KR101779353B1 - 액적 저장 방법 - Google Patents

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Abstract

적어도 일부가 하나 이상의 단일 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 및 액적 유체를 포함하는 액적 스트림의 저장 방법이 제공된다. 이것은, 기판의 표면의 해당 고유 위치 상으로 각각의 액적을 순차적으로 도입시키는 단계를 특징으로 하며, 또한, 상기 액적 스트림이, 점진적 가피로인산 분해에 의해, 분석물로부터 뉴클레오타이드의 정렬 스트림을 생성시키고, 해당 액적에서 각각의 뉴클레오타이드를 포획하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다. 상기 방법은, 전구체 폴리뉴클레오타이드 분석물의 뉴클레오타이드 서열이 형광 분광법을 이용하여 측정되는 미세액적 액적 시퀀서 및 분석 유닛과 결합하여 유용하게 이용될 수 있다. 상기 방법을 수행하기 위한 장치가 또한 개시된다.

Description

액적 저장 방법{DROPLET STORAGE METHOD}
본 발명은 기판의 표면 상에 액적(droplet)을 저장하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 액적 각각이 하나 이상의 단일 뉴클레오타이드(nucleotide) 또는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 포함하는 액체 액적의 저장에 관한 것이다. 상기 방법은 자연 발생 또는 합성 DNA 또는 RNA로부터 유래하는 폴리뉴클레오타이드 분석물의 서열 분석에서 생성될 수 있는 것과 같은 매우 많은 수의 미세액적의 저장 및 특성화에 유용하다.
차세대 유전 물질 서열 분석은, 특히 빠른 서열 분석 장치가 시장에 나오면서 서열 분석 단가가 하락함에 따라, 생명 과학 전반 및 의약품에 있어서 이미 상당한 충격을 주고 있다. 따라서, 이러한 장치에서, 이중 가닥 DNA 분석물은 먼저 다수의 작은 폴리뉴클레오타이드 단편으로 절단됨으로써 간접적으로 서열분석되며, 단편 각각은 먼저 하나의 가닥의 양끝에서 아데닐화되어, 비쌍 아데닌 염기로의 혼성화에 의해, 최초 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 그 상보체의 양끝에 결합될 수 있다. 이렇게 얻어진 처리 단편은 이후 크기 선별되고, 그 자신이 처음 것의 서열 상보체인 제2의 결합 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 의해 코팅된 표면에 포획되어, 결과적으로, 추가적 혼성화에 의해, 표면-결합 이중 가닥 단편의 라이브러리가 생성될 수 있다. 추후 클러스터링 단계에서, 이들 라이브러리 구성 요소는 이후 사용되지 않은 제2 올리고뉴클레오타이드의 사용을 위해, 연장 및 등온 가교 반응을 이용하여, 표면 상에서, 클론적으로 수백만배 증폭된다. 이것은 결과적으로, 그의 가닥 중 하나를 통해 표면에 결합되는 폴리뉴클레오타이드 단편의 고농축화를 유발시킨다. 다음에, 서열분석을 위해 준비된 결합 단일 가닥 단편을 남기기 위해, 각 단편의 비결합 상보적 가닥은 제거된다. 서열 분석 단계에서, 각각의 이들 단일 가닥 단편은 프라이밍되고, 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(ddNTP) 형태의 DNA의 4 개의 특유의 뉴클레오타이드 염기의 혼합물 및 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 연장에 의해, 그의 상보적 가닥이 재생된다. 각각의 ddNTP 유형은 상이한 파장의 상이한 형광단 형광으로 표지된 모이어티에 의해 말단 블로킹(end-blocking) 된다. 이후, 연장 반응은 3 단계의 사이클의 형태를 취한다: 먼저, 연관된 ddNTP가 성장 가닥에 결합되고; 두번째로, 샘플의 조광(illuminating) 및 형광 파장의 검출에 의해, 포함된 뉴클레오타이드 염기가 확인되고, 마지막으로, 다음 연장 사건의 발생을 위해, 말단 블록 및 그의 결합 형광단이 제거된다. 이렇게 함으로써, 상보적 가닥의 서열이 염기 순으로 구축될 수 있다. 이러한 접근법은 고도로 자동화될 수 있고, 높은 정확도로 서열 판독을 생성시킬 수 있으나, 그 작용 속도는 연장 사이클의 속도에 의해 제한된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 사실상, 이 기술의 이용에 있어서, 비교적 짧은 폴리뉴클레오타이드 단편의 병렬 프로세싱 및 다양한 판독이 얻어지는 전체 서열의 조립(assembly)이 관여되는 경향이 있다. 이것은, 그 자체만으로 계산의 복잡성 및 오류 발생 가능성을 초래할 수 있다.
최근, 이러한 점을 보완할 수 있는 직접적 서열 분석 방법을 개발하기 위한 노력이 이루어져 왔다. 예를 들어, WO 2009/030953은, 특히, 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 샘플(예를 들어, 자연 발생 RNA 또는 DNA)의 뉴클레오타이드 염기 또는 염기 쌍의 서열이, 나노 기공의 유출구 내 또는 그 주변에 병치된 플라즈모닉 나노구조가 제공된 나노-다공 기판을 통해, 이의 전위(translocating)에 의해 판독되는 신규의 빠른 시퀀서를 개시한다. 이 장치에서, 플라즈모닉 나노구조는, (선택적으로 표지된) 각각의 뉴클레오타이드 염기가 입사광과의 상호작용에 의해, 특유의 방식으로 형광 또는 라만 산란 광자로 차례로 유도되는 검출 윈도우(detection window, 필수적으로 전자기장)를 정의한다. 이렇게 생성된 광자(photon)는 그후 원격적으로 검출되고, 다중화되며, 정보 내용이 폴리뉴클레오타이드와 결합된 뉴클레오타이드 염기 서열의 특성인 데이타 스트림으로 변환된다. 다음에, 이러한 서열은, 장치에 부속된 보조 연산기에서 또는 장치와 함께 통합된 마이크로프로세서로 프로그래밍된 소프트웨어에 내장된 계산 알고리즘을 이용하여 데이타 스트림으로부터 복구될 수 있다. 플라즈모닉 나노구조 및 그에 관련된 공명 특성의 이용에 대한 추가적 배경은 예를 들어 문헌 [Adv. Mat. 2004, 16(19) pp. 1685-1706]에서 찾아볼 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 빠른 서열 분석을 위한 또 다른 장치는 예를 들어 US6627067, US6267872 및 US6746594에 개시되어 있다. 가장 간단한 형태로서, 이러한 장치는 나노 기공 유출구 내 또는 그 주변 또는 기판을 가로지르는 검출 윈도우를 정의하기 위해, 플라즈모닉 나노구조 대신에 전극을 사용한다. 다음에, 전극 간에 전위차가 인가되고, 나노 기공을 통한 폴리뉴클레오타이드 및 결합 전해질의 전기 전위의 결과로, 그 사이에 흐르는 이온 배지의 전기적 특성의 변화가 시간 함수로서 측정된다. 이 장치에서, 다양한 개별적 뉴클레오타이드 염기가 검출 윈도우를 통과하여 윈도우를 지속적으로 차단 및 비차단하므로, 이는, 저항 또는 전류 흐름에 특성적 변동(characteristic fluctuation)을 유발하는 '사건(event)'을 초래한다. 다음에, 전술된 바와 같이, 이러한 변동을 이용하여 분석을 위한 적절한 데이타 스트림을 생성한다.
