BR112019027764A2 - método para manipular uma microgotícula e método para pirofosforizar um analito de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

É fornecido um método para manipular uma microgotícula de um meio de reação em um meio transportador imiscível com uma molécula alvo ligada a um suporte sólido com a finalidade de efetuar uma transformação química. É caracterizado pelas etapas de (a) colocar a microgotícula em contato com o suporte sólido sob condições em que a microgotícula e o suporte sólido são combinados, (b) permitir que o meio de reação reaja com a molécula alvo e (c) posteriormente exercer uma força para induzir o meio de reação a se destacar do suporte sólido e reformar uma microgotícula no fluido transportador. Em uma concretização, o suporte sólido é uma partícula, grânulo ou semelhante.

Description

MÉTODO PARA MANIPULAR UMA MICROGOTÍCULA E MÉTODO PARA

PIROFOSFORIZAR UM ANALITO DE ÁCIDO NUCLEICO Campo

[0001] A presente invenção refere-se, inter alia, a um método para investigar uma molécula de ácido nucleico; em particular, um método para sequenciar DNA ou RNA de origem natural ou sintética.

[0002] Em nossos pedidos anteriores WO2014/053853, WO2014/053854, WO2014/167323, WO2014/167324 e WO2014/111723, descrevemos um novo método de sequenciamento que envolve a digestão progressiva de um analito polinucleotídico para gerar um fluxo ordenado de nucleotídeos, de preferência um fluxo de trifosfatos de nucleosídeo único, cada um dos quais pode ser capturado um a um em microgotículas correspondentes em um fluxo de microgotículas. Em seguida, cada microgotícula pode ser quimicamente e/ou enzimaticamente manipulada para revelar o nucleotídeo único particular. Em uma concretização, essas manipulações químicas e/ou enzimáticas compreendem um método que envolve o uso de um ou mais tipos de sonda de oligonucleotídeo multicomponentes, cada um dos quais é adaptado para poder capturar seletivamente um dos tipos de nucleotídeo único a partir do qual o analito é constituído. Tipicamente, em cada um desses tipos de sonda, um dos componentes oligonucleotídicos compreende fluoróforos característicos e, no estado não utilizado da sonda, a capacidade desses fluoróforos para fluorescência permanece extinta em virtude da presença de extintores localizados próximos ou por auto-extinção. Em uso, quando a sonda captura seu nucleotídeo único correspondente, torna-se suscetível a exonucleólise ou endonucleólise subsequentes, liberando assim os fluoróforos dos extintores e/ou um do outro, permitindo que eles fluoresçam livremente. Por este meio, a natureza do nucleotídeo único original presente em cada gotícula pode ser inferido indiretamente por meios espectroscópicos.

[0003] Ao projetar dispositivos de sequenciamento utilizando este método, pode ser necessário manipular muitos milhares de microgotículas, garantindo, por exemplo, que elas possam ser entregues de maneira confiável em locais onde possam ser coalescidas com outras e/ou seus conteúdos analisados quanto à presença ou ausência de fluorescência.

[0004] Uma maneira possível de fazer isso é estabelecer caminhos em um substrato ao longo do qual as microgotículas podem ser impulsionadas por forças de eletromolhamento. Os dispositivos para manipular gotículas relativamente grandes desta maneira foram descritos anteriormente no estado da técnica; ver, por exemplo, US6565727, US20130233425 e US20150027889. Tipicamente, isto é conseguido fazendo com que as gotículas, por exemplo, na presença de um fluido de suporte imiscível, viajem de um espaço microfluídico definido por duas paredes opostas de um cartucho ou tubulação. Embutidos nas paredes do cartucho ou tubulação estão os eletrodos cobertos com uma camada dielétrica, cada um dos quais está conectado a um circuito de polarização AC capaz de ser ligado e desligado rapidamente em intervalos para modificar as características de eletromolhamento da camada. Isso dá origem a forças capilares direcionais localizadas que podem ser usadas para direcionar a gotícula ao longo de um determinado caminho.

[0005] Uma variante dessa abordagem, com base em eletromolhamento opticamente mediado, foi ensinada, por exemplo, nos documentos US20030224528, US20150298125 e US20160158748. Em particular, o primeiro desses três pedidos de patente divulga vários dispositivos microfluídicos que incluem uma cavidade microfluídica definida pelas primeira e segunda paredes e em que a primeira parede possui design compósito e é composta de camadas de substrato, fotocondutora e isolante (dielétrica). Entre as camadas fotocondutora e isolante está disposto um conjunto de células condutoras que são eletricamente isoladas umas das outras e acopladas à camada fotoativa e cujas funções são gerar locais discretos correspondentes para recebimento de gotículas na camada de isolamento. Nesses locais, as propriedades de tensão superficial das gotículas podem ser modificadas por meio de forças de eletromolhamento. As células condutoras podem então ser ligadas e desligadas pela luz que incide na camada fotocondutora. Essa abordagem tem a vantagem de que a comutação é muito mais fácil e rápida, embora sua utilidade ainda seja, em certa medida, limitada pelo arranjo dos eletrodos. Além disso, há uma limitação à velocidade com que as gotículas podem ser movidas e até que ponto o caminho real das gotículas pode ser variado.

[0006] Uma concretização de parede dupla dessa última abordagem foi divulgada na Universidade da Califórnia na tese de Berkeley UCB/EECS-2015-119 por Pei. Aqui, é descrita uma célula que permite a manipulação de gotículas relativamente grandes na faixa de tamanho de 100 a 500 µm usando eletromolhamento opticamente mediado através de uma superfície de Teflon AF depositada sobre uma camada dielétrica. Um padrão de luz sobre silício amorfo eletricamente polarizado não padronizado é descrito na forma esquemática. No entanto, no esquema mostrado, a camada dielétrica é fina (100 nm) e disposta unicamente na parede que suporta a camada fotoativa.

[0007] Microfluid Nanofluid (2016) 20:123 ensina a captura e liberação de gotículas assistidas por eletrodos em manchas hidrofílicas em um microcanal hidrofóbico.

[0008] No nosso pedido de patente europeu recentemente depositado 17180391.9 nós descremos um dispositivo investigativo de ácido nucleico que é capaz de manipular muitos milhares de microgotículas simultaneamente, em conformidade com os requisitos de um método de detecção de nucleotídeo único de forma rápida e confiável. Tem a vantagem de ser facilmente reconfigurável pela aplicação de software, tornando-o muito versátil; por exemplo, permitindo que o usuário para o adapte prontamente para precisão ótima, rendimento ou detecção de determinadas modificações epigenéticas. Nós agora também desenvolvemos um método investigativo correspondente de uma característica que é aquela que a etapa de digestão do analito inicial é efetuada fazendo com que um analito suportado em partícula interaja diretamente com os componentes de uma corrente de microgotículas aquosas contendo o meio digestor gerado a montante (incluindo, mas não se limitando a, em um local separado; por exemplo, a montante de um chip em que a digestão ocorre) em um meio transportador imiscível. Por este meio, a etapa de digestão pode ser realizada 'em partículas' e 'em gotículas', aumentando assim significativamente a precisão e confiabilidade dessa etapa de digestão.

[0009] No seu âmbito mais amplo, e reconhecendo que este método é amplamente aplicável, é proporcionado, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, um método para manipular uma microgotícula de um meio de reação em meio transportador imiscível com uma molécula alvo ligada a um suporte sólido com a finalidade de efetuar uma transformação química caracterizada pelas etapas de (a) colocar a microgotícula em contato com o suporte sólido sob condições em que a microgotícula e o suporte sólido são combinados, (b) permitir que o meio de reação reaja com a molécula alvo e (c) depois exercer uma força para induzir o meio de reação a se destacar do suporte sólido e reformar um microgotícula no fluido transportador.

