KR20200019717A - 핵산과 같은 분자를 분석하는 방법 - Google Patents

핵산과 같은 분자를 분석하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200019717A
KR20200019717A KR1020207001605A KR20207001605A KR20200019717A KR 20200019717 A KR20200019717 A KR 20200019717A KR 1020207001605 A KR1020207001605 A KR 1020207001605A KR 20207001605 A KR20207001605 A KR 20207001605A KR 20200019717 A KR20200019717 A KR 20200019717A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
microdroplets
analyte
electrowetting
particles
solid support
Prior art date
Application number
KR1020207001605A
Other languages
English (en)
Inventor
토마스 헨리 아이삭
페드로 쿤하
카메론 알렉산더 프레이링
Original Assignee
베이스4 이노베이션 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베이스4 이노베이션 엘티디 filed Critical 베이스4 이노베이션 엘티디
Publication of KR20200019717A publication Critical patent/KR20200019717A/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B01L3/502792—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics for moving individual droplets on a plate, e.g. by locally altering surface tension
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/089—Virtual walls for guiding liquids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B01L2300/165—Specific details about hydrophobic, oleophobic surfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/168—Specific optical properties, e.g. reflective coatings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0427—Electrowetting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

화학적 변형에 따른 효과를 목적으로 표적 분자가 고체 지지체에 결합된 비혼화성 담체 매질 내에서 반응 매질의 마이크로 액적을 조작하는 방법이 제공된다. 이는 (a) 마이크로 액적과 고체 지지체가 결합되는 조건 하에서 마이크로 액적과 고체 지지체를 접촉시키는 단계; (b) 반응 매질이 표적 분자와 반응하도록 허용하는 단계 및 (c) 그 후 반응 매질이 고체 지지체로부터 분리되어 담체 내의 마이크로 액적으로 개질(reform)되도록 힘을 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 일 실시예에서, 고체 지지체는 입자, 비드 또는 유사한 것이다.

Description

핵산과 같은 분자를 분석하는 방법
본 발명은 그 중에서도 핵산 분자를 조사하는 방법; 특히 천연 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 시퀀싱하는 방법에 관한 것이다.
이 부분에 기술된 내용은 단순히 본 실시예에 대한 배경 정보를 제공할 뿐 종래기술을 구성하는 것은 아니다.
본 발명자들의 이전 출원 WO2014/053853, WO2014/053854, WO2014/167323, WO2014/167324 및 WO2014/111723에서, 본 발명자들은 단일 뉴클레오티드 (nucleotides)의 순서화(ordered) 된 스트림(stream), 바람직하게는 단일 뉴클레오티드 트리포스페이트(triphosphates)의 스트림이며 이들 각각은 마이크로 액적 스트림 내의 상응하는 마이크로 액적에 하나씩 포획될 수 있는 스트림을 생성하기 위해 폴리 뉴클레이티드 분석물(analyte)을 점진적으로 분해(digest)하는 것을 포함하는 새로운 시퀀싱(sequencing) 방법을 기술했다. 그 후(스트림 생성 후), 각각의 액적은 화학적으로 및/또는 효소적(enzymatically)으로 조작되어 그것이 원래 함유한 특정 단일 뉴클레오티드를 드러낼 수 있다. 일 실시예에서, 이들 화학적 및/또는 효소적 조작은 분석물을 구성하는 단일 뉴클레오티드 유형 중 하나를 선택적으로 포획할 수 있도록 조정된 하나 이상의 2-성분 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브(probe) 형태의 사용을 포함하는 방법을 포함한다. 전형적으로, 각각의 이러한 프로브 형태에서, 올리고뉴클레오티드 성분들 중 하나는 특징적인 형광단(fluophores)을 포함하고, 프로브의 미사용 상태에서 프로브에 근접한 소광자(quenchers)의 존재에 의해 또는 자가-소광(self-quenching)에 의해 이들 형광단의 형광 능력은 꺼진 상태로 유지된다. 사용시에는, 프로브가 상응하는 단일 뉴클레오티드를 포획했을 때, 프로브는 후속 외부핵산분해(exonucleolysis) 또는 내부핵산분해(endonucleolysis)에 민감하게 됨으로써 소광자로부터 형광단 및/또는 형광단 각각을 유리(liberating)시켜 자유롭게 형광을 낼 수 있게 한다. 이와 같은 방법으로 각각의 액적에 존재하는 원래의 단일 뉴클레오티드는 분광 수단에 의해 간접적으로 추론될 수 있다.
이 방법을 사용하여 시퀀싱 장치를 설계할 때는, 예를 들어 수천 개의 마이크로 액적을 조작하여 다른 것들과 합쳐질 수 있는 위치 및/또는 형광의 존재 또는 부재에 의해 내용물을 분석할 수 있는 위치로 안정적으로 전달할 수 있어야 한다.
이를 수행하는 한 가지 가능한 방법은 기판 상에 마이크로 액적이 전기 습윤 힘에 의해 추진될 수 있는 경로를 확립하는 것이다. 비교적 큰 액적을 조작하기 위한 장치는 종래 기술로서 예를 들어 US6565727, US20130233425 및 US20150027889에 기술되었다. 일반적으로, 예를 들어 비혼화성 담체 유체의 존재 하에서 액적이 카트리지의 대향하는 두 벽 또는 마이크로 유동 튜브에 의해 형성된 마이크로 유동 채널을 통해 이동하게 함으로써 달성된다. 카트리지 또는 튜브의 벽에는 유전체 층으로 피복된 전극이 있으며, 이들 각각은 층의 전기 습윤 전계 특성을 수정하기 위해 간격을 가지며 빠르게 온/오프 될 수 있는 A/C 바이어싱(biasing) 회로에 연결된다. 이는 주어진 경로를 따라 액적을 조종하는데 사용될 수 있는 국부적이고 방향성을 가지는 모세관 힘을 발생시킨다.
이러한 접근법의 변형으로서 광학-매개 전기 습윤에 기초한 방법이 예를 들어 US20030224528, US20150298125 및 US20160158748에 개시되어 있다. 특히, 이들 3개 특허출원 중 첫번째는 제1 및 제2벽에 의해 정의되는 마이크로 유동 공동을 포함하고, 제1벽은 복합 구조이며 기판, 광전도체층 및 절연(유전체)층으로 구성되는, 다양한 마이크로 유체 장치를 개시한다. 광전도체층과 절연층 사이에는 서로 전기적으로 격리되고, 광활성층에 연결되며, 절연층 상에 대응하는 개별적인 액적 수용 위치를 생성하도록 기능하는 전도성 셀 어레이가 배치된다. 이들 위치에서, 액적의 표면 장력 특성은 전기 습윤 전계에 의해 변경될 수 있다. 이어서, 전도성 셀은 광전도체층 상에 충돌하는 광에 의해 스위칭 될 수 있다. 이 접근법은 그 유용성이 전극의 배열에 의해 여전히 어느 정도 제한되어 있지만, 스위칭이 훨씬 쉽고 빠르다는 장점이 있다. 또한, 액적의 이동 속도 및 실제 액적 경로가 변경될 수 있는 정도에 대한 제한이 있다.
이러한 후자의 이중벽 실시예는 캘리포니아 버클리 대학의 Pei의 학위논문 UCB/EECS-2015-119에 소개되었다. 여기에서, 패턴화 되지 않은 전기 바이어스 된 비정질 실리콘 상에 광 패턴을 이용하여 유전체층 상에 증착된 테프론 AF의 표면에 걸쳐 광학 매개 전기 습윤을 사용함으로써 100 내지 500 μm 크기의 비교적 큰 액적을 조작할 수 있는 셀이 기술되어 있다. 그러나, 예시된 방식에서 유전체층은 얇고(100 nm), 광활성층을 갖는 벽 상에만 배치된다.
Microfluid Nanofluid (2016) 20: 123은 소수성 마이크로 채널의 친수성 패치에서 전극 보조 트랩 및 액적의 방출을 개시한다.
최근에 출원한 유럽 특허 출원 17180391.9에서, 본 발명자들은 빠르고 신뢰할 수 있는 단일 뉴클레오티드 검출 방법의 요구 사항에 따라 수천 개의 마이크로 액적을 동시에 조작할 수 있는 핵산 조사 장치를 기술하였다. 이는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 쉽게 재구성될 수 있어, 예를 들어, 사용자가 최적의 정확도, 처리량 또는 특정 후성 유전적(epigenetic) 변형을 탐지하도록 용이하게 적응시킬 수 있고, 따라서 매우 가변성이 높다. 본 발명자들은 또한 상응하는 조사 방법을 개발하였으며, 이의 특징은 입자-지지된 분석물이 상류(별도의 장소를 포함하되 이에 제한되지 않음; 예를 들어 분해(digestion)가 일어나는 칩(chip)의 상류)에서 생성된 소화 매질을 포함하는 수성 마이크로 액적의 스트림의 성분들과 비혼화성 담체 매질에서 직접 상호작용함으로써 초기 분석물 분해 단계가 수행된다는 것이다. 이와 같은 방법으로, 분해 단계가 '입자 상(on-particle)' 및 '액적 내(in-droplet)'에서 수행될 수 있으므로, 이 분해 단계의 정확성과 신뢰성이 크게 향상된다.
이와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산과 같은 분자를 분석하는 방법은, 화학적 변형에 따른 효과를 목적으로 표적 분자가 고체 지지체에 결합된 비혼화성 담체 매질 내에서 반응 매질의 마이크로 액적을 조작하는 방법으로서, (a) 마이크로 액적과 고체 지지체가 결합되는 조건 하에서 마이크로 액적과 고체 지지체를 접촉시키는 단계; (b) 반응 매질이 표적 분자와 반응하도록 허용하는 단계; 및 (c) 그 후 반응 매질이 고체 지지체로부터 분리되어 담체 내의 마이크로 액적으로 개질(reform)되도록 힘을 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
도 1은 투명한 플라스틱으로 제조된 단일 칩에 통합된 마이크로 액적 제조 영역(1) 및 마이크로 액적 조작 영역(3)을 포함하는 마이크로 유동 칩의 평면도를 나타낸다.