안정한 액적 스트림, 특히 미세액적 스트림의 생성은, 이미 분자생물학 분야에서 적용되고 있는 또 다른 기술 개발 분야이다. 예를 들어, US7708949는 오일 중에서 안정한 물 액적을 생성하기 위한 신규의 미세유체 방법을 기술하고 있고, 예를 들어 US2011/0250597은, 중합 효소 연쇄 반응을 이용하여 주형을 증폭시키는 복수의 프라이머 쌍 및 핵산 주형(전형적으로 폴리뉴클레오타이드 DNA 또는 RNA 단편)을 포함하는 미세액적을 생성하기 위해, 이 기술을 이용하는 방법을 기술하고 있다. 당해 분야와 관련된 다른 특허 출원에는 일반적으로 JP2004/290977, JP2004/351417, US2012/0122714, US2011/0000560, US2010/01376163, US2010/0022414 및 US2008/0003142가 포함된다.
US 6277334는, 제1 및 제2 액적에 포함된 뉴클레오타이드 사이의 반응의 발생을 초래할 수 있는 반응 자리가 제공되는 다공 반응 지지체를 통과한 후, 제1 및 제2 액적이 반응 웰로 도입되는 장치를 개시한다. 그러나, 전구체 폴리뉴클레오타이드 분석물로부터 유래하는 단일 뉴클레오타이드의 정렬 스트림 및 액적 유체로부터의 액적 스트림의 생성이 이루어지는 것에 대해서는 언급되지 않았다.
US 2004/0197817은 기판 상에 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 액적을 증착시킴으로써, 기판 상에서 폴리뉴클레오타이드의 어레이를 조작하기 위한 장치에 관한 것이다. 이 장치는 마찬가지로, 서열 정보를 저장하기 위한 것으로서, 전구체 폴리뉴클레오타이드 분석물로부터 유래하는 단일 뉴클레오타이드의 정렬 스트림 및 액적 유체를 포함하는 액적 스트림의 프린팅에 관련된 것은 아니다.
US 2010/0015614는 미세액적 중합 효소 연쇄 반응 증폭 후, 모세관 전기 영동 분석을 이용한, 생물 물질의 칩-기반 분류, 증폭 및 특성화 장치를 개시하고 있다. 상기 장치는, 예를 들어 박테리아 또는 바이러스의 세포로부터 유래하는 용해물을 포함하는 미세액적을 이용하여 충전된 하나 이상의 마이크로 반응기를 포함하는 평면 기판을 포함한다. 그러나, 전구체 폴리뉴클레오타이드 분석물로부터 유래하는 단일 뉴클레오타이드의 정렬 스트림 및 액적 유체의 액적 스트림의 생성에 대해서는 교시된 바 없다.
EP 1933138은 액적 프린팅 방법을 이용하여, 복수의 통상의 생물적 프로브(올리고뉴클레오타이드 등)를 증착시킴으로써, 생물적 분석 기판 어레이를 생성하는 방법에 관한 것이다. 다시 말하면, 전구체 폴리뉴클레오타이드 분석물로부터 유래하는 단일 뉴클레오타이드의 정렬 스트림 및 액적 유체의 액적 스트림의 생성에 대해서는 교시되지 않았다.
최근 본 발명자들의 종전 출원 GB1217772.1, GB1306444.9 및 GB1306445.6에서, 본 발명자들은 미세 액적의 해당 스트림으로 차례로 포획될 수 있는 뉴클레오타이드의 정렬 스트림을 생성시키기 위한, 점진적 가피로인산 분해(pyrophosphorolysis) 또는 외부핵 분해(exonucleolysis)를 포함하는 신규의 서열분석 방법을 개시하였다. 그 후, 각각의 액적은 본래 포함된 특정 뉴클레오타이드를 밝히기 위해, 화학적 및/또는 효소적으로 조작될 수 있다. 그러나, 이러한 방법에 의해 생성될 수 있는 수백만 액적의 분석에는, 내부에서 발생하는 다양한 화학적 및/또는 생물적 반응이 완료되는 일정 기간 동안 액적의 저장이 요구된다. 이전에, 본 발명자들은 저장 목적을 위해, 엄격한 순서로 액적을 포획 및 유지시키도록 적용된 것으로서, 액적 스트림이 유동하는 챔버를 개시했다. 그러나, 이러한 챔버는 분석되는 폴리뉴클레오타이드가 비교적 짧은 경우에는 안정하나, 미세액적 스트림의 흐름이 차례로 제한되는 챔버의 경우, 다수의 액적에 의해 바람직하지 않은 배압의 구축이 빠르게 야기되므로, 다소 긴 폴리뉴클레오타이드에 적용시, 이러한 챔버의 사용은 문제가 된다.
