JP2020519312A - 酵素産物 - Google Patents
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Abstract
Description
1.DNAを加水分解するために、ヌクレアーゼ(すなわち、ヌクレアーゼ酵素)により処理するステップ、
2.沈殿剤及び/又は凝集剤を使用するステップ、これにより、不溶性複合体を形成させることにより、加水分解されたDNAを析出させる、及び
3.後続するマイクロ濾過ステップを実施するステップ
を組み合わせた場合にのみ、組換えDNAの所望の低下を実現することが明らかとなった:
(i)組換え酵素、核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物Iを提供するステップと、
(ii)核酸を分解するために組成物Iにヌクレアーゼを添加し、これにより酵素、分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物IIを提供するステップと、
(iii)分解された核酸を複合体化させるために、組成物IIに分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップと、これにより酵素、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物IIIを提供し、
(iv)任意選択で、固体/液体分離により組成物IIIを精製するステップと、これにより複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む分離固相、並びに酵素を含む液体組成物IVを提供し、
(v)マイクロ濾過により組成物III又は組成物IVを精製するステップと、これにより酵素を含む組成物Vを提供する、
を含む。
− 酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼからなる群から選択され、及び好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、キシロースイソメラーゼからなる群から選択され;並びに/或いは
− (b−1)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等;(b−2)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等;及び(b−3)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等からなる群から選択され;並びに/或いは
− 炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちUDP−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はN−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも1つに属する。
a)サイズ排除限界が
− 1000kDaを超える、500kDaを超える、400kDaを超える、300kDaを超える、200kDaを超える、150kDaを超える、100kDaを超える、90kDaを超える、80kDaを超える、70kDaを超える、60kDaを超える、50kDaを超える、40kDaを超える、30kDaを超える、若しくは20kDaを超える;及び/又は
− 5μmを超える、4μmを超える、3μmを超える、2μmを超える、1μmを超える、0.5μmを超える、0.4μmを超える、0.3μmを超える、0.2μmを超える、若しくは0.1μmを超える
メンブレン;或いは
b)同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルター
を含み、いずれの場合にも、組成物Vは、マイクロ濾過の濾液である。
(vi)追加のマイクロ濾過又は限外濾過により組成物Vを精製し、これにより酵素を含む組成物VIを提供する
追加のステップを含む。
a)100kDaを超える、80kDaを超える、60kDaを超える、50kDaを超える、40kDaを超える、30kDaを超える、20kDaを超える、15kDaを超える、10kDaを超える、5kDaを超える、若しくは1kDaを超えるサイズ排除限界を有するメンブレン;又は
b)同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルター
を含み、及び組成物VIは、マイクロ濾過の濾液又は限外濾過の保持液である。
a.カチオン性ポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー(CAS Reg No.25988−97−0)、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー(CAS Reg No.31568−35−1)、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー(CAS Reg No.42751−79−1)等;並びに
b.カチオン性ポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド(CAS Reg No.67953−80−4)、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー(CAS Reg No.69418−26−4)等;並びに
c.陰イオン性ポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー(CAS Reg No.25987−30−8;CAS Reg No.9003−06−9)等;並びに
d.硫酸アンモニウム(CAS Reg No.10043−01−3);並びに
e.塩化カルシウム(CAS Reg No.10035−04−8;CAS Reg No.10043−52−4)
が挙げられるが、これらに限定されない。
(i−a)酵素の遺伝子を発現ベクターにクローニングするサブステップ、
(i−b)遺伝子を有する発現ベクターを微生物宿主に導入するサブステップ、
(i−c)微生物宿主において酵素を細胞内発現させるサブステップ、すなわち組換え酵素を細胞内発現させる条件下で、微生物宿主を発酵させるサブステップ、及び
(i−d)細胞破壊により、微生物宿主から酵素(及び核酸)を放出させるサブステップ、これにより組成物Iを提供する;すなわち組換え酵素を放出させるために、細胞破壊により発酵させた細胞を破壊するサブステップ、これにより組換え酵素産物を含む未精製のライセートをもたらす
のうちの1つ又は複数を含む。
(ii−a)組成物Iにヌクレアーゼを添加するサブステップ、
(ii−b)核酸を分解し、これにより組換え酵素を含む組成物II、分解された核酸、及び細胞デブリを提供するために、細胞破壊により微生物宿主から組換え酵素及び核酸を放出させるサブステップ;すなわち組換え酵素及び核酸を放出させるために細胞破壊により発酵させた細胞を破壊して、組換え酵素、分解された核酸、及び細胞デブリ(及びヌクレアーゼ)を含む未精製のライセートをもたらすサブステップ
を含む。
− 大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌K−12W3110の遺伝的に改変された派生株、及び最も好ましくはLE1B109であり、並びに/或いは
