CN105518152B - 液滴储存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种储存液滴流的方法，所述液滴的至少一些包含一种或多种单核苷酸和/或寡核苷酸以及液滴流体。其特征在于，在相应的唯一位置将每个液滴依次引入至基板的表面上的步骤，并且其特征还在于通过下列过程制备所述液滴流：所述过程包括由分析物通过逐步焦磷酸解或核酸外切生成有序的核苷酸流并且液滴将每个核苷酸捕获在相应液滴中的步骤。所述方法可以有利地与微液滴测序仪和分析单元一起使用，其中使用荧光光谱法确定前体多核苷酸分析物中核苷酸的序列。还描述了用于执行所述方法的设备。

Description

液滴储存方法

本发明涉及在基板表面上储存液滴的方法。具体地，其涉及各自含有一个或多个单核苷酸或寡核苷酸的液滴的储存。所述方法可以用于非常大量的微液滴的储存和表征，如可以在来源于天然存在的或合成的DNA或RNA的多核苷酸分析物的测序中生成的。

遗传物质的下一代测序已经总体上对生物科学并且由其是医学产生了显著影响，因为测序的单位成本随着越来越快的测序机器的上市而降低。因此，在一种这样的机器中，通过首先分解为多个较小的多核苷酸片段将双链DNA分析物间接测序，所述多核苷酸片段中的每一个首先在一条链的两端腺苷酸化，从而单链第一寡核苷酸可以通过与未配对的腺嘌呤碱基杂交结合至其互补体的两端。之后对由此得到处理的片段进行尺寸选择并且捕获在涂布有结合的单链第二寡核苷酸的表面上，所述第二寡核苷酸本身是与第一寡核苷酸的序列互补体，从而实际上可以通过进一步杂交形成表面结合的双链片段的文库。在随后的聚集步骤中，之后在表面上使用延伸和等温桥连反应将这些文库成分克隆扩增数百万次以利用未使用的第二寡核苷酸。实际上，这产生了致密浓度的通过其链中的一个结合至表面的多核苷酸片段。之后移除每个片段的未结合的互补链以留下结合的单链片段准备用于测序。在测序阶段中，引发这些单链片段中的每一个，并且其互补链使用聚合酶链式反应和双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)形式的DNA的四种特征性核苷酸碱基的混合物通过延伸重新形成。每种ddNTP类型是用在不同波长发荧光的不同荧光团标记的部分末端封闭的。之后延伸反应采取三步骤循环的形式；首先相关ddNTP结合至生长链；其次，通过照射样品并且检测荧光的波长来确认其含有的核苷酸碱基以及最终移除末端封闭及其相关的荧光团以允许接下来的延伸事件发生。通过这种方式，可以逐个碱基地构建互补链的序列。将理解的是，尽管这个途径可以是高度自动化的并且可以生成高准确性的序列读取，其操作速度受延伸循环速率的限制。因此，在实践中，技术的使用倾向于包括平行加工相对短的多核苷酸片段和组装来自由其得到的各种读取的整个序列。这本身可能会导致计算的复杂性和潜在的误差引入。

最近已经做出努力，开发备选的直接测序方法。例如，WO 2009/030953公开了一种新型快速测序仪，其中尤其是单链或双链多核苷酸样品(例如，天然存在的RNA或DNA)中的核苷酸碱基或碱基对的序列通过将其转运通过纳米孔基板而被读取，所述纳米孔基板设置有在纳米孔的出口内或附近并置的等离子纳米结构(plasmonic nanostructure)。在这种设备中，等离子纳米结构限定了检测窗口(基本上为电磁场)，在其中通过与入射光的相互作用以特征性的方式依次诱导每个核苷酸碱基(任选标记的)发荧光或拉曼散射光子。之后远程检测由此生成的光子，放大并且转换为数据流，其信息内容是与多核苷酸相关的核苷酸碱基序列特有的。这种序列之后可以使用在编程至与其整合的微处理器中或与其连接的辅助计算设备中的相应软件中包含的计算算法来从数据流中找回。在例如Adv.Mat.2004,16(19)pp.1685-1706中，可以发现使用等离子纳米结构及其相关的共振特征的进一步背景。