따라서, 본 발명자들은, 액적이 분석을 위해 준비될 때까지 유지될 수 있도록 기판(substrate)의 표면 상의 구분되는 위치에 액적을 저장하는 단계를 포함하는 방법을 개발하였다. 따라서, 본 발명에 따르면, 적어도 일부가 하나 이상의 단일 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드와 액적 유체(droplet fluid)를 포함하는 액적 스트림의 저장 방법으로서, 해당 고유 위치(unique location)에서 기판의 표면 상에 각 액적을 순차적으로 도입하는 단계를 특징으로 하고, 또한, 상기 액적 스트림이, 점진적 가피로인산 분해(pyrophosphorolysis)에 의해 분석물로부터 뉴클레오타이드의 정렬 스트림을 생성시키고, 해당 액적에서 각각의 뉴클레오타이드를 포획하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 저장 방법이 제공된다.
액적이 저장되는 기판은 원칙적으로, 유리, 중합체, 합성물 및 금속을 포함하는 임의의 불활성 물질로 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 기판은 특히 가시광선 또는 자외선 부근의 주파수의 전자기파에 투과성(transparent)인 것으로서, 예를 들어 유리 또는 투명 플라스틱이다. 또한, 이것은 이러한 전자파 방사를 반사할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 기판은 액적 전달 시스템 아래에 병치되는(juxtaposed) 작용 표면(operative surface)을 가지는 시트(sheet)이다. 이 실시형태에서, 상기 액적 전달 시스템의 바로 아래의 표면은 평평하고 비성형되거나(un-profiled), 홈, 채널, 웰, 핌플(pimple), 함몰부(dimple), 구멍, 기둥(pillar) 및 액적의 유지가 용이하도록 적용되거나 또는 형성된 기타 돌출부(protuberance)와 같은 구조가 될 수 있다. 이것의 한 실시예에서, 상기 구조는, 전형적으로 작용 표면에 규칙적으로 배열된 복수의 웰, 홈 또는 채널을 포함한다. 이들 웰, 홈 또는 채널은, 액적을 적어도 부분적으로 수용하고, 작용 표면에 평행한 방향으로 액적을 못 움직이게 하기에 충분한 크기인 한, 임의의 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 웰은 실질적으로 반구형이고, 이들의 내부 표면은 반사 물질로 코팅된 것이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 기판의 작용 표면 일부는 액적의 부착성을 높이기 위해 화학적 또는 물리적으로 처리된다. 일 실시예에서, 이는, 예를 들어 기판이 유리 시트인 경우, 액적이 전달되는 위치에서, 표면 수산기 또는 수산화 이온 그룹을 생성하도록 표면을 플라즈마 또는 에칭 처리함으로써 기판의 일부가 다른 부분보다 친수성이 되거나 또는 상대적으로 더 친수성이 되도록 함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 작용 표면 일부는 다른 부분보다 소수성이 되거나 또는 상대적으로 더 소수성이 되도록 처리된다. 따라서, 작용 표면은 소수성 표면에 친수성 패턴 또는 어레이를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 친수성이거나 또는 상대적으로 더 친수성인 부분은 전술된 표면 구조의 일부 또는 전부에 해당할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 작용 표면의 일부는, 점성을 제공하는(sticky) 친수성 중합체 코팅이 제공되거나 또는 화학적으로 기능화된다. 이 실시형태에서, 코팅은 전술된 유형의 전자기파를 적절하게 반사하거나 또는 투과시킨다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 작용 표면은 전술된 유형의 구조가 제공되고, 이들 구조의 적어도 일부는 이들 표적 위치에서만 액적의 부착성이 향상되도록 선택적으로 화학적 또는 물리적 처리된다.
액적은, 작용 표면에 적용되는 경우 또는 적용되어 있는 중에도 일정한 정도로 증발되는 경향이 있다. 이것은, 미세액적(microdroplet)이 사용되는 경우 특히 문제가 되는데, 증발 표면 영역 대비 내부 용적 비율이 비교적 크기 때문이다. 따라서, 액적이 기판의 코팅되지 않은 작용 표면에 직접 적용될 수 있으므로, 상황에 따라서는, 작용 표면이, 주위 온도(ambient temperature)에서 비휘발성인 액체 필름으로 코팅되는 것이 바람직할 것이다. 적절하게는, 마지막 저장 단계에서, 상기 액체가 액적을 완전히 캡슐화할 수 있도록, 이러한 필름의 두께는 액적의 직경보다 더욱 커야 한다. 이를 용이하게 하기 위해, 이 액체는 액적 유체보다 저밀도이고, 액적이 중력의 영향으로 필름을 통해 표면으로 빠르게 통과할 수 있을 만큼 충분히 점도가 작은 것이 바람직하다. 액적을 온전한 상태로 유지하기 위해, 필름을 포함하는 액체는 액적 유체와 실질적으로 또는 완전히 비혼성이어야 한다. 액적 유체는 전형적으로 수성 배지(예를 들어, 물 또는 수성 완충액)이며, 따라서 액체는 바람직하게는 소수성, 예를 들어 플루오로카본(fluorocarbon), 탄화수소(hydrocarbon) 또는 실리콘 오일(silicon oil)이다. 또 다른 실시형태에서, 액체는, 예를 들어 열, 자외선 또는 마이크로파 노출에 의해, 고형 투명 매트릭스가 생성되도록 경화될 수 있는 단량체 또는 중합체이다. 이러한 실시형태는, 이후 액적이 고정되어, 장기간 동안, 기판의 운반, 조작 및 저장이 용이할 수 있는 장점을 갖도록, 매트릭스 내에 포획되는 것이 유리하다.