[0010] Em uma versão deste método, é fornecido um método para realizar uma transformação química de uma molécula alvo imobilizada em um determinado local em um suporte sólido compreendendo uma partícula caracterizada pelas etapas de (a) gerar uma corrente de microgotículas cada uma composta por um meio capaz de causar a transformação química; (b) por em contato cada microgotícula por sua vez com a molécula alvo no local determinado e por um determinado período de tempo em condições em que a transformação química pode ocorrer e (c) no final do período determinado, remover a microgotícula do local determinado.

[0011] Adequadamente, este método compreende ainda a etapa de transportar uma microgotícula reformada longe da proximidade do suporte sólido que é empobrecido nos componentes do meio de reação. De preferência, a força exercida é uma força de eletromolhamento que é aplicada em vários pontos ou zonas em um caminho que inclui a localização do suporte sólido. Essa força de eletromolhamento pode ser gerada eletricamente ou opticamente.

[0012] Em uma concretização, o meio de reação empregado é para a transformação de um analito de ácido nucleico e a molécula alvo é um polinucleotídeo; por exemplo, a síntese de um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA) usando um polinucleotídeo de fita simples como um iniciador/molde. Em tal concretização, as microgotículas aplicadas ao suporte sólido compreenderão uma fonte de monômero de nucleotídeo, pelo menos uma polimerase e os outros componentes que são convencionais exigidos na técnica.

[0013] Em outra concretização, o método é útil para investigar a estrutura molecular de um biopolímero tal como um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA) ou uma proteína. Por exemplo, de acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um método para investigar uma molécula alvo compreendendo um biopolímero caracterizado por compreender as etapas de: • fazer com que uma corrente de microgotículas do meio digestor no meio transportador imiscível contacte o biopolímero por um em um caminho permitindo assim que o biopolímero seja progressivamente digerido dentro das microgotículas em suas unidades de monômero único constituintes; • remover as microgotículas de todo o biopolímero, em que pelo menos algumas das microgotículas contêm uma única unidade de monômero; • transporte adicional das microgotículas ao longo do caminho para uma zona de detecção e

• identificar as unidades de monômeros nas microgotículas na zona de detecção e inferir sua estrutura química.

[0014] Numa concretização dos primeiro e segundo aspectos, a molécula alvo/biopolímero é um analito de ácido nucleico e o meio de digestão é um capaz de transformar um polinucleotídeo. Por exemplo, pode conter uma polimerase e um cofator que é de preferência um ânion polifosfato ou um análogo do mesmo. Mais preferivelmente, o polifosfato é pirofosfato que conduz à geração de trifosfatos de nucleotídeo. Em outra concretização, o meio de digestão compreende uma exonuclease que digere o analito em monofosfatos de nucleotídeo. Estes monofosfatos de nucleotídeo podem então ser convertidos nos seus correspondentes trifosfatos de nucleotídeo pela ação de uma cinase. A identificação de mono- ou trifosfatos de nucleotídeo vai então compreender a identificação da nucleobase associada com cada um; por exemplo, por meio de sondas de captura de oligonucleotídeos seletivas de nucleobases, a aplicação de marcadores fluorescentes ou diretamente pela detecção de dispersão Raman característica das nucleobases aprimorada, por exemplo, por fenômenos superficiais ou plasmônicos. Numa concretização, tal etapa de identificação envolverá adequadamente o uso de uma zona de detecção que emprega uma fonte de radiação eletromagnética incidente (como um laser ou LED) e um fotodetector para detectar a radiação resultante das nucleobases.

[0015] Em outra concretização, tal como será explicado em maior detalhe abaixo, o método do segundo aspecto da invenção é caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos resultantes são feitos reagir na presença de uma polimerase, com um sistema de captura de oligonucleotídeo constituído por sondas de fluorescência que, em seu estado não utilizado, não são fluorescentes e são seletivas para pelo menos um dos tipos de nucleotídeos característicos do analito, resultando na liberação de fluoróforos em um estado detectável, e em que a fluorescência resultante derivada do fluoróforo(s) liberado em cada microgotícula é detectada usando uma fonte incidente da primeira radiação eletromagnética e um fotodetector. Adequadamente, a liberação de tais fluoróforos é o resultado da ação de uma exonuclease e/ou endonuclease e opcionalmente uma ligase, sendo essa ação catalisada pela captura do nucleotídeo detectado. Numa concretização, o sistema de captura de oligonucleotídeo é introduzido a jusante do local de digestão de analito através de coalescência de microgotículas ou através de injeção direta. Em tal caso, é preferido que o meio de digestão seja tratado com uma pirofosfatase antes da reação com o sistema de captura de oligonucleotídeo.

[0016] Numa versão preferida destas concretizações, o biopolímero é um ácido nucleico; os monômeros são trifosfatos de nucleosídeos produzidos por pirofosforólise progressiva e a etapa de identificação envolve a detecção de fluorescência gerada por exonucleólise de uma sonda de oligonucleotídeo usada que, no seu estado não utilizado não é fluorescente e seletiva para uma dada nucleobase. Assim, de acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para investigar um analito de ácido nucleico caracterizado por compreender as etapas de: • fazer com que uma corrente de microgotículas de um meio aquoso de pirofosforólise em um meio transportador imiscível contate o analito por um caminho; permitindo assim que o analito seja progressivamente os seus trifosfatos de nucleosídeo único constituintes; • remover as microgotículas no meio transportador em torno do analito em que pelo menos algumas das microgotículas contêm um dos trifosfatos de nucleosídeo único; • adicionalmente transportar as microgotículas ao longo do caminho; • em um ou mais locais ao longo do caminho ou a montante da pirofosforólise introduzindo em cada microgotículas componentes de detecção constituídos por (a) um sistema de captura de oligonucleotídeo compreendido de sondas de fluorescência que no seu estado não utilizado são não-fluorescentes, (b) uma polimerase, (c) opcionalmente uma ligase e (d) uma exonuclease e/ou uma endonuclease capaz de fazer com que o fluoróforo seja liberado do sistema de captura usado em um estado fluorescente; • detectar a fluorescência derivada do(s) fluoróforo(s) liberado(s) em cada microgotícula em um ponto a jusante do(s) local(is) e a pirofosforólise usando uma fonte incidente da primeira radiação eletromagnética e um fotodetector.

[0017] Os métodos destes segundo e terceiro aspectos da presente invenção são especialmente adequados para sequenciar um analito de polinucleotídeo de cadeia dupla que tem um comprimento da cadeia de nucleotídeos que pode, em princípio, ser ilimitado; por exemplo, até e incluindo os muitos milhões de pares de bases de nucleotídeos encontrados em um fragmento de um genoma. Numa concretização, o analito terá, portanto, pelo menos 50, de preferência pelo menos 150 pares de bases de nucleotídeos; adequadamente, será maior que 500, maior que 1000 e, em alguns casos, mais de 5000 pares de nucleobases. Numa concretização, o analito é DNA de origem natural (por exemplo, material genético derivado de uma planta, animal, bactéria ou um vírus) embora o método seja igualmente aplicável para o sequenciamento de DNA parcial ou totalmente sintético ou, de fato outro ácido nucleico feito total ou parcialmente de nucleotídeos constituídos por bases nucleotídicas que não são comumente encontradas na natureza; isto é, nucleotídeos que possuem bases nucleotídicas que não adenina, timina, guanina, citosina e uracila. Exemplos de tais nucleobases incluem 4-acetilcitidina, 5-(carboxi- hidroxilmetil)uridina, 2-O-metilcitidina, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilamino- metiluridina, di-hidrouridina, 2-O-metilpseudouridina, 2-O inosina, N6-isopentiladenosina, 1-metiladenosina, 1- metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 3- metilcitidina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 7- metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-Metoxiaminometil-2- tiouridina, 5-metoxiuridina, 5-metoxicarbonilmetil-2- tiouridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 2-metiltio-N6- isopenteniladenosina, ácido uridina-5-oxiacético-éster metílico, ácido uridina-5 oxiacético, wibutoxosina, wbutosina, pseudouridina, queuosina, 2-tiocididina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, 2-O-metil-5-metil idina e 2-O-metiluridina. Quando o analito for RNA, considerações semelhantes serão aplicadas.

