JP2020529986A - Ｃｙｓ−ｍａｂのコンジュゲーション方法 - Google Patents

Ｃｙｓ−ｍａｂのコンジュゲーション方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2020529986A
JP2020529986A JP2020504698A JP2020504698A JP2020529986A JP 2020529986 A JP2020529986 A JP 2020529986A JP 2020504698 A JP2020504698 A JP 2020504698A JP 2020504698 A JP2020504698 A JP 2020504698A JP 2020529986 A JP2020529986 A JP 2020529986A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
antibody fragment
oxidation
mixture
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2020504698A
Other languages
English (en)
Inventor
アフマトビッチ，ミハウ
ロマニーニ，ダンテ
フォルシー，ジェ−ムズ・アール
ハーバリッチ，ブラッドリー・ジェイ
ティール，オリバー・アール
Original Assignee
アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アムジエン・インコーポレーテツド filed Critical アムジエン・インコーポレーテツド
Publication of JP2020529986A publication Critical patent/JP2020529986A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

本開示は、後続の共役反応に均質な材料を提供するため、ｃｙｓ−ｍＡｂをキャッピングし、還元し、酸化する方法に関する。本方法は、高収率及び均一な生成物品質を提供するシステイン操作抗体のコンジュゲートを製造するための堅固な方法を示す。