액적 전달 시스템으로 돌아가서, 이것은, 인접 액적의 병합이 기판 상에 또는 시스템 자체에 의미 있는 정도로 발생하지 않도록, 기판의 작용 표면에 대하여 설계 또는 배열된다. 일 실시형태에서, 액적 전달 시스템은 보어(bore) 및 액적과 유사한 출구 오리피스(exit orifice) 직경을 가지는 노즐을 포함한다. 이러한 실시형태의 한 바람직한 버전에서, 출구 오리피스에서의 노즐의 보어는, 그의 공급액체 및 출구 오리피스로부터의 액적, 적절하게는 미세액적의 이탈을 용이하게 하기 위해, 단면 특성이 원형 이외의 것, 예를 들어 삼각형, 정사각형, 직사각형, 정다각형 형태, 타원형 등이다. 이렇게 함으로써, 특정 환경에서는, 하기에서 기술되는 유형의 담체 배지(carrier medium)를 필요로 하지 않고, 액적 전달 시스템으로부터 액적을 분배할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 액적이 미세액적인 경우, 이들은 모세관 튜브와 같은 미세유체 경로에 의해 출구 오리피스로 적절하게 전달된다. 이러한 미세유체 경로의 내부 표면은 액적의 유착을 방지하기 위해 적절히 소수성으로 처리된다. 액적은 액적 전달 시스템으로부터 나와 액체 필름을 통과하여 중력에 의해 기판 표면 상으로 원하는 위치에 낙하한다. 증발을 더욱 최소화하기 위해, 일 실시형태에서, 액적 전달 시스템의 출구 오리피스가, 실질적 접촉은 하지 않으면서, 액체 필름의 표면에 가능한 한 근접하게 위치하는 것이 바람직하다. 또 다른 실시형태에서, 출구 오리피스는 액체 필름의 표면 아래에 잠기고, 바람직하게는 출구 오리피스의 노즐의 보어는 전술된 바와 같이, 비원형 단면을 갖는다.
상이한 액적을 기판의 다른 고유 위치에 전달하기 위해, 작용 표면 및 액적 전달 시스템은 서로에 대해 이동가능하게 된다. 이를 위해, 이들 두 개의 구성 요소 중 하나는 고정된 다른 하나에 대해 이동가능하거나 또는 둘 모두 이동가능하게 될 수 있다. 적절하게는, 기판은 이동가능하고, 액적 전달 시스템은 고정된다. 적어도 하나의 공간 차원, 바람직하게는 두개의 공간 차원에서 발생하는 이러한 상대 이동은, 작용 표면에 평행한 평면에서 이루어져야 한다. 전형적으로, 이러한 이동은, 하나 이상의 서보 모터 및 마이크로프로세서에 의해 조절되는 액적 전달 시스템 또는 기판을 가지는 이동식 플랫폼과 같은 공지 방법을 이용하여 수행될 것이다. 적절하게는, 마이크로프로세서는, 액적의 순서 및 위치가 추후 검색을 위해 저장될 수 있는 메모리 및 위치 센서를 추가로 가질 것이다.
본 발명의 방법에 이용되는 액적은 적절하게는 미세액적, 즉 50 마이크론 미만, 바람직하게는 20 마이크론 미만의 직경을 가지는 액적이다. 그 형태는 일반적으로, 사용되는 장치의 정확한 설계에 의해 결정될 것이며, 다양한 시간 주기에서, 예를 들어 구형(spherical), 편원 구형(oblate spheroidal) 또는 타원형(ellipsoidal)일 수 있다. 이들 액적의 적어도 일부는 하나 이상의 단일 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이들 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 그 자체가, 하나 이상의 검출가능한 상태의 통상의 표지(label)를 포함할 것이다. 적절하게는, 이들 표지와 관련된 검출 특성은 형광(fluorescence)일 것이며, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착된 하나 이상의 형광단(fluorophore)으로부터 발현될 것이다. 바람직하게는, 액적 유체는 수성 배지이다.
뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드는, 그의 구성성분 단일 뉴클레오타이드의 정렬 스트림을 생성시키기 위한, 분석물의 점진적 가피로인산 분해 또는 외핵 분해(exonucleoytic degradation: 외부핵 분해)를 포함하는 프로세스에 의해, 전구체 폴리뉴클레오타이드 분석물, 예를 들어 자연 발생 또는 합성 DNA 또는 RNA의 단편으로부터 적절하게 생성된다. 일 실시형태에서, 스트림의 단일 뉴클레오타이드의 순서는 분석물의 뉴클레오타이드의 서열에 상응한다. 공정이 DNA 또는 RNA 분석물의 점진적 가피로인산 분해를 포함하는 경우에, 생성된 단일 뉴클레오타이드 스트림은 각각 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 리보뉴클레오시드 트리포스페이트의 스트림을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, DNA 또는 RNA 분석물의 점진적 외부핵 분해가 발생하는 경우, 단일 뉴클레오타이드 스트림은 각각 데옥시뉴클레오시드 모노포스페이트의 스트림 또는 리보뉴클레오시드 모노포스페이트의 스트림을 포함한다. 이들 각각의 경우, 가피로인산 분해 또는 외부핵 분해는, 방출된 뉴클레오타이드가 반응 영역(reaction zone)으로부터 지속적으로 제거될 수 있도록 유동 수성 배지(flowing aqueous medium)에서 적절하게 수행될 수 있다. 다음에, 일 실시형태에서, 개별적인 뉴클레오타이드들을 포함하는 유동 스트림은 비혼성 담체 배지에 현탁된 수성 액적 스트림으로 변환될 수 있으며, 이때 각각의 액적은 비어 있거나 또는 단일 뉴클레오타이드를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 전체 프로세스는 이러한 액적 스트림 내의 단일 뉴클레오타이드의 순서가 분석물에서 이들 뉴클레오타이드의 순서 및 그에 따라 본래의 서열에 상응하도록 수행된다. 그 후, 스트림 내의 각각의 액적은, 예를 들어 액적 유동의 다양한 지점에, 필요한 화학 물질 또는 효소를 도입함으로써, 하나 이상의 화학적 또는 생물적 전환(transformation)에 적용될 수 있다. 이 프로세스의 일 실시형태에서, 각 액적은, 형광단에 의해 다중 표지된 포획 분자를 포함하는 뉴클레오타이드가 포획되도록 처리된다. 여기서, 형광단은 포획 분자가 비사용 상태인 경우 검출되지 않도록 포획 분자에 배치되며, 이는 예를 들어 이에 매우 근접하게 소광 물질(quencher)을 추가적으로 봉입함에 의해 또는 상호 형광단 퀀칭(fluorophore quenching)에 의해 수행된다. 이후, 뉴클레오타이드가 포획되면, '사용된 포획 분자'는, 형광이 검출될 수 있는 표지 유리(labelled free) 뉴클레오타이드의 캐스케이드를 느슨하게 하는 효소 분해에 민감하게 된다. 이 공정의 또 다른 실시형태에서, 각각의 액적은, 본래 포함된 뉴클레오타이드의 표지 앰플리콘 특성을 생성하도록 처리된다. 이 경우, 뉴클레오타이드는 바람직하게는 포획되고, 생성된 사용 포획 분자는, 예를 들어 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction), 재조합 효소 중합 효소 증폭(recombinase polymerase amplification) 또는 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification)을 이용하여 증폭되어, 복수의 해당 앰플리콘이 생성된다. 이후, 각각의 앰플리콘은 분자 비콘(beacon) 등을 이용하여 형광으로 표지될 수 있다. 이러한 접근법의 상세한 내용은, 각 내용이 참조로서 포함되는 위에 나열된 본 발명자들의 다양한 특허 출원에서 찾아 볼 수 있다.