− 酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−1−ホスフェートホスファターゼ、UDP−グルコース−6−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ(UDP形成型)、α,α−トレハロースホスフェートシンターゼ(UDP形成型)、UDP−グルコース−ヘキソース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−グルコース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−グルコース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UDP−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−N−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−A−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−4−デオキシ−4−ホルムアミド−L−アラビノーストランスフェラーゼ、6−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、UMPキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、UDP−N−アセチルグルコサミン−2−エピメラーゼ(非加水分解型)、β−ガラクトシダーゼ、N−アセチルノイラミン酸リアーゼ、N−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定N−アセチルマンノサミン−6−ホスフェート−2−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される1つ又は複数の追加の遺伝子の欠損により改変されている。
a.微生物宿主において組換え酵素を細胞内で発現させるステップと、
b.細胞破壊により組換え酵素を放出させて、未精製ライセートをもたらすステップと、
c.プロセス溶液を含有する酵素産物内で核酸を分解するためにヌクレアーゼを添加するステップ、これにより酵素処理されたライセートをもたらす、
d.核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップ、これにより複合体化したライセートをもたらす、
e.液相から細胞デブリ及び核酸/沈殿剤複合体を取り除くために液体/固体分離を行うステップ、これにより清澄化したライセートをもたらす、
f.残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップ、これにより濾液をもたらす
を含み、上記方法は、好ましくは、それぞれヌクレアーゼ酵素を用いて、ステップeの液体/固体分離の後に行われる清澄化したライセートの処理、又はマイクロ濾過ステップfの後に行われる濾液の処理を含まない、食品グレード酵素産物を製造する方法に関する。
(i)組換え酵素産物、核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物Iを提供するステップと、
(ii)核酸を分解するために組成物Iにヌクレアーゼを添加するステップ、これにより酵素産物、分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物IIを提供する、
(iii)分解された核酸を複合体化させるために、組成物IIに分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップ、これにより酵素産物、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物IIIを提供する、
(iv)任意選択で、固体/液体分離により組成物IIIを精製するステップ、これにより、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む分離固相、並びに酵素産物を含む液体組成物IVを提供する、
(v)マイクロ濾過により組成物III又は組成物IVを精製するステップ、これにより酵素産物を含む組成物Vを提供する
を含み、上記方法は、それぞれ、液体/固体分離ステップ(iv)の後にヌクレアーゼ酵素を用いて行われる清澄化したライセート(組成物IV)の処理、又はマイクロ濾過ステップ(v)の後にヌクレアーゼ酵素を用いて行われる濾液(組成物V)の処理を含まないことが好ましい。
(i)組換え酵素産物、核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物Iを提供するステップと、
(ii)核酸を分解するために組成物Iにヌクレアーゼを添加するステップ、これにより酵素産物、分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物IIを提供する、
(iii)分解された核酸と複合体化させるために、組成物IIに分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップ、これにより酵素産物、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物IIIを提供する、
(iv)任意選択で、固体/液体分離により組成物IIIを精製するステップ、これにより主に複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリ、及び任意選択で組成物IIIに由来する酵素産物の残渣物を含む分離固相、並びに主に酵素産物、及び任意選択で細胞デブリの残渣物、組成物IIIに由来する複合体化した分解された核酸を含む液体組成物IVを提供する、
(v)マイクロ濾過により組成物III又は組成物IVを精製するステップ、これにより酵素産物を含む組成物Vを提供する
を含み、上記方法は、それぞれ、液体/固体分離ステップ(iv)の後にヌクレアーゼ酵素を用いて行われる清澄化したライセート(組成物IV)の処理、又はマイクロ濾過ステップ(v)の後にヌクレアーゼ酵素を用いて行われる濾液(組成物V)の処理を含まないことが好ましい。
a.酵素産物遺伝子を発現ベクターにクローニングするステップ、
b.酵素産物遺伝子を有する発現ベクターを微生物宿主に導入するステップ、
c.組換え酵素産物を細胞内発現させる条件下で、上記ステップ(b)の微生物宿主を発酵させるステップ。
d.組換え酵素産物を放出させるために、細胞破壊により上記ステップ(c)の発酵させた細胞を破壊するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する未精製のライセートをもたらす、
e.未精製のライセートに由来する核酸を分解するために、未精製のライセートをヌクレアーゼと共にインキュベートするステップ、これにより酵素処理されたライセートをもたらす、
f.核酸と複合体形成するように沈殿剤を酵素処理されたライセートに添加するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する複合体化したライセートをもたらす、
g.液相から細胞デブリ及び核酸と沈殿剤の複合体を取り除くために複合体化したライセートの液体及び/又は固体分離を行うステップ、これにより組換え酵素産物を含有する清澄化したライセートをもたらす、並びに
h.残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くために、酵素処理され、及び任意選択で清澄化したライセートをマイクロ濾過ステップに供するステップ、
のうちの1つ又は複数のステップを含むことを特徴とし、
上記方法は、それぞれ、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる、ステップgの液体/固体分離後の清澄化したライセートの処理、又はステップhのマイクロ濾過後の濾液の処理を含まないことが好ましい。
− 酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼからなる群から選択され、及び好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、キシロースイソメラーゼからなる群から選択され、並びに/或いは
− (b−1)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等;(b−2)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等;及び(b−3)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等からなる群から選択され、並びに/或いは
− 炭水化物修飾酵素であり、且つ、糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちUDP−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はN−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも1つに属し、
