JP2020522996A - 薬剤前処理による間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、効率的な間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法を提供することを目的とするものである。
間葉系幹細胞の培地にスタチン系薬剤を加え、12〜24時間前処理した後、細胞の培地を無エクソソームの完全培地に変更して引き続き培養し、48時間後に馴化培地を収集し、スタチン系薬剤で前処理した間葉系幹細胞から分泌されたエクソソームを超遠心により分離して得ることを含む。
馴化培地を収集した後、遠心により細胞を除去する工程と、遠心により細胞破片を除去する工程と、高速遠心により大型小胞を除去する工程と、そして超遠心により沈殿を回収し、再懸濁後に再度超遠心し、エクソソームを得る工程とをこの順で含む。
間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法
差次接着により初代ラット(SDラット、60〜80g)BM−MSCsを単離し、3〜4代目に拡大継代して使用に備えた。BM−MSCs完全培地(IMDM、Invitrogen、アメリカ)にATVを加え、24時間前処理した後、細胞の培地を無エクソソームの完全培地(18時間の超遠心により得られた10%FBS含有IMDM)に変更して引き続き培養した。48時間後、馴化培地を回収し、超遠心によりATVで前処理したBM−MSCsに分泌されたエクソソーム(MSCATV−Exo)を分離して得た。具体的な超遠心工程は、馴化培地を回収した後、300gで10分遠心することにより、細胞を除去する工程と、2000gで20分遠心することにより、細胞破片を除去する工程と、16500gで30分高速遠心することにより、大型小胞を除去する工程と、120000gで70分超遠心することにより沈殿を回収し、再懸濁後に、再度120000gで70分超遠心し、エクソソームを得る工程とを含む。
電子顕微鏡(HITACHI、H−600IV、日本)で、形態構造を解析観察すること、NTA(Malvern Instruments、NanoSight、イギリス)で、エクソソームの粒径分布を分析すること、及びWestern Blotでエクソソーム蛋白質マーカーを検出することを含む。
超遠心により分離して得たMSCATV−Exoは、電子顕微鏡下で球状若しくはディスク状を示し、100nm程度の大きさを有する。NTA分析により、その粒径分布は30〜150nmの範囲にあり、Western Blotアッセイにより、MSCATV−ExoはTSG101、Alix、CD63、CD81などのエクソソーム蛋白質マーカーを高発現していることが明らかとなる。ATVで前処理されたBM−MSCと前処理されていないBM−MSCは、それぞれの分泌されたエクソソームが、形態、粒径分布及び蛋白質マーカーに有意な差が認められていない。具体的な結果として、図1A〜図1Cに示した。なお、図1Aは、間葉系幹細胞由来エクソソーム(MSC−Exo)の形態構造が電子顕微鏡下で観察されたものであり、球状若しくはディスク状を示し、大きさが100nm程度であり、スタチン系前処理した後、形態が変化しなっかた。図1Bでは、MSC−Exoの粒径分布がNTAにより分析され、スタチン系前処理されたと処理されていないMSC−Exoの粒径分布は、ともに30〜150nmの範囲にある。図1Cでは、エクソソームの蛋白質マーカー同定を示し、スタチン系処理したMSC−Exoは、TSG101、Alix、CD63、CD81などのエクソソーム蛋白質マーカーを高発現している。
Claims (10)
- スタチン系薬剤で間葉系幹細胞を前処理し、分泌されたエクソソームを採取するように処理された間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞由来エクソソームの調製方法。
- 間葉系幹細胞の培地にスタチン系薬剤を加え、12〜24時間前処理した後、細胞の培地を無エクソソームの完全培地に変更して引き続き培養し、48時間後に馴化培地を収集し、スタチン系薬剤で前処理した間葉系幹細胞から分泌されたエクソソームを超遠心により分離して得ることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記超遠心は、
馴化培地を収集し、300gで10分遠心することにより、細胞を除去する工程と、
2000gで20分遠心することにより、細胞破片を除去する工程と、
16500gで30分高速遠心することにより、大型小胞を除去する工程と、
120000gで70分超遠心することにより沈殿を回収し、再懸濁後に、再度120000gで70分超遠心し、エクソソームを得る工程とを含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記スタチン系薬剤は、アトルバスタチンを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞又は脂肪間葉系幹細胞を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1〜5の何れか1項に記載の方法により調製したエクソソームである。
- 間葉系幹細胞の抗アポトーシス能及び/又はホーミング促進能を向上させる製剤の調製のためのスタチン系薬剤の使用。
- 間葉系幹細胞による心筋梗塞微小環境改善作用及び/又は心筋修復能力を有するエクソソームの分泌を促進する製剤の調製のためのスタチン系薬剤の使用。
- 前記スタチン系薬剤は、アトルバスタチンを含み、
好ましくは、スタチン系薬剤1μMで間葉系幹細胞を24時間前処理する、請求項7又は8に記載の使用。 - 前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞又は脂肪間葉系幹細胞を含む、請求項7又は8に記載の使用。
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