단일 뉴클레오타이드가 데옥시뉴클레오시 트리포스페이트일 때 특히 유용한 실시형태에서, 포획 분자는 i- 및 j-형 올리고뉴클레오타이드의 쌍을 포함하며, 이들 중 적어도 하나는 형광단으로 또는 경우에 따라서는 소광 물질(quencher)로 표지된다. 단일 뉴클레오타이드의 존재 하에, 이들 쌍은, 유사하게 표지된 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 포획 분자로 조립될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 표지 포획 분자는, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)를 이용하여, 인식 자리(recognition site)에서 개열되어(cleaved) 생성물을 생성시키며, 이 생성물은 추후 외부핵 분해를 수행하여, 관련된 형광이 그 후에 검출될 수 있는 포획 분자로부터 유래하는 표지 단일 뉴클레오타이드 캐스케이드를 방출할 수 있다. 일 실시형태에서, 이는 표지된 포획 분자 쌍의 i-형 구성 요소이고, 다른 경우 이는 표지된 j-형 구성 요소이고, 또 다른 경우, 두 구성 요소 모두가 표지된다. 마지막 실시형태에서, 포획 분자는 본 발명자들의 특허 출원 PCT/GB2013/052594(WO 2014/053853으로 공개됨) 및 PCT/GB2013/052595(WO 2014/053854으로 공개됨)의 내용에 개시된 다양한 시스템 중 하나 이상을 포함하며, 이들의 내용 및 특히 포획 분자 구조 특성은 본 명세서에서 참조로서 포함된다.
액적은 담체 배지에 선택적으로 현탁될 수 있다. 담체 배지는 적절하게는 액적 유체와 혼합되지 않는 것이고, 바람직하게는, 액체 필름과 동일한 물질로 이루어지거나 또는 적어도 이들은 혼합될 수 있는 것이다. 일 실시형태에서, 액체 필름은 액적 자체와 동시에, 액적 전달 시스템을 통해 방출되는 담체 배지에 의해 형성된다. 이것의 추가적 실시형태에서, 본래의 담체 배지는, 액적의 분석시, 더욱 유리한 배지, 예를 들어 그 자체가 형광에 덜 민감한 담체에 의해, 액적 전달 시스템 내 또는 상류의 동일한 지점에서 대체될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 분석물의 본래의 단일 뉴클레오타이드를 포함하는 액적은 먼저 작용 표면에 전달된 다음, 전술된 다양한 화학적 및 생물적 전환을 수행하는 데 필요한 다양한 포획 분자, 화학 물질 및 효소에 의해 처리된다. 이러한 경우, 필요한 포획 분자, 화학 물질 및 효소는, 예를 들어 그 내부에 직접 주입에 전달된 액적에 첨가될 수 있거나, 또는 병합이 발생할 수 있는 조건 하에서, 이들 물질을 포함하는 추가의 액적을 이미 전달된 액적에 첨가함으로써 전달된 액적에 첨가될 수 있다.
기판이 액적으로 충전되면, 액적의 내용물이 조사될 때까지 저장될 수 있다. 방사되는 형광을 측정함으로써 내용물이 분석되는 경우, 이것은, 예를 들어 이동식 조립체에 설치된 레이저와 같은 전자기파 방사선의 집중식 공급원을 이용하여 각각의 액적을 차례로 조사한 후, 광자 검출기(photon detector)를 이용하여, 하나 이상의 특정 주파수에서 각각의 형광 방사를 측정함으로써 수행될 수 있다. 이렇게 함으로써, 광자 검출기는, 이후 컴퓨터 분석을 위해 마이크로프로세서 또는 독립 실행형 PC(stand-alone PC)에 제공될 수 있는, 폴리뉴클레오타이드 분석물 서열의 단일 특성을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 방법은,
작용 표면을 가지는 기판;
점진적 가피로인산 분해에 의해, 폴리뉴클레오타이드 분석물로부터 단일 뉴클레오타이드의 정렬 스트림을 생성시키는 단계를 포함하는 미세액적 스트림의 생성 수단;
적어도 일부가 하나 이상의 단일 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 미세액적 스트림을 작용 표면의 해당 고유 위치 상으로 전달시키기 위한 노즐 및 출구 오리피스를 포함하는 액적 전달 시스템;
선택적으로 담체 배지 중의 미세액적 스트림을 상기 액적 전달 시스템의 유입구로 전달시키기 위한 수단; 및
상기 작용 표면의 평면에서, 상기 기판 및 상기 액적 전달 시스템 중 하나 또는 둘 모두를 다른 것에 대해 이동시키기 위한 위치화 메커니즘(locating mechanism)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 저장 장치를 이용하여 유리하게 수행될 수 있다.
