JP2022109999A - 核酸等の分子を調査するための方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】核酸分子を調査するための方法、特に天然又は合成起源のDNA又はRNAを配列決定するための方法を提供する。【解決手段】不混和性キャリア媒体の反応媒体の微小液滴を、固形担体に拘束される標的分子とともに、化学的変換をもたらすために操作する方法を提供する。本方法は、（ａ）微小液滴及び固形担体を結合させる条件下で、微小液滴を固形担体に接触させるステップと、（ｂ）反応媒体を、標的分子と反応させるステップと、（ｃ）その後、反応媒体に、固形担体から分離させ、キャリア流体で微小液滴を再び作る力を加えるステップと、を含むことを特徴とする。一実施形態では、固形担体は、粒子又はビード等である。【選択図】図１

Description

本発明はとりわけ、核酸分子を調査するための方法、特に天然又は合成起源のDNA又はR
NAを配列決定するための方法に関する。
出願人の先の出願を示す特許文献１－５において、出願人は単一ヌクレオチドの秩序だ
った流れ、好ましくは単一ヌクレオシド三リン酸の流れを生成するための、ポリヌクレオ
チド分析物の漸進的消化を含む新しい配列決定方法を記載しており、その各々を、微小液
滴流中の対応する微小液滴中に1つずつ捕捉できる。その後、それぞれの微小液滴を化学
的及び/又は酵素的に操作して、微小液滴が最初に含有していた特定の一ヌクレオチドを
明らかにすることができる。1つの実施形態において、これらの化学的及び/又は酵素的操
作は、1つ以上の多成分オリゴヌクレオチドプローブ型の使用を含む方法を含み、その各
々は、分析物が構成される単一ヌクレオチド型の1つを選択的に捕捉することができるよ
うに適合される。典型的にはそのようなプローブタイプの各々において、複数オリゴヌク
レオチド成分のうちの1つは特性フルオロフォアを含み、プローブの未使用状態ではこれ
らのフルオロフォアの蛍光を発する能力が近くに位置するクエンチャーの存在によって、
または自己消光によって消えたままである。使用において、プローブがその対応する単一
ヌクレオチドを捕捉したとき、プローブは、その後のエキソヌクレアーゼ分解又はヌクレ
オチド鎖切断に感受的にされ、それによって、フルオロフォアをクエンチャー及び/又は
互いから遊離させ、フルオロフォアが自由に蛍光を発することを可能にする。この手段に
より、それぞれの液滴に存在する元の一ヌクレオチドの性質を、分光手段により間接的に
推測することができる。
この方法を使用する配列決定装置を設計する際に、例えば、数千の微小液滴を蛍光の有
無について分析される他の内容物及び/又はそれらの内容物と合体され得る位置に確実に
送達され得ることを確実にするために、数千の微小液滴を操作することが必要となり得る
。
これを行う1つの考えられる方法は、エレクトロウェッティング力によって微小液滴を
推進することができる基材上の経路を確立することである。このように比較的大きな液滴
を操作するための装置は当該分野において以前に説明されている。例えば、特許文献６－
８を参照のこと。典型的には、当該装置は液滴を、例えば、不混和性キャリア流体の存在
下で、カートリッジ又はチューブの2つの対向する壁によって画定されるマイクロ流体空
間を通って移動させることによって達成される。カートリッジ又はチューブの壁に埋め込
まれているのは、誘電体層で覆われている電極であり、誘電体層の各々は層のエレクトロ
ウェッティング電界特性を変更するために、間隔をおいて迅速にスイッチを入れたり切っ
たりすることができるように、ACバイアス回路に接続されている。このことは、所与の経
路に沿って液滴を操縦するために使用することができる局所的な指向性毛管力を生じさせ
る。
光学的に媒介されるエレクトロウェッティングに基づくこのアプローチの変形例は例え
ば、引用文献９－１１に教示されている。特に、これらの3つの特許出願のうちの第1のも
のは、第1及び第2の壁によって画定されるマイクロ流体キャビティを含み、第1の壁が複
合体設計であり、基板、光導電及び絶縁(誘電体)層から構成される、各種マイクロ流体デ
バイスを開示する。光導電層と絶縁層との間には互いに電気的に絶縁され、光活性層に結
合された導電性セルの配列が配置され、その機能は絶縁層上に対応する個別の液滴受信位
置を生成することである。これらの箇所では、液滴の表面張力特性をエレクトロウェッテ
ィング力の手段によって変更することができる。次に、光導電層に当たる光によって導電
性セルのスイッチを入れたり切ったりすることができる。この手法は、その有用性が電極
の配置によってある程度依然として制限されているが、切替えがはるかに容易かつ迅速に
なるという長所を有する。さらに、液滴を移動させることができる速度、及び実際の液滴
経路を変化させることができる程度には制限がある。
この後者のアプローチの二重壁の実施形態は、非特許文献１に開示されている。ここで
は、誘電体層上に堆積されたテフロン（登録商標）AFの表面を横切る光学的に媒介される
エレクトロウェッティングを用いて、100～500μmの大きさの比較的大きな液滴の操作を
可能にするセルについて説明する。パターン化されていない電気的にバイアスされたアモ
ルファスシリコン上の光パターンは、概略的な形態で記載されている。しかしながら、表
される機構では、誘電体層は薄く(100nm)、光活性層を支持する壁上にのみ配置されてい
る。
非特許文献２は、疎水性マイクロチャネル中の親水性パッチ上の液滴の電極支援トラッ
プおよび放出を教示する。
国際公開第2014/053853号パンフレット 国際公開第2014/053854号パンフレット 国際公開第2014/167323号パンフレット 国際公開第2014/167324号パンフレット 国際公開第2014/111723号パンフレット 米国特許第6,565,727号明細書 米国特許出願公開第2013/0233425号明細書 米国特許出願公開第2015/0027889号明細書 米国特許出願公開第2003/0224528号明細書 米国特許出願公開第2015/0298125号明細書 米国特許出願公開第2016/0158748号明細書
University of California at Berkeley thesis UCB/EECS-2015-119 by Pei Microfluid Nanofluid (2016) 20: 123
出願人らが最近出願した欧州特許出願、出願番号17180391.9号において、出願人らは、
現在、高速で信頼性のある単一ヌクレオチド検出方法の要件に従って、数千の微小液滴を
同時に操作することができる核酸分子調査装置を説明した。これは、コンピュータソフト
ウェアのアプリケーションによって容易に再構成可能であるという利点を有し、例えば、
ユーザが最適な精度、スループット、又は特定のエピジェネティック修飾を検出するため
に容易に適応することを可能にすることによって、非常に汎用性がある。本発明者らはま
た、対応する調査方法を開発し、その構成は最初の分析物消化ステップが粒子担持分析物
を、不混和性キャリア媒体中の上流(別個の位置、例えば消化が起こるチップの上流を含
むが、これに限定されない)で生成された消化媒体を含有する水性微小液滴の流れの成分
と直接相互作用させることによって実施されることである。この手段により、消化ステッ
プを「粒子上」および「液滴内」で行うことができ、それにより、この消化ステップの精
度および信頼性を有意に増大させる。
その最も広い範囲で、この方法が広く適用可能であることを認識して、本発明の第1の
態様によれば、（ａ）微小液滴及び固形担体を結合させる条件下で、微小液滴を固形担体
に接触させるステップと、（ｂ）反応媒体を、標的分子と反応させるステップと、（ｃ）
その後、反応媒体に、固形担体から分離させ、キャリア流体で微小液滴を再び作る力を加
えるステップと、を含む、不混和性キャリア媒体の反応媒体の微小液滴を、固形担体に拘
束される標的分子とともに、化学的変換をもたらすために操作する方法が提供される。