도 2는 다양한 마이크로 액적이 조작되는 방법을 도시한 (3)의 부분 단면도를 나타낸다.
도 3은 (21b) 상의 위치(25)에 위치한 접촉 정도를 한정하는 점선 윤곽선(7')을 갖는 전형적인 마이크로 액적(여기서 7b)을 위에서 내려다본 평면도를 도시한다.
이하, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
또한, 본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 '포함', '구비'한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 '…부', '모듈' 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어나 소프트웨어 또는 하드웨어 및 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.
가장 넓은 범위에서, 이 방법이 광범위하게 적용 가능하다는 것을 인식하여, 본 발명의 제1양태에 따르면, 다음의 단계를 특징으로 하는 화학적 변형이 작용하도록 표적 분자가 고체 지지체에 결합된 비혼화성 담체 매질 내에서 반응 매질의 마이크로 액적을 조작하는 방법이 제공된다. (a) 마이크로 액적과 고체 지지체가 결합되는 조건 하에서 마이크로 액적과 고체 지지체를 접촉시키는 단계; (b) 반응 매질이 표적 분자와 반응하도록 허용하는 단계 및 (c) 그 후 반응 매질이 고체 지지체로부터 분리되어 담체 내의 마이크로 액적으로 개질(reform)되도록 힘을 가하는 단계.
이 방법의 하나의 버전에서, 입자를 포함하는 고체 지지체 상의 주어진 위치에 고정된 표적 분자의 화학적 변형을 수행하는 다음의 단계를 특징으로 하는 방법이 제공된다. (a) 수행할 화학적 변형을 야기할 수 있는 매질을 각각 포함하는 마이크로 액적의 스트림을 생성하는 단계; (b) 각각의 마이크로 액적을 화학적 변형이 일어날 수 있는 조건 하에서 주어진 위치에서 주어진 기간 동안 표적 분자와 차례로 접촉시키는 단계 및 (c) 주어진 기간의 끝에서 주어진 위치로부터 마이크로 액적을 제거하는 단계.
적합하게는, 이들 방법은 개질된 마이크로 액적을 고체 지지체의 근처로부터 운반해 내는 단계를 더 포함한다. 바람직하게는, 가해지는 힘은 고체 지지체의 위치를 포함하는 경로 상의 다양한 지점 또는 영역에 가해지는 전기 습윤 힘이다. 이 전기 습윤 힘은 전기적으로 또는 광학적으로 생성될 수 있다.
일 실시예에서, 사용되는 반응 매질은 핵산 분석물을 형질 전환하기 위한 것이고 표적 분자는 폴리뉴클레오티드이다; 예를 들어, 프라이머/템플릿(primer/template)로서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 사용하는 핵산(즉, RNA 또는 DNA)의 합성. 이러한 실시예에서, 고체 지지체에 적용되는 마이크로 액적은 뉴클레오티드 단량체의 공급원, 하나 이상의 폴리머라제(polymerase) 및 당업계에 통상적으로 요구되는 다른 성분을 포함할 것이다.
다른 실시예에서, 이 방법은 핵산(즉, RNA 또는 DNA) 또는 단백질과 같은 바이오폴리머의 분자 구조를 조사하는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 제2양태에 따르면, 다음의 단계를 특징으로 하는 바이오폴리머를 포함하는 표적 분자를 조사하는 방법이 제공된다.
* 비혼화성 담체 매질 내의 분해(digestion) 매질의 마이크로 액적의 스트림이 경로에서 바이오폴리머와 하나씩 접촉하게 하여, 바이오폴리머가 마이크로 액적 내에서 그 구성 단일 모노머 유닛으로 점진적으로 분해되도록 하는 단계;
* 바이오폴리머 주위로부터 마이크로 액적을 제거하는 단계로서, 마이크로 액적 중 적어도 일부는 단일 모노머 유닛을 함유하는 단계;
* 경로를 따라 마이크로 액적을 검출 영역으로 더 운반하는 단계 및
* 검출 영역에서 마이크로 액적의 모노머 유닛을 식별하고 그로부터 화학 구조를 유추하는 단계.
제1양태 및 제2양태의 일 실시예에서, 표적 분자/바이오 폴리머는 핵산 분석물이고 분해 매질은 폴리뉴클레오티드를 형질 전환시킬 수 있는 것이다. 예를 들어, 폴리머라제 및 바람직하게는 폴리포스페이트 음이온(polyphosphate anion) 또는 그의 유사체인 보조인자(cofactor)를 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는 폴리포스페이트는 피로인산염(pyrophosphate)이며, 뉴클레오티드 트리포스페이트의 생성을 야기한다. 다른 실시예에서, 분해 매질은 분석물을 뉴클레오티드 모노포스페이트로 분해시키는 핵산말단분해효소(exonuclease)를 포함한다. 이어서, 이들 뉴클레오티드 모노포스페이트는 키나아제(kinase)의 작용에 의해 상응하는 뉴클레오티드 트리포스페이트로 전환될 수 있다. 뉴클레오티드 모노-또는 트리포스페이트의 확인은 각각과 관련된 핵 염기를 식별하는 단계를 포함한다; 예를 들어, 핵 염기-선택적 올리고뉴클레오티드 포획 프로브, 형광 표지의 적용에 의해 또는 직접적으로, 예를 들어 표면 또는 플라즈몬 현상에 의해 강화된 핵 염기의 특징적인 라만-산란을 검출함으로써. 일 실시예에서, 이러한 식별 단계는 입사 전자기장 방사 소스(예컨대 레이저 또는 LED)를 사용하는 검출 영역 및 핵 염기로부터 발생하는 방사를 검출하기위한 광 검출기의 사용을 적절하게 포함할 것이다.
다른 실시예에서, 아래에 보다 상세히 설명될 바와 같이, 본 발명의 제2양태의 방법은 결과적인 뉴클레오티드가 폴리머라제 존재 하에 형광 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템과 반응하는 것을 특징으로 한다. 여기서 형광 프로브는 미사용 상태에서 비형광성이고, 분석물의 특징적인 뉴클레오티드 유형 중 하나 이상에 대해 선택적이어서, 형광단의 방출에 의해 검출 가능한 상태가 되되, 각각의 마이크로 액적에서 방출된 형광단으로부터 나오는 결과적인 형광은 입사(incident) 제1전자기장 방사 소스 및 검출기를 사용하여 검출된다. 적합하게는, 이러한 형광단의 방출은 핵산말단분해효소 및/또는 핵속핵산분해효소(endonuclease) 및 선택적으로 리가제(ligase)의 작용의 결과이며, 이러한 작용은 검출되는 뉴클레오티드의 포획에 의해 촉진(catalysed)된다. 일 실시예에서, 올리고뉴클레오티드 포획 시스템은 마이크로 액적 응집 또는 직접 주입을 통해 분석물 분해 영역의 하류에 도입된다. 이러한 경우에, 분해 매질은 올리고뉴클레오티드 포획 시스템과의 반응 전에 파이로포스파테이스(pyrophosphatase)로 처리되는 것이 바람직하다.
이들 실시예의 하나의 바람직한 버전에서, 바이오 폴리머는 핵산이고; 모노머는 점진적인 가(加)파이로인산분해 및 사용된 올리고뉴클레오티드 프로브의 외부핵산분해에 의해 생성된 형광의 검출을 포함하는 식별 단계에 의해 생성된 뉴클레오시드 트리포스페이트이며, 프로브는 그것의 미사용 상태에서 비형광성이며 주어진 핵 염기에 대해 선택적이다. 따라서, 본 발명의 제3양태에 따르면, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분석물 조사 방법이 제공된다:
* 비혼화성 담체 매질 내의 수성 가(加)파이로인산분해 매질의 마이크로 액적 스트림과 경로 내의 분석물을 접촉시키는 단계로서, 이에 의해 분석물이 그의 구성 단일 뉴클레오사이드 트리포스페이트로 점진적으로 바뀌도록 하는 단계;
* 분석물 주위로부터 담체 매질 내의 마이크로 액적을 제거하는 단계로서, 마이크로 액적 중 적어도 일부는 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 하나를 함유하는 단계;
* 경로를 따라 마이크로 액적을 더 이동시키는 단계;
* 경로 상의 또는 가(加)파이로인산분해의 상류의 하나 이상의 지점에서 각각의 마이크로 액적에 검출 성분을 도입하는 단계로서, (a) 올리고뉴클레오티드 포획 시스템, (b) 폴리머라제, (c) 선택적으로 리가제 및 (d) 형광 상태에서 형광단(들)을 사용된 포획 시스템으로부터 방출시킬 수 있는 핵산말단분해효소 및/또는 핵속핵산분해효소를 포함하는 단계;
* 입사 제1전자기장 방사 소스 및 광 검출기를 사용하여 위치(들) 및 가(加)파이로인산분해의 하류 지점에서의 각각의 마이크로 액적 내에서 방출되는 형광단(들)으로부터 나오는 형광을 검출하는 단계.