적합하게는 본 발명의 장치에 이용되는 기판은 액적 전달 시스템의 출구 오리피스 반대쪽에 병치된 작용 표면을 가지는 평평한 표면, 예를 들어 평평한 시트 또는 플레이트를 포함한다. 바람직하게는 상기 기판 및 그의 작용 표면은 상기에 나열된 하나 이상의 실시형태에 따라 설계되고, 고정식 또는 이동식 플랫폼 상에 적절하게 설치된다. 일 실시형태에서, 작용 표면은 사용 전에, 전술된 바와 같은 액체 필름으로 사전 코팅된다. 유사하게, 액적 전달 시스템은 상기에서 나열된 하나 이상의 실시형태에 따라 설계되고, 고정식 또는 이동식 플랫폼 상에 설치된다. 일 실시형태에서, 기판을 지탱(bearing)하는 플랫폼은 이동식이고, 액적 전달 시스템을 지탱하는 플랫폼은 고정식이다. 또 다른 경우, 기판을 지탱하는 플랫폼은 고정식이고, 액적 전달 시스템을 지탱하는 플랫폼은 이동식이다. 또 다른 실시형태에서, 양 플랫폼은 서로에 대해 이동식이다. 플랫폼 자체는 작용 표면의 평면을 정의하는 직경(dimensions)의 한쪽 또는 양쪽에서 이동가능할 수 있다.
액적 전달 시스템으로 미세액적 스트림을 전달하는 수단은 액적 전달 시스템의 유입구에 직접 또는 간접적으로 부착된 미세유체 경로의 하나 또는 네트워크로 적절하게 이루어진다. 적절하게는, 상기 미세유체 경로는 전술된 유형의 비혼성 담체 배지에 분산된 미세액적 스트림의 형태로, 미세액적을 액적 전달 시스템으로 전달하도록 적용된다. 일 실시형태에서, 미세유체 경로(들)는 제1 영역, 예를 들어 챔버 또는 미세유체 연결 지점에 연결되는 미세유체 튜브, 파이프 등의 네트워크로 이루어지고, 여기서 미세액적은 액적 유체(전형적으로 수성)의 담체 배지로의 배출을 야기할 수 있는 액적 생성 오리피스를 이용하여 생성된다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 제1 영역 외에, 미세유체 경로는 하나 또는 복수의 제2 영역, 예를 들어 챔버(chamber), 미세유체 연결 지점 또는 주입점을 더 포함할 수 있다. 이 경우, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 포획 분자 및 위에 언급된 다양한 화학 물질 및 효소 가운데 임의의 것, 일부 또는 모든 순열(permutation)의 것들이 미세액적 안으로 도입될 수 있고, 이는 예를 들어 액적 유체로의 직접 주입 또는 액적과 하나 이상의 제2 액적 스트립 간 병합의 방법으로 이루어질 수 있다. 상기 미세유체 경로에는 미세액적 스트림의 온도 조절을 가능하게 하기 위해, 그 길이를 따라 다양한 지점에, 하나 이상의 가열기 및/또는 냉각기가 제공될 수 있다. 또한, 담체 배지가 서로 교환될 수 있는 하나 이상의 제3 영역이 제공될 수 있다. 적절하게, 상기 미세유체 경로는 플라스틱으로 제작되며, 미세액적 스트림은 하나 이상의 펌프 수단에 의해 그를 통해 이동된다. 상기 미세유체 경로에는, 플러싱(flushing)에 의해 주기적으로 세척될 수 있도록 하는 보조 미세유체 경로가 제공될 수 있다.
상기 위치화 메커니즘은 적절하게는, 출구 오리피스로부터 미세액적 배출이 야기되기 전에, 기판의 작용 표면과 출구 오리피스를 그 작용 표면의 평면에서 즉시 정확하게 상대위치 조정하는 하나 이상의 모터 및 플랫폼을 포함한다. 적절하게는, 상기 장치에는, 소정의 미세액적이 전달되는 작용 표면 위치를 정의하는 정확한 평면 내 위치를 저장하는 수단이 제공되어 각 데이터 지점은 이후 상황에서 검색(retrieve)될 수 있다. 적절하게는, 상기 위치화 메커니즘은 서보 어시스트로 동작(servo-assisted)한다.
일 실시형태에서, 상기 장치는 액적 전달 시스템과, 기판의 수용 및 배출을 위한 챔버를 수용하는 하우징을 포함할 수 있다. 상기 장치는, 예를 들어 카트리지 및/또는 캐러셀 구성(carousel arrangement)에 의해, 챔버 내외로 일련의 기판을 순차적으로 도입 및 배출시키기 위한 수단을 선택적으로 더 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 장치는 또한 이동식 조립체에 설치된 전자기파 방사선의 공급원 및 광자 검출기를 포함하는 분석 유닛을 선택적으로 포함할 수 있다. 또 다른 경우, 상기 장치는 또한, 하나 이상의 액적 전달 시스템, 전자기파 방사선(예를 들어, 레이저) 공급원 및 광자 검출기에 연결된 마이크로프로세서를 선택적으로 포함할 수 있다. 상기 액적 전달 시스템은 전술된 공정 중 하나를 이용하여, 액적 시퀀서에 적절하게 연결되거나 또는 연결될 수 있다. 일 실시형태에서, 미세액적 생성 수단은 칩(chip) 상에서 수행되고, 그의 생성물은 기판 상으로의 프린팅을 위해, 액적 전달 시스템으로 미세유체에 의해 전달된다.
상기 방법은 지금부터 다음 실시예를 참조하면서 기술된다.
도 1은, 형광 표지된 앰플리콘의 생성을 위해, 각각이 뉴클레오타이드를 포함하는 미세액적의 포획 시스템과의 반응에 적용되는 시퀀서를 개략적으로 도시한다.
도 2는 본 발명의 방법을 이용한 액적 저장장치의 단면도를 도시한다.