Description

本開示は、後続の共役反応に均質な材料を提供するため、ｃｙｓ−ｍＡｂをキャッピングし、還元し、酸化する方法に関する。
共役生体分子は、少なくとも１つは生体系に由来する複数の前駆体分子を含む多種多様な物質である。生体由来の成分は、ほとんどの場合、組換えＤＮＡ技術を用いて生成されている。医薬業界では、共役生体分子は様々な医学的状態の治療法として研究されている。これらの場合、コンジュゲートは、２つ以上の前駆体分子の有用な特性を単一の実体に組み合わせることによって、多くの治療上の恩恵を提供することができる。
医薬バイオコンジュゲートの１つの特に成功したクラスは、抗体−薬物コンジュゲートとも呼ばれる抗体コンジュゲートである。これらの分子は、一般的には哺乳動物細胞培養物に由来する抗体と、生物学的又は薬理学的活性を有する合成分子とからなる。いくつかの抗体−薬物コンジュゲートが癌治療として承認されており、さらに多くが臨床及び前臨床開発中である。今日までに承認されている抗体−薬物コンジュゲートは全て、コンジュゲート分子の混合物を生成する非特異的化学を用いて製造されている。
部位特異的抗体コンジュゲートに基づく医薬は合成分子が抗体分子中の規定の部位に結合されており、治療の恩恵並びに良好な品質管理及び／又は貯蔵寿命を提供することができる。したがって、抗体の部位特異的コンジュゲートを生成する方法を開発するために、多くの努力がなされてきた。部位特異的コンジュゲーションに対する一般的なアプローチは、新しいシステインアミノ酸を抗体の一次構造に導入するシステイン変異抗体（Ｃｙｓ−ｍＡｂ又はＴｈｉｏｍａｂ）の使用である。この操作されたシステインは、合成分子をコンジュゲートするための部位として使用され得る。
Ｃｙｓ−ｍＡｂタンパク質との部位特異的コンジュゲーションには、還元チオール形態の操作されたシステイン側鎖を必要とする。しかし、抗体が哺乳動物細胞培養物から単離されるとき、操作されたシステインは一般に、グルタチオンなどの細胞質チオールとの混合ジスルフィドとして「キャップ」される。したがって、反応性合成分子を直接添加しても、操作されたシステインの側鎖は反応に利用できないので、コンジュゲートは生成されない。
キャップを除去するために単一工程の選択的還元が非常に望ましいが、抗体中の混合ジスルフィドと構造ジスルフィドとの間の化学的類似性のために、今のところ、実現不可能である。還元剤をＣｙｓ−ｍＡｂに加えてキャップを撤去すると、抗体中の他のジスルフィドの一部も還元され、その結果、望ましくない場所で反応してコンジュゲートを形成するチオールを生じ得る。
したがって、高収率及び均一な生成物品質を提供するシステイン操作抗体のコンジュゲートを製造するための効率的で堅固な方法が依然として必要とされている。
一態様では、本開示は、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、ａ）抗体又は抗体断片を含む組成物を得る工程；ｂ）抗体又は抗体断片をシステインブロッキング剤に曝露する工程（ここで、システインブロッキング剤は抗体又は抗体断片の少なくとも１つのシステイン残基と安定な混合ジスルフィドを形成する）；ｃ）還元剤を組成物に添加して還元混合物を形成し、還元混合物が還元抗体又は還元抗体断片を含むように還元反応を生じさせる工程；ｄ）酸化剤を還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及びｅ）活性化学部分を酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程を含む方法を提供する。
一態様では、工程ｂ）の後で工程ｃ）の前に、カチオン交換クロマトグラフィーを行って過剰のシステインブロッキング剤を除去する。一態様では、工程ｃ）の後で工程ｄ）の前に、緩衝液交換工程を行って還元剤を除去する。一実施形態では、緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である。一態様では、工程ｅ）に続いて、精製工程を行って、活性化学部分を除去する。一実施形態では、精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む。
別の態様では、本開示は、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、ａ）抗体又は抗体断片を含む混合ジスルフィドを含む組成物を得る工程；ｂ）組成物に還元剤を添加して還元混合物を形成し、還元混合物が還元抗体又は還元抗体断片を含むように還元反応を生じさせる工程；ｃ）酸化剤を還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及びｄ）活性化学部分を酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程を含む方法を提供する。
一態様では、工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、カチオン交換クロマトグラフィーを行って、過剰のシステインブロッキング剤を除去する。一態様では、工程ｂ）の後で工程ｃ）の前に、緩衝液交換工程を行って還元剤を除去する。一実施形態では、緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である。一態様では、工程ｄ）に続いて、精製工程を行って、活性化学部分を除去する。一実施形態では、精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む。
別の態様では、本開示は、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、ａ）抗体又は抗体断片を含む混合ジスルフィドを含む組成物を得る工程；ｂ）組成物に還元剤を添加して還元混合物を形成し、還元混合物が還元抗体又は還元抗体断片を含むように還元反応を生じさせる工程；ｃ）酸化剤を還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及びｄ）活性化学部分を酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程を含む方法を提供する。
一態様では、工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、緩衝液交換工程を行って還元剤を除去する。一態様では、工程ｃ）に続いて、精製工程を行って、活性化学部分を除去する。一実施形態では、緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である。一実施形態では、精製工程は、ステップが疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む。
一実施形態では、混合ジスルフィドはキャップされた遊離システインを有する抗体又は抗体断片である。一実施形態では、キャップされた遊離システインを有する抗体又は抗体断片は、システイン、システアミン、シスタミン、及びグルタチオンからなる群から選択されるキャップを含む。一実施形態では、還元剤は、トリフェニルホスフィン−３，３’，３”−トリスルホネート（「ＴＰＰＴＳ」）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）、及びトリフェニルホスフィン−３，３’−ジスルホネート（「ＴＰＰＤＳ」）からなる群から選択される。一実施形態では、還元剤対抗体又は抗体断片の比は２〜４：１（モル／モル）である。”）。一実施形態では、酸化剤はデヒドロアスコルビン酸（「ＤＨＡＡ」）である。”）。一実施形態では、酸化剤対抗体又は抗体断片の比は３〜６：１（モル／モル）である。”）。一実施形態では、活性化学部分は、ハロゲンを含むペプチドであり、ハロゲンはＢｒ、Ｉ、及びＣｌからなる群から選択される。”）。一実施形態では、活性化学部分対抗体又は抗体断片の比は２〜３：１（モル／モル）である。
一実施形態では、抗体又は抗体断片は、参照配列（配列番号７）に対する抗体軽鎖のＤ７０、参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＥ２７６、及び参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＴ３６３からなる群から選択される位置にシステイン残基を含む。
１６の天然ジスルフィド結合（緑色で示す）によって結合された４本のポリペプチド鎖（２本の軽鎖、２本の重鎖）からなる典型的なＣｙｓ ｍＡｂ（ＩｇＧ１）。抗体に操作により導入されたさらなるシステインは、２つのさらなるジスルフィド（橙色で示す）を有する。他の１６の天然ジスルフィドの存在下での操作されたジスルフィドが選択的に還元されることが非常に望ましいが、（単一工程では）可能ではない。 最終的な選択的還元は、２工程で実施することができる。（１）還元工程は、操作ジスルフィドを確実に完全な「無キャッピング」とし、いくつかの天然ジスルフィド結合もまた切断される。（２）酸化工程は、ＩｇＧ１の天然構造に戻す。「再キャッピング」を防止するために、酸化に先立って、還元工程（Ｒ−ＳＨ）で解放されたチオールのＵＦ／ＤＦによるクリアランスが必要である。 「無キャップ」Ｃｙｓ ｍＡｂは、アルキル化剤（例えば、ペプチドブロモアセトアミド誘導体）により容易に部位選択的にコンジュゲートされる。 マッチドペア（ＣＡ＋ＴＣＥＰ）及びミスマッチドペア（ＭＥＳ＋ＴＣＥＰ）の還元性能の直接比較。 「無キャップ」Ｃｙｓ ｍＡｂの経時形成。反応条件：ｐＨ５．０の特定の緩衝液中、１０ｇ／ＬのシステアミンキャップＣｙｓ ｍＡｂ、３．５当量のホスフィン（ＴＰＰＴＳ、ＴＰＰＤＳ、又はＴＣＥＰ）、室温。反応混合物をカチオン交換クロマトグラフィーでモニターし、２８０ｎｍで定量した。この図では、「無キャップ」Ｃｙｓ ｍＡｂのみがプロットされている。 システアミンベースのコンジュゲーションプロセスでは、ほぼ化学量論量の還元、酸化、及びアルキル化のための試薬で、均一なＰＡＲ２含有量（例えば、≧９５％）を有するｍＡｂ−ペプチドコンジュゲートが得られる。
本開示は、後続の共役反応に均質な材料を提供するため、ｃｙｓ−ｍＡｂをキャッピングし、還元し、酸化する方法を提供する。本方法は、高収率及び均一な生成物品質を提供するシステイン操作抗体のコンジュゲートを製造するための堅固な方法を示す。
「遊離システイン」は、種々の特性改変基のコンジュゲーションに好適な結合点であることがわかってきた。本明細書中の遊離システインとは、１つ又は２つのポリペプチドの２つのシステイン間の通常のジスルフィド結合に関与していないシステイン残基をいう。通常、遊離システインは、部位選択的変異誘発によって目的のポリペプチド配列に導入されたシステインであるが、タンパク質のなかにはその代わりに適切な位置にシステインを含み得るものもある。背景技術に記載のように、添加されたシステインは、タンパク質に対する特性改変基の好適な結合点であり得る。システイン残基を導入することによって、ジスルフィド結合を形成するためのパートナーがタンパク質中に存在しないので、遊離システインが、通常、得られる。
一態様では、本開示は、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、ａ）抗体又は抗体断片を含む組成物を得る工程；ｂ）抗体又は抗体断片をシステインブロッキング剤に曝露する工程（ここで、システインブロッキング剤は抗体又は抗体断片の少なくとも１つのシステイン残基と安定な混合ジスルフィドを形成する）；ｃ）還元剤を組成物に添加して還元混合物を形成し、還元混合物が還元抗体又は還元抗体断片を含むように還元反応を生じさせる工程；ｄ）酸化剤を還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及びｅ）活性化学部分を酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程を含む方法を提供する。
一態様では、工程ｂ）の後で工程ｃ）の前に、カチオン交換クロマトグラフィーを行って、抗体の均質性を高め、且つ過剰のシステインブロッキング剤を除去する。一態様では、工程ｃ）の後で工程ｄ）の前に、緩衝液交換工程を行って、放出されたキャップ（チオール）を除去し、且つ還元剤を除去する。一実施形態では、緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である。一態様では、工程ｅ）に続いて、精製工程を行って、過剰の活性化学部分を除去し、抗体又は抗体断片コンジュゲートの純度を高める。一実施形態では、精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む。
別の態様では、本開示は、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、ａ）抗体又は抗体断片を含む混合ジスルフィドを含む組成物を得る工程；ｂ）組成物に還元剤を添加して還元混合物を形成し、還元混合物が還元抗体又は還元抗体断片を含むように還元反応を生じさせる工程；ｃ）酸化剤を還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及びｄ）活性化学部分を酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程を含む方法を提供する。
一態様では、工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、カチオン交換クロマトグラフィーを行って、過剰のシステインブロッキング剤を除去する。一態様では、工程ｂ）の後で工程ｃ）の前に、緩衝液交換工程を行って、キャップを除去し、且つ過剰の還元剤を除去する。一実施形態では、緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である。一態様では、工程ｄ）に続いて、精製工程を行って、活性化学部分を除去する。一実施形態では、精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む。
別の態様では、本開示は、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、ａ）抗体又は抗体断片を含む混合ジスルフィドを含む組成物を得る工程；ｂ）組成物に還元剤を添加して還元混合物を形成し、還元混合物が還元抗体又は還元抗体断片を含むように還元反応を生じさせる工程；ｃ）酸化剤を還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及びｄ）活性化学部分を酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程を含む方法を提供する。
一態様では、工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、緩衝液交換工程を行って還元剤を除去する。一態様では、工程ｃ）に続いて、精製工程を行って、活性化学部分を除去する。一実施形態では、緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である。一実施形態では、精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む。
一実施形態では、混合ジスルフィドはキャップされた遊離システインを有する抗体又は抗体断片である。一実施形態では、キャップされた遊離システインを有する抗体又は抗体断片は、システイン、システアミン、シスタミン、及びグルタチオンからなる群から選択されるキャップを含む。一実施形態では、還元剤は、トリフェニルホスフィン−３，３’，３”−トリスルホネート（「ＴＰＰＴＳ」）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）、及びトリフェニルホスフィン−３，３’−ジスルホネート（「ＴＰＰＤＳ」）からなる群から選択される。一実施形態では、還元剤対抗体又は抗体断片の比は２〜４：１（モル／モル）である。”）。一実施形態では、酸化剤はデヒドロアスコルビン酸（「ＤＨＡＡ」）である。”）。一実施形態では、酸化剤対抗体又は抗体断片の比は３〜６：１（モル／モル）である。”）。一実施形態では、活性化学部分は、ハロゲンを含むペプチドであり、ハロゲンはＢｒ、Ｉ、及びＣｌからなる群から選択される。”）。一実施形態では、活性化学部分対抗体又は抗体断片の比は２〜３：１（モル／モル）である。
一実施形態では、抗体又は抗体断片は、参照配列（配列番号７）に対する抗体軽鎖のＤ７０、参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＥ２７６、及び参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＴ３６３からなる群から選択される位置にシステイン残基を含む。
「コンジュゲーションに適用可能な」コンジュゲーション部位とは、選択されたコンジュゲーション部位におけるアミノ酸残基の側鎖が、所定の化学条件下で、目的の追加の機能性部分（又は追加の機能性部分に共有結合したリンカー）と反応し、主要な反応生成物として、追加の機能性部分の側鎖との共有結合（直接又はリンカーを介して）を生じさせることを意味する。
ジスルフィドは、異なる（又は同じ）分子中に存在し得る２つの硫黄原子の共有結合である。タンパク質では、システイン残基は、シスチンとも呼ばれるジスルフィド結合によって連結され得る。
共役反応の有効な標的であるためには、遊離システインは還元型でなければならない。遊離システインを有するタンパク質は同じ理由で製造が困難であり得、したがって、しばしば小さな有機部分を含む混合ジスルフィドとして得られる。混合ジスルフィドは、それぞれポリペプチド配列（同じであっても同じでなくてもよい）に含まれる２つのシステインアミノ酸残基間のジスルフィド結合に類似したジスルフィドを含む分子である。小さな有機部分は本明細書ではＣａｐと呼ばれ、したがって混合ジスルフィドはタンパク質−Ｓ−Ｓ−Ｃａｐ分子である。本願において、用語「混合ジスルフィド」は両方のポリペプチドではない２つの異なる実体を連結するジスルフィド結合を含む分子について使用されるが、分子は混合ジスルフィドに加えて「通常の」ジスルフィド結合をさらに含み得る。
一実施形態では、本発明の方法は、コンジュゲーションを受けるタンパク質がタンパク質−Ｓ−Ｓ−Ｃａｐ分子の組成物の形態で得られるので、タンパク質−Ｓ−Ｓ−Ｃａｐ分子を還元する工程を含む。
上記のように、Ｃａｐは、通常、混合ジスルフィドのジスルフィド結合の一部である少なくとも１個の硫黄原子を含む小さな有機部分に由来する。このような有機部分は、還元形態のモノマーとして、又は酸化形態のダイマーとして存在し得る。したがって、混合ジスルフィドにおいては、−Ｓ−Ｃａｐは、モノマー又はダイマーの半分の酸化形態である。一実施形態では、−Ｓ−Ｃａｐは、システイン／シスチン、システアミン／シスタミン（これは脱カルボキシル化シスチンである）又はグルタチオン（Ｇ−ＳＨ）／グルタチオンジスルフィド（ＧＳ−ＳＧ）に由来し、したがって、混合ジスルフィドは、一実施形態では、タンパク質−Ｓ−Ｓ−ｃｙｓ、タンパク質−Ｓ−Ｓ−ｃｙｓｔ、又はタンパク質−Ｓ−Ｓ−Ｇから選択される（ここで、ｃｙｓはシスチンの半分を指し、ｃｙｓｔはシスタミンの半分を指し、Ｇはグルタチオンジスルフィドの半分を指す。換言すれば、一実施形態において、タンパク質−Ｓ−Ｓ−ＣａｐのＣａｐは、システイン、システアミン又はグルタチオンに由来する。
特定の実施形態では、ｃａｐは
Figure 2020529986
 からなる群から選択される。
上記のように、還元の目的は共役反応において反応性のある遊離還元システイン（−ＳＨ）を有する分子を得ることである。
一実施形態では、混合ジスルフィドはタンパク質−Ｓ−Ｓ−Ｃａｐ分子である（ここで、タンパク質−Ｓは遊離システインを含むタンパク質に由来する）。
反応性硫黄原子をもつタンパク質を得るために、還元剤を混合ジスルフィド組成物に加え、この混合物をインキュベートして還元し、例えば、タンパク質−Ｓ−Ｈの形態の還元されたタンパク質を得る。ここで述べる工程は、ａ）タンパク質を含む混合ジスルフィドの組成物を得る工程、ｂ）前記タンパク質組成物に還元剤を加える工程、ｃ）還元させて、還元タンパク質（Ｐ−ＳＨ）を含む溶液を得る工程である。
還元剤は、複数の利用可能な還元剤から選択することができ、本明細書ではほんの少数の還元剤のみに言及するが、当業者であれば還元剤の非常に大きなレパートリーから選択することができることは知られている。
一実施形態において、還元剤は、グルタチオン、ガンマ−グリタミルシステイン、システイングリシン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン及びリパミドの群から選択されるレドックス緩衝剤である。一実施形態では、グルタレドキシンなどの酵素などのチオールジスルフィドレドックス触媒が含まれる。一実施形態では、還元剤がＤＴＴなどの小分子還元剤から選択される。一実施形態では、還元剤は、ホスフィン、例えば芳香族ホスフィン、例えばトリアリールホスフィン、例えばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）などの置換トリアリールホスフィン、トリフェニルホスフィン−３，３’，３”−トリスルホン酸三ナトリウム（ＴＰＰＴＳ）、又はトリフェニルホスフィン−３，３’−ジスルホン酸二ナトリウム（ＴＰＰＤＳ）である。
混合ジスルフィドが還元されると、還元タンパク質（Ｐ−ＳＨ）を含む溶液が得られる。その後のコンジュゲーションの前に、還元剤及び／又は放出されたＣａｐ分子を除去することが有益であり得る。一実施形態では、還元タンパク質（Ｐ−ＳＨ）を含む溶液から、分子量が１０ｋＤａ未満である分子などの小分子を除去する任意選択のステップを含めることができる。一実施形態では、１０ｋＤａ未満の分子量を有する分子は、透析濾過によって還元タンパク質を含む溶液から除去される。
共役反応では、化学部分が還元タンパク質（タンパク質−ＳＨ）の遊離システインの硫黄原子に共有結合される。化学部分は、特性改変部分などの、タンパク質へのコンジュゲーションに好適な部分であり得る。特性改変部分は、目的タンパク質の１つ以上の特徴を改変可能な化学部分であり得る。一実施形態では、化学部分は、タンパク質の安定化、循環半減期の長期化、又は効力の増大を図ることができる化学部分などの特性改変基である。一実施形態では、化学部分は延長剤である。コンジュゲーションを効果的に起こすために、化学部分は、活性化された形態の化学部分が使用され得る。上記の本明細書に記載の本発明による方法においては、活性型化学部分が還元タンパク質を含む溶液に添加され、化学部分の還元タンパク質へのコンジュゲーションによって、コンジュゲートされたタンパク質が調製される。したがって、本発明による方法には、還元タンパク質を含む溶液に活性型化学部分を添加し、共役反応を起こさせ、前記コンジュゲートタンパク質の調製物を得るさらなる工程が含まれる。
化学部分は、特性改変部分などの、タンパク質へのコンジュゲーションに好適な部分であり得る。特性改変部分は、目的タンパク質の１つ以上の特徴を改変可能な化学部分であり得る。一実施形態では、化学部分は、リンカー配列を有するか又は有さないペプチド及び／又はリガンドである。一実施形態では、化学部分は、タンパク質の安定化、循環半減期の長期化、又は効力の増大を図ることができる化学部分などの特性改変基である。一実施形態では、化学部分はアルブミン結合剤である。コンジュゲーションを効果的に起こさせるために、活性化された形態の化学部分が使用され得る。上記の本明細書に記載の本発明による方法においては、活性型化学部分が還元タンパク質と混合され、化学部分の還元タンパク質へのコンジュゲーションによって、硫黄原子を介してコンジュゲートされたタンパク質が調製される。
化学部分は活性型化学部分であることが好ましく、この活性型化学部分は、タンパク質−ＳＨと反応してタンパク質−Ｓ−化学部分分子を形成することができる部分を意味する。このような活性型化学部分としては、マレイミド基又はハロアセチル基を含む軟求電子性アルキル化試薬を挙げることができ、これらは当該分野で知られている。
一実施形態では、活性型化学部分は、ハロゲン化ペプチドリガンドなどのハロゲン化化学部分である。ハロゲン化化学部分としては、Ｂｒ、Ｉ又はＣＩを挙げ得る。
一実施形態では、活性型化学部分は、ハロゲン化アルブミン結合剤（ＡＢ−ハロ）である。
混合ジスルフィドを効果的に還元するために、通常、モル濃度で過剰な還元剤が適用される。混合ジスルフィドの組成物に還元剤を添加することにより、還元混合物が得られる。還元剤の量は混合ジスルフィドの量の当量で表すことができ、還元剤の量が混合ジスルフィドの量の１当量である場合、混合物中の混合ジスルフィド及び還元剤のモル濃度は等しい。
一実施形態では、還元剤の添加量は混合ジスルフィドのモル量の約２モル当量〜約４モル当量である。
抗体又は抗体断片の過剰還元の量を減少させるために、必要な量を減少させることが有利であり、これは、本明細書に記載するように、プロセス工程が最適化されれば可能である。より少量の還元剤を使用して有効な還元反応を行わせるには、本発明によって提供されるように、残りの反応条件を慎重に選択する必要がある。
混合ジスルフィドの還元には、条件に応じて、数分から数時間を要する。当業者は条件の相異により異なる効果がもたらされることを知っており、したがって、混合ジスルフィドを完全に又はほぼ完全に還元させるのに必要な時間及び条件を、以下の実施例でより詳細に記載する。
還元剤は、混合ジスルフィド組成物に濃縮物として添加してもよいし、薬剤を固体粉末として単に添加することによって添加してもよい。還元剤を混合ジスルフィド組成物と混合して還元を開始する。この混合物を還元混合物と呼ぶことができる。
十分に有効なプロセスとするために、還元は、混合ジスルフィドの総量の少なくとも８０％の還元、例えば少なくとも９０％の還元をもたらすべきである。混合ジスルフィドの量が、還元混合物中の混合ジスルフィドの量の多くとも２０％、例えば多くとも１０％である場合、還元は満足のいくものと考えられる。好ましい実施形態では、還元タンパク質を含む溶液中に約５％の非還元混合ジスルフィドを残し、混合ジスルフィドの約９５％の還元を得ることができる。さらなる実施形態では、効率的なプロセスが好適な時間で残す混合ジスルフィドは多くとも２％である。
還元は、少なくとも１５分間、例えば少なくとも３０分間、又は例えば少なくとも１時間の間に起こり得る。一実施形態では、還元混合物は、還元剤の添加後、２〜１０時間、例えば３〜６時間又は約３〜４時間置かれる。
一実施形態では、還元は、最大２４時間、例えば最大１２時間、例えば最大８時間、例えば最大６時間、例えば最大４時間行われる。
一実施形態では、還元は、１〜５０℃で、例えば室温で、例えば１８〜２５℃で行うことができる。代替の実施形態では、還元は、より低温で、例えば１０℃未満で、例えば約４〜６℃で行うことができる。
コンジュゲーション工程を進める前に、還元タンパク質は、還元混合物から、例えば、過剰の還元剤及び／又は混合ジスルフィドの小有機分子、例えばキャップされた遊離システインを有するタンパク質のＨ−Ｓ−Ｃａｐから分離することができる。この任意選択の工程は、１０ｋＤａ未満の分子量を有する分子などの低分子量を有する分子を除去する工程であり得る。
当業者であれば、好適な膜を使用する濾過によるなどの、分子量の小さい化合物を除去するための種々の方法を知っているであろう。一実施形態では、この方法は、緩衝液交換（限外濾過／透析濾過）の工程を含む。
透析濾過工程の有効性、例えば除去される小分子及び賦形剤の量は、生成される濾液容量に関係し、保持液容量に関係する。また、この文脈における「除去する」という用語は、低分子量分子の残留量として「濃度を低下させる」と解釈されるべきであり、賦形剤は通常、低分子量の分子を「除去する」透析濾過工程（又は代替のプロセス工程）の後に存在することになることにも留意されたい。
コンジュゲーション工程を進める前に、還元タンパク質は、過剰に還元された抗体又は抗体断片の量を減少させるために酸化される。
過剰に還元された抗体又は抗体断片を有効に酸化させるために、モル濃度の過剰の酸化剤が通常適用される。過剰に還元された抗体又は抗体断片の組成物に酸化剤を添加することにより、酸化混合物が得られる。酸化剤の量は過剰に還元された抗体又は抗体断片の量の当量で表すことができ、酸化剤の量が混合ジスルフィドの量の１当量である場合、混合物中の混合ジスルフィド及び還元剤のモル濃度は等しい。
一実施形態では、酸化剤の添加量は過剰に還元された抗体又は抗体断片のモル量の約３モル当量〜約６モル当量である。
過剰に還元された抗体又は抗体断片の酸化は、条件に応じて、数分又は数時間を要し得る。当業者は条件の相異により異なる効果がもたらされることを知っており、したがって、過剰に還元された抗体又は抗体断片を完全に又はほぼ完全に酸化させるのに必要な時間及び条件を、以下の実施例でより詳細に記載する。
酸化剤は、過剰に還元された抗体又は抗体断片組成物に濃縮物として添加してもよいし、薬剤を固体粉末として単に添加することによって添加してもよい。酸化剤を過剰に還元された抗体又は抗体断片組成物と混合して酸化を開始する。この混合物を酸化混合物と呼ぶことができる。
十分に有効なプロセスとするために、酸化は、過剰に還元された抗体又は抗体断片の総量の少なくとも８０％の酸化、例えば少なくとも９０％の酸化をもたらすべきである。過剰に還元された抗体又は抗体断片の量が、酸化混合物中の過剰に還元された抗体又は抗体断片の量の多くとも２０％、例えば多くとも１０％である場合、酸化は満足のいくものと考えられる。好ましい実施形態では、酸化タンパク質を含む溶液中に約５％の過剰に還元された還元抗体又は抗体断片を残し、過剰に還元された抗体又は抗体断片の約９５％の酸化を得ることができる。さらなる実施形態では、効率的なプロセスが好適な時間で残す過剰に還元された還元抗体又は抗体断片は多くとも２％である。
酸化は、少なくとも１５分間、例えば少なくとも３０分間、又は例えば少なくとも１時間の間に起こり得る。一実施形態では、酸化混合物は、酸化剤の添加後、２〜１０時間、例えば３〜６時間又は約３〜４時間放置される。
一実施形態では、酸化は、最大２４時間、例えば最大１２時間、例えば最大８時間、例えば最大６時間、例えば最大４時間行われる。
一実施形態では、酸化は、１〜５０℃で、例えば室温で、例えば１８〜２５℃で行うことができる。代替の実施形態では、還元は、より低温で、例えば１０℃未満で、例えば約２〜８℃で行うことができる。一実施形態では、酸化剤はデヒドロアスコルビン酸である。
上記のように、本方法によれば、コンジュゲーションは、還元されたタンパク質を含む溶液に活性型化学部分を添加することによって行われる。
事前の還元が完全でない場合、還元タンパク質の混合ジスルフィドに対する比は、高収率の共役反応を妨げ得る。さらに、過剰の還元剤及び放出されたＣａｐ分子の存在は、共役反応を妨害し得る。
さらに、反応物、例えば還元タンパク質と活性型化学部分との相対比も、反応の有効性に影響を及ぼす。
一実施形態では、活性型化学部分のモル濃度は、コンジュゲートすべきタンパク質のモル濃度と少なくとも等しいか、又は２倍であり得る。これはまた当量で表すことができ、例えば、コンジュゲートすべきタンパク質に対して少なくとも１０、例えば８、例えば６、例えば４、例えば２、又は例えば１当量が使用され得る。活性型化学部分は高価な資源であり得るので、必要とされる量を減少させることが有利であり、これは、本明細書に記載されるように、前の工程が最適化されれば可能である。少ない量の活性型化学部分を使用して有効な共役反応を行うには、本発明によって提供されるように、残りの反応条件を慎重に選択する必要がある。一実施形態では、活性型化学部分の量はタンパク質の多くとも８当量、例えば、結合すべきタンパク質の多くとも６当量、例えば多くとも４当量、例えば多くとも３当量、例えば多くとも２．５当量、例えば多くとも２当量、例えば多くとも１．５当量である。
酸化タンパク質と化学部分との結合は、条件に応じて、数分又は数時間を要し得る。当業者は、条件の相異により異なる効果がもたらされ、したがって、完全に又はほぼ完全にコンジュゲーションさせるのに必要な時間が条件に基づいて変化することを知っており、本明細書中、以下に条件をより詳細に記載する。本発明の方法によれば、共役反応は、出発物質、例えば還元タンパク質の量が１０％以下、例えば５％以下、好ましくは２％以下に達した場合に満足のいくものと考えられる。
活性型化学部分は、酸化タンパク質を含む溶液に濃縮物として添加してもよいし、薬剤を固形粉末として単に添加することによって添加してもよい。一実施形態では、酸化タンパク質を含む溶液に活性型化学部分を添加する前に、好適な溶液に活性型化学部分を溶解する。また、共役反応の前に、化学部分を溶液中で活性化することもできる。
用語「半減期延長部分」は、薬学的に許容される部分、ドメイン、又はＦｃドメイン及び／若しくは薬学的に活性な部分に共有結合若しくはコンジュゲートした「ビヒクル」を指し、これは、コンジュゲートされていない形態の薬学的に活性な部分と比較して、薬学的に活性な部分のインビボにおけるタンパク質の分解若しくは他の活性を低下させる化学的改変を防止若しくは低減し、半減期、若しくは吸収速度の増大など（これに限定されない）の他の薬物動態特性を向上させ、毒性を減少させ、溶解性を改善し、目的標的に対する薬学的に活性な部分の生物学的活性及び／若しくは標的選択性を高め、製造性を増加させ、且つ／又は薬学的に活性な部分（例えば、ペプチド若しくは非ペプチド部分）の免疫原性を低下させる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、有用な半減期延長部分の例である。本発明による半減期延長部分の他の例としては、エチレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレノキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖状又は分岐状グリコシル化鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、Ｆｅｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ、米国特許第６，６６０，８４３号明細書を参照）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン；例えば、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｂｕｍｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、米国特許第６，９２６，８９８号明細書及び米国特許出願公開第２００５／００５４０５１号明細書；Ｂｒｉｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、米国特許第６，８８７，４７０号明細書を参照）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ、米国特許出願公開第２００３／０１９５１５４Ａ１号明細書；同第２００３／０１９１０５６Ａ１号明細書を参照）、又はチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が挙げられる。