例如，在US6627067、US6267872和US6746594中描述了另一种用于快速测序多核苷酸的装置。以其最简单的形式，这种设备采用电极代替等离子纳米结构来限定整个基板中或者在纳米孔的出口中或周围的检测窗口。之后在整个电极中施加电势差并且，并且作为时间的函数测量在其之间流动的离子介质的电特征的变化，所述变化是多核苷酸和相关的电解质通过纳米孔的电泳转运的结果。在这种装置中，在各个单独的核苷酸碱基通过检测窗口时，它们连续地阻塞和开启所述检测窗，引起产生电流或电阻率的特征性波动的‘事件’。然后，利用这些波动来生成适当的数据流，用于如上所述的分析。

稳定的液滴流，尤其是微液滴流的产生，是已经具有分子生物学应用的另一个技术发展领域。例如，US7708949公开了用于在油中生成稳定水滴的新型微流体方法，而例如US2011/0250597描述了利用这种技术生成含有核酸模板(通常为多核苷酸DNA或RNA片段)和使得模板能够利用聚合酶链式反应扩增的多个引物对的微液滴。涉及所述领域的其他专利申请通常包括JP2004/290977、JP2004/351417、US2012/0122714、US2011/0000560、US2010/01376163、US2010/0022414和US2008/0003142。

US 6277334描述了其中在通过设置有反应位点的多孔反应支持物之后将第一和第二液滴引入至反应孔中的装置，在所述反应位点处可以引起在第一和第二液滴中含有的核苷酸之间发生反应。然而，没有提到由液滴流体生成液滴流和生成来源于前体多核苷酸分析物的有序的单核苷酸流。

US 2004/0197817涉及用于在基板上通过将含有多核苷酸的液滴沉积至基板上来制造多核苷酸阵列的装置。这种装置同样不涉及出于储存测序信息的目的而印刷包含液滴流体的液滴流和来源于前体多核苷酸分析物的有序的单核苷酸流。

US 2010/0015614描述了用于使用微液滴聚合酶链式反应扩增接着毛细管电泳分析，基于芯片分选、扩增和表征生物材料的装置。所述装置包括平面基板，所述平面基板包括一个或多个使用含有例如来源于细菌细胞或病毒的裂解物的微液滴填充的微反应器。然而，没有教导由液滴流体生成液滴流和生成来源于前体多核苷酸分析物的有序的单核苷酸流。

EP 1933138涉及用于通过使用液滴印刷法在其上沉积多个常规生物探针(寡核苷酸等)来制造生物测定基板阵列的方法。再一次地，没有教导由液滴流体生成液滴流和生成来源于前体多核苷酸分析物的有序的单核苷酸流。

最近，在我们之前的申请GB1217772.1、GB1306444.9和GB1306445.6中，我们已经描述了新型的测序方法，其涉及逐步焦磷酸解或核酸外切多核苷酸以生成有序的核苷酸流，其可以被逐个捕获至相应的微液滴流中。之后，可以对每个液滴进行化学和/或酶操作以显示其最初含有的特定核苷酸。然而，数百万个可能通过这种方法生成的液滴的分析经常需要将液滴储存一段时间，与此同时在其中发生的各种化学和/或生物反应进行到完成。之前，出于储存目的，我们已经公开了液滴流流过的腔室，其适用于以严格顺序捕获并保持液滴。然而，尽管当所分析的多核苷酸相对短时，这种腔室是适合的，而当应用于较长的多核苷酸时，其使用变得有问题，因为大量液滴迅速导致不希望的腔室中背压的积累，进而限制了微液滴流的流动。

我们因此已经开发了备选方法，其实际上涉及在基板的表面上的离散的位置储存液滴，在那里可以将它们维持直到它们准备用于分析。因此，根据本发明，提供一种储存液滴流的方法，所述液滴的至少一些包含一个或多个单核苷酸和/或寡核苷酸以及液滴流体，其特征在于在相应的唯一位置将每个液滴依次引入至基板的表面上的步骤，并且其特征还在于通过下列过程制备所述液滴流：所述过程包括由分析物通过逐步焦磷酸解或核酸外切生成有序的核苷酸流并且将每个核苷酸捕获在相应液滴中的步骤。

