CN106048041B - 一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量检测引物及检测方法 - Google Patents

一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量检测引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量检测引物及检测方法。所述引物序列如SEQ ID NO:1‑142所示，其中SEQ ID NO:1和2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3和4为一对上下游引物，以此类推，SEQ ID NO:141‑142为一对上下游引物。应用该办法的引物、试剂盒或芯片用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测，可实现多种微生物碳氮磷硫功能基因的同步化检测、使不同基因得以在同一扩增条件下进行检测，提高检测效率；检测精度高，可以检测低至0.001％的目的基因；保留了荧光定量PCR检测的高灵敏度和准确度，同时具有芯片检测的高通量反应的优点，降低了检测成本，结合其他理化数据或微生物指标，可以分析当前生境下的碳氮磷硫元素循环的情况及其影响因素。

Description

一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量检测引物及检测 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量检测引物及检测方法。
背景技术
微生物是自然界碳氮磷硫元素循环的主要驱动力，通过定量检测微生物碳氮磷硫的功能基因，可以综合分析不同生境下碳氮磷硫循环的整体水平及其影响因素，为环境健康和影响评价提供基因水平上的有力证据
然而，目前很少有涉及微生物碳氮磷硫功能基因的特异性引物设计，一方面源于科学界对微生物驱动碳氮磷硫元素循环认识的缺乏，另一方面源于同一功能基因在不同微生物中表现出多态性，增加了引物设计的难度。现公开的功能基因引物专利都是用来检测功能细菌的，例如检测氨氧化古菌(CN201510185444)和聚磷菌(CN201310042881)，它们分别对氨氮氨单加氧酶A基因和聚合磷酸盐激酶基因设计特异性引物，并用传统的实时荧光定量PCR方法进行定量检测。尽管该方法具有高灵敏度和准确度，但由于不同的特异性引物自身长度、碱基比例、扩增片段的大小不同，进行PCR反应时所需的退火温度、延伸时间、扩增程序也不同，例如，用于氨氧化古菌检测的PCR扩增程序为95℃变性45s、54℃退火1min、72℃延伸1min，而用于聚磷菌的检测的PCR扩增程序为95℃变性40s、A℃退火1min、72℃延伸2min(其中A与它设计的5个特异性引物有关，分别为61、58、61、66和63℃)，因而难以设计多种不同的功能基因，并使其在同一条件下进行扩增检测。随着越来越多的微生物功能需要研究，就需要有可以同时检测多种微生物功能基因的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测引物，可用于同步、平行和高效检测的高通量定量检测微生物碳氮磷硫元素功能基因的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO:1-142所示，其中SEQ ID NO:1和2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3和4为一对上下游引物，以此类推，SEQ ID NO:141-142为一对上下游引物。
另外一方面，本发明还提供一种一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1的引物。
另外一方面，本发明还提供一种一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测芯片，其特征在于，所述芯片含有所述引物或所述试剂盒中的引物。
另外一方面，本发明还提供一种用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测方法，其特征在于，步骤为，
提取DNA样品；
PCR扩增：采用所述引物或所述试剂盒中的引物或所述芯片进行PCR扩增；所述对照引物为SEQ ID NO:143-144；
结果计算及判断：
其中，CN为基因丰度，RA为相对丰度，CNCNPS为碳氮磷硫功能基因的丰度，CN16S为16S rRNA的丰度；
进一步，所述PCR扩增的程序为，95℃预变性5min；95℃，30s，40个循环；62℃，30s退火，72℃，30s延伸，最后从72℃开始升温至97℃，升温速率为4℃/s，以每0.4℃一个测量点对引物的溶解曲线进行测定。
表1 引物相关信息表
DNA样品的制备