本発明による有用な半減期延長部分の他の実施形態には、温度、ｐＨ、及びイオン強度の生理学的条件下で、長半減期血清タンパク質に対する結合親和性を有するペプチドリガンド又は小（非ペプチド有機）分子リガンドが含まれる。例としては、アルブミン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、トランスサイレチン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、チロキシン結合グロブリン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、抗体結合ペプチド若しくは小分子リガンド、又は長半減期血清タンパク質に対して親和性を有する別のペプチド若しくは小分子が挙げられる。（例えば、Ｂｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ− ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｎｄｓ、米国特許第５，７１４，１４２号明細書；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ、米国特許出願公開第２００３／００６９３９５Ａ１号明細書；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、米国特許第６，３４２，２２５号明細書を参照）。「長半減期血清タンパク質」は、いわゆる「担体タンパク質」（例えば、アルブミン、トランスフェリン及びハプトグロビン）、フィブリノーゲン及び他の血液凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンギオテンシン及びブラジキニンなどの物質の前駆体、並びに多くの他の種類のタンパク質を含む、哺乳動物血漿中に溶解した数百の種々のタンパク質のうちの１つである。本発明は薬学的に許容される半減期延長部分（例えば、本明細書中に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない）の任意の単一の種の使用、又は２つ以上の異なる半減期延長部分の組み合わせの使用を包含する。
実施例を含む、本明細書中で使用される組換えポリペプチド及び核酸方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）に記載されるものであり、これらはいずれも任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される項目見出しは、単に構成的な目的のためのものであり、記載する主題を限定すると解釈すべきではない。
本明細書では、別段の定義がない限り、本願と関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
一般に、本明細書に記載の細胞及び組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸の化学、並びにハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法、及びそれらの手法は、よく知られているものであり、当該技術分野において一般に使用されるものである。別段の記載がない限り、本願の方法及び手法は、一般に、当該技術分野においてよく知られる通常の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。酵素反応及び精製手法は、製造者の説明に従って実施されるか、当該技術分野において一般に達成されるように実施されるか、又は本明細書に記載のように実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び製薬化学と関連して使用される専門用語、並びにそれらの実験室的な手順及び手法は、当該技術分野においてよく知られ、且つ一般に使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、及び送達、並びに患者の治療には、標準的な手法が使用され得る。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール及び試薬等に限定されず、したがって、変わり得るものであると理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の説明を目的としているにすぎず、開示の範囲を限定することを意図するものではなく、開示の範囲は特許請求の範囲のみによって定義される。
実施例又は別の形で記載される場合を除き、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を示す数はすべて、すべての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、割合と関連して使用されるとき、±１％を意味し得る。
別段の記載がない限り、本明細書で使用される「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、慣例に従い、「１つ又は複数」を意味する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「残基」という用語は、互換的に使用され、ペプチド又はポリペプチドとの関連で使用されるとき、天然起源のアミノ酸と合成のアミノ酸との両方、並びに天然起源のアミノ酸と化学的に類似したアミノ酸類似体、アミノ酸模倣体及び非天然起源のアミノ酸を指す。
「天然起源のアミノ酸」は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、並びに遺伝コードによってコードされ、合成された後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然起源のアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチルメチオニンスルホニウムである。そのような類似体は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は改変されたペプチド骨格を有し得るが、天然起源のアミノ酸と同一の基本化学構造を保持するであろう。
「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般化学構造と異なる構造を有するが、天然起源のアミノ酸と類似の様式で機能する化学化合物である。例としては、アミドのメタクリロイル誘導体又はアクリロイル誘導体、β−イミノ酸、γ−イミノ酸、δ−イミノ酸（ピペリジン−４−カルボン酸など）などが挙げられる。
「非天然起源のアミノ酸」は、天然起源のアミノ酸と同一の基本化学構造を有するが、翻訳複合体によって伸長ポリペプチド鎖に組み込まれない化合物である。「非天然起源のアミノ酸」には、限定はされないが、天然にコードされるアミノ酸（限定はされないが、２０の一般的なアミノ酸を含む）が修飾（例えば、翻訳後修飾）されることによって生じるが、翻訳複合体によって伸長ポリペプチド鎖にそれ自体が天然に組み込まれることのないアミノ酸も含まれる。ポリペプチド配列に挿入することができる、又はポリペプチド配列における野生型残基の代わりに使用することができる非天然起源のアミノ酸の例のリストには、限定はされないが、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び側鎖が誘導体化されたアミノ酸が含まれる。例としては、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎ又はＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリシン（ｈＬｙｓ又はｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ又はｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬ又はＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリシン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰ又は４−アミノ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリシン（「Ｋ（Ｎε−グリシル）」又は「Ｋ（グリシル）」又は「Ｋ（ｇｌｙ）」と略される）、ニトロフェニルアラニン（ニトロｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（アミノｐｈｅ又はアミノ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ベンジルｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ヒドロキシｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（アセチルａｒｇ）、α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（又はビフェニルアラニン、４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）及び他の類似アミノ酸、並びに具体的に記載のもののいずれかの誘導体化形態が挙げられ、これらのものは、Ｌ−形態又はＤ−形態をとり、括弧内は略語である。
「単離された核酸分子」という用語は、５’末端から３’末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基若しくはリボヌクレオチド塩基の一本鎖若しくは二本鎖のポリマー又はその類似体であって、細胞源から全核酸が単離されるときにその核酸と共に天然に見出されるポリペプチド、ペプチド、脂質、糖質、ポリヌクレオチド、又は他の物質の少なくとも約５０パーセントが取り除かれているものを指す。好ましくは、単離された核酸分子は、その核酸の天然環境において見出され、ポリペプチド生成におけるその使用、又はその治療的、診断的、予防的、若しくは研究的な使用を妨害すると想定される任意の他の混入核酸分子又は他の分子を実質的に含まない。
「単離されたポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、ポリヌクレオチド、又は供給源細胞から単離された場合にポリペプチドが天然に見出される他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離されたポリペプチドをいう。単離されたポリペプチドは、その天然環境において見出され、その治療的、診断的、予防的、又は研究的な使用を妨害すると想定される任意の他の汚染性ポリペプチド又は他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。
リンカー部分を介して別の抗体又は抗体断片に直接又は間接的に連結、付着、又は結合した薬物又はペプチドを含む本発明の組成物は、「コンジュゲート」又は「コンジュゲートされた」分子である。
「コードする」という用語は、１つ又は複数のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を指す。用語は、開始コドン又は終始コドンを必要としない。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列と関連する「同一の」及び「同一性」パーセントという用語は、同一である２つ以上の配列又は部分配列を指す。「同一性パーセント」は、比較分子におけるアミノ酸又はヌクレオチドの間で残基が同一であるパーセントを意味し、比較される分子の中で最小のもののサイズに基づいて計算される。こうした計算では、アライメントにおけるギャップ（存在する場合）は、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により対処することができる。アラインした核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用し得る方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），（１９８８）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが含まれる。
同一性パーセントを計算する際には、比較する配列を、配列間の最大の一致を与えるような方法でアラインする。同一性パーセントを決定するために使用されるコンピュータプログラムは、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一性パーセントを決定する２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドをアラインさせるために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドが最適に一致するようにアラインされる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（３×平均対角として計算される。ここで、「平均対角」は使用される比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」は特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、並びにＰＡＭ ２５０又はＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスが、アルゴリズムと共に使用される。特定の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２を参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照）もまたアルゴリズムによって使用される。
ＧＡＰプログラムを使用し、ポリペプチド又はヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメータには、以下のものがある。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上記）のＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティー：１２（ただし、エンドギャップに対するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列をアラインするための特定のアライメントスキームを用いると、２つの配列において短い領域のみが一致する可能性があり、アラインされたこの短い領域は、２つの全長配列の間に顕著な関連性が存在せずとも非常に高い配列同一性を有する可能性がある。したがって、所望するならば、標的ポリペプチドの少なくとも５０の連続するアミノ酸にまたがるアライメントが得られるように、選択したアライメント法（例えば、ＧＡＰプログラム）を調整することができる。
本明細書で使用される「抗原結合タンパク質」は、特定の標的抗原に特異的に結合する任意のタンパク質を意味する。この用語は、少なくとも２本の全長重鎖及び２本の全長軽鎖を含むインタクトな抗体、並びにその誘導体、多様体、断片及び変異物を包含する。抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片及びＦｖ断片が含まれる。抗原結合タンパク質には、以下にさらに記載されるｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ及びｓｃＦｖなどのドメイン抗体も含まれる。
一般に、抗原結合タンパク質は、その抗原結合タンパク質が非標的分子に対して本質的にバックグラウンドの結合を示すとき、その標的抗原に「特異的に結合する」と言われる。しかしながら、標的に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、異なる種に由来する標的抗原と交差反応し得る。典型的には、抗原結合タンパク質は、表面プラズマ共鳴手法（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ，ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）又は結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）によって測定される解離定数（ＫＤ）が≦１０−７Ｍであると標的に特異的に結合する。抗原結合タンパク質は、記載の方法を使用して測定されるＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき、「高い親和性」で標的に特異的に結合し、記載の方法を使用して測定されるＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき、「非常に高い親和性」で標的に特異的に結合する。
「抗原結合領域」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質又はタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に与えるアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、典型的には、免疫グロブリン、一本鎖免疫グロブリン、又はラクダ科の動物の抗体の「相補的結合領域」（「ＣＤＲ」）を１つ又は複数含む。特定の抗原結合領域は、１つ又は複数の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合の特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切な立体構造の維持に役立つことで、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進することができる。
「組換えタンパク質」は組換え手法を用いて、すなわち、本明細書に記載されるような組換え核酸の発現によって作製されるタンパク質である。組換えタンパク質の生成方法及び生成手法は、当該技術分野においてよく知られている。
「抗体」という用語は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、又は標的抗原への特異的結合についてインタクトな抗体と競合することができるその断片を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体及び二重特異性抗体を含む。したがって、「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも２本の全長重鎖及び２本の全長軽鎖を含む。抗体は、単一の供給源のみに由来するか、又は「キメラ」、すなわち、以下にさらに記載されるように、その抗体の異なる部分が、２つの異なる抗体に由来し得るものであり得る。抗原結合タンパク質、抗体、又は結合断片は、ハイブリドーマにおいて、組換えＤＮＡ手法により又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的な切断により生成され得る。
抗体又はその断片に関して使用される「軽鎖」という用語は、全長軽鎖、及び結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメイン（ＶＬ）及び定常領域ドメイン（ＣＬ）を含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、カッパ鎖及びラムダ鎖が含まれる。
抗体又はその断片に関して使用される「重鎖」という用語は、全長重鎖、及び結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメイン（ＶＨ）並びに３つの定常領域ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置し、ＣＨドメインは、カルボキシル末端に位置し、ＣＨ３が、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い位置に存在する。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１サブタイプ及びＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、並びにＩｇＥを含む、任意のアイソタイプのものであり得る。
本明細書で使用される、抗体又は免疫グロブリンの鎖（重鎖又は軽鎖）の「免疫学的に機能性の断片」（又は単に「断片」）という用語は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠いているが、抗原に特異的に結合する能力を有する抗体の一部（その部分がどのように得られるか、又は合成されるかは問われない）を含む抗原結合タンパク質である。そのような断片は、それが標的抗原に特異的に結合するという点で生物学的に活性であり、所与のエピトープへの特異的に結合について、インタクトな抗体を含む、他の抗原結合タンパク質と競合することができる。
こうした生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ手法によって生成され得、又はインタクトな抗体を含む、抗原結合タンパク質の酵素的若しくは化学的な切断によって生成され得る。免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片には、限定はされないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。
別の実施形態では、Ｆｖ、ドメイン抗体及びｓｃＦｖであり、これらは、本発明の抗体に由来し得る。
例えば、１つ又は複数のＣＤＲなど、本明細書に開示の抗原結合タンパク質の機能性部分は、第２のタンパク質又は小分子に共有結合させることで、体における特定の標的を対象とする治療剤を創出し、二機能性の治療特性を持たせるか、又は血清半減期を延長できることがさらに企図される。
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域とから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によってまとめられる。
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインに加えてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含む１つの重鎖の一部とを含み、その結果、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成することでＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖とを含み、その結果、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間に形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によってまとめられた２つのＦａｂ’断片から構成される。
「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖との両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
「一本鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖及び軽鎖可変領域が抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成するために、可撓性リンカーによって連結されているＦｖ分子である。ｓｃＦｖについては、国際公開第８８／０１６４９号パンフレット、並びに米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び同第５，２６０，２０３号明細書に詳細に論じられており、これらの開示は、参照により組み込まれる。
「ドメイン抗体」又は「一本鎖免疫グロブリン」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。ドメイン抗体の例には、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が含まれる。いくつかの場合、２つ以上のＶＨ領域が、ペプチドリンカーを介して共有結合で連結されることで二価のドメイン抗体が創出される。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一又は異なる抗原を標的とし得る。
「二価の抗原結合タンパク質」又は「二価の抗体」は、２つの抗原結合領域を含む。いくつかの場合、２つの結合領域は、同一の抗原特異性を有する。二価の抗原結合タンパク質及び二価の抗体は、二重特異性であり得、これについては以下を参照されたい。
「多特異性抗原結合タンパク質」又は「多特異性抗体」は、複数の抗原又はエピトープを標的とするものである。
「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」又は「二重特異性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」の抗原結合タンパク質又は抗体は、それぞれハイブリッドの抗原結合タンパク質又は抗体であり、２つの異なる抗原結合部位を有する。二重特異性の抗原結合タンパク質及び抗体は、多特異性抗原結合タンパク質又は多特異性抗体の一種であり、限定はされないが、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含む、様々な方法によって生成され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二重特異性の抗原結合タンパク質又は抗体の２つの結合部位は、２つの異なるエピトープに結合し、こうした２つの異なるエピトープは、同一又は異なるタンパク質標的に存在し得る。
抗原結合タンパク質（例えば、抗体）との関連において使用されるとき、「競合する」という用語は、抗原結合タンパク質間の競合が、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的に機能性の断片）が試験下で阻止又は阻害するアッセイによって決定されることを意味する。多くの種類の競合結合アッセイを使用することができ、それには、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２を参照）、及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）が含まれる。典型的には、このようなアッセイでは、固体表面に結合した精製抗原又はこうした抗原のいずれかを有する細胞、非標識試験抗原結合タンパク質及び標識参照抗原結合タンパク質が使用される。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例において提供される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在すると、競合する抗原結合タンパク質は、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合が少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％阻害する。いくつかの場合、結合は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％以上阻害される。
「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体を含む）などの選択的結合剤による結合を受ける能力を有し、さらに、その抗原に結合する能力を有する抗体を生成するために動物において使用することが可能な分子又は分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用する能力を有する１つ又は複数のエピトープを有し得る。
「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により結合される分子の一部である。この用語は、抗体などの抗原結合タンパク質に特異的に結合する能力を有する任意の決定基を含む。エピトープは、連続的又は非連続的（不連続的）（例えば、ポリペプチドでは、そのポリペプチド配列では互いに連続的ではないが、その分子の中で結び付きを有するアミノ酸残基は、抗原結合タンパク質による結合を受ける）であり得る。立体構造エピトープは、活性タンパク質の立体構造には存在するが、変性タンパク質には存在しないエピトープである。特定の実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質を生成するために使用されるエピトープと類似した三次元構造をそれが含むが、抗原結合タンパク質を生成するために使用されるそのエピトープにおいて見られるアミノ酸残基をそれが含まないか、又はそのいくつかのみを含むという点で模倣的であり得る。エピトープは、タンパク質に存在することが最も多いが、場合により、核酸などの他の種類の分子に存在し得る。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基又はスルホニル基などの化学的に活性な表面分類の分子を含み得、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗原結合タンパク質は、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物において標的抗原に存在するエピトープを優先的に認識する。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」は、記載された分子種が、存在する優勢な種であること、すなわちモル基準で同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の実施形態では、実質的に純粋な分子は、対象種が存在するすべての巨大分子種の少なくとも５０％（モル基準で）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在するすべての巨大分子種の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％を構成する。他の実施形態では、対象種は、実質的な均一性を有するまで精製され、通常の検出方法によって組成物中に混入種を検出することはできず、したがって組成物は、単一の検出可能な巨大分子種からなる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖のヌクレオチドポリマーと二本鎖のヌクレオチドポリマーとの両方を含む。ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり得る。改変には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基改変、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース改変、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラダート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合の改変が含まれる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０の塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０〜４０のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築において使用するための一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのための放射標識、蛍光標識、ハプテン、又は抗原性標識を含む、標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー、又はハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
「単離された核酸分子」は、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくは合成を起源とするか、又はそれらの何らかの組み合わせであるＤＮＡ又はＲＮＡであって、単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドのすべて若しくは一部を伴わないか、又はそれが天然では連結されないポリヌクレオチドに連結されているＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本開示の目的では、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は、インタクトな染色体を包含しないと理解されるべきである。特定の核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、その特定の配列に加えて、最大で１０若しくはさらに最大で２０に及ぶ数の他のタンパク質若しくはその一部をコードする配列を含み得、又は記載の核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含み得、且つ／又はベクター配列を含み得る。
別段の記載がない限り、本明細書で議論される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物が５’から３’へと付加される方向は、転写方向と称される。ＲＮＡ転写物と同一の配列を有するＤＮＡ鎖に存在し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側に位置する配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡ転写物と同一の配列を有するＤＮＡ鎖に存在し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側に位置する配列領域は、「下流配列」と称される。
「制御配列」という用語は、それが連結されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物向けの制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物向けの制御配列は、転写因子のための認識部位を１つ又は複数含むプロモーター、転写エンハンサー配列及び転写終結配列を含み得る。「制御配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を含み得る。
「ベクター」という用語は、宿主細胞へのタンパク質コード情報の導入に使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、又はウイルス）を意味する。
「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、そこに作動可能に連結される１つ又は複数の異種性コード領域の発現を（宿主細胞と協同して）誘導及び／又は制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現コンストラクトは、限定はされないが、転写、翻訳に影響するか、又はそれを制御し、イントロンが存在するのであれば、そこに作動可能に連結されるコード領域のＲＮＡスプライシングに影響する配列を含み得る。