[0018] Voltando à concretização preferida do terceiro aspecto da invenção, na primeira etapa e em uma zona de pirofosforólise dentro do caminho, o analito é pirofosforolizado progressivamente na direção 3'-5' para gerar uma corrente de trifosfatos de nucleosídeo único cuja ordem corresponde à da sequência do analito. A pirofosforólise em si é realizada a uma temperatura na gama de 20 a 90º C na presença de uma corrente de microgotículas contendo um meio pirofosforolizante aquoso incluindo uma enzima, tal como uma polimerase. Numa concretização, este meio é tamponado e também pode conter os outros componentes necessários para sustentar a reação de pirofosforólise (polimerase, ânion pirofosfato, cátion magnésio, etc.). Em outra concretização, o meio adicionalmente contém um ou mais dos componentes de detecção de nucleotídeos que são especificados adicionalmente abaixo. Em ainda outra concretização, alguns ou todos esses componentes podem ser introduzidos em outro dos vários pontos na prática do método; por exemplo, por injeção direta utilizando um injetor de microgotículas ou por coalescência das microgotículas com microgotículas secundárias contendo materiais relevantes. Adequadamente, as microgotículas empregadas são suspensas em um meio transportador imiscível, como um óleo mineral ou de silicone.

[0019] De preferência, o método da invenção é operado de modo que a pirofosforólise é tão rápida quanto possível e em uma concretização esta taxa permanece na gama de 1 a 50 trifosfatos de nucleosídeo único por segundo. Mais informações sobre a reação de pirofosforólise como aplicada à degradação progressiva de polinucleotídeos podem ser encontradas, por exemplo, em J. Biol. Chem. 244 (1969) pp. 30 19-3028.

[0020] Numa concretização, a digestão do analito é realizada ao por em contato cada microgotícula na corrente, por sua vez,

com uma partícula à qual o analito foi previamente anexado. Adequadamente, essas partículas terão sido previamente modificadas para incluir um ou mais locais reativos ao analitos aos quais o analito está ligado por meios químicos ou físicos. Numa concretização, a partícula compreende um grânulo; por exemplo, uma microgrânulo, feito de um material inerte, como vidro, sílica, alumina, um metal ou um polímero não degradável. Em outra concretização, a partícula tem um núcleo de material paramagnético, permitindo que ela seja manipulada magneticamente. Em outra concretização, a partícula pode estar contida em uma microgotícula inicial e manipulada para seu local de digestão por meio de eletromolhamento convencional ou opticamente mediado. Ainda em outra concretização, a partícula pode ser mantida a uma dada localização onde a digestão é efetuada por um ou mais meios, incluindo o magnetismo, eletromolhamento, sucção, constrição física, ou por grupos de fixação secundários neles montados que podem quimicamente ou fisicamente se ligar temporariamente às paredes do caminho; como por exemplo, onde o caminho é um canal ou tubulação microfluídica.

[0021] Existem muitas maneiras pelas quais grupos de ligação secundários e os locais reativos do analito podem ser criados. Por exemplo, no caso do formador, eles podem ser preparados primeiramente revestindo parcialmente as partículas com metal usando um método conhecido como deposição de vapor de metal, deposição de plasma ou similares. Depois disso, a superfície do metal pode ser quimicamente modificada para introduzir uma ou mais primeiras porções que podem se ligar reversivelmente às segundas porções complementares dispostas em uma localização no caminho. Numa concretização, esses pares de primeira e segunda porções são escolhidos de modo que a ligação criada entre eles possa ser reversível e rompida à temperatura ambiente ou próximo à temperatura ambiente. Por este meio, a partícula pode ser fixada ao local de digestão, o analito digerido, e depois o grânulo facilmente destacado do local, permitindo que este receba outro grânulo fresco. Numa concretização, esses pares de primeira e segunda porções podem levar à formação de complexos de proteínas estáveis sob as condições de digestão, por exemplo, usando porções de avidina ou estreptavidina com porções de biotina complementares. Em outra, esses pares podem criar uma ligação química instável; como, por exemplo, em um par de polistididina/íons metálicos quelatados (ligação quebrada a pH baixo ou na presença de imidazol ou quelante de metal forte); um par de ácido borônico/carboidrato adequado (ligação quebrada em pH baixo) ou um par maleimido/selenol (ligação quebrada usando ácido meta-cloroperoxibenzóico). Nestes casos, a partícula pode ser subsequentemente destacada modificando o pH ou a composição das microgotículas passando sobre ela.

[0022] Numa concretização preferida, o par de porções mencionadas acima compreende uma porção de polistididina composta por uma pluralidade de resíduos de histidina (preferencialmente maiores que seis) e uma porção quelante selecionada a partir de, por exemplo, um derivado de sal de nitrotriacetato (NTA) ou iminodiacetato (IDA) de um metal de transição como cobalto, cobre ou níquel. Deve ser observado que estas primeira e segunda porções podem ser implantadas no local da partícula e de caminho, respectivamente, de qualquer maneira.

[0023] Da mesma forma, existem muitas maneiras pelas quais os locais reativos a analitos podem ser criados. Assim, em uma concretização, uma superfície não revestida da partícula pode ser preparada com um agente funcionalizante, por exemplo, no caso de uma sílica, alumina ou grânulos de vidro, um epoxissilano, um aminohidrocarbilsilano ou um mercaptossilano, para criar locais quimicamente reativos para os quais o analito pode ser ligado. Após isso, estes locais reativos podem ser tratados com um derivado do analito que foi correspondentemente modificado para incluir um terminal de grupo iniciador-reativo; por exemplo, em uma concretização, um grupo amina, succinil ou tiol. Em outra concretização, a ligação química pode ocorrer meio de ligação a oligonucleotídeos adaptadores ou através do tipo de complexos de proteína descritos acima.

[0024] Em ainda outra concretização, a partícula assim iniciada compreenderá uma região com apenas um local reativo ao analito, de modo que apenas uma molécula do analito possa ser atacada. Isso pode ser importante se o analito for um pequeno fragmento de polinucleotídeo, pois outras moléculas múltiplas tendem a se ligar durante a preparação, o que é indesejável. É uma preocupação menor se o fragmento de polinucleotídeo for grande, pois os efeitos estéricos trabalharão para militar contra esse resultado. Adequadamente, a partícula terá um diâmetro máximo na faixa de 0,5 a 5 mícrons (µm).

[0025] Numa concretização preferida, as partículas são grânulos esféricos com um núcleo magnético; por exemplo, aqueles vendidos com o nome Dynabeads®.

[0026] É vantajoso em algumas concretizações do método em que o analito alvo é imobilizado de maneira que seja difícil de molhar ou seja muito pequeno para molhar (como um analito imobilizado em uma esfera hidrofóbica ou em uma esfera muito pequena) para modificar a molhabilidade das paredes da superfície próximas ao analito. Tal modificação da molhabilidade pode ser alcançada usando um revestimento químico de superfície, como um revestimento com PEG-silano. Em outra concretização, uma modificação temporária da molhabilidade pode ser induzida usando um dos mecanismos de eletromolhamento mencionados anteriormente. Ao modificar a molhabilidade da superfície, é possível melhorar a confiabilidade do método, pois o usuário pode definir com precisão a área da superfície que recebe esse tratamento de molhabilidade. Assim, torna-se mais fácil controlar o volume preciso de fluido que é desmolhado da superfície por transporte de gotículas, e o volume do fluido restante que pode ser deixado para trás umedecido na superfície. Isto tem a vantagem de proporcionar uma troca de volume altamente reproduzível entre o analito alvo e as gotículas, o que seria difícil de alcançar com um alvo de área superficial mal definida, como um grânulo isolado com uma superfície rugosa.