微生物宿主大腸菌内で、好ましくは研究室株大腸菌K−12W3110の遺伝的に改変された派生株内で、及び最も好ましくはLE1B109内で、発現された方法とも関連する。
a.カチオン性ポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー(CAS Reg No.25988−97−0)、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー(CAS Reg No.31568−35−1)、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー(CAS Reg No.42751−79−1)等;並びに
b.カチオン性ポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド(CAS Reg No.67953−80−4)、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー(CAS Reg No.69418−26−4)等;並びに
c.陰イオン性ポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー(CAS Reg No.25987−30−8;CAS Reg No.9003−06−9)等;並びに
d.硫酸アンモニウム(CAS Reg No.10043−01−3);並びに
e.塩化カルシウム(CAS Reg No.10035−04−8;CAS Reg No.10043−52−4)
の凝集剤からなる群より選択される。
− 「Enter Query Sequence」欄:クエリサブレンジ:無し
− 「Choose Search Set」欄:データベース:非冗長性のタンパク質配列(nr);任意選択のパラメーター:無し
− 「Program Selection」欄:アルゴリズム:blastp(タンパク質−タンパク質BLAST)
− アルゴリズムパラメーター:「General parameters」欄:最大標的配列:100〜20000、好ましくは20000;ショートクエリ:短いインプット配列についてパラメーターを自動的に調整する;期待閾値:10;ワードサイズ:6;クエリ範囲内の最大一致:0
− アルゴリズムパラメーター:「Scoring parameters」欄:マトリックス:BLOSUM62;ギャップコスト:既存:11エクステンション:1;組成調整(compositional adjustments):条件成分に応じたマトリックス調整(Conditional compositional score matrix adjustment)
− アルゴリズムパラメーター:「Filters and Masking」欄:フィルター:無し;マスク:無し
の設定を使用して望み通り調節可能である。
a.炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b.アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
c.脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される方法に関する。
a.組換え酵素産物を含有する細胞破壊未精製ライセートを、ヌクレアーゼを用いて処理するステップと、これにより組換え酵素産物、分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物IIを提供し、
b.核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップ、これにより酵素産物、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物IIIを提供し、
c.液相から細胞デブリ及び核酸/沈殿剤複合体を取り除くために液体/固体分離を行うステップと、これにより、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む分離固相、並びに酵素産物を含む液体組成物IVを提供し、
d.残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップ、これにより酵素産物を含む組成物Vを提供する、
を含む方法に関する。
a.組成物Iとの比較において、組成物V中の核酸含有量が低下していること、及び/又は
b.組成物Iとの比較において、組成物V中の酵素産物の触媒活性が回復していること
により特徴づけられる。
a.炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b.アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、及び
c.脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される調製物に関する。
A)大腸菌株を提供するステップと、
B)任意選択で、栄養培地を添加するステップと、
C)発酵させるステップと、これにより発酵ブロスを取得する、
D)任意選択で、発酵ブロスの固体/液体分離を行うステップと、これによりバイオマスを取得する、
E)任意選択で、ホモジナイゼーションするステップと、
F)ヌクレアーゼを用いて処理するステップ;任意選択で、その後に沈殿剤を添加するステップと、
G)固体/液体分離を行うステップと、これにより上清を取得する、
H)任意選択で、濾過を行うステップと、これにより酵素調製物を取得する、
を含む、酵素調製物を製造する方法とも関連する。
a.炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b.アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
c.脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される酵素調製物に関する。
a)微生物宿主において組換え酵素を細胞内発現させるステップと
b)細胞破壊により組換え酵素を放出させるステップと、これにより未精製のライセートをもたらし、
c)プロセス溶液を含有する酵素産物内で核酸を分解するためにヌクレアーゼを添加するステップと、これにより酵素処理されたライセートをもたらし、
d)核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップと、これにより複合体化したライセートをもたらすステップと、
e)液相から細胞デブリ及び核酸/沈殿剤複合体を取り除くために液体/固体分離を行うステップと、これにより清澄化したライセートをもたらし、
f)残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップと、これにより濾液をもたらす、
を含み、好ましくは、液体/固体分離ステップe)の後、及び/又はマイクロ濾過ステップf)の後に、未精製のライセート若しくは濾液のいずれについてもヌクレアーゼ酵素を用いて行われる処理を含まない、食品グレード酵素産物を製造する方法。
a)酵素産物遺伝子を発現ベクターにクローニングするステップ、
b)酵素産物遺伝子を有する発現ベクターを微生物宿主に導入するステップ、
c)組換え酵素産物を細胞内発現させる条件下で、ステップ(b)の微生物宿主を発酵させるステップ、
d)組換え酵素産物を放出させるために、細胞破壊によりステップcの発酵させた細胞を破壊するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する未精製のライセートをもたらす;
e)清澄化したライセートに由来する核酸を分解するために、清澄化したライセートをヌクレアーゼと共にインキュベートするステップ、これにより酵素処理されたライセートをもたらす、
f)核酸と複合体形成するように沈殿剤をライセートに添加するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する複合体化したライセートをもたらす、
g)液相から細胞デブリ及び核酸と沈殿剤の複合体を取り除くために複合体化したライセートの液体及び/又は固体分離を行うステップ、これにより組換え酵素産物を含有する清澄化したライセートをもたらす、並びに
