3914和用质粒3750转化，所述质粒3914编码载体蛋白、来自大肠杆菌K30的rcsA、链长调节子wzy，都在IPTG-诱导型启动子之下，且所述质粒3750编码组成型表达的基因wchA，以及33F簇的wciB至wzy的基因。将生产细胞接种至5 ml补充有10 mM MgCl2、壮观霉素和四环素的TB-dev培养基中，并在37℃下生长过夜至稳定相。然后将细胞在50 ml含有10 mM MgCl2、壮观霉素、四环素和0.01 mM IPTG的TBdev中稀释至0.05的OD600。6小时后，将0.09 IPTG添加至培养物中，然后使其在37℃下生长过夜。IPTG驱动表达p3814中编码的元件(包括载体蛋白和rcsA，其驱动wca基因座中的33F荚膜多糖簇的表达)和基因组-整合的pglB。然后通过离心收集细胞，并使用溶菌酶方法制备周质细胞提取物[2]。通过SDS PAGE分离周质提取物(归一化为OD600)，并在电转移后通过免疫印迹进行分析(图1)。对于所有样品，用抗His抗血清(左小图)和抗33F抗血清(右小图)进行检测均显示70至170 kDa之间的清楚的梯样模式，强烈指示由载体蛋白和33F多糖组成的糖蛋白。从st10852和从st10853获得的糖缀合物的量和质量与在st8661中观察到的相当。这表明缺失区域上游的基因仍然存在且有活性。
菌株st10853已经用于生物反应器-规模的33F生物缀合物生产。此外，该菌株的基因组已经由类似程序进行进一步修饰，并且已获得最终的无抗性菌株。
实施例2：关于使用替代FRT位点用于同时切除邻近抗性盒的系统性研究
已经构建一系列大肠杆菌W3110衍生物，其仅在替代FRT序列的存在方面不同。首先，O16 rfb簇已经以取代簇的相同取向被庆大霉素抗性盒gntR替换，随后是处于相反取向且被封闭在两个FRTwt位点之间的氯霉素抗性盒clmR。其次，已经实施六次平行的同源重组，以便用卡那霉素抗性盒kanR以替换簇的相反取向替换可拉酸wca簇，所述卡那霉素抗性盒kanR被封闭在两个FRTwt、FRT3、FRT10、FRT13、FRT14和FRT15位点之间，分别产生菌株10175、10176、10177、10178、10179和10180。
六种菌株能够在含有卡那霉素、庆大霉素和氯霉素的培养基中生长。图2描述六种菌株中的wca和rfb基因座的遗传组构。
为了评估FRTwt位点与替代FRT位点的交叉反应性的程度，已将抗性盒除去方案应用于六种菌株。用表达FLP重组酶的温度敏感的pCP20质粒[1]转化所述菌株，并铺板在补充有氨苄青霉素的LB板上以选择pCP20。将板在30℃下孵育过夜，以允许质粒复制。用来自板的条纹接种5 ml LB培养物，并在37℃下经周末生长，以确保pCP20的丢失。将来自致密培养物的系列稀释液铺板在LB板上。将每个重组60个单一菌落复制在补充有氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、庆大霉素或无抗生素的LB板上，并在37℃下生长过夜。
在侧接氯霉素盒的FRT位点和侧接卡那霉素抗性盒的FRT位点之间的交叉反应的情况下，预期针对卡那霉素、庆大霉素和氯霉素的抗性的丢失。在缺乏交叉反应性的情况下，应当保留庆大霉素抗性，而应当丢失卡那霉素和氯霉素抗性。卡那霉素抗性的持久性可以用侧接相应盒的FRT位点的次优效率来解释。氯霉素抗性的持久性可以通过FRTwt对的次优效率或通过保留pCP20(其为氨苄青霉素和氯霉素两者抗性的)来解释。在最后的情况下，预期氨苄青霉素抗性的相伴持久性。
观察复制的克隆的抗性模式，并概述于表1中。通常，已经观察到五种不同的表型模式，忽略氨苄青霉素抗性情况：模式A：该克隆对卡那霉素、庆大霉素和氯霉素有抗性，表明FLP重组酶对两个FRT对的活性完全缺乏；模式B：没有抗性留下，表明两个FRT对之间的非特异性交叉反应；模式C：对卡那霉素和庆大霉素的抗性，表明FLP重组酶对侧接kanR的FRT对的缺陷活性；模式D：对氯霉素和庆大霉素的抗性，表明FLP重组酶对侧接clmR的FRTwt对的缺陷活性，或kanR和clmR的正确特异性除去，而在侧接clmR和kanR的FRT对之间没有交叉反应，但具有质粒pCP20的持久性；模式E：仅对庆大霉素的抗性，表明kanR和clmR的正确特异性除去，而侧接clmR和kanR的FRT对之间没有交叉反应。
表1. 在六种不同菌株中FLP-介导的抗性除去后观察到的抗性模式。
Figure 726345DEST_PATH_IMAGE002
a) 仅留下庆大霉素盒的菌落的百分比。
当使用菌株10178(其中kanR侧接FRT13位点)时，仅对一个克隆观察到模式A(未除去抗性)。几乎仅对于菌株10175观察到模式B(除去所有抗性)，其中kanR侧接FRTwt，代表从该菌株除去抗性的克隆的93%。唯一的例外是衍生自菌株10178的一个克隆，其中FRT13侧接kanR。对于所有替代FRT位点侧接kanR的菌株，始终在超过50%的情况下观察到模式E(仅留下庆大霉素抗性)，而仅衍生自菌株10175 (FRTwt侧接clmR和kanR两者)的克隆的7%显示该模式。当FRT10、FRT13和FRT15侧接kanR时，在很少情况下观察到模式C(留下卡那霉素和庆大霉素抗性)。这可能表明FLP重组酶在对这些特异性FRT位点的作用中的效率稍差。当FRT3、FRT10、FRT13和FRT14侧接kanR时，在许多情况下观察到模式D(留下庆大霉素和氯霉素抗性)。除了衍生自st10176 (FRT3)的一个克隆，所有呈现模式D的克隆也都是氨苄青霉素抗性的，表明氯霉素-抗性表型很可能是由于pCP20的持久性而不是由于clmR的除去缺陷。