각각이 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 미세액적 스트림의 생성
인간 DNA로부터 유래된 100 개의 뉴클레오타이드 염기 폴리뉴클레오타이드 분석물의 점진적 가피로인산 분해에 의해 얻어진 단일 뉴클레오타이드(데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트)의 스트림을 포함하는 수성 배지(1)가 PDMS 중합체로부터 제작된 10 마이크론 직경의 미세유체 튜브를 통해 유동된다. 가피로인산 분해 반응 자체는, 숙시닐 가교(succinyl bridge) 수단에 의해, 분석물이 미리 부착된 유리 마이크로 비드 상에서, 각각의 피로인산나트륨 및 염화 마그네슘 리터 당 2 밀리몰 및 Taq Pol을 포함하는 72℃의 수성 완충(pH 8) 반응 배지 스트림을 통과함으로써 수행된다. 마이크로 비드의 하류(downstream)인 수성 배지(1)의 뉴클레오타이드의 순서는 분석물의 서열에 상응한다. 수성 배지(1)는 액적 헤드(2)로부터 하나 이상의 비혼성 라이트 실리콘 오일(light silicone oil, 4)의 스트림과 접촉되는 제1 챔버(3)로 나타난다. 이러한 스트림의 속도(velocity)는 격렬한 혼합을 회피하고, 각각이 대략 8 마이크론의 직경을 가지는 오일에 현탁된 수성 구형 액적(5)이 생성될 수 있도록 선택된다. 전형적으로, 인접 충전 액적 사이에, 내부가 비어 있는 것이 평균 10 개 존재하도록, 속도(rate)를 조정한다. 그 후, 액적(5)의 스트림은, 제2 액적 헤드(8)의 수단에 의해, 5마이크론의 수성 구형 액적(7)의 제2 스트림이 또한 공급되는 제2 챔버(6)로 동일한 직경의 제2 미세유체 튜브를 따라 초당 1000개의 액적 속도로 운반된다. 액적(5, 7)은 순차적 방식으로 병합되어, 직경이 대략 9마이크론인 확대된 수성 액적(9)이 형성되도록 한다. 액적(7) 각각은 피로포스파타아제(pyrophosphatase)를 포함한다. 액적(5) 각각에 존재하는 임의의 잔여 피로포스페이트 음이온(pyrophosphate anion)은 파괴된다.
그후, 스트림(9)은, 또한 상응하는 액적 헤드(12)를 통해 공급되는 5마이크론의 수성 구형 액적(11)의 제3 스트림과 이들 액적이 접촉되는 제3 챔버(10)로 미세유체 튜브를 통해 동일한 속도로 운반된다. 스트림(9) 각각이 챔버(6, 10) 사이를 이동하는 데 걸리는 시간은 약 2분이다.
그후, 액적(9, 11)은 챔버(10)에서 병합되어, 액적(13, 대략 10마이크론 직경)이 생성된다. 액적(11) 각각은, 4개의 제1 j-형 올리고뉴클레오타이드 및 상응하는 4개의 제2 i-형 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 쌍을 포함하는 포획 시스템 및 중온 리가아제(mesophilic ligase)를 포함한다. 각각의 제1 j-형 올리고뉴클레오타이드는 60 개의 뉴클레오타이드 염기 길이이며, 5' 말단으로부터 45번째 뉴클레오타이드 염기 부근에서, 60 개의 뉴클레오타이드 염기인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 전구체의 폴딩(folding)에 의한, 3 개의 뉴클레오타이드 단일 가닥 루프, 12 개의 뉴클레오타이드 염기 쌍의 이중 가닥 영역 및 33 개의 뉴클레오타이드 염기의 단일 가닥 영역(각각의 4 개의 제1 올리고뉴클레오타이드와 상이함)을 생성함으로써 마련된다. 각각의 이들 4 개의 제1 올리고뉴클레오타이드는 또한 DNA의 4 종의 특유의 뉴클레오타이드 염기(즉, A, T, G 및 C)의 상이한 33번째 염기(단일 가닥 말단으로부터 측정) 특성을 갖는다. 4 개의 다른 제2 i-형 올리고뉴클레오타이드는 각각 28 개의 뉴클레오타이드 염기 길이이며, 제1 올리고뉴클레오타이드 쌍의 4번째 및 32번째 뉴클레오타이드 염기에 의해 정의되는 단일 가닥 영역 부분에 상보적인 상이한 서열을 갖는다.
스트림(13)은, 액적 헤드(16)를 통해 또한 공급되는 5마이크론의 수성 구형 액적(15)의 제4 스트림과의 병합이 일어나는 제3 챔버(14)로 진입되기 전에, 리가아제의 비활성화(10 내지 20분)가 일어나는 핫스팟(hot spot)을 통과한지 30분 후 미세유체 튜브를 통해 동일한 속도로 운반된다. 수성 구형 액적(15) 각각은 스트림(13)에서 생성될 수 있는 4개의 상이한 포획 분자로부터 생성될 수 있는 각각의 4가지 유형의 앰플리콘에 대해 선택적인 4개의 상이한 분자 비콘, DNA의 4개의 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트 특성, Taq Pol 효소 및 각각의 제2 올리고뉴클레오타이드에 대해 선택적인 4 개의 상이한 프라이머 쌍을 포함한다. 수성 구형 액적(15)은 중합 효소 연쇄 반응의 수행에 전형적으로 사용되는 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 이렇게 형성된 병합된 미세액적(17)의 스트림은, 중합 효소 연쇄 반응에 의해, 압축 해제된 포획 분자의 증폭이 발생하는 시간 동안, 60 내지 95℃의 20 내지 30회의 열 사이클(thermal cycle: 분당 약 1 사이클)에 적용된다. 이 기간이 종료되면, 미세액적(17)은 저장을 위해 옮겨진다.
미세액적의 저장
미세액적(17)은, 미세액적(21)이 차례로 출현하는 출구 오리피스(20)로 유도되는 실란화 모세관 보어(silanised capillary bore, 19)가 제공되는 액적 전달 시스템(18)으로 도입된다. 기판(22)은, 작용 표면(operative surface)이 일반적인 반구형 웰(well, 23)의 2차원 어레이로 패턴화된 유리 시트를 포함한다. 웰(23)의 내부 표면은 플라즈마 처리에 의해 사전에 에칭된다. 기판(22)은 라이트 실리콘 오일(24)의 박막으로 그 작용 표면이 코팅되고, 다른 쪽 표면은 광 반사 금속 층(25)으로 코팅된다. 기판(22)은 작용 표면에 평행한 평면에서 마이크로프로세서 및 서보 모터(미도시)에 의해, 이동가능한 플랫폼(26) 상에 설치된다. 사용시, 미세액적(21) 각각은 플랫폼(26)의 이동에 의해 설정되는 고유의 위치에서, 출구 오리피스(20)로부터 순차적으로 나타나고, 중력 낙하하여 라이트 실리콘 오일(24)을 통해 웰(23)에 들어가 오일 중에 저장된다. 미세액적의 분석을 위한 시간이 도래하면, 각 웰은 컴퓨터(미도시)에 연결된 광검출기에 의해 측정되는 임의의 반사 형광 및 레이저를 이용하여 차례로 조광된다.