h)残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くために、酵素処理されたライセートをマイクロ濾過ステップに供するステップ
のうちの1つ又は複数を含むことを特徴とする、組換え酵素産物を製造する方法であって、
好ましくは、液体/固体分離ステップgの後、及び/又はマイクロ濾過ステップhの後に、未精製のライセート又は濾液のいずれについても、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる処理を含まない方法。
a)カチオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー(CAS Reg No.25988−97−0)、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー(CAS Reg No.31568−35−1)、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー(CAS Reg No.42751−79−1)等、
b)カチオン性のポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド(CAS Reg No.67953−80−4)、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー(CAS Reg No.69418−26−4)等、
c)陰イオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー(CAS Reg No.25987−30−8;CAS Reg No.9003−06−9)等、
d)硫酸アンモニウム(CAS Reg No.10043−01−3)、
e)塩化カルシウム(CAS Reg No.10035−04−8;CAS Reg No.10043−52−4)
の凝集剤からなる群より選択される、条項1から6のいずれか1項に記載の方法。
a)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
c)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される、条項1から20のいずれか1項に記載の方法。
a)組換え酵素産物を含有する細胞破壊未精製ライセートを、ヌクレアーゼを用いて処理するステップと、
b)沈殿剤を添加するステップと、これにより核酸を複合体化させ、
c)液相から細胞デブリ及び核酸/沈殿剤複合体を取り除くために、液体/固体分離を行うステップと、
d)残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くために、マイクロ濾過ステップを実施するステップと
を含む、条項1から23のいずれか1項に記載の方法。
a)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
c)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等
からなる群から選択される調製物。
a)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
c)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等、
からなる群から選択される、条項29から32のいずれか1項に記載の酵素調製物。
<組成物Iを用いた組換え酵素産物の処理>
発現プラスミドpLE1A27(よく知られたベクターpRSF−1bの派生体)上にコードされるスクロースシンターゼ遺伝子を有し、スクロースシンターゼを細胞内で発現する組換え発現宿主LE1B109のバイオマスのホモジナイゼーションにより、シロイヌナズナから組換えスクロースシンターゼの未精製細胞抽出物(NCBI参照配列:NP_197583.1,配列番号33)を調製する。ホモジナイズされるバイオマスは、発酵ブロスの濃縮により取得された濃縮済みの細胞調製物であり、600g/Lのバイオマス当量に調整される。ホモジナイゼーション後に、組成物Iが得られる。
<野生型シロイヌナズナのスクロースシンターゼの発現及びその処方物>
野生型シロイヌナズナのスクロースシンターゼをコードする遺伝子(NCBI参照配列:NP_197583.1、配列番号33)を、発現ベクターpLE1A17(pRSF−lbの派生体、Novagen社)にクローン化する。得られたプラスミドは、大腸菌BL21(DE3)細胞の形質転換に使用する。
<野生型トマトのUDP−グリコシルトランスフェラーゼの発現及びその処方物>
野生型トマトのUDP−グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(UGTSL2)(GenBank受託番号XP_004250485.1、配列番号55)を、発現ベクターpLE1A17(pRSF−1bの派生体、Novagen社)にクローン化する。得られたプラスミドは、大腸菌BL21(DE3)細胞の形質転換に使用する。
<野生型ステビア・レバウディアナのグリコシルトランスフェラーゼの発現及びその処方物>
野生型ステビア・レバウディアナのグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(UGT76G1)(GenBank受託番号AAR06912.1、配列番号4)を、発現ベクターpLE1A17(pRSF−1bの派生体、Novagen社)にクローン化する。得られたプラスミドは、大腸菌BL21(DE3)細胞の形質転換に使用する。
Claims (64)
- 組換え酵素処方物を製造する方法であって、
(i)組換え酵素、核酸、及び任意選択で細胞デブリを含む組成物Iを提供するステップと、
(ii)前記核酸を分解するために前記組成物Iにヌクレアーゼを添加するステップと、これにより酵素、分解された核酸、及び任意選択で前記細胞デブリを含む組成物IIを提供し、
(iii)前記分解された核酸と複合体化させるために、組成物IIに前記分解された核酸用の沈殿剤を添加するステップと、これにより前記酵素、複合体化した分解された核酸、及び任意選択で前記細胞デブリを含む組成物IIIを提供し、
(iv)任意選択で、固体/液体分離により前記組成物IIIを精製するステップと、これにより前記複合体化した分解された核酸、及び任意選択で前記細胞デブリを含む分離固相、並びに前記酵素を含む液体組成物IVを提供し、
(v)マイクロ濾過により前記組成物III又は前記組成物IVを精製するステップと、これにより前記酵素を含む組成物Vを提供する、
を含む方法。 - 前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、又は混合したエキソ/エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、配列番号1又は配列番号2の配列と、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一である、請求項1又は2に記載の方法。
- ステップ(ii)において、前記ヌクレアーゼが、組成物IIのバイオマス当量1グラム当たり50U〜2000U、50U〜1000U、50U〜500U、100U〜300U、150U〜300U、及び好ましくは200U〜300Uの量で添加される、請求項1項から3のいずれか記載の方法。
- 前記組換え酵素が、
− 酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼからなる群から選択され、及び好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、キシロースイソメラーゼからなる群から選択され、並びに/或いは
− (b−1)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等;(b−2)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等;及び(b−3)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等からなる群から選択され、並びに/或いは