본 발명의 이들 제2 또는 제3양태의 방법은 원칙적으로 무제한일 수 있는 뉴클레오티드 사슬 길이를 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분석물을 시퀀싱하는데 특히 적합하다; 예를 들어 게놈(genome)의 단편에서 발견되는 수백만 개의 뉴클레오티드 염기쌍을 포함하는 것일 수 있다. 일 실시예에서, 분석물은 따라서 적어도 50개, 바람직하게는 150개 이상의 뉴클레오티드 염기쌍 길이일 것이다; 적합하게는 500 개 초과, 1000개 초과, 일부 경우에는 5000 개가 넘는 뉴클레오티드 염기쌍 길이일 것이다. 일 실시예에서, 분석물은 천연 기원의 DNA(예를 들어, 식물, 동물, 박테리아 또는 바이러스로부터 유래된 유전 물질)이지만, 이 방법은 부분적으로 또는 전체적으로 합성된 DNA 또는 자연에서 일반적으로 접할 수 없는 뉴클레오티드 염기로 구성된 뉴클레오티드로 전체 또는 일부가 구성된 전적으로 다른 핵산, 즉, 아데닌(adenine), 티민(thymine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine) 및 우라실(uracil) 이외의 핵 염기를 갖는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 핵 염기의 예에는 4-아세틸시티딘(4-acetylcytidine), 5-(카르복시히드록실메틸(carboxyhydroxylmethyl))우리딘(uridine), 2-O- 메틸시티딘(methylcytidine), 5-카르복시메틸아미노메틸(carboxymethylaminomethyl)-2-티오우리딘(thiouridine), 5-카르복시메틸아미노-메틸우리딘(carboxymethylamino-methyluridine), 디히드로우리딘(dihydrouridine), 2-O- 메틸슈도우리딘(methylpseudouridine), 2-O- 메틸구아노신(methylguanosine), 이노신(inosine), N6-이소펜틸라데노신(isopentyladenosine), 1-메틸아데노신(methyladenosine), 1-메틸슈도우리딘(methylpseudouridine), 1-메틸구아노신(methylguanosine), 1-메틸이노신(methylinosine), 2,2-디메틸구아노신(dimethylguanosine), 2-메틸아데노신(methyladenosine), 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신(methyladenosine), 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘(methylaminomethyluridine), 5-메톡시아미노메틸(methoxyaminomethyl)-2-티오우리딘(thiouridine), 5-메톡시우리딘(methoxyuridine), 5-메톡시카르보닐메틸(methoxycarbonylmethyl)-2-티오우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘(methoxycarbonylmethyluridine), 2-메틸티오(methylthio)-N6-이소펜테닐아데노신(isopentenyladenosine), 우리딘-5-옥시아세트산(oxyacetic acid)-메틸에스테르(methylester), 우리딘-5-옥시아세트산, 위부톡소신(wybutoxosine), 위부토신(wybutosine), 슈도우리딘(pseudouridine), 큐오신(queuosine), 2-티오시티딘(thiocytidine), 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, 2-O-메틸-5-메틸우리딘 및 2-O-메틸우리딘을 포함한다. 분석물이 RNA 인 경우 유사한 고려 사항이 적용된다.
본 발명의 제3양태의 바람직한 실시예로, 제1단계 및 경로 내의 가(加)파이로인산분해 영역에서, 분석물은 점진적으로 가(加)파이로인산분해되어 3'-5' 방향으로 단일 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 스트림을 생성하며, 이의 순서는 분석물의 시퀀스 순서와 일치한다. 가(加)파이로인산분해 자체는 폴리머라제(polymerase)와 같은 효소를 포함하는 수성 가(加)파이로인산분해 매질을 함유하는 마이크로 액적의 스트림의 존재 하에서 20 내지 90 ℃의 온도에서 수행된다. 일 실시예에서, 이 매질은 완충되고(buffered) 또한 가(加)파이로인산분해 반응(폴리머라제, 파이로인산 음이온(pyrophosphate anion), 마그네슘 양이온 등)을 유지하는데 필요한 다른 성분을 함유할 수도 있다. 다른 실시예에서, 아래에 더 기술된 뉴클레오티드 검출 성분 중 하나 이상을 더 함유한다. 또 다른 실시예에서, 이들 성분 중 일부 또는 전부가 이 방법의 실시에서 다양한 지점 중 다른 지점에 도입될 수 있다; 예를 들어, 마이크로 액적 인젝터를 이용한 직접 주입에 의해 또는 관련 물질을 함유하는 이차 마이크로 액적과 마이크로 액적의 결합에 의해. 적합하게는, 적용된 마이크로 액적은 미네랄 또는 실리콘 오일과 같은 비혼화성 담체 매질에 현탁된다.
바람직하게는, 장치는 가(加)파이로인산분해 속도가 가능한 한 빠르게 동작하도록 설계되고, 일 실시예에서 이 속도는 초당 1 내지 50개의 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 범위이다. 폴리 뉴클레오티드의 점진적인 분해에 적용되는 가(加)파이로인산분해 반응에 대한 추가 정보는 예를 들어 J. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 3019-3028에서 찾을 수 있다.
일 실시예에서, 분석물 분해는 스트림 내의 각각의 마이크로 액적을 차례로 분석물이 사전에 부착된 입자와 접촉시킴으로써 수행된다. 적합하게는, 이러한 입자는 분석물이 화학적 또는 물리적 수단에 의해 결합되는 하나 이상의 분석물-반응 부위를 포함하도록 사전에 변형되었을 것이다. 일 실시예에서, 이 입자는 비드; 예를 들어, 유리, 실리카, 알루미나, 금속 또는 비분해성 중합체와 같은 불활성 물질로 만들어진 마이크로 비드를 포함한다. 다른 실시예에서, 입자는 자기적으로 조작될 수 있게 하는 상자성(paramagnetic) 물질의 코어를 갖는다. 다른 실시예에서, 입자는 초기 마이크로 액적에 함유될 수 있고, 종래의 또는 광학 매개 전기 습윤에 의한 수단으로 그 분해 위치로 조작될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 자화, 전기 습윤, 흡입, 물리적 수축을 포함하는 하나 이상의 수단에 의해 또는 경로의 벽들에 화학적 또는 물리적으로 일시적으로 결합할 수 있는 2차 부착기(secondary attachement groups)에 의해 입자는 분해가 일어나는 주어진 위치에 위치유지 될 수 있다. 여기서 경로는 예를 들어 마이크로 유동 채널 또는 튜브이다.
이러한 2차 부착기 및 분석물 반응성 부위를 생성하는 방법에는 여러 가지가 있다. 예를 들어, 전자의 경우, 금속 증착, 플라즈마 증착 등과 같은 공지된 방법을 사용하여 입자를 금속으로 먼저 코팅함으로써 입자를 제조할 수 있다. 그 후, 금속 표면은 경로의 위치에 배치된 상보적인 제2부분(moieties)에 가역적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 제1부분을 도입하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일 실시예에서, 이들 쌍의 제1 및 제2부분은 그들 사이에 생성된 결합이 주변 온도 또는 주변 온도에 근접한 온도에서 가역적으로 생성되고 끊어질 수 있도록 선택된다. 이와 같은 방법으로, 입자는 분해 위치에 부착될 수 있고, 분석물이 분해된 후, 비드가 위치로부터 쉽게 분리되어 후자가 다른 새로운 비드를 수용할 수 있게 한다. 일 실시예에서, 제1 및 제2부분의 이들 쌍은 분해 조건 하에서, 즉 상보적 비오틴(biotin) 부분과 함께 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin) 부분을 사용함으로써 분해 조건에서 안정한 단백질 복합체의 형성을 초래할 수 있다. 다른 면에서, 이들 쌍은 불안정한 화학 결합을 생성할 수 있다; 예를 들어, 폴리히스티딘/킬레이트(polyhistidine/chelated) 금속 이온 쌍(낮은 pH에서 또는 이미다졸(imidazole) 또는 강한 금속 킬레이터(chelator)의 존재 하에서 결합이 끊어짐); 보론 산/적합한 탄수화물 쌍(낮은 pH에서 결합이 끊어짐) 또는 말레이미도/셀레놀(maleimido/selenol) 쌍(메타-클로로퍼옥시벤조산(chloroperoxybenzoic acid)을 사용하여 결합이 끊어짐). 이들 경우에, 입자는 그 위로 통과하는 마이크로 액적의 pH 또는 조성을 변형시킴으로써 후속적으로 분리될 수 있다.
바람직한 일 실시예에서, 전술한 한 쌍의 부분(moieties)은 복수의 히스티딘(histidine) 잔기(바람직하게는 6보다 큰)를 포함하는 폴리히스티딘 부분 및 예를 들어 코발트, 구리 또는 니켈과 같은 전이 금속의 이미노디아세테이트(IDA: iminodiacetate) 염 유도체 또는 니트로트리아세테이트(NTA: nitrotriacetate)로부터 선택되는 킬레이터 부분을 포함한다. 이들 제1 및 제2부분은 각각의 방식으로 입자 및 부착 부위에 배치될 수 있음을 이해할 것이다.
마찬가지로, 분석물-반응성 부위를 생성할 수 있는 여러 방법이 있다. 따라서, 일 실시예에서, 입자의 코팅되지 않은 표면은 예를 들어 실리카, 알루미나 또는 유리 비드의 경우에 에폭시실란(epoxysilane), 아미노하이드로카르빌실란(aminohydrocarbylsilane) 또는 머캅토실란(mercaptosilane)와 같은 기능성 작용제(agent)로 프라이밍(priming)되어 분석물이 부착될 수 있는 화학적으로 반응성인 부위를 생성할 수 있다. 그 후, 이들 반응성 부위는, 예를 들어 일 실시예에서는 아민(amine), 숙시닐(succinyl) 또는 티올(thiol) 기(group)와 같은, 말단 프라이머-반응성 기를 포함하도록 상응하게 변형된 분석물의 유도체로 처리될 수 있다. 다른 실시예에서, 화학적 부착은 어댑터 올리고뉴클레오티드(adaptor oligonucleotides)에 대한 결찰 또는 전술한 단백질 복합체의 유형을 통해 일어날 수 있다.