[0027] É uma característica da primeira etapa do método que a digestão do analito ocorra em um meio aquoso goticulado no qual microgotículas suspensas em um meio transportador imiscível temporariamente molha e desmolha o grânulo alvo à medida que eles são conduzidos ao longo de sua superfície. Por este meio, quando uma molécula de trifosfato de nucleosídeo é liberada da fita de analito, ela se tornará encapsulada e, em seguida, removida a jusante quando a microgotícula desmolha ou parcialmente desmolha da partícula. Em uma concretização, a digestão ocorre quando a partícula está em contato temporário com uma microgotícula. Em ainda outra, a taxa de molhamento/desmolhamento é ajustada, de modo que, em média, mais microgotículas passam sobre as partículas do que os nucleotídeos são liberados. Noutra concretização, o volume da partícula é menor que o volume das microgotículas; por exemplo, menos de 75% ou preferencialmente, menos de 50% do volume. Em ainda outra, a partícula pode reter uma casca aquosa à medida que as microgotículas passam sobre ela. Neste caso, é preferível que a razão do volume da casca para o volume da microgotícula seja tão pequena quanto possível. Por exemplo, se 50% do volume da microgotícula permanecesse sobre a partícula, isto daria uma possibilidade de 50% de nucleotídeos serem levados com a microgotícula, e 50% de chance de ela ficar para trás.

[0028] Será reconhecido que esta metodologia de molhamento/desmolhamento terá aplicação além do sequenciamento se a transformação química progressiva realizada no analito for diferente de digestão; por exemplo, a síntese de DNA ou a síntese de nanopartículas. As possibilidades para tais transformações pode, numa concretização ainda ser aumentada por ter múltiplos tipos de microgotículas que interagem de uma forma gradual com um transportador de partícula, por exemplo, um catalisador, iniciador ou outro reagente. Assim, de acordo com outro um aspecto da presente invenção é proporcionado um método geral para realizar uma transformação química de uma molécula alvo imobilizada em um determinado local caracterizado pelas etapas de (a) gerar uma corrente de microgotículas, cada uma composta de um meio capaz de causar a transformação química; (b) por em contato com cada microgotícula por vez com a molécula alvo no local indicado e por um determinado período de tempo em condições em que a transformação química possa ocorrer; e (c) no final do período determinado, remover a microgotícula do local determinado. Adequadamente, as microgotículas são suspensas em um veículo imiscível do tipo aqui descrito e o local dado é uma partícula como as descritas acima.

[0029] Para evitar o risco de que uma determinada microgotícula contenha mais de uma molécula de nucleotídeo, é preferível sincronizar os fluxos da microgotícula através da partícula e digestão, de modo que cada microgotícula gerada cheia seja separada em média por de 1 a 20, de preferência 2 a 10 vazias. Adequadamente, as microgotículas tem um volume finito de menos do que 500pL (picolitros), de preferência inferior a 65pL, mais preferivelmente menos do que 4pl e ainda mais preferivelmente menos do que 2 pl. Mais preferidos de todos os seus volumes estão na faixa de 4fL (femtolitros) a 4pL. Numa concretização, a vazão de microgotículas através da partícula está na faixa de 1 a 1000 microgotículas por segundo, de preferência 50 a 500.

[0030] Após as microgotículas terem sido removidas da partícula e em torno do analito, elas criam um fluxo ordenado alguns dos quais já contêm os constituintes de nucleotídeo do analito. Esta corrente de microgotículas é então transportada adicionalmente ao longo do caminho que, por exemplo, pode compreender um espaço microfluídico, como um canal microfluídico ou tubulação. Adequadamente, este transporte pode usar fluxo acionado por pressão ou pode usar força de eletromolhamento; por exemplo, por meio de uma configuração convencional de 'eletromolhamento em dielétrico' (eWOD) ou preferencialmente uma em que as forças de eletromolhamento são geradas por efeitos ópticos. Em uma concretização preferida, o caminho é um espaço microfluídico de eletromolhamento opticamente mediado construído ou definido pelas primeira e segunda paredes compósitas compostas de primeiro e segundo substratos, primeira e segunda camadas condutoras, uma camada fotoativa e primeira e segunda camadas dielétricas. Numa outra concretização, esta zona compreende um chip ou cartucho plano que é oco e acomoda o espaço microfluídico. Em ainda outra, pelo menos as primeiras camadas do substrato e primeiras camadas condutoras são transparentes permitindo que a luz de uma fonte de segunda radiação eletromagnética (por exemplo, laser de feixes múltiplos, ou díodos LED) incida diretamente sobre a camada fotoativa. Em outra concretização, o segundo substrato, a segunda camada condutora e a segunda camada dielétrica são transparentes, de modo que o mesmo objetivo pode ser obtido. Em ainda outra concretização, todas essas camadas são transparentes, permitindo a iluminação de ambos os lados.

[0031] Adequadamente, os primeiro e segundo substratos são feitos de um material que é mecanicamente forte, por exemplo, vidro, metal, semicondutor ou plástico de engenharia. Numa concretização, os substratos podem ter um grau de flexibilidade. Em ainda outra concretização, o primeiro e o segundo substratos têm uma espessura na faixa de 100-1000 µm.

[0032] As primeira e segunda camadas condutoras estão localizadas em uma superfície dos primeiro e segundo substratos e são tipicamente muito finas; cada uma com uma espessura na faixa de 70 a 250 nm, de preferência 70 a 150 nm. Em uma concretização, pelo menos uma dessas camadas é feita de um material condutor transparente, como óxido de índio e estanho

(ITO), uma película muito fina de metal condutor, como prata, ou um polímero condutor, como PEDOT ou similar. As camadas podem ser formadas como uma folha contínua ou uma série de estruturas discretas tais como fios. Alternativamente, a camada condutora pode ser uma malha de material condutor com a radiação eletromagnética sendo direcionada entre os interstícios da malha.

[0033] A camada fotoativa é adequadamente composta de um material semicondutor que pode gerar áreas de carga localizadas em resposta à estimulação pela fonte de segunda radiação eletromagnética. Os exemplos incluem o silício amorfo em uma faixa de espessura de 300 a 1000 nm. Em uma concretização, a camada fotoativa é ativada pela aplicação de luz visível.

[0034] As camadas fotoativas no caso da primeira parede e opcionalmente a camada condutora no caso da segunda parede são revestidas com camadas dielétricas que são muito finas e tipicamente na faixa de 120 a 160 nm. As propriedades dielétricas dessa camada incluem, de preferência, uma alta resistência dielétrica de >10^7 V/m e uma constante dielétrica de > 3. Numa concretização, a camada dielétrica é selecionada a partir de alumina ou sílica de alta pureza, hafnia ou filme fino de polímero não condutor.