この方法の1つのバージョンでは、固形担体上の所与の箇所に固定化された標的分子の
化学変換を実施するための方法が提供され、この方法は、粒子を含み、(a)各々が化学変
換を生じさせることができる媒体からなる微小液滴の流れを生成するステップと、(b)化
学変換が生じ得る条件下で、所与の箇所で、所与の期間にわたって、各微小液滴を標的分
子と順番に接触させるステップと、(c)所与の期間の終わりに、所与の箇所から微小液滴
を除去するステップとを含む。
好適には、これらの方法が、反応媒体の成分が枯渇した固形担体の近傍から改質された
微小液滴を運び去るステップをさらに含む。好ましくは、加えられる力が、固形担体の位
置を含む経路上の様々な点または区域に加えられるエレクトロウェッティング力である。
このエレクトロウェッティング力を、電気的または光学的に発生させることができる。
一実施形態において、使用される反応媒体は核酸分析物を変換するためのものであり、
標的分子はポリヌクレオチドであり、例えば、プライマー/テンプレートとして一本鎖ポ
リヌクレオチドを使用する核酸(例えば、RNA又はDNA)の合成である。このような実施形態
では、固形担体に適用される微小液滴が、ヌクレオチドモノマーの供給源、少なくとも1
つのポリメラーゼ、および当該技術分野で通常必要とされる他の成分を含むであろう。
別の実施形態において、この方法は、核酸(例えば、RNA又はDNA)又はタンパク質のよう
な生体高分子の分子構造を調査するために有用である。例えば、本発明の第2の態様によ
れば、
不混和性キャリア媒体における消化媒体の微小液滴の流れを、経路で１つずつ生体高
分子に接触させることによって、生体高分子を微小液滴内で生体高分子の構成モノマー単
位へ漸進的に消化させるステップと、
少なくとも一部は単一モノマー単位を包含する微小液滴を、生体高分子の周りから除
去するステップと、
微小液滴を、経路に沿って検出区域まで更に送達するステップと、
検出区域で微小液滴のモノマー単位を同定し、モノマー単位からそれらの化学構造を
推測するステップと、
を含むことを特徴とする、生体高分子を含む標的分子を調査するための方法が提供される
。
第1及び第2の態様の一実施形態では、標的分子/生体高分子は核酸分析物であり、消化
媒体はポリヌクレオチドを形質転換することができるものである。例えば、それは、ポリ
メラーゼ、及び好ましくはポリリン酸アニオンまたはその類似体である補因子を含み得る
。最も好ましくは、ポリリン酸がヌクレオチド三リン酸の生成をもたらすピロリン酸であ
る。別の実施形態では、消化媒体が、分析物をヌクレオチド一リン酸に消化するエキソヌ
クレアーゼを含む。次いで、これらのヌクレオチド一リン酸は、キナーゼの作用によって
、それらの対応するヌクレオチド三リン酸に変換され得る。次いで、ヌクレオチド一リン
酸又はヌクレオチド三リン酸の同定は例えば、核酸塩基選択的オリゴヌクレオチド捕捉プ
ローブの手段によって、蛍光標識の適用によって、又は例えば表面若しくはプラズモン現
象によって増強された核酸塩基の特性ラマン散乱を検出することによって直接的に、それ
ぞれに関連する核酸塩基を同定することを含む。一実施形態では、そのような同定ステッ
プが入射電磁放射源(レーザ又はLEDなど)と、核酸塩基から生じる放射を検出するための
光検出器とを使用する検出区域の使用を適切に含む。
別の実施形態では、以下でより詳細に説明するように、本発明の第2の態様の方法は、
結果として生じるヌクレオチドを、ポリメラーゼの存在下で蛍光プローブからなるオリゴ
ヌクレオチド捕捉システムと反応させ、フルオロフォアを検出可能な状態で放出し、蛍光
プローブは、不使用状態で蛍光を発さず核酸分析物に特徴的なヌクレオチドの種類の少な
くとも１つに対して選択的であり、結果として生じ、各微小液滴で放出されるフルオロフ
ォアに由来する蛍光は、第1電磁放射入射源及び光検出器を用いて検出されることを特徴
とする。適切には、このようなフルオロフォアの放出は、エキソヌクレアーゼ及び／又は
エンドヌクレアーゼ並びに任意にリガーゼの作用の結果であり、そのような作用が、検出
される前記ヌクレオチドの捕捉によって触媒される。一実施形態では、オリゴヌクレオチ
ド捕捉システムが微小液滴合体によって、または直接注入によって、分析物消化部位の下
流に導入される。このような場合、消化媒体は、オリゴヌクレオチド捕捉システムとの反
応の前にピロホスファターゼで処理されることが好ましい。
これらの実施形態の好ましい一バージョンにおいて、生体高分子は核酸であり、モノマ
ーは漸進的ピロリン分解によって生成されるヌクレオシド三リン酸であり、同定ステップ
は未使用状態では非蛍光性であり、所定の核酸塩基に対して選択的である、使用されたオ
リゴヌクレオチドプローブのエキソ核分解（exonucleolysis）によって生成される蛍光の
検出を含む。したがって、本発明の第3の態様によれば、
水性加ピロリン酸分解媒体の微小液滴の流れを、経路において分析物に接触させること
によって、分析物を漸進的に分析物の構成単一ヌクレオシド三リン酸にするステップと、
キャリア媒体の、少なくとも一部は単一ヌクレオシド三リン酸の１つを包含する微小液
滴を、分析物の周りから除去するステップと、
微小液滴を経路に沿って更に送達するステップと、
経路に沿い又は加ピロリン酸分解の上流である1つ以上の位置を、各微小液滴検出要素
に導入するステップと、
各微小液滴における、当該1つ以上の位置の下流である地点で放出されるフルオロフェ
アに由来する蛍光を検出するステップと、
を含む核酸分析物の調査方法であり、
各微小液滴検出要素は、
（ａ）不使用状態では蛍光を発しない蛍光プローブを含むオリゴヌクレオチド捕捉システ
ムと、
（ｂ）ポリメラーゼと、
（ｃ）任意に、リガーゼと、
（ｄ）蛍光状態において、使用される捕捉システムからフルオロフェアを放出できるエキ
ソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼと、
からなり、
加ピロリン酸分解は第１電磁照射入射源及び光検出器を使用する、調査方法が提供され
る。
本発明のこれら第２又は第３の態様の方法は、二本鎖ポリヌクレオチド分析物を配列決
定するのに特に適しており、二本鎖ポリヌクレオチド分析物は原則的に無制限であり得る
ヌクレオチド鎖長を有し、例えば、ゲノム断片中に見出される何百万ものヌクレオチド塩
基類対まで有することができる。したがって、一実施形態では分析物が少なくとも50、好
ましくは少なくとも150ヌクレオチド塩基類対長あり、適切には500を超え、1000を超え、
場合によっては5000超のヌクレオチド塩基類対の長さである。一実施形態では分析物が天
然起源のDNA(例えば、植物、動物、細菌またはウィルスに由来する遺伝物質)であるが、
本方法は部分的若しくは完全な合成DNA、又は実際には天然では一般に遭遇しないヌクレ
オチド塩基類からなるヌクレオチド、すなわち、アデニン、チミン、グアニン、シトシン
及びウラシル以外の核酸塩基を有するヌクレオチドから完全に若しくは部分的に構成され
る他の核酸の配列決定に等しく適用可能である。このような核酸塩基の例には、そのよう
な核酸塩基の例には、4-アセチルシチジン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジ
ン、2-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボ
キシメチルアミノ-メチルウリジン、ジヒドロウリジン、2-O-メチルプソイドウリジン、2
-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンチルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-
メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノ
シン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン
、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メト
キシアミノメチル-2-チオウリジン、5-メトキシウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-
2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニ
ルアデノシン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5 -オキシ酢酸、ウィ
ブトキソシン、ウィブトシン、プソイドウリジン、クエオシン、2-チオシチジン、5-メチ
ル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、2-O-メチル-
5-メチルウリジンおよび2-O-メチルウリジンを含む。分析物がRNAである場合、同様の考
察が適用される。
本発明の第３の態様の好ましい実施形態を考えると、第１ステップ及び経路内の加ピロ
リン酸分解区域において、分析物は3-5’方向に漸進的にピロリン酸化されて、単一ヌク
レオシド三リン酸の流れを生成し、その順序は、分析物の配列の順序に対応する。加ピロ
リン酸分解そのものは、ポリメラーゼのような酵素を含む水性加ピロリン酸分解媒体を包
含する微小液滴の流れの存在下、20～90℃の温度で行われる。一実施形態では、この媒体
は緩衝化され、加ピロリン酸分解反応を維持するのに必要な他の成分(ポリメラーゼ、ピ
ロリン酸アニオン、マグネシウムカチオンなど)も含み得る。別の実施形態では、媒体が
、以下にさらに特定されるヌクレオチド検出成分の1つ以上をさらに含む。さらに別の実
施形態では、これらの成分のいくつかまたは全てを、本方法の実施において、例えば、微
小液滴噴射器を使用する直接注入によって、又は微小液滴の、関連材料を含有する二次微
小液滴との合体によって、種々の点の別のところに導入することができる。好適には、使
用される微小液滴が鉱油またはシリコーンオイルなどの不混和性キャリア媒体中に懸濁さ
れる。
望ましいことに、本発明の方法は、加ピロリン酸分解の速度ができるだけ速く、かつ、
1つの実施形態において、この速度は1秒当たり1単位ヌクレオシド三リン酸から50単位ヌ
クレオシド三リン酸までの範囲内にあるように、運用される。ポリヌクレオチドの漸進的
分解に適用される加ピロリン酸分解反応についてのさらなる情報は、例えばJ. Biol. Che
m. 244 (1969) pp. 3019-3028.に見出すことができる。
一実施形態では、分析物消化が流れ中の各微小液滴を、分析物が予め付着している粒子
と順番に接触させることによって実施される。適切には、このような粒子が化学的または
物理的手段によって分析物が結合される1つ以上の分析物反応性部位を含むように予め修
飾されている。一実施形態では、粒子がビード、例えば、グラス、シリカ, アルミナ、金
属又は非分解性高分子などの不活性物質から作製されたマイクロビードである、ビードを
含む。別の実施形態では、粒子が磁気的に操作されることを可能にする常磁性物質のコア
を有する。別の実施形態では、粒子が最初の微小液滴に含まれ、従来の又は光学的に媒介
されるエレクトロウェッティングの手段によってその消化箇所に操作されてもよい。さら
に別の実施形態では、粒子が磁気、エレクトロウェッティング、吸引、物理的収縮を含む
1つ以上の手段によって、又は例えば、経路がマイクロ流体チャンネル若しくはチューブ
である場合のように、経路の壁に一時的に化学的若しくは物理的に結合することができる
、その上に取り付けられた二次付着基によって、消化が行われる所与の位置に保持されて
もよい。
これらの二次付着基及び分析物反応部位を作り出すことができる多くの方法がある。例
えば、これらの二次付着基については、金属蒸着法又はプラズマ堆積等の公知の手法を用
いて、まず粒子を金属で部分的に被覆することにより作製することができる。その後、金
属表面を化学的に修飾して、経路のある箇所に配置される相補的な第2の部分に可逆的に
結合することができる1つ以上の第1の部分を導入することができる。一実施形態では、第
1および第2の部分のこれらの対がそれらの間に生成される結合が環境温度または環境温度
付近で可逆的に作製され、破壊され得るように選択される。この手段により、粒子を消化
箇所に付着させることができ、分析物を消化でき、その後、ビードを当該箇所から容易に
分離させることができ、当該箇所は次に別の新しいビードを受け取ることができる。1つ
の実施形態では、これらの第1および第2の部分の対が、例えば補完的なビオチン部分を有
するアビジン又はストレプトアビジン部分を使用することにより、消化の条件下で安定し
たタンパク質複合体の形成につながりうる。別の実施形態では、これらの対が、例えば、
ポリヒスチジン/キレート化金属イオン対(低pH又はイミダゾール若しくは強金属キレート
化剤の存在下で破壊された結合);ボロン酸/適切な炭水化物一対(低pHで破壊された結合)
又はマレイミド/セレノール対(メタ-クロロペルオキシ安息香酸を使用して破壊された結
合)におけるような、不安定な化学結合を作り出すことができる。これらの場合には、ビ
ード上を通る微小液滴のpH又は組成物を変化させることによって、続いて粒子を分離する
ことができる。
1つの好ましい実施形態において、上記の部分の対は、複数のヒスチジン残留分(好まし
くは6より大きい)及び例えばコバルト、銅又はニッケルのような遷移金属のニトロトリア
セテート(NTA)又はイミノジアセテート(IDA)塩類誘導体から選択されるキレート化剤部分
からなるポリヒスチジン部分を含む。これらの第1および第2の部分はそれぞれ、粒子及び
経路箇所上に、どちらかの方向の周りに展開され得ることが理解される。
同様に、分析物反応部位を作り出すことができる多くの方法がある。したがって、別の
実施形態では、粒子のコーティングされていない表面を、例えば、シリカ、アルミナ又は
ガラスビード、エポキシシラン、アミノヒドロカルビルシラン又はメルカプトシランのよ
うな官能化剤で下塗りして、分析物を付着させることができる化学反応部位を生成するこ
とができる。その後、これらの反応部位を末端プライマー反応性基、例えば一実施形態で
は、アミン、スクシニル又はチオール基を含むように対応して修飾された分析物の誘導体
で処理することができる。別の実施形態において、化学的付着は、アダプターオリゴヌク
レオチドへのライゲーションを介して、または上記のタンパク質複合体の型を介して起こ
り得る。
さらに別の実施形態では、そのようにプライミングされた粒子が1つの分析物反応部位
のみを有する領域を含み、その結果、分析物の1つの分子のみが付着され得る。これは分
析物が小さなポリヌクレオチド断片である場合に重要となることがあり、さもなければ、
複数の分子が調製中に付着する傾向があり、これは望ましくないからである。立体効果が
このような結果を妨げるように働くので、ポリヌクレオチド断片が大きい場合、それはあ
まり問題ではない。適切には、粒子が0.5～5ミクロン(μｍ)の範囲の最大直径を有するで
あろう。
好ましい一実施形態では、粒子が磁気コアを有する球状ビーズであり、例えば、Dynabe
ads(登録商標)の名称で販売されているビーズである。
分析物付近の表面壁の濡れ性を変えるために、湿潤させるのが困難であるか、又は湿潤
させるには小さすぎる(疎水性ビード上又は非常に小さなビード上に固定化される分析物
など)ように標的分析物が固定化される方法のいくつかの実施形態では有利である。この
ような濡れ性の変更は、PEGシランによるコーティングのような化学表面コーティングを
用いて達成することができる。別の実施形態では、前述のエレクトロウェッティングメカ
ニズムのうちの1つを使用して、濡れ性に対する一時的な変更を誘発することができる。
表面濡れ性を変更することによって、この濡れ性処理を受ける表面積をユーザが正確に規