这些结果显示，相邻FRTwt对之间的DNA的丢失的可能性高(93%的情况)，而如果两个FRTwt对之一被一对替代FRT位点替换，则可能性显著降低。当任何替代FRT位点侧接kanR时，仅300例中的1例中观察到庆大霉素抗性的切除，强调FLP-催化反应的特异性。可以从表型推断当已使用替代FRT位点时的正确遗传模式(仅剩余庆大霉素盒)的百分比。表型模式E仅可用其中发生两个盒的正确特异性除去的遗传情形来解释，而表型模式D可以通过相同(仅当还存在氨苄青霉素抗性时)或通过缺乏clmR的切除来解释。因此，属于表型模式E的克隆代表其中clmR和kanR两者均正确特异性除去而不丢失gntR的克隆的最小可能数目，而属于模式E + D的克隆代表其中存在这种遗传组构的克隆的最大可能数目。表1概述考虑这些考量的具有正确遗传模式的克隆的百分比。
为了证实FLP-介导的抗性除去后所述簇的遗传组构，对于每种测试菌株，已经对属于不同表型模式的选择克隆实施菌落PCR。如果未除去任何抗性，则寡核苷酸3206/3208的使用产生7922-bp产物；如果已除去两个FRT位点之间的整个基因组区域，则产生3388-bp产物；如果仅切除clmR，则产生6990-bp产物；如果仅除去kanR，则产生6550-bp产物，且如果实现其中仅留下gntR的想要的模式，则产生5618-bp产物。属于模式D的所有测试克隆都显示对应于clmR和kanR两者的切除、而不对应于仅kanR的切除的条带。对于显示明确的抗性模式(A、B、C或E)的克隆观察到的产物长度对应于唯一可能的推断遗传模式，具有以下例外。测定衍生自其中FRTwt侧接clmR和kanR两者的菌株的显示模式E的四个克隆中的两个，但未观察到PCR产物。测试来自菌株10179(FRT14)的属于模式E的四个克隆，并且其中之一未显示任何PCR产物。当已使用替代FRT位点时属于模式A的唯一菌落衍生自携带FRT13的菌株，并且显示长度与仅除去clmR相符合的产物(6990 bp)，而不是当不除去抗性时在对照中观察到的预期的7922-bp条带。衍生自具有FRT13的菌株的一个克隆显示表型模式C，但PCR反而显示长度对应于clmR和kanR两者的除去的条带(图3)。
具有模式B的衍生自仅携带FRTwt的菌株的一个克隆，具有模式E的衍生自携带FRT3的菌株的一个克隆，具有模式E的衍生自携带FRT10的菌株的一个克隆，具有模式C的衍生自携带FRT10的菌株的一个克隆，具有模式E的衍生自携带FRT13的菌株的一个克隆，具有模式B的衍生自携带FRT13的菌株的一个克隆，具有模式E的衍生自携带FRT14的菌株的一个克隆，以及具有模式E的衍生自携带FRT15的菌株的一个克隆已被储存并分别命名为10247、10248、10249、10250、10251、10252、10253、10254。对于这8种菌株，已经分离基因组并且已经实施使用寡核苷酸3206/3208的PCR。PCR产物已被纯化和测序。获得的产物长度(图4)和获得的测序结果进一步证实预期的基因组组构。在当使用替代FRT位点(FRT13，菌株10525)时观察到两个FRT对之间的基因组物质的完全除去的唯一菌株中，留下的唯一FRT位点是FRTwt。
该实验证明，使用替代FRT位点是用于从与已经存在的FRTwt位点相邻的基因组区域切除抗性盒而不丢失封闭的DNA的有效且有效率的方法。
实施例3：在菌株开发期间使用替代FRT位点用于进一步产生肺炎链球菌血清型荚膜多糖缀合物
菌株stGVXN9876是大肠杆菌W3110的衍生物，其含有几种涉及使用FRTwt的基因组修饰，使得单一拷贝的FRTwt存在于基因组DNA上与重组事件的位点相邻的三个位置。
基因组操纵的目的是添加数拷贝的来自肺炎链球菌聚糖簇的糖基转移酶和来自空肠弯曲杆菌(C. jejuni)的gne差向异构酶。
第一步涉及构建pDOC质粒以用于替换。p3408如下制备。通过使用寡核苷酸从大肠杆菌W3110基因组获得5’同源性区域的PCR产物(含有wca簇的第一基因wza上游的1.2 kb)，并克隆至pDOC-C的EcoRI/XhoI位点中，产生p693。使用寡核苷酸从大肠杆菌W3110基因组获得3’同源性区域的PCR产物(含有wca簇的最后基因wcaM下游的1.2 kb)，并克隆至p693的BcuI/NheI位点中，产生p699。将多克隆位点克隆至p699的AscI/BamHI位点中，产生p3259。质粒3914作为基因合成服务获得自Genewiz LCC。将含有侧接两个FRT13位点的卡那霉素抗性盒kanR的用寡核苷酸4110/4111的来自p3914的PCR产物克隆至p3259的HindIII位点中，产生p3306。质粒3256编码编码源自对肺炎链球菌聚糖簇的PCR的肺炎链球菌糖基转移酶的基因，其在合成启动子J23114的控制下，且随后是转录终止子rrnb T2。将该表达盒扩增并以相对于kanR相反的方向克隆至p3375的PacI/XmaI位点中。编码先前从空肠弯曲杆菌基因组扩增的gne的质粒207用作PCR的模板。所得的扩增子含有合成的启动子J23100，其在gne上游添加一个寡核苷酸，并将其克隆至p3375的SbfI/XmaI位点中，产生p3408。
p3408编码用于插入wca簇中的5’和3’同源性区域，以及在它们之间呈相反取向的以下元件：J23114启动子、肺炎链球菌糖基转移酶基因、rrnb T2终止子、J23100启动子、gne。