또 다른 실시예에서, 이렇게 프라이밍 된 입자는 단 하나의 분석물의 분자만이 부착될 수 있는 단 하나의 분석물-반응성 부위를 갖는 제2영역을 포함할 것이다. 이는 분석물이 작은 폴리뉴클레오티드 단편인 경우 중요할 수 있는데, 그렇지 않으면 준비 단계에서 다수의 분자가 부착되는 바람직하지 않은 경향이 있기 때문이다. 폴리뉴클레오티드 단편이 큰 경우에는 입체 효과(steric effects)가 그러한 결과가 완화되도록 작용할 것이 때문에 그러한 우려는 감소한다. 적합하게는, 입자는 0.5 내지 5 미크론(μm) 범위의 최대 직경을 가질 것이다.
일 실시예에서, 입자는 적합하게는 자기 코어(magnetic core)를 갖는 비드이고; 예를 들어 Dynabeads®라는 이름으로 판매되는 제품이다.
표적 분석물이 습윤하기 어렵거나 너무 작아 습윤하기 어려운 방식(예를 들어 소수성 비드 또는 매우 작은 비드에 고정된 분석물과 같은)으로 고정되는 이 방법의 일부 실시예에서, 분석물에 가까운 표면 벽의 젖음성을 수정하는 것이 바람직하다. 습윤성에 대한 이러한 변형은 PEG-실란(silane) 코팅과 같은 화학적 표면 코팅을 사용하여 달성될 수 있다. 다른 실시예에서, 습윤성에 대한 일시적인 수정은 전술한 전기 습윤 메커니즘 중 하나를 사용하여 유도될 수 있다. 표면 습윤성을 수정함으로써 사용자가 이러한 습윤성 처리를 받는 표면적을 정확하게 정의할 수 있기 때문에 이 방법의 신뢰성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 전방 액적 수송에 의해 표면으로부터 탈습윤되는(de-wetted) 유체의 정확한 체적 및 표면에 습윤된 나머지일 수 있는 유체의 체적을 제어하는 것이 더 쉬워진다. 이는 거친 표면을 갖는 분리된 비드와 같이 잘 정의되지 않은 표면적의 타겟으로는 달성하기 어려운 타겟 분석물과 액적 사이의 재현 가능한 부피 교환을 제공한다는 이점을 갖는다.
마이크로 액적이 현탁된 비혼화성 담체 매질 내의 액적화된 수성 매질 내에서 그 표면에 걸쳐 이동됨에 따라 표적 비드를 일시적으로 습윤하고 탈습윤하면서 분석물의 분해가 이루어진다는 것이 이 방법의 첫번째 단계의 특징이다. 이러한 수단에 의해, 뉴클레오티드 트리포스페이트 분자가 분석물 가닥으로부터 방출될 때, 마이크로 액적이 입자로부터 탈습윤되거나 부분적으로 탈습윤될 때 이는 캡슐화되어 하류에서 제거될 것이다. 일 실시예에서, 분해는 입자가 마이크로 액적과 일시적으로 접촉할 때 일어난다. 또 다른 실시예에서, 습윤/탈습윤 속도는 뉴클레오티드가 방출되는 것보다 평균적으로 더 많은 마이크로 액적이 입자를 통과하도록 조정된다. 다른 실시예에서, 입자의 부피는 마이크로 액적의 부피보다 작다; 예를 들어, 부피의 75 % 미만 또는 바람직하게는 50 % 미만. 또 다른 실시예에서, 입자는 마이크로 액적이 통과함에 따라 수성 쉘(shell)을 보유할 수 있다. 이 경우, 쉘 부피 대 마이크로 방울 부피의 비는 가능한 한 작은 것이 바람직하다. 예를 들어, 마이크로 액적 부피의 50 %가 입자 상에 남아 있으면, 이는 뉴클레오오드가 마이크로 액적과 함께 운반될 가능성이 50 %이고, 그것이 뒤에 남아 있을 가능성이 50 %이다.
분석물 상에서 수행되는 점진적인 화학적 변형이 분해 이외인 경우, 예를 들어, DNA의 합성 또는 나노 입자의 합성과 같은 경우, 이러한 마이크로 액적의 습윤/탈습윤 방법은 시퀀싱 이외의 응용을 가질 것임이 이해될 것이다. 이러한 변형의 가능성은 일 실시예에서 다수의 마이크로 액적 유형이 촉매, 프라이머 또는 다른 반응물을 함유하는 입자와 단계적으로 상호작용하도록 함으로써 더 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 특징으로 하는 주어진 위치에 고정된 표적 분자의 화학적 변화를 수행하는 일반적인 방법이 제공된다. (a) 화학적 변형이 일어나도록 하는 것이 가능한 매질을 포함하는 각각의 마이크로 액적의 스트림을 생성하는 단계; (b) 화학적 변형이 일어날 수 있는 조건 하에서 각각의 마이크로 액적을 표적 분자와 주어진 위치에서 주어진 기간 동안 차례로 접촉시키는 단계 및 (c) 주어진 기간의 끝에서 주어진 위치로부터 마이크로 액적을 제거하는 단계. 적합하게는, 마이크로 액적은 본 발명에 기재된 유형의 비혼화성 담체에 현탁되고(suspended), 주어진 위치는 전술한 것과 같은 입자이다.
주어진 마이크로 액적이 하나 이상의 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 분자를 함유하는 위험을 피하기 위해, 생성된 각각의 충전된 마이크로 액적 각각은 평균적으로 1 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개의 빈 마이크로 액적에 의해 구분되도록 입자와 분해를 통한 마이크로 액적의 흐름을 동기화시키는 것이 바람직하다. 적합하게는, 마이크로 액적의 유한 부피는 500 pL(picolitres) 미만, 바람직하게는 65 pL 미만, 보다 바람직하게는 4 pL 미만, 더욱더 바람직하게는 2 pL 미만이다. 가장 바람직하게는 모든 부피는 4 fL(femtolitres) 내지 4 pL 범위에 있는 것이다. 일 실시예에서, 장치를 통한 마이크로 액적의 유량은 초당 50 내지 1000 마이크로 액적, 바람직하게는 100 내지 500의 범위이다.
마이크로 액적은 입자 및 분석물 주위에서 제거된 후, 이들은 분석물의 뉴클레오티드 성분을 함유하는 정렬된 스트림을 생성한다. 이 마이크로 액적의 스트림은 예를 들어 마이크로 유동 채널 또는 튜브와 같은 마이크로 유동 공간을 포함할 수 있는 경로를 따라 추가로 운반된다. 적절하게는, 이러한 이동은 압력 구동 흐름을 사용하거나 전기 습윤 힘을 사용할 수 있다; 예를 들어, 통상적인 '유전체 상의 전기 습윤' (eWOD) 구성 또는 바람직하게는 광학 효과에 의해 발생되는 전기 습윤 힘에 의한 것일 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 이 경로는 제1 및 제2기판, 제1 및 제2전도체층, 광활성층 및 제1 및 제2유전체층을 포함하는 제1 및 제2복합벽으로 구성되거나 정의된 광학 매개 전기 습윤 마이크로 유동 공간이다. 다른 실시예에서, 이 영역은 중공형이고 마이크로 유동 공간을 수용하는 칩(chip) 또는 편평한 카트리지(cartridge)를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 제1기판 및 제1전도체층은 제2전자기장 방사 소스(예를 들어, 다수의 레이저 빔 또는 LED 다이오드)로부터의 광이 광활성층에 직접 충돌할 수 있도록 투명하다. 다른 실시예에서, 제2기판, 제2전도체층 및 제2유전체층은 동일한 목적에서 투명하다. 또 다른 실시예에서, 이 층들은 모두 투명하여 어느 측에서도 조광할 수 있다.
적합하게는, 제1 및 제2기판은 유리 금속 또는 엔지니어링 플라스틱과 같이 기계적으로 강한 재료로 만들어진다. 일 실시예에서, 기판은 어느 정도의 유연성을 가질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 제1 및 제2기판은 100 내지 1000 μm 범위의 두께를 갖는다.
제1 및 제2전도체층은 제1 및 제2기판의 일면에 위치하고, 전형적으로 70 내지 250 nm, 바람직하게는 70 내지 150 nm의 두께를 갖는다. 일 실시예에서, 이들 층 중 적어도 하나는 인듐 주석 산화물(ITO: Indium Tin Oxide)과 같은 투명한 전도성 재료, 은(silver)과 같은 전도성 금속의 매우 얇은 필름 또는 PEDOT 등과 같은 전도성 폴리머로 만들어진다. 이들 층은 연속 시트 또는 와이어와 같은 일련의 개별 구조로 형성될 수 있다. 대안적으로, 전도체층은 전자기장 방사가 메시(mesh)의 간극들 사이로 향하게 하는 전도성 물질의 메시일 수 있다.
광활성층은 제2전자기장 방사 소스에 의한 자극에 응답하여 국소 전하 영역을 생성할 수 있는 반도체 재료로 적합하게 구성된다. 예로서 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 갖는 수소화 된 비정질 실리콘 층을 포함한다. 일 실시예에서, 광활성층은 가시 광선을 사용하여 활성화된다.
제1벽의 경우에 광활성층 및 선택적으로 제2벽의 경우에 전도체층은, 전형적으로 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 유전체층으로 코팅된다. 이 층의 유전 특성은 바람직하게는 10^7 V/m 이상의 높은 유전 강도 및 3 이상의 유전 상수를 포함한다. 일 실시예에서, 유전체층은 고순도 알루미나 또는 실리카, 하프니아(hafnia) 또는 얇은 비전도성 중합체 필름으로부터 선택된다.