本明細書で使用される「作動可能に連結される」は、この用語が適用される構成要素が、適切な条件下でそれがその固有機能を実施することが可能になる関係にあることを意味する。例えば、ベクターにおいてタンパク質コード配列に「作動可能に連結」制御配列は、制御配列の転写活性と適合する条件下でタンパク質コード配列の発現が達成されるようにそこに連結される。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されており、それによって目的とする遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語には、目的遺伝子が存在する限り、子孫の形態又は遺伝的構成が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然起源のアミノ酸ポリマーにも適用される。この用語はまた、例えば、糖タンパク質を形成するための糖質残基の付加、又はリン酸化によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し得る。ポリペプチド及びタンパク質は、天然起源及び非組換え細胞によって産生し得るか、又は遺伝子操作若しくは組換えられた細胞によって産生され、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、或いは天然の配列からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失、それへの付加及び／又はその置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、具体的には、抗原結合タンパク質、抗体、或いは抗原結合タンパク質からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失、それへの付加及び／又はその置換を有する配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、全長タンパク質と比較して、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部の欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片は、全長タンパク質と比較して改変されたアミノ酸も含み得る。特定の実施形態では、断片は、約５〜５００のアミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、又は少なくとも４５０のアミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含む、抗体の免疫学的に機能性の断片が含まれる。
「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）それと共に通常見られると想定される他のタンパク質を少なくともいくつかは含まないか、（２）例えば、同一種などの同一源に由来する他のタンパク質を実質的に含まないか、（３）異なる種に由来する細胞によって発現するか、（４）天然ではそれに付随するポリヌクレオチド、脂質、糖質、若しくは他の物質の少なくとも約５０パーセントが取り除かれているか、（５）天然ではそれに付随しないポリペプチドと（共有結合的若しくは非共有結合的な相互作用によって）作動可能に結び付いているか、又は（６）天然には生じないことを意味する。一般的には、「単離されたタンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、又は少なくとも約５０％を構成する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、若しくは合成起源の他のＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせにより、そのような単離されたタンパク質はコードされ得る。単離されたタンパク質は、その天然環境において見出され、その治療、診断、予防、研究又は他の使用を妨害すると想定されるタンパク質若しくはポリペプチド又は他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。
ポリペプチド（例えば、抗体などの抗原結合タンパク質）の「多様体」は、別のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失及び／又は置換が生じたアミノ酸配列を含む。多様体には、融合タンパク質が含まれる。
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学部分へのコンジュゲーションによって、挿入、欠失、又は置換による多様体と異なる何らかの様式で化学的に改変されたポリペプチド（例えば、抗体などの抗原結合タンパク質）である。
ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質に関連して本明細書を通して使用される「天然起源」という用語は、天然に見出される物質を指す。
本明細書で使用される「対象」又は「患者」は、任意の哺乳類であり得る。典型的な実施形態では、対象又は患者は、ヒトである。
「保存的アミノ酸置換」は、天然のアミノ酸残基（すなわち野生型ポリペプチド配列の所与の位置に存在する残基）の、非天然の残基（すなわち野生型ポリペプチド配列の所与の位置に存在しない残基）による置換を含み得、置換の結果、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷に対する影響はほとんどないか又は全くない。保存的アミノ酸置換はまた、典型的には、生物学的な系における合成によってではなく、化学的なペプチド合成によって組み込まれる非天然起源のアミノ酸残基を包含する。こうしたものには、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分が逆転又は反転した他の形態が含まれる。
天然起源の残基は、下記の共通の側鎖特性に基づくクラスに分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
アミノ酸のさらなるグループもまた、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ（２ｄ Ｅｄ．１９９３），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている原理により明確に説明し得る。いくつかの場合、そのような特性の２つ以上に基づいて置換をさらに特徴付けることが有用であり得る（例えば、Ｔｈｒ残基などの「極性の小さい」残基での置換は、適切な状況では高度に保存的な置換となり得る）。
保存的置換は、こうしたクラスの１つのメンバーと、同一クラスの別のメンバーとの交換を含み得る。非保存的置換は、こうしたクラスの１つのメンバーと、別のクラスのメンバーとの交換を含み得る。
上記の分類のものと類似の生理化学的特性を有することが知られる合成アミノ酸残基、希少アミノ酸残基、又は改変アミノ酸残基を、配列における特定のアミノ酸残基を「保存的」に置換するものとして使用することができる。例えば、Ｄ−Ａｒｇ残基は、典型的なＬ−Ａｒｇ残基を置換するものとして働き得る。２つ以上の上記のクラスに関して特定の置換を説明することができる場合もあり得る（例えば、小さい疎水性の残基での置換は、上記のクラスの両方に見られる残基、又は両方の定義を満たすそのような残基と類似の生理化学的特性を有することが当該技術分野において知られる他の合成残基、希少残基、若しくは改変残基での１つのアミノ酸の置換を意味する）。
「ベクター」は、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進する送達媒体、（ｂ）そこからのポリペプチドの生成を促進する送達媒体、（ｃ）それを用いる標的細胞の遺伝子導入／形質転換を促進する送達媒体、（ｄ）核酸配列の複製を促進する送達媒体、（ｅ）核酸の安定性を促進する送達媒体、（ｆ）核酸及び／又は形質転換／遺伝子導入細胞の検出を促進する送達媒体、並びに／又は（ｇ）ポリペプチドをコードする核酸に対して有利な生物学的機能及び／若しくは生理化学的機能を別の形で付与する送達媒体を指す。ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター及び合成核酸ベクター（適切な一連の発現制御要素を含む核酸配列）を含む、任意の適切なベクターであり得る。このようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター、及びウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが挙げられる。
組換え発現ベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は真核細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞、酵母細胞、若しくは哺乳類細胞）においてタンパク質が発現するように設計することができる。１つの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類の非ヒト宿主細胞である。代表的な宿主細胞には、典型的にはクローニング及び発現に使用される宿主が含まれ、こうした宿主には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株であるＴＯＰ１０Ｆ’、ＴＯＰ１０、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５ａ、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、哺乳類細胞株であるＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ２９３、２９３−ＥＢＮＡｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９（１９８９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）が含まれる。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼ及びインビトロの翻訳システムを使用し、インビトロで転写及び翻訳することができる。ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含むクローニング部位の上流にプロモーターを含むことが好ましい。スイッチのオンオフが切り替え可能なプロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターが挙げられる。
様々な実施形態において、ベクターは、標的ポリペプチドの発現を調節する作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。ベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハンサー及び他の発現促進要素を含むか、又はそれと結び付けられ得る。そのような要素の例としては、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３−３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、若しくはＨＩＶ ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター）、有効なポリ（Ａ）終結配列、Ｅ，コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミド産物のための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子及び／又は簡便なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。ベクターはまた、ＣＭＶ ＩＥなどの構成的プロモーターとは対照的な誘導性プロモーターを含み得る。１つの態様では、肝臓組織又は膵臓組織などの代謝に関連する組織における配列の発現を促進する組織特異的プロモーターに作動可能に連結された標的ポリペプチドをコードする配列を含む核酸が提供される。
本開示の別の態様では、本明細書に開示の核酸及びベクターを含む宿主細胞が提供される。様々な実施形態において、ベクター又は核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、他の実施形態では、ベクター又は核酸は、染色体外に存在する。
そのような核酸、ベクター、又はそれらのいずれか若しくは両方の組み合わせを含む酵母細胞、細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））及び哺乳類細胞（例えば、不死化哺乳類細胞）などの組換え細胞が提供される。様々な実施形態において、標的ポリペプチドの発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、又は直鎖発現要素などの非組み込み核酸を含む細胞が提供される。
本明細書で提供される標的ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、形質転換又は遺伝子導入によって宿主細胞に導入することができる。細胞を発現ベクターで形質転換する方法はよく知られている。
標的をコードする核酸は、ウイルスベクターにより宿主細胞又は宿主動物に配置及び／又は送達することができる。この能力を有する任意の好適なウイルスベクターを使用することができる。ウイルスベクターは、任意の数のウイルスポリヌクレオチドを、単独で、或いは所望の宿主細胞における本発明の核酸の送達、複製及び／又は発現を促進する１つ又は複数のウイルスタンパク質と組み合わせて含み得る。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムのすべて若しくは一部を含むポリヌクレオチド、ウイルスタンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又はウイルス核酸及びポリペプチドをコードする核酸を含むインタクトなウイルス粒子であり得る。ウイルス粒子であるウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子又は改変ウイルス粒子を含み得る。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターアンプリコンなど、複製及び／又は発現のための別のベクター又は野生型ウイルスが存在する必要があるベクターであり得る（例えば、ウイルスベクターは、ヘルパー依存性ウイルスであり得る）。典型的には、そのようなウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子からなるか、或いは導入遺伝子容量が増えるか、又は核酸の遺伝子導入及び／又は発現に役立つようにそのタンパク質及び／又は核酸含量が改変されたウイルス粒子からなる（そのようなベクターの例としては、ヘルペスウイルス／ＡＡＶアンプリコンが挙げられる）。典型的には、ウイルスベクターは、通常はヒトに感染するウイルスと類似のもの及び／又はそれに由来するものである。この点に関して好適なウイルスベクター粒子としては、例えば、アデノウイルスベクター粒子（アデノウイルス科（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）の任意のウイルス又はアデノウイルス科（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスに由来する任意のウイルスを含む）、アデノ随伴ウイルスベクター粒子（ＡＡＶベクター粒子）又は他のパルボウイルス及びパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）が挙げられる。
本明細書に記載されるように発現する標的ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法を使用して単離することができる。標的ポリペプチドは、それを自然に発現する細胞から単離することができ、又は例えば、標的ポリペプチドを自然には発現しない細胞など、標的ポリペプチドを発現するように操作された細胞から単離することができる。
標的ポリペプチドを単離するために用いることができるタンパク質精製方法、並びに関連する材料及び試薬は、当該技術分野において知られている。標的ポリペプチドを単離するために有用であり得るさらなる精製方法は、Ｂｏｏｔｃｏｖ ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１５１４−９，Ｆａｉｒｌｉｅ ＷＤ，２０００，Ｇｅｎｅ ２５４：６７−７６などの参考文献に見出すことができる。
提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）が１つ又は複数組み込まれ且つ／又は連結されるポリペプチドである。いくつかの抗原結合タンパク質では、ＣＤＲは、「フレームワーク」領域に組み込まれ、この領域によってＣＤＲの方向が整えられ、その結果、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が達成される。本明細書に記載の特定の抗原結合タンパク質は、抗体であるか、又は抗体に由来する。他の抗原結合タンパク質では、ＣＤＲ配列は、異なる型のタンパク質骨格に組み込まれる。
一般に、提供される抗原結合タンパク質は、典型的には、本明細書に記載のＣＤＲを１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ）含む。いくつかの場合、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造と、（ｂ）ポリペプチド構造に挿入及び／又は連結される１つ又は複数のＣＤＲとを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態をとり得る。例えば、ポリペプチド構造は、天然起源の抗体又はその断片若しくは多様体のフレームワークであり得るか、又はそれを含み得、或いは本質的に完全に合成のものであり得る。様々なポリペプチド構造の例が以下にさらに記載される。
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であるか、又は抗体に由来する。したがって、提供される特定の抗原結合タンパク質の例には、限定はされないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）などのドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣体」と称されることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体、及びそれぞれのその一部又は断片が含まれる。いくつかの場合、抗原結合タンパク質は、完全抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）である。他の場合、抗原結合タンパク質は、本発明の抗体に由来するＣＤＲを使用するｓｃＦｖである。
別の態様では、インビトロ又はインビボ（例えば、ヒト対象に投与された場合）の半減期が少なくとも１日である抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。様々な他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、４０日、５０日、又は６０日以上の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、非誘導体化抗体又は非改変抗体と比較してその半減期が長くなるように誘導体化又は改変される。別の実施形態では、血清半減期を増加させるために抗原結合タンパク質は点変異を含む。そのような変異体及び誘導体化形態に関する詳細は、以下にさらに提供される。
提供される抗原結合タンパク質のいくつかは、典型的には、天然起源の抗体と関連する構造を有する。こうした抗体の構造単位は、典型的には、１つ又は複数の四量体を含み、四量体はそれぞれ、ポリペプチド鎖の２つの同一のカプレットから構成されるが、哺乳類のいくつかの種は、単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。典型的な抗体では、それぞれの対又はカプレットは、１つの全長「軽」鎖（特定の実施形態では、約２５ｋＤａ）と、１つの全長「重」鎖（特定の実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）とを含む。個々の免疫グロブリン鎖はそれぞれ、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」から構成され、「免疫グロブリンドメイン」はそれぞれ、およそ９０〜１１０のアミノ酸からなり、特徴的なフォールディングパターンを示す。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識を担う可変ドメインを含む。カルボキシ末端部分は、鎖のもう一方の末端と比較して進化的に保存度が高く、「定常領域」又は「Ｃ領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般に、カッパー軽鎖及びラムダ軽鎖に分類され、こうした軽鎖はそれぞれ、１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含む。重鎖は、典型的には、ミュー鎖、デルタ鎖、ガンマ鎖、アルファ鎖、又はイプシロン鎖に分類され、こうした鎖は、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧは、限定はされないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む、いくつかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプには、ＩｇＭ及びＩｇＭ２が含まれる。ＩｇＡサブタイプには、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が含まれる。ヒトでは、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプは、４本の重鎖及び４本の軽鎖を含み、ＩｇＧ及びＩｇＥアイソタイプは、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み、且つＩｇＭアイソタイプは、５本の重鎖及び５本の軽鎖を含む。重鎖のＣ領域は、典型的には、エフェクター機能を担い得るドメインを１つ又は複数含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存する。ＩｇＧの重鎖は、例えば、重鎖のそれぞれが、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体は、これらのアイソタイプ及びサブタイプのいずれかを有することができる。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、又はＩｇＧ４サブタイプのものである。
全長の軽鎖及び重鎖では、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。
本明細書で提供される抗体では、免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に、３つの超可変領域（「相補性決定領域」又はＣＤＲと呼ばれることの方が多い）によって連結された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む同一の全体構造を示す。上述のそれぞれの重鎖／軽鎖対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列されることで、抗原の特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然起源の軽鎖及び重鎖の可変領域は両方とも、典型的には、これらの要素が以下の順序に従う：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。これらのドメインの各々に位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための番号付けシステムが考案されている。この番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７及び１９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）又はＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３に定義されている。
本発明は、少なくとも１つのコンジュゲーション部位を有する抗原結合タンパク質を含む組成物に関する。コンジュゲーション部位は、コンジュゲーション部位でのアミノ酸残基の側鎖を通した規定コンジュゲーション化学によって付加する機能性部分（例えば、薬物、リガンド又はペプチド）のコンジュゲーションに適用可能でなければならない。本発明に従って抗原結合タンパク質に対し高い選択性の部位特異的コンジュゲーションを達成するには、多様な設計基準の考察を必要とする。第一に、好ましいコンジュゲーション又は結合化学が定義又は規定されなければならない。機能性部分は、当該技術分野で知られる様々なコンジュゲーション化学を組み合わせることによって、抗原結合タンパク質の選択されたコンジュゲーション部位にコンジュゲート又は結合させることができる。例えば、抗原結合タンパク質上の接近可能なシステインチオールを標的とするマレイミド活性化コンジュゲーションパートナーは、１つの実施形態であるが、抗原結合タンパク質配列内の標準的又は非標準的な、例えば非天然のアミノ酸の側鎖を標的とする多くのコンジュゲーション化学反応又は結合化学反応を本発明に従って使用することができる。
化学選択的コンジュゲーションのための化学反応としては、銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン［３＋２］二極性付加環化、シュタウディンガーライゲーション、他のアシル転移プロセス（Ｓ→Ｎ；Ｘ→Ｎ）、オキシム化、ヒドラゾン結合形成及び他の適切な有機化学反応、例えば水溶性パラジウム触媒を使用するクロスカップリングなどが挙げられる。（例えば、Ｂｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｄ（０）−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｎ ｗａｔｅｒ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（１６）：２５０９−１１（２００１）；Ｄｉｂｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｙ ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃ−Ｃ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｎ ｗａｔｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７（４）：４７６−７８（１９９８）；ＤｅＶａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｑｕｅｏｕｓ−ｐｈａｓｅ，ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ａｒｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅｓ ｕｎｄｅｒ ｍｉｌｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｕｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ，ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｄｅｍａｎｄｉｎｇ ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６９：７９１９−２７（２００４）；Ｓｈａｕｇｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，２００３，６８，６７６７−６７７４；Ｐｒｅｓｃｈｅｒ，ＪＡ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ ＣＲ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １（１）；１３−２１（２００５））。
上述したように、抗原結合タンパク質へのコンジュゲーション（又は共有結合）は、コンジュゲーション部位でのアミノ酸残基、例えばシステイニル残基（これに限定されない）側鎖によって行われる。選択される内部コンジュゲーション部位でのアミノ酸残基、例えばシステイニル残基は、天然Ｆｃドメイン配列内の同一アミノ酸残基位置を占めるアミノ酸残基であるか、又は置換若しくは挿入によってＦｃドメイン配列内へ操作され得る。
全抗原結合タンパク質内のコンジュゲーション部位の配置の選択は、本発明に従って内部コンジュゲーション部位を選択することの別の重要な局面である。抗原結合タンパク質上の露出したアミノ酸残基のいずれも、強力に有用なコンジュゲーション部位であり得、抗原結合タンパク質配列の選択されたコンジュゲーション部位に前に存在していない場合、部位選択的結合のためにシステイン又は何らかの他の反応性アミノ酸に変異させることができる。しかし、このアプローチは、コンジュゲートパートナーの活性を攪乱させるか、又は操作された変異の反応性を制限する可能性がある潜在的立体障害を考慮に入れていない。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体又はその機能的断片である。一実施形態では、抗体又はその機能的断片は、参照配列（配列番号７）に対する抗体軽鎖のＤ７０、参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＥ２７６、及び参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＴ３６３からなる群から選択される１つ又は複数のコンジュゲーション部位にシステイン又は非標準的なアミノ酸アミノ酸置換を含む。明快にするために、「参照配列（配列番号７）に対する抗体軽鎖のＤ７０」は、抗体５Ｇ１２．００６の軽鎖のＡＨｏ位置Ｄ８８及び抗体５Ｇ１２．００６の軽鎖のカバット位置Ｄ７０と同じ置換部位であり、「参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＥ２７６」は、抗体５Ｇ１２．００６の重鎖のＡＨｏ位置Ｅ３８４及び抗体５Ｇ１２．００６の重鎖のカバット位置Ｅ２８５と同じ置換部位であり、「参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＴ３６３」は、抗体５Ｇ１２．００６の重鎖のＡＨｏ位置Ｔ４８７及び抗体５Ｇ１２．００６の重鎖のカバット位置Ｔ３８２と同じ置換部位である。
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２，１９９１中、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって記載されるシステムを使用して特定することができる。本明細書に開示の特定の抗体は、表４Ａ及び表４Ｂに示されるＣＤＲの１つ又は複数のアミノ酸配列と同一であるか、又はそれとの実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のアミノ酸配列を含む。こうしたＣＤＲでは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって記載されるシステムが使用される。
天然起源の抗体に含まれるＣＤＲの構造及び特性は上述されている。簡潔に記すと、従来の抗体では、ＣＤＲは、それらが抗原の結合及び認識を担う領域を構成する重鎖及び軽鎖の可変領域のフレームワーク内に組み込まれている。可変領域は、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲ（上記を参照（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３もまた参照されたい））を、フレームワーク領域（前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と命名されている；前出のＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７もまた参照されたい）内に含む。しかしながら、本明細書で提供されるＣＤＲは、従来の抗体構造の抗原結合ドメインを定義するために使用されるだけでなく、本明細書に記載の様々な他のポリペプチド構造に組み込むことができる。
提供される抗原結合タンパク質には、モノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた任意の手法を用いて、例えば免疫スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって生成され得る。脾臓細胞は、当該技術分野で知られた任意の手法を用いて、例えばそれらを骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成することによって不死化し得る。ハイブリドーマ生成融合手順に使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、且つ所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地においてそれらを増殖不可能にする酵素欠損を有する。マウス融合における使用に好適な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合において使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。
いくつかの場合、免疫原で動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）を免疫化し、免疫化した動物から脾臓細胞を収集し、収集した脾臓細胞を骨髄腫細胞株へ融合し、それによってハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立し、標的ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによってハイブリドーマ細胞株が生成される。このようなハイブリドーマ細胞株、及びそれが産生するモノクローナル抗体は、本願の態様である。
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体は、当該技術分野において知られる任意の手法を使用して精製することができる。ハイブリドーマ又はｍＡｂをさらにスクリーニングして、特定の特性を有するｍＡｂを同定することができる。