为了替换，将菌株9876经由电穿孔用pTKRED (GenBank:GU327533.1)和供体质粒p3408共转化。由于pTKRED的温度敏感的复制表型，使所得的细胞始终在30℃下在补充有壮观霉素(用于选择pTKRED)和补充有卡那霉素(用于选择p3408)的LB中生长。将质粒插入受体细胞中，以使得能够在同一细胞内存在供体质粒DNA的情况下表达在辅助质粒上编码的酶。
接下来，进行插入程序。使新鲜转化的菌株在TSB培养基中在卡那霉素和壮观霉素存在的情况下在30℃下以5 ml规模以180 rpm生长过夜。将50 μl的致密培养物转移至含有1 ml补充有壮观霉素和卡那霉素的TSB的新管中。然后使新的培养物在30℃下以180 rpm生长2小时，将细胞在4℃下以4000 rpm离心15分钟，并将上清液替换为补充有spec、0.2%阿拉伯糖(w/v)和1 mM IPTG的TSB培养基。培养基组成支持辅助质粒选择，以及重组酶和SceI核酸内切酶表达以使得能够插入。将细胞重悬浮，并在30℃下以180rpm进一步孵育3小时。将0.5 ml培养物铺板在补充有kan(用于DNA插入物的选择)和10% (w/v)蔗糖(以针对供体质粒反选择)的TSB板上，并在37℃下孵育过夜(以选择温度敏感的辅助质粒的丢失)。细胞菌苔出现。在补充有kan的TSB板上进行划条纹，并在37℃下孵育过夜。
为了针对正确的插入表型筛选所得菌落，将来自划条纹的单一菌落复制铺板至补充有spec、amp或kan的LB板上。针对所述插入进一步分析对kan有抗性(对于插入物的存在)、但对amp和spec敏感(对于供体和辅助质粒的不存在)的菌落。
为了证实该菌株丢失被替换的源自W3110的DNA并含有DNA插入物，进行菌落PCR。挑选具有正确表型的候选菌落，并经历菌落PCR测试。执行两种PCR。i)一种PCR使用寡核苷酸3206/4195，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的5’的区域。ii)一种PCR使用寡核苷酸3081/3957，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的3’的区域。来自整合的各个克隆显示正确的PCR模式(PCR i和ii阳性)。将所得菌株命名为st10084。
接下来的步骤是从整合菌株除去抗生素抗性。用表达FLP重组酶的温度敏感的pCP20质粒[1]转化菌株10084，并铺板在补充有氨苄青霉素的LB板上以选择pCP20。将板在30℃下孵育过夜，以允许质粒复制。用来自板的条纹接种5 ml LB培养物，并在42℃下生长过夜，以确保pCP20的丢失。将来自过夜培养物的系列稀释液铺板在LB板上。在补充有氨苄青霉素、卡那霉素或无抗生素的LB板上复制60个单一菌落。所有菌落都在无抗生素的板上生长，5个菌落在卡那霉素板上生长(未切除抗性盒)，14个菌落在氨苄青霉素板上生长(保留pCP20)。
为了证实卡那霉素抗性的丢失是由于所述盒的切除，并且除了卡那霉素抗性盒以外没有丢失任何基因组物质，实施菌落PCR。使用寡核苷酸3081和3957：i. 如果除去卡那霉素盒且未除去毗邻FRT位点的DNA，则预期1513-bp条带；ii. 如果未除去卡那霉素盒，则预期2879-bp条带；iii. 如果FRT13位点和rfb O16基因座中存在的FRTwt位点之间的DNA区域已被环出，则预期无PCR产物。
通过菌落PCR测试具有正确抗性模式(无氨苄青霉素和卡那霉素抗性)的12个菌落，并且如果切除卡那霉素抗性盒并且FRT13和FRTwt位点之间的DNA是完整的，则它们全部显示预期的1513-bp条带。作为对照，抗性除去之前的菌株显示预期的2879-bp条带。
使用两个替代的FRT位点对(用于wca基因座替换的FRT13，用于rfb基因座替换的FRTwt)允许获得双重无标记整合而不丢失这两个相邻基因座中的DNA。将所得菌株命名为10085。
实施例4：使用替代的FRT位点在已经含有单一FRTwt拷贝的菌株中引入另外的重组变化
菌株stLMTB11280是大肠杆菌W3110的衍生物，其含有几种涉及使用FRTwt的基因组修饰，使得数拷贝的FRTwt存在于基因组DNA上与重组事件的位点相邻的多个位置。存在两个单一拷贝的FRTwt，以及侧接氯霉素抗性盒的一对FRTwt序列。
实施另外的基因组操纵以在基因组中添加一个拷贝的工程改造簇。
供体pDOC质粒pLMTB4184编码5’和3’同源性区域，用于替换O16抗原簇的rfbD至wbbL的基因。在它们之间，以相同的取向，编码七个目标基因的转录单元，随后为卡那霉素抗性盒，其以相反的取向侧接两个FRT3位点。
为了替换，将菌株11280经由电穿孔用pTKRED (GenBank:GU327533.1)和供体质粒p4184共转化。由于pTKRED的温度敏感的复制表型，使所得的细胞始终在30℃下在补充有10mM MgCl2、壮观霉素(用于选择pTKRED)和补充有卡那霉素(用于选择p4184)的TSB中生长。将质粒插入受体细胞中，以使得能够在同一细胞内存在供体质粒DNA的情况下表达在辅助质粒上编码的酶。