本方法适用于各类环境样本的DNA。使用土壤DNA提取试剂盒(MP生物医药，美国)提取土壤样品DNA，每个样品需0.5-1.0g土壤，其余类型环境样本请采用对应的提取试剂盒按说明书进行提取。DNA质量用NanoDrop ND-2000分光光度计(赛默科技，美国)测定的OD260/280值来确定，数值在1.6-1.9之间表示DNA可用。DNA浓度使用双链DNA试剂盒(普洛麦格，美国)进行测定，一次功能基因定量至少需要有10微升30ng/μL的DNA样品。
芯片的制备
本方法采用多样品纳米分配器(WaferGen生物系统，美国)对引物和DNA样品在SmartChip纳米芯片(WaferGen生物系统，美国)上进行分配，其中芯片共有72×72个纳米孔，可支持5184个荧光定量PCR反应。本方法采用80个引物×64个样品的方案进行荧光定量PCR检测。需要准备的材料为20μmol/L的牛血清白蛋白水溶液、2块384无酶孔板(赛默科技，美国)、LightCycler 480DNA SYBR Green I Mix(罗氏制药，美国)、去除核酸的PCR级高纯水(罗氏制药，美国)和芯片试剂盒。
引物分配前，预先制备PCR反应液I(混合699μLLightCycler 480DNA SYBR GreenI Mix和419μL高纯水)，之后按照图1所示，在384孔板中前6列的相应位置分别加入12.1μLPCR反应液I和3.0μL引物混合液。同样地，DNA样品分配前，预先制备PCR反应液II(混合610μLLightCycler 480DNA SYBR Green I Mix、122μL牛血清白蛋白水溶液和244μL高纯水)，之后按照图2所示，在384孔板中前4列的相应位置分别加入12.9μL PCR反应液II和3.2μL DNA样品，一个芯片反应最多可支持64个DNA样品。
开始分配时，选择mRNA表达分析模式，选择MyDesign下的80个引物和64个样品分配方案，并进行样品分配。分配过程为自动化操作过程。引物和样品分配后都需要将芯片离心，第一次离心为3300转/min×5min，第二次离心为3300转/min×15min。离心完的芯片贴膜后等待PCR检测。
高通量荧光定量PCR检测
高通量荧光定量PCR检测器为SmartChip实时PCR系统(WaferGen生物系统，美国)。PCR程序为95℃预变性5min，40个循环的变性(95℃×30s)、退火(62℃×30s)和延伸(72℃×30s)，最后从72℃开始升温至97℃，以每0.4℃一个测量点对引物的溶解曲线进行测定。PCR程序完成后，软件将自动分析并导出数据。
有益效果
1)本发明实现了多种微生物碳氮磷硫功能基因的同步化检测；
2)调整和优化了引物的结构和产物的大小，使不同基因得以在同一扩增条件下进行检测，提高检测效率；
3)可以检测低至0.001％的目的基因，检测精度高；
4)保留了荧光定量PCR检测的高灵敏度和准确度，同时具有芯片检测的高通量反应的优点，降低了检测成本；
5)结合其他理化数据或微生物指标，可以分析当前生境下的碳氮磷硫元素循环的情况及其影响因素。
附图说明
图1是芯片制备中引物和对照在384孔板中的分配方案图。
图2是芯片制备中DNA样品在384孔板中的分配方案图。
图3是实施例1中的DNA样品和对照在384孔板中的分配方案图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
现以土壤样本为实施例，对本发明的高通量检测方法做进一步阐述
1、土壤样本描述
土壤样本来源于中国科学院封丘农业-生态试验站27年长期施肥土壤，共7种不同的施肥方式：不施肥(CK)、施氮钾肥(NK)、施氮磷肥(NP)、施磷钾肥(PK)、施氮磷钾肥(NPK)、施有机肥(OM)和施有机肥和氮磷钾肥各半的混合肥(1/2OMN),其中有机肥为玉米杆、豆饼和棉籽饼的混合物，混合重量比例为100:40:45。每个处理每年的氮肥施用量为150kg/ha(CK和PK除外)，磷肥施用量为75kg/ha(CK和NK除外)，钾肥施用量为150kg/ha(CK和NP除外)。土壤采样时的当季作物为玉米。采样方式为相同处理内随机取5个不同位置的表层土(0-15cm)，将其均匀混合后作为一个样品，每个处理取4个样品，共28个样品。
2、样本DNA提取
取每个土壤样本0.5g，用土壤DNA提取试剂盒提取土壤DNA，分别用NanoDrop ND-2000分光光度计和双链DNA试剂盒对提取的DNA质量和浓度进行检测(表2)，可以看出，所有DNA的OD260/280均处于1.6-1.9之间，浓度大于30ng/μL，每个样品提取100μL DNA溶液，满足后续定量实验要求。
表2 DNA质量和浓度检测表
3、芯片准备
