JP2020524513A - 核酸等の分子を調査するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
不混和性キャリア媒体における消化媒体の微小液滴の流れを、経路で1つずつ生体高分子に接触させることによって、生体高分子を微小液滴内で生体高分子の構成モノマー単位へ漸進的に消化させるステップと、
少なくとも一部は単一モノマー単位を包含する微小液滴を、生体高分子の周りから除去するステップと、
微小液滴を、経路に沿って検出区域まで更に送達するステップと、
検出区域で微小液滴のモノマー単位を同定し、モノマー単位からそれらの化学構造を推測するステップと、
を含むことを特徴とする、生体高分子を含む標的分子を調査するための方法が提供される。
水性加ピロリン酸分解媒体の微小液滴の流れを、経路において分析物に接触させることによって、分析物を漸進的に分析物の構成単一ヌクレオシド三リン酸にするステップと、
キャリア媒体の、少なくとも一部は単一ヌクレオシド三リン酸の1つを包含する微小液滴を、分析物の周りから除去するステップと、
微小液滴を経路に沿って更に送達するステップと、
経路に沿い又は加ピロリン酸分解の上流である1つ以上の位置を、各微小液滴検出要素に導入するステップと、
各微小液滴における、当該1つ以上の位置の下流である地点で放出されるフルオロフェアに由来する蛍光を検出するステップと、
を含む核酸分析物の調査方法であり、
各微小液滴検出要素は、
(a)不使用状態では蛍光を発しない蛍光プローブを含むオリゴヌクレオチド捕捉システムと、
(b)ポリメラーゼと、
(c)任意に、リガーゼと、
(d)蛍光状態において、使用される捕捉システムからフルオロフェアを放出できるエキソヌクレアーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼと、
からなり、
加ピロリン酸分解は第1電磁照射入射源及び光検出器を使用する、調査方法が提供される。
Claims (23)
- (a)微小液滴及び固形担体を結合させる条件下で、前記微小液滴を固形担体に接触させるステップと、
(b)反応媒体を、標的分子と反応させるステップと、
(c)その後、前記反応媒体に、前記固形担体から分離させ、キャリア流体で微小液滴を再び作る力を加えるステップと、
を含む、不混和性キャリア媒体の反応媒体の微小液滴を、固形担体に拘束される標的分子とともに、化学的変換をもたらすために操作する方法。 - 前記反応媒体が核酸分析物を変換する媒体であり、前記標的分子がポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドが、分析物から放出され、微小液滴の前記固形担体の付近から運び去られることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- それぞれヌクレオチドを運び去ることができる複数微小液滴を、前記分析物に順次接触させることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記化学的変換を用いて核酸分析物の配列を決定し、
前記方法は、
消化媒体を不混和性キャリア媒体に含む前記反応媒体の微小液滴の流れを、粒子を1つずつ経路に含む前記固形担体に拘束される、核酸分析物を含む前記標的分子に接触させることによって、前記核酸分析物を前記分析物の構成ヌクレオチドへ漸進的に消化させるステップと、
少なくとも一部は単一のヌクレオチドを包含する前記微小液滴を、前記核酸分析物の周りから除去するステップと、
前記微小液滴を、前記経路に沿って検出区域まで更に送達するステップと、
前記検出区域で前記微小液滴内の前記ヌクレオチドを同定し、前記ヌクレオチドから前記分析物の分子の配列を推測するステップと、
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 前記消化媒体は、ポリメラーゼと、前記ポリメラーゼに前記核酸分析物の分子からヌクレオチドを1つずつ放出させるコファクターとを含むことを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記コファクターは、ポリリン酸の陰イオン、又はポリリン酸の陰イオンの類似体であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記ポリリン酸がピロリン酸であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記消化媒体が、エキソヌクレアーゼを含み、結果として放出されるヌクレオチド一リン酸をキナーゼで更に処理して、前記ヌクレオチド一リン酸をヌクレオチド三リン酸に変えることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 結果として生じる前記ヌクレオチドを、ポリメラーゼの存在下で蛍光プローブからなるオリゴヌクレオチド捕捉システムと反応させ、フルオロフォアを検出可能な状態で放出し、