− 炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちUDP−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はN−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも1つに属する、
請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組換え酵素が、野生型酵素である、又は酵素エンジニアリング技術により派生した改良型バリアントである、請求項5に記載の方法。
- ステップ(v)における前記マイクロ濾過が、残留固体及び/又は酵素よりも高い分子量を有するコンポーネントの除去を含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(v)における前記マイクロ濾過が、
a)粒径排除限界が
− 1000kDaを超える、500kDaを超える、400kDaを超える、300kDaを超える、200kDaを超える、150kDaを超える、100kDaを超える、90kDaを超える、80kDaを超える、70kDaを超える、60kDaを超える、50kDaを超える、40kDaを超える、30kDaを超える、若しくは20kDaを超える、及び/又は
− 5μmを超える、4μmを超える、3μmを超える、2μmを超える、1μmを超える、0.5μmを超える、0.4μmを超える、0.3μmを超える、0.2μmを超える、若しくは0.1μmを超える
メンブレン、或いは
b)同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルター
を含み、いずれの場合にも、前記組成物Vが、前記マイクロ濾過の濾液である、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。 - (vi)追加のマイクロ濾過又は限外濾過により前記組成物Vを精製するステップであって、これにより前記酵素を含む組成物VIを提供する追加のステップを含む、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(vi)における前記追加のマイクロ濾過又は限外濾過が、
a)100kDaを超える、80kDaを超える、60kDaを超える、50kDaを超える、40kDaを超える、30kDaを超える、20kDaを超える、15kDaを超える、10kDaを超える、5kDaを超える、若しくは1kDaを超える粒径排除限界を有するメンブレン、又は
b)同等の分子量排除特性を有するフィルター、好ましくはデプスフィルター
を含み、及び前記組成物VIが、前記マイクロ濾過の濾液又は前記限外濾過の保持液である、請求項9に記載の方法。 - 前記沈殿剤が、カチオン性ポリマーである、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記沈殿剤が、キトサン、ポリアミン、ポリアミノ酸、及びポリアクリルアミドからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記沈殿剤が、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、及びポリ−N−メチルビニルアミンからなる群から選択されるポリアミンである、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記沈殿剤が、ポリアルギニン及びポリリジンから選択されるポリアミノ酸である、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記沈殿剤が、ポリエチレンイミン及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記沈殿剤が、
− 好ましくはジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー、及びジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマーからなる群から選択される、カチオン性のポリアミンに基づく凝集剤、並びに
− 好ましくはホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド、及びアクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマーからなる群から選択される、カチオン性のポリアクリルアミドに基づく凝集剤、並びに
− 陰イオン性のポリアミンに基づく凝集剤、好ましくはアクリルアミド−アクリル酸コポリマー、並びに
− 硫酸アンモニウム、並びに
− 塩化カルシウム
からなる群から選択される凝集剤である、又はそれを含む、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(vi)の前記限外濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる前記保持液(組成物VI)の処理を含まない、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(vi)の前記マイクロ濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる前記濾液(組成物VI)の処理を含まない、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(v)の前記マイクロ濾過の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる前記濾液(組成物VI)の処理を含まない、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記液体/固体分離ステップの後、前記マイクロ濾過ステップの後、及び/又は前記限外濾過ステップ後のそれぞれにおいて、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われるそれぞれ前記清澄化したライセート、前記濾液、又は前記保持液の処理を含まない、請求項1から19のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(ii)の他に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われる任意の追加の処理を含まない、請求項1から20のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(i)が、
(i−a)前記酵素の遺伝子を発現ベクターにクローニングするサブステップ、
(i−b)前記遺伝子を有する前記発現ベクターを微生物宿主に導入するサブステップ、
(i−c)微生物宿主において前記酵素を細胞内発現させるサブステップ、すなわち前記組換え酵素を細胞内発現させる条件下で、前記微生物宿主を発酵させるサブステップ、及び
(i−d)細胞破壊により、前記微生物宿主から前記酵素を放出させるサブステップ、これにより前記組成物Iを提供する、すなわち、前記組換え酵素を放出させるために、細胞破壊により前記発酵させた細胞を破壊するサブステップ、これにより組換え酵素産物を含む未精製のライセートをもたらす、
のうちの1つ又は複数を含む、請求項1から21のいずれか1項に記載の方法。 - 前記微生物宿主が
− 大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌K−12W3110の遺伝的に改変された派生株、及び最も好ましくはLE1B109であり、並びに/或いは