[0035] Em outra versão desta configuração, pelo menos a primeira camada dielétrica, de preferência ambas as camadas, é revestida com uma camada anti-incrustante para auxiliar no estabelecimento do ângulo de contato desejado de microgotículas/fluido tranpsortador/superfície nos vários locais de eletromolhamento e adicionalmente para impedir que o conteúdo das microgotículas adira à superfície e diminuam à medida que a microgotícula é movida ao longo do caminho. Se a segunda parede não compreender uma segunda camada dielétrica, a segunda camada anti-incrustante pode ser aplicada diretamente sobre a segunda camada condutora. Para um desempenho ótimo, a camada anti-incrustração deve ajudar a estabelecer um ângulo de contato na gama de 50-70º, quando medido como uma interface de três pontos de superfície ar-líquido a 25ºC. Dependendo da escolha do meio transportador, o mesmo ângulo de contato das microgotículas em um caminho similar preenchido com uma emulsão aquosa será maior; maior que 100°. Numa concretização, essas camadas têm uma espessura inferior a 50 nm e são tipicamente uma camada monomolecular. Em outra, estas camadas são constituídas por um polímero de um éster de acrilato, tal como metacrilato de metila ou um derivado seu substituído por grupos hidrofílicos; por exemplo, alcoxissilil. De preferência, uma ou ambas as camadas anti-incrustantes são hidrofóbicas para garantir um desempenho ótimo.

[0036] As primeira e segunda camadas dielétricas e, portanto, as primeira e segunda paredes adequadamente definem um caminho composto de um espaço microfluídico que possui menos de 50, preferencialmente com menos de 10 µm de profundidade e no qual as microgotículas estão contidas. Numa concretização, antes de estarem contidas no espaço das microgotículas, as microgotículas têm um diâmetro intrínseco que é mais de 10% maior, adequadamente mais de 20% maior, do que uma dimensão do espaço das microgotículas. Por este meio, dentro do caminho, as microgotículas são feitas experimentar compressão, levando a um desempenho aprimorado de eletromolhamento para certas operações através da adição de energia potencial de superfície acima daquela de estado natural não comprimido das microgotículas.

[0037] Em outra concretização, o caminho inclui um ou mais espaçadores para manter as primeira e segunda paredes separadas a uma separação predeterminada. As opções para espaçadores incluem grânulos ou pilares, sulcos ou similares criados a partir de uma camada intermediária, por exemplo, camada de resistência que foi produzida por foto-padronização. Várias geometrias espaçadoras também podem ser usadas para definir espaços tais como canais estreitos, canais cônicos ou canais parcialmente fechados que são definidos por linhas de pilares. Pelo design cuidadoso, é possível utilizar estas estruturas para auxílio na deformação das microgotículas, para subsequentemente efetuar a divisão das microgotículas e para efetuar operações sobre as microgotículas deformadas.

[0038] A distância entre as primeira e segunda paredes afeta o nível de deformação das microgotículas; adicionando ou removendo o arrasto da superfície que impede o movimento de microgotículas. Ao estruturar o dispositivo de modo que o espaçamento entre as primeira e segunda paredes varie pelo dispositivo, é possível ter um caminho de pelo menos uma dimensão variável no qual o perfil é sob medida para diferentes operações de microgotícula.

[0039] As primeira e segunda paredes são polarizadas usando uma fonte de energia AC conectada às camadas condutoras para fornecer uma diferença de potencial de tensão entre elas; adequadamente na faixa de 10 a 50 volts AC.

[0040] O dispositivo de sequenciamento da presente invenção inclui ainda uma fonte de segunda radiação eletromagnética com um comprimento de onda na faixa de 400 a 1000 nm e uma energia maior que o intervalo de banda da camada fotoexcitável. Adequadamente, a camada fotoativa será ativada em locais de eletromolhamento, onde a intensidade incidente da radiação empregada está na faixa de 0,01 a 0,2 Wcm-2. A fonte de radiação electromagnética é, numa concretização, altamente atenuada e em outra pixelada, de modo a produzir regiões fotoexcitadas sobre a camada fotoctiva que também são correspondente pixeladas. Por este meio, os locais correspondentes de eletromolhamento pixelados na primeira camada dielétrica são induzidos. Em contraste com o design ensinado em US20030224528, estes pontos de eletromolhamento pixelados não estão associados com qualquer estrutura permanente correspondente na primeira parede à medida que as células condutoras estão ausentes. Como consequência, no dispositivo da presente invenção e na ausência de qualquer iluminação, todos os pontos na superfície da primeira camada dielétrica têm uma propensão igual de se tornarem locais de eletromolhamento. Isso torna o dispositivo muito flexível e os caminhos de eletromolhamento altamente programáveis. Para distinguir essa característica dos tipos de estrutura permanente ensinados no estado da técnica, optamos por caracterizar os locais de eletromolhamento gerados em nosso dispositivo como 'efêmeros' e as reivindicações de nosso pedido devem ser interpretadas de acordo.

[0041] O projeto de caminho otimizado ensinado aqui é particularmente vantajoso, pois a pilha compósita resultante possui as propriedades de anti-incrustação e de modificação do ângulo de contato da monocamada revestida (ou camada funcionalizada muito fina) combinadas com o desempenho de uma camada intermediária mais espessa com alta força dielétrica e alta constante dielétrica (como óxido de alumínio ou hafnia). A estrutura resultante da camada é altamente adequada para a manipulação de microgotículas de volume muito pequeno, como aquelas com diâmetro menor que 10 µm, por exemplo, na faixa de 2 a 8, 2 a 6, 2 a 5 ou 2 a 4 µm. Em uma concretização preferida, estes intervalos podem dar origem a microgotículas possuindo um volume na faixa de 10fL a 1 pL. Para essas microgotículas extremamente pequenas, a vantagem de desempenho de ter uma espessura mínima da pilha não condutora total acima da camada fotoativa é extremamente vantajosa, pois as dimensões da gotícula começam a se aproximar da espessura da pilha dielétrica e, portanto, o gradiente de campo através da gotícula (um requisito para movimento induzido por eletromolhamento) é reduzido para o dielétrico mais espesso.

[0042] Onde a fonte de segunda radiação eletromagnética é pixelada, ela é adequadamente fornecida direta ou indiretamente usando uma tela reflexiva ou dispositivo de microespelho digital (DMD) iluminado pela luz de LEDs. Isso permite que padrões altamente complexos de locais efêmeros de eletromolhamento sejam rapidamente criados e destruídos na primeira camada dielétrica, permitindo assim que as microgotículas sejam guiadas com precisão ao longo dos caminhos de eletromolhamento usando forças de eletromolhamento bem controladas. Isso é especialmente vantajoso quando o objetivo é manipular muitos milhares de microgotículas simultaneamente ao longo de vários caminhos de eletromolhamento. Tais caminhos de eletromolhamento podem ser vistos como sendo construídos a partir de um continuum de locais virtuais de eletromolhamento na primeira camada dielétrica.

[0043] Os pontos de impacto das fontes de segunda radiação eletromagnética na camada fotoativa podem ter qualquer forma conveniente, incluindo a circular convencional. Numa concretização, as morfologias destes pontos são determinadas pelas morfologias das correspondentes pixelações e em outra correspondem total ou parcialmente às morfologias das microgotículas no caminho. Em uma concretização preferida, os pontos de impacto e, portanto, os locais de eletromolhamento podem ser em forma crescente e orientados na direção pretendida de deslocamento da microgotícula no caminho. Em outra concretização, a segunda parede também inclui uma camada fotoativa que permite que outros locais efêmeros de eletromolhamento sejam induzidos na segunda camada dielétrica; seja por meio da mesma fonte de radiação eletromagnética ou de uma segunda fonte do tipo aqui descrito. Adequadamente, os próprios locais de eletromolhamento são menores do que a superfície da microgotícula aderente à primeira parede e dão um gradiente de intensidade de campo máxima em toda a linha de contato formada entre a gotícula e a superfície dielétrica. A adição de uma segunda camada fotoativa permite a possibilidade de fazer a transição da aresta de molhamento a partir da superfície superior para a inferior do caminho, e a aplicação direcionada de forças de eletromolhamento alternativas ou adicionais para cada microgotículas.