定することができるので、方法の信頼性を改善することが可能である。したがって、前方
への液滴輸送によって表面から脱湿潤される流体の正確な体積、及び表面に湿潤された後
に残され得る残りの流体の体積を制御することがより容易になる。これは、粗い表面を有
する孤立したビーズのような、表面積があまり限定されていない標的で達成することが困
難である、標的分析物と液滴との間に高度に再現性のある体積交換を与えるという利点を
有する。
本方法の第1ステップの特徴は、標的ビードがその表面上を駆動される際に、不混和性
キャリア媒体中に懸濁された微小液滴が標的ビードを一時的に湿潤および脱湿潤させる、
分析物の消化が液滴化水性媒体中で行われることである。この手段により、ヌクレオチド
三リン酸分子が分析物鎖から放出されるとき、ヌクレオチド三リン酸分子はカプセル化さ
れ、次いで、微小液滴が粒子から脱湿潤するか又は部分的に脱湿潤する場合、下流に除去
される。一実施形態では、粒子が微小液滴と一時的に接触しているときに、消化が行われ
る。さらに別の実施形態では、湿潤/脱湿潤の速度が、平均して、放出されるヌクレオチ
ドよりも多くの微小液滴が粒子上を通過するように調整される。別の実施形態では、粒子
の体積が微小液滴の体積よりも小さく、例えば、当該体積の75%未満、又は好ましくは50%
未満である。さらに別の実施形態では、微小液滴がその上を通過する際に、粒子が水性シ
ェルを保持することができる。この場合、シェル体積対微小液滴体積の比は、可能な限り
小さいことが好ましい。例えば、微小液滴体積の50%が粒子上に残る場合、このことは、
ヌクレオチドが微小液滴と共に運び去られる50%の可能性を与え、そしてヌクレオチドが
残る50%の可能性を与える。
この微小液滴湿潤/脱湿潤方法論は、分析物に対して実施される漸進的化学変換が消化
以外、例えばDNAの合成又はナノ粒子の合成である場合、配列決定以外の応用を有するこ
とが理解される。このような変換の可能性は、一実施形態では複数の微小液滴タイプを、
例えば触媒、プライマー、または他の反応物を担持する粒子と段階的に相互作用させるこ
とによって、さらに増大させることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、
（ａ）それぞれ化学的変換を起こす媒体からなる微小液滴の流れを生成するステップと、
（ｂ）前記化学的変換を起こすことができる条件下で、各微小液滴を次々に、所与の箇所
で、所与の期間、標的分子と接触させるステップと、（ｃ）前記所与の期間の最後に、前
記微小液滴を前記所与の箇所から除去するステップと、を含むことを特徴とする、所与の
箇所に固定される標的分子の化学的変換を実施する一般的な方法が提供される。好適には
、微小液滴が本明細書に記載されるタイプの不混和性キャリア中に懸濁され、所与の箇所
は上記のような粒子である。
所与の微小液滴が複数の単一ヌクレオチド分子を含むリスクを回避するために、生成さ
れた各充填微小液滴が平均で1～20、好ましくは2～10個の空白部によって分離されるよう
に、粒子をわたる微小液滴の流れ及び消化を同期させることが好ましい。好適には、微小
液滴が500pL(ピコリットル)未満、好ましくは65pL未満、より好ましくは4pL未満、さらに
より好ましくは2pL未満の有限体積を有する。最も好ましくは、それらの全ての体積が4fL
(フェムトリットル)～4pLの範囲である。一実施形態では、粒子をわたる微小液滴流速が1
～1000微小液滴/秒、好ましくは50～500微小液滴/秒である。
微小液滴が粒子から及び分析物の周囲から除去された後、微小液滴は規則正しい流れを
生成し、そのいくつかは、ここで、分析物のヌクレオチド構成を含む。次いで、この微小
液滴の流れは、例えば、マイクロ流体チャンネル又はチューブなどのマイクロ流体空間を
含み得る経路に沿ってさらに輸送される。適切には、この輸送が加圧駆動流を使用しても
よく、又は、例えば従来の「エレクトロウェッティングオン誘電体」(eWOD)構成、若しく
は好ましくはエレクトロウェッティング力が光学効果によって生成される構成の手段によ
って、エレクトロウェッティング力を使用してもよい。好ましい一実施形態では、経路は
、第1及び第2の基板、第1及び第2の導体層、光活性層、並びに第1及び第2の誘電体層から
なる第1及び第2複合壁から構成されるか、又はそれによって画定される光学的に媒介され
る、エレクトロウェッティングマイクロ流体空間である。別の実施形態では、この区域が
、空洞でありマイクロ流体空間を収容するチップ又は扁平状カートリッジを含む。さらに
別の実施形態では、少なくとも第1基板及び第1導体層が透明であり、第２電磁波照射源(
例えば、多重レーザービーム又はLEDダイオード)からの光が光活性層に直接当たることを
可能にする。別の実施形態では、第2の基板、第2の導体層、及び第2の誘電体層は同じ目
的を達成できるように透明である。さらに別の実施形態では、これらの層はすべて透明で
あり、両側から照明を行うことができる。
適切には、第1及び第2の基板が、機械的に強い材料、例えば、ガラス、金属、半導体又
はエンジニアリングプラスティックから作られる。一実施形態では、基板がある程度の柔
軟性を有することができる。さらに別の実施形態では、第1及び第2の基板が100～1000μm
の厚さを有する。
第1及び第2の導体層は、第1及び第2の基板の一方の表面に位置し、典型的には非常に薄
く、それぞれ70～250nm、好ましくは70～150nmの厚さを有する。一実施形態では、これら
の層のうちの少なくとも1つは酸化インジウムスズ(ITO)などの透明導電材、銀などの導電
性金属の非常に薄いフィルム、又はPEDOTなどの導電性高分子から作製される。当該層は
、連続シートとして、又はワイヤなどの一連の別個の構造として形成することができる。
あるいは、導体層が、電磁波がメッシュの隙間の間に向けられる導電材のメッシュであっ
てもよい。
光活性層は、好適には、第２電磁放射線源による刺激に応答して、局所的な電荷領域を
生成することができる半導体材料から構成される。例としては、300～1000nmの範囲の厚
さのアモルファスシリコンが挙げられる。一実施形態では、光活性層が可視光の適用によ
って活性化される。
第1の壁の場合には光活性層は、任意に第2の壁の場合には導電層は、非常に薄く典型的
には120～160nmの範囲の誘電体層で被覆される。この層の誘電特性は、107V/m超の高誘電
強度及び3超の誘電率を含むことが好ましい。一実施形態では、誘電体層が、高純度アル
ミナ又はシリカ、ハフニア又は薄い非導電性高分子膜から選択される。
この構成の別のバージョンでは、少なくとも第1の誘電体層、好ましくは両層が防汚層
でコーティングされて、各種エレクトロウェッティング箇所で所望の微小液滴/キャリア
流体/表面接触角度を確立するのを助け、さらに、微小液滴が経路に沿って移動するとき
に、微小液滴の中身が表面に付着し、減少することを防止する。第2の壁が第2の誘電体層
を含まない場合、第2の防汚層は、第2の導体層上に直接的に適用されてもよい。最適な性
能のためには、防汚層が、25℃で大気-液体-表面3点インタフェースとして測定した場合
、50～70°の範囲にある接触角度の確立を助けるべきである。キャリア媒体の選択に依存
して、水性エマルションで満たされた類似する経路における微小液滴の同じ接触角度はよ
り高く、100°を超える高さになるであろう。一実施形態では、これらの層が50nm未満の
厚さを有し、典型的には単分子層である。別の実施形態では、これらの層が、アルコキシ
シリル等の親水性基で置換されたメタクリル酸メチル又はその誘導体などのアクリル酸塩
エステルの重合体から構成される。好ましくは、防汚層の一方又は両方が最適な性能を保
証するために疎水性である。
第1及び第2の誘電体層、したがって第1及び第2の壁は、深さが50μm未満、好ましくは1
0μm未満であり、その中に微小液滴が含まれるマイクロ流体空間からなる経路を適切に画
定する。一実施形態では、微小液滴が微小液滴空間に含まれる前に、微小液滴は、微小液