− 酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−1−ホスフェートホスファターゼ、UDP−グルコース−6−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ(UDP形成型)、α,α−トレハロースホスフェートシンターゼ(UDP形成型)、UDP−グルコース−ヘキソース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−グルコース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−グルコース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UDP−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−N−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−A−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−4−デオキシ−4−ホルムアミド−L−アラビノーストランスフェラーゼ、6−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、UMPキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、UDP−N−アセチルグルコサミン−2−エピメラーゼ(非加水分解型)、β−ガラクトシダーゼ、N−アセチルノイラミン酸リアーゼ、N−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定N−アセチルマンノサミン−6−ホスフェート−2−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される1つ又は複数の追加の遺伝子の欠損により改変されている、
請求項22に記載の方法。 - a)微生物宿主において組換え酵素を細胞内発現させるステップと、
b)細胞破壊により前記組換え酵素を放出させるステップと、これにより未精製のライセートをもたらし、
c)プロセス溶液を含有する前記酵素産物内で核酸を分解するためにヌクレアーゼを添加するステップと、これにより酵素処理されたライセートをもたらし、
d)核酸と複合体化するように沈殿剤を添加するステップと、これにより複合体化したライセートをもたらし、
e)液相から細胞デブリ及び核酸/沈殿剤複合体を取り除くために液体/固体分離を行うステップと、これにより清澄化したライセートをもたらし、
f)残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くためにマイクロ濾過ステップを実施するステップと、これにより濾液をもたらす、
を含む、食品グレードの酵素産物を製造する方法。 - 前記液体/固体分離ステップe)の後、及び/又は前記マイクロ濾過ステップf)の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われるそれぞれ前記未精製のライセート又は前記濾液の処理を含まない、請求項24に記載の方法。
- 組換え酵素産物を製造する方法であって、
a)酵素産物遺伝子を発現ベクターにクローニングするステップ、
b)前記酵素産物遺伝子を有する前記発現ベクターを微生物宿主に導入するステップ、
c)前記組換え酵素産物を細胞内発現させる条件下で、ステップb)の微生物宿主を発酵させるステップ、
d)前記組換え酵素産物を放出させるために、細胞破壊によりステップc)の発酵させた細胞を破壊するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する未精製のライセートをもたらし、
e)前記清澄化したライセートに由来する核酸を分解するために、前記清澄化したライセートをヌクレアーゼと共にインキュベートするステップ、これにより酵素処理されたライセートをもたらし、
f)核酸と複合体形成するように沈殿剤を前記ライセートに添加するステップ、これにより組換え酵素産物を含有する複合体化したライセートをもたらし、
g)前記液相から細胞デブリ及び核酸と沈殿剤の複合体を取り除くために前記複合体化したライセートの液体及び/又は固体分離を行うステップ、これにより組換え酵素産物を含有する清澄化したライセートをもたらし、並びに
h)残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くために、前記酵素処理されたライセートをマイクロ濾過ステップに供するステップ、
のうちの1つ又は複数のステップを含む方法。 - 前記液体/固体分離ステップg)の後、及び/又は前記マイクロ濾過ステップh)の後に、ヌクレアーゼ酵素を用いて行われるそれぞれ前記未精製のライセート又は前記濾液の処理を含まない、請求項26に記載の方法。
- 前記微生物宿主が、大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌K−12W3110の遺伝的に改変された派生株であり、及び最も好ましくはLE1B109である、請求項1から27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、ベクターpRSF−1bに基づく、請求項1から28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、抗生物質耐性遺伝子を有しない、請求項1から29のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項24のステップ(a)において、又は請求項26のステップ(c)において適する消泡剤が添加され、前記消泡剤が、ポリプロピレングリコール(CAS Reg No.25322−69−4)、ポリグリセロールポリエチレン−ポリプロピレンブロックコポリマー(CAS Reg No.78041−14−2)、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー(CAS Reg No.9003−11−6)、ポリプロピレングリセロールモノブチルエーテル(CAS Reg No.9003−13−8)、ポリジメチルシロキサン(CAS Reg No.63148−62−9;CAS Reg No.68083−18−1)、シリカ(CAS Reg No.7631−86−9;CAS Reg No.63231−67−4)、ステアリン酸(CAS Reg No.57−11−4)、セスキオレイン酸ソルビタン(CAS Reg No.8007−43−0)、グリセロールモノステアレート(CAS Reg No.123−94−4)、ポリソルベート(ポリソルベート60(CAS Reg No.9005−67−8)、ポリソルベート65(CAS Reg No.9005−71−4)、及びポリソルベート80(CAS Reg No.9005−65−6)のようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル)、菜種油モノ及びジグリセリド(CAS Reg No.93763−31−6)、及び白色鉱油(CAS Reg No.64742−47−8)の消泡剤からなる群から選択される、
請求項24から30のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項24のステップ(d)において、又は請求項26のステップ(f)において、1つ又は複数の適する凝集剤が添加され、前記凝集剤が、好ましくは
a)カチオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー(CAS Reg No.25988−97−0)、メチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー(CAS Reg No.31568−35−1)、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン−エチレンジアミンターポリマー(CAS Reg No.42751−79−1)等、
b)カチオン性のポリアクリルアミドに基づく凝集剤、例えばホルムアルデヒド及びジメチルアミンと共に縮合させることにより改変されたポリアクリルアミド(CAS Reg No.67953−80−4)、アクリルアミド−アクリロキシエチルトリメチルアンモニウムクロライドコポリマー(CAS Reg No.69418−26−4)等、
c)陰イオン性のポリアミンに基づく凝集剤、例えばアクリルアミド−アクリル酸コポリマー(CAS Reg No.25987−30−8;CAS Reg No.9003−06−9)等、
d)硫酸アンモニウム(CAS Reg No.10043−01−3)、
e)塩化カルシウム(CAS Reg No.10035−04−8;CAS Reg No.10043−52−4)、