[0044] Em uma concretização, os meios para manipular os pontos de impacto da segunda radiação eletromagnética na camada fotoativa são adaptados ou programados para produzir uma pluralidade de primeiros caminhos de eletromolhamento em funcionamento concomitante, por exemplo, paralelos, na primeira e, opcionalmente, na segunda camada dielétrica. Em outra concretização, são adaptados ou programados para, assim, produzir uma pluralidade de terceiros caminhos de eletromolhamento nas primeiras e, opcionalmente, nas segundas camadas dielétricas que interceptam com os primeiros caminhos de eletromolhamento para criar pelo menos um local de coalescência de microgotículas onde diferentes microgotículas primárias e secundárias que viajam ao longo de caminhos diferentes podem ser feitas coalescerem. O primeiro e o terceiro caminho de eletromolhamento podem se cruzar perpendicularmente um ao outro ou a qualquer ângulo, inclusive de frente. Esta concretização é especialmente útil quando se deseja entregar os componentes de detecção (ver abaixo) nas microgotículas no caminho para coalescência de gotículas. Em ainda outra concretização em que vários primeiro, segundo e terceiro caminhos de eletromolhamento são empregados, os meios para manipular os pontos de impacto são adequadamente controlados por um microprocessador que não apenas cria os caminhos pelos quais as microgotículas passam, mas também sincroniza o movimento de cada microgotícula em relação uma a outra.

[0045] Como mencionado acima, em algumas concretizações, o método da invenção também inclui a etapa de introduzir em um ou mais locais ao longo do caminho, componentes de detecção de nucleotídeos compostos por (a) um sistema de captura de oligonucleotídeo compreendido pelos tipos de sondas fluorescentes especificados abaixo e/ou em nossos pedidos de patentes anteriores (ou sondas com função equivalente); (b) uma polimerase, (c) opcionalmente uma ligase e (d) uma exonuclease e/ou endonuclease capaz de fazer com que o fluoróforo seja liberado do sistema de captura usado em um estado fluorescente. Em uma concretização, alguns ou todos esses componentes são introduzidos juntos ou em estágios nas microgotículas no(s) local(is) ao longo do caminho ou a montante do mesmo (ver acima); por exemplo, estando presente no meio original de microgotículas. A introdução desses componentes de detecção pode ser alcançada em um ou mais locais, por exemplo, por injeção direta usando um injetor de microgotículas ou por coalescência das microgotículas com microgotículas secundárias contendo os materiais relevantes. Numa concretização preferida, uma pirofosfatase é introduzida nas microgotículas a jusante do analito e a montante do primeiro ponto de introdução dos componentes de detecção.

[0046] Vários sistemas de captura podem ser empregados de acordo com nossas patentes anteriores. Por exemplo, em uma concretização, eles são selecionados a partir de sistemas compreendendo (a) um primeiro oligonucleotídeo de fita única marcado com fluoróforos característicos em um estado indetectável e (b) segundo e terceiro oligonucleotídeos de fita única capazes de hibridar com regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo.

[0047] Em outra concretização, eles são selecionados a partir de sistemas compreendendo (a) um primeiro oligonucleotídeo de fita simples incluindo um local de restrição de endonuclease de restrição, um único local de captura de nucleotídeo para capturar as regiões de trifosfato de nucleosídeo único e regiões de oligonucleotídeo justapostas de ambos os lados do transportador do local de corte respectivamente, pelo menos, um fluoróforo e pelo menos um extintor, de modo a extinguir os fluoróforos e (b) segundo e terceiro oligonucleotídeos de fita simples, capazes de hibridar com regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo de ambos os lados do local de captura.

[0048] Em outro, eles são selecionados a partir de sistemas que compreendem tanto (a) um primeiro oligonucleotídeo de cadeia simples, incluindo um local de bloqueio de exonuclease, um local de reconhecimento de endonuclease de restrição localizado no lado 5' do local de bloqueio e incluindo um único local de captura de nucleotídeo para capturar o trifosfato de nucleosídeo único, e pelo menos uma região de fluoróforo localizada no lado 5' do local de reconhecimento disposto de modo a tornar o fluoróforo extinto e (b) um segundo e, opcionalmente, um terceiro oligonucleotídeo de fita única cada um separado do primeiro oligonucleotídeo e capaz de hibridar com regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo que flanqueia os lados 3' e 5' do local de captura ou (a) um primeiro oligonucleotídeo de cadeia simples incluindo um local de bloqueio de exonuclease, um local de reconhecimento de endonuclease de restrição localizado no lado 3' do local de bloqueio e incluindo um único local de captura de nucleotídeos para capturar o trifosfato de nucleosídeo único e pelo menos uma região de fluoróforo localizada no lado 3' do local de reconhecimento disposto de modo a extinguir o(s) fluoróforo(s) e (b) um segundo e, opcionalmente, um terceiro oligonucleotídeo de fita simples, cada um separado do primeiro oligonucleotídeo e capaz de hibridizar com regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo que flanqueia os lados 3' e 5' do local de captura.

[0049] Em outro, eles são selecionados a partir de sistemas compreendendo (i) dois componentes compreendendo; (a) um primeiro oligonucleotídeo compreendendo uma região de fita dupla e uma região de fita simples e (b) um segundo oligonucleotídeo de fita simples cuja sequência de nucleobases é pelo menos parcialmente complementar à da região de fita simples do primeiro oligonucleotídeo ou (ii) um único oligonucleotídeo compreendendo uma região nucleotídica de fita simples cujas extremidades estão ligadas a duas regiões oligonucleotídicas de fita dupla diferentes; e em que os sistemas de captura de oligonucleotídeos são marcados com fluoróforos em um estado indetectável.

[0050] Em ainda outra, eles são selecionados a partir de sistemas que compreendem uma região nucleotídica de fita simples cujas extremidades estão ligadas a regiões oligonucleotídicas de fita dupla, em que pelo menos uma das regiões oligonucleotídicas compreende fluoróforos em um estado indetectável.

[0051] Após a introdução dos componentes de detecção e de preferência depois de um período de incubação, durante o qual um sinal de fluorescência desenvolve, as microgotículas são interrogadas a jusante usando um sistema de detecção que compreende uma fonte incidente de primeira radiação eletromagnética e um fotodetector. Deverá ser observado que, em algumas concretizações, as primeira e segunda fontes de radiação eletromagnética podem ser as mesmas. Por este meio, fluoróforos fluorescentes liberados à medida que o sistema de captura de oligonucleotídeo usado sofre exonucleólise e/ou endonucleólise são detectados e a natureza do trifosfato de nucleosídeo contida em cada microgotícula é determinada. Numa concretização, esta detecção irá ocorrer em uma zona de detecção compreendendo uma superfície provida de locais de detecção no final do caminho aos quais as microgotículas são em última análise acionadas por uma ou uma combinação de fluxo impulsionado por pressão, eletromolhamento convencional, ou EWOD opticamente mediada. Tal superfície pode ser perfilada com estruturas tais como poços e semelhantes para criar estes locais de destino finais. Em outra concretização, a etapa de detecção envolve a introdução dos microgotículas em uma zona de detecção compreendendo uma matriz de tubos capilares através dos quais cada microgotícula é empilhada e viaja antes de ser interrogada pelo sistema de detecção de fluorescência em locais de detecção localizados no ponto de saída.

[0052] Em uma concretização, o sistema de detecção é composto por uma ou mais fontes de primeira radiação eletromagnética, por exemplo, um de mais lasers ou LEDs para interrogar o conteúdo de cada microgotículas e um ou mais fotodetectores ou um dispositivo equivalente sintonizado para o(s) comprimento(s) de onda de fluorescência característico(s) ou envelope(s) de comprimento de onda dos vários fluoróforos empregados no sistema de captura particular que está sendo usado. Qualquer fluorescência emitida detectada pelo(s) fotodetector(es) a partir de então gera um sinal elétrico que pode ser processado e analisado em um computador usando algoritmos conhecidos para revelar dados característicos da sequência do analito.