이 구성의 다른 실시예에서, 적어도 제1유전체층, 바람직하게는 두 층 모두는 방오층으로 코팅되어 다양한 전기 습윤 지점에서 원하는 마이크로 액적/담체/표면 접촉각을 형성하도록 보조하고, 추가적으로 액적이 경로를 따라 이동함에 있어 표면에 흡착되어 액적의 내용물이 감소되는 것을 방지한다. 제2벽이 제2유전체층을 포함하지 않으면, 제2방오층은 제2전도체층 상에 직접 적용될 수 있다. 최적의 성능을 위해 방오층은 25 ℃에서 기액 표면(air-liquid surface) 3점 인터페이스로 측정할 때 50° 내지70° 범위의 마이크로 액적/담체/표면 접촉 각도를 형성하는 데 도움을 주어야 한다. 담체 매질의 선택에 따라, 수성 에멀전으로 충전된 유사한 경로 내의 액적의 동일한 접촉각은 100° 보다 높을 것이다. 일 실시예에서, 이들 층(들)은 50 nm 미만의 두께를 가지고, 통상 단분자층이다. 다른 실시예에서, 이들 층은 메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate)와 같은 아크릴레이트 에스테르(acrylate ester)의 중합체 또는 친수성기로 치환된 이의 유도체, 예컨대 알콕시 실릴(alkoxysilyl)로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 방오층 중 하나 또는 둘 모두는 최적의 성능을 보장하기 위해 소수성이다.
제1 및 제2유전체층, 따라서 제1 및 제2벽은 폭이 50 μm 미만인, 바람직하게는 10 μm 미만인 마이크로 유동 공간을 포함하는 경로를 적합하게 형성한다. 일 실시예에서, 이 마이크로 액적 공간에 포함되기 전에, 마이크로 액적은 마이크로 유동 공간의 한 치수보다 10 % 이상, 적합하게는 20 % 이상인 고유 직경을 갖는다. 이러한 수단에 의해, 경로 내의 마이크로 액적은 압축을 경험하게 됨에 따라 특정 작업에 대해 비압축 자연 상태의 마이크로 액적에서 보다 높은 표면 전위 에너지를 추가함으로써 향상된 전기 습윤 성능을 제공한다.
다른 실시예에서, 경로는 제1 및 제2벽을 미리 결정된 간극만큼 이격시키기 위한 하나 이상의 스페이서(spacer)를 포함한다. 스페이서에 대한 옵션으로서 비드(beads) 또는 필라(pillars), 포토 패터닝에 의해 생성된 중간 층, 예를 들어 레지스트 층(resist layer)으로부터 만들어지는 리지(ridges)가 포함된다. 다양한 스페이서 형상이 좁은 채널, 테이퍼 진 채널 또는 필라 라인으로 정의된 부분적으로 둘러싸인 채널과 같은 공간을 형성하는 데 사용될 수 있다. 세심한 설계에 의해, 마이크로 액적의 변형을 돕고, 이어서 마이크로 액적 분리 및 변형된 마이크로 액적에 대한 작업을 수행하도록 이러한 구조를 사용될 수 있다.
제1 벽과 제2 벽 사이의 거리는 마이크로 액적의 미세 방울의 변형 수준에 영향을 주어, 마이크로 액적의 운동을 방해하는 표면 드래그(drag)를 부가하거나 제거한다. 제1벽과 제2벽 사이의 간격이 장치를 가로 질러 변하도록 장치를 구성함으로써, 상이한 마이크로 액적 작업에 맞게 조정되는 적어도 하나의 가변 치수를 갖는 경로를 가질 수 있다.
제1 및 제2벽은 그들 사이에 전압 전위차를 제공하기 위해 전도체층에 부착된, 적합하게는 10 내지 50 볼트의 범위인, AC 전력 소스를 사용하여 바이어스 된다.
본 발명의 시퀀싱 장치는 400 내지 1000 nm 범위의 파장 및 광활성화(photoexcitable) 층의 밴드 갭보다 높은 에너지를 갖는 전자기장 방사 소스를 더 포함한다. 적합하게는, 사용된 방사선의 입사 강도가 0.01 내지 0.2 Wcm-2의 범위에 있는 전기 습윤 지점에서 광활성층이 활성화될 것이다. 일 실시예에서, 전자기장 방사 소스는 픽셀화 되는 광활성층 상에 대응하는 광화성화 된 영역을 생성하기 위해 고도로 감쇠되고 또한 다른 예에서는 픽셀화 된다. 이에 의해, 또한 픽셀화 되는 제1유전체층 상의 대응되는 전기 습윤 지점이 유도된다. US20030224528에 개시된 디자인과는 대조적으로 전도성 셀이 없기 때문에, 픽셀화 된 전기 습윤 지점은 대응되는 제1벽 내의 어떠한 영구적인 구조와도 연계되지 않는다. 결과적으로, 본 발명의 장치에서 임의의 조명이 없다면, 제1유전체층의 표면 상의 모든 지점은 동일한 경향을 갖는 전기 습윤 지점이 된다. 이것은 장치를 매우 유동적으로 만들고 전기 습윤 경로를 고도로 프로그램 가능하게 한다. 이 특성을 종래 기술에서 개시된 영구 구조의 유형과 구별하기 위해, 본 발명자들은 장치에서 생성된 전기 습윤 지점을 '일시적(ephemeral)'이라고 특징짓기로 했으며, 본 발명자들 실시예들의 주장은 그에 따라 해석되어야 한다.
본 명세서에 개시된 최적화된 구조 설계는 결과적인 복합 스택이 (예컨대 산화 알루미늄(aluminium oxide) 또는 하프니아(Hafnia)와 같은) 고 유전 강도 및 고 유전율 상수를 갖는 더 두꺼운 중간층의 성능을 제공하는 코팅된 단일층(monolayer)으로부터 (또는 매우 얇은 기능화 된 층으로부터) 방오 및 접촉각 변형 특성을 갖는다는 점에서 특히 유리하다. 결과적인 층 구조는 10 μm 미만, 예를 들어 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5 또는 2 내지 4 μm 범위의 매우 작은 부피의 액적 조작에 매우 적합하다. 바람직한 일 실시예에서, 이들 범위는 10 fL 내지 1 pL 범위의 부피를 갖는 마이크로 액적을 발생시킨다. 이러한 매우 작은 액적의 경우, 액적 치수가 유전체 스택의 두께에 근접하고, 따라서 액적을 가로지르는 전계 구배(전기 습윤에 의한 움직임을 위한 요구 사항)가 더 두꺼운 유전체에 대해 감소됨에 따라, 광활성층 위에 완전한 비전도성인 스택을 갖는 성능상의 이점은 매우 유리한 것이다.
전자기장 방사 소스가 픽셀화 되는 경우, LED로부터의 빛에 의해 조광(illuminated)되는 반사 스크린 또는 디지털 마이크로 미러 장치(DMD: Digital Micromirror Device)를 사용하여 직접 또는 간접적으로 적절하게 제공된다. 이는 제1유전체층에서 매우 복잡한 패턴의 임시 전기 습윤 지점이 신속하게 생성 및 소멸될 수 있게 함으로써, 미세하게 제어되는 전기 습윤 힘을 이용하여 마이크로 액적이 임의의 임시 경로를 따라 정밀하게 조종될 수 있게 한다. 이는 다수의 전기 습윤 경로를 따라 수천 개의 이러한 마이크로 액적을 동시에 조작하는 것이 목적인 경우에 특히 유리하다. 이러한 전기 습윤 경로는 제1유전체층 상의 연속적인 가상 전기 습윤 지점들의 연속체로부터 구성되는 것으로 간주될 수 있다.
광활성층 상에 전자기장 방사 소스의 충돌 지점은 일반적인 원형을 포함하는 임의의 용이한 형상일 수 있다. 일 실시예에서, 이들 점의 형태는 대응하는 픽셀화의 형태에 의해 결정되고, 다른 예에서는 경로 내의 마이크로 액적의 형태에 전적으로 또는 부분적으로 대응한다. 바람직한 일 실시예에서, 충돌 지점 및 이에 따른 전기 습윤 지점은 초승달 모양 일 수 있고 경로 내의 마이크로 액적의 의도된 이동 방향으로 지향(oriented)될 수 있다. 다른 실시예에서, 제2벽은 또한, 동일한 전자기장 방사 소스 또는 본 발명에 기술하고 있는 제2소스에 의해, 추가 전기 습윤 위치가 유도(induce)될 수 있게 하는 광활성층을 포함한다. 적절하게는, 전기 습윤 지점 자체는 제1벽에 부착된 마이크로 액적 표면보다 작고, 액적과 표면 유전체 사이에 형성된 접촉 선을 가로 질러 최대 전계 강도 구배(gradient)를 제공한다. 제2광활성층의 추가는 전기 습윤 경계(edge)를 경로의 상부 표면에서 하부 표면으로 전이(transition)시키고, 각각의 마이크로 액적에 대안적인 또는 추가의 전기 습윤 힘을 가할 수 있게 한다.
일 실시예에서, 광활성층 상의 제2전자기장 방사의 충돌 지점을 조작하기위한 수단은 복수의 동시에 흐르는(running), 예컨대 평행하게 흐르는, 제1전기 습윤 경로를 제1 및 선택적으로 제2유전체층 상에 생성하도록 구성되거나 프로그래밍 된다. 다른 실시예에서, 서로 다른 경로를 따라 진행한 서로 다른 주(primary) 및 부(secondary) 마이크로 액적이 결합될 수 있도록 적어도 하나의 마이크로 액적 결합 지점(coalescing location)을 생성하기 위한 제1전기 습윤 경로와 교차하는 복수의 제3전기 습윤 경로를 제1 및/또는 선택적으로 제2유전체층 상에 추가로 생성하도록 구성되거나 프로그래밍 된다. 제1 및 제2전기 습윤 경로는 직각 또는 서로 정면으로 마주함을 포함하는 임의의 각도로 교차할 수 있다. 이 실시예는 액적 결합에 의해 경로 내의 마이크로 액적 내로 검출 성분(하기 참조)을 전달하는 것이 바람직한 경우에 특히 유용하다. 다수의 제1, 제2 및 제3습윤 경로가 사용되는 또 다른 실시예에서, 충돌 지점을 조작하기위한 수단은 마이크로 프로세서에 의해 적절하게 제어되며, 이는 마이크로 액적이 통과하는 경로를 생성할 뿐만 아니라, 각각의 마이크로 액적의 이동을 서로 동기화 시킨다.