滴空間の１つの寸法よりも10%を超える、適切には20%を超える固有直径を有する。この手
段によって、微小液滴は、経路内で圧縮を受け、微小液滴の圧縮されていない自然状態の
表面ポテンシャルエネルギーより高い表面ポテンシャルエネルギーの追加により、特定の
操作のための向上したエレクトロウェッティング性能をもたらす。
別の実施形態では、経路が、第1及び第2の壁を所定の間隔まで離して保持するための1
つ又は複数のスペーサを含み得る。スペーサに対する選択肢には、光パターニングによっ
て生成されたレジスト層等の中間層から生み出されたビード又はピラー又は隆起部等が含
まれる。様々なスペーサ幾何学的形状を使用して、ピラーの線によって画定される、細い
チャネル、先細りのチャネル、又は部分的に囲まれたチャネル等の空間を画定することも
できる。注意深いデザインによって、これらの構造を使用して、微小液滴の変形を助け、
続いて微小液滴の分割を行い、変形した微小液滴に対して操作を実施することができる。
第1の壁と第2の壁との間の距離は、微小液滴の変形のレベルに影響を及ぼし、微小液滴
の運動を妨げる表面抵抗を付加または除去する。第1の壁と第2の壁との間の間隔が装置を
横切って変化するように装置を構造化することによって、異なる微小液滴操作のために輪
郭が調整される、少なくとも1つの可変寸法の経路を有することが可能である。
第1及び第2の壁は導体層に取り付けられたAC電源を使用してバイアスされ、これらの間
に、適切には10～50ボルトの交流電位差を提供する。
本発明のシーケンシング装置は、400～1000nmの範囲の波長及び光励起可能層のバンド
ギャップよりも高いエネルギを有する第２電磁放射源をさらに含む。好適には、光活性層
が、採用される放射線の入射強度が0.01～0.2 Wcm-2であるエレクトロウェッティング箇
所で、活性化されるであろう。電磁放射源は、一実施形態では高度に減衰され、別の実施
形態では画素化される光活性層上に対応する光励起領域を生成するように同様に画素化さ
れる。この手段によって、第1の誘電体層上の画素化される対応エレクトロウェッティン
グ箇所が誘起される。米国特許出願公開第2003/0224528号明細書に教示された設計とは対
照的に、これらの画素化エレクトロウェッティング点は、導電性セルが存在しないので、
第1の壁の対応する永久構造とは関連しない。その結果、本発明の装置では照度がない場
合、第1の誘電体層の表面上の全ての点は、エレクトロウェッティング箇所になる傾向が
等しい。これは、装置を非常に柔軟にし、エレクトロウェッティング経路を高度にプログ
ラム可能にする。この特性を、従来技術で教示された永久構造のタイプと区別するために
、我々は我々の装置で生成されたエレクトロウェッティング箇所を「一過的」として特性
付けることを選択し、我々の出願の特許請求の範囲は、それに応じて解釈されるべきであ
る。
ここで教示される最適化された経路デザインは、得られる複合体積層体が高誘電強度及
び高誘電率を有するより厚い中間層(酸化アルミニウム又はハフニアなど)の性能と組み合
わされた、コーティングされた単層(又は非常に薄い機能層)からの防汚及び接触角修正特
性を有するという点で、特に好都合である。得られる積層構造は、10μm未満、例えば2～
8、2～6、2～5又は2～4μmの径を有するような、非常に小さな体積の微小液滴の操作に非
常に適している。1つの好ましい実施形態において、これらの範囲は10fL～1pLの範囲の体
積を有する微小液滴を生じさせる。これらの極めて小さな微小液滴では、液滴寸法が誘電
体積層の厚さに近づき始め、したがって、液滴を横切る場勾配(エレクトロウェッティン
グ誘起運動の必要条件)がより厚い誘電体に関して低減されるので、光活性層の上に最小
厚さの全非導電性積層を有することの性能上の利点は極めて好都合である。
第２電磁放射源が画素化される場合、電磁放射源は、例えばLEDからの光によって照明
される反射スクリーン又はデジタルマイクロミラーデバイス(DMD)を使用して直接的又は
間接的に適切に供給される。これは、一過的エレクトロウェッティング箇所の非常に複雑
なパターンが迅速に生成され、第1の誘電体層において破壊されることを可能にし、それ
によって、厳密に制御されたエレクトロウェッティング力を使用して、エレクトロウェッ
ティング経路に沿って微小液滴が正確に操縦されることを可能にする。これは、複数のエ
レクトロウェッティング経路に沿って数千のこのような微小液滴を同時に操作することを
目的とする場合に特に有利である。このようなエレクトロウェッティング経路は、第1の
誘電体層上の仮想的エレクトロウェッティング箇所の連続体から構成されると考えること
ができる。
光活性層への第２電磁放射線源の衝突点は、従来の円形を含む任意の好都合な形状とす
ることができる。一実施形態では、これらの点の形態が対応する画素化の形態によって決
定され、別の形態では、経路の微小液滴の形態に完全に又は部分的に対応する。1つの好
ましい実施形態では、衝突点したがってエレクトロウェッティング箇所は三日月形であっ
てもよく、経路における微小液滴の意図された移動方向に配向されてもよい。別の実施形
態では、第2の壁はまた、第2の誘電体層上に、同じ電磁波源又は本明細書に記載される種
類の第2の源のいずれかを手段することによって、さらなる一過性エレクトロウェッティ
ング箇所を誘導することを可能にする光活性層を含む。好適には、エレクトロウェッティ
ング箇所自体が第1の壁に付着する微小液滴表面よりも小さく、液滴と表面誘電体との間
に形成される接点線を横切る最大場強度勾配を与える。第2の光活性層を追加することに
より、ウェットエッジを経路の上面から下面に移行させることが可能になり、各微小液滴
に代替または追加のエレクトロウェッティング力を目標に適用することが可能になる。
一実施形態では、光活性層上の第２電磁波放射の衝突点を操作するための手段が、第1
の誘電体層及び任意選択で第2の誘電体層上に、複数の同時に流れる例えば並列の、第1の
エレクトロウェッティング経路を生成するように適合又はプログラムされる。別の実施形
態では、第1及び任意選択で第2の誘電体層上に、第1のエレクトロウェッティング経路と
交差する複数の第3のエレクトロウェッティング経路も生成して、異なる経路に沿って移
動し異なった主要微小液滴及び副次的微小液滴を合流させることができる少なくとも1つ
の微小液滴合流箇所を生成するように適合又はプログラムされる。第1及び第3のエレクト
ロウェッティング経路は互いに直角に、又は正面を含む任意の角度で交差してもよい。こ
の実施形態は、検出成分（下記参照）を、液滴合流によって、経路中の微小液滴中に送達
することが所望される場合に特に有用である。多数の第1、第2、および第3のエレクトロ
ウェッティング経路が使用されるさらに別の実施形態では、衝突点を操作するための手段
がマイクロプロセッサによって適切に制御され、マイクロプロセッサは、それに沿って微
小液滴が通過する経路を生成するだけでなく、互いに対する各微小液滴の動きを同期させ
る。
上述したように、本発明のある実施形態では、方法は、経路に沿う少なくとも１つの箇
所に、ヌクレオチド検出成分を導入するステップも含み、当該ヌクレオチド検出成分は、
（ａ）以下及び／又は出願人らの先の特許出願で特定される蛍光プローブの種類（すなわ
ち均等の機能を有するプローブ）を含むオリゴヌクレオチド捕捉システムと、（ｂ）ポリ
メラーゼと、（ｃ）任意に、リガーゼと、（ｄ）蛍光状態において、使用される捕捉シス
テムからフルオロフェアを放出できるエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ
と、からなる。一実施形態では、これらの成分のいくつか又は全ては、経路に沿った箇所
又はその上流(上記参照)で、例えば元の微小液滴媒体中に存在することによって、一緒に
又は段階的に微小液滴中に導入される。これらの検出成分の導入は、1つ以上の箇所で、
例えば、微小液滴噴射器を使用する直接注入によって、又は関連材料を含有する二次微小