接下来，进行插入程序。使新鲜转化的菌株在TSB培养基(10 mM MgCl2)中在卡那霉素和壮观霉素存在的情况下在30℃下以5 ml规模以180 rpm生长过夜。将50 μl的致密培养物转移至含有1 ml补充有壮观霉素和卡那霉素的TSB的新管中。然后使新的培养物在30℃下以180 rpm生长2小时，将细胞在4℃下以4000 rpm离心15分钟，并将上清液替换为补充有kan、10 mM MgCl2、0.2%阿拉伯糖(w/v)和1 mM IPTG的TSB培养基。培养基组成支持辅助质粒选择，以及重组酶和SceI核酸内切酶表达以使得能够插入。将细胞重悬浮，并在30℃下以180rpm进一步孵育4小时。将细胞在4℃下以4000 rpm离心15分钟，并新重悬浮于1 mLTSB (MgCl2、0.2% ara、1 mM IPTG)中，并在30℃下进一步孵育1 h。然后将致密培养物铺板在补充有kan(用于DNA插入物的选择)和10% (w/v)蔗糖(以针对供体质粒反选择)的TSB板上，并在37℃下孵育过夜(以选择温度敏感的辅助质粒的丢失)。细胞菌苔出现。在补充有kan和10% (w/v)蔗糖的TSB板上进行划条纹，并在37℃下孵育过夜。
为了针对正确的插入表型筛选所得菌落，将来自划条纹的单一菌落复制铺板至补充有spec、amp或kan的LB板上。针对所述插入进一步分析对kan有抗性(对于插入物的存在)、但对amp和spec敏感(对于供体和辅助质粒的不存在)的菌落。
为了证实该菌株丢失被替换的源自W3110的DNA并含有DNA插入物，进行菌落PCR。挑选具有正确表型的候选菌落，并经历菌落PCR测试。执行三种PCR。i)一种PCR使用寡核苷酸2449/5210，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的5’的区域。ii)一种PCR使用寡核苷酸546/1237，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的3’的区域。iii)一种PCR使用寡核苷酸3454/3455，其仅当靶标基因座未被修饰时才得到产物，意指重组不成功。来自所述整合的各个克隆显示正确的PCR模式(PCR i和ii阳性，PCR iii阴性)。将所得菌株命名为stLMTB11339。
接下来的步骤是从整合菌株除去氯霉素(ECA簇)和卡那霉素的抗生素抗性。用表达FLP重组酶的温度敏感的pCP20质粒[1]转化菌株11339，并铺板在补充有氨苄青霉素的LB板上以选择pCP20。将板在30℃下孵育过夜，以允许质粒复制。用来自板的条纹接种5 ml LB培养物，并在42℃下生长过夜，以确保pCP20的丢失。将来自过夜培养物的系列稀释液铺板在LB板上。在补充有氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或无抗生素的LB板上复制60个单一菌落。9个菌落在无抗生素的板上不生长，没有菌落在卡那霉素板上生长，15个菌落在氯霉素上生长(未切除ECA中的抗性盒)，19个菌落在氨苄青霉素板上生长(保留pCP20)。总共41个菌落显示正确的抗性模式(仅在无抗生素的LB板上生长)。
为了证实抗性的丢失是由于所述盒的切除，并且除了所述抗性盒以外没有丢失任何基因组物质，实施两种菌落PCR。1)卡那霉素盒除去。使用寡核苷酸3376和1265：i. 如果除去卡那霉素盒且未除去毗邻FRT位点的DNA，则预期900-bp条带；ii. 如果未除去卡那霉素盒，则预期1945-bp条带；iii. 如果FRT3位点和wca基因座中存在的FRTwt位点之间的DNA区域已被环出，则预期无PCR产物。2)氯霉素盒除去。使用寡核苷酸3376和3495：i. 如果除去氯霉素盒且未除去毗邻FRT位点的DNA，则预期2023-bp条带；ii. 如果未除去氯霉素盒，则预期2991-bp条带。
通过菌落PCR测试具有正确抗性模式(无氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素抗性)的8个菌落，并且如果切除卡那霉素抗性盒并且FRT13和FRTwt位点之间的DNA是完整的，则它们全部显示预期的900-bp条带。8个菌落中的仅4个显示从氯霉素盒除去预期的2023-bp条带，而其他4个在PCR中未给出信号。作为对照，抗性除去之前的菌株分别对于氯霉素和卡那霉素盒显示预期的2991和1945-bp条带。
使用两个替代的FRT位点对(用于wca基因座替换的FRT13，用于rfb基因座替换的FRTwt)允许获得双重无标记整合而不丢失这两个相邻基因座中的DNA。此外，使用两种不同的选择标记允许同时从wec ECA簇切除氯霉素抗性盒和从rfb O16簇切除卡那霉素抗性盒。将所得菌株命名为11340。
实施例5：通过使用替代的FRT位点制备没有不想要的遗传元件的菌株。
菌株stLMTB10502是大肠杆菌W3110的衍生物，其中以下基因已被缺失：i. waaL，其被一个FRTwt位点替换；ii. 从rfbD至wbbL的rfb O16簇，其被一个FRT3位点替换。
基因组操纵的目的是缺失wca可拉酸簇，同时维持上述簇和rfbD基因(rfb O16簇的第二个基因)之间的短基因组区域(2525 bp)完整，使得没有不想要的糖簇的菌株可以用作进一步同源重组的起点。可拉酸和O16抗原簇之间的基因组区域的维持是根本的，因为i.其含有用于表达插入的元件的O16抗原簇的启动子，和ii. 当维持同源区域时，可以通过使用供体pDOC用于O16抗原簇替换来进一步修饰该菌株。
供体pDOC质粒pLMTB3385编码5’和3’同源性区域，用于替换可拉酸簇的wcaM至wza的基因。在它们之间，以相反的取向，卡那霉素抗性盒侧接两个FRT15位点。