전술한 바와 같이, 일부 실시예에서, 본 발명의 방법은 또한 하나 이상의 위치에 다음을 포함하는 뉴클레오티드 검출 성분을 도입하는 단계를 포함한다. (a) 아래 및/또는 본 발명자들의 이전 특허 출원에 열거된 형광 프로브 유형(또는 동등한 기능을 가지는 로브)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템; (b) 폴리머라제, (c) 선택적으로 리가제 및 (d) 형광 상태에서 사용된 포획 시스템으로부터 형광단(들)이 방출되도록 작용할 수 있는 핵산말단분해효소 및/또는 핵속핵산분해효소. 일 실시예에서, 이들 성분의 일부 또는 전부는 함께 또는 단계적으로 경로 또는 그 상류 (위 참조) 위치(들)에서 예를 들어, 원래의 마이크로 액적 매질에 존재함으로써 마이크로 액적으로 도입된다. 이들 검출 성분의 도입은, 예를 들어 마이크로 액적 인젝터를 사용한 직접 주입에 의해 또는 관련 물질을 함유하는 2차 마이크로 액적과 마이크로 액적의 결합에 의해 하나 이상의 위치에서 수행될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 파이로포스파테이스는 분석물의 하류 및 검출 성분의 첫 번째 도입 지점의 상류에 있는 마이크로 액적으로 도입된다.
본 발명자들의 이전 특허에 따른 다양한 포획 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서 이들은 (a) 비검출 상태인 특징적인 형광단으로 표지된 제1단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 (b) 제1올리고뉴클레오티드 상의 상보성 영역에 혼성체화(hybridising) 할 수 있는 제2 및 제3단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 시스템으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 이들은 (a) 제한 핵속핵산분해효소 니킹(nicking) 부위, 단일 뉴클레오티드 트리포스페이트를 포획하기 위한 단일 뉴클레오티드 포획 부위 및 적어도 하나의 형광단 및 형광단이 소광될 수 있도록 하는 적어도 하나의 소광자(quencher)를 각각 갖는 니킹-부위 양측에 병치된 올리고뉴클레오티드 영역을 포함하는 제1단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 (b) 포획 부위 양측에 제1올리고뉴클레오티드 상의 상보성 영역에 혼성체화 할 수 있는 제2 및 제3단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 시스템으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 이들은 다음 중 하나를 포함하는 시스템으로부터 선택된다. (a) 핵산말단분해효소 차단 부위, 차단 부위의 5' 측면에 위치하는 제한 핵속핵산분해효소 인지 부위, 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포획하기 위한 단일 뉴클레오티드 포획 부위 및 인지 부위의 5' 측면에 위치하는 형광단(들)을 소광될 수 있도록 형성된 적어도 하나의 형광단 영역을 포함하는 제1단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 (b) 제1올리고뉴클레오티드로부터 각각 분리되고, 포획 부위의 3' 및 5' 측면 옆에 있는 제1올리고뉴클레오티드 상의 상보 영역으로 혼성체화 할 수 있는 제2 및 선택적으로 제3단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 (a) 핵산말단분해효소 차단 부위, 차단 부위의 3' 측면에 위치하는 제한 핵속핵산분해효소 인지 부위, 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포획하기 위한 단일 뉴클레오티드 포획 부위 및 인지 부위의 3' 측면에 위치하는 형광단(들)을 소광될 수 있도록 형성된 적어도 하나의 형광단 영역을 포함하는 제1단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 (b) 제1올리고뉴클레오티드로부터 각각 분리되고, 포획 부위의 3' 및 5' 측면 옆에 있는 제1올리고뉴클레오티드 상의 상보 영역으로 혼성체화 할 수 있는 제2 및 선택적으로 제3단일 가닥 올리고뉴클레오티드.
다른 실시예에서, 이들은 다음 중 하나를 포함하는 시스템으로부터 선택되되, 올리고뉴클레오티드 포획 시스템은 비검출 상태인 형광단으로 표지된다. (i) (a) 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 포함하는 제1올리고뉴클레오티드 및 (b) 그 핵 염기 시퀀스가 제1올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 영역의 그것에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 두 성분, 또는 (ii) 말단이 두 개의 상이한 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 영역에 부착된 단일 가닥 뉴클레오티드 영역을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드.
또 다른 실시예에서, 이들은 단일 가닥 뉴클레오티드 영역을 포함하되, 그 말단은 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드 영역에 부착되며, 여기서 올리고 뉴클레오티드 영역 중 하나 이상은 비검출 상태의 형광단을 포함하는 시스템으로부터 선택된다.
검출 성분의 도입 후, 바람직하게는 형광 신호가 발생하는 배양 기간 후에, 마이크로 액적은 입사 제1전자기장 방사 소스 및 광 검출기를 포함하는 검출 시스템을 이용하여 하류에서 조사된다. 일부 실시예들에서, 제1 및 제2전자기장 방사 소스는 동일할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이러한 수단에 의해, 사용된 올리고뉴클레오티드 포획 시스템이 외부핵산분해 및/또는 내부핵산분해를 겪음에 따라 방출되어 형광하는 형광단이 검출되고, 각각의 마이크로 액적에 함유된 뉴클레오시드 트리포스페이트의 성질이 결정된다. 일 실시예에서, 이 검출은 압력 구동 흐름, 종래의 전기 습윤 또는 광학 매개 EWOD 중 하나 또는 조합에 의해 마이크로 액적이 최종적으로 이동되는 검출 위치가 경로 끝에 제공되는 표면을 포함하는 검출 구역에서 일어날 것이다. 최종 목적지를 생성하기 위해 이러한 표면은 벽들 및 유사하나 것들 등과 같은 구조로 프로파일링 될 수 있다. 다른 실시예에서, 검출 단계는 각각의 마이크로 액적이 적층되고 출구 지점에서 형광 검출 시스템에 의해 조사되기(interrogated) 전까지 이동하는 모세관 튜브의 어레이를 포함하는 검출 영역에 마이크로 액적을 도입하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 검출 시스템은 각각의 마이크로 액적의 내용물을 조사(interrogate)하기 위해 예를 들어 하나 이상의 레이저 또는 LED와 같은 하나 이상의 제1전자기장 방사 소스 및 사용되는 특정한 포획 시스템에 채용된 다양한 형광단의 특징적인 형광 파장(들) 또는 파장 포락선(envelope)에 맞춰진 하나 이상의 광 검출기 또는 동등한 장치를 포함한다. 그 후 검출기(들)에 검출된 임의의 형광은 분석물의 시퀀스의 데이터 특성을 나타내기 위해 공지된 알고리즘을 사용하여 컴퓨터에서 처리되고 분석될 수 있는 전기적 신호를 발생시킨다.
본 발명의 바람직한 제3양태의 일 실시예에서, 비혼화성 담체 내의 수성 마이크로 액적의 스트림 내의 마이크로 액적 각각을 분석물이 부착된 입자와 차례로 접촉시키되, 여기서 (마이크로 액적이) 입자 주위로부터 제거되기 전에 효소가 분석물로부터 뉴클레오시드 트리포스페이트 분자를 적어도 일부의 마이크로 액적으로 방출하도록 작용하는 단계를 특징으로 하는 핵산 분석물을 가(加)파이로인산분해 하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시예에서, 이 방법은 (a) 비검출 상태인 특징적인 형광단으로 표지된 제1단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 (b) 제1 올리고뉴클레오티드 상의 상보적인 영역으로 혼성체화 할 수 있는 제2 및 제3단일 가닥 올리고뉴클레오티드을 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템인 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시예에서, 이 방법은 (a) 제한 핵속핵산분해효소 니킹 부위를 포함하는 제1단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 단일 뉴클레오티드 트리포스페이트를 포획하기 위한 단일 뉴클레오티드 포획 부위 및 적어도 하나의 형광단 및 형광단이 소광될 수 있도록 하는 적어도 하나의 소광자를 각각 갖는 니킹-부위 양측에 병치된 올리고뉴클레오티드 영역 및 (b) 포획 부위 양측에 제1올리고뉴클레오티드 상의 상보성 영역에 혼성체화 할 수 있는 제2 및 제3단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템인 것을 특징으로 한다.
또 다른 방법으로, 이 방법은 (a) 핵산말단분해효소 차단 부위, 차단 부위의 5’ 측면에 위치하는 제한 핵속핵산분해효소 인지 부위, 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포획하기 위한 단일 뉴클레오티드 포획 부위 및 인지 부위의 5’ 측면에 위치하는 형광단(들)을 소광될 수 있도록 형성된 적어도 하나의 형광단 영역을 포함하는 제1단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 (b) 제1올리고뉴클레오티드로부터 각각 분리되고, 포획 부위의 3’ 및 5’ 측면 옆에 있는 제1올리고뉴클레오티드 상의 상보 영역으로 혼성체화 할 수 있는 제2 및 선택적으로 제3단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 (a) 핵산말단분해효소 차단 부위, 차단 부위의 측면 3’에 위치하는 제한 핵속핵산분해효소 인지 부위, 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포획하기 위한 단일 뉴클레오티드 포획 부위 및 인지 부위의 3’ 측면에 위치하는 형광단(들)을 소광될 수 있도록 형성된 적어도 하나의 형광단 영역을 포함하는 제1단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 (b) 제1올리고뉴클레오티드로부터 각각 분리되고, 포획 부위의 3’ 및 5’ 측면 옆에 있는 제1올리고뉴클레오티드 상의 상보 영역으로 혼성체화 할 수 있는 제2 및 선택적으로 제3단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템인 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시예에서, 이 방법은 (i) (a) 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 포함하는 제1올리고뉴클레오티드 및 (b) 그 핵 염기 시퀀스가 제1올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 영역의 그것에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 두 성분, 또는 (ii) 말단이 두 개의 상이한 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 영역에 부착된 단일 가닥 뉴클레오티드 영역을 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템인 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시예에서, 이 방법은 단일 가닥 뉴클레오티드 영역을 포함하되, 그 말단은 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드 영역에 부착되며, 여기서 올리고 뉴클레오티드 영역 중 하나 이상은 비검출 상태의 형광단을 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 제3양태에 따라 DNA 분석물을 시퀀싱하기에 적합한 본 발명의 방법은 하기 도면 및 관련 서술에 의해 설명된다.