在其上储存液滴的基板原则上可以由包括玻璃、聚合物、复合材料和金属在内的任何惰性材料制成。在一个实施方案中，基板是尤其是在可见光或近紫外光的频率处对电磁辐射透明的，例如玻璃或透明塑料。在另一实施方案中，其能够反射这种电磁辐射。在又一个实施方案中，基板是在液滴递送系统下方并置的具有操作表面的片材。在这种实施方案中，紧接着在液滴递送系统下方的表面可以是平面的或无轮廓的(un-profiled)或设置有如沟槽、通道、孔、凸起、凹陷、孔洞、柱和其他隆起的结构，其被调整或成形以促进液滴的保持。在这种的一个实例中，在通常布置为均匀阵列的操作表面中该结构包括多个孔、沟槽或通道。这些孔、沟槽或通道可以是任何形状的，只要它们足够大以至少部分容纳液滴并且使得它们在与操作表面平行的方向上不可移动。在一个实施方案中，孔基本上是半球形的并且使它们的内表面涂布有反光材料。

在另一个优选的实施方案中，对基板的操作表面的部分进行化学或物理处理以提高液滴与其的粘着性。在一个实例中，这可以通过使得表面的部分亲水或比其余部分相对更亲水而实现；例如，在基板是玻璃片材的情况下，通过等离子体处理或侵蚀表面以在将要递送液滴的位置处生成表面羟基或氢氧根离子基团。在另一个实施方案中，处理操作表面的一部分以使它们疏水或比其他部分相对更疏水。因此，操作表面可以包括在另外的疏水表面上的亲水性区域的模式或阵列。在这种情况中，亲水或相对更亲水的部分可以对应于上述表面结构中的一些或全部。

在另一个实例中，操作表面的一部分是化学官能化的或者设置有使它们具有粘性的亲水聚合物涂层。在这个实施方案中，涂层适宜地为对上述类型的电磁辐射透明或反射上述类型的电磁辐射。在另一个优选的实施方案中，操作表面设置有上述类型的结构并且对这些结构中的至少一些进行选择性地化学或物理处理以仅在这些目标位置提高液滴粘着性。

当涂覆于操作表面时，并且在对其涂覆时的某种程度上来说，液滴具有蒸发的倾向。当采用微液滴时这是特别有问题的，因为它们的蒸发表面积与内部容积的比较高。因此，尽管可以将液滴直接涂覆至基板的未涂布的操作表面，但在某些情况下将会优选的是，在环境温度用基本上不挥发的液体的膜涂布操作表面。适宜地，这种膜的厚度应当大于液滴的直径，从而在其储存的最终状态下，液滴被液体完全包封。为了促进，优选的是，液体比液滴流体密度低并且具有足够低的粘度以使液滴在重力的影响下迅速通过膜到表面上。为了保持液滴的完整性，包含膜的液体应当与液滴流体基本上或完全不可溶混。因为液滴流体通常是水性介质(例如，水或水性缓冲液)，液体因此优选为疏水性的液体；例如氟代烃、烃或硅油。在另一个实施方案中，液体是可以固化形成固体透明基质的单体或聚合物；例如通过暴露于热、紫外线或微波辐射。这个实施方案具有以下优点：液滴之后被捕获在基质中，使其不可移动并且使得基板容易运输、操作和长期储存。

转到液滴递送系统，这是相对于基板的操作表面设计或布置，从而在系统本身或在基板上均不发生任何可察觉程度的相邻液滴的聚结。在一个实施方案中，液滴递送系统包括具有与液滴的直径相似的孔和出口孔直径的喷嘴。在这个实施方案的一个优选的方式中，喷嘴在出口孔处的孔横截面轮廓是除圆形之外，例如三角形、正方形、矩形、规则多边形的形状、椭圆体等，从而促进液滴(适合地为微液滴)从出口孔和向其中供给的液体中的分离(disengagement)。通过这种方式，在某些情况下可以在不需要以下所述类型的载体介质的情况下分配来自液滴递送系统的液滴。在另一个实施方案中并且在液滴是微液滴的情况下，通过微流体通路如毛细管道将它们适宜地递送至出口孔。适宜地使这个微流体通路的内表面疏水以防止液滴与其粘着。在从液滴递送系统中排出之后，液滴在重力作用下经由液体膜落到基板的表面上的所需位置。为了进一步使蒸发最小化，在一个实施方案中，优选的是，液滴递送系统的出口孔位于与液体膜的表面尽可能地接近而实际上不与其接触。在另一个实施方案中，出口孔浸入在液体膜的表面以下并且优选地喷嘴在出口孔处的孔具有如上所述的非圆形的横截面。