为了替换，将菌株11502经由电穿孔用pTKRED (GenBank:GU327533.1)和供体质粒p3385共转化。由于pTKRED的温度敏感的复制表型，使所得的细胞始终在30℃下在补充有壮观霉素(用于选择pTKRED)和补充有卡那霉素(用于选择p3385)的TSB中生长。将质粒插入受体细胞中，以使得能够在同一细胞内存在供体质粒DNA的情况下表达在辅助质粒上编码的酶。
接下来，进行插入程序。使新鲜转化的菌株在TSB培养基中在卡那霉素和壮观霉素存在的情况下在30℃下以5 ml规模以180 rpm生长过夜。将50 μl的致密培养物转移至含有1 ml补充有壮观霉素和卡那霉素的TSB的新管中。然后使新的培养物在30℃下以180 rpm生长2小时，将细胞在4℃下以4000 rpm离心15分钟，并将上清液替换为补充有kan、10 mMMgCl2、0.2%阿拉伯糖(w/v)和1 mM IPTG的TSB培养基。培养基组成支持辅助质粒选择，以及重组酶和SceI核酸内切酶表达以使得能够插入。将细胞重悬浮，并在30℃下以180rpm进一步孵育4小时。将细胞在4℃下以4000 rpm离心15分钟，并新重悬浮于1 mL TSB (MgCl2、0.2% ara、1 mM IPTG)中，并在30℃下进一步孵育1 h。然后将致密培养物铺板在补充有kan(用于DNA插入物的选择)和10% (w/v)蔗糖(以针对供体质粒反选择)的TSB板上，并在37℃下孵育过夜(以选择温度敏感的辅助质粒的丢失)。细胞菌苔出现。在补充有kan和10% (w/v)蔗糖的TSB板上进行划条纹，并在37℃下孵育过夜。
为了针对正确的插入表型筛选所得菌落，将来自划条纹的单一菌落复制铺板至补充有spec、amp或kan的LB板上。针对所述插入进一步分析对kan有抗性(对于插入物的存在)、但对amp和spec敏感(对于供体和辅助质粒的不存在)的菌落。60个测试的克隆中的11个具有正确的模式，而剩余显示氨苄青霉素抗性的持久性。
为了证实该菌株丢失被替换的源自W3110的DNA并含有DNA插入物，进行菌落PCR。挑选具有正确表型的候选菌落，并经历菌落PCR测试。执行三种PCR。i)一种PCR使用寡核苷酸3206/4363，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的5’的区域。ii)一种PCR使用寡核苷酸4364/3975，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的3’的区域。iii)一种PCR使用寡核苷酸3872/3957，其仅当靶标基因座未被修饰时才得到产物，意指重组不成功。来自所述整合的所有克隆都显示正确的PCR模式(PCR i和ii阳性，PCR iii阴性)。将所得菌株命名为stLMTB10605。
接下来的步骤是从整合菌株除去卡那霉素抗性盒。用表达FLP重组酶的温度敏感的pCP20质粒[1]转化菌株10605，并铺板在补充有氨苄青霉素的LB板上以选择pCP20。将板在30℃下孵育过夜，以允许质粒复制。用来自板的条纹接种5 ml LB培养物，并在42℃下生长过夜，以确保pCP20的丢失。将来自过夜培养物的系列稀释液铺板在LB板上。在补充有氨苄青霉素、卡那霉素或无抗生素的LB板上复制10个单一菌落。2个菌落显示正确的抗性模式(仅在无抗生素的LB板上生长)，并且它们已经在菌落PCR中进行测试。
为了证实抗性的丢失是由于所述盒的切除，并且除了所述抗性盒以外没有丢失任何基因组物质，使用寡核苷酸3206和3957实施一种菌落PCR，所述寡核苷酸3206和3957在侧接卡那霉素抗性的FRT15位点外部退火。如果除去卡那霉素盒且未除去毗邻FRT位点的DNA，则预期423-bp条带；如果未除去卡那霉素盒，则预期2862-bp条带；如果FRT15位点和rfb基因座中存在的FRT3位点之间的DNA区域已被环出，则预期无PCR产物。两个测试的菌落均显示从正确盒除去预期的模式。
使用两个替代的FRT位点对(用于wca基因座替换的FRT15，用于rfb基因座替换的FRT3)允许获得双重无标记缺失而不丢失这两个相邻基因座中的DNA。这是FRT3和FRT15位点之间缺乏交叉反应性的第一个证据。将所得菌株命名为10651。
后来已分别从菌株10651起源的菌株10739和10740除去整个或部分(wzzE至wecG)ECA wca簇，所述菌株10739和10740可以用作用于开发糖-特异性生物缀合物生产衍生物的一般起始菌株。
实施例6：在菌株开发期间使用替代FRT位点以允许同源基因簇的整合
菌株stLMTB10739用作起始菌株，用于整合两个高度同源的基因簇。
在第一遗传操纵中，wca可拉酸簇被异源聚糖簇替换。供体pDOC质粒pLMTB2941编码5’和3’同源性区域，用于替换wca簇。在它们之间，以相同的取向，异源基因簇，随后为氯霉素抗性盒，其以相反的取向侧接两个FRTwt位点。
为了替换，将菌株10739经由电穿孔用pTKRED (GenBank:GU327533.1)和供体质粒p2941共转化。由于pTKRED的温度敏感的复制表型，使所得的细胞始终在30℃下在补充有壮观霉素(用于选择pTKRED)和补充有氨苄青霉素(用于选择p2941)的TBdev中生长。将质粒插入受体细胞中，以使得能够在同一细胞内存在供体质粒DNA的情况下表达在辅助质粒上编码的酶。