前述の配列に基づくキメラ抗体及びヒト化抗体も提供される。治療剤として使用するためのモノクローナル抗体は、使用前に様々な方法で改変してもよい。１つの例は、キメラ抗体であり、キメラ抗体は、機能性の免疫グロブリン軽鎖若しくは免疫グロブリン重鎖又はその免疫学的に機能性の部分を生成するために共有結合で連結される異なる抗体に由来するタンパク質セグメントからなる抗体である。一般に、重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であり、一方、鎖の残りは、別の種に由来する、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である。キメラ抗体に関する方法は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５を参照されたい。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤＲ移植については、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，５３０，１０１号明細書に記載されている。
一般に、キメラ抗体を作製する目標は、意図される患者種に由来するアミノ酸の数が最大化したキメラを創出することである。１つの例は、「ＣＤＲ移植」抗体であり、この抗体は、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する相補性決定領域（ＣＤＲ）を１つ又は複数含む一方、抗体鎖の残部は、別の種に由来する、又は別の抗体クラス若しくは抗体サブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である。ヒトにおける使用では、げっ歯類抗体に由来する可変領域又は選択されるＣＤＲがヒト抗体に移植されることが多く、これによりヒト抗体の天然起源の可変領域又はＣＤＲが交換される。
キメラ抗体の１つの有用な型は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト動物で最初に産生したモノクローナル抗体から生成される。通常、抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体の特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基に相同であるように改変される。ヒト化は、例えば、ヒト抗体の対応領域をげっ歯類可変領域の少なくとも一部で置換することによる様々な方法を使用して実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照）。
一態様では、本明細書で提供される抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲは、同一又は異なる系統種に由来する抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）に移植される。例えば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であるＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、ＶＨ１２並びに／又はＶＬ１及びＶＬ２のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲをアラインさせて、コンセンサスアミノ酸配列を同定し得る。他の実施形態では、本明細書に開示の重鎖又は軽鎖のＦＲは、異なる重鎖又は軽鎖に由来するＦＲと交換される。一態様では、抗体の重鎖及び軽鎖のＦＲにおける希少アミノ酸は交換されず、残りのＦＲアミノ酸が交換される。「希少アミノ酸」は、ＦＲにおいて通常ではそれが見出されない位置に存在する特定のアミノ酸である。或いは、１つの重鎖又は軽鎖由来の移植可変領域は、本明細書に開示する特定の重鎖又は軽鎖の定常領域とは異なる定常領域とともに使用され得る。他の実施形態では、移植可変領域は一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。
特定の実施形態では、ヒト以外の種に由来する定常領域をヒト可変領域と共に使用することでハイブリッド抗体を生成することができる。
完全ヒト抗体もまた提供される。抗原にヒトを曝露することなく所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体（「完全ヒト抗体」）を作製するための方法が利用可能である。完全ヒト抗体の生成を実行するために提供される特定の手段の１つは、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、任意の所望の抗原で免疫化され得る動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する１つの手段である。完全ヒト抗体を使用することにより、マウス又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することによって引き起こされることがある免疫原性及びアレルギー反応を最小限に抑えることができる。
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常、マウス）を免疫化することによって生成することができる。この目的のための抗原は、通常、６個以上の連続するアミノ酸を有し、任意選択によりハプテンなどのキャリアにコンジュゲートされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８、及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、マウスのゲノム中に、ヒトの重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大きい断片を挿入することによって生産される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全相補体より少ない相補体を有する部分的に改変された動物を交雑して、所望の免疫系を全て改変した動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に対して免疫特異的であるが、マウスでなくヒトの、可変領域を含むアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法のさらなる詳細については、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体の作製するためのトランスジェニックマウスに関するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第６，７１３，６１０号明細書、同第６，６７３，９８６号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，３００，１２９号明細書、同第６，２５５，４５８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書及び同第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公開国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。
上記のトランスジェニックマウスは、本明細書では「ＨｕＭａｂ」マウスと称し、内因性の［ミュー］鎖及び［カッパー］鎖の遺伝子座を不活性化する標的化変異と共に、ヒトの重鎖（［ミュー］及び［ガンマ］）並びに［カッパー］軽鎖の非再編成免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭ又は［カッパー］の発現の減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧ［カッパー］モノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの作製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１に詳細に記載されており、これらの文献はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書及び同第５，７７０，４２９号明細書並びに米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４６号パンフレット及び国際公開第９２／０３９１８号パンフレットを参照されたい。これらすべての文献の開示内容は、参照によってそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するために利用される技術はまた、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。例えば、標的抗原に対するヒトモノクローナル抗体を生成するためにＨＣｏ７及びＨＣｏ１２のトランスジェニックマウス系統を使用することができる。トランスジェニックマウスを使用するヒト抗体の産生に関する詳細は、以下にさらに提供する。
ハイブリドーマ技術を使用することで、上記のものなどのトランスジェニックマウスから所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを生成及び選択することができる。そのような抗体は、適切なベクター及び宿主細胞を使用してクローニング及び発現させてよく、或いは、抗体は、培養したハイブリドーマ細胞から収集することができる。
完全ヒト抗体はまた、（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されるような）ファージディスプレイライブラリーに由来し得る。ファージディスプレイ手法は、糸状バクテリオファージの表面での抗体レパートリーのディスプレイと、選択される抗原に対するその結合によるファージのその後の選択とを介して免疫選択を模倣している。そのような手法の１つは、国際公開第９９／１０４９４号パンフレット（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質の誘導体も提供される。誘導体化された抗原結合タンパク質は、抗体又は断片に対して特定用途における半減期の増加などの所望の特性を付与する任意の分子又は物質を含み得る。誘導体化された抗原結合タンパク質は、例えば、検出可能（又は標識）部分（例えば、放射性分子、比色分析分子、抗原性分子、若しくは酵素分子、検出可能なビーズ（磁性若しくは高電子密度の（例えば、金）ビーズなど）、又は別の分子に結合する分子（例えば、ビオチン若しくはストレプトアビジン））、治療的又は診断的な部分（例えば、放射性部分、細胞傷害性部分、又は医薬的に活性な部分）、或いは特定用途（例えば、ヒト対象などの対象への投与、又は他のインビボ若しくはインビトロでの使用）のための抗原結合タンパク質の安定性を向上させる分子を含み得る。抗原結合タンパク質の誘導化に使用することができる分子の例には、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。抗原結合タンパク質のアルブミン連結誘導体及びＰＥＧ化誘導体は、当該技術分野においてよく知られる手法を使用して調製することができる。特定の抗原結合タンパク質には、ｐｅｇ化された本明細書に記載の一本鎖ポリペプチドが含まれる。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）又はＴＴＲ多様体にコンジュゲート又は連結される。ＴＴＲ又はＴＴＲ多様体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールからなる群から選択される化学物質で化学的に改変することができる。
他の誘導体としては、抗原結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合した異種性ポリペプチド含む組換え融合タンパク質の発現によるなどの、抗原結合タンパク質と他のタンパク質又はポリペプチドとの共有結合性又は集合性のコンジュゲートが挙げられる。例えば、コンジュゲートされるペプチドは、例えば、酵母アルファ因子リーダーなどの異種性のシグナル（若しくはリーダー）ポリペプチド、又はエピトープタグなどのペプチドであり得る。抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質は、抗原結合タンパク質の精製又は同定を容易にするために付加されたペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）を含み得る。抗原結合タンパク質はまた、Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４及び米国特許第５，０１１，９１２号明細書に記載のＦＬＡＧペプチドに連結することができる。ＦＬＡＧペプチドは、抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が可逆的に結合するエピトープを提供することで迅速なアッセイを可能にすると共に、発現する組換えタンパク質の精製を容易にする。所与のポリペプチドにＦＬＡＧペプチドが融合した融合タンパク質の調製に有用な試薬は市販されている（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つ又は複数の標識を含む。「標識基」又は「標識」という用語は、任意の検出可能な標識を意味する。好適な標識基としては、限定はされないが、下記のものが挙げられる：放射性同位体若しくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチン基、又は二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体向けの結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質にカップリングされる。タンパク質の標識方法は、当該技術分野において様々なものが知られており、そうしたものを適切となるように使用してよい。
「エフェクター基」という用語は、抗原結合タンパク質にカップリングされ、細胞傷害性物質として作用する任意の基を意味する。好適なエフェクター基の例は、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）である。他の適切な基としては、毒素、治療基、又は化学療法基が挙げられる。適切な基の例としては、カリチアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシン及びマイタンシンが挙げられる。いくつかの実施形態では、エフェクター基は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質にカップリングされる。
一般に、標識は、それが検出されることになるアッセイに応じて様々なクラスに分類される：ａ）同位体標識（放射性又は重同位体であり得る）、ｂ）磁性標識（例えば、磁性粒子）、ｃ）酸化還元活性部分、ｄ）光学色素；酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ｅ）ビオチン化された基、及びｆ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体向けの結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。いくつかの実施形態では、標識基は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質にカップリングされる。タンパク質の標識方法は、当該技術分野において様々なものが知られている。
特定の標識としては、光学色素が挙げられ、こうした光学色素には、限定はされないが、発色団、リン光体及びフルオロフォアが挙げられ、後者は多くの場合に特異的である。フルオロフォアは、「小分子」蛍光体又はタンパク質性蛍光体であり得る。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性によって検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、限定はされないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、並びにＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が挙げられる。フルオロフォアを含む、好適な光学色素については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されており、この文献は参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
好適なタンパク質性蛍光標識としてはまた、以下に限定はされないが、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）種、プチロサルカス（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）種又はエクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）及びレニラ（国際公開第９２／１５６７３号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９８／１４６０５号パンフレット、国際公開第９８／２６２７７号パンフレット、国際公開第９９／４９０１９号パンフレット、米国特許第５２９２６５８号明細書、同第５４１８１５５号明細書、同第５６８３８８８号明細書、同第５７４１６６８号明細書、同第５７７７０７９号明細書、同第５８０４３８７号明細書、同第５８７４３０４号明細書、同第５８７６９９５号明細書、同第５９２５５５８号明細書）が挙げられる。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質又はその一部をコードする核酸も提供され、こうした核酸としては、抗体の１方若しくは両方の鎖、又はその断片、誘導体、変異タンパク質、若しくは多様体をコードする核酸、重鎖可変領域又はＣＤＲのみをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定、分析、変異導入、又は増幅のためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、又はシークエンシングプライマーとしての使用に十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンス核酸、並びにこうしたものの相補配列が挙げられる。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００、又はそれを超える数のヌクレオチド長であり得、且つ／又は例えば調節配列などの追加の配列を１つ若しくは複数含み得、且つ／又は例えばベクターなどのより長い核酸の一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、ＲＮＡ及び／若しくはＤＮＡヌクレオチド、並びにその人工的な多様体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。本明細書で提供される任意の可変領域をこうした定常領域に付加することで完全な重鎖配列及び軽鎖配列を形成し得る。しかしながら、こうした定常領域配列が特定の例として提供されるにすぎないことは理解されるべきである。いくつかの実施形態では、可変領域配列は、当該技術分野において知られる他の定常領域配列に連結される。
特定の抗原結合タンパク質又はその一部（例えば、全長抗体、重鎖若しくは軽鎖、可変ドメイン、又はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、若しくはＣＤＲＬ３）をコードする核酸は、抗原で免疫化したマウスのＢ細胞から単離し得る。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によって単離し得る。ファージディスプレイは、それによって抗体及び他の抗原結合タンパク質の誘導体を調製し得る既知の手法の別の例である。１つの手法では、目的の抗原結合タンパク質の構成要素であるポリペプチドは、任意の適切な組換え発現系において発現し、発現したポリペプチドは、会合によって抗原結合タンパク質を形成することが可能である。
１つの態様では、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸にハイブリダイズする核酸がさらに提供される。核酸のハイブリダイズ法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９；６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書に定義される中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む事前洗浄液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣを含むハイブリダイゼーション緩衝液及び約５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は約５０％のホルムアミドを含むものなど、他の類似のハイブリダイゼーション溶液が４２℃のハイブリダイゼーション温度で使用される）、並びに０．５ｘＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて６０℃で行う洗浄条件が使用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、４５℃の６ｘＳＳＣ中でハイブリダイズし、続いて６８℃の０．１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で１回以上洗浄する。さらに、当業者であれば、ハイブリダイゼーション条件及び／又は洗浄条件を操作して、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加又は減少させることができる。
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータ及び好適な条件を考案するための手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（上記）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３−６．４）に記載されており、当業者であれば、例えば核酸の長さ及び／又は塩基組成に基づいて容易に決定することができる。
核酸への変異導入によって変更を導入することができ、それによってその核酸がコードするポリペプチド（例えば、抗体又は抗体誘導体）のアミノ酸配列に変更が生じる。変異は、当該技術分野において知られる任意の手法を使用して導入することができる。一実施形態では、例えば、部位特異的変異導入プロトコールを使用して１つ又は複数の特定のアミノ酸残基が変更される。別の実施形態では、例えば、ランダム変異導入プロトコールを使用して１つ又は複数の無作為に選択される残基が変更される。実施方法はどうあれ、変異ポリペプチドを発現させ、その所望の特性をスクリーニングすることができる。
変異は、それがコードするポリペプチドの生物学的活性を大きく改変することなく核酸に導入することができる。例えば、非必須アミノ酸残基位置でのアミノ酸置換につながるヌクレオチド置換を実施することができる。或いは、それがコードするポリペプチドの生物学的活性を選択的に変更する１つ又は複数の変異を核酸に導入することができる。例えば、変異によって生物学的活性を量的又は質的に変更することができる。量的な変更の例としては、活性の増加、低減、又は除去が挙げられる。質的な変更の例としては、抗体の抗原特異性の変更が挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれかをコードする核酸は、当該技術分野において十分に確立されている分子生物学手法を使用して変異導入してアミノ酸配列を改変することができる。
別の態様では、核酸配列の検出のためのプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとしての使用に適した核酸分子が提供される。核酸分子は、全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用することができる断片、又はポリペプチドの活性部分をコードする断片のみを含み得る。
核酸の配列に基づくプローブは、核酸又は類似の核酸の例えば、１つのポリペプチドをコードする複数の転写物の検出に使用することができる。プローブは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素の補因子などの標識基を含み得る。そのようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞の同定に使用することができる。
別の態様では、ポリペプチド又はその一部（例えば、１つ若しくは複数のＣＤＲ又は１つ若しくは複数の可変領域ドメインを含む断片）をコードする核酸を含むベクターが提供される。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、及び発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の核酸を含み得る。組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ又は複数の調節配列を含み、こうした調節配列は、発現する核酸配列に作動可能に連結されている。調節配列には、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の恒常的な発現を誘導するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーター及びサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば、組織特異的調節配列；Ｖｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７を参照されたい。この文献はそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、並びに特定の処理又は条件に応じてヌクレオチド配列の誘導性の発現を誘導するもの（例えば、哺乳類細胞におけるメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ）プロモーター、並びに原核生物系と真核生物系の両方におけるｔｅｔ応答性及び／又はストレプトマイシン応答性プロモーター（同文献を参照されたい）が含まれる。当業者には、発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることは理解されよう。発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質又はペプチドを含む、タンパク質又はペプチドを産生することができる。
別の態様では、組換え発現ベクターが導入された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））又は真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、若しくは哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であり得る。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換手法又は遺伝子導入手法によって原核細胞又は真核細胞に導入することができる。哺乳類細胞の安定した遺伝子導入は、使用する発現ベクター及び遺伝子導入手法に依存し、僅かな細胞画分のみでそのゲノムへ外来ＤＮＡの組み込み得ることが知られている。こうした組み込み体を同定及び選択するために、一般に、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性のためのもの）をコードする遺伝子が、目的遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。導入核酸が安定的に遺伝子導入された細胞は、数ある方法の中でも特に、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生き延びることになるが、他の細胞は死に至る）。
上記のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む、プラスミド、発現ベクター、転写カセット、又は発現カセットの形態の発現系及びコンストラクト、並びにそのような発現系又はコンストラクトを含む宿主細胞も本明細書で提供される。
本明細書で提供される抗原結合タンパク質は、多くの従来の手法のいずれかによって調製され得る。例えば、抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られる任意の手法を用いて、組換え発現系によって産生され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照されたい。
抗原結合タンパク質は、ハイブリドーマ細胞株（例えば、具体的には、抗体をハイブリドーマにおいて発現させ得る）又はハイブリドーマ以外の細胞株において発現させることができる。抗体をコードする発現コンストラクトは、哺乳類宿主細胞、昆虫宿主細胞、又は微生物宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の既知の方法を使用して実施することができ、こうした方法には、例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、同第４，９１２，０４０号明細書、同第４，７４０，４６１号明細書、同第４，９５９，４５５号明細書によって例示されているような、当該技術分野において知られる遺伝子導入手順によってウイルス又はバクテリオファージにポリヌクレオチドをパッケージングし、そのコンストラクトで宿主細胞に形質導入を行うものが含まれる。使用される最適な形質転換手順は、形質転換される宿主細胞がどの型かということに依存するであろう。哺乳類細胞への異種性ポリヌクレオチドの導入方法は当該技術分野においてよく知られており、限定はされないが、デキストラン媒介型遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型遺伝子導入、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、核酸と正に荷電した脂質との混合、及び核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが含まれる。
組換え発現コンストラクトは、典型的には、下記のものの１つ又は複数を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む：本明細書で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲ、軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及び／若しくはＣＨ３）並びに／又は抗原結合タンパク質の別の骨格部分。こうした核酸配列は、標準的なライゲーション手法を使用して適切な発現ベクターに挿入される。一実施形態では、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域は、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＣ末端に付加され、発現ベクターにライゲーションされる。ベクターは、典型的には、用いられる特定の宿主細胞において機能性となるように選択される（すなわち、ベクターは、宿主の細胞機構と適合し、遺伝子の増幅及び／又は発現を可能にし得る）。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを使用するタンパク質間相互作用検出法を使用するベクターが使用される（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号明細書（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。好適な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、又はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（以前は「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」）から購入することができる。抗体及び断片のクローニング及び発現のための他の有用なベクターとしては、Ｂｉａｎｃｈｉ ａｎｄ ＭｃＧｒｅｗ，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：４３９−４４（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。追加の好適な発現ベクターは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓにおいて議論されている。
典型的には、宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミドを維持するための配列と、外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列とを含むであろう。そのような配列は、まとめて「フランキング配列」と称され、特定の実施形態では、典型的には、下記のヌクレオチド配列の１つ又は複数を含むであろう：プロモーター、１つ又は複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライス部位及びアクセプタープライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチドの分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現すべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメント。こうした配列のそれぞれを以下に議論する。
任意選択により、ベクターは、「タグ」をコードする配列、すなわち抗原結合タンパク質をコードする配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得、こうしたオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）をコードするか、又はそれに対する市販の抗体が存在する、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニン）、若しくはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現に際してポリペプチドに融合され、宿主細胞からの抗原結合タンパク質の親和性精製又は検出のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、親和性マトリックスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。その後、任意選択で、切断のために特定のペプチダーゼを使用するなど、様々な手段によって精製抗原結合タンパク質からタグを除去することができる。
フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／又は株由来）、異種（すなわち、宿主細胞種又は株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源由来のフランキング配列の組み合わせ）、合成又は天然であり得る。したがって、フランキング配列の供給源は、任意の原核生物若しくは真核生物、任意の脊椎生物若しくは無脊椎生物、又は任意の植物であり得るが、但し、フランキング配列が宿主の細胞機構において機能性であり、宿主の細胞機構によって活性化可能であることが条件である。
ベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術分野においてよく知られるいくつかの方法のいずれによって得てもよい。通常、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離することができる。いくつかの例では、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知であり得る。この場合、核酸合成又はクローニングのための本明細書に記載の方法を使用してフランキング配列を合成することができる。
フランキング配列は、その全てが知られているか一部のみが知られているかにかかわらず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、及び／又はゲノムライブラリーを、同じ種又は別の種由来のオリゴヌクレオチド及び／又はフランキング配列断片などの好適なプローブでスクリーニングすることによって得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含むＤＮＡの断片を、例えば、コード配列、又は別の遺伝子を含み得るＤＮＡのより大きな断片から単離することができる。制限エンドヌクレアーゼで消化することで適切なＤＮＡ断片を生成した後、アガロースゲルによる精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）のカラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に知られる他の方法を使用して単離することによって単離を達成し得る。この目的の達成に好適な酵素の選択は、当業者には容易に分かるであろう。
通常、複製起点は商業的に購入された原核生物の発現ベクターの一部であり、起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製部位の起点を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに結合することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はＨＰＶ若しくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製要素の起点は、哺乳類の発現ベクターには不要である（例えば、ＳＶ４０の起点は、それがウイルス性の初期プロモーターも含むという理由のみで使用されることが多い）。
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドをコードする領域の末端に対して３’側に位置し、転写の終結に役立つ。通常、原核細胞における転写終止配列は、Ｇ−Ｃに富む断片とそれに続くポリＴ配列である。この配列は、ライブラリーから容易にクローニングされるか、又はさらにベクターの一部として商業的に購入される一方、本明細書に記載のものなど、核酸合成のための方法を使用しても容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞について、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、若しくはカナマイシンなどの抗生物質若しくは他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補完するタンパク質、又は（ｃ）複合培地若しくは定義培地からは利用不可能な重要栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。好都合なことに、ネオマイシン耐性遺伝子もまた原核宿主細胞と真核宿主細胞の両方における選択に使用し得る。
他の選択遺伝子を用いて、発現する遺伝子を増幅することができる。増幅は、増殖又は細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が組換え細胞の累代の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳類細胞に適した選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子及びプロモーターの存在しないチミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を、この形質転換体のみがベクター中に存在する選択可能な遺伝子によって生存するように特異的に適合されている選択圧下に置く。培地中の選択薬剤濃度を連続的に増加させる条件下で形質転換細胞を培養することによって選択圧力をかけ、それによって選択可能遺伝子と、標的ポリペプチドに結合する抗原結合タンパク質などの別の遺伝子をコードするＤＮＡの両方が増幅される。結果として、増幅されたＤＮＡから合成される抗原結合タンパク質などのポリペプチドの量が増加する。
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、通常、プロモーターの３’及び発現されるべきポリペプチドのコード配列の５’に位置する。
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が望まれる場合など、場合により、グリコシル化又は収量を改善するために様々なプレ配列又はプロ配列を操作し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、又はプロ配列を付加することができ、これもまたグリコシル化に影響し得る。最終的なタンパク質産物は、発現に伴って完全には除去されずに残存し得た１つ又は複数の追加のアミノ酸を（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１の位置に有し得る。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１個又は２個のアミノ酸残基を有し得る。或いは、酵素による切断部位をいくつか使用すると、成熟ポリペプチド内のそのような領域を酵素が切断するのであれば、結果的に所望のポリペプチドが僅かに切り詰められた形態で生じ得る。
発現及びクローニングは、典型的には、宿主生物によって認識され、抗原結合タンパク質をコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むであろう。プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス、誘導性プロモーター及び構成的プロモーターのうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度の変化などの培養条件の何らかの変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。一方、構成的プロモーターはそれらが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、すなわち、遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。好適なプロモーターは、制限酵素消化によって供給源のＤＮＡからプロモーターを取り出し、ベクターに所望のプロモーター配列を挿入することにより、抗原結合タンパク質を構成する重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結される。
酵母宿主と共に使用するのに好適なプロモーターもまた、当該技術分野においてよく知られている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳類宿主細胞での使用に適したプロモーターはよく知られており、こうしたプロモーターとしては、限定はされないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたものが挙げられる。他の好適な哺乳類プロモーターとしては、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターなどの異種性の哺乳類プロモーターが挙げられる。
抗原結合タンパク質を構成する軽鎖又は重鎖をコードするＤＮＡの、高等真核生物による転写を増加させるために、ベクターにエンハンサー配列を挿入し得る。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常、約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは方向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’及び３’の両方の位置に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトタンパク質及びインスリン）。しかし、通常、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野で知られているＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーはコード配列に対して５’又は３’でベクター中に位置し得るが、一般的にはプロモーターの５’の部位に位置する。細胞外への抗体の分泌を促進するために、適切な天然又は異種性のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体を産生する宿主細胞の型に依存し、天然のシグナル配列を異種性のシグナル配列と交換することができる。哺乳類宿主細胞において機能性であるシグナルペプチドの例としては、以下のものが挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列、欧州特許第０３６７５６６号明細書に記載のインターロイキン−４受容体のシグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載のＩ型のインターロイキン−１受容体のシグナルペプチド、欧州特許第０４６０８４６号明細書に記載のＩＩ型のインターロイキン−１受容体のシグナルペプチド。
一実施形態では、リーダー配列は、配列番号２１（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬ ＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡ ＲＣ）を含み、これは配列番号２２（ａｔｇｇａｃａｔｇａ ｇａｇｔｇｃｃｔｇｃ ａｃａｇｃｔｇｃｔｇ ｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃ ｔｇｃｔｇｔｇｇｃｔ ｇａｇａｇｇｃｇｃｃ ａｇａｔｇｃ）によってコードされる。別の実施形態では、リーダー配列は、配列番号２３（ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬ ＬＴＱＧＴＧＳＷＡ）を含み、これは配列番号２４（ａｔｇｇｃｃｔｇｇｇ ｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔ ｃｃｔｃａｃｃｃｔｃ ｃｔｃａｃｔｃａｇｇ ｇｃａｃａｇｇｇｔｃ ｃｔｇｇｇｃｃ）によってコードされる。
提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築してよい。このようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含むことも、また含まないこともあり得る。本明細書に記載のフランキング配列の１つ又は複数がベクター中にまだ存在しない場合、それらを個別に得て、ベクターに結合させることができる。それぞれのフランキング配列の取得に使用される方法は、当業者によく知られている。
ベクターを構築し、抗原結合配列を構成する軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に完成ベクターを挿入し得る。抗原結合タンパク質のための発現ベクターの選択宿主細胞への形質転換は、遺伝子導入、感染、リン酸カルシウムによる共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型遺伝子導入、又は他の既知の手法を含む、よく知られる方法によって達成することができる。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型の機能であろう。こうした方法及び他の適切な方法は、当業者によく知られており、例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１に示されている。
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、抗原結合タンパク質を合成し、これは、続いて、培養培地（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）から、又はそれを産生する宿主細胞（それが分泌されない場合）から直接回収され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいか又は必須のポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化など）及び生物学的に活性な分子へのフォールディングのし易さなどの様々な因子に依存するであろう。
発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野においてよく知られており、限定はされないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株（限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）及び多くの他の細胞株を含む）が含まれる。別の実施形態では、それ自身の抗体を作製しないが、異種抗体を作製し分泌する能力を有する、Ｂ細胞系列由来の細胞株を選択することができる。
本明細書で使用する「リンカー部分」は、本発明の組成物中に含有される毒素ペプチド類似体又は他のポリペプチド鎖（例えば、免疫グロブリンＨＣ若しくはＬＣ又は免疫グロブリンＦｃドメイン）のアミノ酸残基に共有結合されている生物学的に許容されるペプチジル又は非ペプチジル有機基を意味しており、そのリンカー部分は、その毒素ペプチド類似体又は他のポリペプチド鎖を組成物中の別のペプチド若しくはポリペプチド鎖又は半減期延長部分に共有的に結合又はコンジュゲートする。本組成物のいくつかの実施形態では、本明細書で記載する半減期延長部分は、毒素ペプチド類似体自体のアミノ酸残基又は任意選択で毒素ペプチド類似体のアミノ酸残基に共有結合されているペプチジル又は非ペプチジルリンカー部分（芳香族又はアリールリンカーを含むが、それらに限定されない）にコンジュゲートされている、すなわち直接的に共有結合されている。任意のリンカー部分の存在は、任意選択的である。存在する場合、その化学的構造は、主として、本発明の組成物の分子の１つ又は複数の他の機能的部分に関連して１つの機能的部分をポジショニング、結合、接続するか又は表示若しくは位置を最適化するためのスペーサーとして役立つため、さほど重要ではない。リンカー部分の存在は、本発明の組成物のいくつかの実施形態の薬理学的活性を最適化する際に有用であり得る。リンカーは、存在する場合、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を構築することができる。リンカー部分は、存在する場合、独立して、任意の他のリンカー又は本発明の組成物中に存在し得るリンカーと同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、本発明の毒素ペプチド類似体の多価ディスプレイを促進する多価リンカーであり得る。そのような生物学的に活性な化合物の多価ディスプレイは、親和性によって結合親和性及び／又は効力を増加させることができる。治療薬のインビボ特性は、ポリマー又はタンパク質へのコンジュゲーションによって変化（すなわち、特異的標的化、半減期延長、分布プロファイルなど）させることができる。
ペプチジルリンカー。上述のように、リンカー部分は、存在する場合（毒素ペプチド類似体の第１級アミノ酸配列内であっても、毒素ペプチド類似体へ半減期延長部分を付加させるためのリンカーとしてであっても）、実際には「ペプチジル」であってよく（すなわちペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構築される）、また、好ましくは１〜約４０のアミノ酸残基、より好ましくは１〜約２０のアミノ酸残基、最も好ましくは１〜約１０のアミノ酸残基の長さで構築されてよい。必ずではないが、リンカー内のアミノ酸残基は、２０の標準アミノ酸からのものが好ましく、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及び／又はセリンからのものがより好ましい。ペプチジルリンカーは、例えば、ペプチド結合によって連結されたグリシン、セリン及びアラニンなど、立体障害のない多数のアミノ酸から構築されることがより一層好ましい。また、ペプチジルリンカーは、存在する場合、インビボで循環中の急速なタンパク質分解性代謝回転を回避するペプチジルリンカーが選択されることも望ましい。これらのアミノ酸のいくつかは、当業者であれば明確に理解するようにグリコシル化されてよい。例えば、シアル化部位を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ１Ｘ２ＮＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号２５）（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である）。
他の実施形態では、ペプチジルリンカー部分の１〜４０のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択される。好ましくは、リンカーは、グリシン及びアラニンなどの、立体障害のない多数のアミノ酸から構築される。したがって、好ましいリンカーとしては、ポリグリシン、ポリセリン及びポリアラニン、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの例示的なペプチジルリンカーは、ポリ（Ｇｌｙ）１〜８、特に（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号２６）、（Ｇｌｙ）５（配列番号２７）及び（Ｇｌｙ）７（配列番号２８）並びにＧｌｙＳｅｒ及びポリ（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ、例えば「Ｌ１５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号２９）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）２〜４及びポリ（Ａｌａ）１〜８である。ペプチジルリンカーの他の特定の例としては、（Ｇｌｙ）５Ｌｙｓ（配列番号３０）及び（Ｇｌｙ）５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号３１）が含まれる。有用なペプチジルリンカーの他の例は以下の通りである。
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号３２）；
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号３３）；
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号３４）；及び
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号３５）。
上記の命名法を説明するために、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３６）を意味する。Ｇｌｙ及びＡｌａの他の組み合わせも有用である。
他の好ましいリンカーは、本明細書で「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ；又は「Ｇ４Ｓ」；配列番号３７）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号３８）；「Ｌ２０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号３９）；「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４０）として同定されたリンカー及び下記の実施例において使用した任意のリンカーである。
ペプチドリンカー部分を含む本発明の組成物のいくつかの実施形態では、酸性残基、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸残基は、リンカー部分のアミノ酸配列内に配置される。例として以下のペプチドリンカー配列が挙げられる。
ＧＧＥＧＧＧ（配列番号４１）；
ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号４２）；
ＧＥＥＥＧ（配列番号４３）；
ＧＥＥＥ（配列番号４４）；
ＧＧＤＧＧＧ（配列番号４５）；
ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号４６）；
ＧＤＤＤＧ（配列番号４７）；
ＧＤＤＤ（配列番号４８）；
ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号４９）；
ＷＥＷＥＷ（配列番号５０）；
ＦＥＦＥＦ（配列番号５１）；
ＥＥＥＷＷＷ（配列番号５２）；
ＥＥＥＦＦＦ（配列番号５３）；
ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号５４）；又は
ＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号５５）。
他の実施形態では、リンカーは、リン酸化部位、例えばＸ１Ｘ２ＹＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号５６）（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、及びＸ５は、それぞれ独立して任意のアミノ酸残基である）；Ｘ１Ｘ２ＳＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号５７）（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は、それぞれ独立して任意のアミノ酸残基である）、又はＸ１Ｘ２ＴＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号５８）（ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は、それぞれ独立して任意のアミノ酸残基である）を構成する。
ここに示すリンカーは例示的なものであり、本発明の範囲内のペプチジルリンカーは、はるかに長くてもよく、また他の残基を含んでもよい。ペプチジルリンカーは、例えば、システイン、別のチオール又は半減期延長部分とコンジュゲーションするための求核剤を含有することができる。別の実施形態では、リンカーは、システイン若しくはホモシステイン残基、又はマレイミド、ヨードアセトアミド若しくはチオエステルにコンジュゲーションするための他の２−アミノ−エタンチオール部分若しくは３−アミノ−プロパンチオール部分、官能化半減期延長部分を含有する。
別の有用なペプチジルリンカーは例えば、ランダムなＧｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列を含む大きな柔軟なリンカー、例えば、約１ｋＤａのＰＥＧ分子のサイズであると推定されるＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＨ（配列番号５９）又はＨＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴ（配列番号６０）である。或いは、有用なペプチジルリンカーは、剛性螺旋構造（例えば、剛性リンカー：−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧ−／／配列番号６１）を形成するために当該技術分野において知られるアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらに、ペプチジルリンカーはまた、式−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−の６炭素の脂肪族分子などの非ペプチジルセグメントを含むことができる。ペプチジルリンカーは、本明細書に記載した誘導体を形成するために変化させることができる。
非ペプチジルリンカー。任意選択で、非ペプチジルリンカー部分もまた、半減期延長部分を半減期延長部分コンジュゲート毒素ペプチド類似体のペプチド部分にコンジュゲートさせるために有用である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２〜２０）などのアルキルリンカーを使用できる。これらのアルキルリンカーはさらに、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの任意の非立体障害基によって置換されていてもよい。例示的な非ペプチジルリンカーはＰＥＧリンカー（例えば、以下に示す）である：
Figure 2020529986
 （式中、ｎは、リンカーが約１００〜約５０００ダルトン（Ｄａ）、好ましくは約１００〜約５００Ｄａの分子量を有するようなｎである）。
一実施形態では、非ペプチジルリンカーは、アリールである。リンカーは、本明細書に記載の方法と同じ方法で誘導体を形成するために変化させることができる。「アリール」は、フェニル、又は飽和、部分飽和若しくは不飽和の３員、４員又は５員の炭素架橋と近接融合したフェニルであり、フェニル又は架橋は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル又はハロから選択される０、１、２又は３つの置換基によって置換されている。「ヘテロアリール」は、不飽和の５員、６員若しくは７員の単環、又は部分飽和若しくは不飽和の６員、７員、８員、９員、１０員若しくは１１員の二環式環であって、少なくとも１つの環は不飽和である二環式環であり、これらの単環及び二環式環は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個の原子を含有し、その環は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜４ハロアルキル及びハロから選択される０、１、２又は３つの置換基によって置換されている。
非ペプチジルリンカー又は非ペプチド半減期延長部分などの本発明の組成物の非ペプチド部分は、従来の有機化学反応によって合成することができる。
多価リンカーの他の実施形態は、制御された長さの剛性ポリ複素環コアを含む。リンカーは、直交結合化学（すなわちアジド「クリック」、アミド結合、マレイミド又はハロアセトアミドとのアルキル化によるチオエーテル形成、オキシム形成、還元的アミノ化など）に適応するために片方の末端で化学的に識別される。
上記は単なる例示であり、本発明によって任意選択で使用できる様々な種類のリンカーの徹底的な処理ではない。
実施例１
抗ＧＩＰＲ／ＧＬＰ−１ペプチドコンジュゲートの生成
抗ＧＩＰＲ抗体２Ｇ１０＿ＬＣ１．００３を、配列番号１５１（軽鎖）にＥ７０Ｃ変異を有するように、又は配列番号１５２（重鎖）にＥ２７５Ｃ変異を有するように操作した。ビスシステアミンでキャップした抗ＧＩＰＲ Ｃｙｓ ｍＡｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中に３〜１２ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ１）を２〜４当量のトリフェニルホスフィン−３，３’，３”−トリスルホネートを用いて、室温で、部分的に還元した。陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を使用して、反応の進行をモニターした（典型的には１〜２時間で完了）。遊離したシステアミンを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）への緩衝液交換によって、部分的に過剰還元されたＩｇＧ１からパージした。得られた部分的に過剰還元されたシステアミンを含まないＣｙｓ ｍＡｂ（３〜１２ｍｇ／ｍＬ）を、４〜７当量の４ｍＭのデヒドロアスコルビン酸、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４を添加してｐＨ７．０−７．５にした後、２〜８℃でインキュベートして再酸化した。再酸化の進行を逆相ＨＰＬＣでモニターした。ＩｇＧ１が完全に再形成される（典型的には、１〜３時間）とすぐに、Ｃ末端リンカー（配列番号２９）を有する２〜３当量のブロモアセチル−ＧＬＰ−１ペプチド（配列番号１２９）を添加し、反応混合物を２〜８℃でさらにインキュベートした。アルキル化反応の進行を、標的ペプチド対抗体比（ＰＡＲ）プロファイルが得られるまで（例えば、≧９５％ＰＡＲ２、＜５％ＰＡＲ０＋ＰＡＲ１）、ＬＣ／ＭＳ及び／又はＣＥＸによってモニターした。酢酸を用いてｐＨを５．０に調整することによって反応混合物の反応を停止させた。所望のＰＡＲ２抗ＧＩＰＲ／ＧＬＰ−１コンジュゲートを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製し、続いて１０％酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５．２中へＵＦ／ＤＦにより製剤化した。
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
「ＧＬＰ−１受容体アゴニスト」又は「ＧＬＰ−１ペプチド」は、ＧＬＰ−１受容体活性を有する化合物を指す。このような化合物の例としては、エキセンディン、エキセンディン類似体、エキセンディンアゴニスト、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）類似体、ＧＬＰ−１（７−３７）アゴニストなどが挙げられる。ＧＬＰ−１受容体アゴニスト化合物は、任意選択でアミド化してよい。「ＧＬＰ−１受容体アゴニスト」及び「ＧＬＰ−１受容体アゴニスト化合物」という用語は、同じ意味を有する。
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
Figure 2020529986
ＡＥＥＡは、［２−（２−アミノ）エトキシ）］酢酸を指す。
ＥＤＡは、エチレンジアミンを指す。
ＭＰＡは、マレイミドプロピオン酸を指す。
結果及び考察
Ｃｙｓ ｍＡｂタンパク質（ＩｇＧ１）との成功した部位特異的コンジュゲーションは、ジスルフィド架橋ＩｇＧ１足場に操作されたシステイン残基を選択的に還元する（「無キャップ」）能力に大きく依存する。この実際的に困難なプロセスは、ＩｇＧ１四量体を保持する少なくとも１６個の天然ジスルフィド結合の存在下で、２つの操作されたシステインのジスルフィド結合のみを還元することを目的とする。単一工程の選択的還元が非常に望ましいが、現在のところは実現可能ではない（図１）。代わりに、以下のような２工程の純選択的還元が開発された（図２）。
還元工程：Ｃｙｓ ｍＡｂを還元剤（典型的には、ホスフィン）と反応させて、操作されたシステイン残基の完全な還元（「無キャッピング」）をもたらした。いくつかの天然ジスルフィド結合も還元される。この望ましくない副反応の程度は翻訳後の修飾（例えば、「キャップ」の固有性）及び反応条件（例えば、温度、還元剤の種類及び量、反応緩衝液）を含む反応パラメータに大きく依存する。結果は、「無キャップ」で且つ過剰に還元されたＣｙｓ ｍＡｂである。
酸化工程：還元工程で遊離したチオール「キャップ」は、Ｃｙｓ ｍＡｂの望ましくない「再キャッピング」を防止するために、進行する前に除去しなければならない。次いで、天然のジスルフィド結合を、酸化剤（典型的には、デヒドロアスコルビン酸）の存在下で回復させる。
この２工程のプロトコールは、Ｓ−アルキル化反応による部位特異的コンジュゲーションの準備ができた「無キャップ」Ｃｙｓ ｍＡｂタンパク質を生成する（図３）。
実質的に均一なＣｙｓ ｍＡｂコンジュゲート（ＰＡＲ２；ペプチド対抗体比２）を達成するためには、酸化による天然ジスルフィド結合の回復が完全ではないので、過剰還元を最小限に保つことが必須である。他方、還元不足は、アルキル化不足の不純物（ＰＡＲ１、ＰＡＲ０）をもたらすので、同様に望ましくない。過剰還元が最小限で無キャッピングが完全な最適な還元プロファイルのためには、以下のように、いくつかのパラメータを適切に組み合わせる必要がある。
正に帯電したシステイン「キャップ」（例えば、システアミン、ＣＡ）は、負に帯電した還元剤と対になっていなければならない。トリフェニルホスフィン−３，３’，３”−トリスルホネート（ＴＰＰＴＳ）が特に有効であることがわかった。他のアニオン性ホスフィン、例えば、ＴＣＥＰ、ＴＰＰＤＳは機能的であったが、それらの性能はＴＰＰＴＳよりも劣っていた（図 ）。ミスマッチした対、例えば、メルカプトエタンスルホネート（ＭＥＳ、負に帯電した「キャップ」）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、負に帯電した還元剤）は、緩慢な、非選択的な、及び／又は不完全な反応をもたらした（図４）。
逆荷電した反応パートナー（例えば、正に帯電したシステアミンでキャップされたＩｇＧ１及び負に帯電したＴＰＰＴＳ）間の魅力的なクーロン相互作用を最大にするために、反応緩衝液は低いイオン強度（例えば、２０ｍＭ酢酸ナトリウム）でなければならない。反応媒体のイオン強度を増加させると、還元は緩慢で且つ非選択的になる（図 ）。
反応ｐＨは、遊離したチオール（「キャップ」）が二次副反応、例えば、ＩｇＧ１の天然ジスルフィドとのジスルフィド交換を受けるのを防ぐために、十分に低くなければならない（例えば、ｐＨ５）。
上記の変数の適切な組み合わせは、僅かに過剰な還元剤（例えば、１．５当量過剰、全Ｃｙｓ ｍＡｂ当たり３．５当量）の使用により完全な無キャッピングを可能にし、その結果、最小限の過剰還元に導く。このような最小程度の過剰還元は、穏やかな酸化剤としてデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ、例えば、４〜６当量）を使用する次の酸化工程において容易に補正される。得られた実質的に均一な「無キャップ」Ｃｙｓ−ｍＡｂは、僅かに過剰（例えば、０．２当量過剰、全Ｃｙｓ ｍＡｂ当たり２．２当量）のブロモアセトアミド（例えば、合成ペプチドのブロモアセトアミド誘導体）を用いてきれいにアルキル化し、≧９５％のＰＡＲ２コンジュゲートを得ることができる（図 ）。