为了使得不同的液滴能够递送至基板上不同的唯一位置，将操作表面和液滴递送系统调整为相对于彼此可移动。为了实现此目的，这两个组件之一可以相对于固定的另一个移动或者可以使二者为可移动的。适宜地，基板是可移动的并且液滴递送系统是固定的。在至少一个、优选两个空间维度中发生的这种相对运动应当在与操作表面平行的平面中发生。通常将会使用已知方法如携带基板的可移动平台或由一个或多个伺服电动机和微处理器控制的液滴递送系统进行这种移动。适宜地，微处理器将会额外具有位置传感器和在其中可以储存液滴的顺序和位置以用于之后找回(retrieval)的存储器。

在目前的方法中采用的液滴适宜地为微液滴，即具有小于50、优选小于20微米的直径的液滴。它们的形状通常将会通过所使用的装置的确切设计来确定并且在各个时间段可以是例如球体、扁球体或椭圆体。这些液滴中的至少一些可以含有一个或多个单核苷酸和/或寡核苷酸。通常这些核苷酸或寡核苷酸本身将会包含一个或多个可检测状态的常见标记。适宜地，与这些标记相关的检测性质将会是荧光并且将会归因于与核苷酸或寡核苷酸连接的一个或多个荧光团。优选地，液滴流体是水性介质。

适宜地，由前体多核苷酸分析物，例如天然存在的或合成的DNA或RNA的片段，通过包括逐步焦磷酸解或核酸外切降解(核酸外切)分析物以生成其构成性单核苷酸的有序流的过程，生成核苷酸和寡核苷酸。在一个实施方案中，流中单核苷酸的排序对应于分析物中核苷酸的序列。在另一实施方案中，在所述过程包括DNA或RNA分析物的逐步焦磷酸解的情况下，所生成的单核苷酸流分别包含脱氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸的流。在又一个实施方案中，在已经发生DNA或RNA分析物的逐步核酸外切的情况下，单核苷酸流分别包含脱氧核糖核苷单磷酸的流或核糖核苷单磷酸的流。在这些情况中的每一个中，可以适宜地在流动水性介质中进行焦磷酸解或核酸外切，从而从反应区中连续地移除所释放的核苷酸。之后，并且在一个实施方案中，可以将含有单独核苷酸的流动的流转化为在不可溶混载体介质中悬浮的水性液滴的流；每个液滴是空的或者含有单一核苷酸。在另一个实施方案中，进行整个过程从而在这个液滴流中的单核苷酸的排序对应于分析物中这些核苷酸的排序和由此的原始顺序。之后，可以对流中的每个液滴进行一个或多个化学或生物转化；例如通过在液滴流中的各个点向其中引入所需的化学物质或酶。在这个过程的一个实施方案中，处理每个液滴以用被荧光团多重标记的捕获分子捕获其含有的核苷酸。在这里，将荧光团置于捕获分子上从而当捕获分子在未使用状态下时它们是不可检测的；例如通过额外包含与其紧密靠近的猝灭剂或者通过相互荧光团猝灭。之后，当已经捕获核苷酸时，‘所使用的捕获分子’变得对酶降解敏感，所述酶降解释放级联的标记的游离核苷酸，其相关荧光之后可以被检测。在所述过程的另一个实施方案中，处理每个液滴以形成其最初含有的核苷酸特有的标记的扩增子。在这种情况下，优选捕获核苷酸，并且使用例如聚合酶链式反应、重组酶聚合酶扩增或滚环扩增来扩增所得到的使用的捕获分子以生成多个相应的扩增子。之后，可以使用分子信标(molecular beacon)等将扩增子中的每一个荧光标记。可以在以上列出的我们的各种专利申请中发现关于这些途径的另外的详情，其中的每一个的主旨通过引用结合。