接下来，进行插入程序。使新鲜转化的菌株在TBdev培养基中在氯霉素和壮观霉素存在的情况下在30℃下以5 ml规模以180 rpm生长过夜。将50 μl的致密培养物转移至含有2 ml补充有壮观霉素和氯霉素的TBdev的新管中。然后使新的培养物在30℃下以180 rpm生长3小时，将细胞在4℃下以4000 rpm离心5分钟，并将上清液替换为2 mL补充有spc、0.2%阿拉伯糖(w/v)和1 mM IPTG的TBdev培养基。培养基组成支持辅助质粒选择，以及重组酶和SceI核酸内切酶表达以使得能够插入。将细胞重悬浮，并在30℃下以180rpm进一步孵育4小时。将细胞在4℃下以4000 rpm离心5分钟，并新重悬浮于2 mL TBdev中，并在37℃下进一步孵育1 h。然后将致密培养物铺板在补充有clm(用于DNA插入物的选择)和10% (w/v)蔗糖(以针对供体质粒反选择)的TBdev板上，并在37℃下孵育过夜(以选择温度敏感的辅助质粒的丢失)。细胞菌苔出现。在补充有kan和10% (w/v)蔗糖的TSB板上进行划条纹，并在37℃下孵育过夜。
为了针对正确的插入表型筛选所得菌落，将来自划条纹的120个单一菌落复制铺板至补充有spec、amp或clm的LB板上。针对所述插入进一步分析对clm有抗性(对于插入物的存在)、但对amp和spec敏感(对于供体和辅助质粒的不存在)的菌落。120个菌落中的119个对clm有抗性，并且对amp和spec敏感。
为了证实该菌株丢失被替换的源自W3110的DNA并含有DNA插入物，进行菌落PCR。挑选具有正确表型的候选菌落，并经历菌落PCR测试。执行三种PCR。i)一种PCR使用寡核苷酸1822/3050，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的5’的区域。ii)一种PCR使用寡核苷酸1366/746，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的3’的区域。iii)一种PCR使用寡核苷酸3967/3969，其扩增插入的基因组的一部分。来自所述整合的21个测试的克隆中的21个显示正确的PCR模式(PCR i、ii和iii是阳性的)。
测试10个克隆的功能性。所有测试的克隆都获取表达异源基因的能力。选择一个起作用的克隆，并命名为stLMTB10867。
作为进一步步骤，将与第一异源基因簇具有高度同源性的第二基因簇插入组成型表达的O16抗原rfb基因座中。如果在wca-整合簇和第二聚糖基因簇之间存在长的同源性延伸段，则在该第二同源重组程序期间保持氯霉素抗性压力是必要的。以该方式，可选择想要的重组事件，因为如果将同源性延伸段用作5’重组区域，则将切除氯霉素抗性盒。在该情况下，供体质粒是pDOC p3952，其编码5’和3’同源性区域，用于替换rfb簇。在它们之间，以相同的取向，第二基因簇，随后为卡那霉素抗性盒，其以相反的取向侧接两个FRT3位点。
为了替换，将菌株10867经由电穿孔用pTKRED (GenBank:GU327533.1)和供体质粒p3952共转化。由于pTKRED的温度敏感的复制表型，使所得的细胞始终在30℃下在补充有壮观霉素(用于选择pTKRED)和补充有卡那霉素(用于选择p3952)的LB中生长。将质粒插入受体细胞中，以使得能够在同一细胞内存在供体质粒DNA的情况下表达在辅助质粒上编码的酶。
接下来，进行插入程序。使新鲜转化的菌株在TBdev培养基中在卡那霉素和壮观霉素存在的情况下在28℃下以5 ml规模以180 rpm生长过夜。将50 μl的致密培养物转移至含有2 ml补充有壮观霉素和氯霉素的TBdev的新管中。然后使新的培养物在30℃下以180 rpm生长3小时，将细胞在4℃下以4000 rpm离心5分钟，并将上清液替换为2 mL补充有spc、0.2%阿拉伯糖(w/v)和1 mM IPTG的TBdev培养基。培养基组成支持辅助质粒选择，以及重组酶和SceI核酸内切酶表达以使得能够插入。将细胞重悬浮，并在30℃下以180rpm进一步孵育4小时。使用50μl的培养物来接种2 mL的具有0.2%阿拉伯糖(w/v)和1 mM IPTG的TBdev，使其在30℃下生长过夜。第二天，将培养物在37℃下放置1小时，且然后铺板在补充有kan (用于选择DNA插入物)、clm(用于选择想要的重组事件)和10% (w/v)蔗糖(以针对供体质粒反选择)的TBdev板上，并在37℃下孵育过夜(以选择温度敏感的辅助质粒的丢失)。细胞菌苔出现。在补充有clm、kan和10% (w/v)蔗糖的TBdev板上进行划条纹，并在37℃下孵育过夜。
为了针对正确的插入表型筛选所得菌落，将来自划条纹的60个单一菌落复制铺板至补充有spec、amp或clm+kan的LB板上。针对所述插入进一步分析对clm和kan有抗性(对于插入物的存在以及具有正确的重组模式)、但对amp和spec敏感(对于供体和辅助质粒的不存在)的菌落。60个菌落中的55个展现想要的抗性模式。
挑选具有正确表型的候选菌落，并经历菌落PCR测试。执行两种PCR。i)一种PCR使用寡核苷酸3204/3940，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的5’的区域，且wca和rfb基因座之间的遗传物质未丢失。ii)一种PCR使用寡核苷酸548/1237，并且仅在重组正确发生的情况下才扩增插入的DNA的3’的区域。iii)一种PCR使用寡核苷酸3967/3969，其扩增插入的基因组的一部分。首先筛选30个菌落用于PCR i。发现3个阳性菌落。仅对这些菌落实施PCR ii和iii，并且导致对于其中全部都是阳性的。