の凝集剤からなる群から選択される、請求項24から31のいずれか1項に記載の方法。 - 前記沈殿剤が、ポリエチレンイミン及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される、請求項1から32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記沈殿剤が、Superfloc(登録商標)781G、Superfloc(登録商標)C448、Superfloc(登録商標)C581G、Superfloc(登録商標)C752、Superfloc(登録商標)SD−2081、及びポリエチレンイミンLupasol(登録商標)の沈殿剤からなる群から選択される、請求項1から33のいずれか1項に記載の方法。
- 使用される前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、又は混合したエキソ/エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項1から34のいずれか1項に記載の方法。
- 使用される機能的に活性なヌクレアーゼが、配列番号1又は配列番号2の配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%同一である、請求項1から35のいずれか1項に記載の方法。
- 発酵ブロス1ml当たりの使用されるヌクレアーゼの量が、200Uを超える、100Uを超える、50Uを超える、40Uを超える、30Uを超える、20Uを超える、15Uを超える、10Uを超える、5Uを超える、3Uを超える、2Uを超える、1Uを超える、0.5Uを超える、又は0.1Uを超える、請求項1から36のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項24のステップ(f)又は請求項26のステップ(h)に対応する前記マイクロ濾過ステップにおいて、1000kDaを超える、500kDaを超える、400kDaを超える、300kDaを超える、200kDaを超える、150kDaを超える、100kDaを超える、90kDaを超える、80kDaを超える、70kDaを超える、60kDaを超える、50kDaを超える、40kDaを超える、30kDaを超える、又は20kDaを超える粒径排除限界により特徴づけられるメンブレンが使用され、及び前記組換え酵素産物が、前記マイクロ濾過ステップの前記濾液内で得られる、請求項24から37のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項24のステップ(f)又は請求項26のステップ(h)に対応する前記マイクロ濾過ステップにおいて、メンブレンが、5μmを超える、4μmを超える、3μmを超える、2μmを超える、1μmを超える、0.5μmを超える、0.4μmを超える、0.3μmを超える、0.2μmを超える、又は0.1μmを超える粒径排除限界を有し、及び前記組換え酵素産物が、前記マイクロ濾過ステップの前記濾液内で得られる、請求項24から38のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項24のステップ(f)又は請求項26のステップ(h)に対応する前記マイクロ濾過ステップの後に、任意選択で、100kDaを超える、80kDaを超える、60kDaを超える、50kDaを超える、40kDaを超える、30kDaを超える、20kDaを超える、15kDaを超える、10kDaを超える、5kDaを超える、又は1kDaを超える粒径排除限界を有するメンブレンの使用により特徴づけられる追加の限外濾過ステップが適用され、及び前記組換え酵素産物が前記限外濾過ステップの前記保持液内で得られる、請求項24から39のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項24のステップ(e)又は請求項26のステップ(g)に対応する前記固体/液体分離ステップが、遠心分離、フィルタープレス、及び/又はマイクロ濾過の技術により達成される、請求項24から40のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも5つ、好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも3つ、なおいっそうより好ましくは少なくとも2つ、及び最も好ましくは少なくとも1つの細胞内タンパク質を発現させる、請求項1から41のいずれか1項に記載の方法。
- 製造株から発現する1つ又は複数の組換え酵素が、単独で又は総合して、前記酵素産物の総タンパク質含有量の少なくとも50%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも30%、よりいっそう好ましくは少なくとも20%、及び最も好ましくは少なくとも10%を占める、請求項1から42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素産物が、食品酵素である、請求項1から43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素産物が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される、請求項1から44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素産物が、
a)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
c)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等、
からなる群から選択される、請求項1から45のいずれか1項に記載の方法。 - 前記酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はN−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも1つに属する、請求項1から46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換え酵素が、野生型酵素である、又は酵素エンジニアリング技術により派生した改良型バリアントである、請求項1から47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物製造用宿主が、例えば、酵素、好ましくは大腸菌酵素のホスホグルコムターゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−1−ホスフェートホスファターゼ、UDP−グルコース−6−デヒドロゲナーゼ、セルロースシンターゼ(UDP形成型)、α,α−トレハロースホスフェートシンターゼ(UDP形成型)、UDP−グルコース−ヘキソース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−グルコース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−グルコース−1−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UDP−糖ジホスファターゼ、ヌクレオチドジホスファターゼ、UDP−グルコース−4−エピメラーゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リボヌクレオシドジホスフェートレダクターゼ、リポポリサッカライド−N−アセチルマンノースアミノウロノシルトランスフェラーゼ、脂質−A−二糖合成酵素、ウンデカプレニルジホスホムラモイルペンタペプチド−β−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ウンデカプレニルホスフェート−4−デオキシ−4−ホルムアミド−L−アラビノーストランスフェラーゼ、6−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ウリジンキナーゼ、UMPキナーゼ、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、UDP−N−アセチルグルコサミン−2−エピメラーゼ(非加水分解型)、β−ガラクトシダーゼ、N−アセチルノイラミン酸リアーゼ、N−アセチルマンノサミンキナーゼ、推定N−アセチルマンノサミン−6−ホスフェート−2−エピメラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ガラクトシド−O−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される、1つ又は複数の追加の遺伝子の欠損により改変されている、請求項1から48のいずれか1項に記載の方法。