在一个具体的实施方案中，尤其是当单核苷酸是脱氧核糖核苷三磷酸时可用的，捕获分子包含一对i形和j形寡核苷酸，其至少一种被一个或多个荧光团和任选的一个或多个猝灭剂标记。在单一核苷酸的存在下，可以将这些对组装为被同样标记的双链寡核苷酸捕获的分子。在另一个实施方案中，在识别位点使用例如限制性核酸内切酶切割这种标记的被捕获的分子以得到产物，所述产物进而可以经历随后的核酸外切以释放级联的来源于捕获的分子的标记单核苷酸，其相关荧光之后可以被检测。在一个实施方案中，被标记的是捕获分子的i形组分，在另一个实施方案中，j形组分是被标记的，并且在又一个实施方案中，两种组分均是被标记的。在最终的实施方案中，捕获分子包含在我们的专利申请PCT/GB2013/052594(作为WO 2014/053853公布)和PCT/GB2013/052595(作为WO 2014/053854公布)中公开的各种体系中的一种或多种，其内容并且尤其是捕获分子结构特征通过引用结合在本文中。

液滴可以任选地悬浮在载体介质中。载体介质适宜地为与液滴流体不可溶混的载体介质并且优选包含与液体膜相同的材料或者至少它们是可溶混的。在一个实施方案中，液体膜由与液滴本身同时经由液滴递送系统排出的载体介质形成。在这个的另一个实施方案中，可以在液滴递送系统中或上游的一些点用当分析液滴时更有利的介质代替原始的载体介质；例如本身对荧光较不敏感的载体。

在另一个实施方案中，首先将含有来自多核苷酸分析物的原始单核苷酸的液滴递送至操作表面并且之后用实现上述各种化学和生物转化所需的各种捕获分子、化学物质和酶处理。在这种情况下，可以通过例如向其中直接注射和/或在可以出现聚结的条件下将另外的含有这些物质的液滴加入至已经递送的液滴上来加入所需的捕获分子、化学物质和酶以递送液滴。

一旦已经用液滴填充基板，即可以将其储存直到将要研究液滴的内容物时。在将要通过测量它们发射的荧光来分析内容物的情况下，这可以通过以下方式完成：例如进而用聚焦的电磁辐射源(例如，来自安装在可移动组件上的激光器)照射每个液滴，并且之后使用光子检测器测量在一个或多个特征频率的荧光发射。通过这种方式，光子检测器可以生成多核苷酸分析物的序列特有的信号，之后可以将其供给至微处理器或独立运行的PC用于计算分析。

可以使用微液滴储存设备有利地执行本发明的方法，所述液滴储存设备特征在于包括：

·具有操作表面的基板；

·用于生成微液滴流的工具，所述生成微液滴流包括由多核苷酸分析物通过逐步焦磷酸解或核酸外切生成有序的单核苷酸流的步骤；

·包括喷嘴和出口孔的用于将微液滴流递送至所述操作表面上的相应唯一位置上的液滴递送系统，所述微液滴的至少一些含有一个或多个核苷酸和/或寡核苷酸；

·用于将任选地在载体介质中的所述微液滴流递送至所述液滴递送系统的入口的工具以及

·用于在所述操作表面的平面上将所述基板和所述液滴递送系统之一或二者相对彼此移动的定位机构。

适宜地，在本发明的设备中使用的基板包括具有与液滴递送系统的出口孔相对并置的操作表面的平坦表面，例如平坦片材或板。优选地，基板及其操作表面根据以上列出的实施方案中的一个或多个设计并且适宜地安装在固定的或可移动的平台上。在一个实施方案中，操作表面在使用之前预涂布有如上所述的液体膜。同样地，液滴递送系统根据以上列出的实施方案中的一个或多个设计并且安装在固定的或可移动的平台上。在一个实施方案中，携带基板的平台是可移动的并且携带液滴递送系统的平台是固定的。在另一实施方案中，携带基板的平台是固定的并且携带液滴递送系统的平台是可移动的。在又一个实施方案中，两个平台均是相对于彼此可移动的。平台本身可以是在限定操作表面的平面的维度之一或二者中可移动的。