测试三个克隆的功能性(酶表达)。所有测试的克隆都获取表达预期酶的能力，特别是来自rfb簇(对于解释，参见下文)。选择一个起作用的克隆，并命名为stLMTB10883。
接下来的步骤是从整合菌株除去氯霉素(可拉酸wca簇)和卡那霉素(上述O16簇中的整合)的抗生素抗性。用表达FLP重组酶的温度敏感的pCP20质粒[1]转化菌株10883，并铺板在补充有氨苄青霉素的LB板上以选择pCP20。将板在30℃下孵育过夜，以允许质粒复制。用来自板的条纹接种5 ml LB培养物，并在42℃下生长过夜，以确保pCP20的丢失。将来自过夜培养物的系列稀释液铺板在LB板上。在补充有氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或无抗生素的LB板上复制20个单一菌落。所有菌落都显示正确的抗性模式(仅在无抗生素的LB板上生长)。
为了证实抗性的丢失是由于所述盒的切除，并且除了所述抗性盒以外没有丢失任何基因组物质，实施两种菌落PCR。i. 使用结合在FRT3位点外部的寡核苷酸3966和1237的卡那霉素盒除去；ii. 使用结合在FRTwt位点外部的寡核苷酸3929和1231的氯霉素盒除去。三个筛选的菌落具有从卡那霉素盒的正确除去预期的模式。针对氯霉素PCR测试其中的2个，并且还导致预期的模式。将由该卡那霉素/氯霉素除去产生的两个证实的克隆之一命名为stLMTB10900。
使用两个替代的FRT位点对(用于rfb基因座替换的FRT13，用于wca基因座替换的FRTwt)允许获得双重无标记整合而不丢失这两个相邻基因座中的DNA。在这种特殊情况下，同时除去是必要的，因为在插入第二拷贝的所述簇期间的氯霉素盒和卡那霉素抗性盒的持久性对于选择正确的重组事件是严格必需的。
测试27_0048菌株10739、10867、10883和10900，并通过获得感受态细胞并用不同组的质粒转化它们来针对功能性进行比较。将5 mL TBdev (10 mM MgCl2，补充有适当的抗生素)用10 uL的回收悬浮液接种，并在37℃下生长过夜。将50 mL TBdev 10 mM MgCl2和抗生素主要培养物接种至OD600 0.1，并在37℃下摇动。在必要的情况下，用1mM IPTG和0.1%阿拉伯糖在OD600 0.8至1下实施诱导。使培养物在37℃下生长过夜。收获对应于2 OD的体积，重悬浮于100 uL的Lämmli缓冲液中，在95℃下加热10分钟。添加蛋白酶K并在55℃下孵育1小时，随后在70℃下孵育10分钟用于失活。将样品彻底涡旋并离心。将对应于0.4 OD的体积上样在SDS-page凝胶上。运行后，转移至膜上并遵循Western Blot测量表达的酶的功能。wca-编码的簇对于其自身表达依赖于rcsA的表达，而rfb-编码的簇是有活性的，但生物合成需要wchA。为了理解两个簇是否都有活性，已经选择使用的质粒组合。可观察到两个整合簇均有功能：菌株10883和10900中wchA的存在导致产生抗血清-反应性种类，而rcsA的添加活化wca-整合簇，产生抗血清-反应性种类。
实施例7 用于实施插入DNA的缺失的有用序列
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 263725DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 184408DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 658245DEST_PATH_IMAGE008

Claims (25)

1.从宿主细胞中的基因组多核苷酸除去插入核酸的至少两个部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 制备包含第一插入核酸的基因组多核苷酸，所述第一插入核酸侧接一对彼此相同且具有第一核酸序列的相同取向的第一重组位点；
b) 将步骤a)的所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第一重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除所述第一插入核酸和所述第一重组位点之一；
c) 将第二插入核酸插入步骤b)的所述基因组多核苷酸中，所述第二插入核酸侧接一对相同取向的第二重组位点，其中所述第二重组位点彼此相同且具有与所述第一核酸序列共有不超过98%序列同一性的第二核酸序列；和
d) 将步骤c)的所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第二重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除所述第二插入核酸和所述第二重组位点之一，但不除去不侧接相同的重组位点的基因组多核苷酸序列。
2.用于从宿主细胞中的基因组多核苷酸除去插入核酸的至少两个部分的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 制备包含至少第一和第二插入核酸的基因组多核苷酸，其中i)所述第一插入核酸侧接彼此相同且具有第一核酸序列的相同取向的第一重组位点，ii)所述第二插入核酸侧接相同取向的第二重组位点，所述第二重组位点彼此相同且具有与所述第一核酸序列共有不超过98%序列同一性的第二核酸序列，且iii)任何另外的重组位点具有与所述第一或第二核酸序列共有不超过98%序列同一性的核酸序列；和