Claims (26)

  1. 적어도 일부가 하나 이상의 단일 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 및 액적 유체를 포함하는 액적 스트림(stream of droplets)의 저장 방법으로서, 해당 고유 위치에서 기판(substrate)의 표면 상에 각각의 액적을 순차적으로 도입시키는 단계를 특징으로 하고, 또한, 상기 액적 스트림이, 점진적 가피로인산 분해(pyrophosphorolysis)에 의해 분석물로부터 뉴클레오타이드의 정렬 스트림을 생성시키고, 해당 액적에서 각각의 뉴클레오타이드를 포획하는 단계를 포함하는 프로세스에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액적이, 이들의 병합을 방지하는 조건 하에서, 상기 표면 상에 도입되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 기판의 상기 표면에, 액적이 도입되는 복수의 웰(well), 홈(groove), 채널(channel), 핌플(pimple), 함몰부(dimple), 구멍(hole), 기둥(pillar) 및 기타 돌출부(protuberance)가 제공되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면이, 상기 액적 유체와 혼합되지 않는 액체 필름으로 코팅되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 필름을 포함하는 상기 액체가 상기 액적 유체보다 저밀도인 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 필름을 포함하는 상기 액체의 점성(viscosity)이 이를 통해 상기 액적이 상기 기판의 상기 표면 상으로 이동되도록 하는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 액적 유체가 물 또는 수성 완충액이고, 상기 필름을 포함하는 상기 액체가 탄화불소(flurorocarbon) 오일, 탄화수소(hydrocarbon) 오일, 실리콘 오일 또는, 열 또는 자외선 방사의 작용에 의해 투명 고형 매트릭스를 형성하도록 경화될 수 있는 액체 단량체(monomer) 또는 중합체(polymer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 기판의 상기 표면의 적어도 일부가 다른 부분보다 상대적으로 더욱 친수성이 되도록 하는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  9. 제1항에 있어서, 액적 전달 시스템을 사용하여 상기 액적이 상기 기판의 표면 상으로 도입되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 액적 전달 시스템이, 단면 형상이 원형 이외의 것인 출구 오리피스를 갖는 노즐을 포함하는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 액적 전달 시스템 및 상기 기판의 표면이 적어도 하나의 공간 차원(spatial dimension)에서 서로에 대해 상대적으로 이동 가능한 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 액적 전달 시스템 및 상기 기판의 표면의 상대 이동이 마이크로프로세서(microprocessor) 및 서보 보조 메커니즘(servo-assisted mechanism)에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 마이크로프로세서에 각각의 액적의 순서 및 위치를 저장하기 위한 메모리가 제공되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 액적은, 적어도 일부가 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 액적 스트림을 포함하는 담체 배지(carrier medium) 형태로 상기 액적 전달 시스템으로 전달되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표면이, 상기 액적 유체와 혼합되지 않는 액체 필름으로 코팅되되,
    상기 담체 배지와, 상기 필름을 포함하는 상기 액체가 동일한 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 액적에 포함되는 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드가 하나 이상의 형광단(fluorophore)에 의해 표지되는(labelled) 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 액적 스트림이 전구체 폴리뉴클레오타이드 분석물의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 순서의 뉴클레오타이드를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 프로세스는, 비활성 상태에서, 형광단으로 다중 표지된 포획 분자를 이용하여 뉴클레오타이드를 포획하고, 포획 후, 효소 분해에 적용되도록 하기 위해, 각각의 액적을 처리하는 추가적 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 프로세스는, 포함되는 뉴클레오타이드의 표지 앰플리콘(labelled amplicon) 특성의 생성을 위해, 각각의 액적을 처리하는 추가적 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 앰플리콘이, 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction), 재조합 효소 중합 효소 증폭(recombinase polymerase amplification) 및 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, (1) 상기 액적의 적어도 일부가, 분석물로부터 유래하는 단일 뉴클레오타이드를 포함하고, (2) 상기 액적이 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 추가적 단계 중 적어도 하나의 수행 전에, 상기 기판의 작용 표면으로 전달되는 것을 특징으로 하는 액적 스트림의 저장 방법.
  22. a. 작용 표면을 가지는 기판;
    b. 점진적 가피로인산 분해에 의해, 폴리뉴클레오타이드 분석물로부터 단일 뉴클레오타이드의 정렬 스트림을 생성시키는 단계를 포함하는 미세액적 스트림의 생성 수단;
    c. 적어도 일부가 하나 이상의 단일 뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 미세액적 스트림을 작용 표면의 해당 고유 위치 상으로 전달시키기 위한 노즐 및 출구 오리피스를 포함하는 액적 전달 시스템;
    d. 선택적으로 담체 배지 중의 미세액적 스트림을 상기 액적 전달 시스템의 유입구로 전달시키기 위한 수단; 및
    e. 상기 작용 표면의 평면에서, 상기 기판 및 상기 액적 전달 시스템 중 하나 또는 둘 모두를 다른 것에 대해 이동시키기 위한 위치화 메커니즘(locating mechanism)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 저장 장치.
  23. 제22항에 있어서, 미세액적 스트림을 액적 전달 시스템에 전달시키기 위한 수단이 미세유체 경로(microfluidic path)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 저장 장치.
  24. 제23항에 있어서, 제공된 미세액적이 전달되는 작용 표면을 정의하는 평면의 정확한 위치를 저장하기 위한 수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 저장 장치.
  25. 제22항에 있어서, 상기 작용 표면이 사용 전에 액체 필름에 의해 사전 코팅되는 것을 특징으로 하는 미세액적 저장 장치.
  26. 제22항에 있어서, 상기 액적 전달 시스템과, 상기 기판의 수용 및 배출을 위한 챔버(chamber)를 수용하는 하우징(housing)을 포함하는 미세액적 저장 장치.
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