用于将微液滴流递送至液滴递送系统的工具适宜地包含与液滴递送系统的入口直接或间接连接的微流体路径中的一个或网络。适宜地，微流体路径适用于将微液滴以分散在上述类型的不可溶混的载体介质中的微液滴的流的形式递送至液滴递送系统。在一个实施方案中，微流体路径包含与第一区域连接的微流体管、管道等的网络；例如其中借助液滴生成孔形成微液滴的腔室或微流体结(microfluidic junction)，在所述液滴生成孔中可以使得液滴流体(通常为水性的)流出至载体介质中。在另一个实施方案中，并且除了这个第一区域之外，微流体路径还可以包含一个或多个第二区域，例如，一个或多个腔室、微流体结或注射点，其中可以将以上提到的核苷酸、寡核苷酸、一个或多个捕获分子和各种化学物质和酶中的任何、一些或全部排列引入至微液滴中：例如通过向液滴流体或与一个或多个第二微液滴流的液滴聚结中直接注射。微流体通路可以在沿其长度的多个点处设置有一个或多个加热器和/或冷却器以允许微液滴流的温度控制。其还可以设置有一个或多个第三区域，其中可以将载体介质与另一种载体介质交换。适宜地，以塑料制造微流体通路并且微液滴流借助一个或多个泵通过其移动。微流体通路可以设置有辅助微流体通路以使其能够通过冲洗周期性地清洁。

定位机构适宜地包括平台和一个或多个电动机，所述电动机使得基板的操作表面和出口孔能够在操作表面的平面中在使微液滴从后者中流出之前立刻相对于彼此精确定位。适宜地，所述设备设置有储存所述平面中限定在其处递送给定微液滴的所述操作表面的确切位置的工具，从而可以在随后的场合找回每个数据点。适宜地，定位机构是伺服辅助。

在一个实施方案中，这个设备可以包括容纳所述液滴递送系统和适用于接收和弹出所述基板的腔室的外壳。所述设备还可以任选地包括用于将一系列底物依次引入至腔室或从腔室中弹出的工具；例如借助筒和/或转盘式(carousel)构造。在另一个实施方案中，所述设备还可以任选地包括分析单元，所述分析单元包括安装在可移动组件上的电磁辐射源和光子检测器。在又一个实施方案中，所述设备还可以任选地包括与液滴递送系统、电磁辐射源(例如，激光器)和光子检测器中的一个或多个连接的微处理器。液滴递送系统适宜地与采用上述工艺中的一个的液滴测序仪连接或可连接。在一个实施方案中，在芯片上运行用于生成微液滴的工具并且其产物微流体递送至液滴递送系统以用于印刷至基板上。

现在将参照以下实施例来说明所述方法，其中：

图1示意性地说明了其中使各自含有核苷酸的微液滴经历与捕获体系的反应以生成荧光标记的扩增子的测序仪。

图2说明了采用本发明的方法的液滴储存设备的截面图。

各自含有寡核苷酸的微液滴流的生成

使通过逐步焦磷酸解来源于人类DNA的100个核苷酸碱基的多核苷酸分析物得到的包含单核苷酸(脱氧核糖核苷三磷酸)流的水性介质1流经由PDMS聚合物制造的十微米直径的微流体管。通过使包含Taq Pol和2毫摩尔/升浓度的焦磷酸钠和氯化镁中的每一种的72℃的水性、缓冲(pH 8)反应介质的流经之前已经借助琥珀酰基桥与分析物连接的玻璃微珠通过，进行焦磷酸解反应本身。在微珠下游的1中核苷酸的顺序对应于分析物的序列。1从液滴头2中流出进入第一腔室3，在那里其与一个或多个不可溶混的轻硅油4的流接触。选择这些流的速度以避免湍流混合并且形成悬浮在油中的水性球体液滴5，其各自具有大约八微米的直径。典型地，调节速率从而在相邻的填充液滴之间存在平均10个空液滴。之后将5的流沿着相同直径的第二微流体管以1000液滴/秒的速率向前运送至第二腔室6，还借助第二液滴头8将五微米的水性球体液滴7的第二流供给至所述第二腔室6中。使液滴5和7以连续方式聚结以形成直径大约九微米的变大的水性液滴9。7中的每一个含有焦磷酸酶以破坏在5中的每一个中存在的任何残留的焦磷酸根阴离子。