[0053] Em uma concretização do terceiro aspecto preferido da invenção, é fornecido um método para a pirofosforólise de um analito de ácido nucleico, caracterizado pela etapa de contactar, por vez, cada microgotícula em uma corrente de microgotículas aquosas em um meio transportador imiscível e contendo uma enzima pirofosforolizada com um partícula à qual o analito é anexado, pelo qual a enzima libera uma molécula de trifosfato de nucleosídeo do analito em pelo menos algumas das microgotículas antes de serem removidas ao redor da partícula.

[0054] Em um outro ponto, este método é caracterizado pelo fato de que o sistema de captura de oligonucleotídeos compreende (a) um primeiro oligonucleotídeo de fita simples marcado com fluoróforos característicos em um estado indetectável e (b) segundo e terceiro oligonucleotídeos de fita simples capazes de hibridar com regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo.

[0055] Em outro, este método é caracterizado pelo fato de que o sistema de captura de oligonucleotídeo compreende (a) um primeiro oligonucleotídeo de cadeia simples incluindo um local de corte por endonuclease de restrição, um único local de captura de nucleotídeo para capturar as regiões de trifosfato de nucleosídeo único e oligonucleotídeo justapostas em ambos os lados do local de corte contendo, respectivamente, pelo menos um fluoróforo e pelo menos um extintor de modo a tornar os fluoróforos extintos e (b) segundo e terceiro oligonucleotídeos de fita simples, capazes de hibridar com regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo de ambos os lados do local de captura.

[0056] Em um outro ponto, este método é caracterizado pelo fato de que o sistema de captura de oligonucleotídeo compreende (a) um primeiro oligonucleotídeo de fita simples incluindo um local de bloqueio de exonucleases, um local de reconhecimento de endonucleases de restrição localizado no lado 5' do local de bloqueio e incluindo um único local de captura de nucleotídeo para capturar o trifosfato de nucleosídeo único e pelo menos uma região de fluoróforo localizada no lado 5' do local de reconhecimento disposto de modo a tornar o fluoróforo extinto e (b) um segundo e opcionalmente um terceiro oligonucleotídeo de fita simples, cada um separado do primeiro oligonucleotídeo e capaz de hibridar com regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo que flanqueia os lados 3' e 5' do local de captura ou (a) um primeiro oligonucleotídeo de fita simples, incluindo um local de bloqueio de exonuclease, um local de reconhecimento de endonucleases de restrição localizado no lado 3' do local de bloqueio e incluindo um único local de captura de nucleotídeos para capturar o único trifosfato de nucleosídeo e pelo menos uma região de fluoróforo localizada no lado 3' do local de reconhecimento disposto de modo a tornar o fluoróforo extinto e (b) um segundo e, opcionalmente, um terceiro oligonucleotídeo de fita única, cada um separado do primeiro oligonucleotídeo e capaz de hibridar com regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo que flanqueia os lados 3' e 5' do local de captura.

[0057] Em ainda outra, este método é caracterizado por o sistema de captura de oligonucleotídeos compreender (i) dois componentes compreendendo; (a) um primeiro oligonucleotídeo compreendendo uma região de fita dupla e uma região de fita simples e (b) um segundo oligonucleotídeo de fita simples cuja sequência de nucleobases é pelo menos parcialmente complementar à da região de fita simples do primeiro oligonucleotídeo ou (ii) um único oligonucleotídeo compreendendo uma região nucleotídica de fita simples cujas extremidades estão ligadas a duas regiões oligonucleotídicas de fita dupla diferentes; e em que os sistemas de captura de oligonucleotídeos são marcados com fluoróforos em um estado indetectável.

[0058] Em ainda outra, este método é caracterizado por o sistema de captura de oligonucleotídeo compreender uma região nucleotídica de fita simples cujas extremidades estão ligadas a regiões oligonucleotídicas de fita dupla, em que pelo menos uma das regiões oligonucleotídicas compreende fluoróforos em um estado indetectável.

[0059] Um método da presente invenção adequado para sequenciar um analito de DNA de acordo com o terceiro aspecto preferido da invenção é agora ilustrado pelas seguintes figuras e descrição associada.

[0060] A Figura 1 mostra um plano de um chip microfluídico compreendendo uma zona de preparação de microgotículas 1 e uma zona de manipulação de microgotículas 3 em conjunto em um único chip feito de plástico transparente. 1 compreende regiões contendo fluido 7, 8 e 9 ligadas a entradas 4, 5 e 6 que, respectivamente, introduzem no chip um fluxo pirofosforolizante, um fluxo de pirofosfatase inorgânica e um fluxo de vários químicos de detecção e enzimas necessárias para a identificação de trifosfatos de nucleosídeo de acordo com um de nossos pedidos de patentes anteriores. Estes fluxos são em seguida entregues, respectivamente, para os orifícios 7a, 8a e 9a a partir dos quais várias microgotículas 7b, 8b e 9b são produzidas (por exemplo, utilizando uma cabeça de distribuição de gotículas ou por corte a partir de uma gotícula intermediária maior). 10 é um reservatório contendo microgrânulos compósitos de polímero paramagnético 11 para alguns ou a todos os quais está ligada uma única molécula do analito de polinucleotídeo a ser sequenciado.

Cada um dos 11 é transportado em microgotículas ao longo do caminho de eletromolhamento 12 para um local 7c onde é mantido por magnetismo e contatado com um fluxo de 7b.

Neste local, o analito ligado a 11 é progressivamente pirofosforolizado a uma velocidade tal que, após cada 7b ser desengatado de 11, ele fica vazio ou contém apenas uma molécula de trifosfato de nucleosídeo.

Depois do desengate, 7b, juntamente com microgotículas 8b e 9b, são feitos a mover para 3, onde eles são manipulados ao longo de vários caminhos de eletromolhamento opticamente mediados (definidos aqui por locais quadrados de eletromolhamento 25) a uma temperatura de 30-40ºC, em conformidade com o esquema ilustrado na Figura 2. No processo, 7b e 8b são primeiramente feitos coalescer em primeiros pontos de coalescência 12 para gerar microgotículas intermediárias 13 que são posteriormente feitas coalescer com 9b em segundos pontos de coalescência 14 para gerar uma pluralidade de fluxos de microgotículas finais 15 que se movem para a frente através uma região de incubação 16 mantidos a uma temperatura na faixa de 60 a 75ºC, a fim de permitir que os conteúdos incubem e as reações químicas e enzimáticas necessárias ocorram.

Posteriormente, 15 são transportados para os locais finais na zona de detecção 2, onde são interrogados com luz de uma fonte de LED e qualquer fluorescência emitida por cada microgotícula é detectada usando um fotodetector.

A saída do fotodetector é um fluxo de dados correspondente à sequência do analito que pode ser analisado usando algoritmos de sequenciamento conhecidos.

[0061] A Figura 2 mostra uma vista parcial, em corte, de 3 ilustrando a forma como as várias microgotículas são manipuladas. 3 compreende placas de plástico transparentes ou de vidro superior e inferior (17a e 17b) cada uma 500 µm de espessura e revestidas com camadas transparentes de condutor Óxido de Estanho de Índio (ITO) 18a e 18b com uma espessura de 130 nm.