Claims (40)

  1. 抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、
    ａ）抗体又は抗体断片を含む組成物を得る工程；
    ｂ）前記抗体又は抗体断片をシステインブロッキング剤に曝露する工程（ここで、前記システインブロッキング剤は前記抗体又は抗体断片の少なくとも１つのシステイン残基と安定な混合ジスルフィドを形成する）；
    ｃ）還元剤を前記組成物に添加して還元混合物を形成し、前記還元混合物が還元抗体又は還元抗体断片を含むように還元反応を生じさせる工程；
    ｄ）酸化剤を前記還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、前記酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及び
    ｅ）活性化学部分を前記酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程
    を含む方法。
  2. 前記混合ジスルフィドは、キャップされた遊離システインを有する抗体又は抗体断片である、請求項１に記載の方法。
  3. キャップされた遊離システインを有する前記抗体又は抗体断片は、システイン、システアミン、シスタミン、及びグルタチオンからなる群から選択されるキャップを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 工程ｂ）の後及び工程ｃ）の前に、カチオン交換クロマトグラフィーを行って、過剰のシステインブロッキング剤を除去する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記還元剤は、トリフェニルホスフィン−３，３’，３”−トリスルホネート（「ＴＰＰＴＳ」）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）、及びトリフェニルホスフィン−３，３’−ジスルホネート（「ＴＰＰＤＳ」）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 還元剤対抗体又は抗体断片の比は２〜４：１（モル／モル）である、請求項５に記載の方法。
  7. 工程ｃ）の後及び工程ｄ）の前に、緩衝液交換工程を行って前記還元剤を除去する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記酸化剤はデヒドロアスコルビン酸（「ＤＨＡＡ」）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 酸化剤対抗体又は抗体断片の比は３〜６：１（モル／モル）である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記活性化学部分は、ハロゲンを含むペプチドであり、前記ハロゲンはＢｒ、Ｉ、及びＣｌからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 活性化学部分対抗体又は抗体断片の比は２〜３：１（モル／モル）である、請求項１１に記載の方法。
  13. 工程ｅ）に続いて、精製工程を行って、前記活性化学部分を除去する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、
    ａ）抗体又は抗体断片を含む混合ジスルフィドを含む組成物を得る工程；
    ｂ）前記組成物に還元剤を添加して還元混合物を形成し、前記還元混合物が還元抗体又は還元抗体断片を含むように還元反応を生じさせる工程；
    ｃ）酸化剤を前記還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、前記酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及び
    ｄ）活性化学部分を前記酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程
    を含む方法。
  16. 前記混合ジスルフィドは、キャップされた遊離システインを有する抗体又は抗体断片である、請求項１５に記載の方法。
  17. キャップされた遊離システインを有する前記抗体又は抗体断片は、システイン、システアミン、シスタミン、及びグルタチオンからなる群から選択されるキャップを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 工程ａ）の後及び工程ｂ）の前に、カチオン交換クロマトグラフィーを行って、過剰のシステインブロッキング剤を除去する、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記還元剤は、トリフェニルホスフィン−３，３’，３”−トリスルホネート（「ＴＰＰＴＳ」）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）、及びトリフェニルホスフィン−３，３’−ジスルホネート（「ＴＰＰＤＳ」）からなる群から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 還元剤対抗体又は抗体断片の比は２〜４：１（モル／モル）である、請求項１９に記載の方法。
  21. 工程ｂ）の後及び工程ｃ）の前に、緩衝液交換工程を行って前記還元剤を除去する、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記酸化剤はデヒドロアスコルビン酸（「ＤＨＡＡ」）である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 酸化剤対抗体又は抗体断片の比は３〜６：１（モル／モル）である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記活性化学部分は、ハロゲンを含むペプチドであり、前記ハロゲンはＢｒ、Ｉ、及びＣｌからなる群から選択される、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 活性化学部分対抗体又は抗体断片の比は２〜３：１（モル／モル）である、請求項２５に記載の方法。
  27. 工程ｄ）に続いて、精製工程を行って、前記活性化学部分を除去する、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートを調製する方法であって、
    ａ）還元抗体又は還元抗体断片を含む還元混合物を含む組成物を得る工程；
    ｂ）酸化剤を前記還元混合物に添加して酸化混合物を形成し、前記酸化混合物が酸化抗体又は酸化抗体断片を含むように酸化反応を生じさせる工程；及び
    ｃ）活性化学部分を前記酸化混合物に添加してコンジュゲーション混合物を形成し、抗体コンジュゲート又は抗体断片コンジュゲートが形成されるように共役反応を生じさせる工程
    を含む方法。
  30. 前記還元剤は、トリフェニルホスフィン−３，３’，３”−トリスルホネート（「ＴＰＰＴＳ」）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）、及びトリフェニルホスフィン−３，３’−ジスルホネート（「ＴＰＰＤＳ」）からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 還元剤対抗体又は抗体断片の比は２〜４：１（モル／モル）である、請求項３０に記載の方法。
  32. 工程ａ）の後及び工程ｂ）の前に、緩衝液交換工程を行って前記還元剤を除去する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記緩衝液交換工程は、限外濾過／透析濾過である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記酸化剤はデヒドロアスコルビン酸（「ＤＨＡＡ」）である、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 酸化剤対抗体又は抗体断片の比は３〜６：１（モル／モル）である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記活性化学部分は、ハロゲンを含むペプチドであり、前記ハロゲンはＢｒ、Ｉ、及びＣｌからなる群から選択される、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 活性化学部分対抗体又は抗体断片の比は２〜３：１（モル／モル）である、請求項３６に記載の方法。
  38. 工程ｃ）に続いて、精製工程を行って、前記活性化学部分を除去する、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）、限外濾過／透析濾過、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）後に限外濾過／透析濾過を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記抗体又は抗体断片は、参照配列（配列番号７）に対する抗体軽鎖のＤ７０、参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＥ２７６、及び参照配列（配列番号８）に対する抗体重鎖のＴ３６３からなる群から選択される位置にシステイン残基を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
JP2020504698A 2017-08-04 2018-08-03 Ｃｙｓ−ｍａｂのコンジュゲーション方法 Pending JP2020529986A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762541522P 2017-08-04 2017-08-04
US62/541,522 2017-08-04
PCT/US2018/045212 WO2019028382A1 (en) 2017-08-04 2018-08-03 CYS-MABS CONJUGATION METHOD