之后将9的流以相同的速率经由微流体管道向前运送至第三腔室10中，在那里这些液滴与也经由相应的液滴头12向其供给的五微米的水性球体液滴11的第三流接触。9中的每一个在腔室6和10之间移动所花费的时间为大约2分钟。

之后使液滴9和11在10中聚结以制备液滴13(直径大约十微米)。11中的每一个含有嗜温连接酶以及包含四个j形第一寡核苷酸和四个相应的i形第二单链寡核苷酸的对的捕获体系。每个j形第一寡核苷酸为60个核苷酸碱基长并且通过以下方式制备：在从5’末端开始的第45个核苷酸碱基附近折叠60个核苷酸碱基的单链寡核苷酸前体以产生3个核苷酸的单链环、12个核苷酸碱基对的双链区和33个核苷酸碱基单链区域，其在四种第一寡核苷酸中的每一个均不同。这四种第一寡核苷酸中的每一个还具有不同的第33个碱基(从单链末端开始测量)，其特征为为DNA的四种特征性核苷酸碱基类型(即A、T、G和C)。四种不同的i形第二寡核苷酸各自为28个核苷酸碱基长并且具有由它们的第一寡核苷酸对的第4和第32个核苷酸碱基限定的单链区域的该部分互补的不同序列。

接下来，13的流以相同的速率经由微流体管道向前运送，在所述管道处三十分钟之后其通过热点，在所述热点处使连接酶失活(十至二十分钟)，之后，进入第三腔室14，在那里使其与也经由液滴头16向其供给的五微米的水性球体液滴15的第四流聚结。15中的每一个含有针对第二寡核苷酸中的每一个选择的四种不同引物对、Taq Pol酶、DNA特有的四种脱氧核糖核苷酸三磷酸以及针对可以由能够在13中产生的四种不同捕获分子生成的四种类型扩增子中的每一种选择的四种不同分子信标。15还可以含有通常在进行聚合酶链式反应中采用的其他添加剂。之后在60至95℃之间对由此形成的聚结的微液滴17的流进行20和30次之间的热循环(大约一次循环/分钟)，在此期间解链的捕获分子的扩增通过聚合酶链式反应发生。在这个时期的末期，转移17以储存。

微液滴的储存

将17引入至设置有通向出口孔20的硅烷化毛细孔19的液滴递送系统18，微液滴21从所述出口孔20逐个排出。基板22包括玻璃片材，其操作表面设置有半球形孔23的规则二维阵列的。通过等离子体处理将23的内表面预蚀刻。在其操作表面上用轻硅油24的薄膜将22涂布并且在其其他表面上用轻反射金属层25涂布。将22安装在平台26上，所述平台26可以在与其操作表面平行的平面中借助微处理器和伺服电动机(未示出)移动。在使用中，21中的每一个在通过26的移动形成的唯一位置依次从20中排出并且在重力作用下经由24落入23中，在那里它们储存在油下。当到分析微液滴的时间时，使用激光器依次照射每个孔并且通过与计算机连接的光检测器(未示出)测量任何反射的荧光。

Claims (30)

1.一种储存液滴流的方法，所述液滴的至少一些包含一个或多个单核苷酸和/或寡核苷酸以及液滴流体，其特征在于在相应的唯一位置将每个液滴从液滴递送系统依次打印至基板的液体膜涂布的表面上的步骤，所述液滴递送系统包含喷嘴和出口孔，所述基板包含平坦片材或板，并且其特征还在于(1)通过下列过程制备所述液滴流：所述过程包括由分析物通过逐步焦磷酸解生成有序的核苷酸流并且将每个核苷酸捕获在相应液滴中的步骤；和(2)所述液滴递送系统和平坦基板在至少一种空间维度中是相对于彼此可移动的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在防止它们聚结的条件下将所述液滴引入至所述表面上。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述基板的所述表面设置有向其引入液滴的多个孔、沟槽、通道、凸起、凹陷、孔洞、柱和其他隆起。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述液体膜由与所述液滴流体不可溶混的液体构成。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于构成所述膜的所述液体比所述液滴流体密度低。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于构成所述膜的所述液体的粘度使得所述液滴通过其迁移至所述基板的所述表面上。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述液滴流体是水或水性缓冲液并且构成所述膜的所述液体选自由下列各项组成的组：烃油、硅油或者可以通过热或uv辐射的作用固化形成固体透明基质的液体单体或聚合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述烃油是氟代烃油。