Cada uma de 18a e 18b está conectada a uma fonte AC 19 com a camada ITO em 18b sendo o terra. 18b é revestida com uma camada de silício amorfo 20 com 800 nm de espessura. 18a e 20 são, cada uma, revestidas com uma camada de espessura 160nm de alumina de alta pureza ou hafnia 21a e 21b, que são por sua vez revestidas com uma monocamada de poli(3- (trimetoxissilil)propilmetacrilato) 22 para tornar suas superfícies hidrofóbicas. 21a e 21b estão espaçadas a 3µM utilizando espaçadores (não mostrados), de modo que as microgotículas sofrem um grau de compressão quando introduzidas neste espaço.

Uma imagem de uma tela pixelizada refletiva, iluminada por uma fonte de luz LED 23 é disposta geralmente abaixo de 17b e luz visível (comprimento de onda 660 ou 830nm) a um nível de 0,01Wcm2 é emitida a partir de cada diodo 24 e causa impacto em 20 por propagação na direção das múltiplas setas ascendentes através de 17b e 18b.

Nos vários pontos de impacto, regiões de carga fotoexcitadas 26 são criadas em 20, as quais induzem ângulos de contato líquido-sólido modificados em 21b nos locais correspondentes de eletromolhamento 25. Essas propriedades modificadas fornecem a força capilar necessária para impulsionar as microgotículas de um ponto 25 para outro. 23 é controlado por um microprocessador (não mostrado) que determina quais de 26 na matriz são iluminados a qualquer momento ao usar um algoritmo pré-programado. Dessa maneira, as várias microgotículas podem ser movidas ao longo dos vários caminhos mostrados na Figura 1 de maneira sincronizada.

[0062] A Figura 3 mostra um plano de cima para baixo de uma microgotícula típica (aqui 7b) localizada em um local 25 em 21b com o contorno pontilhado 7' que delimita a extensão do toque. Neste exemplo, 26 possui forma crescente na direção de deslocamento de 7b.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para manipular uma microgotícula de um meio de reação em um meio transportador imiscível com uma molécula alvo ligada a um suporte sólido com o objetivo de efetuar uma transformação química caracterizado pelo fato de que possui as etapas de (a) colocar a microgotícula em contato com o suporte sólido sob condições em que a microgotícula e o suporte sólido são combinados; (b) permitir que o meio de reação reaja com a molécula alvo e (c) em seguida exercer uma força para induzir o meio de reação a se destacar do suporte sólido e reformar uma microgotícula no fluido transportador.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de reação é um meio para transformar um analito de ácido nucleico e a molécula alvo compreende um polinucleotídeo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que um nucleotídeo é liberado do analito e é levado para longe da vizinhança do suporte sólido em uma microgotícula.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que várias microgotículas são sequencialmente colocadas em contato com o analito, cada um capaz de transportar um nucleotídeo.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a transformação química é usada para determinar a sequência de um analito de ácido nucleico e o método compreende as etapas de: • fazer com que uma corrente de microgotículas do meio de reação compreendendo um meio de digestão no meio transportador imiscível entre em contato com a molécula alvo compreendendo um analito de ácido nucleico ligado ao suporte sólido compreendendo uma partícula uma a uma em um caminho, fazendo com que o analito seja progressivamente digerido em seus nucleotídeos constituintes; • remover as microgotículas de todo o analito em que pelo menos algumas das microgotículas contêm um único nucleotídeo; • adicionalmente transportar as microgotículas ao longo do caminho para uma zona de detecção e • identificar os nucleotídeos dentro das microgotículas na zona de detecção e inferir a sequência da molécula de analito a partir dela.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de digestão compreende uma polimerase e um cofator que faz com que a polimerase libere nucleotídeos um a um da molécula de analito.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o cofator é um ânion polifosfato ou análogo do mesmo.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polifosfato é pirofosfato.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de digestão compreende uma exonuclease e os monofosfatos de nucleotídeos assim liberados são ainda tratados com uma cinase para convertê-los em trifosfatos de nucleotídeos.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos resultantes são feitos a reagir na presença de uma polimerase com um sistema de captura de oligonucleotídeo composto por sondas de fluorescência que em seu estado não utilizado não são fluorescentes e são seletivas para pelo menos um dos tipos de nucleotídeos característicos do analito, resultando na liberação de fluoróforos em um estado detectável, e em que a fluorescência resultante derivada dos fluoróforos liberados em cada microgotícula é detectada usando uma fonte incidente da primeira radiação eletromagnético e um fotodetector.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a liberação de fluoróforos é o resultado da ação de uma endonuclease e/ou exonuclease e, opcionalmente, uma ligase, sendo essa ação catalisada pela captura do nucleotídeo detectado.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o sistema de captura de oligonucleotídeo é introduzido nas microgotículas a jusante da partícula por coalescência de gotículas ou por injeção direta.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o meio de digestão é ainda tratado com uma pirofosfatase antes da reação com o sistema de captura de oligonucleotídeos.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 13, caracterizado pelo fato de que as microgotículas são movidas sobre uma superfície quimicamente modificada para ter áreas com nível localmente aumentado de molhabilidade e em que esse aumento na molhabilidade é usado para mediar o molhamento do fluido da microgotícula em torno da molécula alvo.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 14, caracterizado pelo fato de que são usados efeitos de eletromolhamento ou eletromolhamento opticamente mediado para modificar localmente a molhabilidade de uma região da superfície ao redor da partícula.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 15, caracterizado pelo fato de que as microgotículas são transportadas na terceira etapa usando eletromolhamento ou eletromolhamento opticamente mediado.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos parte do caminho é um espaço microfluídico de eletromolhamento opticamente mediado, construído por ou definido por: • uma primeira parede compósita composta por • um primeiro substrato transparente; • uma primeira camada condutora transparente no substrato com uma espessura na faixa de 70 a 250 nm; • uma camada fotoativa ativada por radiação eletromagnética na faixa de comprimento de onda 400- 1000nm na camada condutora com uma espessura na faixa de 300-1000nm e • uma primeira camada dielétrica na camada condutora com uma espessura na faixa de 120 a 160 nm e ▪ uma segunda parede compósita composta por • um segundo substrato; • uma segunda camada condutora transparente no substrato com uma espessura na faixa de 70 a 250 nm e

• opcionalmente, uma segunda camada dielétrica na camada condutora com uma espessura na faixa de 25 a 50 nm; em que as superfícies expostas das primeira e segunda camadas dielétricas estão dispostas a menos de 50 µm de distância.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o espaço microfluídico é ativado para transportar as microgotículas por meio de (a) uma fonte AC que fornece uma diferença de potencial entre as primeira e segunda paredes compósitas que conectam as primeira e segunda camadas condutoras e (b) pelo menos uma fonte de segunda radiação eletromagnética com uma energia maior que o intervalo de banda da camada fotoexcitável adaptada para colidir com a camada fotoativa para induzir os primeiros locais de eletromolhamento efêmeros correspondentes na superfície da primeira camada dielétrica.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que as primeira e segunda fontes de radiação eletromagnética são as mesmas.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa inicial de transportar a partícula para o local em que a digestão ocorre em uma microgotícula usando eletromolhamento ou eletromolhamento mediado opticamente ou magneticamente.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 20, caracterizado pelo fato de que a partícula é mantida magneticamente no local desejado enquanto a corrente de microgotículas é contatada com ela.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 21, caracterizado pelo fato de que a fluorescência é detectada pelas etapas de introdução das microgotículas na entrada de pelo menos um tubo capilar e fazendo com que a primeira radiação eletromagnética colida com as microgotículas à medida que elas emergem da(s) saída(s).

23. Método para pirofosforizar um analito de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de por em contato por vez cada microgotícula em uma corrente de microgotículas aquosas suspensas em um meio transportador e contendo uma enzima de pirofosforolização com uma partícula à qual o analito é anexado por onde a enzima é feita liberar uma molécula de trifosfato de nucleosídeo do analito em pelo menos algumas das microgotículas antes de serem removidas ao redor da partícula.