도 1은 투명한 플라스틱으로 제조된 단일 칩에 통합된 마이크로 액적 제조 영역(1) 및 마이크로 액적 조작 영역(3)을 포함하는 마이크로 유동 칩의 평면도를 나타낸다. (1)은 가(加)파이로인산분해 스트림, 무기(inorganic) 가(加)파이로인산분해 스트림 및 본 발명자들의 이전 특허 출원 중 하나에 따른 뉴클레오시드 트리포스페이트를 식별하는데 필요한 다양한 검출 화학 물질 및 효소의 스트림 각각을 칩으로 도입하는 유입구(4, 5 and 6)에 부착된 유체(7, 8 and 9)를 함유하는 영역을 포함한다. 이들 스트림은 이어서 다양한 마이크로 액적(7b, 8b 및 9b)이 (예를 들어, 액적-분배 헤드를 사용하거나 또는 중간물인 더 큰 액적을 잘라내어) 생성되는 오리피스(7a, 8a 및 9a)로 각각 전달된다. (10)은 시퀀싱 될 폴리뉴클레오티드 분석물의 단일 분자가 일부 또는 모두 부착되는 상자성(paramagnetic)-중합체 복합 마이크로 비드(11)를 함유하는 저장소이다. 각각의 (11)은 전기 습윤 경로(12)를 따라 위치(7c)로 마이크로 액적으로 이동되어 자성에 의해 위치유지 되고 (7b)의 스트림과 접촉된다. 이 위치에서, (11)에 부착된 분석물은 각각의 (b)가 (11)로부터 분리된 후 비워지거나 또는 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 분자만을 함유하는 속도로 점진적으로 가(加)파이로인산분해된다. 분리 후, 마이크로 액적(8b 및 9b)과 함께 (7b)는 도 2에서 도시된 방식에 따라 30 내지 40 ℃의 온도 범위에서 (여기서 정사각형 전기 습윤 위치(25)로 정의된) 다양한 광학 매개 전기 습윤 경로를 따라 조작되는 (3)으로 이동하게 된다. 이 과정에서, (7b) 및 (8b)는 먼저 제1결합 지점(12)에서 합체되어 중간물인 마이크로 액적(13)을 생성한 후, 제2결합 지점(14)에서 (9b)와 합쳐져서 내용물이 배양되고 필요한 화학적 및 효소적 반응이 일어나도록 60-75 ℃ 온도 범위로 유지되는 배양 영역(16)을 지나 전방으로 이동하는 복수의 최종 마이크로 액적(15) 스트림을 생성한다. 그 후, (15)는 검출 영역(2) 내의 최종 위치로 이송되고, 여기서 LED 소스로부터의 광 및 광 검출기를 사용하여 검출되는 각각의 마이크로 액적에 의해 방출되는 임의의 형광을 이용하여 조사된다(interrogated). 광 검출기의 출력은 공지된 시퀀싱 알고리즘을 사용하여 분석될 수 있는 분석물의 시퀀스에 상응하는 데이터 스트림이다.
도 2는 다양한 마이크로 액적이 조작되는 방법을 도시한 (3)의 부분 단면도를 나타낸다. (3)은 두께가 130 nm인 전도성 ITO(Indium Tin Oxide, 18a 및 18b)의 투명층으로 코팅된 각각 500 μm 두께인 상단 및 하단 유리판(17a 및 17b)을 포함한다. (17a) 및 (17b) 각각은 AC 소스(19)에 연결되고, (18b)의 ITO 층은 접지(grounded)된다. (18b)는 800 nm 두께의 비정질 실리콘 층(20)으로 코팅된다. (18a) 및 (20)은 각각 160 nm 두께의 고순도 알루미나 또는 하프니아(21a)로 코팅된 후, 폴리(3-(트리메톡시실릴)프로필 메타아크릴레이트, 22) 단일층으로 코팅되어 고순도 알루미나 또는 하프니아 층(21a)의 표면에 소수성을 제공한다. (21a) 및 (21b)는 스페이서(미도시)를 사용하여 3 μm 이격되어 마이크로 액적이 이 공간에 도입될 때 어느 정도 압축되도록 한다. LED 광원(23)에 의해 조광되는, 반사형 픽셀화 된 스크린의 이미지는 일반적으로 (17b) 아래에 배치되고, 0.01 Wcm-2 레벨의 가시광(파장 660 또는 830 nm)이 각각의 다이오드(24)로부터 방출되고, 복수의 상향 화살표의 방향으로 전파되어 (17b) 및 (18b)을 통과하여 (20)에 충돌하게 된다. 다양한 충돌 지점에서, 상응하는 전기 습윤 위치(25)에서 (21b)의 액체-고체(liquid-solid) 접촉각 변화를 야기하는 전하의 광활성화 된 영역(26)이 (20)에 생성된다. 이러한 변화된 특성은 마이크로 액적을 한 지점(25)에서 다른 지점으로 추진하는 데 필요한 모세관 힘을 제공한다. (23)은 사전에 프로그래밍 된 알고리즘을 이용하여 임의의 주어진 시간에 어레이 중 어느 (26)가 조광되도록 할지를 결정하는 마이크로 프로세서(12)에 의해 제어된다. 이와 같은 방법으로 다양한 마이크로 액적이 도 1에 도시된 다양한 경로를 따라 동기화되어 이동될 수 있다.
도 3은 (21b) 상의 위치(25)에 위치한 접촉 정도를 한정하는 점선 윤곽선(7')을 갖는 전형적인 마이크로 액적(여기서 7b)을 위에서 내려다본 평면도를 도시한다. 이 예에서, (26)은 (7b)의 이동 방향으로 초승달 모양이다.
이상의 설명은 본 실시예의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 실시예의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 실시예들은 본 실시예의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 실시예의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 실시예의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 실시예의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (23)

  1. 화학적 변형에 따른 효과를 목적으로 표적 분자가 고체 지지체에 결합된 비혼화성 담체 매질 내에서 반응 매질의 마이크로 액적을 조작하는 방법으로서,
    (a) 마이크로 액적과 고체 지지체가 결합되는 조건 하에서 마이크로 액적과 고체 지지체를 접촉시키는 단계;
    (b) 반응 매질이 표적 분자와 반응하도록 허용하는 단계; 및
    (c) 그 후 반응 매질이 고체 지지체로부터 분리되어 담체 내의 마이크로 액적으로 개질(reform)되도록 힘을 가하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 반응 매질은 핵산 분석물을 형질 전화하기 위한 매질이고, 상기 표적 분자는 폴리뉴클레오티드인 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    뉴클레오티드는 상기 분석물로부터 방출되고 마이크로 액적 내의 상기 고체 지지체의 근처로부터 운반되어 지는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    뉴클레오티드를 각각 운반해 낼 수 있는 다수의 마이크로 액적이 상기 분석물과 순서대로 접촉하도록 이동되는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 핵산 분석물의 시퀀스를 결정하는데 사용되고,
    비혼화성 담체 매질 내의 분해 매질을 포함하는 상기 반응 매질의 마이크로 액적의 스트림이 경로에서 입자를 포함하는 상기 고체 지지체에 결합된 상기 핵산 분석물을 포함하는 표적 분자와 하나씩 접촉하게 하여, 상기 분석물이 그 구성 뉴클레오티드로 점진적으로 분해되도록 하는 단계;
    상기 분석물 주위로부터 상기 마이크로 액적을 제거하는 단계로서, 상기 마이크로 액적 중 적어도 일부는 단일 뉴클레오티드를 함유하는 단계;
    상기 경로를 따라 상기 마이크로 액적을 검출 영역으로 더 운반하는 단계; 및
    상기 검출 영역에서 상기 마이크로 액적 내의 상기 뉴클레오티드를 식별하고 그로부터 상기 분석물 분자의 상기 시퀀스를 유추하는 단계
    를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분해 매질은 폴리머라제 및 상기 폴리머라제로 하여금 상기 분석물 분자로부터 뉴클레오티드를 하나씩 방출하도록 야기하는 보조인자(cofactor)를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 보조인자는 폴리포스페이트 음이온(polyphosphate anion) 또는 그의 유사체인 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 폴리포스페이트는 피로인산염(pyrophosphate)인 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 분해 매질은 핵산말단분해효소(exonuclease)를 포함하고, 그 결과 방출된 상기 뉴클레오티드 모노포스페이트(monophosphates)는 키나이제(kinase)로 더 처리되어 뉴클레오티드 트리포스페이트로 전환되는 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    결과적인 뉴클레오티드는 폴리머라제 존재 하에 형광 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드 포획 시스템과 반응하고, 상기 형광 프로브는 미사용 상태에서 비형광성이고, 상기 분석물의 특징적인 뉴클레오티드 유형 중 하나 이상에 대해 선택적이어서, 형광단의 방출에 의해 검출 가능한 상태가 되되, 각각의 마이크로 액적에서 방출된 형광단으로부터 나오는 결과적인 형광은 입사 제1전자기장 방사 소스 및 검출기를 사용하여 검출되는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 형광단의 방출은 핵산말단분해효소 및/또는 핵속핵산분해효소(endonuclease) 및 선택적으로 리가제(ligase)의 작용의 결과이며, 이러한 작용은 검출되는 뉴클레오티드의 포획에 의해 촉진되는(catalysed) 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 포획 시스템은 액적 결합 또는 직접 주입을 통해 상기 입자의 하류에 있는 상기 마이크로 액적 내로 도입되는 방법.