9.根据前述权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于将所述基板的所述表面的至少部分调整为比其余部分相对更亲水。

10.根据前述权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于所述平坦片材或板的表面相对于出口孔并置，所述液滴递送系统相对于所述平坦片材或板是可移动的。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于所述液滴递送系统包括喷嘴，所述喷嘴包括横截面轮廓为三角形，矩形，规则多边形或椭圆形的出口孔。

12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于所述液滴递送系统包括喷嘴，所述喷嘴包括横截面轮廓为正方形的出口孔。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述液滴递送系统和所述基板的所述表面在定义所述平坦片材或板的平面的两个维度中是相对于彼此可移动的。

14.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于通过微处理器和伺服辅助机构控制所述液滴递送系统和所述基板的所述表面的所述相对移动。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述微处理器设置有存储器以储存每个液滴的顺序和位置。

16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于将所述液滴以含有液滴流的载体介质的形式递送至所述液滴递送系统，所述液滴的至少一些含有所述核苷酸或寡核苷酸。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述载体介质和构成所述膜的所述液体是相同的。

18.根据前述权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于用一种或多种荧光团标记在所述液滴中含有的核苷酸或寡核苷酸。

19.根据前述权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于所述液滴流具有对应于前体多核苷酸分析物中核苷酸序列的排序的核苷酸排序。

20.根据前述权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于所述过程包括处理每个液滴以用捕获分子捕获所述核苷酸的另外的步骤，所述捕获分子被非活性状态的荧光团多重标记，其在捕获之后经历酶降解。

21.根据前述权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于所述过程包括处理每个液滴以形成特征为其含有的核苷酸的标记的扩增子的另外的步骤。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于通过选自由下列各项组成的组的方法形成所述扩增子：聚合酶链式反应、重组酶聚合酶扩增和滚环扩增。

23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于：(1)所述液滴的至少一些含有来源于所述分析物的单核苷酸以及(2)在进行根据权利要求20所述的额外步骤中的至少一个之前将所述液滴递送至所述基板的所述操作表面。

24.一种微液滴储存设备，其特征在于包括

a.具有操作表面的基板，所述基板包含液体膜涂布的平坦片材或板，所述操作表面提供了包含多个孔，沟槽，通道，凸起，凹陷，孔洞，柱和其它隆起结构的唯一的液滴接收位置；

b.用于生成微液滴流的工具，所述生成微液滴流包括由多核苷酸分析物通过逐步焦磷酸解生成有序的单核苷酸流的步骤；

c.包括喷嘴和出口孔的用于将所述微液滴流递送至液滴接收位置的液滴递送系统，所述微液滴的至少一些包含一个或多个单核苷酸和/或寡核苷酸；

d.用于将任选地在载体介质中的所述微液滴流递送至所述液滴递送系统的入口的工具以及

e.用于在所述操作表面的平面上将所述基板和所述液滴递送系统之一或二者相对彼此移动的定位机构。

25.根据权利要求24所述的微液滴储存设备，其特征在于用于将所述微液滴流递送至所述液滴递送系统的所述工具包括微流体路径。

26.根据权利要求24或权利要求25所述的微液滴储存设备，其特征在于其还包括储存所述平面中限定在其处递送给定微液滴的所述操作表面的确切位置的工具。

27.根据权利要求24至25中任一项所述的微液滴储存设备，其特征在于所述操作表面在使用之前预涂布所述液体膜。

28.根据权利要求24至25中任一项所述的微液滴储存设备，所述微液滴储存设备包括容纳所述液滴递送系统和适用于接收和弹出所述基板的腔室的外壳。

29.权利要求24-25任一项所述的微液滴储存设备，其特征在于所述基板被固定，并且所述液滴递送系统相对于所述基板是可移动的。

30.权利要求24-25任一项所述的微液滴储存设备，其特征在于所述液体膜是UV可固化的聚合物。