液滴との微小液滴の合体によって、達成され得る。1つの好ましい実施形態において、ピ
ロリン酸は、分析物の下流及び検出成分の第1の導入点の上流で、微小液滴に導入される
。
出願人らの先の特許によれば、種々の捕捉システムを使用することができる。例えば、
一実施形態では、捕捉システムは、(a)検出不可能な状態の特性フルオロフォアで標識さ
れた第1の一本鎖オリゴヌクレオチドと、(b)第1のオリゴヌクレオチド上の相補的領域に
ハイブリダイズすることができる第2及び第3の一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含むシス
テムから選択される。
別の実施形態では、捕捉システムは、(a)制限エンドヌクレアーゼニッキング部位を含
む第1の一本鎖オリゴヌクレオチド、単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌ
クレオチド捕捉部位、及びフルオロフォアを消光させるように、それぞれ少なくとも1つ
のフルオロフォア及び少なくとも1つの消光剤を有するニッキング部位のいずれかの側に
並置されたオリゴヌクレオチド領域と、(b)捕捉部位のいずれかの側の第1のオリゴヌクレ
オチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる第2及び第3の一本鎖オリゴヌク
レオチドと、を含むシステムから選択される。
別の実施形態では、捕捉システムは、(a)エキソヌクレアーゼ遮断部位、遮断部位の5'
側に位置し単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位を含む
制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びフルオロフォアを消光させるように配置された認
識部位の5'側に位置する少なくとも1つのフルオロフォア領域を含む、第1の一本鎖オリゴ
ヌクレオチドと、(b)第1のオリゴヌクレオチドからそれぞれ分離し、捕捉部位の3'及び5'
側に隣接する、第1のオリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることがで
きる、第2及び任意選択で第3の一本鎖オリゴヌクレオチド、を含むシステムから選択され
、又は、(a)エキソヌクレアーゼ遮断部位、遮断部位の3'側に位置し単一ヌクレオシド三
リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位を含む制限エンドヌクレアーゼ認識部
位、及びフルオロフォアを消光させるように配置された認識部位の3'側に位置する少なく
とも1つのフルオロフォア領域を含む、第1の一本鎖オリゴヌクレオチドと、(b)第1のオリ
ゴヌクレオチドからそれぞれ分離し、捕捉部位の3'及び5'側に隣接する、第1のオリゴヌ
クレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる、第2及び任意選択で第3の
一本鎖オリゴヌクレオチド、を含むシステムから選択される。
別の実施形態では、捕捉システムは、(i)(a)二本鎖領域及び一本鎖領域を含む第1のオ
リゴヌクレオチドと、(b)核酸塩基配列が第1のオリゴヌクレオチドの一本鎖領域の核酸塩
基配列と少なくとも部分的に相補的である第2の一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含む2つ
の成分を包含するシステムから選択され、又は、(ii)末端が2つの異なる二本鎖オリゴヌ
クレオチド領域に付着している一本鎖ヌクレオチド領域を含む単一のオリゴヌクレオチド
を包含するシステムから選択され、オリゴヌクレオチド捕捉システムが検出不能な状態で
フルオロフォアによって標識されている。
さらに別の実施形態では、捕捉システムは、一本鎖ヌクレオチド領域を含むシステムか
ら選択され、その端部は二本鎖オリゴヌクレオチド領域に付着し、ここで、オリゴヌクレ
オチド領域の少なくとも1つは検出不能な状態のフルオロフォアを含む。
検出成分の導入後、好ましくは蛍光シグナルが発生するインキュベーション期間後、微
小液滴は、第1の電磁放射線の入射源および光検出器を含む検出システムを用いて下流で
調べられる。いくつかの実施形態では、第1および第2の電磁放射源は同じであってもよい
ことが理解されるであろう。この手段によって、使用されたオリゴヌクレオチド捕捉シス
テムがエキソヌクレアーゼ分解及び/又はエンドヌクレアーゼ分解を受けるときに放出さ
れる蛍光フルオロフォアが検出され、各微小液滴に含まれるヌクレオシド三リン酸の性質
が決定される。一実施形態では、この検出が、微小液滴が圧力駆動流、従来のエレクトロ
ウェッティング、又は光学的に媒介されるEWODのうちの1つまたは組合せによって最終的
に駆動される経路の端部に検出位置が設けられた表面を含む、検出ゾーンで行われる。こ
のような表面は、これらの最終目的地位置を作り出すために、ウェルなどの構造でプロフ
ァイルされてもよい。別の実施形態では、検出ステップが、出口点に位置する検出位置で
蛍光検出システムによって問い合わせられる前に、各微小液滴が積み重ねられ、移動する
、毛細管のアレイを含む検出ゾーンに微小液滴を導入することを含む。
一実施形態では、検出システムは、各々の微小液滴の含有物を調べるための、例えば1
つ以上のレーザー又はLEDのような第1の電磁波放射の1つ以上の源と、使用されている特
定の捕捉システムで使用される種々の蛍光体の特徴的な蛍光波長又は波長エンべロープに
同調された1つ以上の光検出器又は均等の装置とから構成される。その後、光検出器によ
って検出される任意の放出蛍光は、分析物の配列のデータ特性を明らかにするために、既
知のアルゴリズムを使用してコンピュータで処理および分析することができる電気信号を
生じる。
本発明の好ましい第3の態様の1つの実施形態では、不混和性キャリア媒体中の水性微小
液滴流中の、加ピロリン酸分解酵素を包含する各微小液滴を、分析物が付着している粒子
と次々に接触させ、それによって、酵素に、分析物からヌクレオシド三リン酸分子を微小
液滴の少なくとも一部に放出させた後、それらを粒子の周囲から除去するステップを特徴
とする、核酸分析物を加ピロリン酸分解する方法が提供される。
別の実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチド捕捉システムが、(a)検出不可能な
状態の特性フルオロフォアで標識された第1の一本鎖オリゴヌクレオチドと、(b)第1のオ
リゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる第2及び第3の一本鎖
オリゴヌクレオチドと、を含むことを特徴とする。
別の実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチド捕捉システムが、(a)制限エンドヌ
クレアーゼニッキング部位を含む第1の一本鎖オリゴヌクレオチド、単一ヌクレオシド三
リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位、及びフルオロフォアを消光させるよ
うに、それぞれ少なくとも1つのフルオロフォア及び少なくとも1つの消光剤を有するニッ
キング部位のいずれかの側に並置されたオリゴヌクレオチド領域と、(b)捕捉部位のいず
れかの側の第1のオリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる
第2及び第3の一本鎖オリゴヌクレオチドと、を含むことを特徴とする。
別の実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチド捕捉システムが、(a)エキソヌクレ
アーゼ遮断部位、遮断部位の5'側に位置し単一ヌクレオシド三リン酸を捕捉するための単
一ヌクレオチド捕捉部位を含む制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びフルオロフォアを