前記蛍光プローブは、不使用状態で蛍光を発さず前記核酸分析物に特徴的な前記ヌクレオチドの種類の少なくとも1つに対して選択的であり、
結果として生じ、各微小液滴で放出される前記フルオロフォアに由来する蛍光は、第1電磁放射入射源及び光検出器を用いて検出されることを特徴とする、請求項5〜9の何れか一項に記載の方法。 - フルオロフォアの放出は、エンドヌクレアーゼ及び/又はエキソヌクレアーゼ並びに任意にリガーゼの作用の結果であり、そのような作用が、検出される前記ヌクレオチドの捕捉によって触媒されることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド捕捉システムが、液滴合体又は直接注入によって前記粒子の下流の前記微小液滴に導入されることを特徴とする、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド捕捉システムによる反応の前に、前記消化媒体がピロホスファターゼでさらに処理されることを特徴とする、請求項10〜12の何れか一項に記載の方法。
- 化学的に修飾される表面をわたって前記微小液滴を移動させて、濡れ性のレベルが局所的に向上する範囲を有し、前記濡れ性のかかる向上を用いて前記標的分子周りにおける微小液滴流体の濡れを媒介することを特徴とする、請求項5〜13の何れか一項に記載の方法。
- エレクトロウェッティング又は光学的に媒介されるエレクトロウェッティング効果を用いて、前記粒子周りの表面の領域の濡れ性を局所的に変更することを特徴とする、請求項5〜14の何れか一項に記載の方法。
- 第3ステップにおいて、エレクトロウェッティング又は光学的に媒介されるエレクトロウェッティングを用いて、前記微小液滴を送達することを特徴とする、請求項5〜15の何れか一項に記載の方法。
- 前記経路の少なくとも一部が、光学的に媒介されるエレクトロウェッティングマイクロ流体空間であり、前記エレクトロウェッティングマイクロ流体空間は、
第1複合壁であり、
第1透明基板、
前記第1透明基板上の、70〜250nmの厚さを有する第1透明導体層、
前記第1透明導体層上の、300〜1000nmの厚さを有し、400〜1000nmの波長範囲の電磁照射によって活性化される光活性層、及び
前記第1透明導体層上の、120〜160nmの厚さを有する第1誘電体層
を含む第1複合壁と、
第2複合壁であり、
第2基板、
前記第2基板上の、70〜250nmの厚さを有する第2透明導体層、及び
任意に、前記第2透明導体層上の、25〜50nmの厚さを有する第2誘電体層
を含む第2複合壁と、
によって構成され又は画定され、
前記第1誘電体層及び第2誘電体層の露出面は、50μm未満の間隔で配置されることを特徴とする、請求項5〜16の何れか一項に記載の方法。 - (a)前記第1複合壁及び第2複合壁にわたって、前記第1透明導体層及び第2透明導体層を接続する電位差を供給する交流電源と、
(b)前記光活性層に衝突させて、前記第1誘電体層の表面上の対応する第1一過性エレクトロウェッティング箇所を誘起するように適合される光励起層のバンドギャップより高いエネルギを有する少なくとも1つの第2電磁放射源と、
によって、マイクロ流体空間が活性化されて前記微小液滴を送達することを特徴とする、請求項17に記載の方法。 - 第1電磁放射源と、第2電磁放射源とが同一である、請求項18に記載の方法。
- 前記粒子を、微小液滴においてエレクトロウェッティング又は光学的に媒介されるエレクトロウェッティング又は磁気のいずれかを用いて、消化が起きる箇所へ送達する初期ステップを更に備えることを特徴とする、請求項5〜19の何れか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、微小液滴の前記流れが前記粒子と接触する所望の箇所で、磁気的に保持されることを特徴とする、請求項5〜20の何れか一項に記載の方法。
- 前記微小液滴を少なくとも1つの毛細管の入口に導入し、前記微小液滴が出口から現れるときに第1電磁放射を前記微小液滴に衝突させるステップによって、蛍光が検出されることを特徴とする、請求項10〜21の何れか一項に記載の方法。
- キャリア媒体に懸濁されるとともに、加ピロリン酸分解酵素を包含する水性微小液滴の流れにおいて、各微小液滴を順に、分析物が付着する粒子に接触させ、各微小液滴を前記粒子の周りから除去する前に、前記酵素に前記分析物からヌクレオシド三リン酸分子を前記微小液滴の少なくとも一部に放出させるステップを含む、核酸分析物を加ピロリン酸分解する方法。
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