按本发明方法，将合成的引物制成引物混合液后如图1所示加入到384孔板前6列(预先制备PCR反应液I(混合699μL LightCycler 480DNA SYBR Green I Mix和419μL高纯水)，按照图1所示，在384孔板中前6列的相应位置分别加入12.1μL PCR反应液I和3.0μL引物混合液)，之后用多样品纳米分配器将引物分配到一片Samrtchip芯片上，将芯片3300转/min离心5min。将28个样品如图3所示，加入到新的384孔板前4列(预先制备PCR反应液II(混合610μL LightCycler 480DNA SYBR Green I Mix、122μL牛血清白蛋白水溶液和244μL高纯水)，按照图2所示，在384孔板中前4列的相应位置分别加入12.9μL PCR反应液II和3.2μLDNA样品)，H2O样品位置加入与DNA等量的高纯水，作为阴性对照。这样，每个DNA样品都有2个计数平行。之后再用多样品纳米分配器将DNA样品分配到同一Smartchip芯片上(开始分配时，选择mRNA表达分析模式，选择MyDesign下的80个引物和64个样品分配方案，并进行样品分配。分配过程为自动化操作过程。)引物和DNA样品分配后都需要将芯片离心，第一次离心为3300转/min×5min，第二次离心为3300转/min×15min。离心后的芯片贴膜后等待定量。
4、高通量荧光定量和数据处理
用SmartChip实时PCR系统(WaferGen生物系统，美国)对芯片进行高通量定量检测，检测的PCR程序为95℃预变性5min，40个循环的变性(95℃×30s)、退火(62℃×30s)和延伸(72℃×30s)，最后从72℃开始升温至97℃，升温速率为4℃/s，以每0.4℃一个测量点对引物的溶解曲线进行测定。PCR程序完成后，软件将自动分析并导出数据。检测完毕后，导出的数据按以下条件进行筛选：1)扩增效率需在90％-110％之间；2)循环临界值(CT)必须小于31；3)两个计数平行样品同时得到扩增的认定为有效扩增。筛选后的数据计算相对丰度(RA)：
其中，CN为基因丰度，CNCNPS为碳氮磷硫功能基因的丰度，CN16S为16S rRNA的丰度。
每个施肥处理的碳氮磷硫功能基因相对丰度为4个平行样品的平均值，结果见表3。
表3 碳氮磷硫功能基因的相对丰度(％)和平均变异系数SV(％)表
由于每个基因在微生物中表达量存在很大差异，并且不同环境来源的微生物种类也存在很大差异，因而每个基因的相对丰度也存在较大不同。下面就该土壤中不同功能基因含量差异进行分析，仅供参考。
acsA表达碳单氧化物水解酶，用于形成乙酰辅酶A合成酶并将CO和H2O氧化成CO2，是微生物体内的常见基因，本实例中其相对丰度为36.496-45.433％，氮元素添加对acsA的表达有益，因此除PK外，其余处理的基因丰度都高于CK。acsE编码铁硫蛋白甲基转移酶，将甲基四氢叶酸的甲基转移到铁硫蛋白上，是细胞内电子传递和能量传递的关键环节，应具有较高表达量，本例中其相对丰度为12.676-15.395％。gam编码葡萄糖氧化酶，是微生物葡萄糖利用的胞外酶，由于葡萄糖是最广泛存在也是容易被微生物利用的碳源，其丰度值应较高，本例中其相对丰度为16.924-20.394％，磷肥施用可能对其有降低效果。mct表达C1-C4 CoA转移酶，参与炭基转移和甲基天冬氨酸循环，是三羧酸循环中重要的供能步骤之一，应具有高表达量，本实例中其相对丰度为53.231-63.333％，施肥处理能明显提高该基因的相对丰度。amyX、exc和pox分别编码普鲁兰酶、几丁质酶和酚氧化酶，有很强的底物特异性，只针对普鲁兰糖、几丁质和多酚类难降解有机物有效，其丰度与土壤中特异性底物浓度的多少有关，因此可能具有较低的基因丰度，本例中它们的丰度仅分别为0.002-0.007％、0.002-0.003％和0.043-0.067％。mcrA编码甲基辅酶A还原酶，是厌氧条件下生成甲烷的关键基因，仅存在于特定的甲烷产生菌上，与所处的厌氧环境密切相关，因而表达量因土壤的采样位置而异，本例中其表达量为0.002-0.015％，这与采样时取土为表层土有关。ureC基因是微生物降解有机氮的关键基因，能够降解尿素形成氨和二氧化碳，而尿素是农业施肥常用的氮肥，其相对丰度值在农业土壤上应较高，本例中其相对丰度为18.633-21.475％。hzo编码联氨氧化酶，hzsA和hzsB均为联氨合成酶基因，三者均用于调控土壤的厌氧氨氧化过程，只有厌氧环境下的特定菌群具备该基因，因此表达量较低，本例中三者的表达量分别为0.001-0.002％、0.001-0.002％和0.017-0.024％。hao基因编码羟胺氧化还原酶，主导羟胺形成亚硝酸或者N2O的过程，而nosZ1和nosZ2均用于表达氧化亚氮还原酶，主导者N2O还原成N2的过程，它们是氮元素循环硝化与反硝化过程的关键基因，应具有较高的表达水平，在本例中它们的相对丰度分别为13.928-18.175％、11.971-14.247％和13.412-15.524％。ppx表达外切聚磷酸酶，用于调控胞内多聚磷酸降解，形成单磷酸盐广泛用于其它生理生化反应，是细胞内磷元素供应的中枢环节，应具有高表达水平，本实例中其相对丰度为44.742-53.041％，施肥处理能明显提高该基因的相对丰度。phoD和phnK被广泛用于检测碱性磷酸酶(断裂C-O键)和C-P裂解酶(断裂C-P键)，分别用于胞外有机磷降解利用和胞内C-P信号分子的合成与降解，是常见的磷循环基因，应具有较高的表达水平，在本例中它们的表达量分别为11.624-13.091％和16.903-19.731％，施肥过程能显著提高它们的相对丰度。cphy是半胱氨酸植酸酶的编码基因，常见于海洋菌分泌的植酸酶，在土壤中含量较低，在本例中其表达量仅为0.005-0.008％。apsA是硫酸盐同化菌的特征基因，土壤硫循环无机硫活化的关键基因，应具有较高的表达水平，本例中其相对丰度为21.424-26.942％，施肥处理能明显提高该基因的相对丰度。