b) 将所述基因组多核苷酸暴露于识别所述第一和第二重组位点的重组酶，使得相同的重组位点重组，导致切除侧接相同的重组位点的插入核酸，但不除去不侧接相同的重组位点的基因组多核苷酸序列。
3.权利要求1或2的方法，其中所述基因组多核苷酸是原核基因组多核苷酸或质粒。
4.权利要求1或2或3的方法，其中所述基因组多核苷酸是真核染色体。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第一和第二插入核酸是选择标记。
6.宿主细胞基因组多核苷酸，其包含第一重组工程改造的区域和第二重组工程改造的区域，其中第一单一重组位点与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二单一重组位点与所述第二重组工程改造的区域相邻，其中所述第一和第二重组位点具有与彼此以及任选地与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点的核酸序列共有90-98%同一性的核苷酸序列。
7.包含宿主细胞基因组多核苷酸的宿主细胞，所述宿主细胞基因组多核苷酸含有第一重组工程改造的区域和第二重组工程改造的区域，其中第一重组位点疤痕与所述第一重组工程改造的区域相邻，且第二重组位点疤痕与所述第二重组工程改造的区域相邻；其中所述第一和第二重组位点疤痕具有不同的多核苷酸序列，所述不同的多核苷酸序列与彼此具有小于98%同一性，且任选地与所述宿主细胞基因组多核苷酸中存在的任何另外的重组位点疤痕的多核苷酸序列具有小于98%同一性。
8.权利要求7的宿主细胞，其中所述第一和第二重组位点是重组酶、例如FLP重组酶的重组位点。
9.权利要求8的宿主细胞，其中所述第一重组位点具有SEQ ID NO:1-10中任一者的核酸序列。
10.权利要求7-9中任一项的宿主细胞，其中所述第一和第二重组位点被隔开小于100、75、50、25、10或5千碱基。
11.原核基因组多核苷酸或真核染色体，其包含与至少两个重组工程改造的区域相邻的至少两个重组位点疤痕，其中每个重组位点疤痕具有不同的多核苷酸序列。
12.用于工程改造宿主细胞的方法，其包括以下步骤：
a) 整合第一多核苷酸盒，所述第一多核苷酸盒包括侧接第一对重组位点的第一选择标记；
b) 通过识别所述第一对重组位点的重组酶的作用除去所述第一选择标记；
c) 整合第二多核苷酸盒，所述第二多核苷酸盒包括侧接第二对重组位点的第二选择标记；和
d) 通过识别所述第二对重组位点的重组酶的作用除去所述第二选择标记；
其中所述第一对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第二对重组位点具有相同的核酸序列，且所述第一和第二对重组位点共有90-98%核酸序列同一性。
13.权利要求12的方法，其中步骤b)和d)的重组酶是FLP重组酶。
14.权利要求13的方法，其中所述FLP重组酶具有与SEQ ID NO:11具有至少80%同一性的氨基酸序列。
15.可通过权利要求12-14中任一项的方法获得的工程改造的宿主细胞。
16.工程改造的宿主细胞，其在所述宿主细胞基因组多核苷酸中包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个重组位点的单一拷贝，其中每个重组位点具有与所述其他重组位点具有小于98%同一性的核苷酸序列。
17.权利要求16的工程改造的宿主细胞，其中所述至少2个重组位点是FRT位点。
18.权利要求16或权利要求17的工程改造的宿主细胞，其中所述至少2个重组位点在所述宿主细胞基因组多核苷酸中隔开小于100kb、75kb、50kb、25kb、10kb、5kb、3kb或1kb。
19.工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中天然rfb簇的至少一部分和wca可拉酸簇的至少一部分已被缺失，同时维持所述rfb簇的启动子完整。
20.权利要求19的工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中还缺失waaL基因。
21.权利要求19或20的工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中所述革兰氏阴性宿主细胞是大肠杆菌。
22.权利要求19-21中任一项的工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中所述天然rfb簇的至少一部分被异源聚糖簇替换。
23.权利要求19-22中任一项的工程改造的革兰氏阴性宿主细胞，其中所述waaL基因被pglB基因或pglL基因替换。
24.权利要求6-10或16-23中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞经工程改造以表达a)寡糖基转移酶，例如PglB或PglL；b)异源聚糖簇，例如rfb簇或编码合成荚膜多糖所需的糖基转移酶的基因簇；以及含有被所述寡糖基转移酶识别的糖基化位点、例如WO 06/119987 (权利要求1)中公开的优化的共有序列的蛋白。
25.用于制备糖基化蛋白的方法，其包括以下步骤：
i) 在适用于产生糖基化蛋白的条件下培养权利要求24的宿主细胞，和
ii) 从培养物分离所述糖基化蛋白。
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