  13. 제10항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분해 매질은 상기 올리고뉴클레오티드 포획 시스템과의 반응 전에 파이로포스파테이스(pyrophosphatase)로 더 처리되는 방법.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로 액적은 국부적으로 습윤성이 증가된 영역을 갖도록 화학적으로 변형된 표면 위로 이동하도록 야기되며, 이러한 습윤성의 증가는 상기 표적 분자 주위의 상기 마이크로 액적의 습윤을 매개하는데 이용되는 방법.
  15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자 주위의 상기 표면의 영역의 상기 습윤성을 국부적으로 변화시키기 위해 전기 습윤 또는 광학 매개 전기 습윤 효과가 이용되는 방법.
  16. 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로 액적은 상기 제3단계에서 전기 습윤 또는 광학 매개 전기 습윤을 이용하여 이동되는 방법.
  17. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경로의 적어도 일부는
    제1복합벽으로서,
    투명한 제1기판;
    상기 기판 상에, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 투명한 제1전도체층;
    상기 전도체층 상에, 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 가지고, 400 내지 1000 nm 범위의 파장 범위를 갖는 전자기장 방사에 의해 활성화되는 광활성층; 및
    상기 전도체층 상에, 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 제1유전체층;
    을 포함하는 제1복합벽 및
    제2복합벽으로서,
    제2기판;
    상기 기판 상에, 70 내지 250 nm범위의 두께를 갖는 제2전도체층; 및
    선택적으로, 상기 전도체층 상에, 25 내지 50 nm 범위의 두께를 갖는 제2유전체층;
    을 포함하는 제2복합벽으로 구성되거나 정의되되,
    상기 제1 및 제2유전체층의 노출된 표면은 50 μm 미만으로 이격되는 광학 매개 전기 습윤 마이크로 유동 공간인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 마이크로 유동 공간은 (a) 상기 제1 및 제2전도체층을 연결하는 상기 제1 및 제2복합벽에 걸쳐 전압을 제공하는 AC소스 및 (b) 상기 제1유전체층의 표면 상에 대응하는 임시 제1전기 습윤 지점을 유도하기 위해 광활성층 상에 충돌하도록 구성된 광활성화(photoexcitable) 층의 밴드 갭보다 높은 에너지를 갖는 적어도 하나의 제1전자기장 방사 소스의 수단에 의해 상기 마이크로 액적을 이동시키도록 활성화되는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 제1 및 제2전자기장 방사 소스는 동일한, 방법.
  20. 제5항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자를 분해가 일어나는 상기 위치로 전기 습윤 또는 광학 매개 전기 습윤을 사용하거나 혹은 자기적으로(magnetically) 이동시키는 초기 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 제5항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 상기 마이크로 액적의 스트림과 접촉하는 동안 원하는 위치에 자기적으로 위치유지 되는 방법.
  22. 제10항 중 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로 액적을 적어도 하나의 모세관 튜브의 유입구에 도입하는 단계 및 상기 배출구(들)로부터 나오는 상기 마이크로 액적에 상기 제1전자기장 방사가 충돌하게 하는 단계에 의해 형광이 검출되는 방법.
  23. 분석물이 부착된 입자와 가(加)파이로인산분해 효소를 함유하고 담체 매질 내에 현탁되는 수성 마이크로 액적의 스트림 내의 각각의 마이크로 액적을 상기 입자와 차례로 접촉시키되, 여기서 상기 입자 주위로부터 제거되기 전에 상기 분석물로부터 뉴클레오시드 트리포스페이트 분자를 적어도 일부의 상기 마이크로 액적으로 방출하도록 작용하는 상기 효소를 포함하는 핵산 분석물을 가(加)파이로인산분해 하기 위한 방법.
KR1020207001605A 2017-06-21 2018-06-21 핵산과 같은 분자를 분석하는 방법 KR20200019717A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17177204.9 2017-06-21
EP17177204 2017-06-21
EP17208257.0 2017-12-18
EP17208257 2017-12-18
PCT/EP2018/066579 WO2018234448A1 (en) 2017-06-21 2018-06-21 METHOD FOR SEARCHING MOLECULES SUCH AS NUCLEIC ACIDS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200019717A true KR20200019717A (ko) 2020-02-24

Family

ID=62684838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207001605A KR20200019717A (ko) 2017-06-21 2018-06-21 핵산과 같은 분자를 분석하는 방법

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20210146364A1 (ko)
EP (2) EP3641936A1 (ko)
JP (2) JP7066756B2 (ko)
KR (1) KR20200019717A (ko)
CN (1) CN110785236A (ko)
AU (1) AU2018288535A1 (ko)
BR (1) BR112019027764A2 (ko)
CA (1) CA3067171A1 (ko)
IL (1) IL271544A (ko)
SG (2) SG11201912295VA (ko)
WO (1) WO2018234448A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201909514D0 (en) 2018-11-20 2019-08-14 Lightcast Discovery Ltd Device and method for microdroplet detection of cells
BR112021017202A2 (pt) * 2019-02-19 2021-12-07 Lightcast Discovery Ltd Dispositivo para a manipulação de microgotículas
GB201915027D0 (en) 2019-10-17 2019-12-04 Lightcast Discovery Ltd Apparatus and methods for manipulating microdroplets
GB202109966D0 (en) * 2021-07-09 2021-08-25 Lightcast Discovery Ltd Improvements in or relating to a microfluidic device

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962020A (en) * 1988-07-12 1990-10-09 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
US6958132B2 (en) * 2002-05-31 2005-10-25 The Regents Of The University Of California Systems and methods for optical actuation of microfluidics based on opto-electrowetting
US7329545B2 (en) * 2002-09-24 2008-02-12 Duke University Methods for sampling a liquid flow
US7968287B2 (en) * 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US20060153745A1 (en) 2005-01-11 2006-07-13 Applera Corporation Fluid processing device for oligonucleotide synthesis and analysis
EP1844162B1 (en) * 2005-02-01 2014-10-15 Applied Biosystems, LLC Method for identifying a sequence in a polynucleotide
US20100120130A1 (en) * 2007-08-08 2010-05-13 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet Actuator with Droplet Retention Structures
US8852952B2 (en) 2008-05-03 2014-10-07 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of loading a droplet actuator
WO2009149257A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 The University Of Chicago The chemistrode: a plug-based microfluidic device and method for stimulation and sampling with high temporal, spatial, and chemical resolution
WO2011020011A2 (en) * 2009-08-13 2011-02-17 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator and droplet-based techniques
US10752945B2 (en) * 2012-09-12 2020-08-25 The Regents Of The University Of California Accurate genome sequencing of single cells by single-stranded amplification and sequencing
GB201217770D0 (en) 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Biological probes and the use thereof
GB201217772D0 (en) 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
GB201300957D0 (en) 2013-01-18 2013-03-06 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
CN105339507A (zh) * 2013-02-21 2016-02-17 托马生物科学公司 用于核酸分析的方法、组合物和试剂盒
GB201306445D0 (en) 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
GB201306444D0 (en) 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
GB201412977D0 (en) * 2014-07-22 2014-09-03 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
WO2016090295A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 The Regents Of The University Of California Single-sided light-actuated microfluidic device with integrated mesh ground
WO2016094522A1 (en) 2014-12-09 2016-06-16 Berkeley Lights, Inc. Automated detection of assay-positive areas in microfluidic devices
GB201501012D0 (en) * 2015-01-21 2015-03-04 Base4 Innovation Ltd Improved droplet sequencing apparatus and method
JP6891169B2 (ja) 2015-10-27 2021-06-18 バークレー ライツ，インコーポレイテッド 共有結合した疎水性表面を有するマイクロ流体エレクトロウェッティングデバイス装置
CN106048041B (zh) * 2016-07-08 2017-04-26 中国科学院城市环境研究所 一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量检测引物及检测方法
WO2018187476A1 (en) * 2017-04-04 2018-10-11 Miroculus Inc. Digital microfluidic apparatuses and methods for manipulating and processing encapsulated droplets

Also Published As

Publication number Publication date
US20230201836A1 (en) 2023-06-29
SG11201912295VA (en) 2020-01-30
AU2018288535A1 (en) 2020-02-06
US20210146364A1 (en) 2021-05-20
BR112019027764A2 (pt) 2020-07-07
WO2018234448A1 (en) 2018-12-27
JP2022109999A (ja) 2022-07-28
SG10202111850XA (en) 2021-12-30
JP7475391B2 (ja) 2024-04-26
CA3067171A1 (en) 2018-12-27
EP3912725A1 (en) 2021-11-24
IL271544A (en) 2020-02-27
JP2020524513A (ja) 2020-08-20
EP3641936A1 (en) 2020-04-29
JP7066756B2 (ja) 2022-05-13
CN110785236A (zh) 2020-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102657042B1 (ko) 마이크로 유체 분석 장치
JP7475391B2 (ja) 核酸等の分子を調査するための方法
EP3084523B1 (en) Substrates comprising nano-patterning surfaces and methods of preparing thereof
KR20150143614A (ko) 단일 뉴클레오티드 검출방법
US9546996B2 (en) Sequencing apparatus
KR101779353B1 (ko) 액적 저장 방법
JP6482672B2 (ja) 改良された液滴配列決定装置および方法
JP2023545029A (ja) マイクロ液滴の操作を容易にするためのデバイス及び方法に関する改善
JP2005300460A (ja) 相互作用検出部と該検出部を備えるバイオアッセイ用基板、並びに媒質滴下方法と媒質の水分の蒸発を防止する方法
Wang Microfluidics for biosensor chips