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2020529986A true JP2020529986A (ja) 2020-10-15

Family

ID=63371775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020504698A Pending JP2020529986A (ja) 2017-08-04 2018-08-03 Ｃｙｓ−ｍａｂのコンジュゲーション方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210346513A1 (ja)
EP (1) EP3661562A1 (ja)
JP (1) JP2020529986A (ja)
AU (1) AU2018309090B2 (ja)
CA (1) CA3071852A1 (ja)
MX (1) MX2020001327A (ja)
WO (1) WO2019028382A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20181327A1 (es) * 2015-12-23 2018-08-20 Amgen Inc Metodo para tratar o mejorar trastornos metabolicos con proteinas de union para el receptor peptidico inhibidor gastrico (gipr) en combinacion con agonistas de glp-1

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008546670A (ja) * 2005-06-17 2008-12-25 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
JP2010526821A (ja) * 2007-05-08 2010-08-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン改変抗ｍｕｃ１６抗体および抗体−薬物結合体
JP2010533495A (ja) * 2007-07-16 2010-10-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化ＣＤ７９ｂ抗体およびイムノコンジュゲートならびにそれらの使用
WO2016103146A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Novartis Ag Selective reduction of cysteine residues in il-17 antibodies
JP2017501148A (ja) * 2013-12-13 2017-01-12 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー タンパク質のチオエーテルコンジュゲーション方法

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0575319B1 (en) 1991-03-11 1999-11-10 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning and expression of renilla luciferase
JPH06508035A (ja) 1991-06-14 1994-09-14 ディーエヌエックス　コーポレーション トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産
ATE381614T1 (de) 1992-07-24 2008-01-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US6342225B1 (en) 1993-08-13 2002-01-29 Deutshces Wollforschungsinstitut Pharmaceutical active conjugates
AU694745B2 (en) 1993-09-10 1998-07-30 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Uses of green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
MX9603570A (es) 1994-02-23 1997-03-29 Chiron Corp Metodo y composiciones para incrementar la vida media en suero de agentes farmacologicamente activos.
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
WO1998026277A2 (en) 1996-12-12 1998-06-18 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
EP1064360B1 (en) 1998-03-27 2008-03-05 Prolume, Ltd. Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6887470B1 (en) 1999-09-10 2005-05-03 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
EP1276849A4 (en) 2000-04-12 2004-06-09 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
CA2440582A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US20050054051A1 (en) 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
WO2005084390A2 (en) * 2004-03-02 2005-09-15 Seattle Genetics, Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
JP6713931B2 (ja) * 2014-02-11 2020-06-24 シアトル ジェネティクス，インコーポレイティド タンパク質の選択的還元
GB201419185D0 (en) * 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resin
MA43348A (fr) * 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
SG11201809830WA (en) * 2016-02-12 2018-12-28 Synthon Biopharmaceuticals Bv Selective reduction of cysteine-engineered antibodies
JOP20190177A1 (ar) * 2017-01-17 2019-07-16 Amgen Inc طريقة لعلاج أو تحسين اضطرابات أيضية باستخدام مساعدات مستقبل glp-1 مقترنة بمناهضات لمستقبل ببتيد مثبط معوي (gipr)

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008546670A (ja) * 2005-06-17 2008-12-25 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
JP2010526821A (ja) * 2007-05-08 2010-08-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン改変抗ｍｕｃ１６抗体および抗体−薬物結合体
JP2010533495A (ja) * 2007-07-16 2010-10-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化ＣＤ７９ｂ抗体およびイムノコンジュゲートならびにそれらの使用
JP2017501148A (ja) * 2013-12-13 2017-01-12 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー タンパク質のチオエーテルコンジュゲーション方法
WO2016103146A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Novartis Ag Selective reduction of cysteine residues in il-17 antibodies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.R.JUNUTULA, ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 26, no. 8, JPN6022026971, 2008, pages 925 - 932, ISSN: 0005011968 *
X.CHEN, ET AL., MABS, vol. 1, no. 6, JPN6022026969, 2009, pages 563 - 571, ISSN: 0005011969 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210346513A1 (en) 2021-11-11
AU2018309090A1 (en) 2020-02-20
EP3661562A1 (en) 2020-06-10
WO2019028382A1 (en) 2019-02-07
AU2018309090B2 (en) 2023-03-30
CA3071852A1 (en) 2019-02-07
MX2020001327A (es) 2020-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2956000C (en) An anti-ctla4 monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof, a pharmaceutical composition and use
JP4236493B2 (ja) 癌マーカー用生物合成結合蛋白質
US20200283512A1 (en) Anti-serum albumin binding variants
US9751935B2 (en) Anti-serum albumin binding variants
JP7175899B2 (ja) 胃抑制ペプチド受容体（ｇｉｐｒ）に対するアンタゴニストにコンジュゲートされたｇｌｐ－１受容体アゴニストを使用して代謝障害を治療又は改善する方法
CN110724198B (zh) 长效纤连蛋白iii型结构域融合蛋白
JP7250706B2 (ja) 胃抑制ペプチド受容体（ｇｉｐｒ）に対するアンタゴニスト結合タンパク質／ｇｌｐ－１受容体アゴニスト融合タンパク質を使用した代謝障害の治療又は寛解方法
JP2024023264A (ja) 切断可能なｃ末端電荷対タグを有する二重特異性抗体
JP2020529986A (ja) Ｃｙｓ−ｍａｂのコンジュゲーション方法
TW202328201A (zh) 產生抗體肽軛合物的方法
CN114480413B (zh) 一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法
WO2023186120A1 (zh) 抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物
WO2024046239A1 (zh) 靶向人gprc5d的重组人源化单克隆抗体及其应用
US20220363753A1 (en) Anti-tirc7 antigen binding proteins
WO2023142109A1 (zh) 一种长效重组人生长激素及其应用
CN112789058A (zh) 双特异性抗体构建体的下游加工
JP2020019723A (ja) 抗ＣＤ７０抗体とＩｇＧ結合ペプチドの複合体

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210802

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220620

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220705

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220929

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221228

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230314

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230608

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230914

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20231121

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240319

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20240325