- a)組換え酵素産物を含有する細胞破壊未精製ライセートを、ヌクレアーゼを用いて処理するステップと、
b)核酸を複合体化させるために、沈殿剤を添加するステップと、
c)液相から細胞デブリ及び核酸/沈殿剤複合体を取り除くために、液体/固体分離を行うステップと、
d)残留固体及び/又は高分子量コンポーネントを取り除くために、マイクロ濾過ステップを実施するステップと
を含む、請求項1から49のいずれか1項に記載の方法。 - A)大腸菌株を提供するステップと、
B)任意選択で、栄養培地を添加するステップと、
C)発酵させるステップと、これにより発酵ブロスを取得し、
D)任意選択で、前記発酵ブロスの固体/液体分離を行うステップと、これによりバイオマスを取得し、
E)任意選択で、ホモジナイゼーションするステップと、
F)ヌクレアーゼを用いて処理するステップと、
G)固体/液体分離を行うステップと、これにより上清を取得し、
H)任意選択で、濾過を行うステップと、これにより前記酵素調製物を取得する、
を含む、酵素調製物を製造する方法。 - 請求項1から51のいずれか1項に記載の方法により取得可能な組換え酵素調製物。
- 0ng/g〜50ng/g、0ng/g〜40ng/g、0ng/g〜30ng/g、0ng/g〜20ng/g、0ng/g〜10ng/g、0ng/g〜9ng/g、0ng/g〜8ng/g、0ng/g〜7ng/g、0ng/g〜6ng/g、0ng/g〜5ng/g、0ng/g〜4ng/g、0ng/g〜3ng/g、0ng/g〜2ng/g、0ng/g〜1ng/g、及び好ましくは0ng/g〜0.9ng/g、0ng/g〜0.8ng/g、0ng/g〜0.7ng/g、0ng/g〜0.6ng/g、0ng/g〜0.5ng/g、0ng/g〜0.4ng/g、0ng/g〜0.3ng/g、0ng/g〜0.2ng/g、0ng/g〜0.1ng/g、又はより好ましくは0.1ng/g未満、又は最も好ましくは0.01ng/g未満の残留DNA濃度により特徴づけられる、請求項52に記載の調製物。
- 請求項1から51項のいずれか1項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、0.01ng/g〜50ng/gの間、0.01ng/g〜40ng/gの間、0.01ng/g〜30ng/gの間、0.01ng/g〜20ng/gの間、0.01ng/g〜10ng/gの間、0.01ng/g〜9ng/gの間、0.01ng/g〜8ng/gの間、0.01ng/g〜7ng/gの間、0.01ng/g〜6ng/gの間、0.01ng/g〜5ng/gの間、0.01ng/g〜4ng/gの間、0.01ng/g〜3ng/gの間、0.01ng/g〜2ng/gの間、0.01ng/g〜1ng/gの間、及び好ましくは0.01ng/g〜0.9ng/gの間、0.01ng/g〜0.8ng/gの間、0.01ng/g〜0.7ng/gの間、0.01ng/g〜0.6ng/gの間、0.01ng/g〜0.5ng/gの間、0.01ng/g〜0.4ng/gの間、0.01ng/g〜0.3ng/gの間、0.01ng/g〜0.2ng/gの間、0.01ng/g〜0.1ng/gの間、又はより好ましくは0.1ng/g未満、又は最も好ましくは0.01ng/g未満の残留DNA濃度により特徴づけられる調製物。組換えDNA濃度は、サイズが少なくとも100塩基対の組換えDNAを含む代表的なDNA断片のポリメラーゼ連鎖反応に基づく増幅に準拠する方法により決定されるものである。較正は、製造用宿主に由来する全DNA調製物を用いて実施される。
- 請求項1から51のいずれか1項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、酵素産物が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される調製物。
- 請求項1から51のいずれか1項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、酵素産物が、
a)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
c)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等、
からなる群から選択される調製物。 - 請求項1から51のいずれか1項に記載の方法に基づき製造される酵素の調製物であって、前記酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちUDP−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はN−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも1つに属する調製物。
- 前記組換え酵素が、野生型酵素である、又は酵素エンジニアリング技術により派生した改良型バリアントである、請求項52から57のいずれか1項に記載の酵素調製物。
- 50ng/g未満の組換えDNA濃度で細胞内で発現させた組換え酵素産物の酵素調製物であって、前記酵素調製物の総タンパク質含有量の少なくとも10%を占める、製造用宿主の少なくとも3つの異なる細胞内宿主細胞タンパク質を含有する、酵素調製物。
- 前記製造用宿主が、大腸菌、好ましくは研究室株大腸菌K−12W3110の遺伝的に改変された派生株であり、及び最も好ましくは、LE1B109である、請求項52から59のいずれか1項に記載の酵素調製物。
- 前記発現させた酵素産物を含有し、及び配列番号1又は配列番号2のヌクレアーゼに対して少なくとも70%の同一性を有する検出可能な量のヌクレアーゼを更に含有する、請求項52から60のいずれか1項に記載の酵素調製物。
- 前記組換え酵素が、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選択され、並びに好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ニトリラーゼ、リパーゼ、アスパラギナーゼ、ホスホリパーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼエステラーゼ、タンナーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、デカルボキシラーゼ、及びキシロースイソメラーゼからなる群から選択される、請求項52から61のいずれかに1項に記載の酵素調製物。
- 前記組換え酵素産物が
a)炭水化物修飾酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ポリサッカライドリアーゼ、炭水化物エステラーゼ等、
b)アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質修飾酵素、例えばアミノトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ等、並びに
c)脂質修飾酵素、例えばリパーゼ又はホスホリパーゼ等、
からなる群から選択される、請求項52から62のいずれかに1項に記載の酵素調製物。 - 前記組換え酵素産物が、炭水化物修飾酵素であり、且つ糖ホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちUDP−グリコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、スクロースシンターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、又はN−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼの酵素クラスのうちの少なくとも1つに属する、請求項52から63のいずれかに1項に記載の酵素調製物。
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