消光させるように配置された認識部位の5'側に位置する少なくとも1つのフルオロフォア
領域を含む、第1の一本鎖オリゴヌクレオチドと、(b)第1のオリゴヌクレオチドからそれ
ぞれ分離し、捕捉部位の3'及び5'側に隣接する、第1のオリゴヌクレオチド上の相補的領
域にハイブリダイズすることができる、第2及び任意選択で第3の一本鎖オリゴヌクレオチ
ド、を含み、又は、(a)エキソヌクレアーゼ遮断部位、遮断部位の3'側に位置し単一ヌク
レオシド三リン酸を捕捉するための単一ヌクレオチド捕捉部位を含む制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位、及びフルオロフォアを消光させるように配置された認識部位の3'側に位置
する少なくとも1つのフルオロフォア領域を含む、第1の一本鎖オリゴヌクレオチドと、(b
)第1のオリゴヌクレオチドからそれぞれ分離し、捕捉部位の3'及び5'側に隣接する、第1
のオリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる、第2及び任意
選択で第3の一本鎖オリゴヌクレオチド、を含むことを特徴とする。
さらに別の実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチド捕捉システムが、(i)(a)二本
鎖領域及び一本鎖領域を含む第1のオリゴヌクレオチドと、(b)核酸塩基配列が第1のオリ
ゴヌクレオチドの一本鎖領域の核酸塩基配列と少なくとも部分的に相補的である第2の一
本鎖オリゴヌクレオチドと、を含む2つの成分を包含し、又は、(ii)末端が2つの異なる二
本鎖オリゴヌクレオチド領域に付着している一本鎖ヌクレオチド領域を含む単一のオリゴ
ヌクレオチドを包含し、オリゴヌクレオチド捕捉システムが検出不能な状態でフルオロフ
ォアによって標識されていることを特徴とする。
さらに別の実施形態では、本方法は、オリゴヌクレオチド捕捉システムが、一本鎖ヌク
レオチド領域を含み、その端部は二本鎖オリゴヌクレオチド領域に付着し、ここで、オリ
ゴヌクレオチド領域の少なくとも1つは検出不能な状態のフルオロフォアを含むことを特
徴とする。
マイクロ流体チップの平面図である。 種々の微小液滴がどのように操作されるかを示す微小液滴操作区域の部分断面図である。 典型的な微小液滴の上面図を示す。
次に、DNA分析物を配列決定するのに適した本発明の方法を、本発明の好ましい第３態
様に従って、以下の図および関連する説明によって説明する。
図1はマイクロ流体チップの平面図を示し、当該マイクロ流体チップは透明プラスチッ
ク製の単一チップに一体化された微小液滴調製区域1と微小液滴操作区域3とを含む。１は
、入口4、5、および6に取り付けられた流体7、8、及び9を包含する領域を含み、入口4、5
、および6は、それぞれ、加ピロリン酸分解流、無機ピロホスファターゼ流、及び出願人
らの以前の出願の1つに従ってヌクレオシド三リン酸を同定するために必要とされる種々
の検出化学物質および酵素の流れをチップに導入する。次いで、これらの流れは、それぞ
れオリフィス7a、8a及び9aに送達され、そこから種々の微小液滴7b、8b及び9bが生成され
る(例えば、液滴ディスペンシングヘッドを使用して、またはより大きな中間液滴から切
断することによって)。10は、常磁性ポリマー複合体マイクロビーズ11を含むリザーバで
あり、常磁性ポリマー複合体マイクロビーズ11の一部又は全部に配列決定されるべきポリ
ヌクレオチド分析物の単一分子が付着される。11の各々は、微小液滴でエレクトロウェッ
ティング経路12に沿って位置7cに輸送され、そこで磁気によって保持され、7bの流れと接
触される。この箇所において、11に付着した分析物は、各7bが11から離脱した後、それが
空であるか、または1つのヌクレオシド三リン酸分子のみを含むような速度で、漸進的に
加ピロリン酸分解される。離脱後、微小液滴8b及び9bとともに7bは、図2に示された機構
によって、30～40℃の温度で、様々な光学的に媒介されるエレクトロウェッティング経路
（ここでは正方形状エレクトロウェッティング箇所25によって定められる)に沿って操作
される3に移動させられる。このプロセスでは、7b及び8bが第１合流点12で合流して中間
微小液滴13を生成させ、その後、第2合流点14で9bと合流して、60～75℃の温度で維持さ
れるインキュベート領域16を通って前方に移動する複数の最終微小液滴15の流れを生成し
、内容物をインキュベートし、必要な化学反応および酵素反応を起こさせる。その後、15
は、検出ゾーン2内の最終位置に輸送され、そこで、LED源からの光及び光検出器を用いて
検出される各微小液滴によって放出される任意の蛍光で問い合わせられる。光検出器の出
力は、既知の配列決定アルゴリズムを用いて分析することができる分析物の配列に対応す
るデータストリームである。
図2は、種々の微小液滴がどのように操作されるかを示す3の部分断面図を表す。３は、
各々が厚さ130nmの導電性酸化インジウムスズ(ITO)18a及び18b の透明層で被覆された厚
さ500μmの頂部及び底部ガラスプレート又は透明プラスチックプレート(17a及び17b)を含
む。18a及び18b の各々はAC源19に接続され、18b上の酸化インジウムスズ層は接地されて
いる。18bは厚さ800nmのアモルファスシリコン層20で被覆されている。18a及び20は、そ
れぞれ、高純度アルミナ又はハフニア21a及び21b の厚さ160nmの層でコーティングされ、
これらは次に、ポリ(3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート)22単層でコーティ
ングされて、これら表面を疎水性にする。21a及び21bはスペーサー(図示せず)を使用して
3μm離間され、その結果、微小液滴はこの空間に導入されたときにある程度の圧縮を受け
る。発光ダイオード光源23によって照明された反射性の画素化されたスクリーンの画像は
、一般に17bの下に配置され、0.01Wcm2の水準の可視光(波長660又は830nm)がそれぞれの
ダイオード24から放射され、17b及び18bを通る多数の上方向の矢印の方向に伝播すること
によって20に衝突させられる。種々の衝突点において、光励起された電荷領域26が20内に
生成され、これは、対応するエレクトロウェッティング箇所25において、21b内に変更さ
れた液体-固体接触角度を誘起する。これらの変更された特性は、微小液滴をある点25か
ら別の点へと推進するために必要な毛管力を提供する。23は、あらかじめプログラムされ
たアルゴリズムを用いて、26のアレイのどれが任意の時点で照明されるかを決定するマイ
クロプロセッサ（図示せず）によって制御される。この手段により、種々の微小液滴を、
図1に示す種々の経路に沿って同期した方法で移動させることができる。
図3は、接触の程度を画定する点線輪郭7’を有するとともに、21b上の位置25に位置す
る典型的な微小液滴(ここでは7b)の上面図を示す。この例では、26が7bの移動方向に三日
月形状である。

Claims (23)

  1. （ａ）微小液滴及び固形担体を結合させる条件下で、前記微小液滴を固形担体に接触させ
    るステップと、
    （ｂ）反応媒体を、標的分子と反応させるステップと、
    （ｃ）その後、前記反応媒体に、前記固形担体から分離させ、キャリア流体で微小液滴を
    再び作る力を加えるステップと、
    を含む、不混和性キャリア媒体の反応媒体の微小液滴を、固形担体に拘束される標的分子
    とともに、化学的変換をもたらすために操作する方法。
  2. 前記反応媒体が核酸分析物を変換する媒体であり、前記標的分子がポリヌクレオチドを
    含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. ヌクレオチドが、分析物から放出され、微小液滴の前記固形担体の付近から運び去られ
    ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. それぞれヌクレオチドを運び去ることができる複数微小液滴を、前記分析物に順次接触
    させることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記化学的変換を用いて核酸分析物の配列を決定し、
    前記方法は、
    消化媒体を不混和性キャリア媒体に含む前記反応媒体の微小液滴の流れを、粒子を１
    つずつ経路に含む前記固形担体に拘束される、核酸分析物を含む前記標的分子に接触させ
    ることによって、前記核酸分析物を前記分析物の構成ヌクレオチドへ漸進的に消化させる
    ステップと、
    少なくとも一部は単一のヌクレオチドを包含する前記微小液滴を、前記核酸分析物の
    周りから除去するステップと、
    前記微小液滴を、前記経路に沿って検出区域まで更に送達するステップと、
    前記検出区域で前記微小液滴内の前記ヌクレオチドを同定し、前記ヌクレオチドから
    前記分析物の分子の配列を推測するステップと、
    を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 前記消化媒体は、ポリメラーゼと、前記ポリメラーゼに前記核酸分析物の分子からヌク
    レオチドを１つずつ放出させるコファクターとを含むことを特徴とする、請求項５に記載
    の方法。
  7. 前記コファクターは、ポリリン酸の陰イオン、又はポリリン酸の陰イオンの類似体であ
    ることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ポリリン酸がピロリン酸であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 前記消化媒体が、エキソヌクレアーゼを含み、結果として放出されるヌクレオチド一リ
    ン酸をキナーゼで更に処理して、前記ヌクレオチド一リン酸をヌクレオチド三リン酸に変
    えることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  10. 結果として生じる前記ヌクレオチドを、ポリメラーゼの存在下で蛍光プローブからなる
    オリゴヌクレオチド捕捉システムと反応させ、フルオロフォアを検出可能な状態で放出し
    、
    前記蛍光プローブは、不使用状態で蛍光を発さず前記核酸分析物に特徴的な前記ヌクレ
    オチドの種類の少なくとも１つに対して選択的であり、
    結果として生じ、各微小液滴で放出される前記フルオロフォアに由来する蛍光は、第1
    電磁放射入射源及び光検出器を用いて検出されることを特徴とする、請求項５～９の何れ
    か一項に記載の方法。
  11. フルオロフォアの放出は、エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ並びに任
    意にリガーゼの作用の結果であり、そのような作用が、検出される前記ヌクレオチドの捕
    捉によって触媒されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記オリゴヌクレオチド捕捉システムが、液滴合体又は直接注入によって前記粒子の下
    流の前記微小液滴に導入されることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記オリゴヌクレオチド捕捉システムによる反応の前に、前記消化媒体がピロホスファ
    ターゼでさらに処理されることを特徴とする、請求項１０～１２の何れか一項に記載の方
    法。
  14. 化学的に修飾される表面をわたって前記微小液滴を移動させて、濡れ性のレベルが局所
    的に向上する範囲を有し、前記濡れ性のかかる向上を用いて前記標的分子周りにおける微
    小液滴流体の濡れを媒介することを特徴とする、請求項５～１３の何れか一項に記載の方
    法。
  15. エレクトロウェッティング又は光学的に媒介されるエレクトロウェッティング効果を用
    いて、前記粒子周りの表面の領域の濡れ性を局所的に変更することを特徴とする、請求項
    ５～１４の何れか一項に記載の方法。
  16. 第３ステップにおいて、エレクトロウェッティング又は光学的に媒介されるエレクトロ
    ウェッティングを用いて、前記微小液滴を送達することを特徴とする、請求項５～１５の
    何れか一項に記載の方法。
  17. 前記経路の少なくとも一部が、光学的に媒介されるエレクトロウェッティングマイクロ
    流体空間であり、前記エレクトロウェッティングマイクロ流体空間は、
    第１複合壁であり、
    第１透明基板、
    前記第１透明基板上の、７０～２５０ｎｍの厚さを有する第１透明導体層、
    前記第１透明導体層上の、３００～１０００ｎｍの厚さを有し、４００～１０００ｎ
    ｍの波長範囲の電磁照射によって活性化される光活性層、及び
    前記第１透明導体層上の、１２０～１６０ｎｍの厚さを有する第１誘電体層
    を含む第１複合壁と、
    第２複合壁であり、
    第２基板、
    前記第２基板上の、７０～２５０ｎｍの厚さを有する第２透明導体層、及び
    任意に、前記第２透明導体層上の、２５～５０ｎｍの厚さを有する第２誘電体層
    を含む第２複合壁と、
    によって構成され又は画定され、
    前記第１誘電体層及び第２誘電体層の露出面は、５０μｍ未満の間隔で配置されること
    を特徴とする、請求項５～１６の何れか一項に記載の方法。
  18. （ａ）前記第１複合壁及び第２複合壁にわたって、前記第１透明導体層及び第２透明導体
    層を接続する電位差を供給する交流電源と、
    （ｂ）前記光活性層に衝突させて、前記第１誘電体層の表面上の対応する第１一過性エレ
    クトロウェッティング箇所を誘起するように適合される光励起層のバンドギャップより高
    いエネルギを有する少なくとも１つの第2電磁放射源と、
    によって、マイクロ流体空間が活性化されて前記微小液滴を送達することを特徴とする、
    請求項１７に記載の方法。
  19. 第1電磁放射源と、第2電磁放射源とが同一である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記粒子を、微小液滴においてエレクトロウェッティング又は光学的に媒介されるエレ
    クトロウェッティング又は磁気のいずれかを用いて、消化が起きる箇所へ送達する初期ス
    テップを更に備えることを特徴とする、請求項５～１９の何れか一項に記載の方法。
  21. 前記粒子が、微小液滴の前記流れが前記粒子と接触する所望の箇所で、磁気的に保持さ
    れることを特徴とする、請求項５～２０の何れか一項に記載の方法。
  22. 前記微小液滴を少なくとも１つの毛細管の入口に導入し、前記微小液滴が出口から現れ
    るときに第１電磁放射を前記微小液滴に衝突させるステップによって、蛍光が検出される
    ことを特徴とする、請求項１０～２１の何れか一項に記載の方法。
  23. キャリア媒体に懸濁されるとともに、加ピロリン酸分解酵素を包含する水性微小液滴の
    流れにおいて、各微小液滴を順に、分析物が付着する粒子に接触させ、各微小液滴を前記
    粒子の周りから除去する前に、前記酵素に前記分析物からヌクレオシド三リン酸分子を前
    記微小液滴の少なくとも一部に放出させるステップを含む、核酸分析物を加ピロリン酸分
    解する方法。
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LAB ON CHIP, vol. 11, JPN6023023796, 2011, pages 1292 - 1297, ISSN: 0005082960 *

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