其余基因的表达量均在1-10％之间，是功能基因相对丰度的常见范围。
现举例说明，如何判断不同处理间的实验结果。
通过与不施肥(CK)处理进行对比，可以得到施加相应肥料后土壤微生物相关基因含量的变化，现以CK和OM为例进行说明。相比于不施肥对照组(CK)，除frdA、amyX、mcrA、nifH和cphy之外，施加有机肥(OM)对其余所有基因都有显著的提高。有报道表明，有机肥能够增加土壤有机质含量，给土壤微生物带来丰富的物质和能量来源，提高土壤微生物多样性和活力。因此，施加有机肥能全面提高微生物对土壤碳氮磷硫循环的促进作用。
将不同施肥组进行比较，可以得到相应元素添加对功能基因含量的影响，现以PK和NPK为例进行说明。将PK和NPK处理作对比，可以分析氮肥施加对功能基因的影响。可以发现，施加氮肥(尿素)后，除rbcL、smtA、mct和frdA外，其余固碳及碳循环基因的相对丰度均得到显著性提升，并且大部分碳化合物降解基因(包括gam、abfA、xylA、exg、exoPG、mnp、Isop、amyX、apu、glx和lig)均得到显著性增加。有报道表明，氮是构成微生物体内参与元素循环过程中重要酶的组成成分，氮肥的施加增加了微生物对碳元素的利用和转化能力，而碳元素的固定和转化也为氮元素的循环过程提供了能量支持，因而施加氮元素有利于促进土壤碳循环过程。然而大多数的氮相关基因却显著降低，包括脲酶基因ureC、氨氧化细菌amoA2、氨氧化古菌amoB、羟胺氧化还原酶hao、亚硝酸盐还原酶nxrA、nirK1、nirK2和nirK3、硝酸盐还原酶napA和nasA以及氧化亚氮还原酶nosZ2。有报道表明，长期施加氮肥可能使作物减少根系分泌物的分泌，从而降低对微生物单循环相关基因的刺激及促进作用；另外，长期施加氮肥可能使土壤微生物对氮元素产生依赖，从而降低了某些氮利用基因的丰度，从而减缓了氮元素的微生物循环效率。因此，从整体上看，长期施加氮肥，对土壤氮元素的循环过程可能产生副作用。另外，氮肥施加对无机解磷基因pqqC和植酸酶基因bpp都有促进作用。有报道表明，磷元素由于土壤缓冲和金属离子的作用而难以被作物利用，而施加氮肥不仅可以降低pH，还能提高微生物释放有机酸阴离子的能力，从而竞争性螯合金属离子，释放磷酸盐，提高土壤速效磷的含量。
此外，该芯片方法可以同时检测到71种碳氮磷硫功能基因的基因丰度，并且能够检测到0.001％水平的功能基因相对丰度，检测精度高，提高了检测效率，降低了检测成本。从平均变异系数上看，变异范围在6.1-24.9％之间，整体准确度高。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (5)

1.一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO:1-142所示，其中SEQ ID NO:1和2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3和4为一对上下游引物，以此类推至SEQ ID NO:141-142为一对上下游引物。
2.一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1的引物。
3.一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测芯片，其特征在于，所述芯片含有权利要求1的引物或权利要求2试剂盒中的引物。
4.一种用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测方法，其特征在于，步骤为，
提取DNA样品；
PCR扩增：采用权利要求1的引物或权利要求2试剂盒中的引物或权利要求3的芯片进行PCR扩增；所述对照引物为SEQ ID NO:143-144；
结果计算及判断：
其中，CN为基因丰度，RA为相对丰度，CNCNPS为碳氮磷硫功能基因的丰度，CN16S为16SrRNA的丰度。
5.权利要求4所述用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为，95℃预变性5min；95℃，30s，40个循环；62℃，30s退火，72℃，30s延伸，最后从72℃开始升温至97℃，升温速率为4℃/s，以每0.4℃一个测量点对引物的溶解曲线进行测定。
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